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Dokumentenidentifikation DE10158601A1 12.06.2003
Titel Verwendung von GABA zur Behandlung von intestinalen Entzündungen
Anmelder Laves Arzneimittel GmbH, 30952 Ronnenberg, DE
Erfinder Kalousek, Markus B., Dr., Schenkon, CH;
Grimmecke, Hans-Dieter, Dr., 01454 Wachau, DE;
Seibold, Frank, Dr., Kehrsatz, CH
Vertreter Harmsen & Utescher, Rechtsanwälte, Patentanwälte, 20457 Hamburg
DE-Anmeldedatum 29.11.2001
DE-Aktenzeichen 10158601
Offenlegungstag 12.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.06.2003
IPC-Hauptklasse A61K 31/197
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft die Verwendung von GABA zur Behandlung von intestinalen, nicht T-zellvermittelten Entzündungen.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung von GABA zur Behandlung von intestinalen Entzündungen.

GABA ist die geläufige Abkürzung für γ-Aminobuttersäure, bei der es sich um eine seit langem bekannte, nicht proteinogene Aminosäure mit endständiger Carboxylgruppe handelt, die in tierischem und pflanzlichem Gewebe verbreitet vorkommt. GABA wurde Ende der 50er-Jahre im Hypothalamusgewebe des menschlichen Gehirns nachgewiesen. Bald stellte sich heraus, daß GABA der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Zentralnervensystem und Vermittler der paesynaptischen Hemmung im Rückenmark ist. Der inhibitorische Transmitter GABA agiert über zwei verschiedene Arten von Rezeptoren, GABAA und GABAB. Die Substanz wird an einer paesynaptischen Membran freigesetzt und aktiviert ZNS Ionenkanäle, insbesondere Chloridkanäle, die zu Hyperpolarisationen und damit zur Hemmung der Erregungsleitung, also zur postsynaptischen Hemmung führen. eine Zusammenfassung der bisherigen Arbeiten über GABA als Neurotransmitter ist enthalten im Handbook of Psychopharmacology, Band 4, Amino Acid neurotransmitters, herausgegeben, von L. L. Iversen et al., Plenum, New York und London, 1975.

Bisher sind zwei Präparate bekannt, die GABA als Therapeutikum verwenden. AMINALON der russischen Firma Akrichin und GAMMALON der japanischen Firma Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd. GABA sollen auf das zentrale Nervensystem wirken und werden beispielsweise zur Beschleunigung des zerebralen Metabolismus eingesetzt. Indikationen sind Gehirngefäßerkrankungen, chronische zerebro-vaskuläre Insuffizienz, posttraumatische Behandlung nach einem Insult, geistige Entwicklungsstörungen und Seekrankheit sowie allgmein bestimmte neurologische, psychische und narkologische Fälle nach Einschätzung des Arztes. Die Wirksamkeit dieser Präparate ist aber wissenschaftlich nicht gesichert.

Alle bisherigen Untersuchungen haben ergeben, daß peripher zugeführtes GABA die Bluthirnschranke nicht überwinden kann [Galzigna L, Garbin L, Bianchi M, Marzotto A. Arch Int. Pharmacodyn Ther 1978 Sept.; 235 (1) 73-85]. Daher sind Analoga zu dieser Substanz entwickelt worden, die diese Schranke überwinden können und von denen insbesondere Baclofen, nämlich 4-Amino-3-p-chlorphenylbuttersäure als Antiepileptikum und als zentrales Muskelrelaxans bei multipler Sklerose eingesetzt wird.

Erst in jüngerer Zeit wurde festgestellt, daß GABA auch im peripheren Bereich, insbesondere im vegetativen Nervensystem der glatten Darmmuskulatur, eine Rolle spielt, obgleich die bisher vorliegenden Erkenntnisse noch kein vollständiges Bild der Wirkungsweise vermitteln. So hat man gefunden, daß einerseits GABA durch Freisetzung von Acetylcholin aus intrinsischen cholinergen Neuronen bewirkt, daß durch die Bindung der Substanz am GABAA-Rezeptor vermehrt Acetylcholin ausgeschüttet wird und dann eine Kontraktion der Darmmuskulatur erfolgt, wohingegen die Wirkung der Substanz auf den GABAB-Rezeptor zu einer Hemmung der Acetylcholinfreisetzung und damit Relaxation der Darmmuskulatur führt. Daneben gibt es auch Hinweise darauf, daß GABA inhibitorische nichtadrenerge-nichtcholinerge Neuronen stimuliert. Diese antagonistische Wirkung von GABA auf den Darm, die über verschiedene Rezeptoren erfolgt, ist am Model des Ileums eines isolierten Meerschweindarms erklärbar. GABA bewirkt dort zunächst eine Kontraktion des Ileums, der dann eine zeitlich verzögerte Relaxation folgt. Insoweit wird auf J. Ong und D. I. Kerr in European Journal of Pharmacology, 134 (1987) 349.353, A. Krantis et al. in European Journal of Pharmacology, 67 (1980) 461-468, P. V. Kaplita et al. in European Journal of Pharmacology, 79 (1982) 42-51 und S. Manzini et al. in European Journal of Pharmacology, 123 (1986) 229-236 verwiesen.

Aus der DE 197 12 977 A1 ist bekannt, daß GABA eine gewisse Wirkung bei Diarrhöen, insbesondere bei der chronischen radiogenen Colitis, aufweist, ohne daß der Wirkungsmechanismus abgeklärt werden konnte.

US 6127418 beschreibt die Verwendung von GABA-Analoga für die Prophylaxe von gastrointestinalen Läsionen und zur Behandlung von entzündlichen und funktionellen Magen-Darm-Erkrankungen. Die verwendeten GABA-Derivate, wie z. B. Gabapentin, passieren die Blut- Hirnschranke, reichern sich im Zentralnervensystem an und wirken zentral [Luer MS, Hamani C, Dujovny M, Gidal B, Cwik M, Deyo K, Fischer JH. Neurol Res. 1999 21 (6): 559-62. Lesch et al. (1998) Gastroenterology 114 (4), 200 ff].

Entzündungsreaktionen werden bis heute hin im wesentlichen durch die vier klassischen Symptome Schmerz, Wärme, Rötung und Schwellung charakterisiert, wobei diese typische Symptomatik Ereignisse beschreibt, die aufgrund der Fortschritte auf dem Gebiet der Immunologie und Zellbiologie erst in jüngster Zeit genauer analysiert werden konnten. Eine Übersicht über die unterschiedlichen Grundlagen von Entzündungen ist in der Arbeit von D. Gemsa und K. Resch in Immunologie. Grundlagen. Klinik. Praxis, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1997, Seiten 135-158 zu finden. Entzündungen können als Folge der Gewebeschädigung bei mechanischer oder chemischer Reizung (z. B. bei Strahlen- oder Chemotherapie, bei Behandlung mit anderen, die Darmschleimhaut schädigenden Medikamenten oder infolge von toxischen Abbauprodukten bei Enzymmangel oder bakterieller Fehlbesiedlung im Darm) oder als Reaktion auf Infekte sowie als Resultat immunologischer Fehlreaktionen (Autoimmunerkrankungen/chronisch-entzündliche Erkrankungen) entstehen.

Zentrales Ereignis aller Entzündungsreaktionen ist der Einstrom von Leukozyten in einen Entzündungsherd. Die rekrutierten Leukozyten schütten proinflammatorische, permeabilitätssteigernde und toxische Substanzen aus oder lösen die Ausschüttung solcher Substanzen durch anderen Zellen aus (Zytokine, Enzyme, Mediatoren, Prostaglandine, Sauerstoffradikale). Dies führt zur erhöhten Durchblutung sowie zur Aktivierung und zum erhöhten Durchsatz von Immunzellen, welche an der Elimination des Erregers und am Abtransport von Abbauprodukten beteiligt sind. Verschiedene Wachstumsfaktoren - darunter auch Zytokine - fördern die Proliferation von Gewebezellen und somit den Heilungsprozeß. Chronische Entzündungen treten dann auf, wenn das auslösende Ereignis nicht eliminiert werden kann oder sich die Immunantwort verselbständigt und durch aktivierte T-Helfer-Lymphozyten perpetuiert wird. Wenn sich die Immunantwort gegen körpereigene Antigene richtet, entstehen Autoimmunerkrankungen.

Im Verlauf des Entzündungsprozesses werden aber auch gesunde Zellen angegriffen, was zu Gewebsläsionen führt, welche bei chronischen Entzündungen anhalten und eine Gewebeschädigung zur Folge haben können [Gemsa and Resch, 1997].

Die Entzündungsreaktion ist ein sehr komplexer Vorgang, welcher durch verschiedenste Elemente des angeborenen sowie des erworbenen, zellulären und u. U. humoralen Immunsystems sowie durch Mediatoren und gewebedegradierende Enzyme vermittelt wird. Bei kurzfristigen, akuten Entzündungen, wie sie bei Infekten oder bei noxischer Einwirkung auftreten, sind überwiegend Zellen der angeborenen Immunabwehr, insbesondere neutrophile Granulozyten, beteiligt. Sie phagozytieren Fremdstoffe und abgestorbene Zellen und setzen dabei gewebeschädigende Enzyme und reaktive Sauerstoffverbindungen sowie permeabilitätssteigernde und chemotaktische Mediatoren frei. Makrophagen strömen nach und sezernieren Entzündungsmediatoren wie IL-1 und TNFα. Diese Zytokine rekrutieren Gefäßendothelzellen und parenchymale oder mesenchymale Zellen, um am Entzündungsprozeß teilzunehmen. Dadurch werden noch mehr Enzyme, Lipidmediatoren sowie reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies produziert, welche die Entzündung vorantreiben und die Gewebeschädigung verstärken. Die erworbene, spezifische Immunabwehr und insbesondere T-Helfer- Lymphozyten spielen erst bei der Unterhaltung chronischer Entzündungsprozesse eine Rolle, wo sie aufgrund spezifischer Stimulation durch persistierende Antigene Zytokine wie Interferon γ oder IL-2 ausschütten, welche die anhaltende Aktivierung der Makrophagen unterstützen [Gemsa and Resch, 1997].

Überraschend wurde jetzt festgestellt, daß GABA ein hervorragendes Mittel zur Prophylaxe gegen oder zur Behandlung von intestinalen Läsionen oder Entzündungen darstellt, auch wenn diese nicht T-Zellvermittelt sind.

Die Wirksamkeit von GABA bei intestinalen Entzündungen läßt sich noch nicht im einzelnen wissenschaftlich exakt erklären. Aus der Literatur ist bekannt, daß GABA über den GABAA-Rezeptor einerseits die Proliferationsrate von T-Lymphozyten vermindert und dadurch Allergien vom verzögerten Typ IV (DTH, delayed type hypersensitivity) vermindert [Tian et al., 1999], andererseits aber die Zytotoxizität von zytotoxischen T- Lymphozyten erhöht [Bergeret et al., 1998]. Eine Verminderung der T- Zellproliferation sollte immunsuppressiv wirken, wohingegen eine Erhöhung der Zytotoxizität immunstimulierend wäre. Welche dieser beiden Aktivitäten in vivo dominiert, und wie ihr Einfluß auf eine Immunantwort ist, kann für einzelne Indikationen nicht vorausgesagt werden. Aufgrund der Funktion von T-Helferzellen bei der anhaltenden, chronischen Entzündung ist davon auszugehen, daß der proliferationshemmende Einfluß von GABA im Rahmen von Entzündungsreaktionen nur dann zum Zuge kommt, wenn entweder allergische Prozesse vom Typ IV beteiligt sind, oder wenn T-Lymphozyten die chronifizierte Entzündung unterhalten (z. B. bei "Insulin Dependent Diabetes Mellitus, IDDM") [Kaufman, 2000].

Über den Einfluß von GABA auf die unspezifische Immunantwort bei akuten Entzündungen ist wenig bekannt. Gentilini et al. berichten, daß GABA die Aktivität von alveolaren Makrophagen nicht beeinflußt [Gentilini et al., 1995].

Im folgenden wird unter GABA natürlich vorkommendes, synthetisch oder halbsynthetisch hergestelltes GABA verstanden.

GABA kann unproblematisch vollsynthetisch mit guten Ausbeuten hergestellt werden; wir verweisen insoweit zusammenfassend auf die Monographie in "The Merck Index", 11. Aufl. Merck & Co., Inc., Rahway, N. J., USA 1989, S. 70. Da GABA aber fast ubiquitär in Pflanzen und Tieren vorkommt, ist es auch möglich, anstelle der synthetischen Verbindung geeignete Extrakte oder deren Fraktionen aus Pro- oder Eukaryonten einzusetzen. Insbesondere Prokaryonten, und hier wiederum Bakterien, produzieren relativ große Mengen an GABA, so daß es möglich ist, die Substanz entweder aus deren eiweiß- und zellfreien Extrakten zu gewinnen oder diese Extrakte und Fraktionen selbst in standardisierter Form einzusetzen. Derartige Extrakte/Fraktionen können insbesondere aus Streptococcen, Staphylococcen, Escherichia, Proteus, Klebstella, Gaffkya oder Mykobakterien hergestellt werden. Zur Herstellung wird aus technischen Gründen meist das leicht zugängliche E. coli verwendet.

Die wirksame Dosierung der Substanz liegt im Bereich von etwa 0,2 µg /kg/d bis ca. 500 mg/kg/d; die bevorzugte Gabe bei oraler Anwendung bei etwa 20 µg/kg/d bis 50 mg/kg/d. Da sich GABA durch geringe Toxizität auszeichnet und bereits heute in Dosen bis zu 3 g/Tag verabreicht wird, ist eine große therapeutische Breite gegeben, so daß auch bei höheren Dosen keine Nebenwirkungen zu erwarten sind.

Die Verwendung von GABA erfolgt vorzugsweise oral oder rektal, z. B. in Form von Lösungen, Pulver, Granulaten, Tabletten, Kapseln, Dragees, Suppositorien oder Klysmen. Die Herstellung der pharmazeutischen Darreichungsformen erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise und entspricht Standardverfahren.

Da GABA beim erfindungsgemäßen Einsatz peripher wirkt, ist eine ZNS- Wirkung nicht nötig bzw. unerwünscht. Da GABA die Blut-Hirnschranke nicht überwindet, wird eine spezifisch periphere Wirkung erreicht.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Synthese von GABA aus Succinimid

Die vorgestellte Methode entspricht der von Tafel und Stern (1900, Ber. 33, 2224). 135 g Succinimid wird in 450 ml Schwefelsäure (50%) gelöst und elektrolytisch bei 54A 7 Std. reduziert. Die Kathodenflüsigkeit wird anschließend mit Wasser verdünnt und durch Fällung mit zunächst Bariumcarbonat, dann Barythydratlösung aufgereinigt. Die baryt- und schwefelsäurefreie, schwach saure Flüssigkeit wird dann im Vakuum mehrfach - zuletzt im Wasserstoffstrom - abdestilliert. Die Ausbeute beträgt etwa 60% der theoretisch möglichen. Das gewonnene Pyrrolidon wird dann zusammen mit der 2,5-fachen Menge kristallisierten Bariumhydroxids und der 10-fachen Menge Wasser 2 Stunden am Rückflußkühler gekocht und so hydrolysiert. Die enstehende GABA- Lösung wird zunächst mit Kohlensäure von Verunreinigungen befreit und dann der Rest des Baryts mit Schwefelsäure ausgefällt. Die baryt- und schwefelsäurefreie Lösung wird eingedampft. Die verbleibende Rohsäure, deren Ausbeute der theoretisch möglichen sehr nahe kommt, wird in der 4-fachen Menge Wasser gelöst und mit der 25-fachen Menge absoluten Alkohols versetzt. Nach Abfiltration der ersten Trübung und nochmaliger Zugabe einer gleichen Menge Alkohols kristallisiert die Hauptmenge der Säure aus.

Beispiel 2 Darstellung von GABA aus Piperylurethan und Salpetersäure

Hier wird auf eine Methode von Schotten (1883, Ber. 16, 643) zurückgegriffen. 300 ml rauchende Salpetersäure werden unter Kühlung zu 157,216 g Piperylurethan getropft. Die entstehende salpetersaure Lösung wird in 0,5 l Wasser aufgenommen und eine aus einer öligen Säure bestehende Phase abgetrennt. Die wässrige Phase wird mit zweimal 100 ml Äther extrahiert und die Ätherphasen mit der zuvor abgetrennten öligen Phase vereinigt. Diese wird mit der gleichen Menge konzentrierter Salzsäure in einem geschlossenen Behälter über 100°C erhitzt. Die zurückbleibende salzsaure Lösung wird eingedampft und der Rückstand in wenig Wasser (10 ml) aufgenommen. Nach Filtration und Versetzung mit 5 ml Ethylalkohol und 100 mg Platinchlorid bildet sich nach einem Tag ein Niederschlag. Das Filtrat des Niederschlags wird mit H2S von Platin befreit und eingedampft. GABA kristallisiert dann als salzsaures Salz mit einer Ausbeute von ca. 90 g (87%) aus.

Beispiel 3 Gewinnung einer GABA-haltigen Wirkstoff-Fraktion aus einem Extrakt aus E. coli

Zur Gewinnung der GABA-haltigen Wirkstoff-Fraktion aus E. coli wird bevorzugt E. coli des Serotyps 02:K1:H6 fünf Tage bei 37°C bis zu einer Wachstumsdichte von 3 × 108 koloniebildenden Einheiten/ml auf einem Nährmedium auf Fleischpeptonbasis bebrütet. Aus der gewachsenen Kultur wird in an sich bekannter Weise durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen. Aus diesem Extrakt wird GABA isoliert. Dazu werden beispielsweise 1,5 ml des Extrakts an einer, speziell für die Trennung von Aminosäuren geeigneten Kationenaustauschsäule mit einem Stufengradienten bei 58°C getrennt, wobei GABA mit dem Wechsel von Puffer A (1,7% Natriumcitratdihydrat, 0,5% NaCl in Wasser, pH 4 mit HCl) zu Puffer B (1,9% Natriumcitratdihydrat, 5% NaCl in Wasser, pH 6) nach einer Retentionszeit von ca. 43 Minuten eluiert und in Fraktionen aufgefangen wird. Die Detektion und Quantifizierung von GABA erfolgt durch Untersuchung der Fraktionen an einem kommerziellen Aminosäureanalysator (Beckmann 6300), im Prinzip nach dem Verfahren von Spackmann, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190). Die GABA-haltigen Fraktionen der Ionenaustauschchromatographie werden gepoolt (1,2 ml) und entsalzt (z. B. 100 µl an Sephadex G10-Gelchromatographie (Säulendimensionen 1 m × 2 cm, Fluß 300 µl) in 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser). Der GABA enthaltende Peak, der - wie oben beschrieben - durch Aminosäureanalyse detektiert wird, wird eingetrocknet und in Wasser (z. B. 200 µl) aufgenommen. GABA kann so in einer Menge von mindestens 500 nmol/ml eiweiß- und zellfreiem Peptidextraktes aus E. coli gewonnen werden.

Beispiel 4 Orale Gabe von GABA

Sowohl GABA in reiner Form als auch GABA-haltige Extrakte oder Fraktionen können in getrockneter oder gelöster Form oral appliziert werden. Möglich ist eine Gabe als Lösung, Pulver, Granulat, Dragee, Tablette oder Kapsel. Eine bevorzugte Dosierung liegt im Bereich von 20 µg/kg/d bis 50 mg/kg/d. Zur Herstellung von Tabletten kann beispielsweise 1 g GABA mit 99 g Trägersubstanzen (Magnesiumstearat, Polyvidon, Lactose oder Stärke) gemischt und in an sich bekannter Weise zu Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 0,1 mg verarbeitet werden. In entsprechender Weise können auch Pulver, Granulate, Kapseln oder Dragees in an sich bekannter Weise produziert werden.

Zur Herstellung einer Lösung zur peroralen Gabe werden 1 g GABA in isotonischer Kochsalzlöung gelöst, ggf. mit Geschmackskorrigentien versetzt, sterilisiert und in Trinkampullen abgefüllt.

Beispiel 5 Hemmung intestinaler Entzündungsreaktionen als Folge noxischer Einwirkung

2 Gruppen von je 6 Balb-c Mäusen (Alter 2 Monate) erhielten unter Doppelblindbedingungen während 1 Woche Placebo (Rinderpepton) bzw. Placebo + 370 µg/ml GABA (Verum) zu trinken. Die durchschnittliche, tägliche Trinkmenge lag bei 6 ml und unterschied sich nicht signifikant zwischen den zwei Behandlungsgruppen. Nach einwöchiger Behandlung erhielten alle Mäuse während 5 Tagen 2.5% DSS in Trinkwasser, um durch chemische Noxe eine Entzündung hervorzurufen. Danach erfolgte eine erneute Behandlung mit Verum oder Placebo während 4 Tagen. Danach wurde der Darm asserviert und der Kryptenindex bestimmt. Der Kryptenindex stellt ein Maß für die Degeneration der Darmwand, und somit ein Maß für die Entzündung dar; je größer die Zahl, desto stärker die Entzündung. Verummäuse hatten einen Kryptenindex von 3.0, Placebomäuse einen von 4.9. Daraus folgt, daß die mit GABA behandelten Mäuse eine signifikant geringere Entzündung aufweisen als die Placebomäuse. Die Gewichtszunahme war in der Verumgruppe signifikant größer als in der Placebogruppe. Zudem wurden in der Placebogruppe häufiger klinische Zeichen einer Kolitis, wie Anusrötung, weicher Stuhl und transanaler Blutabgang beobachtet.

Dieses Experiment zeigt, daß GABA intestinale, entzündliche Läsionen, welche durch noxische Einwirkung ausgelöst werden, verhindert.


Anspruch[de]
  1. 1. Verwendung von GABA zur Behandlung von intestinalen, nicht T- zellvermittelten Entzündungen.
  2. 2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von Colitiden.






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