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Dokumentenidentifikation DE69528523T2 12.06.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0754189
Titel REZEPTOR MODULIERENDES MITTELN UND ENTSPRECHENDES VERFAHREN
Anmelder Receptagen Corp., Edmonds, Wash., US;
University of Washington, Seattle, Wash., US
Erfinder MORGAN, A. Charles, Edmonds, US;
WILBUR, Scott, D., Edmonds, US;
PATHARE, M., Pradip, Seattle, US
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69528523
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.04.1995
EP-Aktenzeichen 959162843
WO-Anmeldetag 07.04.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/US95/04404
WO-Veröffentlichungsnummer 0095027723
WO-Veröffentlichungsdatum 19.10.1995
EP-Offenlegungsdatum 22.01.1997
EP date of grant 09.10.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.06.2003
IPC-Hauptklasse C07H 23/00
IPC-Nebenklasse G01N 33/82   A61K 31/714   

Beschreibung[de]
Beschreibung Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen rezeptormodulierende Agentien, die Zelloberflächenrezeptoren modulieren, und genauer, rezeptormodulierende Agentien, die an Zelloberflächenrezeptoren binden und den Rezeptor-Wander-Weg ('receptor trafficking pathway') beeinflussen, sowie Verfahren, die damit zusammenhängen.

Hintergrund der Erfindung

Zelloberflächenrezeptoren machen eine Klasse von Proteinen aus, die für Rezeptorvermitlelte Endocytose von spezifischen Liganden verantwortlich sind. Einfach gesagt, dienen die Rezeptoren als Begleiter zur Ligandenabgabe an intrazelluläre Zielorte.

Ligandenabgabe wird im allgemeinen durch beschichtete Regionen auf der Plasmamembran, sogenannte 'coated pits', erreicht. Diese Grübchen stülpen sich kontinuierlich ein und schnüren sich ab, wobei sie beschichtete Vesikel ('coated vesicles') im Cytoplasma bilden. Coated pits und Vesikel stellen einen Weg zur rezeptorvermittelten Endocytose von spezifischen Liganden bereit. Die Liganden, die an spezifische Zelloberflächenrezeptoren binden, werden über coated pits Internalisiert, was es den Zellen ermöglicht, eine große Anzahl von spezifischen Liganden in sich aufzunehmen, ohne ein entsprechend großes Volumen an extrazellulärer Flüssigkeit aufzunehmen. Die Internalisierten beschichteten Vesikel können ihre Hüllen verlieren oder auch nicht und binden an andere Vesikel, um größere Vesikel zu bilden, sogenannte "Endosomen". Im Endosom werden der Ligand und der Rezeptor getrennt oder "sortiert". Endosomen, die Liganden und Rezeptoren sortieren, sind als "Kompartiment zum Entkoppeln von Rezeptor und Ligand" oder 'CURL' bekannt.

Endosomen können mit primären Lysosomen verschmelzen, wo ihr Inhalt verdaut wird, oder sie können an andere intrazelluläre Zielorte abgegeben werden. Die Rezeptorproteine werden im allgemeinen nicht verdaut, sondern werden stattdessen an die Zellmembranoberfläche mittels eines Prozesses, genannt "Exocytose", recycelt, oder sie werden zu frühen oder späten Endosomen über multivesikuläre Körperchen übertragen. Der gesamte Weg wird als der "Rezeptor-Wander-Weg" ('receptor trafficking pathway') bezeichnet.

Einige Rezeptoren liefern ihren Liganden direkt an das Cytoplasma oder andere spezifische intrazelluläre Orte ab. Vielleicht ist einer der am meisten untersuchte Rezeptor-Wander-Wege der des Eisentransports. Bei diesem Weg bindet ein Serum-Trägerprotein, Transferrin, Eisen und transportiert es zu Transferrinrezeptoren auf der Plasmamembranoberfläche. Nach Bindung und Internalisierung über coated pits verbindet sich das daraus resultierende Vesikel zuerst mit frühen Endosomen und dann mit späten Endosomen. Dieser Prozeß führt zu einem allmählichen Abfall des pH in dem Vesikel. Der Abfall des pH bewirkt, daß das Transferrin- Trägerprotein seine Affinität für Eisen verliert. Wenn dies stattfindet, begibt sich das Eisen durch die Membran des Vesikel und verbindet sich mit dem intrazellulären Pool von Enzymen. Der Transferrinrezeptor kann dann an die Zelloberfläche zurückkehren, wo er den Prozeß wiederholen kann.

Andere Rezeptoren können ihren Liganden direkt an die Lysosomen zum Verdau abgeben. Zum Beispiel liefert der Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor ("EGF") seinen Liganden direkt an ein Lysosom zum Abbau ab (Prog. Histochem. Cvtochem. 26: 39-48, 1992). Der EGF-Rezeptor kann an die Zelloberfläche zurückkehren, abhängig von seinem Phosphorylierungsstatus (Cancer Treat. Rep. 61: 139-160, 1992; J. Cell. Biol. 116: 321-330, 1992).

Ein einzelner Rezeptor kann mehr als einen Rezeptor-Wander-Weg innerhalb derselben Zelle verwenden. Zum Beispiel ist in polarisierten Zellen, wie etwa spezialisierten Transport- Epithelzellen, das Membran-Wander unterschiedlich zwischen der apikalen und der vasalen Seite der Zelle (Sem. Cell. Biol. 2: 387-396, 1991). Darüberhinaus können nicht-polarisierte Epithelzellen simultan zwei getrennte Sortierungswege verfolgen.

Die Kontrolle oder Regulation von Zelloberflächenrezeptoren kann mittels einer Vielzahl von Techniken erreicht werden. Die Regulation von Zelloberflächenrezeptoren kann, auf einem sehr einfachen Niveau, durch die Bindung von natürlich vorkommenden Liganden erreicht werden. Wie oben diskutiert, wird die Rezeptorbindung eines Liganden im allgemeinen die Internalisierung des Ligand-Rezeptor-Komplexes auslösen. Eine solche Internalisierung kann die Zelle gegenüber weiterer Ligandenbindung unempfindlich machen (J. Immunol. 150: 3161-9, 1993; Mol. Endocrinol. 6: 2090-102, 1992; J. Cell. Physiol. 154: 281-8, 1993; Receptor 1: 13-32, 1990-91: Biochem. J. 288: 55-61, 1992; L Immunol. 148: 2709-11, 1992; J. Cell. Physiol. 14: 24-34, 1991). Diese Art der Regulation ist jedoch vorübergehend in ihrer Natur und führt nicht zu einer Verringerung der biologischen Antwort.

Die Regulation der Zelloberflächenrezeptoren kann ebenso durch Verabreichung von Rezeptorantagonisten oder Agonisten erreicht werden. Rezeptorantagonisten sind organische Protein- oder Peptidliganden, die im allgemeinen durch empirische Struktur-Funktions-Studien oder durch die Verwendung von detaillierten Kenntnissen über die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor hergeleitet sind. Im wesentlichen kann ein Antagonist jedes Molekül mit einer Bindungsaktivität sein, die der eines natürlichen Liganden ähnlich ist, das aber nicht in der Lage ist, die biologische Antwort hervorzurufen, die normalerweise durch den natürlichen Liganden induziert wird. Daher blockiert der Antagonist die Rezeptoraktivität kompetitiv. Mit einem kompetitiven Antagonisten hängt die Regulation der Rezeptoraktivität von sowohl der Affinität des Antagonisten für den Rezeptor als auch seiner extrazellulären Konzentration über die Zeit hinweg ab. Rezeptoragonisten sind Protein- oder Peptidliganden, die in einer ähnlichen Weise wie die Antagonisten hergeleitet werden. Im wesentlichen kann ein Agonist jedes Molekül sein, das an den Rezeptor in einer Weise bindet, die derjenigen des natürlichen Liganden überlegen ist.

Ein Rezeptor von besonderem Interesse ist der Vitamin-B&sub1;&sub2;-Rezeptor. Wie in experimentellen invitro-Daten, prä-klinischen Tiermodellen sowie JPatientenstudien gezeigt worden ist, ist Vitamin-B&sub1;&sub2; ein Coenzym, das zur Zellteilung ebenso wie für den Zellstoffwechsel bei proliferierenden normalen und neoplastischen Zellen notwendig ist. Nicht ausreichendes Vitamin-B&sub1;&sub2; bewirkt, daß die Zellteilung in einem Schwebezustand gehalten wird, und kann letztendlich zu Apoptose führen. Der Nährstoff stammt im allgemeinen aus einer Aufnahme, über die Nahrung und wird im Komplex mit Transportproteinen durch den Körper transportiert. Der Komplex aus Transportprotein und Vitamin-B&sub1;&sub2; wird durch einen zellulären Rezeptor erkannt, der den Komplex Internalisiert und das Vitamin intrazellulär freisetzt. Der gesamte Prozeß ist in einer Übersicht dargestellt in GUT 31: 59, 1991. Vitamin-B&sub1;&sub2; wird durch die Nahrung aufgenommen. Bindungsproteine im Speichel (R-Binder) und dem Darm (intrinsischer Faktor-(IF)) komplexieren das Vitamin-B&sub1;&sub2; nach seiner Freisetzung von endogenen Bindungsproteinen mittels der Wirkung von Enzymen und einem niedrigen pH im Magen. Vitamin-B&sub1;&sub2; wird durch das intestinale Epithel in einer rezeptorspezifischen Weise auf Transcobalamin II (TcII) übertragen. Der Vitamin-B&sub1;&sub2;/Transcobalamin II-Komplex wird dann durch den Körper transportiert und von Rezeptoren erkannt, die auf sich teilenden Zellen vorhanden sind, Internalisiert und innerhalb der Zelle freigesetzt, wo er von bestimmten Enzymen als ein Cofaktor verwendet wird.

Der Rezeptor mit hoher Affinität in sich teilenden Geweben oder Zellen, der für die Internalisierung von Vitamin-B&sub1;&sub2; verantwortlich ist, erkennt Transcobalamin II, das an Vitamin-B&sub1;&sub2; komplexiert ist. Der Vitamin-B&sub1;&sub2;/TcII-Rezeptor erkennt nur den Vitamin-B&sub1;&sub2;/TcII-Komplex und nicht das Serumtransportprotein oder das Vitamin allein. Der Rezeptor ist auf nicht-sich teilenden Zellen nicht nachweisbar; der Mechanismus zum Versorgen von nicht-sich teilenden Zellen mit Vitamin-B&sub1;&sub2; wird schlecht verstanden. Es ist jedoch bekannt, daß mehr Vitamin-B&sub1;&sub2; während der Zellteilung als während des Zellstoffwechsels erforderlich ist, und daß der Vitamin-B&sub1;&sub2;/TcII-Rezeptor das einzige Mittel mit hoher Affinität für die zelluläre Aufnahme von Vitamin-B&sub1;&sub2; während der Zellteilung ist. Wenn Zellen zur Teilung stimuliert werden, weisen sie eine vorübergehende Expression dieses Rezeptors auf, was zu einer Vitamin- B&sub1;&sub2;-Aufnahme führt, die der tatsächlichen DNA-Synthese vorangeht (J. Lab. Clin. Med. 103: 70, 1984). Die Vitamin-B&sub1;&sub2;-Rezeptor-Niveaus können durch Bindung von &sup5;&sup7;Co-Vitamin- B&sub1;&sub2;, komplexiert an Transcobalamin II (im Serum vorhanden), auf Replika-Kulturen, die in chemisch definiertem Medium ohne Serum wachsengelassen werden, gemessen werden. Keine rezeptorvermittelte Aufnahme findet in der Abwesenheit von Trägerprotein ab.

Sich teilende Zellen, die zur Differenzierung induziert werden, verlieren die Rezeptorexpression und nehmen Vitamin-B&sub1;&sub2; nicht länger auf. Noch wichtiger, Leukämiezellen, die an Vitamin-B&sub1;&sub2; verarmt werden, werden aufhören, sich zu teilen, und sterben (Acta Haemat. 81: 61, 1989). In einem typischen Experiment wurden Leukämiezellkulturen für drei Tage an Serum verarmt und dann entweder mit Serum (einer Quelle von Vitamin-B&sub1;&sub2;) oder einem nichtmetabolisierbaren Analog von Vitamin-B&sub1;&sub2; versehen und für bis zu fünf Tage kultiviert. Zellkulturen, die mit Vitamin-B&sub1;&sub2; versehen wurden, wuchsen weiter, während diejenigen, die an aktivem Nährstoff verarmt waren, aufhörten zu wachsen und starben.

Auf der Grundlage dieser Beobachtungen ist vorgeschlagen worden, daß eine Ganzkörperverarmung an Vitamin-B&sub1;&sub2; zur Behandlung von Krebs oder anderen Störungen, die durch ein unkontrolliertes Wachstum von Zellen gekennzeichnet sind, nützlich sein kann. Darüberhinaus wird wegen der wesentlichen Rolle, die von Vitamin-B&sub1;&sub2; enthaltenden Enzymen bei der Zellteilung gespielt wird, geglaubt, daß eine Verarmung an Vitamin-B&sub1;&sub2; in Kombination mit chemotherapeutischen Arzneien, die die zelluläre Replikation inhibieren, verwendet werden kaim. Zum Beispiel waren, wenn Vitamin-B&sub1;&sub2;-Verarmung mit Methotrexat kombiniert wurde, die beiden Modalitäten zusammen beim Aufbrauchen der Folat-Konzentrationen in Leukämiezellen effizienter als jede alleine (FASEB J. 4: 1450, 1990; Arch. Biochem. Biophys. 270: 729, 1989; Leukemia Research 15: 165, 1991). Folate sind Vorläufer bei der Produktion von DNA und Proteinen. In typischen Experimenten wurden Kulturen von Leukämiezellen gegenüber Stickstoff (I)-Oxid für mehrere Stunden ausgesetzt, um die aktive Form von endogenem Vitamin-B&sub1;&sub2; in eine inaktive Form umzuwandeln. Replica-Kulturen wurden dann ohne weitere Behandlung belassen oder zusätzlich mit Methotrexat behandelt. Die zellulären Folat- Konzentrationen wurden drei Tage später gemessen. Zellen, die mit der Kombination behandelt wurden (d. h. sowohl Methotrexat als auch inaktives Vitamin-B&sub1;&sub2;) zeigten eine auffallendere Abnahme an zellulären Folat-Konzentrationen als mit jedem einzelnen der beiden Ansätze allein. Diese Kombination wird ebenso zu einer höheren Zelltötung in vitro. Wenn dieser Ansatz auf die Behandlung von stark aggressiver Leukämie/Lymphoma in Tiermodellen angewandt wurde (Am. J. Haematol. 34: 128, 1990; Anticancer Res. 6: 737, 1986; Cancer Chemother, Pharmacol. 17: 114, 1986; Br. J. Cancer 50: 793, 1984), wurde eine Addition oder Synergie der Anti-Tumorwirkung beobachtet, was zu verlängerten Remissionen und Heilungen rührte.

Ein Schlüsselergebnis bei den oben beschriebenen Experimenten war, daß kurzfristig (Stunden bis Tage), eine Ganzkörperverarmung an Vitamin-B&sub1;&sub2; synergistisch mit chemotherapeutischen Arzneien wirken kann (wie etwa Methotrexat und 5-FU), um Tumorwachstum zu inhibieren und Tiere mit Leukämie/Lymphom zu behandeln. Trotz synergistischer Anti- Tumoraktivität gab es keine Toxizität, die der kurzfristigen Vitamin-B&sub1;&sub2;-Verarmung bei proliferierenden normalen Zellen zugeordnet werden könnte. Diese Kombinationstherapie wurde in mehreren Tiermodellen gezeigt. Beobachtungen bei Patienten haben Hinweise darauf gegeben, daß eine langfristige (Monate bis Jahre) Vitamin-B&sub1;&sub2;-Verarmung erforderlich ist, um eine signifikante Toxizität in normalem Gewebe zu erzeugen. Sogar in diesen Fällen kann eine darauffolgende Infusion von Vitamin-B&sub1;&sub2; die Symptome in leichter Weise umkehren (Br. J. Cancer 5: 810, 1989).

Wegen der vielversprechenden Aussicht dieses therapeutischen Ansatzes sind verschiedene Verfahren versucht worden, um in effizienter und kontrollierbarer Weise eine temporäre Ver armung an Vitamin-B&sub1;&sub2; durchzuführen. Solche Verfahren beeinflussen jedoch die gesamten Vorräte an Vitamin-B&sub1;&sub2; des Körpers. Sie schließen eine Einschränkung in der Ernährung, hohe Dosen an Vitamin-B&sub1;&sub2;-Analogen (nicht-metabolisierbaren-kompetitiven Antagonisten, die als Enzyminhibitoren wirken) sowie Stickstoff (I)-oxid ein (Transformation von Vitamin-B&sub1;&sub2; zur inaktiven Form). Diese verschiedenen Methoden sind in Kultursystemen und in Tieren verwendet worden, um Vitamin-B&sub1;&sub2; zu verarmen. Die wirksamste und am meisten verwendete Methode ist die Inhalation von Stickstoff (I)-oxid (Lachgas) gewesen. Typischerweise werden Tiere unter einer Atmosphäre von 50% bis 70% Stickstoff (I)-oxid für Perioden von einigen Stunden bis einige Tage gehalten, was die Umwandlung von endogenem Vitamin-B&sub1;&sub2; in eine inaktive Form verursacht. Diese Methodologie ist in Kombination mit Arzneien zur Therapie von Leukämie/Lymphom verwendet worden. Ein weiteres Verfahren zur Verarmung von Vitamin-B&sub1;&sub2; beinhaltet die Infusion eines nicht-metabolisierbaren Analogs von Vitamin- B&sub1;&sub2;, das im wesentlichen die aktive Form ausverdünnt. Diese Art der Therapie ist nicht spezifisch für sich teilende Zellen, sondern beeinflußt leberabhängige Stoffwechselprozesse. Ein weiterer Ansatz beinhaltet das Einschränken der Nahrungsaufnahme von Vitamin-B&sub1;&sub2;. Dieses Verfahren erfordert jedoch sehr lange Perioden an Nahrungsbeschränkung und wird durch eine Lagerung von Vitamin-B&sub1;&sub2; in der Leber ausgeglichen. Alle diese Verfahren leiden an Problemen der Spezifität, da sie sowohl das Vitamin-B&sub1;&sub2;-abhängige Wachstum als auch den grundlegenden Metabolismus beeinträchtigen, und sind deshalb zur Entwicklung von antiproliferativen pharmazeutischen Produkten nicht besonders geeignet.

Im Hinblick auf die biologische Wichtigkeit von Zelloberflächenrezeptoren sind rezeptorkontrollierende Mittel als eine Klasse von pharmazeutischen Arzneien aufgetaucht. Darüberhinaus wurde einhergehend mit der Ankunft von Gentechnik zur Isolierung und Amplifizierung von Genen für Zelloberflächenrezeptoren sowie von Computerprogrammen, um die Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptoren zu modulieren (d. h. "rationelles" drug-design) die Produktion von rezeptorkontrollierenden Arzneien signifikant erhöht.

Heute sind viele Monate oder sogar Jahre an wissenschaftlicher Forschung sowie signifikante finanzielle Quellen erforderlich, um neue Rezeptorantagonisten oder Agonisten zu erzeugen. Um diesen Prozeß zu beschleunigen, sind neue Screening-Technologien entwickelt worden, die rekombinante Peptid- oder Antikörper-Bibliotheken verwenden (siehe z. B. Gene 73: 305, 1988; Proc. Nat. Acad. Bei. CUSA) 87: 6378, 1990; Biochromatography 5: 22, 1990; Protein Engineering 3: 641, 1989). Während das Screenen von Bibliotheken nicht dasselbe Maß an Kenntnissen über ein spezifisches Rezeptor/Ligandensystem erfordert, beinhaltet es einen intensiven Screening-Aufwand, der funktionelle Rezeptor-spezifische Assays verwendet. Darüberhinaus sind die anfänglichen Verbindungen, die durch solche Screening-Programme identifiziert werden, im allgemeinen nur Vorläufer für die Entwicklung von therapeutischen Produkten durch typischere Struktur-Funktions-Beurteilungen.

Während Antagonisten und Agonisten im allgemeinen in der Lage sind, eine biologische Antwort zu regulieren, werden die Oberflächenrezeptoren, die solche Liganden binden, kontinuierlich wieder auf der Zelloberfläche exprimiert. Daher muß eine effektive Regulation durch Antagonisten oder Agonisten auf einer relativ hohen und anhaltenden Serumkonzentration beruhen, um die neuen Oberflächenrezeptoren zu binden, die kontinuierlich auf der Zelloberfläche exprimiert werden.

Entsprechend gibt es einen Bedarf auf dem Gebiet für Mittel, die an Zelloberflächenrezeptoren binden und so damit assoziierte biologische Antworten regulieren und die weiterhin das normale zelluläre Wander des gebundenen Rezeptors ausführen. Ebenso gibt es einen Bedarf auf dem Gebiet für Mittel, die bei Bindung durch einen Zelloberflächenrezeptor und Internalisierung ein Zurückhalten des Rezeptors innerhalb der Zelle fördern. Darüberhinaus gibt es einen Bedarf für Verfahren, die sich auf die Verabreichung von solchen Mitteln beziehen, um eine biologische Antwort zu regulieren. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt weiterhin damit zusammenhängende Vorteile bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt, die vorliegende Erfindung stellt rezeptormodulierende Agentien bereit, die in der Lage sind, einen Rezeptor-Wander-Weg der Zelle zu beeinflussen. Rezeptormodulierende Agentien der vorliegende Erfindung umfassen ein Cobalamin oder ein Derivat davon, das mittels eines Linkers an eine Umleitgruppe gekoppelt ist, wobei das rezeptormodulierende Agens in der Lage ist, Transcobalamin II zu binden.

Geeignete Umleitgruppen schließen beispielsweise ein: Lysosomotrope Gruppen, wie etwa Gentamicin, Kanamycin, Neomycin und Streptomycin, intrazelluläre Polymerisationsgruppen, wie etwa Dipeptidester und Leucin-Reißverschlüsse ("leucine zippers"), Pepitdsortier- Sequenzen, wie etwa Retentionspeptide für das endoplasmatische Reticulum, Golgi- Retentionspeptide, lysomale Retentionspeptid, organismusspezifische Retentionspeptide und Clathrin-bindende Peptide, konditionelle Membranbindungspeptide, wie etwa geladenes Glutamat, Aspartat und Histidin, und bi- oder multivalente Rezeptorquervernetzungsgruppen.

Im allgemeinen ist der Linker wenigstens vier Atome lang, typischerweise ist der Linker ungefähr 6 bis 20 Atome lange und bevorzugt ist der Linker 12 Atome lang. Geeignete Linker schließen Linker ein, die eine Aminogruppe einschließen, wie etwa Diaminoalkyl, Diaminoalkylaryl, Diaminoheteroalkyl, Diaminoheteroalkylaryl und Diaminoalkane. Bevorzugt ist der Linker -NH(CH&sub2;)xNH-, wobei x = 2-20 ist, oder -NH(CH&sub2;)yCO-, wobei y = 3-12 ist. In einer Ausführungsform ist der Linker ein trifunktioneller Linker.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein B&sub1;&sub2;- Molekül an eine Umleitgruppe an einer b-, d- oder e-Kopplungsstelle gekoppelt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein B&sub1;&sub2;-Molekül an einer Umleitgruppe an einer d- oder e-Kopplungsstelle gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform ist das B&sub1;&sub2;-Molekül an eine Umleitgruppe an einer Ribose-Kopplungsstelle gekoppelt. In noch einer anderen Ausführungsform ist das rezeptormodulierende Agens an Transcobalamin gebunden.

Rezeptormodulierende Agentien der vorliegende Erfindung können wirken, indem sie einen Rezeptor-Wander-Weg auf eine aus mehreren Weise beeinflussen, einschließlich dem Umleiten eines Agens/Rezeptor-Komplexes, des Quervernetzens von einem oder mehreren Zelloberflächenrezeptoren, des Verankerns eines Zelloberflächenrezeptors in der Membran und des Zurückhaltens eines Rezeptors in einem Endosom.

Ein anderer Aspekt der vorliegende Erfindung schließt ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimer ein, das ein erstes und ein zweites Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekühl umfaßt, gekoppelt durch eine Kopplungsstelle, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kopplungsstellen a-g, Kopplungsstellen h und Kopplungsstellen i, wobei das erste und zweite Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül durch wenigstens einen Linker gekoppelt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die B&sub1;&sub2;- Moleküle durch eine e- oder d-Kopplungsstelle gekoppelt.

In einer anderen Ausführungsform sind die B&sub1;&sub2;-Molekül durch einen Linker gekoppelt. Im allgemeinen ist der Linker wenigstens vier Atome lang, typischerweise ist der Linker unge fähr 10 bis 55 Atome lang, und bevorzugt ist der Linker 35 bis 45 Atome lang. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker ein trifunktioneller Linker. Geeignete Linker schließen Linker ein, die eine Aminogruppe, wie etwa Diaminoalkyl, Diaminoalkylaryl, Diaminoheteroalkyl, Diaminoheteroalkylaryl und Diaminoalkane einschließen. Bevorzugt ist der Linker -NH(CH&sub2;)xNH-, wobei x = 2-20 ist, oder -NH(CH&sub2;)yCO-, wobei y = 3-12 ist.

Unter einem anderen Aspekt dieser Ausführungsform ist ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimer an wenigstens ein Transcobalamin II-Molekül gekoppelt. Unter noch einem anderen Aspekt dieser Ausführungsform ist wenigstens eines der besagten ersten und zweiten Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküle des Dimers ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Derivat.

Diese und andere Aspekte der vorliegende Erfindung werden unter Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angehängten Zeichnungen deutlich werden. Zusätzlich werden verschiedene unten dargestellte Literaturangaben, die bestimmte Prozeduren oder Zusammensetzungen in größerem Detail beschreiben, durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit miteinbezogen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, die den Wirkmechanismus eines rezeptormodulierenden Agens der vorliegende Erfindung veranschaulicht. Ein gesunder Rezeptor wird bei Bindung durch den geeigneten Liganden internalisiert werden, den Liganden innerhalb der Zelle freisetzen und dann an die Zelloberfläche zurückkehren. Rezeptormodulierende Agentien der vorliegende Erfindung behindern den Rezeptor-Wander-Weg durch Inhibieren des Recycling des Rezeptors an die Zelloberfläche. Im wesentlichen bindet die Zielgruppe auf den rezeptormodulierenden Agentien an den Rezeptor und die Umleitgruppe leitet den Komplex aus Rezeptor/rezeptormodulierendem Agens an andere Punkte innerhalb der Zelle um, wo er zurückgehalten oder abgebaut werden kann. (In dieser schematischen Darstellung werden keine Rezeptoren gezeigt, die de novo synthetisiert werden).

Fig. 2-5 sind Formeln, die Familien von Antibiotika repräsentieren, die als Umleitgruppen wirken. Die bevorzugten reaktiven Gruppen zum Koppeln mit einer Zielgruppe werden angezeigt. Diese Umleitgruppen erleichtern das Zurückhalten ('retention') des Komplexes aus Rezeptor/rezeptormodulierendem Agens durch eine Protonierung des Komplexes, und geben ihn schließlich an Lysosomen zum Abbau ab.

Fig. 2 zeigt Formeln, die die Antibiotika-Familien von Gentamicin, Sisomicin und Netilmicin darstellen.

Fig. 3 zeigt Formeln, die die Antibiotika-Familien von Kanomycin, Tobramycin und Amikacin darstellen.

Fig. 4 zeigt Formeln, die die Antibiotika-Familien von Neomycin, Paromomycin, Ribostamycin und Butirosin darstellen.

Fig. 5 zeigt Formeln, die die Antibiotika-Familie von Streptomycin darstellen.

Fig. 6 zeigt Formeln, die substituierte Aminochinoline (z. B. Chloroquin), substituierte Aminoacridine (z. B. Quinacrin) und substituierte Aminonaphthaline (z. B. Dansyl- Cadaverin) darstellen, die alle repräsentative Umleitgruppen der vorliegende Erfindung sind. Diese Umleitgruppen behindern den Rezeptor-Wander-Weg durch Protonierung und intrazelluläres Zurückhalten.

Fig. 7 zeigt Formeln, die Glycosylierungsinhibitoren darstellen, die alle repräsentative Umleitgruppen der vorliegende Erfindung sind. Diese Zucker können an Zielgruppen unter Verwendung von Verknüpfungen, die typisch für oligomere Kohlenhydratketten sind, konjugiert sein. Das resultierende rezeptormodulierende Agens wird durch interne Glycosyltransferasen erkannt, einer intrazellulären Zurückhaltung ('retention') und schließlich dem Abbau in Lysosomen unterworfen.

Fig. 8 zeigt eine Formel, die ein Vitamin-B&sub1;&sub2; (Cyanocobalamin)-Molekül darstellt, und identifiziert eine bevorzugte Kopplungsstelle zur Verwendung bei der vorliegende Erfindung zur Derivatisierung und Konjugation.

Fig. 9 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zur Synthese eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-GABA-Addukts darstellt.

Fig. 10a ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zur Synthese eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Derivats zeigt, umfassend ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül mit einem Diaminododecan-Linker-Arm, gekoppelt an eine der Kopplungsstellen d-, e-, oder b-.

Fig. 1 Ob ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zum Koppeln eines Bernsteinsäureanhydrids an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Diaminododecan-Addukt in Vorbereitung zur Kopplung des Addukts an eine Umleitgruppe oder ein anderes Molekül über eine Amino-Reaktionsstelle zeigt.

Fig. 11 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zur Synthese eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Derivats zeigt, umfassend ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül und einen Diaminododecan-Linker-Arm, gekoppelt an eine Ribose-Kopplungsstelle.

Fig. 12 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zum Koppeln von Vitamin-B&sub1;&sub2; oder eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-GABA-Addukts an Amikacin zeigt.

Fig. 13 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zum Koppeln von Vitamin-Biz oder eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-GABA-Addukts an Streptomycin zeigt.

Fig. 14 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zum Koppeln von Vitamin-B&sub1;&sub2;-Carboxylat-Addukts oder eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-GABA-Addukts an Acridin zeigt.

Fig. 15 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zur Synthese eines bivalenten rezeptormodulierenden Agens, eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimers, unter Verwendung eines trifunktionellen Linkers zeigt. Der trifunktionelle Linker ermöglicht das Koppeln an zusätzliche Verbindungen (z. B. R-NH&sub2;), wie etwa zum Beispiel Aminoglucoside (Fig. 2-5), Aminoacridine (Fig. 6), Glycosylierungsinhibitoren (Fig. 7) und Biotin.

Fig. 16 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zur Synthese eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimers unter Verwendung eines homobifunktionellen oder homotrifunktionellen quervernetzenden Reagenz zeigt.

Fig. 17 ist eine schematische Darstellung, die ein repräsentatives Reaktionsschema zur Synthese eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimers unter Verwendung eines heterobifimktionellen Quervernetzers zeigt.

Fig. 18-21 sind schematische Darstellungen, die repräsentatives Reaktionsschemata zur Synthese verschiedener rezeptormodulierender Agentien zeigt, die im allgemeinen eine Umleitgruppe, bezeichnet durch die reaktive Gruppe und R, ausgewählt aus denjenigen, die in Fig. 2-7 dargestellt sind, sowie ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül oder ein Derivat davon als eine Zielgruppe umfassen.

Fig. 22 ist ein Graph, der die Bindungskurve von Transcobalamin II an die in Beispiel 1 produzierten Cyanocobalamin-Monocarbonsäuren veranschaulicht. AD = Cyanocobalamin (1); AL = Cyanocobalamin-b-Monocarbonsäure (2); AM = Cyanocobalamin-e- Monocarbonsäure (3); und AN = Cyanocobalamin-d-Monocarbonsäure (4).

Fig. 23 ist ein Graph, der die Bindungskurve von Transcobalamin II an die in Beispiel 3 und 4 erzeugten Cyanocobalamm-Diaminododecan-Addukte veranschaulicht. AH = Cyanocobalamin-b-Monocarbonsäure-Konjugat-Diaminododecan (7); AI = Cyanocobalamin-e- Monocarbonsäure-Konjugat-Diaminododecan (8); AJ = Cyanocobalamin-d- Monocarbonsäure-Konjugat-Diaminododecan (9); AK = Cobalamin-e-Monocarbonsäure- Konjugat-Diaminododecan und AE = Cyanocobalamin-Ribose-Succinat (11).

Fig. 24 ist ein Graph, der die Bindungskurve von Transcobalamin II an einer Reihe von Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimeren veranschaulicht. Dimer X = b-Säure-Dimer mit Isophthaloyidichlorid (36); Dinier Y = e-Säure-Dimer mit Isophthaloyidichlorid (37); Dimer Z = d-Säure-Dimer mit Isophthaloyidichlorid (38); Dimer A = b-Säure-Dimer mit p-Iod- Benzoylisophthaloyidichlorid (58); Dimer B = e-Säure-Dimer mit p-Iod- Benzoylisophthaloyldichlorid (59); und Dimer C = d-Säure-Dimer mit p-Iod- Benzoylisophthaloyldichlorid (60). Diese Dimere wurden hergestellt, wie in den Beispielen unten gezeigt (siehe Beispiele 13 und 16).

Fig. 25 ist ein Graph, der die Bindungskurve von Transcobalamin II an eine Reihe von biotinylierten Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekülen veranschaulicht. AA = Cyanocobalamin-b- Monocarbonsäure-Konjugat-Diaminododecan und Biotin (17); AB = Cyanocobalamin-e- Monocarbonsäure-Konjugat-Diaminododecan und Biotin (18); AC = Cyanocobalamin-d- Monocarbonsäure-Konjugat-Diaminododecan und Biotin (19); AF = Cyanocobalamin- Ribose-Succinat-Konjugat-Diaminododecan (13); und AG = Cyanocobalamin-Ribose- Succinat-Konjugat-Diaminododecan und Biotin (20). Diese biotinylierten Moleküle wurden hergestellt, wie in den Beispielen unten dargestellt (siehe Beispiel 8).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf ein rezeptormodulierendes Agens, das in der Lage ist, an einen Zelloberflächenrezeptor zu binden, um ein Komplex aus rezeptormodulierendem Agens/Rezeptor ("Agens/Rezeptor-Komplex") zu bilden. Die Bindung eines geeigneten rezeptormodulierenden Agens an einen Zelloberflächenrezeptor führt im allgemeinen zur Einstülpung des Agens/Rezeptor-Komplexes in die Zelle in das vesikuläre System auf dieselbe Weise wie der natürliche Ligand. Jedoch beeinflußt ein rezeptormodulierendes Agens der vorliegenden Erfindung, wenn erst einmal Internalisiert oder als Teil des Internalisierungsprozesses, den Rezeptor-Wander-Weg, indem es effektiv behindert, verhindert oder verzögert, daß der Rezeptor an die Oberfläche zurückkehrt, wodurch es die Zelle an den Rezeptoren verarmt, die in der Lage sind, an ihren natürlichen Liganden zu binden und die damit zusammenhängenden biologischen Antworten auszulösen.

Innerhalb der vorliegende Erfindung bezieht sich "Beeinflussen des Rezeptor-Wander-Wegs" auf ein Behindern des Rezeptor-Wander-Wegs auf eine solche Weise, daß die biologische Antwort beeinflußt wird. Dies würde ein Einfangen, Aufhalten, Zurückhalten, Umleiten oder Abbauen des Zelloberflächenrezeptors einschließen. Eine "Umleitgruppe" ist eine Gruppe, die einen Agens/Rezeptor-Komplex umleitet, was zu einer verlängerten Zurückhaltung, Abbau und/oder Modulierung des Rezeptors innerhalb des Zellinneren oder auf der Zelloberfläche führt, einschließlich beispielsweise Zurückhalten des Rezeptors in der Zellmembran oder Leiten des Rezeptors zu einem Lysosom innerhalb der Zelle. Geeignete Umleitgruppen werden im Detail unten beschrieben.

Eine Zielgruppe, die Vitamin-B&sub1;&sub2; ist, wird an eine Umleitgruppe durch ein beliebiges geeignetes auf dem Gebiet bekanntes Mittel gekoppelt, einschließlich direkter kovalenter Verknüpfung eines geeigneten chemischen Linker oder durch eine sehr enge Assoziation in nichtkovalenter Verknüpfung, um das rezeptormodulierende Agens zu ergeben. Als ein Beispiel für letzteres, in einer Ausführungsform wird das Koppeln durch die Kombination eines Avidin oder Streptavidin-Konjugats mit einem Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat erzielt. Das Koppeln der Zielgruppe und der Umleitgruppe sollte von einer solchen Natur sein, daß sie einer Spaltung durch enzymatische Bedingungen und Bedingungen mit niedrigem pH widersteht, wie sie normalerweise innerhalb des inneren Teils der Zelle angetroffen werden, einschließlich Endosomen und Lysosomen. Geeignete Linker werden unten bezeichnet. Die Fähigkeit, einer Spaltung zu widerstehen, kann mittels auf dem Gebiet bekannter Mittel nachgewiesen werden, einschließlich eines Aussetzens des rezeptormodulierenden Agens gegenüber Enzymen bei niedrigem pH und Messen der Freisetzung der Ziel- oder Umleitgruppe unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken.

Die Kopplung einer Zielgruppe und einer Umleitgruppe sollte nicht die Fähigkeit der Zielgruppen signifikant behindern, spezifisch an den Zelloberflächenrezeptor zu binden. Das rezeptormodulierende Agens kann ebenso zusätzliche Gruppen einschließen, solange wie sie nicht die Ziel- oder Umleitgruppen stören. Zum Beispiel können solche Gruppen an das rezeptormodulierende Agens durch die Verwendung eines trifunktionellen Linker gekoppelt werden, oder sie können an eine Umleit- oder Zielgruppe gekoppelt werden. Eine optimale Verknüpfung der beiden Gruppen kann durch Vergleich der Affinität der Bindung des rezeptormodulierenden Agens mit einer freien Zielgruppe in Bindungsinhibitionsassays bestimmt werden.

Diese und andere geeignete Techniken werden im Detail in Sambrook et al., Moleclar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, beschrieben.

Das Koppeln einer Zielgruppe und einer Umleitgruppe sollte ebenso nicht signifikant die Fähigkeit der Umleitgruppe beeinflussen, den Agens/Rezeptor-Komplex innerhalb der Zelle zurück- oder aufzuhalten. Dies kann empirisch durch eine von mehreren Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, bestimmt werden, einschließlich der Verwendung von Markierungstechniken, um das intrazelluläre Zurückhalten der Zielgruppe gegenüber demjenigen des rezeptormodulierenden Agens zu vergleichen, wie unten beispielhaft gezeigt.

Die Zielgruppe ist ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül. Vitamin-B&sub1;&sub2; ist ein essentieller Nährstoff für sich teilende Zellen. Durch Inhibieren seiner Aufnahme kann das Wachstum von sich teilenden Zellen aufgehalten werden. Der Zelloberflächenrezeptor für Vitamin-B&sub1;&sub2; ist der Transcobalamin II/Vitamin-B&sub1;&sub2; ('TcII/B&sub1;&sub2;')-Rezeptor, der durch eine hohe Affinität für das Trägerprotein, Transcobalamin II (TcII) gekennzeichnet ist, wenn es mit Vitamin-B&sub1;&sub2; komplexiert ist ("TcII/B&sub1;&sub2;-Komplex"). Der TcII/B&sub1;&sub2;-Rezeptor erkennt nicht Vitamin-B&sub1;&sub2; alleine, erkennt aber das Trägerprotein Teil mit reduzierter Affinität, wenn es nicht mit Vitamin-B&sub1;&sub2; komplexiert ist. In vielerlei Hinsicht ist dieses Rezeptorsystem ähnlich demjenigen für Transferrin/Eisen dahingehend, daß das Ziel des Rezeptorsystems ist, Vitamin-B&sub1;&sub2; in Zellen abzugeben, so daß es von Enzymen verwendet werden kann, die bei der DNA-Synthese beteiligt sind. Innerhalb des Kontext der vorliegende Erfindung bezieht sich der Begriff "Vitamin-B&sub1;&sub2;" auf die Klasse von Verbindungen, die als Cobalamine und Derivate davon bekannt sind, einschließlich, als Beispiel, Cyanocobalamin. Der Begriff "Vitamin-B&sub1;&sub2;" wird mit dem Begriff Cyanocobalamin austauschbar verwendet.

Geeignete Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküle schließen jedes Vitamin-B&sub1;&sub2; ein, das in der Lage ist, an ein anderes Molekül zu koppeln, während es seine Fähigkeit beibehält, einen TcII/B&sub1;&sub2;-Komplex zu bilden. Eine bevorzugte Vitamin-B&sub1;&sub2;-Zielgruppe umfaßt im allgemeinen ein Vitamin-B&sub1;&sub2;- Molekül, wie etwa Cyanocobalamin, und einen Linker, der im Detail unten beschrieben wird. Der Linker kann an eine beliebige von mehreren Stellen auf einem Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül gekoppelt werden, einschließlich potentieller Carboxyl-Kopplungsstellen a- bis g-, einer Alkohol (Ribose)-Kopplungsstelle ("Kopplungsstelle h") oder einer Benzimidazol-Kopplungsstelle ("Kopplungsstelle i") (siehe Struktur I unten). Bevorzugt wird ein Linker an die Kopplungsstellen b-, d- oder e- auf einem Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül gekoppelt. Noch bevorzugter wird ein Linker an eine Kopplungsstelle d- oder e- gekoppelt. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt Verbindungen ein, die durch die folgende Formel dargestellt werden:

Struktur I

wobei wenigstens einer von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; ein Linker ist. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß eine Anzahl von anderen Kopplungsstellen auf dem Vitamin- B&sub1;&sub2;-Molekül chemisch verändert werden können, ohne das Koppeln des Moleküls mit einem Linker oder Teil zu beeinflussen. Kopplungsstellen, die nicht durch einen Linker besetzt sind, können eine Vielzahl von chemischen Gruppen daran anhängt haben, einschließlich einer Amino-, sekundärer Amino-, tertiärer Amino-, Hydroxy-, kurzkettiger Alkyl-, kurzkettiger Alkoxy-, Alkoxyalkyl-, Alkoxyalkoxy-, Cycloalkylalkoxy- und Thioalkyl-Gruppe.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist R&sub1;, R&sub2; oder R&sub4; ein Linker, und die verbleibenden R-Gruppen sind -NH&sub2;, mit der Ausnahme von R&sub7;, das bevorzugt -OH ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist R&sub2; ein Linker, R&sub1;, R&sub3;-R&sub6;, sind -NH&sub2; und R&sub7; ist -OH.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist R&sub7; ein Linker und R&sub1;-R&sub6; sind -NH&sub2;.

* Pierce Chemical, Co., Rockford, Illinois

** Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin

* Pierce Chemical, Co., Rockford, Illinois

* Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin

Geeignete Linker schließen einen von mehreren Linkem ein, bevorzugt einen, der wenigstens zwei Kopplungs- oder reaktive Gruppen enthält, die es dem Linker ermöglichen, an sowohl Vitamin-B&sub1;&sub2; als auch eine Umleitgruppe zu binden. Im Kontext der vorliegende Erfindung werden die Begriffe "Kopplungsgruppe" und "reaktive Gruppe" austauschbar verwendet. Beispielsweise kann ein Linker homobifunktionell, heterobifunktionell, homotrifunktionell oder heterotrifunktionell sein. Homobifunktionelle Mittel können das Quervernetzen oder die Dimerisierung von Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekülen in einem einzelnen Schritt erleichtern, deshalb sollte eine Kopplungsreaktion unter Verwendung dieser Mittel mit einem Überschuß an homobifunktionellen Mitteln durchgerührt werden, es sei denn, daß eine Dimerisierung das erwünschte Resultat ist, wie in der unten im Detail beschriebenen Synthese von Dimeren.

Geeignete homobifunktionelle Mittel schließen diejenigen ein, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, sowie diejenigen, die im Detail unten beschrieben sind. Heterobifunktionelle Mittel erleichtern das Quervernetzen in einem schrittweise Verfahren, was es erlaubt, daß mehr als ein Linker eingebaut und eine Vielzahl von Zielmitteln, wie etwa Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküle, verknüpft werden. Geeignete heterobifunktionelle Mittel schließen diejenigen ein, die in Tabelle 2 aufgelistet sind, sowie diejenigen, die im Detail unten beschrieben sind. Homo- und heterotrifunktionelle Linker werden an eine Umleitgruppe und ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül gekoppelt, wie oben beschrieben, mit dem zusätzlichen Vorteil einer dritten Kopplungsstelle auf dem Linker. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß dies ermöglicht, eine Anzahl unterschiedlicher Moleküle mit der Umleitgruppe zu koppeln, einschließlich von beispielsweise Marker, wie etwa radioaktiv markierte und fluoreszierende Moleküle, Proteine und Peptide, wie etwa Antikörper, und konjugierende Moleküle, wie etwa Biotin. Geeignete trifunktionelle Linker werden in Tabelle 3 aufgelistet. Homobifunktionelle, heterobifunktionelle, homotrifunktionelle und heterotrifunktionelle Linker sind kommerziell erhältlich.

Geeignete Linker sind im allgemeinen relativ lineare Moleküle, die mehr als 4 Atome lang sind, typischerweise zwischen 6 und 30 Atome lang, und bevorzugt 8 bis 20 Atome lang sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Linker ein lineares Molekül von 12 Atomen Länge. Im Kontext der vorliegende Erfindung bezieht sich der Begriff "Atom" auf ein chemisches Element, wie etwa beispielsweise C, N, O oder S. Die oben angegebenen Bereiche beruhen auf dem relativ linearen Auszählen des Linkers. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß ein Linker linear, verzweigt sein kann und sogar zyklische Elemente enthalten kann.

Kopplungs- oder reaktive Gruppen schließen jede funktionelle Gruppe ein, die in der Lage ist, einen Linker an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül zu koppeln. Geeignete Kopplungsgruppen schließen nukleophile und elektrophile funktionelle Gruppen ein. Geeignete nukleophile Gruppen schließen Hydroxygruppen, Aminogruppen und Thiogruppen ein. Geeignete elektrophile Gruppen schließen Carbonsäuregruppen und Carbonsäurederivate, einschließlich Säurehalogeniden. Säureanhydriden und aktiven Estern, wie etwa NHS-Ester, ein.

Geeignete homobifunktionelle Linker schließen beispielsweise Diaminoalkane ein, wie diejenigen, die durch die Formel NH&sub2;(CH&sub2;)xNH&sub2;, dargestellt sind, wobei x = 2-20. Ein bevorzugter Linker ist Diaminododecan. Geeignete heterobifunktionelle Linker schließen diejenigen ein, die durch die Formel NH&sub2;(CH&sub2;)yNH&sub2;, dargestellt sind, wobei y = 3-12. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, daß eine Schutzgruppe notwendig sein kann, wenn man eine heterobifunktionelle Gruppe verwendet.

Ein Linker kann an die bevorzugten b-, d- oder e-Kopplungsstellen (siehe Struktur I oben) durch eines von mehreren geeigneten Mitteln gekoppelt werden, einschließlich beispielsweise der Aktivierung eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküls durch Hydrolysieren seiner Propionamidgruppen, um Monocarboxylate zu erzeugen, Aufreinigen der resultierenden Monocarboxylate und Koppeln eines Linkers an eine ausgewählte Kopplungsstelle. Die Hydrolyse der Kopplungsstelle kann durch Aussetzen von Vitamin-B&sub1;&sub2; gegenüber einer wäßrigen Säure für eine Zeitperiode und unter geeigneten Bedingungen erreicht werden, um die erwünschten Propionamidgruppen zu hydrolysieren. Bevorzugt wird die Hydrolyse durch Aussetzen des Amids gegenüber verdünnter wäßriger Säure für eine Periode von ungefähr 6 bis 12 Tagen, typischerweise ungefähr 9 bis 11 Tage und am bevorzugtesten ungefähr 10 Tagen bei Zimmertemperatur, durchgeführt. Geeignete wäßrige Säuren schließen beispielsweise 0,1 N Salzsäure, 0,5 N Phophosäure oder 0,5 N Schwefelsäure ein.

Die Aufreinigung von b-, d- und e-Monocarboxylaten kann durch eines von mehreren Mitteln, einschließlich Säulenchromatographie, wie etwa Gelpermationschromatographie, Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasenchromatographie erreicht werden. Bevorzugt ist die Säulenchromatographie eine präparative Umkehrphasen-Flüssigchromatographie. Diese Techniken werden in Detail in Lim, HPLC of Small Molecules, IRL Press, Washington, D. C., 1986 beschrieben. Die Aufreinigung von Monocarboxylaten mittels präparativer Flüssigchromatographie (LC) sollte bei einer sehr geringen Flußrate durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die LC-Aufreinigung bei einer Flußrate von 0,15 ml/min auf einer 5 um, 4,6 · 250 mm Propylamin-Säule durchgeführt werden (RAININ microsorb-MV-amino-Säule), wobei mit 58 uM Pyridinacetat, pH 4,4 in H&sub2;O : THF (96 : 4)-Lösung eluiert wird. Noch bevorzugter wird die Kopplungsreaktion unter Verwendung einer analytischen Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) überwacht. Die Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie wird bevorzugt durchgeführt unter Verwendung einer analytischen Version der oben bezeichneten Propylaminsäule unter Verwendung eines Gradienten-Lösungsmittelsystems bei einer Flußrate von 1 ml/min. Innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung wird das d-Isomer als der am längsten zurückgehaltene Peak (dritter) identifiziert, das e-Isomer wird als der zweite zurückgehaltene Peak identifiziert, und das b-Isomer wird als der am kürzesten zurückgehaltene Peak (erster) identifiziert, der von der LC-Säule eluiert wird. Das d-Isomer kann ebenso als das Vitamin-B&sub1;&sub2;-Derivat identifiziert werden, das die größte biologische Aktivität aufweist, wie unten bemerkt.

Eine Ribose-Kopplungsstelle (Kopplungsstelle h, siehe Struktur I) kann durch eine von mehreren geeigneten Mitteln aktiviert werden, einschließlich dem Aktivieren einer Hydroxylgruppe an der Kopplungsstelle h durch Reaktion mit einem geeigneten Reagenz (z. B. Bernsteinsäureanhydrid), um ein Ribosederivat zu ergeben, das eine reaktive Gruppe trägt (z. B. eine Carboxylatgruppe). Diese Technik wird im Detail in Toraya, Bioinorg. Chem. 4: 245-255, 1975 beschrieben. Die Trennung und Aufreinigung des aktivierten Moleküls kann auf einer C18-Säule, wie unten bemerkt, erzielt werden. Wenn die Kopplungsstelle h aktiviert worden ist, kann ein Linker an diese Stelle auf dieselbe Weise, wie unten beschrieben, gekoppelt werden.

Nach Aktivieren des Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküls an einer ausgewählten Kopplungsstelle können die Linker an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül gekoppelt werden, um ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker- Addukt zu bilden, unter Verwendung von einem von mehreren Mitteln, einschließlich beispielsweise einer Amid-Bildungsreaktion, die eine Amingruppe auf dem Linker und eine Carboxylat-Kopplungsstelle auf einem Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül verwendet. Alternativ kann ein Linker an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül durch eine Amid-Bildungsreaktion gekoppelt werden, die eine Carboxylatgruppe auf dem Linker und eine Aminogruppe auf einem B&sub1;&sub2;-Molekül verwendet. Die Amid-Bildungsreaktion kann die Verwendung eines Kopplungsreagenz einschließen. Geeignete Kopplungsmittel schließen Carbodiimid-Kopplungsmittel ein, wie etwa beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylammopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDC), 1- Benzyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (BDC), 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4- ethyl)carbodiimid (CMC) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Bevorzugt ist das Kopplungsmittel wasserlöslich. Noch bevorzugter ist das Kopplungsmittel EDC.

Alternativ kann die Amid-Bildungsreaktion, die den Linker an ein B&sub1;&sub2;-Molekül koppelt, eine reaktive Carbonsäuregruppe und ein Amin verwenden. Geeignete reaktive Carbonsäuregruppen schließen Carbonsäurederivate ein, die ein Amid bei Reaktion mit einem Amin ergeben. Solche reaktiven Gruppen schließen beispielsweise ein beliebiges reaktives Carbonsäurederivat, einschließlich beispielsweise Carbonsäurehalogenide, wie etwa Säurechloride und -bromide, Carbonsäureanhydride, wie etwa Essigsäureanhydride und Trifluoressigsäureanhydride, Ester, wie etwa p-Nitrophenylester und N-Hydroxysuccinimidester, ein. Solche Techniken werden im Detail in Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin, 1984, beschrieben.

Obwohl die Kopplung eines Linkers durch eine Cyano-Kopplungsstelle möglich ist, wird sie nicht bevorzugt aufgrund der Instabilität der Linker, die an diese Stelle gekoppelt sind. Dolphin, D., [205] Methods Enzymol. 18C: 34-52, 1971. Zusätzlich kann ein Linker an ein Benzimidazol gekoppelt werden (Kopplungsstelle i, siehe Struktur I), unter Verwendung von Techniken, die im Detail in Jacobsen, Anal. Biochem. 113: 164-171, 1981 beschrieben sind.

Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukte können unter Verwendung von jedem geeigneten Mittel getrennt und aufgereinigt werden, einschließlich Säulenchromatographie, wie etwa Gelpermationschromatographie, Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasenchromatographie. Bevorzugt ist die Säulenchromatographie eine präparative LC. Diese Techniken werden im Detail in Lim, HPLC of Small Molecules, IRL Press, Washington, D. C., 1986 beschrieben.

Wie oben bemerkt, müssen die Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierenden Agentien der vorliegenden Erfindung in der Lage sein, Transcobalamin II zu binden. Die Fähigkeit eines rezeptormodulierenden Agens, an Teil zu binden, kann unter Verwendung von einem von mehreren auf dem Gebiet bekannten Mitteln festgestellt werden, einschließlich kompetitiver Bindungsassays mit dem rezeptormodulierenden Agens, das mit nativem Vitamin-B&sub1;&sub2; in Wettbewerb tritt.

Umleitgruppen der vorliegende Erfindung schließen jede Gruppe ein, die in der Lage ist, den Rezeptor-Wander-Weg zu beeinflussen. Diese Eigenschaft kann beurteilt werden durch Verwendung eines rezeptormodulierenden Agens mit einer radioaktiv markierten Zielgruppe und durch Verfolgen seines Weges durch die Zelle. Dies wird unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken erreicht, einschließlich der Verwendung einer radioaktiv markierten, biotinylierten oder FITC-markierten Zielgruppe, gefolgt von Bindungsassays, ELISA oder Flußcytometrie. Ein bevorzugtes rezeptormodulierendes Agens ist eines, das zum Entfernen des höchsten prozentualen Anteils an Rezeptor für die längste Zeitperiode führt.

Geeignete Umleitgruppen dieser Erfindung beeinträchtigen die Selektivität der Zielgruppe nicht signifikant. Ob eine Umleitgruppe die Selektivität einer Zielgruppe beeinträchtigt, kann mit einem von mehreren Verfahren bestimmt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich des Vergleichs der Bindung des rezeptormodulierenden Agens auf rezeptorpositiven und rezeptornegativen Zellen, beurteilt mittels ELISA, Flußcytometrie oder anderen Bindungsassays.

Umleitgruppen bewirken das Zurückhalten/Abbau eines Agens/Rezeptor-Komplexes innerhalb von wenigstens einem Zelltyp, aber nicht notwendigerweise in allen Zellen. In ähnlicher Weise verursacht eine Umleitgruppe das Zurückhalten eines Agens/Rezeptor-Komplexes in einigen Zellen, aber nicht notwenigerweise anderen Agens/Rezeptor-Komplexen in anderen Zellen. Unterschiedliche Umleitgruppen können ebenso zwischen Rezeptor-Spezies unterscheiden, zum Beispiel wie in polarisiertem Epithel, wo derselbe Rezeptor unabhängig auf der apikalen, basalen oder basolateralen Seite der Zelle wandern kann ('may traffic'). Um zu bestimmen, ob eine bestimmte Umleitgruppe geeignet ist, wird eine Umleitgruppe kovalent an eine Zielgruppe angehängt, und das resultierende rezeptormodulierende Agens wird auf Rezeptormodulierung auf verschiedenen Rezeptor-tragenden Zellen unter Verwendung von Bindungs- oder funktionellen Assays, die auf dem Gebiet bekannt sind, verglichen.

Geeignete Umleitgruppen dieser Erfindungen können in fünf unterschiedliche funktionelle Klassen kategorisiert werden: (1) lysosomotrope Gruppen; (2) intrazelluläre Polymerisationsgruppen; (3) proteinsortierende Signale oder Sequenzen; (4) konditionelle Membranbindungspeptide; und (5) bi- oder multivalente Rezeptor-Quervernetzungsgruppen. Während solche Umleitgruppen unterschiedlich funktionelle Wirkmechanismen haben mögen, fördern alle das Zurückhalten des Agens/Rezeptor-Komplexes innerhalb des intrazellulären vesikulä ren Systems. Alle diese Klassen von Umleitgruppen werden die Fähigkeit verleihen, den Rezeptor-Wander-Weg zu beeinflussen.

Unter einem Gesichtspunkt der vorliegende Erfindung werden eine erste funktionelle Klasse von Umleitgruppen, lysosomotrope Gruppen, offenbart. Innerhalb des Kontextes der vorliegende Erfindung bezieht sich der Begriff "lysosomotrope Gruppen" auf Gruppen, die den Agens/Rezeptor-Komplex zu den Lysosomen leiten. Zahlreiche lysosomotrope Gruppen sind bekannt und werden in Biochem. Pharmacol. 23: 2495-2531, 1974 in einem Überblick dargestellt.

Eine bevorzugte lysosomotrope Gruppe schließt ein Aminoglycosid-Antibiotikum ein, markien, durch die charakteristische Fähigkeit, sich in Lysosomen nach intrazellulärer Protonierung anzusammeln. Eine intrazelluläre Protonierung findet unter den zunehmend sauren Bedingungen statt, die während des Transfers von frühen zu späten Endosomen und schließlich zum Lysosom auftreten. Starke positive Ladungen verhindern, daß die lysosomotrope Gruppe die Membran-umhüllten Vesikel verläßt, wodurch der Agens/Rezeptor-Komplex in dem Gefäß eingefangen ist.

Ammoglycosid-Antibiotika sind in ihrer Struktur ähnlich, werden aber in strukturell verwandte Familien von Verbindungen auf der Grundlage der Zuckereinheiten eingeteilt. Jede der Familien der Aminoglycosid-Antibiotika, sowie repräsentative Mitglieder davon, werden in den Fig. 2-5 dargestellt. Diese Familie schließen Gentamicin, Kanamycin, Neomycin und Streptomycin ein. Die Gentamicin-Familie schließt Gentamicin-C&sub1;, Gentamicin-C&sub2;, Gentamicin-C1a, Sisomicin und Netilmicin ein; die Kanamycin-Familie schließt Kanamycin A, Tobramycin und Amikacin ein; die Neomycin-Familie schließt Neomycin B, Paromomycin, Ribostamycin und Bytirosin B ein; und die Streptomycin-Familie schließt Streptomycin A und Streptomycin B ein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegende Erfindung ist die Umleitgruppe Gentamicin, die in den Lysosomen in Konzentrationen bis zum 300-fachen der extrazellulären Konzentration akkumuliert (J. Pharmacol. Exp. Ther. 255: 867-74, 1990; Ren. Fail. 14: 351-7, 1992).

Geeignete Aminoglycoside haben reaktive Aminogruppen, die in der Lage sind, durch Peptid- oder andere chemische Linker gekoppelt zu werden. Daher kann eine Zielgruppe bequemerweise über eine kovalente Verknüpfung an diese Umleitgruppen unter Verwendung von einer von mehreren auf dem Gebiet bekannten Techniken angehängt werden, um kovalente Bindungen zu bilden, zum Beispiel unter Verwendung von Thioether-, Disulfid-, Ether-, Ester- und Peptid-Bindungen. Da viele der Aminoglycosid-Antibiotika mehrere Amine haben, die in einer Konjugationsprozedur derivatisiert werden könnten, kann ein primäres Amin, das in diesen Verbindungen enthalten wird, selektiv umgesetzt werden, um das kovalente Anhängen an die Zielgruppe durch dieses Amin zu begünstigen (siehe das Amin, das mit einem Pfeil in den Fig. 2-4 angezeigt wird). Im Hinblick auf Streptomycin kann das kovalente Anhängen an die Zielgruppe durch Umwandeln der Aldehydgruppe, die in Fig. 5 angezeigt wird, in ein Amin und durch Anhängen der Zielgruppe unter Verwendung von Carbodiimid oder einer anderen geeigneten aktivierten Carbonsäure erreicht werden. Aminoglycoside sind wasserlöslich und binden nicht leicht an andere Proteine und verleihen daher einem rezeptormodulierenden Agens keine unspezifische Bindung.

Besonders bevorzugte Aminoglycoside schließen diejenigen ein, die eine präferentielle Derivatisierung eines ausgewählten Amins ermöglichen. Insbesondere schließen bevorzugte Aminoglycoside diejenigen Verbindungen ein, denen Schutzgruppen an verschiedene Stickstoffatome angefügt werden können und bei denen darauffolgend selektiv die Schutzgruppen entfernt werden können, um ein einzelnes freies Amin zu ergeben. Das freie Amin kann weiter durch beispielsweise Zugabe eines Peptidlinkers derivatisiert werden oder kann direkt an die Zielgruppe kovalent angehängt werden. Diese Umleitgruppen schließen Ribostamycin (siehe Fig. 4), Kanamycin (siehe Fig. 3), Amikacin und Streptomycin ein. Ribostamycin wird besonders bevorzugt aufgrund seiner relativ niedrigen Toxizität und seiner Derivatisierungschemie, die es ermöglicht, daß eine Acylwanderungsreaktion auf einem Hydroxylgeschützten Ribostamycin durchgerührt werden kann, um ein einzelnes Amin-Addukt zu ergeben. Kanamycin kann ebenso bei einer selektiven Schutz/Acylierungsreaktion verwendet werden; Amikacin ist kommerziell in einer Form erhältlich, die das Anhängen ohne Entfernen der Schutzgruppen von seinen Aminen oder Alkoholgruppen ermöglicht; und Streptomycin kann ebenso in leichter Weise durch Protonieren von Guanidin-Gruppen unter physiologischen Bedingungen derivatisiert werden, um die Polykationen bereitzustellen, die für das Zurückhalten in der Zelle oder dem Lysosom notwendig sind.

Unter einem anderen Aspekt der vorliegende Erfindung sind lysosomotrope Verbindungen, die Nicht-Aminoglycoside sind, die sich nach einer intrazellulären Protonierung ansammeln können, ebenso geeignete Umleitgruppen (siehe Fig. 6). Geeignete Nicht-Aminoglycosid- Verbindungen, die diese Eigenschaft aufweisen, sind auf dem Gebiet bekannt, eine Reihe von Aminoacridin- und Aminochinolin-Farbstoffen, die durch Chloroquin und Quinacrin typifiziert werden; eine Gruppe von Aminonaphthalinen, typifiziert durch Dansyl-Cadaverin und Derivate davon. Solche Farbstoffe sind durch ein Zurückhalten in der Zelle und durch eine geringe Toxizität charakterisiert. Alle diese Verbindungen haben charakteristische Stellen zum kovalenten Anhängen an eine Zielgruppe über den in Fig. 6 angezeigten Stickstoff und können daran, wie oben beschrieben, angehängt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegende Erfindung verwendet ein lysosomotropes Peptid, das einer Ladungsmodifizierung unter intrazellulären Bedingungen unterliegt, wenn es als eine Umleitgruppe verwendet wird. Wenn die Ladungsmodifizierung stattgefunden hat, wirkt das Umleitpeptid dahingehend, daß es den Agens/Rezeptor-Komplex in dem intrazellulären Vesikelsystem zurückhält, bis der Membranfluß es an das Lysosom zum Abbau abliefert. Bevorzugt sind diese Peptide in der Lage, durch intrazelluläre Proteinkinasen phosphoryliert zu werden. Wenn durch die intrazellulären Enzyme phosphoryliert, wären solche Peptide stark anionisch.

Ein Zurückhalten auf Ladungsbasis kann eine inhärente Eigenschaft des Umleitpeptids sein oder kann durch eine intrazelluläre Modifizierung verliehen werden. Eine intrazelluläre Modifizierung kann durch eines von mehreren auf dem Gebiet bekannten Mitteln erzielt werden, einschließlich der Phosphorylierung von bestimmten Resten von einigen Rezeptoren (z. B. dem EGF-Rezeptor), die ein intrazelluläres Umleiten verursachen kann (Cancer Treat. Res. 61: 139-160, 1992: J. Cell. Biol. 116: 321-30,1992).

Die Umleitpeptide können kovalent an eine Zielgruppe durch ein beliebiges Mittel angehängt werden, einschließlich zum Beispiel dem kovalenten Verknüpfen des Peptids direkt an die Zielgruppe oder durch Verwenden einer geeigneten Linkergruppe, wie etwa G-G-G, die derivatisiert und kovalent an die Zielgruppe angehängt werden kann.

Bevorzugte Umleitpeptide schließen Proteinkinase-Substrat-Peptide ein, die ein Serin beinhalten. Diese Peptide sind besonders bevorzugt zum Verstärken des Rezeptor-Umleitens in Tumor-Zielzellen, die erhöhte Konzentrationen an Proteinkinaseaktivität für Serine oder Tyrosine haben. Erhöhte Konzentrationen an Kinaseaktivität innerhalb von Tumorzellen kann auf die Anwesenheit von Onkogenprodukten, wie etwa H-ras, auf der cytoplasmatischen Seite der Tumorzell-Plasmamembran zurückgerührt werden (C. I. B. A. Found. Symp. 164: 208-18, 1992).

Geeignete Umleitpeptide schließen ebenso Proteinkinase-Substrate und -Peptide ein, die eine einzelne positive Ladung besitzen. Letzerer Typ des Umleitpeptids kann ein Ionenpaar mit einem "Glutamat-artigen" Rest eines angehängten oder eng damit verbundenen Restes (Reste) des Rezeptor bilden. Besonders bevorzugte Umleitpeptide können aus den in Tabelle 4 identifizierten Proteinen und Aminosäuren unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Technologien hergeleitet werden.

Tabelle 4

Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Umleitgruppe ein lysosomotroper Aminosäureester, der in hoher Konzentration die Lyse von Granula-enthaltenden Zellen verursachen kann, wie etwa NK-Zellen, cytolytischen T-Zellen and Monocyten. Die Konzentration muß im allgemeinen unter 100 mM gehalten werden, um Lyse zu verhindern. Geeignete lysosomotrope Aminosäureester und ihre Ursprünge werden in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Die lysosomotropen Aminosäureester, die in Tabelle 5 identifiziert werden, können verwendet werden, um den Agens/Rezeptor-Komplex nach Intrazellulärer Spaltung des Esters in Lysosomen zurückzuhalten. In einer Ausführungsform können solche Aminosäureester als der C-terminale Teil eines größeren Peptids, das eine Linkersequenz und/oder eine Phosphorylierungssubstratsequenz enthält, und mit geeigneten Resten, wie etwa Cystein, zum kovalenten Anhängen an eine Zielgruppe, wie etwa eine Sequenz, die für einen Peptid- oder Proteinligand für einen gegebenen Zelloberflächenrezeptor kodiert, verwendet werden.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine zweite funktionelle Klasse von Umleitgruppen offenbart. Diese Klasse schließt Peptide ein, die eine Polymerisierung innerhalb von Endosomen oder Lysosomen durchlaufen, was ihre Passage durch intrazelluläre Membranen verhindert.

Intrazelluläre Polymerisationsverbindungen können in ein größeres Peptid eingebaut werden, das die Zielgruppe und einen Linker enthält. Geeignete Peptide schließen den Dipeptidester ein, auf den in Tabelle 5 verwiesen wird (d. h. L-Leucyl-L-Leucin-O-Me). Nach Transport in Zellen akkumulieren diese Dipeptidester bevorzugt in Lysosomen und sekundären Granula von cytotoxischen Zellen. Diese Dipeptide durchlaufen ebenso eine Selbstassoziierung und Polymerisation, was zu einem Einfangen bei niedrigen Konzentrationen und einem Membranbruch bei höheren Konzentrationen führt.

TABELLE 6 POLYMERISATIONS-DIPEPTIDESTER: L-LEUCYL-L-LEUCIN-0-ME

J. Invest. Dermat. 99: 805-825, 1992

J. Clin. Invest. 84: 1947-56, 1989

Transpl. 53: 1334-40, 1992

J. Immunol. 138: 51-7, 1987

J. Immunol. 148: 3950-7, 1992

J. Immunol. 136: 1038-48, 1986

Cryobiology 29: 165-74, 1992

Acta. Biochem. Biophys. Hung 24: 299-311, 1989

Blood 79: 964-71, 1992

Blood 78: 2131-8, 1991

J. Immunol. 139: 2137-42, 1987

J. Exp. Med. 172: 183-194, 1990

J. Clin. Invest. 78: 1415-20, 1986

PNAS 87: 83-7, 1990

J. Immunol. 137: 1399-406, 1986

PNAS 82: 2468-72, 1985

Geeignete intrazelluläre Polymerisationsverbindungen schließen ebenso Peptide ein, die zu alpha-helikalen Strukturen, die als "Leucin-Reissverschlüsse" ("Leucin-Zipper") bezeichnet werden, assoziieren können. Im Kontext dieser Erfindung können solche Strukturen verwendet werden, um intrazelluläre Polymere zu bilden, die nicht in der Lage sind, aus intrazellulä ren Vesikeln auszutreten. Solche Sequenzen können ausgewählt werden durch Beobachten der Selbstassoziierung der Verbindungen in Lösung und der Bildung von Polymeren, die in der Lage sind, an DNA zu binden. Geeignete Peptidsequenzen, die zu alpha-helikalen Strukturen selbstassoziieren können, werden in Tabelle 7 dargestellt.

TABELLE 7 LEUCIN-REISSVERSCHLÜSSE

Boc(t-butoxycarbonyl)-Aib(alpha-aminoisobutryl)

Glu(OBnI)-(benzoylester)-Leu-Aib-Ala-Leu-Aib-Ala- Boc-Aib-Leu-Aib-Aib-Leu-Leu-Aib-Leu-Aib-CD-Me

Proteins 12: 324-30, 1992

Lys(Z)(benzyloxy-carbonyl)-Aib-O-Me

PNAS 87: 7921-5, 1990

GELEELLKHLKELLKGER

Biochem. 31: 1579-84, 1992

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine dritte funktionelle Klasse von Umleitgruppen offenbart. Diese Klasse schließt Gruppen ein, die durch intrazelluläre Rezeptoren erkannt werden können. Solche Sequenzen werden anhand ihrer Fähigkeit identifiziert, die Bewegung von endogen synthetisierten Proteinen zur Zelloberfläche anzuhalten. Geeignete Peptide schließen bestimmte Peptidsequenzen, (wie etwa Sortier- oder Signal Sequenzen) ein, die mit dem Wandern ('trafficking') von endogen synthetisierten Proteinen assoziiert sind (Our. Opin. Cell. Biol. 3: 634-41, 1991). Solche Peptidsequenzen führen nach kovalenten Anhängen an den C-Terminus einer exogen zugegebenen Zielgruppe zum Zurückhalten der Agens-Rezeptor-Komplexe im endoplasmatischen Retikulum ("ER"), Golgi Apparat oder den Lysosomen.

Solche Peptidsequenzen werden durch intrazelluläre Rezeptoren erkannt, von denen Beispiele sowohl Säugetier- als auch bakterielle Versionen der ER-Rezeptor einschließen, die im Detail in J. Cell. Biol. 120: 325-8, 1993; Embo. J. 11: 4187-95. 1992; Nature 348: 162-3, 1990, beschrieben sind. Weitere beispielhafte Peptidsequenzen und Varianten davon (gezeigt in Klammern) die von intrazellulären Rezeptoren erkannt werden können, werden in Tabelle 8, Abschnitten A und B, dargestellt.

Bestimmte Signalsequenzen können zum Zurückhalten durch einen Typ von Organismus gegenüber einem anderen Typ bevorzugt werden. Zum Beispiel ist REDLK eine bevorzugte Sequenz, die durch prokaryotische Zellen und zu einem geringeren Grad durch eukaryotische Zellen erkannt wird (siehe Tabelle 8, Abschnitt C). Daher können bei Verwendung dieser Sequenz als die Umleitgruppe rezeptormodulierende Agentien konstruiert werden, um selektiv einen rezeptorvermittelten Prozeß in Bakterien zu inhibieren, währen dies wenig Effekt auf Säugetierzellen hat.

Tabelle 8

Eine weitere Klasse von Peptidsequenzen dieser Erfindung, bezeichnet als "Internalisierungssignale", funktionieren, indem sie an Clathrin binden, sowohl in den coated pits als auch in denjenigen intrazellulären Vesikeln, die eine Clathrinhülle behalten. Repräsentative Beispiele von solchen Clathrin-bindenden Peptiden (CBP) werden in Tabelle 13, Abschnitt D offenbart.

Das CBP bindet an Clathrin in den coated pits, die sich anfänglich auf der Zelloberfläche befinden, was ein Zurückhalten der Zielgruppe verursacht, an die es konjugiert ist.

Eine weitere Klasse von Gruppen, die in der Lage sind, intrazelluläre Rezeptoren zu erkennen, schließt Kohlenhydrate ein. Geeignete Kohlenhydrate schließen jedes Kohlenhydrat ein, das in der Lage ist, an intrazelluläre Kohlenhydrat(CHO)-Rezeptoren zu binden, aber nicht an Zelloberflächen-CHO-Rezeptoren. Solche Kohlenhydrate schließen ein: Mannose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat. Geeignete Kohlenhydratgruppen schließen diejenigen ein, die an dem Insulin-artigen Wachstumsfaktor II/Mannose-6-phosphat (IGF II/M6P)-Rezeptor binden, schließen Analoge von Mannose-6-phosphat ein sowie andere phosphorylierte Saccharide (Carbohydrate Res. 213: 37-46, 1991: FEBS Lett. 262: 142-4,1990).

Die Affinität der Umleitgruppe kann durch Veränderungen in der chemischen Natur der phosphorylierten Saccharide variiert werden (J. Biol. Chem. 264: 7970-5, 1989; J. Biol. Chem. 264: 7962-9, 1989) (Monosaccharide binden mit der geringsten Affinität, während Di- oder Tri-Saccharide mit steigend höherer Affinität binden). Ein Clustering von phosphorylierten Sacchariden auf Proteinträgern kann die Affinität an den intrazellulären Rezeptor dramatisch erhöhen.

Die Synthese verschiedener Oligosaccharide wird in einem Übersichtsartikel dargestellt in Sem. Cell. Biol. 2: 319-326. 1991. Obwohl die Expression des Mannose-6-phosphat-Rezeptors hauptsächlich intrazellulär ist, findet eine Expression ebenso auf Zelloberflächen statt. Daher sollte im Kontext der vorliegenden Erfindung ein kovalentes Anfügen eines Kohlenhydrats, das den Mannose-6-phosphat-Rezeptor bindet, an eine Zielgruppe, so konstruiert sein, daß sich ein wenigstens 100-facher Unterschied in der Bindungsaffinität zwischen der Zielgruppe und der Umleitgruppe ergibt. Zum Beispiel hätte eine Vitamin-B&sub1;&sub2;/Transcobalamin-II- Rezeptor-Zielgruppe, in diesem Falle Vitamin-Biz, eine Bindungsaffinität für das Trägerprotein, Transcobalamin II (TcII) von ≥ 10&supmin;¹&sup0; M und eine Affinität für den IGF II/M-6-P- Rezeptor von 10&supmin;&sup8; M oder weniger. Dies wird die Spezifität der Vitamin-B&sub1;&sub2;-Bindung (über TcII) aufrecht erhalten, während ein Transfer des rezeptormodulierenden Agens von dem Serum-M-6-P-löslichen Rezeptor zu einem Zelloberflächenrezeptor ermöglicht wird.

Zusätzlich zu IGF II/M-6-P-Rezeptorgruppen fördern andere Umleingruppen auf Kohlenhydratbasis ebenso das Zurückhalten des modulierenden Agens/Rezeptor-Komplex im ER oder dem Golgi-Komplex. Solche Gruppen beruhen auf der Erkennung durch verschiedene Glycosyltransferasen von Kohlenhydratgruppen, entweder als ein natürliches Substrat oder als ein Inhibitor. Solche Gruppen werden in einer Übersicht dargestellt in Sem. Cell. Biol. 2: 289- 308, 1991. Zum Beispiel schließen Saccharid-Erkennungsgruppen vorletzte Zucker ein, wie etwa Glucose und N-Acetylglucosamin (die natürliche Substrate sind). Bevorzugter sind jedoch Glycosylierungsinhibitoren, die von Glycosyltransferasen erkannt werden, aber nicht dazu dienen können, weitere Kohlenhydratreste an den wachsenden Ketten anzuhängen (Sem. Cell. Biol. 2: 309-318. 1991) (siehe Fig. 7).

In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine vierte funktionelle Klasse von Umleitgruppen offenbart. Diese Klasse umfaßt im allgemeinen Umleitgruppen, die den Rezeptor an die Zellmembran verankern. Beispielsweise schließt diese Klasse Membranbindungspeptide ein, die eine bedingte, pH-abhängige Membranbindung aufweisen. Solche Peptide weisen einen α-helikalen Charakter in Säure auf, aber nicht in neutralen pH- Lösungen. Wenn ein konditionelles Membranbindungspeptid eine hellikale Konfirmation bei einem sauren pH annimmt, bekommt es die Eigenschaft der Amphiphilie (z. B. hat es sowohl hydrophobe als auch hydrophile Grenzflächen). Genauer bildet ein solches Peptid innerhalb eines pH-Bereichs von näherungsweise 5,0-5,5 eine α-helikale amphiphile Struktur, die das Einfuhren des Peptids in eine Zielmembran erleichtert. Eine α-Helix-induzierte saure pH- Umgebung kann zum Beispiel in der Niedrig-pH-Umgebung gefunden werden, die in zellulären Endosomen oder Lysosomen vorliegt. In wäßriger Lösung bei physiologischem pH wird ein konditionelles Membranbindungspeptid entfaltet (aufgrund einer starken Ladungsabstoßung zwischen geladenen Aminosäureseitenketten) und ist nicht in der Lage, mit Membranen zu wechselwirken.

Geeignete konditionelle Membranbindungspeptidsequenzen schließen die geladenen Aminosäuren Glutamat, Aspartat und Histidin ein. Ein bevorzugtes konditionelles Membranbindungspeptid schließt diejenigen mit einem hohen prozentualen Anteil an Helix-bildenden Resten, wie etwa Glutamat, Methionin, Alanin und Leucin ein. Weiterhin schließen konditionelle Membranbindungspeptidsequenzen ionisierbare Reste mit pKas innerhalb des Bereichs von pH 5-7 ein, so daß eine hinreichend ungeladene Membranbindungsdomäne innerhalb des Peptids bei pH 5 vorhanden sein wird, um ein Einrühren in die Zielzellmembran zu ermöglichen. Konditionelle Membranbindungspeptide können durch kovalente Bindungen an eine chemische oder Peptid-Zielgruppe eingebaut werden oder als eine gesamte Peptidsequenz, einschließlich eines Linkers und einer Peptid-Zielgruppe, synthetisiert werden.

Ein besonders bevorzugtes konditionelles Membranbindungspeptid ist aa1-aa2-aa3- EAALA(EALA)&sub4;-EALEALAA-Amid, das eine Modifizierung einer publizierten Peptidsequenz darstellt (Biochemistry 26: 2964, 1987). Innerhalb dieser Peplidsequenz ist der erste Aminosäurerest (aaI) bevorzugt ein einzigartiger Rest, wie etwa Cystein oder Lysin, das die chemische Konjugation des konditionellen Membranbindungspeptids an ein Zielprotein erleichtert. Das Peptid kann ebenso in ein Fusionsprotein mit einer Protein- oder Peptid- Zielgruppe eingebaut werden (siehe Beispiel 7). Die Aminosäurereste 2-3 (d. h. aa2-aa3) können ausgewählt werden, um die Affinität des translozierenden Peptids für unterschiedliche Membranen zu modulieren. Zum Beispiel wird, wenn beide Reste 2 und 3 Lysin und Arginin sind, das Peptid die Fähigkeit haben, an Membranen oder Bereiche von Lipiden zu binden, die eine negative Oberflächenladung haben. Wenn die Reste 2-3 neutrale Aminosäuren sind, wird das Peptid sich in neutrale Membranen einbauen.

Noch ein anderes bevorzugtes konditionelles Membranbindungspeptid kann aus Sequenzen von Apo-Lipoprotein A-1 und B abgeleitet werden; Peptid-Toxine, wie etwa Melittin, Bombolittin, Delta-Hämolysin und die Pardaxine; Antibiotika-Peptide, wie etwa Alamethicin; Peptidhormone, wie etwa Caicitonin, Corticotropin-Freisetzungsfaktor, Beta-Endorphin, Glucagon, Nebenschilddrüsenhormon und Pancreas-Polypeptid. Solche Peptide binden normalerweise an Membranen bei physiologischem pH, aber, duch Anhängen von Substituenten, können die Peptide in ihrer Fähigkeit, alpha-Helices bei saurem pH zu bilden, verstärkt werden und in ihrer Membranbindung bei physiologischem pH verringert werden. Ein Beispiel eines solche modifizierten Peptids mit pH-abhängiger Membranbindung bei saurem pH ist vollständig succinyliertes Melittin. In diesem Beispiel wird ein Peptid (Melittin), das normalerweise an Membranen bei physiologischem pH bindet, in ein pH-abhängiges Peptid durch Succinylierung von Lysinen umgewandelt. Nach der Succinylierung weist das Peptid einen amphipatischen Charakter nur bei sauren pHs auf.

Das Einführen eines konditionellen Membranbindungspeptids in eine Ziel-Zellmembran wird verstärkt durch Stabilisierung der amphiphilen α-Helix. Eine Helixstabilisierung kann erreicht werden: (1) durch Hinzufügen von sich wiederholenden "EALA"-Einheiten, um ein längeres Peptid zu bilden; (2) durch Anbringen eines Amids an den C-Terminus des Peptids, um dem helikalen Dipol entgegenzuwirken; (3) durch Polymerisieren des Peptids; (4) durch Substituieren eines natürlichen Helixbildners mit einem oder mehreren der gestapelten Glutamate; oder (5) durch Anhängen des Peptids an eine Zielgruppe durch Verwendung eines längeren Linkers, um eine hinreichende Distanz zwischen dem Membranbindungspeptid und der Zielgruppe für das Peptid bereitzustellen, um mit den intrazellulären Zielzellmembranen wechselzuwirken.

In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine fünfte funktionelle Klasse von Umleitgruppen offenbart. In diesem Kontext funktioniert die Umleitgruppe nur als ein modulierendes Agens dahingehend, daß die Gruppe die Rezeptoren außer Kraft setzt, indem sie dieselben quervernetzt. Diese Klasse schließt bi- oder multivalente Rezeptor- Quervernetzungsgruppen ein, die aus monovalenten Bindungszielgruppen gebildet werden. Das Quervernetzen von Rezeptoren in einigen Rezeptorsystemen reicht aus, um ein Umleiten von Zelloberflächenrezeptoren zu Lysosomen zum Abbau zu verursachen, anstelle ihres normalen Wegs der Rezeptor-Rückkehr. Die Synthese eines bivalenten rezeptormodulierenden Agens wird in größeren Einzelheiten in den Beispielen unten beispielhaft veranschaulicht.

Ein bevorzugtes quervernetzendes rezeptormodulierendes Agens ist ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimer. Bei dieser Ausführungsform wirkt jedes Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül als ein Zielagens und ein Umleitagens; Quervernetzen des Bis-Dimers wird die Vitamin-B&sub1;&sub2;-Rezeptoren quervernetzen, wodurch der Rezeptor-Wander-Weg behindert wird. Ein bevorzugtes Vitamin-B&sub1;&sub2;-Dimer umfaßt im allgemeinen zwei Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküle, wie etwa Cyanocobalamin, gekoppelt durch einen oder mehrere Linker durch Kopplungsstellen, die unabhängig ausgewählt sind aus a-g, h (Ribose) und i (Benzimidazol). Bevorzugt findet das Quervernetzen zwischen den d- oder e- Kopplungsstellen an beiden Molekülen statt. Das Dimer muß in der Lage sein, einen B&sub1;&sub2;/TcII- Komplex zu bilden. Wie oben bemerkt, kann diese Eigenschaft unter Verwendung von einer aus mehreren auf dem Gebiet bekannten Techniken getestet werden, einschließlich kompetitiver Bindungsassays.

Ein Vitamin-B&sub1;&sub2; kann an ein zweites Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül auf dieselbe Weise gekoppelt werden, wie im Detail für die Konjugation von Umleitgruppe an Vitamin-B&sub1;&sub2;-Zielgruppen beschrieben. Wie oben bemerkt, können die Dimere unter Verwendung von einem oder mehreren Linkern verschiedener Länge und einer beliebigen Kombination von homobifunktionellen, heterobifunktionellen, homotrifunktionellen oder heterotrifunktionellen Linkem syn thetisiert werden. Wie oben bemerkt, ermöglicht die Verwendung eines trifunktionellen Linker das Koppeln mit einer beliebigen Anzahl von zusätzlichen Gruppen.

Bei der Auswahl eines Linkers für die Dimer-Synthese sollte darauf geachtet werden, daß die Gesamtzahl von Atomen, die den Linker zwischen den Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekülen umfassen, im allgemeinen größer als 10 Atome sein sollte, typischerweise im Bereich von 30 bis 55 Atomen sein sollte und bevorzugt 45 Atome sein sollte. Wie oben bemerkt, wird ein Fachmann auf dem Gebiet erkennen, daß, obwohl die Anzahl an Atomen relativ in Bezug auf eine lineare Kette von Atomen berechnet wird, linearkettige verzweigtkettige und zyklischkettige Linker oder Kombinationen davon geeignet wären. Daher würde die Struktur der Atomkette in einem Linker beispielsweise Alkyl, Heteroalkyl, Alkylaryl und Heteroalkylaryl einschließen.

Beispielsweise kann ein Dimer durch Kombinieren von zwei unterschiedlichen Vitamin-B&sub1;&sub2;- Linker-Addukten in der Anwesenheit eines Kopplungsmittels synthetisiert werden. Die Linker koppeln, und die Dimere können dann getrennt und aufgereinigt werden unter Verwendung derselben Verfahren, die oben dargestellt sind.

Alternativ kann aktiviertes Vitamin-B&sub1;&sub2; einfach mit einem homobifunktionellen oder homotrifunktionellen Linker (Tabellen 1 und 3) kombiniert werden. Bevorzugt sollte in dieser Ausführungsform das Verhältnis von Vitamin-B&sub1;&sub2; zu Linker im Bereich von 2 : 1 sein. Bevorzugt wird ein 1 : 1-Verhältnis zur Herstellung von gemischten Dimeren (z. B. b- und e- Säurederivaten) oder gemischten Liganden (z. B. B&sub1;&sub2; und Hormon) verwendet. Die Dimere können getrennt und aufgereinigt werden, wie oben ausgeführt.

In noch einer anderen Alternative können Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukte, die wie oben beschrieben synthetisiert worden sind, durch einen dritten Linker gekoppelt werden. Der dritte Linker, ein "Quervernetzer" dient dazu, die Linker auf den Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukten zu überbrücken. Geeignete Quervernetzer schließen diejenigen ein, die in Tabellen 1, 2 und 3 erwähnt sind.

Die Polymerisierung von Peptiden kann erreicht werden durch Einbringen eines Cysteinrests an jedem Ende eines Peptids, gefolgt von einer Oxidation unter Verwendung von gelöstem Sauerstoff oder einem anderen milden Oxidationsmittel, wie etwa oxidiertem Glutathion. Die durchschnittliche Länge eines polymerisierten Peptids kann kontrolliert werden durch Variieren der Polymerisationsreaktionsbedingungen.

Die Aminosäuresequenz von jedem der Peptide dieser Erfindung kann so ausgewählt werden, daß sie alle L-Aminosäuren oder alle D-Aminosäuren mit einem Seitenketten-pKa von 5,0 bis 9,0 einschließt. D-Aminosäuren können vorteilhafterweise verwendet werden, um nichtproteolysierbare Peptide zu bilden, da die D-Aminosäuren nicht innerhalb der Zelle metabolisiert werden. Weiterhin können die Peptide der vorliegenden Erfindung eine Kombination aus L- und D-Aminosäuren einschließen, wobei D-Aminosäuren gegen L-Aminosäuren auf beiden Seiten einer proteolytischen Spaltstelle ausgetauscht sind. Ein noch weiteres bevorzugtes nicht-spaltbares Peptid beinhaltet Peptidbindungsanaloge, die gegenüber einer proteolytischen Spaltung durch zelluläre Enzyme nicht empfindlich sind.

Wie oben diskutiert, umfassen die rezeptormodulierenden Agentien dieser Erfindung eine Zielgruppe, gekoppelt an die Umleitgruppe. Die Umleitgruppen, die oben identifiziert sind, können kovalent an die Zielgruppe durch eine aus mehreren auf dem Gebiet bekannten Techniken angehängt werden, einschließlich (a) mittels chemischer Modifizierungen, wie etwa eine Disulfidbildung, Thioetherbildung, Amidbildung oder eine reduzierte oder nichtreduzierte Schiffsche Base, (b) durch direkte Peptidbindungsbildung, wie in einem Fusionsprotein, oder (c) durch Verwendung eines chemischen und Peptidlinkers. Geeignete Peptidlinker in dieser Hinsicht entsprechen zwei oder mehreren Aminosäureresten, die es dem Umleitpeptid ermöglichen, seine aktive Konfirmation zu erlangen, unabhängig von seiner Wechselwirkung mit der Zielgruppe, und die eine hinreichende Distanz für einen Zugang der Umleitgruppe an zum Beispiel intrazelluläre Membranen von der Peptidanhängungsstelle auf der Zielgruppe ermöglichen.

In einer Ausführungsform kann eine Umleitgruppe an eine Vitamin-B&sub1;&sub2;-Zielgruppe durch eine von mehreren Mitteln konjugiert werden, einschließlich beispielsweise dem Koppeln einer Umleitgruppe an eine reaktive Gruppe auf einem Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukt; Koppeln eines Vitamin-B&sub1;&sub2; an eine reaktive Gruppe auf einem Umleitgruppen-Linker-Addukt oder einer geeigneten Seitenkette davon; Koppeln eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukts an ein Umleitgruppen-Linker-Addukt oder eine geeignete Seitenkette davon; Koppeln eines Umleitgruppen/Biotinbindungsprotein-Konjugats an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat; oder Koppeln eines Umleitgruppen-Biotin-Konjugats an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Bindungsprotein-Konjugat.

Das Koppeln einer Umleitgruppe an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukt oder eines Vitamin-B&sub1;&sub2; an ein Umleitgruppen-Linker-Addukt kann erreicht werden unter Verwendung derselben Techniken, die oben für das Koppeln eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküls mit einem Linker dargestellt worden sind. Die einzige wesentliche Überlegung dieses Aspekts der Erfindung ist, daß die gesamte Linkerlänge ausreichend sein muß, um eine sterische Behinderung zu verhindern. Bevorzugt ist die gesamte Linkerlänge wenigstens 6 Atome.

Das Koppeln eines Umleitgruppen/Biotin-Bindungsprotein-Konjugats an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;- Biotin-Konjugat kann erreicht werden unter Verwendung eines von mehreren Mitteln, die im Detail in Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, ed. D. Savage, Pierce Chemicsal Co., 1992 beschrieben worden sind. In Kürze, ein Biotin-Bindungsprotein-Konjugat wird hergestellt unter Verwendung einer Umleitgruppe oder, wie in einer zweiten Ausführungsform, eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküls. Geeignete Biotin-Bindungsproteine schließen Avidin oder Streptavidin ein. Unter gewissen Umständen kann ein Linker verwendet werden, um die Moleküle zu beabstanden. Zum Beispiel wird beim Koppeln eines Vitamin-B&sub1;&sub2; an ein Avidin ein Linker von wenigstens 6 Atomen bevorzugt.

Ein Biotin-Konjugat wird hergestellt unter Verwendung eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Moleküls oder, wie in einer zweiten Ausführungsform, einer Umleitgruppe. Beispielsweise wird ein Vitamin- B&sub1;&sub2;-Molekül mit einem NHS-Ester von Biotin kombiniert. Bevorzugt ist das Vitamin-B&sub1;&sub2;- Molekül ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukt, wie oben beschrieben. Noch bevorzugter ist das Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Linker-Addukt, gekennzeichnet durch einen 12- atomigen linearen Linker, gekoppelt an die d- oder e-Kopplungsstelle.

Nach der Formulierung wird das Koppeln zwischen den Biotin-Konjugaten und den Biotin- Bindungsprotein-Konjugaten in leichter Weise durch Kombinieren der komplementierenden Konjugate, d. h. eines Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugats mit einem Umleitgruppen/Avidin- Konjugat, erreicht.

Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat verwendet, um ein Vitamin-B&sub1;&sub2; an eine Anzahl von Verbindungen durch Biotin- Bindungsprotein-Konjugate zu koppeln. Unter Verwendung eines Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin- Konjugats kann eine beliebige Verbindung, die in der Lage ist, ein Biotin-Bindungsprotein zu koppeln, an ein Vitamin-B&sub1;&sub2; gekoppelt und dadurch in Zellen, die den Vitamin-B&sub1;&sub2;-Rezeptor exprimieren, internalisiert werden. Solche Verbindungen schließen ein, zusätzlich zu den Umleitgruppen, die im Detail unten beschrieben sind, Hormone, Enzyme, Antikörper oder Fragmente davon, Marker oder Therapeutika. Das Koppeln einer beliebigen dieser Verbindungen an ein Biotin-Bindungsprotein, wie etwa Avidin oder Streptavidin, kann unter Verwendung von Techniken, die im Detail in Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, ed. D. Savage, Pierce Chemical Co., 1992 beschrieben sind, erreicht werden.

Unter einem Aspekt dieser Ausführungsform ist ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat an ein Therapeutikum/Avidin-Konjugat gekoppelt, das auf neoplastische Krankheiten gerichtet ist. Therapeutika für neoplastische Krankheiten, die an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat durch Avidin gekoppelt werden können, schließen Doxorubicin, Daunorubicin, Etoposid, Teniposid, Vinblastin, Vincristin, Cyclophophamid, Cisplatin und Nucleosid-Antimetabolite, wie etwa Arabinosylcytosin, Arabinosyladenin und Fludarabin, ein.

Unter einem anderen Aspekt dieser Ausführungsform wird ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat an einen Marker gekoppelt, der mit einem Biotin-Bindungsprotein konjugiert ist. Geeignete Marker schließen beispielsweise fluoreszierende Moleküle oder radioaktiv markierte Moleküle ein. Diese Kombination kann als ein Nachweissystem verwendet werden, das in eine Screening-Vorrichtung eingebaut ist, um Patienten mit Zellen, die wenig Rezeptor tragen, zu identifizieren, oder bei der Bewertung einer Rezeptor-Hochregulierung zum Beispiel nach einer Behandlung von Patienten auf irgendeine Rezeptormodulierungskrankheit aus einer großen Vielzahl von Rezeptormodulierungskrankheiten.

Unter einem anderen Aspekt dieser Ausführungsform wird ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin-Konjugat an eine Radioisotop gekoppelt, das an ein Biotin-Bindungsprotein konjugiert ist. Geeignete Radioisotope schließen alle hochenergetisch emittierenden Radioisotope ein, die in der Lage sind, ein Biotin-Bindungsprotein zu konjugieren. Diese Kombination kann als ein zielgerichtetes Radiodiagnostikum oder Radiotherapeutikum verwendet werden.

Unter einem noch weiteren Aspekt dieser Ausführungsform wird ein Vitamin-B&sub1;&sub2;/Biotin- Konjugat verwendet, um Vitamin-B&sub1;&sub2; an eine feste Matrix oder ein Avidin-beschichtetes Substrat zu immobilisieren. Beispielsweise würde dies ermöglichen, TcII, TcII-Rezeptoren zu isolieren und die Kopplungsstellen auf dem Vitamin-B&sub1;&sub2; zu bestimmen.

Die rezeptormodulierenden Agentien dieser Erfindung regulieren rezeptorabhängige biologische Antworten durch Veränderungen in dem Rezeptor-Wander-Weg. Wie in Fig. 1 dargestellt, unter spezifischem Bezug auf den Rezeptor für Vitamin-B&sub1;&sub2;, sind Zelloberflächenrezeptoren oft mit Clathrin-coated pits assoziiert. Bei Bindung an das rezeptormodulierende Agens der vorliegenden Erfindung schnüren sich die coated pits ein, um Vesikel zu bilden. Die Vesikel werden dann durch das Umleitmittel an Lysosomen zum Rezeptorabbau geleitet oder an Endosomen abgegeben, wo das Umleitmittel fest bindet oder den Agens/Rezeptor- Komplex aufhält. Daher können die rezeptormodulierenden Agentien die Rezeptoren, welche normalerweise ein Recycling durchlaufen, außer Kraft setzen.

Neu synthetisierte Rezeptoren werden schließlich den Internalisierten Rezeptor auf der Zelloberfläche ersetzen. Dieser Prozeß ist jedoch bei weitem zeitraubender als das Recycling - viele Zellen benötigen Stunden oder Tage, um eine maximale Rezeptor-Re-Expression zu erzielen. Ein fortlaufendes Aussetzen der Zelle gegenüber den rezeptormodulierenden Agentien wird die intrazellulären Rezeptor-Pools erschöpfen. Daher kann durch Modulieren eines Plasmamembranrezeptors eine Re-Expression des Rezeptors deutlich verzögert werden, wodurch eine biologische Antwort, die mit diesen Rezeptor assoziiert ist, für eine verlängerte Zeitperiode reguliert wird.

Die biologische Aktivität von rezeptormodulierenden Agentien der vorliegenden Erfindung kann in vitro durch eine von mehreren auf dem Gebiet bekannten Mitteln bestimmt werden, einschließlich Kompetitionsbindungsassays oder Zellproliferationsstudien. Diese Techniken werden im Detail in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, 3rd Edition, ed. Burdon and von Knippenberg. Elsevier, 1987 beschrieben. Beispielsweise kann ein rezeptormodulierendes Agens mit einer geeigneten Zelllinie kultiviert werden, wie etwa K562-Zellen (ATCC CCL 243), unter Bedingungen, die in vivo-Bedingungen darstellen. Solche Bedingungen würden das Bereitstellen einer menschlichen Quelle von Teil (wie etwa menschlichem Serum), Vitamin-B&sub1;&sub2; und bevorzugt das sorgfältige chromatographische Entfernen von dem gesamten TcII aus anderen Medienzusätzen einschließen, so daß die Proliferation nur von einer bekannten Menge von exogenem Teil abhängt. Die Zellkulturen, die an Vitamin-B&sub1;&sub2; verarmt sind, verlieren allmählich ihre proliferative Fähigkeit, was schließlich zum Zelltod führt. Die biologische Aktivität kann in vivo unter Verwendung von Techniken, die im Detail in Shieh et al., J. Immunol. 152(2): 859-866, 1994 beschrieben sind, bewertet werden, bei denen menschliche Tumorzellinien in nackte Mäuse injiziert werden, gefolgt von einer Therapie mit rezeptormodulierenden Agentien. Als nächstes werden die Tumorzellen entfernt, Einzelzellsuspensionen hergestellt, und die TcII-Zelloberflächenrezeptordichte kann durch Flußcytometrie und biotinyliertes Vitamin-B&sub1;&sub2; und Avidin-FITC bewertet werden.

Das rezeptormodulierende Agens der vorliegenden Erfindung kann in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden, um eine Vielzahl von Störungen zu behandeln, die dadurch charakterisiert sind, daß die Kontrolle des Krankheitsprozesses oder die Symptome durch eine Modulierung von einem oder mehreren Rezeptorsystemen und den damit assoziierten biologischen Antworten erzielt werden kann. Solche Krankheiten schließen neoplastische Krankheiten, Autoimmunkrankheiten, rheumatische Arthritis, kardiovaskuläre Krankheiten und neurodegenerative Krankheiten ein.

Bei vielen nicht-neoplastischen Krankheitsprozessen ist ein Stadium gemeinsam, bei dem der Krankheitsprozeß selbst oder seine Symptome durch die Verwendung eines antiproliferativen Mittels, wie etwa Vitamin-B&sub1;&sub2;/TcII-rezeptormodulierenden Agentien, aufgehalten oder verbessert werden können. Diese allgemein anerkannten Stadien schließen eine Sensibilisierungs- oder Auslösephase ein, bei der Immunzellen, die für die Krankheit verantwortlich sind, durch Antigen-spezifische oder unspezifische Mittel angeschaltet werden, gefolgt von einer proliferativen Phase, bei der die Immunzelle hinsichtlich ihrer Anzahl expandieren, und schließlich einer symptomatischen Phase, bei der die expandierten Immunzellen einen Gewebeschaden direkt oder indirekt erzeugen. Neoplastische Krankheiten schließen beispielsweise Leukämie, Sarcom, Myelom, Carcinom, Neurom, Melanom, Krebs der Brust, der Lunge, der Leber, des Gehirns, des Colons, der Cervix, der Prostata, Hodgkinsche Krankeit und Nicht-Hodgkinsches Lymphom ein. Deswegen werden anti-proliferative chemotherapeutische Arzneien, häufig bei der Behandlung von vielen Krankheiten, die nicht Krebs sind, verwendet, sind aber hinsichtlich ihrer Verwendung auf lebensbedrohliche Situationen aufgrund ihrer assoziierten Toxizität beschränkt. Anti-proliferative Mittel, wie diejenigen der vorliegenden Erfindung (mit wenig der direkten Toxizität von chemotherapeutischen Arzneien) können in größerem Umfang verwendet werden. Genauer sind die Vitamin-Bisrezeptormodulierenden Agentien der vorliegenden Erfindung nicht für Plasmamembranprozesse (z. B. Ionentransport) schädlich. Zusätzlich ist die anti-proliferative Aktivität durch Verabreichung von Vitamin-B&sub1;&sub2; reversibel. Darüberhinaus sind die Agentien dieser Erfindung möglicherweise nicht mutagen, teratogen oder carcinogen, da sie auf dem Niveau der Plasmamembran wirken und nicht auf dem Niveau des Kerns und der DNA durch Interkalierung oder Quervernetzung (wie dies viele chemotherapeutische Arzneien tun).

Ein Verständnis der pharmazeutischen Anwendungen für B&sub1;&sub2;/TcII-rezeptormodulierende Agentien erfordert eine Kenntnis der Zelltypen, auf die mit einer solchen Therapie gezielt wird. Zu diesem Zweck werden verschiedene pharmazeutische Anwendungen in Tabelle 9 unten offenbart.

TABELLE 9

Proliferierende und aktivierte T-Zellen können eine große Vielzahl von Krankheiten verursachen, die von der chronischen Entzündung bei Morbus Crohn zu einer akuteren Organtransplantationsabstoßung reichen. Bei all diesen Krankheiten kann die T-Zelle einer zentralen pathogenen Rolle oder einen akzessorischeren Rolle dienen. Anti-proliferative chemotherapeutische Arzneien dienen dazu, die Symptome zu reduzieren, und führen in einigen Fällen zu einem langfristigem Rückfall. In ähnlicher Weise können proliferierende Fibroblasten und Epithelzellen Krankheiten verursachen, die durch ein Zellenüberwachstum charakterisiert sind. Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierende Agentien können verwendet werden, um existierenden chemotherapeutische Behandlungsschemata bei diesen Krankheiten zu ersetzen, oder mit diesen in Kombination verwendet werden. Ein wichtiger Aspekt der Verwendung von anti proliferativen Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierenden Agentien bei diesen Krankheiten ist es, sie nichl so aggressiv oder mit einem unpassenden Zeitplan aufzutragen, so daß die normalen Heilungs- (Adhäsion, Narbenbildung) oder Zellerneuerungs- (Psoriasis) Prozesse ebenso inhibiert werden. Als solche können niedrige Dosen von rezeptormodulierenden Agentien während der Heilung verwendet werden, und höhere Dosen, wenn die Heilung abgeschlossen ist. Alternativ werden die rezeptormodulierenden Agentien möglicherweise überhaupt nicht verwendet, bis nachdem die Heilung abgeschlossen ist.

Wie zuvor erwähnt, können B&sub1;&sub2;/TcII-rezeptormodulierende Agentien verwendet werden, um neoplastische Zellen an Vitamin-B&sub1;&sub2; zu verarmen. Es ist bereits gezeigt worden, daß eine ausreichende Verarmung zum Tod von rasch proliferierenden lymphoiden Neoplasmen fuhrt, wie etwa Leukämie und Lymphom. Darüberhinaus verbessert eine kurzfristige Behandlung, um eine zelluläre Verfügbarkeit dieses Nährstoffes zu verringern, in Kombination mit existierenden chemotherapeutischen Mitteln, die therapeutische Wirksamkeit merkbar.

Für feste Tumore kann eine Vitamin-B&sub1;&sub2;-Verarmung eine Cytostase und eine Differenzierung sowie Zelltod induzieren. Daher können B&sub1;&sub2;/TcII-rezeptormodulierende Agentien verwendet werden, um eine Differenzierung bei hormonell empfindlichen festen Tumoren zu induzieren. Ein Anwachsen der Anzahl an Zellen, die einen differenzierten Phänotyp exprimieren, sollte sich auch in einem Anwachsen der Expression von Hormonrezeptoren fortpflanzen. Der Hormonrezeptorstatus von Tumoren, wie etwa Brust- und Prostatakrebs, stehen in direktem Zusammenhang mit ihrer Antwort auf eine hormonelle Therapie. Entsprechend können B&sub1;&sub2;/TcII-rezeptormodulierende Agentien verwendet werden, um die Anzahl an Rezeptorpositiven Tumorzellen zu erhöhen oder um die Rezeptordichte zu erhöhen, um die Wirksamkeit einer darauffolgenden hormonellen Therapie zu verstärken.

Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierende Agentien können sowohl replizierende neoplastische als auch normale Zellen beeinflussen. Jedoch zeigen Knochenmarksvorläufer (bone marrow progenitors) eine unterschiedliche Empfindlichkeit oder Antwort. Daher können B&sub1;&sub2;- rezeptormodulierende Agentien verwendet werden, um die Empfindlichkeit von Knochenmarksvorläufern (Progenitors) zu modulieren, um ihre Widerstandskraft gegenüber den toxischen Effekten von chemotherapeutischen Agentien zu verbessern. Solche chemotherapeutischen Arzneien wirken hauptsächlich auf replizierende Zellen, wobei nicht-replizierende Zellen viel weniger empfindlich sind. Eine Verringerung der Empfindlichkeit von Vorläufern gegenüber toxischen Arzneien würde die Knochenmarksreserven erhöhen und die darauffolgende Antwort auf Kolonie-stimulierende Faktoren verbessern und höhere Dosen Chemotherapie ermöglichen oder die Pause bis zur Wiederherstellung reduzieren. Es sollte ebenso klar sein, daß solche positiven Effekte auf die Knochenmarksvorläufer als eine natürliche Konsequenz einer B&sub1;&sub2;-Rezeptortherapie für Krebs ein zusätzlicher Mechanismus ist, mit dem der therapeutische Index von chemotherapeutischen Arzneien, die nicht 5-FU und Methotrexat sind, verbessert werden kann.

Bei einer Vielzahl von Autoimmunkrankheiten, Graft-versus-host-Krankheit, ektopischer Allergie und Organtransplantation, folgt einer anfänglichen "Induktions"phase bei der der Patient gegenüber Selbst- oder Allo-Antigenen sensibilisiert wird, eine "proliferative" Phase, bei der verbotene oder nicht-regulierte Klone von B- oder T-Zellen expandiert werden. Es ist lange bekannt gewesen, daß die Behandlung mit antiproliferativen, chemotherapeutischen Arzneien nach der Induktion die Expansion von verbotenen Klone inhibieren, das Fortschreiten der Krankheit inhibieren und einen stabilen Toleranzstatus wiederherstellen kann.

Entzündung ist eine Anwendung, bei der Antikörper bereits in klinischen Versuchen verwendet werden. Das Hauptaugenmerk ruhte auf dem Inhibieren der frühen Manifestationen der Entzündung, indem ein Ansammeln oder eine Bindung von Entzündungszellen an Gefaßendothel des verletzten Gewebes inhibiert wird. Es ist ebenso allgemein anerkannt, daß die Proliferation der Zellen an der Entzündungsstelle zur Pathologie und der Zerstörung des Gewebes bei sowohl akuter als auch chronischer Entzündung beiträgt. Zu diesem Zweck sind antiproliferative chemotherapeutische Arzneien in großem Maße verwendet worden, um die Folgen einer Entzündung zu inhibieren.

Methotrexat ist eine solche Arznei, die häufig verwendet wird, um Symptome zu behandeln, die mit rheumatoider Arthritis assoziiert sind. Die Arznei wirkt dahingehend, daß sie sowohl örtlich (z. B. Synovium) als auch allgemeine Entzündung, die mit einem Fortschreiten der Krankheit assoziiert ist, reduziert. Methotrexat wirkt synergistisch mit einer Vitamin-B&sub1;&sub2;- Verarmung bei der Therapie von Leukämie. B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierende Agentien können deshalb mit Methotrexat kombiniert werden, um die Wirksamkeit bei rheumatoider Arthritis zu verbessern. Andere Methotrexat-Anwendungen schließen die Behandlung von zerstörerischer Entzündung ein, die mit chronischer Herzkrankheit und Colitis assoziiert ist.

Operation, Bestrahlung oder Chemotherapie am Abdomen wird oft durch die Entwicklung von Gewebeverklebungen kompliziert. Diese stellen ein beträchtliches klinisches Problem dar, weil sie zu einer Blockade des Darms führen und einen operativen Eingriff erfordern. Peritoneale Verklebungen entstehen als ein Resultat der Proliferation von den Zellen der peritonealen Membran, die das Abdomen auskleidet. Ein nicht-toxisches Mittel des Eingriffs in eine solche Proliferation könnte zu einer Wiederherstellung dieser normalen Zellen gegenüber homeostatischen Kontrollmechanismen und dadurch zu einer Inhibition der Bildung von Verklebungen führen. Ein ähnlicher Prozeß einer gutmütigen Proliferation und einer darauffolgenden Vernarbung ist eine Komplikation einer Operation an der Netzhaut. Das direkte Anbringen eines niedermolekularen Analogs eines Antikörper-Rezeptor-Antagonisten könnte solche behindernden Komplikationen verhindern.

Der Begriff "Behandlung", wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf das Reduzieren oder Erleichtern von Symptomen bei einem Patienten, das Verhindern der Verschlechterung oder des Fortschreitens von Symptomen, die Inhibition oder Eliminierung der Ursache oder die Verhinderung der Infektion oder Krankheit bei einem Patienten, der davon frei ist. Daher schließt zum Beispiel die Behandlung einer Infektion die Zerstörung des infizierenden Agens, die Inhibition oder Störung seines Wachstums oder Reifung, die Neutralisierung seiner pathologischen Effekte und ähnliches ein. Eine Krankheit wird "behandelt", in dem man den Mangel teilweise oder insgesamt heilt, der für die Defizienz verantwortlich ist, oder der sie heftiger macht.

Die rezeptormodulierenden Agentien der vorliegenden Erfindung werden in einer therapeutisch wirksamen Dosis verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Dosis kann durch ein in- vitro-Experiment, gefolgt von in-vivo-Studien, bestimmt werden.

Pharmazeutische Zusammensetzung, die die rezeptormodulierenden Agentien in einer Mischung mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten, können gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Verarbeitungstechniken hergestellt werden. Der Träger kann eine Vielzahl von Formen annehmen, abhängig von der Form der Zubereitung, die zur Verabreichung erwünscht ist (z. B. intravenös, oral topisch, aerosol, Zäpfchen, parenteral oder spinale Injektion). Bevorzugt erfolgt die Verabreichung über eine stereotaktische Injektion.

Die folgenden Beispiele werden zu Erläuterungszwecken, nicht zur Beschränkung dargeboten.

BEISPIELE

Zusammenfassend offenbaren die folgenden Beispiele die Synthese von mehreren rezeptormodulierenden Agentien dieser Erfindung unter Verwendung von unterschiedlichen funktionellen Klassen von Umleitgruppen. Genauer wird eine Reihe von Beispielen präsentiert, die Vitamin-B&sub1;&sub2; als eine Zielgruppe in einem rezeptormodulierenden Agens verwenden.

Alle Chemikalien, die von kommerziellen Quellen erworben wurden, hatten analytische oder bessere Qualität und wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet, sofern nicht anderweitig festgestellt. Isophthaloyidichlorid wurde von Lancaster Synthesis Inc. (Windham, NH) gekauft. Alle anderen Reagenzien wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) erhalten. Die Lösungsmittel für die HPLC-Analyse wurden in HPLC-Qualität gekauft und wurden vor der Verwendung gefiltert (0,2 um). Die Ionenaustauschchromatographie wurde mit stark basischem Anion 2% quervernetzendem Dowex-1-Chlorid, 200-400 mesh (Aldrich Chemical Co.), durchgeführt. Amberlite XAD-2-nichtionisches polymeres Adsorbens und Octadecylfunktionalisiertes Kieselgel, für die Säulenchromatographie waren von Aldrich Chemical Co.

¹H NMR wurden auf einem Bruker AC-500-Instrument (500 MHz) aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen werden als ppm (δ) unter Verwendung von Tetramethylsilan als internen Bezug ausgedrückt. Die IR-Daten wurden auf einem Perkin-Elmer-1420 Infrarot- Spektrophotometer aufgenommen. Die UV-Daten wurden auf einem Perkin-Elmer-1420- Infrarot-Spektrophotometer aufgenommen. Massenspektrumsdaten wurden auf einem VG- 7070H Massenspektrometer mit Fast Atom Bombardment (FAB) aufgenommen.

Die HPLC-Trennungen von Verbindungen wurden auf einem quaternären 1050- Gradientenpumpsystem von Hewlett-Packard mit einem UV-Detektor durchgerührt. Die Analyse der HPLC-Daten wurde mit einer Hewlett-Packard-HPLC-Chemstation-Software durchgeführt.

HPLC für Monomere: Die HPLC-Trennungen wurden bei einer Flußrate von 1 ml/min auf einer 5 mm, 4,6 250 mm NH&sub2;-Säule durchgeführt (RAININ microsorb-MV-amino-säule), wobei mit 58 mM Pyridinacetat, pH 4,4 in H&sub2;O : THF (96 : 4) Lösung eluiert wurde. Die Re tentionszeiten waren: 1 = 4,3 min; 2 = 6,5 min; 3 = 8,0 min; 4 = 8,8 min; 5 = 10,9 min; 6 = 2,3 min; 7 = 2,3 min; 8 = 3,0 min; 9 = 2,9 min; 10 = 2,9 min; 13 = 3,4 min. Umkehrphasen- HPLC-Chromatographie wurde unter Verwendung einer Hewlett-Packard-Lichrospher 100 RP-18 (5 mm, 125 · 4 mm) C-18-Säule durchgeführt, unter Verwendung eines Gradientenlösungssystems bei einer Durchflußrate von 1 ml/min. Das Lösungsmittel A im Gradient war Methanol. Das Lösungsmittel B war Wasser. Ausgehend von 40% A wurde der Gradient auf 100% A über 10 min erhöht. Der Gradient wurde dann auf 40% A über eine 5 min-Periode zurückgebracht. Die Retentionszeiten unter diesen Bedingungen für die Biotin-Konjungate waren: 17 = 7,1 min; 18 = 7,2 min; 19 = 6,9 min; 20 = 6,4 min.

Der Anmelder erkennt an, daß auf die folgenden eingetragenen Marken hiernach Bezug genommen wird: Dowex, Amberlite, Lichrospher und Vydac.

Eine präparative LC wurde durchgeführt, um die Mischung von Monocarbonsäure zu trennen, unter Verwendung eines peristaltischen RAININ Rabbit-plus-Pumpsystems mit einem UV- sichlbar DYNAMAX-Extinktionsdetektor (Modell UV-1) bei einer Flußrate von 0,15 ml/min. Eine ID-Säule (Alltech, 150 psi), (1000 mm · 25 mm), gepackt mit Aminopropylsiliziumdioxid (40-63 mm) wurde verwendet.

HPLC für Dimere: Für die Dimere 36, 37 und 38 war das Lösungsmittel A im Gradienten Methanol. Das Lösungsmittel B war H&sub2;O. Der Gradient wurde bei der Ausgangsmischung auf 70% A für 2 min gehalten, dann wurde der prozentuale Anteil von A linear auf 100% über die nächsten 10 min erhöht. Der Gradient wurde auf 100% A für 20 min gehalten. Die Retentionszeiten unter diesen Bedingungen für die Dimere waren: 36 = 8,7 min; 37 = 9,0 min; 38 = 8,9 min. Für die Dimere 58-60 und 64-66 war das Lösungsmittel A im Gradienten Methanol. Das Lösungsmittel B war wäßrige 1% Essigsäure. Der Gradient wurde bei 40% A begonnen und bei dieser Zusammensetzung für 2 min gehalten, dann wurde der prozentuale Anteil an A linear auf 100% über die nächsten 10 min erhöht. Die Retentionszeiten für die Verbindungen, die unter diesen Bedingungen untersucht wurden, waren: 58 = 14,0 min; 59 = 14,1 min; 60 = 13,9 min; 64 = 8,7 min; 65 = 8,6 min; 66 = 9,0 min.

BEISPIEL 1 HERSTELLUNG UND AUFREINIGUNG VON CYANOCOBALAMIN- MONOCARBOXYLATEN: MODIFIZIERUNG AUF DEM CORRIN-RING

Dieses Beispiel dient dazu, die Hydrolyse der b-, d- und e-Propionamidstellen auf einem Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül unter Verwendung von verdünnter Säure in Vorbereitung für die Kopplung eines, Linkers an die Stellen zu zeigen. Bedeutenderweise ist die Hydrolyse der b-, d- und e- Propionamide selektiv gegenüber der Hydrolyse von a-, c- und g-Acetamiden oder dem f- Amid in der heterocyclischen Kette, die das Benzimidazol verbindet. Eine optimale Ausbeute von Monocarboxylat bis di- und tri-Carboxylat-Derivaten wurde bei Zimmertemperatur in 0,1 N HCl über eine 10-tägige Periode erhalten. Das nicht-hydrolysierte Vitamin-Biz und die hergestellten di- und tri-Carboxylate wurden in leichter Weise aus den erwünschten Monocarboxylaten mittels präparativer Flüssigchromatographie isoliert.

Im besonderen wurde Cyanocobalamin (1) (3,7 mmol, 5 g) in 500 ml 0,1 N HCl aufgelöst und bei Zimmertemperatur für 10 Tage unter einer Argonatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde dann mit 6 N NaOH neutralisiert und die Cobamide wurden durch Extraktion in Phenol entsalzt und auf eine 200 g (60 · 4 cm, 200-400 mesh) Dowex Cl&supmin; · 2 Säule aufgetragen (Acetatform; hergestellt durch Waschen mit gesättigtem Natriumacetat, bis es frei von Cl&supmin; war, dann Waschen mit 200 ml Wasser). Die Säule wurde mit Wasser eluiert, um nicht-umgesetztes Cyanocobalamin zu entfernen, und dann mit 0,04 M Natriumacetat (pH 4,67) eluiert.

Die erste Fraktion der Elution enthielt 3 Monocarbonsäuren. Diese wurden durch Extraktion in 100 ml 90% (w/w) Phenol, zweimal mit 25 ml und einmal mit 10 ml Phenol, entsalzt. Drei Volumina Ethylether (3 · 160 ml) und 1 Volumen Aceton (160 ml) wurden zu den kombinierten Phenolextrakten zugegeben. Die Monocarbonsäuren wurden aus der organischen Phase durch Extraktion mit Wasser entfernt (2 · 100 ml). Die kombinierten wäßrigen Phasen wurden zweimal mit 20 ml Ether extrahiert, um verbleibendes Phenol zu entfernen. Die wäßrige Lösung der Monocarbonsäuren wurde bis zur Trockenheit eingedampft. Ausbeute: 2,5 g (50%).

Die Mischung der drei Säuren (0,350 g) wurde dann auf eine 200 g (1000 mm · 25 mm) Säule von Aminopropyl-beschichtetem Siliziumdioxid (40-63 mm) aufgetragen und mit 58 mM Pyridinacetat, pH 4,4 in H&sub2;O : THF (9 6: 4) eluiert; das Eluat wurde mit einem automatischen Fraktionssammler gesammelt. Es wurde gefunden, daß die erste eluierte Säure b- Monocarbonsäure (2) war, die zweite eluierte war e-Monocarbonsäure (3) und die dritte eluierte Säure war d-Monocarbonsäure (4). Die Säurefraktion wurden durch Phenolextraktion entsalzt. Die erhaltenen Feststoffe wurden aus wäßrigem Aceton kristallisiert.

b-Säure (2): Ausbeute 0,122 g (35%), Schmp. 267-270ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (MeOH- d&sub4;, δ) 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,00 (m, 2H); 1,18 (s, 3H, C-46 CH&sub3;); 1,24 (d, 3H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,36 (br s, 9H, C-47 CH&sub3;, C-54 CH&sub3;); 1,4 (s, 3H, C-25 CH&sub3;); 1,9 (d, 7H, C-36 CH&sub3;, C-30 CH&sub2;, C-48 CH&sub2;); 2,26 (d, 6H, B10 & B11, CH&sub3;); 2,36 (d, 2H, C-26 CH&sub2;); 2,57 (s, 10H, C-35 CH&sub3;, C-31 CH&sub2;, C-37 CH&sub2;, C-53 CH&sub3;); 2,8 (m, 2H, C-60 CH&sub2;); 3,3 (m, 3H, C-8H, C-13H); 3,6 (m, 2H, Pr&sub1; CH&sub2;); 3,7 (d, 1H, R&sub5;); 3,9 (d, 1H, R&sub3;); 4,0 (m, 1H, R&sub4;); 4,12 (d, 1H, C-19); 4,17 (s, 1H, C-3); 4,3 (m, 1H, R&sub2;); 4, 5 (m, 1H); 4,7 (m, 1H, R&sub3;); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,2 (s, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4); 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1357 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660,1570, 1490,1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε23441)

e-Säure (3): Ausbeute 0,168 g (48%), Schmp. 245-250ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (MeOH- d&sub4;, δ) 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,01 (m, 2H); 1,15 (s, 3H, C-46 CH&sub3;); 1,23 (d, 3H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,36 (br s, 9H, C-47 CH&sub3;, C-54 CH&sub3;); 1,4 (s, 3H, C-25 CH&sub3;); 1,83 (s, 4H, C-55 CH&sub2;); 1,93 (m, 6H, C-36 CH&sub3;; C-30 CH&sub2;; C-48 CH&sub2;); 2,22 (d, 6H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,35 (s, 3H, C-26 CH&sub2;); 2,5 (d, 13H, C-35 CH&sub3;, C-31 CH&sub2;, C-37 CH&sub2;, C-53 CH&sub3;); 2,9 (m, 1H, C-60 H); 3,2 (m, 1H, C-13H); 3,4 (m, 1H, C-8 H); 3,6 (d, 1H, Pr&sub1; CH); 3,7 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,0 (m, 2H); 4,1 (d, 1H): 4,2 (m, 2H); 4,6 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R1); 6,5 (s, 1H, B4); 7,0 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1357 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε21 842)

d-Säure (4): Ausbeute: 0,060 g (17%), Schmp. > 300ºC, ¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ) 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,04 (m, 2H); 1,15 (s, 3H, C-46 CH&sub3;) 1,25 (d, 3H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,36 (br s, 9H, C-47 CH&sub3;, C-54 CH&sub3;); 1,4 (s, 3H, C-25 CH&sub3;); 1,85 (s, 4H); 2,01 (s, 6H); 2,23 (d, 8H, B10 & B11, CH&sub3;); 2,38 (d, 3H, C-26 CH&sub2;); 2,53 (d, 13H, C-36 CH&sub3;, C-30 CH&sub2;, C-48 CH&sub2;); 2,6 (m, 5H); 2,9 (m, 1H, C-60 H); 3,3 (d, 1H, C-13H); 3,4 (m, 1H, C-8 H); 3,6 (d, 1H, Pr&sub1; CH); 3,7 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,0 (m, 2H) 4,1 (d, 1H); 4,3 (m, 2H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R1); 6,5 (s, 1H, B4); 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). UV (MeOH): λ360 (ε22 127). MS (FAB&spplus;): m/e 1357 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹.

BEISPIEL 2 CYANOCOBALAMIN, MODIFIZIERT AN RIBOSE: SUCCINAT-KONJUGAT (5)

Dieses Beispiel dient dazu, die Aktivierung der Ribosekopplungsstelle zu zeigen, indem man die Stelle h (siehe Struktur I) mit Bernsteinsäureanhydrid koppelt. Cyanocobalamin (1) (0,15 mmol, 200 mg) wurde in 40 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), enthaltend 8 g (80 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 6,4 ml Pyridin, aufgelöst. Nach 14-16 h bei Zimmertemperatur wurde der Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid durch Zugabe von 500 ml Wasser und Halten des pH5 der Reaktionsmischung bei 6 mit 10% KOH zerstört. KCN wurde dann auf eine Endkonzentration von 0,01 M zugegeben, und der pH der Lösung wurde auf 6 mit 3 N HCl erneut eingestellt. Nach 1 h wurden die Cyanocobalamin-Bestandteile mittels Phenolextraktion entsalzt und auf eine Säule mit 100 g Dowex Cl&supmin; (60 · 2,5 cm) (Acetatform, 200-400 mesh) aufgetragen. Das Cyanocobalamin wurde mit Wasser eluiert. Das Succinat-Konjugat (5) wurde mit NaOAc (0,04 M, pH 4,67) eluiert, was 180 mg (85%) nach der Isolierung ergab. Das O2',O5'-Disuccinyl-Derivat blieb auf der Säule unter diesen Bedingungen absorbiert. Schmp. 208-210ºC mit Zersetzung.

¹H NMR (D&sub2;O-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 0,95 (m, 2H); 1,15 (s, 3H); 1,2 (d, 3H); 1,35 (d, 7H); 1,4 (s, 3H), 1,8 (s, 3H); 1,9 (s, 12H); 2,2 (d, 6H); 2,36 (d, 2H), 2,5 (d, 10H); 2,6-2,7 (m, 7H); 3,0 (m, 1H); 3,3 (d, 1H); 3,37 (m, 1H); 3,5 (d, 1H); 4,0 (d, 1H); 4,18 (m, 2H); 4,25 (m, 3H); 4,54 (d, 1H); 6,0 (s, 1H); 6,3 (d, 1H); 6,4 (s, 1H); 7,0 (s, 1H); 7,2 (s, 1H); MS (FAB&spplus;): m/e 1455 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (Me-OH): λ360 (ε26041).

BEISPIEL 3

KOPPELN VON CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄUREN MIT 1,12- DIAMINODODECAN: REAKTION MIT NATRIUMCYANID

Dieses Beispiel dient dazu, die Kopplung eines Linkers an ein Cyanocobalamin- Monocarboxylat zu zeigen. Die Kopplung der Monocarboxylate (2, 3, 4) mit Diaminododecan wurde zuerst unter Verwendung von N-Ethyl-N'-Dimethylamino-Propylcarbodiimidhydro chlorid (EDC) in H&sub2;O gemäß Yamada und Hogenkamp, L Biol. Chem. 247: 6266-6270, 1972 versucht. Jedoch hatten die erhaltenen Produkte keine reaktive Aminogruppe. Eine Veränderung der Reaktionsbedingungen durch Veränderung des Reaktionsgemischs zu DMF/EO und Zugabe von NaCN/N-Hydroxysuccinimid (siehe Beispiel 4) zur Reaktionsmischung ergab die erwünschten Diaminododecan-Addukte.

Eine Mischung von Cyanocobalamin-Monocarbonsäure (0,370 mmol, 500 mg) und 1,12 Diaminododecan (3,6 g) in 100 ml H&sub2;O wurde auf pH 6 mit 1 N HCl eingestellt. Die Lösung wurde dann mit N-Ethyl-N'-Dimethylamino-propyl-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) (726 mg) behandelt und bei Zimmertemperatur für 22 h gerührt. In fünf Intervallen von 6 bis 14 h wurden 650 mg EDC zur Reaktionsmischung zugegeben. Nach einer gesamten Reaktionszeit von 4 Tagen (Überwachung mittels HPLC) wurde die Lösung bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert. Der feste Rückstand wurde in 50 ml Wasser aufgelöst und auf eine Säule mit 175 g Amberlite XAD-2 (60 · 4 cm) aufgetragen. Verunreinigungen wurden von der Säule mit 1 l Wasser gewaschen, dann wurde das rohe Produkt mit 500 ml Methanol eluiert. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand wurde in 25 ml Wasser aufgelöst und wurde auf eine 100 g Dowex Cl-Säule (60 · 2,5 cm) (Acetatform, 200-400 mesh) aufgetragen. Das Endprodukt wurde unter Verwendung von 250 ml Wasser eluiert, wodurch nichtumgewandelte Säure an der Säule gebunden gelassen wurde, die später mit 0,04 mol/l Natriumacetatpuffer pH 4,67 eluiert wurde. Die Fraktion, die das Endprodukt enthielt, wurde bis zur Trockenheit verdunstet.

Der erhaltene Massenspektrumswert zeigte an, daß HCl von dem erwünschten Produkt verloren wurde. Weiterhin wiesen ¹H-NMR-Daten daraufhin, daß einige Protonen durch das Kobalt beeinflußt wurden. Daher wurde diese Reaktion mit NaCN durchgeführt (Beispiel 4), um das Gleichgewicht zum Zurückhalten von Co-CN zu treiben. N-Hydroxysuccinimid wurde ebenso zugegeben, um die Kopplungsreaktion zu erleichtern.

e-Säure-Addukt (6): Ausbeute: 222 mg (40%). Schmp. 172-174ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ): 0,43 (m, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,06 (t, 4H, C-46 CH&sub3;); 1,16 (m, 5H); 1,2 (m, 5H); 1,33 (m, 7H); 1,43 (s, 3H); 1,68 (m, 4H); 1,86 (m, 5H); 2,2 (m, 8H); 2,3 (m, 6H); 2,4 (m, 10H); 2,55 (m, 10H); 2,8 (m, 4H); 3,1 (m, 6H); 3,3 (m, 5H); 3,6 (m, 2H); 3,7 (m, 2H); 3,8 (m, 1H); 4,0 (m, 1H); 4,1 (m, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 4,48 (m, 1H); 4,6 (m, 1H); 6,0 (d 1H, C-10); 6,2 (m, 1H, R1); 6,5 (m, 1H, B4), 7,1 (m, 1H, B2); 7,2 (m, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1512. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε21 877).

d-Säure-Addukt (7): Ausbeute: 225 mg (45%). Schmp. 195-198ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ): 0,43 (m, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,09 (m, 7H); 1,14 (m, 6H); 1,2 (m, 10H); 1,27 (m, 10H), 1,33 (m, 6H); 1,5 (m, 3H); 1,77 (s, 3H), 2,2 (m, 8H); 2,26 (s, 2H), 2,5 (m, 10H); 2,7 (m, 5H); 3,0 (m, 2H); 3,1 (m, 2H); 3,2 (m, 2H); 3,5 (m, 2H); 3,6 (m, 1H); 3,8 (m, 1H); 3,9 (m, 1H); 4,0 (m, 1H); 4,1 (m, 1H); 4,2 (m, 1H); 4,4 (m, 1H); 4,6 (m, 1H); 6,0 (d 1H, C-10); 6,1 (m, 1H, R&sub1;), 6,4 (m, 1H, B4); 7,0 (m, 1H, B2); 7,1 (m, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1512. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε22 680).

BEISPIEL 4 KOPPELN VON CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄUREN MIT 1,12- DIAMINODODECAN: REAKTION, ENTHALTEND NATRIUMCYANID

Cyanocobalamin-Monocarbonsäure (2, 3, 4) (0,370 mmol, 500 mg) und N- Hydtoxysuccinimid (1,48 mmol, 170 mg) wurden in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (1 : 1) (18,4 ml) aufgelöst und 363 mg NaCN wurden zugegeben. 1,12 Diaminododecan wurden in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (1 : 1) (18,4 ml) aufgelöst und der pH wurde auf 6 mit 1 N HCL eingestellt. Die Diaminododecan-Lösung wurde dann in einem Teil zur Cyanocobalamin- Lösung zugegeben. EDC (285 mg) wurden zugegeben und der pH der Lösung wurde erneut auf 5,5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde dann über Nacht in der Dunkelheit bei Zimmertemperatur gerührt. In fünf Intervallen von 6-14 h wurden 170 mg N- Hydroxysuccinimid und 285 mg EDC zur Lösung zugegeben, wobei der pH-Wert 5,5 jedes Mal wieder eingestellt wurde. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 4 Tagen (die Reaktion wurde durch HPLC verfolgt) wurde die Lösung bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert. Der feste Rückstand wurde in 50 ml H&sub2;O aufgelöst und auf eine 200 g Amberlite XAD-2-Säule (60 · 4 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit 1 l Wasser eluiert, um unerwünschte Materialien zu entfernen, dann wurde das erwünschte Produkt mit 500 ml Methanol eluiert. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand wurde in 25 ml Wasser aufgelöst und auf eine 100 g Dowex Cl-Säule (60 · 2,5 cm) (Acetatform, 200-400 mesh) aufgetragen. Das erwünschte Produkt wurde von der Säule mit 250 ml Wasser eluiert, wobei jegliche nichtumgesetzte Säure an der Säule gebunden belassen wurde. Hierauf folgte eine Elution mit 0,04 mol/l Natriumacetatpuffer, pH 4,7. Die Fraktionen, die das Endprodukt enthielten, wurden bis zur Trockenheit eingedampft.

b-Isomer (8): Ausbeute: 410 mg (82%). Schmp. 172-174ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (Me-OH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,18 (s, 4H); 1,3 (m, 13H); 1,39 (m, 13H); 1,45 (s, 5H), 1,6 (m, 4H); 1,72 (m, 2H); 1,9 (s, 6H); 2,25 (d, 6H, B10 & B11 CH&sub3;), 2,35 (m, 5H); 2,56 (m, 5H), 2,8-3,0 (m, 8H); 3,15 (m, 4H); 3,3 (m, 2H); 3,4 (m, 2H); 3,6 (m, 1H); 3,68 (m, 1H); 3,75 (m, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,07 (m, 1H); 4,12 (d, 1H); 4,2 (br s, 1H); 4,3 (m, 1H); 4,47 (m, 1H); 4,7 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,2 (d, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4), 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1539 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060. 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε15409).

e-Isomer (9): Ausbeute: 430 mg (86%). Schmp. 175-180ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (Me-OH-d&sub4;, δ) 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,17 (s, 4H, C-46 CH&sub3;); 1,22 (d, 4H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,29 (s, 24H); 1,36 (br s, 6H), 1,4 (s, 6H); 1,6 (m, 3H); 1,87 (s, 8H); 2,05 (m, 2H), 2,25 (s, 6H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,36 (m, 3H), 2,55 (d, 10H); 2,8 (s, 4H); 3,06 (t, 2H); 3,1 (m, 3H); 3,3 (s, 1H); 3,34 (m, 1H); 3,4 (m, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,65 (m, 1H); 3,75 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,0 (m, 1H); 4,1 (d, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,3 (m, 2H), 4,48 (m, 2H); 4,6 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R1); 6,5 (s, 1H, B4); 7,0 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1539 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε16 720).

d-Isomer (10): Ausbeute: 400 mg (80%). Schmp. 174-178ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (Me-OH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,07 (m, 3H, C-46 CH&sub3;); 1,2 (d, 4H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,27 (m, 15H); 1,35 (br s, 9H), 1,42 (s, 3H); 1,53 (m, 2H); 1,6 (m, 4H); 1,86 (s, 4H), 2,25 (d, 6H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,5 (d, 10H), 2,8 (s, 3H); 2,9 (m, 6H); 3,15 (m, 3H); 3,2 (m, 4H); 3,4 (m, 3H); 3,6 (d, 1H); 3,75 (d, 1H); 3,96 (d, 1H); 4,08 (m, 2H); 4,19 (m, 1H); 4,3 (m, 2H), 4,65 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4); 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7); UV (Me-OH): λ360 (ε17 665). MS (FAB&spplus;): m/e 1539 (M&spplus; + 1). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹.

BEISPIEL 5 KOPPLUNG VON CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄUREN MIT GAMMA- AMINOBUTTERSÄURE (GABA)

Diese Beispiel dient dazu, das Koppeln eines Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Linkers an ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Molekül zu demonstrieren. Dieses Reaktionsschema wird in Fig. 9 dargestellt.

Gamma-Aminobuttersäure (GABA) tert-butylester (11) (1 mmol) und Cyanocobalamin- Monocarboxylate (2, 3, 4) (0,1 mmol) werden in 20 ml HO gemischt, und ausreichend 0,1 N HCl wird zugegeben, um den pH auf 6,0 einzustellen. N-Ethyl-N¹- Dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) (0,5 mmol) wird zur Lösung dazugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Zimmertemperatur für 24 Stunden gerührt, und dann wird die Mischung unter Vakuum getrocknet. Diese Reaktionsmischung wird mit TFA behandelt, um den tert-Butylester zu entfernen. Ein Cyanocobalamin-GABA-Addukt (12) wurde aufgereinigt. Eine Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie wird durchgeführt, wie oben beschrieben. Ein Cyanocobalamin-GABA-Addukt (12) kann weiter mit einem Carbodiimid aktiviert und an eine Gruppe, wie unten beschrieben, gekoppelt werden.

BEISPIEL 6 CYANOCOBALAMIN, MODIFIZIERT AN RIBOSE: SUCCINAT- DIAMINODODECAN-KONJÜGAT (13)

Cyanocobalamin-Ribose-Succinat (5) (0,370 mmol, 538 mg) und N-Hydroxysuccinimid (1,48 mmol, 170 mg) wurden in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (1 : 1) (18,4 ml) aufgelöst und 363 mg NaCN wurden zugegeben. Dieses Reaktionsschema wird in Fig. 11 dargestellt. 1,12 Diaminododecan wurde in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (1 : 1) (18,4 ml) aufgenommen, der pH wurde auf 6 mit 1 N HCL eingestellt. Die Diaminododecan-Lösung wurde dann in einem Teil zur Cyanocobalamin-Lösung zugegeben. EDC (285 mg) wurden zugegeben, der pH der Lösung wurde auf 5,5 wieder eingestellt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht in Dunkelheit bei Zimmertemperatur gerührt. In fünf Intervallen von 6-14 h wurden 170 mg N- Hydroxysuccinimid und 285 mg EDC zur Lösung zugegeben, wobei der pH-Wert 5,5 jedes Mal wieder eingestellt wurde. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 4 Tagen (HPLC- überwacht), wurde die Lösung bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert. Der feste Rückstand wurde in 50 ml H&sub2;O aufgelöst und auf eine 200 g Amberlite XAD-2-Säule (60 · 4 cm) aufgetragen. Die Verunreinigungen wurden von der Säule mit 1 l Wasser gewaschen, um dann wurde das Rohprodukt mit 500 ml Methanol eluiert. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand wurde in 25 ml Wasser aufgelöst und auf eine 100 g Dowex Cl-Säule (60 · 2,5 cm) (Acetatform, 200-400 mesh) aufgetragen. Das Endprodukt wurde unter Verwendung von 250 ml Wasser eluiert, wobei nicht-umgesetzte Säure an der Säule gebunden belassen wurde, was später mit 0,04 mol/l Natriumacetatpuffer, pH 4,7 eluiert wurde. Die Fraktionen, enthaltend das Endprodukt (13) wurde bis zur Trockenheit eingedampft. Ausbeute: 425 mg (70%), Schmp. 185-187&sup0;C mit Zersetzung.

¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,15 (s, 3H); 1,2 (d, 3H); 1,3 (s, 27H); 1,4 (m, 3H); 1,55 (m, 6H); 1,85 (m, 12H); 2,2 (d, 6H); 2,3 (d, 6H), 2,5 (d, 10H); 2,8 (m, 10H), 3,0 (t, 3H); 3,1 (t, 3H); 3,2 (s, 6H); 3,3 (m, 4H); 3,58 (m, 2H); 3,6 (d, 1H); 4,1 (d, 1H); 4,2 (m, 2H); 4,3 (m, 1H); 4,4 (d, 1H); 6,0 (s, 1H); 6,2 (d, 1H); 6,5 (s, 1H); 7,1 (s, 1H); 7,2 (s, 1H); MS (FAB&spplus;): m/e 1638 (M&spplus;). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490. 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360.

BEISPIEL 7

MODIFIZIERUNG VON CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄÜREN, KONJUGIERT MIT 1,12-DIAMINODODECAN: REAKTION MIT BERNSTEINSÄUREANHYDRID

Dieses Beispiel dient dazu, die Modifizierung einer Amino-Termmus-verknüpfenden Gruppe an einen Carboxylat-Terminus zu zeigen. Eine solche Modifizierung kann notwendig sein, um Amino-enthaltende Umleitmittel (z. B. Aminozucker) an Cyanocobalamin-Derivate zu konjugieren, die einen Linker enthalten.

Cyanocobalamin-Carbonsäure-Diaminododecan-Konjugat (8, 9, 10) (0,138 mmol, 200 mg) wurde in 40 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), enthaltend 8 g (80 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 6,4 ml Pyridin, aufgelöst. Nach 14-16 h bei Zimmertemperatur wurde der Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid durch Zugabe von 500 ml Wasser und Halten des pH5 der Reaktionsmischung bei 6 mit 10% KOH zerstört. KCN wurde dann auf einer Endkonzentration von 0,01 M zugegeben und der pH der Lösung wurde auf 6 mit 3 N HCl wieder eingestellt. Nach 1 h wurden die Cyanocobalamin-Bestandteile durch Phenolextraktion entsalzt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert. Er wurde in 40 ml H&sub2;O aufgelöst, 1 N NaOH (2 ml) wurden zugegeben, und die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur für 15-20 Minuten gerührt. Sie wurde dann mit 1 N HCl neutralisiert, und die Cyanocobalamin-Bestandteile (14, 15, 16) wurden durch Phenolextraktion entsalzt. Ausbeute: 80 mg (40%), Schmp. 190-198ºC mit Zersetzung.

¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,17 (s, 4H, C-46 CH&sub3;); 1,23 (d, 4H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,29 (s, 24H); 1,36 (br s, 6H); 1,4 (s, 6H); 1,87 (s, 4H); 2,05 (m, 2H); 2,25 (s, 6H, B10 & B11 CH&sub3;), 2,35 (m, 3H); 2,4 (m, 5H); 2,55 (d, 10H); 2,7 (s, 5H); 2,8 (m, 2H); 3,1 (m, 6H); 3,3 (s, 6H); 3,4 (m, 1H); 3,65 (m, 2H); 3,75 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,0 (m, 1H); 4,1 (d, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 4,48 (m, 1H); 4,6 (m, 2H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4); 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1639 (M&spplus;). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε22 564).

BEISPIEL 8 CYANOCOBALAMIN, MODIFIZIERT AN MONOCARBONSÄURE: DIAMINODODECAN-BIOTIN-KONJUGAT

Dieses Beispiel dient dazu, das Koppeln eines Vitamin-B&sub1;&sub2;-Derivats und Biotin zu zeigen. Biotin-Konjugate (17, 18, 19) wurden durch Reaktion von aktiviertem Cyanocobalamin- Monocarbonsäure-Diaminododecan (14), (15) und (16) mit dem NHS-Ester von Biotin (Sigma Chemical Co.) erhalten.

Zu einer Lösung von Cyanocobalamin-Monocarbonsäure-Diaminododecan-Konjugat (14, 15, 16) (300 mg, 0,195 mmol) in DMF (35 ml) wurde Triethylamin (0,027 ml, 0,195 mmol) zugegeben. N-Hydroxysuccinimidobiotin (100 mg, 0,295 mmol) wurde dann über eine Periode von 10-15 min zugegeben und bis zur Trockenheit eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und auf eine 75 g Dowex Cl- (40 · 2 cm) (Acetatform, 200-400 mesh) Säule aufgetragen. Das Produkt wurde unter Verwendung von 250 ml Wasser eluiert.

Es wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand wurde in 10 ml Methanol- Wasser (7: 3 v/v) aufgelöst, und die Lösung wurde auf einer Umkehrphasen-C-18-Säule (500 mm · 25 mm, Alltech, 150 psi) aufgetragen, die mit demselben Lösungsmittel entwickelt wurde. Ein peristaltisches RAININ Rabbit-plus-Pumpsystem wurde verwendet mit einem UV-sichtbar Extinktionsdetektor DYNAMAX (Modell UV-1). Das Eluat wurde mit einem automatischen Fraktionssammler gesammelt. Die Fraktionen, die das Endprodukt enthielten (HPLC-überwacht) wurden bis zur Trockenheit eingedampft.

b-Isomere (17): Ausbeute: 159 mg (53%). Schmp. 210-212ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (Me-OH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,18 (s, 4H); 1,3 (m, 13H); 1,39 (m, 13H); 1,45 (s, 5H), 1,6 (m, 4H); 1,72 (m, 2H); 1,9 (s, 6H); 2,2 (d, 8H, B10 & B11 CH&sub3;), 2,6 (d, 12H); 2,7 (m, 3H), 2,8-3,0 (m, 8H); 3,1 (m, 3H); 3,2 (m, 2H); 3,4 (s, 1H); 3,6 (m, 2H); 3,68 (d, 1H); 3,75 (m, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,07 (m, 1H); 4,12 (d, 1H); 4,2 (s, 1H); 4,3 (m, 1H); 4,47 (m, 1H); 4,7 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,2 (d, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4), 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1764 (M&spplus;). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε23 746).

Anal. Berechn. für C&sub8;&sub5;H&sub1;&sub2;&sub7;N&sub1;&sub7;O&sub1;&sub6;CoPS·11H&sub2;O: C, 51,98; H, 7,59; N, 12,13. Gefunden: C, 51,91; H, 7,81; N, 12,31.

e-Isomere (18): Ausbeute: 174 mg (58%). Schmp. 222-224ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (Me-OH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,17 (s, 4H, C-46 CH&sub3;); 1,22 (d, 4H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,29 (s, 24H); 1,36 (br s, 6H), 1,4 (s, 6H); 1,6 (m, 4H); 1,72 (m, 2H); 1,87 (s, 4H); 2,17 (m, 3H), 2,25 (s, 6H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,36 (m, 3H), 2,55 (d, 10H); 2,64 (m, 2H); 2,8 (s, 4H); 2,97 (s, 4H); 3,1 (m, 3H); 3,3 (m, 1H); 3,4 (m, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,65 (m, 1H); 3,75 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,0 (m, 1H); 4,1 (d, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,3 (m, 2H), 4,48 (m, 2H); 4,6 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C- 10); 6,3 (d, 1H, R1); 6,5 (s, 1H, B4); 7,0 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1764 (M&spplus;). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε24 441).

Anal. Berechn. für C&sub8;&sub5;H&sub1;&sub2;&sub7;N&sub1;&sub7;O&sub1;&sub6;CoPS·9H&sub2;O (13): C, 52,96; H, 7,53; N, 12,35. Gefunden: C, 52,85; H, 7,55; N, 12,30.

d-Isomere (10): Ausbeute: 165 mg (55%). Schmp. 216-218ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (Me-OH-d&sub4;, δ: 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,16 (s, 3H, C-46 CH&sub3;); 1,2 (d, 4H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,28 (s, 15H); 1,35 (br s, 9H), 1,42 (s, 3H); 1,53 (m, 2H); 1,6 (m, 4H); 1,72 (m, 2H); 1,86 (s, 6H), 2,16 (m, 3H); 2,02 (m, 4H); 2,25 (d, 6H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,5 (d, 10H), 2,7 (d, 1H); 2,8 (m, 5H); 3,1 (m, 6H); 3,2 (m, 3H); 3,4 (m, 1H); 3,57 (m, 1H); 3,6 (d, 1H); 3,7 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 4,0 (m, 1H); 4,11 (d, 1H); 4,17 (m, 1H); 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 2H); 4,6 (m, 1H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4); 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7). MS (FAB&spplus;): m/e 1764 (M&spplus;). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε29 824).

Anal. Berechn. für C&sub8;&sub5;H&sub1;&sub2;&sub7;N&sub1;&sub7;O&sub1;&sub6;CoPS·10H&sub2;O: C, 52,46; H, 7,56; N, 12,24. Gefunden: C, 52,27; H, 7,56; N, 12,34.

BEISPIEL 9 CYANOCOBALAMIN, MODIFIZIERT AN RIBOSE: SUCCINAT- DIAMINODODECAN-BIOTIN-KONJUGAT(20)

Dieses Beispiel dient dazu, die Konjugation des Ribose-verknüpften Diaminododecan- Addukts (13) mit Biotin zum Erzeugen eines Cyanocobalamin-Biotin-Konjugats (20) zu zeigen.

Einer Lösung von (11) (300 mg, 0,183 mmol) in DMF (35 ml) wurde Triethylamin (0,025 ml, 0,183 mmol) zugegeben. N-Hydroxysuccinimidobiotin (100 mg, 0,295 mmol) wurde über eine Periode von 10-15 min zugegeben und dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und auf pH 10 mit 1 N NaOH eingestellt und auf eine 75 g Dowex Cl- (40 · 2 cm) (200-400 mesh) Säule aufgetragen. Die Wasserfraktion wurde verworfen. Das Produkt wurde dann mit 0,1 N NH&sub4;OAc eluiert und mittels Phenolextraktion entsalzt. Der Rückstand wurde in 10 ml Methanol-Wasser (7 : 3 v/v) aufgelöst, und die Lösung wurde auf einer Umkehrphasensäule (Octadecyl) aufgetragen, die mit demselben Lösungsmittel entwickelt wurde. Die Fraktionen, die das Endprodukt (20) enthielten (HPLCüberwacht), wurden bis zur Trockenheit eingedampft. Ausbeute: 135 mg (45%), Schmp. 198- 205ºC mit Zersetzung.

¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,15 (s, 3H); 1,2 (d, 3H); 1,3 (s, 27H); 1,36 (m, 6H); 1,4 (m, 3H), 1,6 (m, 4H); 1,7 (m, 2H); 1,85 (m, 12H); 2,0 (d, 3H); 2,17 (m, 3H); 2,2 (d, 6H); 2,3 (d, 6H); 2,5 (d, 10H); 2,64 (m, 2H); 2,8 (m, 10H), 3,1 (m, 6H); 3,25 (m, 6H); 3,58 (m, 2H); 4,0 (m, 1H); 4,1 (m, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,4 (m, 1H); 4,6 (s, 2H); 4,7 (m, 1H); 6,0 (s, 1H); 6,2 (d, 1H); 6,5 (s, 1H), 7,1 (s, 1H); 7,2 (s, 1H). MS (FAB&spplus;): m/e 1866 (M&spplus;). IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε28 434).

BEISPIEL 10 SYNTHESE EINES CYANOCOBALAMIN/LYSOSOMOTROPEN VERBINDUNG (STREPTOMYCIN) REZEPTORMODULIERENDES AGENS

Dieses Beispiel zeigt das Koppeln von Streptomycin an ein Cyanocobalamin oder Cobalamin- Derivat. Streptomycin (21) wird mit Cyanocobalamin-Monocarboxylat (2, 3, 4) oder einem Diaminoalkylsuccinat-Derivat (14, 15, 16) durch die Verwendung einer Oxim-gekoppelten Verknüpfüngsgruppe konjugiert (Fig. 13). Die Verknüpfüngsgruppe ((3- Aminopropyl)aminoxy)acetamid (22) wird hergestellt durch Umsetzen des N- Hydroxysuccinimidylester von 1,1-Dimethylethoxycarbonyl-aminooxy-essigsäure (23) (J. Med. Chem. 36: 1255-126, 1993) mit einem Überschuß von Diaminopropan in wasserfreiem THF. Die Verknüpfüngsgruppe wird von anderen Verbindungen der Reaktionsmischung durch präparative Chromatographie getrennt. Der Linker (Ig) wird dann mit Streptomycin (0,5 g) in 10 ml H&sub2;O-enthaltendem Natriumacetat gemischt. Die wäßrige Lösung wird in einem H&sub2;O-Bad für 10 min erwärmt, um ein rohes Streptomycin-Linker-Addukt (25) zu ergeben, das mittels Chromatographie auf Säure-gewaschenem Aluminiumoxid (J. Am. Chem. Soc. 68: 1460, 1946) aufgereinigt werden kann. Die wäßrige Lösung, enthaltend das Streptomycin-Linker-Addukt (0,15 mmol), wird mit einer wäßrigen Lösung von aktiviertem Cyanocobalamin (2, 3, 4) (01. mmol) gemischt, und EDC (0,5 mmol) wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Zimmertemperatur für 24 Stunden gerührt, dann über eine präparative Umkehrphasenchromatographiesäule zur Aufreinigung des Cyanocobalamin-Streptomycinrezeptormodulierenden Agens (26) laufengelassen.

BEISPIEL 11 SYNTHESE EINES CYANOCOBALAMIN/LYSOSOMOTROPEN VERBINDUNG (ACRIDIN) REZEPTORMODULIERENDEN AGENS

Dieses Beispiel zeigt das Koppeln des Vitamin-B&sub1;&sub2; an Acridin. Chloroquin, Quinacrin und Acridin sind lysosomotrope Farbstoffe, die relativ nicht-toxisch und bis zu mehreren 100-fach in Lysosomen konzentriert sind. Acridin-Derivate können kovalent an eine Zielgruppe (wie etwa Cyanocobalamin) mit dem in Fig. 14, Verfahren A veranschaulichten Reaktionsschema oder in ähnlicher Weise, wie in Verfahren B beschrieben, angehängt werden. Beide Reaktionsschemata produzieren ein Cyanocobalamin-Acridin-Konjugat.

Verfahren A: Eine Diaminseitenkette wird zuerst auf eine Weise synthetisiert, die der Seitenketten von Quinacrin analog ist. Insbesondere wird ein mit mono-Phthaloyl-geschütztes 1,4-. Diaminobutan (27) mit 6,9-Dichloro-2-Methoxyacridin (28) in Phenol umgesetzt (J. Am. Chem. Soc. 66: 1921-1924, 1944). Die Reaktionsmischung wird dann in einen Überschuß von 2 N NaOH gegossen und mit Ether extrahiert. Der Etherextrakt wird mit 1 M NaHCO&sub3;, dann mit H&sub2;O gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Rohprodukt wird aus H&sub2;O-Alkohol umkristallisiert. Die Phthaloyl-Schutzgruppe wird unter Verwendung von wasserfreiem Hydrazin in MeOH (Bioconjugate Chem. 2: 435-440, 1991) entfernt, um das Aminoacridin (29) zu ergeben. Aminoacridin (29) wird dann mit Vitamin-B&sub1;&sub2;-Monocarbonsäure (2, 3, 4) konjugiert, um ein Cyanocobalamin-Acridin-Konjugat (30) zu ergeben.

Verfahren B: Acridinderivat (31) (0,098 mmol, 0,045 g) wurde in 0,5 ml Trifluoressigsäure aufgelöst. Diese Lösung wurde bei Zimmertemperatur für 0,5 h gerührt. TFA wurde mittels eines Aspirationsvakuums entfernt. Der Rückstand wurde in 5 ml Acetonitril aufgelöst und wurde durch einige Tropfen Triethylamin neutralisiert. Acetonitril wurde dann mit einem Aspirationsvakuums entfernt. Der Rückstand wurde in DMSO (10 ml) aufgelöst und Cyanocobalamin-Carbonsäure-Diaminododecan-Succinyl-Derivat (15, 16, 17) (0,098 mmol, 134 mg) wurde zugegeben, gefolgt von Triethylamin (12 ul). Die Reaktionsmischung wurde dann bei Zimmertemperatur für 24 h gerührt (HPLC-überwacht) und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert, was ein Cyanocobalamin-Acridin-Konjugat (32) ergab. Ausbeute: 120 mg (62%), Schmp. 182-188ºC.

¹H NMR (MeOH-d&sub4;, δ): 0,43 (s, 3H, C-20 CH&sub3;); 1,17 (s, 4H, C-46 CH&sub3;); 1,23 (d, 4H, Pr&sub3; CH&sub3;); 1,29 (s, 24H); 1,36 (br s, 6H); 1,4 (s, 6H), 1,65 (m, 2H); 1,87 (s, 4H); 2,05 (m, 2H); 2,25 (s, 6H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,35 (m, 3H); 2,4 (d, 5H); 2,44 (d, 2H); 2,55 (d, 10H), 2,64 (s, 5H); 2,8-2,9 (m, 8H); 3,1-3,15 (m, 6H); 3,3 (s, 6H); 3,4 (m, 1H); 3,65 (m, 2H); 3,75 (d, 1H); 3,9 (d, 1H); 3,98 (s, 2H); 4,0 (m, 2H); 4,1 (d, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 4,48 (m, 1H); 4,6 (m, 2H); 6,0 (s, 1H, C-10); 6,3 (d, 1H, R&sub1;); 6,5 (s, 1H, B4), 7,1 (s, 1H, B2); 7,2 (s, 1H, B7); 7,3 (t, 1H); 7,4 (dd, 1H); 7,6 (dd, 1H); 7,7 (2dd, 2H); 7,8 (d, 1H); 7,9 (d, 1H), 8,4 (d, 1H).

BEISPIEL 12 SYNTHESE EINES CYANOCOBALAMIN/LYSOSOMOTROPEN VERBINDUNG (AMIKACIN)-REZEPTORMODULIERENDEN AGENS

Dieses Beispiel demonstriert die Konjugation von Amikacin an ein Cyanocobalamin- Molekül, um ein Cyanocobalamin-Amikacin-Konjugat zu bilden. Ein Reaktionsschema für die Konjugation wird in Fig. 12 dargestellt. Wie oben bemerkt, werden chemische Gruppen, die subzellulär innerhalb von Lysosomen zurückgehalten werden, als lysosomotrop bezeichnet. Aminoglycoside sind lysosomotrope Verbindungen und können daher als Umleitgruppen dieser Erfindung verwendet werden. Das primäre langkettige Amin an der Hydroxyaminobuttersäureseitenkette des Aminoglycosids, Amikacin (siehe Fig. 3), ist bevorzugt reaktiv. Im einzelnen wird Amikacin (33) (Sigma Chemical Co., St. Louis) mit einem Vitamin-B&sub1;&sub2;- Monocarboxylat (2, 3, 4) in der Anwesenheit von EDC umgesetzt. Ein Cyanocobalamin- Amikacin-Konjugat (34) wird dann getrennt und mittels Umkehrphasen-LC-Chromatographie unter den oben angeführten Bedingungen aufgereinigt.

BEISPIEL 13 CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄURE-DIAMINODODECAN-KONJUGAT- DIMER: ISOPHTHALOYLDICLORID-QUERVERNETZUNG

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Cyanocobalamin-Dimers, geeignet zur Verwendung als ein Quervernetzungs-rezeptormodulierendes Agens. Die Quervernetzung von Rezeptoren ist in einigen Rezeptorsystemen ausreichend, um ein Umleiten von Zelloberflächenrezeptoren zu Lysosomen zum Abbau zu verursachen anstelle ihres normalen Wegs des Rezeptor-Recycling.

Einer Lösung von Cyanocobalamin-Monocarbonsäure-Diaminododecan-Konjugat (8, 9, 10) (0,192 mmol, 0,300 g) in DMF (30 ml) wurde Triethylamin (18 ul) zugegeben. Isophthaloyldichlorid (35) (0,096 mmol, 0,0195 g) wurde über eine Periode von 10-15 min zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 55-60ºC für 48 h gerührt (HPLC-überwacht) und bis zur Trockenheit eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 20 ml Methanol : H&sub2;O (7 : 3) aufgelöst und auf einer Umkehrphasen-C-18-Säule (500 mm · 25 mm, Alltech, 150 psi) aufgetragen, die mit demselben Lösungsmittel entwickelt wurde. Ein peristaltisches RAININ-Rabbit-plus- Pumpensystem wurde mit einem UV-sichtbar-Extinktionsdetektor DYNAMAX (Modell UV- 1) verwendet. Das Eluat wurde mit einem automatischen Fraktionssammler gesammelt. Die Fraktionen, die das Endprodukt enthielten (HPLC-überwacht) wurden bis zur Trockenheit eingedampft.

b-Säure-Dimer (36): Ausbeute: 96 mg (30%). Schmp. 217-220ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (D&sub2;O, δ): 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 1,18 (s, 8H); 1,3 (m, 36H); 1,37 (m, 12H); 1,46 (s, 10H), 1,6 (m, 8H); 1,9 (d, 12H); 2,05 (m, 10H); 2,2 (d, 16H, B10 & B11 CH&sub3;), 2,35 (m, 8H); 2,6 (d, 18H), 2,8-3,0 (m, 16H); 3,15 (m, 6H); 3,3 (s, 8H); 3,37 (m, 14H); 3,6 (m, 4H); 3,76 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,07 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,18 (m, 2H); 4,3 (m, 2H); 4,5 (m, 2H); 4,6 (s, 2H); 4,68 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R&sub1;); 6,6 (s, 2H, 2B4), 7,1 (s, 1H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,54 (t, 1H); 7,95 (d, 2H); 8,25 (s, 1H); MS (FAB&spplus;): m/e 3208. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV: λ360 (ε42 380).

e-Säure-Dimer (37): Ausbeute: 121 mg (38%). Schmp. 220-222ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (D&sub2;O, δ): 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 1,17 (s, 8H); 1,22 (d, 13H); 1,29 (s, 45H); 1,36 (d, 22H); 1,44 (s, 10H), 1,6 (m, 8H); 1,87 (s, 8H); 2,04 (m, 10H); 2,25 (s, 12H, B10 & B11 CH&sub3;), 2,36 (m, 8H); 2,55 (d, 20H), 2,8 (m, 8H); 3,15 (m, 8H); 3,29 (s, 10H); 3,36 (m, 14H); 3,6 (m, 4H); 3,73 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,07 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,16 (m, 2H); 4,3 (m, 2H); 4,5 (m, 2H); 4,6 (s, 2H); 4,66 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R&sub1;); 6,6 (s, 2H, 2B4), 7,1 (s, 1H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,54 (t, 1H); 7,93 (d, 2H); 8,25 (s, 1H); MS (FAB&spplus;): m/e 3208. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε33 854).

d-Säure-Dimer (38): Ausbeute: 96 mg (30%). Schmp. 225-228ºC mit Zersetzung. ¹H NMR (D&sub2;O, δ): 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 1,16 (s, 8H); 1,29 (m, 36H); 1,35 (d, 12H); 1,44 (s, 10H), 1,53 (m, 6H); 1,6 (m, 8H); 1,85 (s, 12H); 2,03 (m, 8H); 2,25 (d, 12H, B10 & B11 CH&sub3;), 2,33 (m, 8H); 2,54 (d, 20H), 2,8 (m, 8H); 3,13 (m, 8H); 3,28 (s, 12H); 3,35 (m, 12H); 3,6 (m, 4H); 3,73 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,07 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,16 (m, 2H); 4,3 (m, 2H); 4, 5 (m, 2H); 4,64 (m, 2H); 4,7 (s, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R1); 6,6 (s, 2H, 2B4), 7,1 (s, 1H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,54 (t, 1H); 7,93 (d, 2H); 8,25 (s, 1H); MS (FAB&spplus;): m/e 3208. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360 (ε31 747).

BEISPIEL 14 CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄURE-DIAMINODODECAN-KONJUGAT- DIMER: ETAC-QUERVERNETZUNG

Dieses Beispiel dient dazu, die Synthese eines bivalenten rezeptormodulierenden Agens unter Verwendung eines heterotrifunktionellen Quervernetzers zu illustrieren. Das Reaktionsschema für diese Synthese wird in Fig. 15 dargestellt. Der heterotrifunktionellen Quervernetzer wird als ETAC-Reagenz gebildet (Bioconjugate Chem. 1: 36-50, 1990; Bioconjugate Chem. 1: 51-59, 1990, J. Am. Chem. Soc. 101: 3097-3110, 1979). Eine Bivalenz verleiht zusätzlich dazu, daß sie die Bindungsaffinität erhöht, ebenso die Fähigkeit, benachbarte Rezeptoren querzuvernetzen und Endocytose auszulösen. Die bivalenten "Arme" des Mittels können mit Peptid- oder anderen verknüpfenden Molekülen verlängert werden, um eine simultane Bindung von beiden "Armen" zu ermöglichen. Im Falle von Vitamin-B&sub1;&sub2; kann dies durch Gelfiltration beurteilt werden. Wenn die Linker eine simultane Wechselwirkung ermöglichen, wird es zwei Mole Teil für jedes Mol an ETAC-Dimer geben, das in einem einzelnen Peak von 80.000 m. w. vorhanden ist (gegenüber 40.000 m. w. an monomerem Teil). Eine simultane Bindung von zwei Molen Teil wird dann das Potential zum bivalenten Binden an Zelloberflächenrezeptoren haben. Dies kann durch Vergleich der Affinität der Monomer- und Dimerbindung an den Rezeptor getestet werden. Während das bivalente Mittel so synthetisiert werden kann, daß es eine beliebige Umleitgruppe dieser Erfindung einschließt, die die lysosomale Zielsetzung und Zurückhaltung verstärkt, wird die Verbindung Tyramin, die für radioaktives Markieren nützlich ist, zu Illustrationszwecken offenbart.

Unter Bezugnahme auf Fig. 15 wird Carboxy-ETAC (39) mittels des Verfahrens von Liberatore et al. (Biocomugate Chem. 1: 1990) hergestellt. Das Carboxy-ETAC wird in sein Säurechlorid durch Reaktion in Thionylchlorid umgewandelt. Eine Zugabe von Amin (40) ergibt das Amin-ETAC-Addukt (41). Die Reaktion von Amin-ETAC (1 mmol) in CH&sub3;CN mit 1 M wäßrigem Cysteamin (10 mmol) wird durchgeführt durch Rühren bei Zimmertemperatur für 24 h. Diese Verbindung wird mit NaCNBH&sub3; unter sauren Bedingungen reduziert. Das rohe Amin-ETAC-Cysteamin-Addukt (42) wird mittels Umkehrphasen-LC unter Verwendung von oben aufgeführten Bedingungen aufgereinigt. Ein Vitamin-B&sub1;&sub2;-Monocarboxylat (2, 3, 4) wird mit der Tyramin-ETAC-Cysteamin-Verbindung durch Umsetzen mit EDC in H&sub2;O konjugiert.

Das resultierende Vitamin-B&sub1;&sub2;-ETAC-Tyramin-Dimer (43) wird mittels Umkehrphasen-LC unter Verwendung von oben beschriebenen Bedingungen aufgereinigt.

BEISPIEL 15 CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄURE-DIAMINODODECAN-KONJUGAT- DIMER: ISOPHTHALAT-QUERVERNETZUNG MIT BIOTINGRUPPE

Dieses Beispiel illustriert die Synthese eines bivalenten rezeptormodulierenden Agens, das zusätzlich an eine Biotingruppe (44) gekoppelt ist. Eine weitere Modifizierung kann durch Koppeln dieses Moleküls mit einer Avidin- oder Strepavidingruppe erhalten werden.

Reaktionschritt A: Biotin (12,3 mmol, 3 g) wurde in warmem (Badtemperatur 70ºC) DMF (60 ml) unter einer Argonatmosphäre aufgelöst. Es wurde dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt, und DCC (13,5 mmol, 2,79 g) wurde zugegeben, gefolgt von Tetrafluorophenol (24,6 mmol, 4,08 g). Die Reaktionsmischung wurde dann auf 0ºC gekühlt und für 0,5 h gerührt. Sie wurde dann auf Umgebungstemperatur zurückgebracht und für weitere 4-5 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gefiltert, und das Filtrat wurde bis zur Trockenheit eingedampft. Der Niederschlag wurde mit Acetonitril (50 ml) gewaschen und wurde gefiltert, um 5 g (98%) eines weißen Feststoffs (45) zu ergeben.

¹H NMR (DMSO, δ): 1,4 (m, 2H); 1,7 (m, 2H); 2,5 (t, 2H); 2,8 (t, 2H); 3,1 (m, 1H); 4,1 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 6,4 (d, 2H); 7,9 (m, 1H).

Reaktionschritt B: 6-Aminohexansäure (46) (7,5 mmol, 0,99 g) wurde in H&sub2;O (75 ml) aufgelöst. Triethylamin (0,5 ml) wurde zugegeben, gefolgt von einer Lösung von TFP-Ester von Biotin (5 mmol, 1,96 g) in warmem Acetonitril (300 ml). Die Reaktion wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Sie wurde dann gefiltert, gewaschen mit H&sub2;O (50 ml) und unter hohem Vakuum getrocknet. Ausbeute: 0,870 g (47%). Das Filtrat wurde bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in kochendem Acetonitril (75 ml) aufgenommen und wurde gefiltert, gewaschen mit heißem Acetonitril. Der Feststoff (47) wurde unter hohem Vakuum getrocknet, um 0,6 g zu ergeben, bei einer Ausbeute von insgesamt 1,47 g (79%).

¹H NMR (DMSO, δ): 1,2-1,6 (m, 8H); 2,0 (t, 2H); 2,2 (t, 2H); 2,5 (dd, 2H); 2,8 (dd, 2H); 3,1, (m, 3H); 4,1 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 6,4 (d, 2H); 7,7 (m, 1H).

Reaktionschritt C: Biotin-konjugierte Hexansäure (47) (2,68 mmol, 1 g) wurde in DMSO (50 ml) aufgelöst. Triethylamin (0,4 ml) wurde zugegeben, gefolgt von TFP-Acetat (4,02 mmol, 1,05 g). Die Reaktionsmischung wurde dann bei Zimmertemperatur für 15-20 min gerührt (HPLC-überwacht). Sie wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ether und Dichlormethan gewaschen und unter hohem Vakuum getrocknet (48). Ausbeute: 1,24 g (89%).

¹H NMR (DMSO, δ): 1,2 (t, 2H); 1,3-1,7 (m, 5H); 2,1 (t, 2H); 2,6 (dd, 2H); 2,8 (m, 4H); 3,1 (m, 4H); 4,2 (m, 1H); 4,4 (m, 1H); 6,4 (d, 2H); 7,8 (t, 1H); 8,0 (m, 1H).

Reaktionschritt D: TFP-Ester von Biotin-Hexansäure (48) (0,67 mmol, 0,35 g) wurde in DMF (40 ml) aufgelöst. Triethylamin (80 ul) wurde zugegeben, gefolgt von Aminoisophthalsäure (1,005 mmol, 0,182 g). Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur für 8 Tage gerührt (HPLC-überwacht), während Triethylamin (80 ul) jedesmal nach 24 h zugegeben wurde. Es wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde dann auf eine Siliziumdioxidsäule aufgetragen und wurde anfänglich mit Acetonitril (450 ml) eluiert. Er wurde dann mit Methanol eluiert, 20 ml an Fraktionen wurden gesammelt, bei der Fraktion 2 wurde das Lösungsmittel zu DMF gewechselt. Die Fraktionen, die das Endprodukt enthielten (HPLC überwacht), wurden bis zur Trockenheit eingedampft (49), um 230 mg (65%) zu ergeben.

¹H NMR (DMSO-d&sub6;, δ): 1,3-1,7 (m, 8H); 2,1 (t, 2H); 2,3 (t, 2H); 2,6 (m, 2H); 2,8 (m, 2H); 3,1 (m, 3H); 4,1 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 6,4 (d, 2H); 7,8 (t, 1H); 8,1 (m, 1H); 8,46 (s, 2H).

Reaktionsschritt E: Biotin-Hexansäure-Isophthalsäure (49) (0,376 mmol, 200 mg) wurde in DMF (30 ml) unter Argonatmosphäre aufgelöst. TFP-Acetat (0,94 mmol, 241 mg) wurde mittels einer Nadel mit doppelten Ende zugegeben, gefolgt von Triethylamin (112 ul). Die Reaktion wurde dann bei Zimmertemperatur für 24 h (HPLC-überwacht) gerührt. Sie wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Das hellbraune Öl wurde in Ether aufgenommen, der Feststoff wurde gefiltert und mit Ether gewaschen (50 ml) (50), um 250 mg (86%) zu ergeben.

¹H NMR (DMSO-d&sub6;, δ): 1,3-1,7 (m, 8H); 2,1 (t, 2H); 2,3 (t, 2H); 2,6 (m, 2H); 2,8 (m, 2H); 3,1 (m, 3H); 4,2 (m, 1H); 4,4 (m, 1H); 6,4 (d, 2H); 7,8 (t, 1H); 8,1 (m, 2H); 8,57 (s, 1H); 8,9 (s, 2H).

Reaktionsschritt F: Zu einer Lösung aus Cyanocobalamin-Carbonsäure-Diaminododecan- Konjugat (8, 9, 10) (0,130 mmol, 0,2 mg) in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (3 : 1) (40 ml), wurde Triethylamin (12 ul) zugegeben. DiTFP-Ester von Biotin-Hexansäure-Isophthalsäure (50) (0,065 mmol, 0,050 g) wurde über eine Periode von 5-10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur für 3 h (HPLC-überwacht) gerührt. Sie wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert, um 230 mg (62%) (51) zu ergeben. Schmp 195-198ºC mit Zersetzung.

BEISPIEL 16 CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄURE-DIAMINODODECAN-KONJUGAT- DIMER: ISOPHTHALAT-QUERVERNETZUNG MIT PARA-IODOBENZOYL- GRUPPE

Dies ist ein Beispiel für ein bivalentes rezeptormodulierendes Agens, das auch an eine para- Iodobenzoyigruppe konjugiert ist.

Reaktionsschritt A: Eine Menge von 5 g (28 mmol) an 5-Aminoisophthalsäure (52) wurde in 30 ml 1 N NaOH aufgelöst und in ein Eis/Wasserbad gebracht. Zur kalten Lösung wurden 7,5 g (28 mmol) 4-Iodbenzoylchlorid (52) in 60 ml Acetonitril tropfenweise zugegeben. Der dicke weiße Niederschlag wurde dann für 10 Minuten vor Entfernung des Eis/Wasserbads gerührt, und die Mischung wurde für zusätzliche 10 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf pH4 mit Essigsäure eingestellt, und der resultierende Feststoff eingesammelt. Der Feststoff wurde dann in 30 ml 1 N NaOH aufgelöst und mit Ether (2 · 50 ml) gewaschen. Die resultierende wässrige Lösung wurde gefiltert und auf pH 4 mit Essigsäure angesäuert. Der weiße Niederschlag wurde dann gesammelt und unter hohem Vakuum getrocknet, um 0,6 g (99+%) von (54) zu ergeben. Schmp > 300ºC; IR (Nujol, cm&supmin;¹) 3570(m), 3300(m), 1645, 1580(m), 1525(m), 760(m); ¹H NMR (DMSO-d&sub6;, δ), 8,51 (2H, d, J = 0,7 Hz), 8,27 (1H, s), 7,94 (2H, d, J = 4,2 Hz), 7,84 (2H, d, J = 4,1 Hz).

Reaktionsschritt B: Eine Menge von 5 g (12,2 mmol) an 5-[N-Iodbenzoyl)amino]- isophthalsäure (54) wurde in 100 ml wasserfreiem Ethylacetat suspendiert. Hierzu wurden 12,5 g (73 mmol) 2,3,5,6-Tetrafluorphenol (55) zugegeben, gefolgt von 5 g (24,2 mmol) 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid. Diese Suspension wurde dann bei Zimmertemperatur für 3 Tage vor dem Abfiltern des Feststoffs und Waschen mit zusätzlichen 20 ml Ethylacetat gerührt. Das Filtrat wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der resultiertende klebrige weiße Feststoff wurde in 50 ml Acetonitril suspendiert und für 30 Minuten gerührt. Das Filtern ergab 3,75 g an weißem Feststoff (43%) (56). Schmp. 250-251ºC; IR (Nujol, cm&supmin;¹) 3220(m), 3060(m), 1750, 1655, 1520, 1485, 1330, 1195, 1110, 1085, 955 (m), 945(m); ¹H NMR (DMSO-d&sub6;, δ), 9,06 (2H, d, J = 0,7 Hz), 8,57 (1H, t, J = 1,4 Hz), 8,04 (2H, m), 7,94 (2H, d, J = 4,2 Hz), 7,81 (2H, d, J = 4,3 Hz).

Reaktionsschritt C: Zu einer Lösung aus Cyanocobalamin-Carbonsäure-Diaminododecan- Konjugat (56) (0,192 mmol, 0,3 g) in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (3 : 1) (40 ml) wurde Triethylamin (0,018 ml) zugegeben. Zu dieser Lösung wurde DiTFP-Ester von 5-[N-(p- Iodobenzoyl)amino]-isophthalsäure (57) (0,096 mmol, 0,068 g) über eine Periode von 5-10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur für 4-5 h (HPLC überwacht) gerührt. Sie wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 20 ml Methanol: H&sub2;O (8: 2) aufgelöst und auf eine Umkehrphasen-C-18-Säule (500 mm · 25 mm, Alltech, 150 psi) aufgetragen, die mit demselben Lösungsmittel entwickelt wurde. Ein peristaltisches RAININ-Rabbit-Plus-Pumpsystem wurde verwendet mit einem UV-sichtbar-Extinktionsdetektor DYNAMAX (Modell UV-1); das Eluat wurde mit einem automatischen Fraktionssammler gesammelt. Die Fraktionen, die das Endprodukt enthielten (HPLC-überwacht), wurden bis zur Trockenheit eingedampft.

b-Säure-Dimer (58): Ausbeute: 280 mg (76%), Schmp. 230-233ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (D&sub2;O, δ) 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 1,19 (s, 8H); 1,3 (m, 36H); 1,37 (d, 12H); 1,46 (s, 10H), 1,63 (m, 8H); 1,87 (s, 12H); 2,05 (m, 10H); 2,27 (d, 16H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,35 (m, 8H), 2,6 (d, 18H); 2,8 (s, 8H); 3,0 (s, 10H); 3,15 (m, 8H); 3,3 (d, 8H); 3,37 (m, 14H); 3,6 (m, 2H); 3,68 (d, 2H); 3,76 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,07 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,18 (m, 2H); 4,3 (m, 2H), 4,5 (m, 2H); 4,64 (m, 4 H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R&sub1;); 6,6 (s, 2H, 2B4); 7,1 (s, 2H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,7 (d, 2H); 7,9 (d, 2H); 7,99 (d, 1H); 8,28 (s, 2H); MS (FAB&spplus;): m/e 3453. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360,6 (ε48 871).

e-Säure-Dimer (59): Ausbeute: 258 mg (70%), Schmp. 285-2903ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (D&sub2;O, δ) 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 1,17 (s, 8H); 1,22 (m, 13H); 1,29 (s, 45H); 1,36 (d, 22H), 1,44 (s, 10H); 1,6 (m, 8H); 1,86 (s, 12H); 2,04 (m, 10H); 2,25 (s, 12H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,36 (m, 8H), 2,55 (d, 20H); 2,83 (m, 8H); 3,15 (m, 8H); 3,29 (s, 10H); 3,36 (m, 8H); 3,58 (m, 2H); 3,65 (m, 2H); 3,75 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,06 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,16 (m, 2H); 4,3 (m, 2H); 4,5 (m, 2H), 4,57 (s, 2H); 4,65 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R1); 6,5 (s, 2H, 2B4); 7,1 (s, 2H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,7 (d, 2H); 7,89 (d, 2H); 7,98 (s, 1H); 8,26 (s, 2H); MS (FAB&spplus;): m/e 3453. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360,6 (ε41 481).

d-Säure-Dimer (60): Ausbeute: 265 mg (72%), Schmp. 253-255ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (D&sub2;O, δ) 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 1,16 (s, 8H); 1,22 (d, 12H); 1,33 (m, 36H); 1,43 (s, 10H), 1,53 (m, 6H); 1,6 (m, 8H); 1,86 (s, 12H); 2,03 (m, 8H), 2,25 (d, 12H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,33 (m, 8H), 2,54 (d, 20H); 2,8 (s, 4H); 3,0 (s, 4H); 3,28 (s, 10H); 3,35 (m, 8H); 3,58 (m, 2H); 3,65 (m, 2H); 3,73 (m, 2H); 3,88 (d, 2H); 4,05 (m, 2H); 4,1 (m, 2H); 4,17 (m, 2H); 4,3 (m, 2H), 4,5 (m, 2H), 4,57 (s, 2H); 4,63 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R&sub1;); 6,5 (s, 2H, 2B4); 7,1 (s, 2H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,7 (d, 2H); 7,89 (d, 2H); 7,98 (s, 1H); 8,26 (s, 2H); MS (FAB&spplus;): m/e 3453. IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660, 1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹. UV (MeOH): λ360,6 (ε48 245).

BEISPIEL 17 CYANOCOBALAMIN-MONOCARBONSÄURE-DIAMINODODECAN-KONJUGAT- DIMER: ISOPHTHALAT-QUERVERNETZUNG MIT PARA-(TRI- BUTYLSTANNYL)BENZOYL-GRUPPE

Dies ist ein Beispiel eines bivalenten rezeptormodulierenden Agens, gekoppelt an eine para- (Tri-Butylstannyl)-Gruppe.

Reaktionsschritt A: Eine Menge von 2 g (28 mmol) des diTFP-Esters von 5-[N-(p- Iodobenzoyl)amino]-isophthalsäure (57) (wie oben hergestellt) wurde in 20 ml trockenem Toluol unter Argon aufgelöst. Hierzu wurden 2,8 ml (5,5 mmol) von (Tributylzinn) (61) zugegeben, gefolgt von 40 mg (0,04 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (62). Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur für 15 Minuten gerührt vor einem Erwärmen auf 80ºC für 2 Stunden. Da die Mischung nur geringfügig während der 2 h-Periode dunkler wurde, wurden zusätzlich 40 mg Palladium-Katalysator zugegeben. Innerhalb 1 Stunde war die Mischung schwarz geworden. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde das Toluol mittels Rotationsverdampfung entfernt. Das resultierende schwarze Öl (enthaltend Feststoffe) wurde dann in 20 ml Ethylacetat aufgenommen und auf 10 g Kieselgel (mittels Rotationsverdampfung) getrocknet. Dieser Feststoff wurde dann zu einer 250 g (40 · 3,5 cm) Kieselgelsäule zugegeben und anfänglich mit Hexanen eluiert, enthaltend 5% Essigsäure. Nach 600 ml wurde das Lösungsmittel zu 90/10 Hexane/Ethylacetat (enthaltend 5% Essigsäure) gewechselt. Die Fraktionen 14-16 wurden kombiniert und getrocknet, um 1,5 g (62%) eines weißen Feststoffes zu ergeben (62). Schmp 120-123ºC;

¹H NMR (CDCl&sub3;, δ), 8,87 (2H, d, J = 0,7 Hz), 8,76 (1H, t, J = 1,6 Hz), 8,38 (1H, s), 7,84 (2H, d, J = 4,1 Hz), 7,62 (2H, d, J = 4,1 Hz), 7,07 (2H, m), 1,55 (6H, m), 1,36 (15H, m), 1,11 (6H, m) , 0,89 (9H, t, J = 7,3 Hz); MS (FAB&spplus;) M + H Muster, berechnet 870 (75,1%), 871 (52,9%), 872 (100%), 873 (41,0%), 874 (21,4%), gefunden 870 (82,1%), 871 (55,1%), 872 (100%), 873 (42,1%), 874 (25,2%).

IR(Nujol, cm&supmin;¹) 1750, 1645, 1520, 1480(m), 1185, 1100, 1085.

Reaktionsschritt B: Zu einer Lösung aus Cyanocobalamin-Carbonsäure-Diaminododecan- Konjugat (8, 9, 10) (0,065 mmol, 0,1 g) in einer Mischung von DMF : H&sub2;O (3 : 1) (40 ml) wurde Triethylamin (0,006 ml) zugegeben. DiTFP-Ester von 5-[N-(p- Tributylzinnbenzoyl)amino]-isophthalsäure (63) (0,0325 mmol, 0,028 g) wurde über eine Periode von 5-10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur für 12-14 h (HPLC-überwacht) gerührt. Sie wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit 100 ml Aceton verdaut, und das Lösungsmittel wurde dekantiert.

b-Säure-Dimer (64): Ausbeute: 90 mg (70%), Schmp. 208-212ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (D&sub2;O, δ) 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 0,88 (t, 9H); 1,15 (t, 12H); 1,19 (s, 8H); 1,3 (m, 36H); 1,37 (d, 12H); 1,46 (s, 10H), 1,6 (m, 8H); 1,9 (s, 12H); 2,05 (m, 10H); 2,28 (d, 16H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,35 (m, 8H), 2,6 (d, 18H); 2,8-2,9 (m, 16H); 3,15 (m, 8H); 3,3 (s, 8H); 3,37 (m, 14H); 3,6 (m, 4H); 3,76 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,07 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,18 (m, 2H); 4,3 (m, 2H), 4,5 (m, 2H); 4,68 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2Ri); 6,6 (s, 2H, 2B4); 7,1 (s, 2H, 2B2); 7,25 (d, 2H, 2B7); 7,6 (d, 2H); 7,9 (d, 2H); 7,99 (br s, 1H); 8,28 (br s, 2H); IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660,1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹.

e-Säure-Dimer (65) Ausbeute: 93 mg (72%), Schmp. > 300ºC, ¹H NMR (D&sub2;O, δ) 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 0,88 (t, 9H); 1,12 (t, 12H); 1,17 (d, 8H); 1,22 (d, 13H); 1,29 (s, 45H); 1,36 (s, 22H), 1,44 (s, 10H); 1,6 (m, 8H); 1,87 (d, 12H); 2,04 (m, 10H); 2,25 (s, 12H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,36 (m, 8H), 2,55 (d, 20H); 2,8 (m, 8H); 3,15 (m, 8H); 3,29 (s, 10H); 3,36 (m. 14H); 3,6 (m, 4H); 3,73 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,07 (m, 2H); 4,12 (m, 2H); 4,16 (m, 2H); 4,3 (m, 2H); 4,5 (m, 2H), 4,66 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R1); 6,6 (s, 2H, 2B4); 7,1 (s, 2H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,6 (d, 2H); 7,9 (d, 2H); 7,98 (br s, 1H); 8,28 (br s, 2H); IR (KBr): 3400, 3200,2950, 2060,1660,1570,1490, 1060 cm&supmin;¹.

d-Säure-Dimer (66): Ausbeute: 100 mg (78%), Schmp. 202-205ºC mit Zersetzung, ¹H NMR (D&sub2;O, δ) 0,43 (s, 6H, C-20 CH&sub3;); 0,88 (t, 9H); 1,12 (t, 12H); 1,15 (s, 8H); 1,29 (m, 36H); 1,35 (d, 12H), 1,44 (s, 10H); 1,53 (m, 6H); 1,6 (m, 8H); 1,86 (d, 12H), 2,03 (m, 8H); 2,25 (d, 12H, B10 & B11 CH&sub3;); 2,33 (m, 8H), 2,54 (d, 20H); 2,8 (m, 8H); 3,13 (m, 8H); 3,28 (s, 10H); 3,35 (m, 10H); 3,6 (m, 4H); 3,73 (m, 2H); 3,9 (d, 2H); 4,05 (m, 2H); 4,1 (m, 2H); 4,17 (m, 2H); 4,3 (m, 2H); 4,5 (m, 2H), 4,6 (m, 2H); 6,0 (s, 2H, 2C-10); 6,26 (d, 2H, 2R&sub1;); 6,6 (s, 2H, 2B4); 7,1 (s, 2H, 2B2); 7,25 (s, 2H, 2B7); 7,6 (d, 2H); 7,9 (d, 2H); 7,98 (br s, 1H); 8,28 (br s, 2H); IR (KBr): 3400, 3200, 2950, 2060, 1660,1570, 1490, 1060 cm&supmin;¹.

BEISPIEL 18 BEWERTUNG DER FÄHIGKEIT DER VITAMIN-B&sub1;&sub2; REZEPTORMODULIERENDEN AGENTIEN, TCII ZU BINDEN

Dieses Beispiel dient dazu, einen kompetitiven Bindungsassay zu zeigen, der geeignet ist zum Bewerten der Fähigkeit von Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierenden Agentien, Teil zu binden. Die Bindung der Vitamin-B&sub1;&sub2;-Derivate an rekombinantes Transcobalamin II wurde in pikomularen Konzentrationen durchgeführt und der prozentuale gebundene Anteil festgestellt.

Bei diesem kompetitiven Bindungsassay wurden verschiedene B&sub1;&sub2;-Derivate, einschließlich Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierenden Agentien, auf ihre Fähigkeit bewertet, Teil zu binden relativ im Vergleich zu radioaktiv markierten B&sub1;&sub2;. Verschiedene Konzentrationen von jedem Derivat wurde mit immobilisiertem TcII in der Anwesenheit einer konstanten Menge von radioaktiv markierten B&sub1;&sub2; inkubiert. Nach Inkubation für 20 Minuten bei 37ºC wurde das freie radioaktiv markierte B&sub1;&sub2; von dem Teil gebundenen Tracer mittels Entfernung des Überstandes getrennt. Die Radioaktivität der Überstandslösung wurde dann gemessen, um die Menge an freiem radioaktiv markiertem B&sub1;&sub2; zu bestimmen, das am Ende eines jeden Wettbewerbs vorhanden war. Durch Messung der Menge an freiem radioaktiv markierten B&sub1;&sub2; für jeden Wettbewerb wurde die Fähigkeit jedes Derivats, die Bindung von radioaktiv markierten B&sub1;&sub2; zu inhibieren, bestimmt. Eine Bindungskurve wurde dann für jedes B&sub1;&sub2;-Derivat konstruiert, wobei die Menge an radioaktiv markiertem gebundenen B&sub1;&sub2; (% radioaktiver Marker gebunden) mit der Konzentration des in der ursprünglichen Mischung vorhandenen Derivats korreliert wurde. Je effektiver das Derivat bei der Bindung an Teil ist, desto niedriger der prozentuale Anteil an gebundenem radioaktiv markierten Vitamin-B&sub1;&sub2;.

Fig. 22 zeigt die Bindungskurve von Cobalamin II an die Cyanocobalamin- Monocarbonsäuren, die in Beispiel 1 hergestellt wurden. AD = Cyanocobalamin (1); AL = Cyanocobalamin-b-monocarbonsäure (2); AM = Cyanocobalamin-e-monocarbonsäure (3); und AN = Cyanocobalamin-rf-monocarbonsäure (4). Das d-Carboxylat (3) scheint beinahe so gut wie Cyanocobalamin zu binden. Zwei Proben von Vitamin B&sub1;&sub2; wurden verwendet, eine als ein bekannter Standard und die andere als eine Unbekannte.

Fig. 23 zeigt die Bindungskurve von Transcobalamin II an die Cyanocobalamin- Diaminododecan-Addukte (8, 9, 10) und das Succinat-Addukt (13), hergestellt, in Beispiel 3 und 4 oben. AH = Cyanocobalamin-b-monocarbonsäure-conj.-diaminododecan (7), AI = Cyanocobalamin-e-monocarbonsäure-conj.-diaminododecan (8), AJ = Cyanocobalamin-d- monocarbonsäure-conj.-diaminododecan (9), AK = Cobalamin-e-monocarbonsäure-conj.- diaminododecan und AE = Cyanocobalamin-Ribose-Succinat (11). Das b-Konjugat (17) hat die geringste Bindung, während das e-Konjugat (18) eine mittlere Bindung hat, und das d- Konjugat (19) ziemlich gut bindet. Das an die Ribosestelle angehängte Biotin-Konjugat (13) scheint sehr gut zu binden, was auch sein Vorläufer-Aminoderivat (12) tut. Die zusätzlich untersuchte Verbindung ist von einer unbekannten Struktur, hat aber möglicherweise die Amingruppe mit dem Kobaltatom koordiniert, da das Massenspektrum anzeigt, daß es die passende Masse für (7) minus HCN hat. Es ist klar, daß diese unbekannte Verbindung wahrscheinlich nicht Teil bindet.

Fig. 24 zeigt die Bindungskurve von Transcobalamin II an einer Reihe von Vitamin-B&sub1;&sub2;- Dimeren. Dimer X = b-Säure-Dimer mit Isophthaloyidichlorid (36); Dimer Y = e-Säure- Dimer mit Isophthaloyidichlorid (37); Dimer Z = d-Säure-Dimer mit Isophthaloyidichlorid (38); Dimer A = b-Säure-Dimer mit p-Iodobenzoyl-Isophthaloyldichlorid (58); Dimer B = e- Säure-Dimer mit p-Iodobenzoyl-Isophthaloyldichlorid (59); und Dimer C = d-Säure-Dimer mit p-Iodobenzoyl-Isophthaloyldichlorid (60).

Fig. 25 zeigt die Bindungskurve von Transcobalamin II an einer Reihe von biotinylierten Vitamin-Bis-Molekülen. AA = Cyanocobalamin-b-Monocarbonsäure-conj.-Diaminododecan und Biotin (17); AB = Cyanocobalamin-c-Monocarbonsäure-conj.-Diaminododecan und Biotin (18); AC = Cyanocobalamin-d-Monocarbonsäure-conj.-Diaminododecan und Biotin (19); AF = Cyanocobalamin-Ribose-Succinat-conj.-Diaminododecan (13); und AG = Cyanocobalamin-Ribose-Succinat-conj.-Diaminododecan und Biotin (20).

BEISPIEL 19 ASSAY AUF DIE BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON VITAMIN-B&sub1;&sub2;- REZEPTORMODULIERENDEN AGENTIEN

Dieses Beispiel dient dazu, die Verwendung eines Assays zu demonstrieren, um die biologische Aktivität der rezeptormodulierenden Agentien der vorliegenden Erfindung zu bestimmen.

Eine Herabmodulierung eines Rezeptors beinhaltet einen Vergleich der Behandlung einer Zielzellinie, wie etwa K562, jede Probe wird mit Vitamin-B&sub1;&sub2; oder einem Vitamin-B&sub1;&sub2;- rezeptormodulierenden Agens bei 4ºC für 24 Stunden behandelt. Nach dieser Periode werden die Zellen jeder Probe von einem Vitamin-B&sub1;&sub2; oder einem Vitamin-B&sub1;&sub2;- rezeptormodulierenden Agens mittels Zentrifugation getrennt. Die Zellen werden dann gewaschen und in Phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 2 mM EDTA, für eine kurze Zeitperiode, die 15 Minuten bei 4ºC nicht überschreitet, resuspendiert. Dann werden die Zellenwieder gewaschen und in ein Gewebekulturmedium bei 4ºC zurückgebracht. Das Gewebekulturmedium enthält Teil und einen radioaktiv markierten TcII/B&sub1;&sub2;-Komplex. Der Zeitverlauf der TcII/B&sub1;&sub2;-Bindung an den Zellrezeptor wird durch Messen des prozentualen Anteils an radioaktivem Marker bestimmt, der an die Zelle bei 0, 15, 30, 60, 120 und 240 Minuten gebunden wird. Diejenigen Proben, die den Vitamin-B&sub1;&sub2;-rezeptormodulierenden Agentien der vorliegenden Erfindung ausgesetzt worden waren, zeigen signifikant reduzierte TcII/B&sub1;&sub2;- Komplexbindung im Vergleich mit Zellen, die in Vitamin-B&sub1;&sub2; kultiviert worden sind. Trypsin-behandelte Zellen zeigen eine nicht-spezifische Bindung oder Aufnahme des markierten Vitamin-B&sub1;&sub2; auf oder innerhalb der Zelle.

BEISPIEL 20 VERFAHREN ZUM BESTIMMEN DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT EINES REZEPTORMODULIERENDEN AGENS

Dieses Beispiel dient dazu, ein Verfahren zu demonstrieren, das zum Bestimmen der biologischen Aktivität eines rezeptormodulierenden Agens der vorliegenden Erfindung geeignet ist.

0,2 · 10&sup6;-Zellen/ml K562-Zellen wurden in RPMI-Medium kultiviert, das durch Zugabe von 10 uM MeTHF, 2,7 nM Vitamin-B&sub1;&sub2; und 1% menschlichem Serum modifiziert worden war. Kein Folat wurde zugegeben. 10 uM d-Diaminododecan-Addukt (7) wurde zugegeben und über 9 Tage bei 37ºC kultiviert. 10 uM Vitamin-B&sub1;&sub2;, das unter identischen Bedingungen wie (7) kultiviert wurde, wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Kulturen wurden dann unabhängig voneinander im Hinblick auf Proliferation und Zelltod mittels Trypan-Blau-Ausschluß beurteilt. Die Resultate werden in Tabelle 10, unten, hinsichtlich des prozentualen Anteils an Zelltod beschrieben.

Tabelle 10

Das rezeptormodulierenden Agens, in diesem Falle d-Diaminododecan-Addukt (7), zeigt klar die merkbare biologische Aktivität des rezeptormodulierenden Agens.

BEISPIEL 21 SYNTHESE EINES ANTI-ENTZÜNDLICHEN REZEPTORMODULIERENDEN AGENS

Das synthetische Peptid f-met-leu-phe ist äquivalent zu einem bakteriellen Zellwandbestandteil (Biochem. Soc. Trans, 19: 1127-9, 1991: Agents Actions Suppl. 35: 3-8, 1991. Agents Actions Suppl. 35: 11-6, 1991; J Immunol. 146: 975-80, 1991). Dieses Peptid wird von Rezeptoren auf PMN erkannt, die mittels Chemotaxe zu Stellen einer lokalen Entzündung entlang eines Gradient des Peptids antworten können. Während der Entzündung kann die Rezeptorexpression dramatisch durch Mobilisieren von Rezeptor aus intrazellulären Pools erhöht werden. Nicht-spezifische Verfahren, die verwendet werden, um diese Hochregulation aufzuheben, inhibieren ebenso Chemotaxe und vermutlich die anti-entzündliche Reaktion, die mit einer lokalen Entzündung assoziiert ist (J. Immunol. 145: 2633-8, 1990). Die Synthese eines Rezeptormodulationsagens, das als ein Inhibitor von früher Entzündung nützlich ist, wird unten beschrieben.

Das Peptid f-met-leu-phe-(gly)3-leu-O-Me wird synthetisiert unter Verwendung einer Teebeutelmethodologie oder von Festphasenpeptidsyntheseprozeduren, die von Merrifield et al. (Biochemistry 21: 5020-31, 1982) and Houghten (Proc. Natl. Acad. Bei. (USA) 82: 5131-35, 1985), beschrieben worden sind, oder unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen automatisierten Synthesizer, wie etwa dem Applied-Biosystems 430 A-Peptidsynthesizer. Das Peptid-Amid wird in 45% Trifluoressigsäure-51% Methylenchlorid-2% Ethandithiol-2% Anisol für 20 Minuten von seinen Schutzgruppen befreit und aus dem 4-Methylbenzhydrylamin- Harz unter Verwendung der Tam-Merrifield-Low-High-HF-Prozedur gespalten (J. P. Tarn et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442-55. 1983). Das Peptid wird dann aus dem Harz unter Verwendung von 0,1 M Ammoniumacetatpuffer, pH 8 extrahiert und lyophilisiert. Das rohe Peptid wird aufgereinigt unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC auf einer analytischen Vydac-C-4-Säule (The Separations Group, Hesperia, Calif.), und einem linearen Gradienten von 0,5-1,0%/min von 100% Acetonitril +0,1% v/v Trifluoracetat auf 100% Acetonitril + 0,1% Trifluoracetat. Das HPLC aufgereinigte Peptid wird mittels Aminosäureanalyse analysiert (R. L. Heinriksen and S. C. Meredith, Anal. Biochem. 160: 65-74, 1984) nach Gasphasenhydrolyse (N. M. Meltzer et al., Anal. Biochem. 160: 356-61, 1987). Die Sequenz des aufgereinigten Peptids kann mittels Edman-Abbaus auf einem kommerziell erhältlichen Sequen zierer (R. M. Hewick et al., L. Biol. Chem. 15: 7990-8005, 1981) bestätigt werden. Das Peptidamid wird in einen O-Methylester (d. h. f-met-leu-phe-(gly)3-leu-O-Me) durch Behandlung mit Dimethylformamid (5 g/60 ml) mit 1,3 Äquivalenten von NaHCO&sub3; in einem Überschuss Methyliodid (4 Äquivalente) umgewandelt. Die Mischung wird unter Argongas bei Zimmertemperatur 40 Stunden gerührt. Wenn erforderlich, wird das Peptid bis zur Trockenheit mit 150 ml Ethylacetat extrahiert. Der Rezeptor für das modulierende Agens wird verwendet, um PMN zu behandeln, aktiviert mit GM-CSF (um die Expression von fMLP-Rezeptoren zu erhöhen). Der Verlust der Bindung von biotinylierten fMLP wird verglichen mit fMLP- gegen f-MLP-rezeptormodulierenden Agens-behandelten Zellen.

BEISPIEL 22 SYNTHESE EINES FUSIONSPROTEIN-REZEPTORMODULIERENDEN AGENS

Ein EGF-rezeptormodulierendes Agens, enthaltend ein gentechnisch hergestelltes Fusionsprotein, wird hierin beschrieben. In Kürze, der C-Terminus einer DNA-Sequenz, die für EGF oder seine Rezeptorbindungsdomäne kodiert, wird mit konventionellen Prozeduren (z. B. unter Verwendung einer T&sub4;DNA-Ligase) an eine DNA-Sequenz ligiert, die einem GGG-Spacer entspricht. Der C-Terminus der EGF-GGG-DNA-Sequenz wird dann an den N-Terminus einer DNA-Sequenz fusioniert, die für das konditionelle Membranbindungspeptid KGEAALA(EALA)4-EALEALAA kodiert. Alternativ · können Peptid-Spacer-DNA- Sequenzen in vitro unter Verwendung von Standard-Oligonukleotidsyntheseprozeduren synthetisiert werden (siehe, z. B. U.S. Patent Nrn. 4,500,707 und 4,668,777). Die rekombinante EGF-Peptid-DNA-Sequenz wird in einen E. coli-Expressionsvektor unter Verwendung von herkömmlichen Prozeduren kloniert. E. coli-Stamm HB101 wird mit der fusionierten rekombinanten DNA-Sequenz transformiert und kultiviert, um das EGF-Peptid zu produzieren. Das Fusionsprotein wird aus der transformierten E. coli-Kultur mittels Standardverfahren aufgereinigt, einschließlich anti-EGF-Affinitätschromatographie. Das Fusionsprotein kann aus der Affinitätsmatrix unter Verwendung von Standardtechniken, wie etwa hohem Salzgehalt, chaotropen Agentien oder hohem oder niedrigen pH eluiert werden. Der Verlust des EGF- Rezeptors wird mittels Flußcytometrie und einem monoklonalen Maus-Antikörper auf einen EGF-Rezeptor gemessen.


Anspruch[de]

1. Rezeptormodulierendes Agens, umfassend ein Cobalamin oder ein Derivat davon, gekoppelt an eine Umleitgruppe mittels eines Linkers, wobei das rezeptormodulierende Agens in der Lage ist, Transcobalamin II zu binden.

2. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei der Linker 4-20 Atome lang ist.

3. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Diaminoalkylen, Diaminoalkylarylen, Diaminoheteroalkylen und Diaminoheteroalkylarylen.

4. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei der Linker an die Umleitgruppe über eine Kopplungsstelle an dem Cobalamin gekoppelt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus b-, d- und e-Kopplungsstellen.

5. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei der Linker an eine Ribose- Kopplungsstelle an dem Cobalamin gekoppelt ist.

6. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei der Linker ein trifunktioneller Linker ist.

7. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 6, wobei ein Biotin-Molekül über eine reaktive Stelle auf dem trifunktionellen Linker gekoppelt ist.

8. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus lysosomotropen Gruppen, intrazellulären Polymerisationsgruppen, Peptidsortiersequenzen, konditionellen Membranbindungspeptiden und bi- oder multivalenten Rezeptor-Quervernetzungsgruppen und Membranankern.

9. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe eine lysosomotrope Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gentamicin, Sisomicin, Netilmicin, Kanamycin, Tobramycin, Amikacin, Neomycin, Paromomycin, Ribostamycin, Butirosin und Streptomycin.

10. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Aminoacridin-Derivat, einem Aminochinolin- Derivat und einem Aminonaphthalin-Derivat.

11. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chloroquin, Quinacrin, Dansyl-Cadaverin und Derivaten davon.

12. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe eine intrazelluläre Polymerisationsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dipeptidestern und Leucin-Reißverschlüssen ("Leucin-Zippers").

13. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe eine Peptidsortiersequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus endoplasmatischen Reticulum-Retentionspeptiden, Golgi-Retentionspeptiden, lysosomalen Retentionspeptiden, Organismus-spezischen Retentionspeptiden und Clathrin-Bindungspeptiden.

14. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei die Umleitgruppe ein konditionelles Membranbindungspeptid ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus geladenem Glutamat, Aspartat und Histidin.

15. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei das rezeptormodulierende Agens einen Rezeptor-Wander-Weg ('receptor-trafficking pathway') durch Umlenken eines Agens-Rezeptor-Komplexes beeinflußt.

16. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei das rezeptormodulierende Agens einen Rezeptor-Wander-Weg durch Quervernetzen von einem oder mehreren Rezeptoren beeinflußt.

17. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei das rezeptormodulierende Agens einen Rezeptor-Wander-Weg durch Verankern eines Rezeptors in einer Zellmembran beeinflußt.

18. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1, wobei das rezeptormodulierende Agens einen Rezeptor-Wander-Weg durch Zurückhalten eines Agens/Rezeptor- Komplexes in einem Endosom beeinflußt.

19. Cobalamin-Dimer, umfassend eines erstes und zweites Cobalamin oder ein Derivat davon, gekoppelt durch eine Cobalamin-Kopplungsstelle, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Kopplungsstellen a-g. Kopplungsstelle h und Kopplungsstelle i, wobei das erste und zweite Cobalamin durch wenigstens einen Linker gekoppelt sind.

20. Dimer nach Anspruch 19, wobei der Linker ungefähr 10 bis 55 Atome lang ist.

21. Rezeptormodulierendes Agens, umfassend ein Cobalamin oder ein Derivat davon, gekoppelt an eine Umleitgruppe zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung innerhalb eines Verfahrens zum Modulieren eines Vitamin- B&sub1;&sub2;-Rezeptors.

22. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 21, wobei das rezeptormodulierende Agens ein Cobalamin-Dimer ist.

23. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 21, wobei die Vitamin-B&sub1;&sub2;- Rezeptormodulation ausreicht, um eine neoplastische Krankheit zu behandeln.

24. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 23, wobei die neoplastische Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leukämie, Sarkom, Myelom, Carcinom, Neurom, Melanom, Krebs der Lunge, der Leber, der Brust, des Gehirns, des Colons, der Cervix, der Prostata, Hodgkinsche Krankheit und Nicht-Hodgkinsches Lymphom.

25. Rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Herstellung des Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zum Regulieren einer biologischen Antwort, die mit einem Zelloberflächenrezeptor assoziiert ist.

26. Cobalamin-Derivat, umfassend ein Cobalamin oder ein Derivat davon, gekoppelt an ein Biotin-Molekül, wobei das Biotin zusätzlich an eine Umleitgruppe gekoppelt ist.

27. Cobalamin-Derivat nach Anspruch 26, wobei das Cobalamin an das Biotin durch einen Linker gekoppelt ist.

28. Cobalamin-Derivat nach Anspruch 26, wobei das Biotin an die Umleitgruppe über ein Biotin-Bindungsprotein gekoppelt ist.

29. Cobalamin-Derivat nach Anspruch 28, wobei das Biotin-Bindungsprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Avidin und Streptavidin.

30. Komplex, umfassend ein rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1 oder 21, gebunden an ein Transcobalamin II.

31. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein rezeptormodulierendes Agens nach Anspruch 1 oder 21 und einen geeigneten pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel.

32. Verwendung eines rezeptormodulierenden Agens nach Anspruch 1 oder 21, eines Cobalamin-Dimers nach Anspruch 19 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 31 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neoplastischen Krankheit.







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