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Dokumentenidentifikation DE69623620T2 07.08.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0832098
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON IGF-1 UND IGFBP-3 MIT RICHTIGER FALTUNG UND DISULFIDBINDUNGEN
Anmelder Celtrix Pharmaceuticals, Inc., Santa Clara, Calif., US
Erfinder SOMMER, Andreas, Danville, US;
OGAWA, Yasushi, Pacifica, US;
TAO, Peggy, San Jose, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69623620
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.05.1996
EP-Aktenzeichen 969168293
WO-Anmeldetag 30.05.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/08113
WO-Veröffentlichungsnummer 0096040736
WO-Veröffentlichungsdatum 19.12.1996
EP-Offenlegungsdatum 01.04.1998
EP date of grant 11.09.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.08.2003
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 14/435   C07K 14/65   C12N 15/12   

Beschreibung[de]
Sachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Sachgebiet der Herstellung aktiver, richtig gefalteter Proteine, und im Besonderen die Rückfaltung der Polypeptide des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors-1 (insulin-like growth factor-I, IGF-I) und des IGF-Bindungsproteins-3 (insulin-like growth factor binding protein-3, IGFBP-3).

Hintergrund

Wachstumsfaktoren sind Polypeptide, die eine Vielzahl biologischer Antwortreaktionen (z. B. DNA-Synthese, Zellteilung, Expression spezifischer Gene usw.) in einer definierten Population von Zielzellen stimulieren. Es wurde eine Vielzahl solcher Wachstumsfaktoren identifiziert, darunter der transformierende Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1), TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), die Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II.

IGF-I und IGF-II sind hinsichtlich Aminosäuresequenz und Struktur verwandt, wobei jedes der Polypeptide ein Molekulargewicht von ungefähr 7,5 Kilodalton (kD) hat. IGF-I trägt den Hauptanteil der Wirkung als Wachstumshormon, es ist damit der Hauptverantwortliche für das Wachstum nach der Geburt. IGF-I wurde auch mit der Wirkung diverser anderer Wachstumsfaktoren in Verbindung gebracht, da die Behandlung von Zellen mit solchen Wachstumsfaktoren zu gesteigerter IGF-I-Produktion führt. Der IGF-II wiederum hat, wie angenommen wird, eine wichtige Rolle beim Wachstum des Fötus. Sowohl IGF-I als auch IGF-II haben insulinähnliche Wirkungen (daher ihre Bezeichnungen) und sind mitogen (stimulieren die Zellteilung) der Zellen aus Nerven-, Muskel- und Knochengewebe, aus Gewebe der Fortpflanzungsorgane, sowie für eine Vielzahl anderer Gewebearten.

Im Gegensatz zu den meisten anderen Wachstumsfaktoren kommen die IGFs in nennenswerter Menge im Kreislauf vor, doch nur ein winziger Bruchteil dieses IGF liegt frei im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten vor. Der größte Teil des zirkulierenden IGF ist an IGF- Bindungsprotein-3 (IGFBP-3) gebunden. Der IGF-I-Spiegel im Serum kann zur Diagnose von Wachstumsabnormitäten, z. B. hypophysärer Riesenwuchs, Akromegalie, Zwergwuchs und verschiedene Defizienzen der Wachstumshormone. Obwohl IGF-I m vielen Geweben hergestellt wird, glaubt man, daß der größte Teil des zirkulierenden IGF-I in der Leber synthetisiert wird.

Fast das gesamte IGF zirkuliert in einem nichtkovalent assoziierten, ternären Komplex aus IGF-I, IGF-II, IGFBP-3 und einer größeren Protein-Untereinheit, die als säurelabile Untereinheit ("acid labile subunit" (ALS)) bezeichnet wird. Dieser ternäre Komplex besteht aus äquimolaren Mengen jedes der drei Bestandteile. ALS hat keine direkte IGF-bindende Aktivität und scheint nur an den binären IGF/IGFBP-3-Komplex zu binden. Der ternäre Komplex aus IGF + IGFBP-3 + ALS hat ein Molekulargewicht von etwa 150 kD. Man nimmt an, daß dieser ternäre Komplex im Blutkreislauf "als Reservoir und Puffer von IGF-I und IGF-II [fungiert], die schnelle Veränderungen der Konzentration des freien IGF verhindern" (Blum et al. (1991) "Plasma IGFBP-3 Levels as Clinical Indicators" in: Modem Concepts of Insulin- like Growth Factors, S. 381-393, E. M. Spencer, Hrsg., Elsevier, New York).

Der größte Teil des zirkulierenden IGF-I, IGF-II und IGFBP-3 ist in Gestalt eines Komplexes, und demzufolge kann nur sehr wenig freier IGF nachgewiesen werden. Auch ist ein hoher Spiegel an freiem IGF im Blut gar nicht wünschenswert. Ein solcher führt nämlich aufgrund der insulinähnlichen Wirkung des IGF zu schwerer Hypoglycämie. Im Gegensatz zu den IGFs und zum IGFBP-3 gibt es einen größeren Vorrat an freiem ALS im Plasma, der sicherstellt, daß jeder IGF/IGFBP-3-Komplex, der in den Kreislauf gelangt, sofort einen temären Komplex bildet.

Zwar ist das IGFBP-3 das häufigste IGF-bindende Protein im Kreislauf, doch wurden bisher in verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten wenigstens fünf andere verschiedene IGF-Bindungsproteine (IGFBPs) identifiziert. Obwohl alle diese Proteine IGFs binden, haben sie ihren Ursprung in separaten Genen und weisen unterschiedliche Aminosäuresequenzen auf. Somit sind die Bindungsproteine nicht einfach Analoga oder Ableitungen eines gemeinsamen Vorläufers. Im Gegensatz zum IGFBP-3 sind andere zirkulierende IGFBPs nicht mit IGFs gesättigt. Kein IGFBP außer dem IGFBP-3 kann den erwähnten ternären 150 kD- Komplex bilden.

IGF-I und IGFBP-3 können aus natürlichen Quellen gereinigt oder auf rekombinantem Weg hergestellt werden. In der Fachwelt ist z. B. die Reinigung von IGF-I aus menschlichem Serum wohlbekannt (Rinderknecht et al., (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 73: 2365- 2369). Die Herstellung von IGF-I mittels rekombinanter Verfahren wird in EP 0.128.733, veröffentlicht im Dezember 1984 gezeigt. IGFBP-3 kann mittels eines von Baxter et al. ((1986) "Growth Hormone-Dependent Insulin-like Growth Factors (IGF) Binding Protein from Human Plasma Differs from Other Human IGF Binding Proteins", Biochem. Biophys. Res. Comm. 139: 1256-1261) gezeigten Verfahrens aus natürlichen Quellen gereinigt werden. IGFBP-3 kann, wie in Sommer et al. (vorst., S. 715-728) erörtert, von rekombinanten Organismen synthetisiert werden. Rekombinantes IGFBP-3 bindet IGF-I im molaren Verhältnis 1 : 1.

Die lokale Verabreichung des IGF-I/IGFBP-3-Komplexes in Wunden von Ratten und Schweinen ist signifikant wirkungsvoller als die Verabreichung von IGF-I allein (Sommer et al., vorst.). Die subcutane Verabreichung des IGF-I/IGFBP-3-Komplexes an hypophysektomierte, ovariektomierte und normale Ratten, wie auch die intravenöse Verabreichung an Cynomologous-Affen verhindern wirkungsvoll den Hypoglykämieeffekt einer Verabreichung von IGF-I allein.

Sowohl IGF-I als auch IGFBP-3 haben Disulfidisomerase-Aktivität, wenn sie einzeln gemessen werden. Das Gemisch beider Proteine jedoch hemmt diese Aktivität sehr wesentlich (Koedam und Leo von den Brande (1994) "Insulin-like Growth Factors (IGFs) and IGF Binding Protein-3 Display Disulfid Isomerase Activity" Biochem. Biophys. Res. Comm. 198: 1225-1231).

Gentechnische Verfahren haben es ermöglicht, mittels rekombinanter Expressionssysteme, besonders solcher in Prokaryonten wie Escherichia coli, große Mengen von Polypeptiden herzustellen, die von clonierter DNA codiert werden. Die exprimierten heterologen Peptide, die sonst von der Wirtszelle entweder gar nicht oder nur in begrenzter Menge hergestellt würden, können einen bedeutenden Anteil an der gesamten Polypeptidproduktion der Wirtszelle erreichen.

Wenn clonierte DNA auf hohem Spiegel in rekombinanten Expressionssystemen exprimiert wird, treten häufig einige Probleme auf. Polypeptide, die im Cytoplasma der Wirtszelle überexprimiert werden, sammeln sich oft in Form von unlöslichen "Einschlußkörperchen" oder "refraktilen Körperchen" an, besonders wenn Bakterien als Wirtszellen verwendet werden (Williams et al., (1982) Science 215: 687-689; Schoner et al., (1985) Biotechnology 3: 151- 154). Die Bildung von Einschlußkörperchen ist jedoch nicht auf bakterielle Expressionssysteme beschränkt. Das Krüppelgenprodukt von Drosophila zum Beispiel kann Einschlußkörperchen bilden, wenn es in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus- Expressionssystems hergestellt wird. Polypeptide, die sich in Form von Einschlußkörperchen oder refraktilen Körperchen ansammeln, sind für biologische oder chemische Tests ziemlich nutzlos. Die Überführung dieses unlöslichen Materials in aktive, lösliche Polypeptide erfordert zeitraubende und schwierige Solubilisierungs- und Rückfaltungsschritte, die die Herstellung der Polypeptide verteuern und die Ausbeute an biologisch aktivem Polypeptid senken.

Selbst wenn die heterologen Polypeptide im Cytoplasma von Wirtszellen in löslicher Form exprimiert werden, kann es sein, daß sie aufgrund inkorrekter Faltung biologisch inaktiv sind. Zu inkorrekter Faltung kann es im Cytoplasma der Wirtszelle oder während des Isolationsvorganges kommen.

Die Schwierigkeiten bei der Gewinnung biologisch aktiven rekombinanten Proteins aus rekombinanten Expressionssystemen steigern sich noch bei Polypeptiden, die Cysteinreste enthalten, wie IGF-I. IGF-I enthält sechs Cysteinreste, die alle intramolekulare Disulfidbindungen bilden, von denen man annimmt, daß sie die aktive Anordnung des Proteins stabilisieren. Die Cysteinreste im IGF-I können inkorrekte Disulfidbindungen bilden, d. h. Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten, wie sie beim nativen IGF-I nicht vorkommen. IGF-I-Moleküle, die inkorrekte Disulfidbindungen enthalten, weisen eine verringerte biologische Aktivität auf (Raschdorf et al., (1988) Biomed. Env. Mass. Spectros. 16: 3-8).

Es hat sich gezeigt, daß die Menge von löslichem Polypeptid bei der rekombinanten Expression in E. coli gesteigert werden kann, wenn die Fermentationstemperatur auf unter 30ºC abgesenkt wird. Dieses Verfahren ist eine brauchbare Alternative zur Renaturierung von Polypeptiden aus den Einschlußkörperchen, es erfordert jedoch ein Expressionssystem, das unter 30ºC wirkungsvoll arbeitet. Trotzdem ist das Verfahren wirtschaftlich wohl nicht rentabel, da die Absenkung der Fermentationstemperatur die Dauer und damit auch die Kosten des Fermentationsvorganges in die Höhe treibt. Damit geht auch ein erhöhtes Kontaminationsrisiko für die Kultur einher.

Auf dem Fachgebiet sind viele Verfahren zur Rückfaltung von Proteinen bekannt. Die U.S.-Patente Nr. 4.511.502, Nr. 4.511.503 und 4.512.922 z. B. beschreiben Verfahren zur Rückfaltung von aus Einschlußkörperchen gewonnenen Proteinen, die als universell anwendbar angesehen werden und jeweils nur geringe Modifikationen erfordern. Diese Verfahren laufen im allgemeinen darauf hinaus, die Struktur des inkorrekt gefalteten Proteins aufzubre chen, dann das Molekül von schwachen intramolekularen Kräften wie Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophoben Wechselwirkungen und Ionenbindungen in richtiger Anordnung falten zu lassen und schließlich durch Oxidation korrekte Disulfidbindungen bilden zu lassen.

Bei einem solchen Verfahren wird das rückzufaltende Protein unter Bedingungen gereinigt, die zur Beibehaltung der Cysteineinheiten des Proteins als freie Sulfhydrylgruppen führen. Dies geschieht durch Beigabe eines reduzierenden Agens während des ganzen Reinigungsprozesses. Dadurch kann sich das Protein während des Reinigungsprozesses wieder rückfalten, ohne daß es zu inkorrekten intramolekularen Disulfidbindungen kommt. Das reduzierende Agens wird anschließend verdünnt, um das rückgefaltete Protein in Gegenwart von Luft oder eines anderen Oxidationsmittels Disulfidbindungen bilden zu lassen. Dieses Verfahren kann leicht in die meisten Reinigungsprozesse eingebaut werden und funktioniert optimal bei rekombinanten Proteinen mit relativ unkomplizierter tertiärer Struktur.

Ein anderer Weg ist die Rückfaltung des Protein in Gegenwart sowohl der reduzierten (R-SH) als auch der oxidierten (R-S-S-R) Form einer Sulfhydrylverbindung. Dies erlaubt den Disulfidbindungen sich während des Reinigungsprozesses zu bilden, aufzubrechen und sich erneut zu bilden. Die reduzierten und oxidierten Formen der Sulfhydrylverbindung werden in einem Puffer zur Verfügung gestellt, der genügend Denaturierungskraft hat, um alle intermediären Anordnungen des Proteins während des Rückfaltungsvorgangs in Lösung zu halten. Als geeignetes Denaturierungsmittel wird Harnstoff vorgeschlagen, da es eine mittlere Denaturierungskraft aufweist, die es dem Protein erlaubt, zu seiner korrekten Anordnung zu gelangen, jedoch auch die Löslichkeit der Zwischenprodukte der Faltung beibehält. Dieser Weg ist am effektivsten, wenn das rückzufaltende Protein ein relativ unkompliziertes Faltungsmuster aufweist.

Ein anderes Vorgehen, das für schwierigere Rückfaltungen angewandt werden kann, besteht darin, alle Disulfidbindungen aufzubrechen, die sich im Zug der Synthese oder Isolation des Proteins gebildet haben könnten, und dann die freien Sulfhydrylgruppen des Proteins zu derivatisieren. Freie Sulfhydryle werden durch Sulfonierung derivatisiert, womit die Bildung von Disulfidbindungen blockiert wird. Dann wird das Protein in einem schwachen Denaturierungsmittel rückgefaltet und anschließend desulfoniert, was die Bildung korrekter Disulfidbindungen erlaubt. Die Desulfonierung findet in Gegenwart einer Sulfhydrylverbindung statt. Eine kleine Menge der entsprechenden oxidierten Form der Verbindung garantiert, daß geeignete Disulfidbindungen intakt bleiben. Der pH-Wert wird verändert, d. h. auf einen solchen Wert angehoben, daß die Sulfhydrylverbindung mindestens teilweise ionisiert wird und somit die nucleophile Verdrängung des Sulfonates erhöht.

Diese Rückfaltungsverfahren, wiewohl praktisch aufgrund ihrer universellen Anwendbarkeit, haben sich bisher für IGF-I noch nicht als besonders wirkungsvoll erwiesen und können u. U. in der Ausführung schwierig oder umständlich sein.

Es wurden auch spezifische Rückfaltungsverfahren für IGP-I offenbart. Die PCT- Veröffentlichungen WO 91/02807, WO 93/11240 und WO 93/19084 offenbaren jeweils Verfahren zur Rückfaltung von rekombinant exprimiertem IGF-I-Protein.

WO 91/02807 offenbart Fusionsproteine für IGF-I, bei denen eine positiv geladene Aminosäuresequenz mit dem Aminoende des IGF-I fusioniert wird. Die aminoterminale Addition hilft bei der Rückfaltung, so daß eine Ausbeute von etwa 50% richtig gefalteter Proteine erzielt wird. Dieser Weg erfordert als zusätzliche Schritte die Wiederentfernung des aminoterminalen Fusionspeptids und die Reinigung des Produkts, um nativen IGF-I zu erhalten.

WO 93/11240 offenbart ein Verfahren zur Rückfaltung des IGF-I-Proteins in einer einzigen Lösung, die ein chaotropes Agens, ein organisches Lösungsmittel und ein Reduktionsmittel von alkalischem pH-Wert enthält, so daß eine Ausbeute von 85% richtig gefalteten Proteins erreicht wird.

WO 93/19084 offenbart ein dreistufiges Verfahren zur Rückfaltung von rekombinant hergestelltem IGF-I. Unrichtig gefaltetes Met-IGF-I, d. h. IGF-I mit einem aminoterminalen Methionin (dieser Methioninrest muß entfernt werden, um reifes IGF-I zu ergeben), wird in einer denaturierenden Lösung solubilisiert. Es wird ein Oxidationsmittel hinzugegeben, um eine Redox-Lösung zu bilden. Dann wird ein zusätzliches Reduktionsmittel hinzugegeben, um den Disulfidaustausch zu erhöhen, und die Lösung wird über Nacht inkubiert. Dieses Verfahren ergibt Erträge von bis zu 30% richtig gefalteten Proteins. Dieses Protein muß noch weiter prozessiert werden, um die aminoterminalen Methioninreste zu entfernen.

Neuerdings wurde von Hober et al. ((1994) "Folding of Insulin-Like Growth Factor is Thermodynamically Controlled by Insulin-Like Growth Factor Binding Protein" Biochemistry 33: 6758-6761) ein Verfahren zur Rückfaltung des IGF-I, das auf Zugabe von nativem IGFBP-I beruht. Die Zugabe von nativem IGFBP-1 zu reduziertem IGF-I-Polypeptid unter Redox-Bedingungen erbrachte Erträge von bis zu 89% nativem IGF-I. Eine Verwendung von IGFBP-3 wurde dabei nicht offenbart, ebensowenig eine solche von ungefalteten IGFBPs.

Alle Rückfaltungsverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ergeben Erträge von deutlich unter 100%. Die heterologe Mischung, die aus diesen Verfahren resultiert, muß anschließend weiter gereinigt werden; ein Prozeß, der zeitraubend und/oder teuer sein kann.

Es besteht also Bedarf an einem einfachen, schnellen, hocheffizienten Verfahren zur Rückfaltung von IGF und IGFBP-3 in richtiger Anordnung, mit korrekten Disulfidbindungen.

Demgemäß ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein schnelles, hocheffizientes Verfahren zur Rückfaltung von IGF-I und IGFBP-3 zu liefern, indem die beiden Polypeptide gemeinsam rückgefaltet werden, was hohe Erträge an richtig gefalteten Proteinen ergibt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein einfaches, hochwirksames Verfahren zur Herstellung gereinigter Komplexe aus nativem IGF-I und IGFBP-3 zu liefern.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Unter einem ersten Aspekt liefert die Erfindung ein schnelles, hocheffizientes Verfahren für die Rückfaltung von IGF-I und IGFBP-3, weiterhin ein effizientes Verfahren, um native IGF-I/IGFBP-3-Komplexe zu erhalten. Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Reinigung von nativem IGF-I und nativem IGFBP-3 aus den IGF-I/IGFBP-3-Komplexen.

Unter einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein schnelles, hocheffizientes Verfahren für die Rückfaltung von IGF-I, was sehr hohe Erträge an nativem IGF-I ergibt.

Unter einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein schnelles, hocheffizientes Verfahren für die Rückfaltung von IGFBP-3, was gesteigerte Erträge an nativem IGFBP-3 ergibt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des menschlichen IGF-I.

Fig. 2 zeigt eine Nucleotidsequenz, die menschliches IGF-I codiert.

Fig. 3 und Fig. 4 zeigen zwei alternierende Aminosäuresequenzen des IGFBP-3.

Fig. 5, Fig. 6 und Fig. 7 zeigen drei alternative Nucleotidsequenzen, die menschliches IGFBP-3 codieren.

Fig. 8 zeigt eine Nucleotidsequenz, die Ubiquitin-Hydrolase der Hefe (YUH) codiert.

Fig. 9 und Fig. 10 zeigen die Ergebnisse der gemeinsamen Faltung von IGF-I und IGFBP-3. Die ausgefüllten Rauten stellen die Rückfaltung von nur IGF-I bzw. nur IGFBP-3 dar, die offenen Rauten stellen die Resultate der gemeinsamen Faltung dar.

Offenbarung der Erfindung

Proteine, die in großen Mengen in rekombinanten Expressionssystemen exprimiert werden, weisen häufig eine niedrige oder nicht mehr feststellbare biologische Aktivität auf, die auf unrichtige Faltung und Bildung inkorrekter Disulfidbindungen zurückzuführen ist. Die vorliegende Erfindung liefert ein neuartiges Verfahren von extrem hoher Wirksamkeit zur schnellen Rückfaltung von rekombinant erzeugtem IGF-I und IGFBP-3, das natives IGF-I und IGFBP-3 ergibt. Überraschenderweise entdeckten die Erfinder, daß die Oxidation einer Mischung aus denaturiertem und reduziertem IGF-I und IGFBP-3, d. h. gemeinsame Faltung (Verbindung von ungefaltetem oder unrichtig gefaltetem IGF-I mit ungefaltetem oder unrichtig gefaltetem IGFBP-3 unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, mit nachfolgender Oxidation) zu einer synergistischen Zunahme der Rückfaltungseffizienz bei beiden Proteinen führte und fast 100% native IGF-I und einen sehr hohen Prozentanteil nativen IGFBP-3 ergab. Ebenso unerwartet fanden die Erfinder, daß die Kinetik der Rückfaltung, vor allem hinsichtlich der Faltung des IGFBP-3 wesentlich verändert waren, was zu einer beträchtlichen Verkürzung des Zeitbedarfs für die Rückfaltung führte. Diese Befunde waren deshalb besonders überraschend, weil bekannt ist, daß die Disulfidisomerase-Aktivität (eine Enzymaktivität, die das Aufbrechen und die Neubildung von Disulfidbindungen umfaßt, und die bei der Rückfaltung der Proteine mithelfen kann) des IGF-I durch die Zugabe äquimolarer Mengen von IGFBP-3 gehemmt wird (Koedam und Leo von Brande, vorst.).

Die Erfindung liefert auch effiziente Verfahren zur Herstellung gereinigten, nativen IGF, nativen IGFBP-3 und nativen IGF/IGFBP-3-Komplexes aus rekombinanten Expressionssystemen. Gemeinsame Faltung von IGF-I und IGFBP-3 führt zur Bildung nativer IGF-I/IGFBP-3-Komplexe. Diese Komplexe können mit Leichtigkeit im Zug der Faltungsreaktion von allen unrichtig gefalteten Proteinen abgetrennt werden; die Verfahren dazu sind einfach und auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Falls gewünscht, können IGF-I und IGFBP-3 mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren jeweils leicht weiter isoliert und gereinigt werden.

Definitionen

"Insulinähnlicher Wachstumsfaktor" (insulin-like growth factor, IGF) umfaßt eine Familie von Faktoren, darunter IGF-I und IGF-II, ist jedoch nicht nur auf diese beschränkt. IGF ist ein Polypeptid von ungefähr 7,5 kD Molekulargewicht. IGF umfaßt natürlich vorkommendes IGF-I oder IGF-II, deren Analoga oder Varianten, sowie Fusionen von IGF-I oder IGF-II und anderen Aminosäuresequenzen. IGF kann aus natürlichen Quellen erhalten werden oder mit rekombinanten Mitteln hergestellt werden.

"IGF-Bindungsprotein-3" (insulin-like growth factor binding protein-3, in dieser Arbeit stets als IGFBP-3 bezeichnet) ist ein Mitglied der Familie der Bindungsproteine für die Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren, welches IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-5 und IGFBP-6 umfaßt, jedoch nicht auf diese beschränkt ist. IGFBP-3 kann aus natürlichen Quellen erhalten werden oder mit rekombinanten Mitteln hergestellt werden. IGFBP-3 bildet einen Komplex mit IGF und einem dritten Molekül, das als ALS bekannt ist.

"Natives IGF-I" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als IGF-I einschließlich natürlich vorkommendem IGF-I, Analoga und Varianten davon, das richtig gefaltet ist und nur korrekte Disulfidbindungen enthält. Korrekte Disulfidbindungen werden zwischen den Aminosäureresten C6-C48, C47-C52 und C18-C61 oder den Homologen dieser Aminosäurereste in Analoga und Varianten von IGF-I gebildet. Natives IGF-I ist biologisch aktiv.

"Unlösliches IGF-I" bezeichnet ausgefälltes oder aggregiertes IGF-I, das in Wirtszellen enthalten oder in anderer Weise den Wirtszellen zugeordnet ist und eine biologisch inaktive Anordnung mit inkorrekten oder gar nicht gebildeten Disulfidbindungen angenommen hat. Unlösliches IGF-I kann in Einschlußkörperchen oder refraktilen Körperchen enthalten sein, d. h. es kann unter dem Phasenkontrastmikroskop sichtbar sein oder auch nicht.

"Unrichtig gefaltetes IGF-I" bezeichnet IGF-I in biologisch inaktiver Anordnung, mit inkorrekten oder gar nicht gebildeten Disulfidbindungen. Unrichtig gefaltetes IGF-I kann, muß aber nicht unlöslich sein.

"Unlösliches IGFBP-3" bezeichnet ausgefälltes oder aggregiertes IGFBP-3, das in Wirtszellen enthalten oder in anderer Weise den Wirtszellen zugeordnet ist und eine biologisch inaktive Anordnung, mit inkorrekten oder gar nicht gebildeten Disulfidbindungen annimmt. Das unlösliche IGFBP-3 kann in Einschlußkörperchen oder refraktilen Körperchen enthalten sein, d. h. es kann unter dem Phasenkontrastmikroskop sichtbar sein oder auch nicht.

"Unrichtig gefaltetes IGFBP-3" bezeichnet IGFBP-3 in biologisch inaktiver Anordnung, mit inkorrekten oder gar nicht gebildeten Disulfidbindungen. Unrichtig gefaltetes IGFBP-3 kann, muß aber nicht unlöslich sein.

"Natives IGFBP-3" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als IGFBP-3 einschließlich natürlich vorkommenden IGFBP-3, Analoga und Varianten davon, das richtig gefaltet ist und nur korrekte Disulfidbindungen enthält. Natives IGFBP-3 ist biologisch aktiv.

"Nativer IGF-I/IGFBP-3-Komplex" wird im Rahmen dieser Arbeit als nichtkovalent gebundener Komplex aus nativem IGF-I und nativem IGFBP-3 definiert.

"Reduktionsmittel" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als Verbindung oder Stoff, der Sulfhydrylgruppen in reduziertem Zustand hält und intra- oder intermolekulare Disulfidbindungen reduziert. Akzeptable Reduktionsmittel sind unter anderen Dithiothreit (DTT), 2-Mercaptoethanol, Dithioerythrit, Cystein, Cysteamin (2-Aminoethanthiol) und reduziertes Glutathion.

"Oxidationsmittel" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als jegliche Verbindung oder jeglicher Stoff, die bzw. der imstande ist, ein Elektron von einer zu oxidierenden Verbindung zu entfernen. Akzeptable Oxidationsmittel sind unter anderen oxidiertes Glutathion, Cystein, Cysteamin, oxidiertes Dithiothreit, oxidiertes Erythreit und Sauerstoff.

"Denaturierungsmittel" oder "Denaturans" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als jegliche Verbindung oder jeglicher Stoff, der eine reversible Auseinanderfaltung eines Proteins verursacht. Die Stärke eines Denaturierungsmittels oder Denaturans wird sowohl von den Eigenschaften als auch der Konzentration des jeweiligen Denaturierungsmittels oder Denaturans bestimmt. Akzeptable Denaturierungsmittel oder Denaturantien können Chaotrope, Detergentien, organische, wassermischbare Lösungsmittel, Phospholipide oder eine Kombination zweier oder mehrerer solcher Mittel sein. Akzeptable Chaotrope sind unter anderen Harnstoff, Guanidin und Natriumthiocyanat. Nutzbare Detergentien sind unter anderen starke Detergentien wie Natriumdodecylsulfat oder Polyoxyethylenether (z. B. die Detergentien Tween oder Triton), milde, nichtionische Detergentien (z. B. Digitonin), milde kationische Detergentien wie N-[2,3-Dioleyoxy)-propyl]-N,N,N-Trimethylammonium, milde ionische Detergentien (z. B. Natriumcholat oder Natriumdesoxycholat) oder zwitterionische Detergentien wie unter anderen Sulfobetaine (Zwittergent), 3-(3-Chlolamidopropyl) dimethylammonio-1-propansulfat (CHAPS) und 3-(3-Chlolamidopropyl)-dimethylammonio-2-hydroxy-1- propansulfonat (CHAPSO). Wassermischbare organische Lösungsmittel wie Acetonitril, niedere Alkanole (besonders C&sub2;-C&sub4;-Alkanole wie Ethanol oder Isopropanol) oder niedere Alkandiole (besonders C&sub2;-C&sub4;-Alkandiole wie Ethylenglycol) können als Denaturantien benützt werden. Phospholipide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können natürlich vorkommende Phospholipide wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Phosphatidylinositol oder synthetische Phospholipidderivate oder -varianten wie Dihexanoylphosphatidylcholin oder Diheptanoylphosphatidylcholin sein.

"Rückfalten" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als jeglicher Vorgang oder jegliches Verfahren, der bzw. das geeignet ist, ein Polypeptid aus einem unrichtig gefalteten oder nicht gefalteten Zustand in dessen nativen, richtig gefalteten Zustand zu überführen.

"Gemeinsame Faltung" wird im Rahmen dieser Arbeit definiert als Rückfaltungsvorgänge, -reaktionen oder -verfahren, die wenigstens zwei Polypeptide verwenden, welche miteinander interagieren, und die Umwandlung ungefalteten oder unrichtig gefalteten Polypeptids zu nativem, richtig gefaltetem Polypeptid zum Ergebnis haben.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung besteht in der gemeinsamen Faltung von IGF-I und IGFBP-3, was zu einem schnellen, hocheffizienten Rückfalten der beiden Proteine führt und natives IGF-I und IGFBP-3 ergibt. Weiterhin eingeschlossen sind vereinfachte Verfahren zur Reinigung von nativem IGF-I, IGFBP-3 und IGF-I/IGFBP-3-Komplex. Die Erfindung kann wie folgt ausgeführt werden:

a) IGF-I und IGFBP-3 werden im molaren Verhältnis von etwa 1 : 3 bis 3 : 1 gemischt, dann mit Denaturierungsmitteln und Reduktionsmitteln denaturiert und reduziert. Alternativ werden IGF-I und IGFBP-3 jeweils einzeln reduziert und dann im molaren Verhältnis von etwa 1 : 3 bis 3 : 1 gemischt, so daß sie den IGF-I/IGFBP-3-Komplex bilden.

b) Ein Oxidationsmittel wird dann zum IGF-I/IGFBP-3-Gemisch aus Schritt(a) zugegeben.

c) Gegebenenfalls kann der IGF-I/IGFBP-3-Komplex aus dem IGF-I/IGFBP-3-Gemisch der gemeinsamen Faltung gereinigt werden.

d) Gegebenenfalls können IGF-I und IGFBP-3 aus dem Komplex einzeln gereinigt werden. Der Schritt (a) kann auch folgendermaßen ausgeführt werden:

i) IGF-I und IGFBP-3 werden einzeln denaturiert und dann zu einer Mischung von denaturiertem IGF-I und IGFBP-3 vereinigt, die anschließend reduziert wird.

ii) IGF-I wird denaturiert und reduziert, dann wird natives IGFBP-3 zugegeben, wodurch eine Lösung aus IGFBP-3 und reduziertem, denaturiertem IGF-I entsteht.

iii) IGFBP-3 wird denaturiert und reduziert, dann wird natives IGF-I zugegeben, wodurch eine Lösung aus IGF-I und reduziertem, denaturiertem IGFBP-3 entsteht.

Im Fall(a), wenn IGF-I und IGFBP-3 zusammengebracht und mit Denaturierungsmitteln und Reduktionsmitteln denaturiert und reduziert werden, hat das Gemisch aus IGF-I und IGFBP-3 vorzugsweise ein molares Verhältnis von etwa 1,5 : 1 bis 1 : 1,5.

Das IGF-I und IGFBP-3 für die gemeinsame Faltung gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Hochexpressionssystemen und unter Verwendung einer Vielzahl von Wirtszellen wie unter anderen Bakterien, Hefe, Insekten- und Säugetierzellinien produziert werden. Vorzugsweise werden IGF-I und IGFBP-3 in bakteriellen Wirtszellen produziert. Stärker vorzuziehen ist eine Produktion von IGF-I und IGFBP-3 in E. coli- Wirtszellen, darunter der E. coli-Stamm W3110DE3.

Die Wirtszellen werden mit Expressionsvektoren transformiert, die IGF-I- oder IGFBP-3- codierende DNA enthalten. Zur Transformation der Wirtszellen kann eine Vielzahl von Verfahren angewandt werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, wie CaCl&sub2; für bakterielle oder Hefewirtszellen, CaPO&sub4; für Insekten- oder Säugetier-Wirtszellen oder Elektroporation für alle Wirtszellentypen. Verfahren zur Transformation von Wirtszellen sind beschrieben in: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) und Ausubel (1987) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York).

Expressionsvektoren, die IGF-I- oder IGFBP-3-codierende DNA enthalten, können mittels der auf dem Fachgebiet wohlbekannten Standardverfahren hergestellt werden. IGF-I- oder IGFBP-3-codierende DNA kann aus natürlichen Quellen wie Gen- oder cDNA-Banken erhalten oder chemisch synthetisiert werden. Weiterhin können Varianten von IGF-I oder IGFBP-3 mittels einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet wohlbekannter Verfahren, einschließlich stellengerichteter Mutagenese hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Varianten sind beschrieben in: Sambrook et al., vorst. und Ausubel, vorst.

Transformierte mikrobielle Wirtsstämme werden in flüssigem Medium mit assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Salzquellen unter Anwendung der auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren gezüchtet. Transformierte Insekten- oder Säugetierzellen werden in flüssigem Medium mit assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Salzquellen und gegebenenfalls Vitaminen, Aminosäuren, Wachstumsfaktoren und anderen eiweißartigen Kulturzusätzen, die der Fachwelt bekannt sind, kultiviert. Flüssige Medien für die Zucht von Wirtszellen können gegebenenfalls Antibiotika oder Fungizide enthalten, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu verhindern, und/oder Wirkstoffe wie Antibiotika zur Selektion von Wirtszellen, die den Expressionsvektor enthalten, aber auch andere Wirkstoffe.

IGF-I und IGFBP-3 können durch eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren aus Wirtszellen gereinigt werden. Normalerweise ist das in bakteriellen Wirtszellen hergestellte IGF-I oder IGFBP-3 schlecht löslich oder unlöslich (in der Form der Einschlußkörperchen). Im Fall des unlöslichen Proteins kann es aus Wirtszellenlysaten durch Zentrifugieren gewonnen werden. Im Fall des schlecht löslichen Proteins können Wirkstoffe wie Polyethylenimin (PEI), jedoch auch andere, zugegeben werden, um das Ausfallen teilweise löslichen Proteins zu induzieren. Das ausgefällte Protein kann dann bequem durch Zentrifugieren gewonnen werden.

Unlösliches oder gefälltes IGF-I oder IGFBP-3 kann dann mit jedem der auf dem Fachgebiet bekannten Mittel solubilisiert werden. Vorzugsweise wird IGF-I oder IGFBP-3 mit Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid solubilisiert.

Wenn IGF-I oder IGFBP-3 als Fusionsprotein hergestellt wird, kann die Fusionssequenz wahlweise entfernt werden. Die Entfernung einer Fusionssequenz kann durch enzymatische oder chemische Spaltung erreicht werden; vorzuziehen ist die' enzymatische Spaltung. Die enzymatische Entfernung der Fusionssequenzen kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren geschehen. Die Wahl des Enzyms zur Entfernung der Fusionssequenzen wird von der Art der Fusion bestimmt sein, und die Reaktionsbedingungen werden wiederum von der Wahl des Enzyms abhängen, wie der Fachmann erkennen wird. Das gespaltene IGF-I oder IGFBP-3 kann mittels wohlbekannter Verfahren weiter von der gespaltenen Fusionssequenz gereinigt werden. Wie der Fachmann erkennen wird, werden diese Verfahren von der Art und den Eigenschaften der Fusionssequenz abhängen. Reingungsverfahren können unter anderen sein: Größenausschlußchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Dialyse.

IGF-I oder IGFBP-3 werden vorzugsweise weiter gereinigt, um die DNA aus der Proteinlösung zu entfernen. Die DNA kann mit jedem von mehreren auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie Ausfällen oder Ionenaustauschchromatographie entfernt werden, vorzugsweise jedoch wird sie mittels Ausfällen mit Protaminsulfat entfernt. IGF-I oder IGFBP-3 können von der ausgefällten DNA mittels Verfahren wie Zentrifugierung oder Filtrierung abgetrennt werden.

IGF-I oder IGFBP-3 können direkt nach der Entfernung der DNA zur gemeinsamen Faltung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet oder mit auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren weiter gereinigt und/oder konzentriert werden. Die gemeinsame Faltung von relativ unreinem (rohem) IGF-I und IGFBP-3 hat den Vorteil, daß es die Erträge steigert und die Reinigung des nativen IGF-I/IGFBP-3-Komplexes vereinfacht. Die Reinigung des gemeinsam gefalteten Komplexes erfordert nur ein Verfahren (im Gegensatz zur separaten Rei nigung der beiden Polypeptide vor dem gemeinsamen Zusammenfalten, die zwei erfordert), und sie erlaubt dem Reinigungsverfahren, die Eigenschaften des nativen IGF-I/IGFBP-3- Komplexes auszunützen.

Wenn gewünscht, können IGF-I und IGFBP-3 noch weiter gereinigt werden. Die Reinigung von IGF-I und IGFBP-3 kann mit einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren erreicht werden, darunter Hydrophobe Interaktionschromatographie, Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen. Die weitere Reinigung kann auch einen Trocknungs- oder Ausfällungsschritt des gereinigten Proteins beinhalten. Werden IGF-I und IGFBP-3 getrocknet oder ausgefällt, können die Proteine vor dem Wiederauflösen in Denaturierungsmittel zusammengebracht werden, oder sie können einzeln wiederaufgelöst und dann für die gemeinsame Faltung zusammengebracht werden.

Zur Denaturierung von IGF-I und IGFBP-3 kann eine Vielzahl verschiedener Denaturierungsmittel verwendet werden, darunter Harnstoff oder Guanidin, aber auch andere. Vorzuziehen als Denaturierungsmittel ist Harnstoff. Die Denaturierung kann in einem einstufigen Vorgang erfolgen, bei dem IGF-I und IGFBP-3 mit einer Lösung des Denaturierungsmittels in jener Konzentration behandelt werden, wie sie auch für die gemeinsame Faltung verwendet wird, oder in einem zweistufigen Vorgang, bei dem IGF-I und IGFBP-3 mit einer hohen Konzentration von Denaturierungsmittel denaturiert und anschließend verdünnt werden, wobei man eine Lösung mit einer solchen Konzentration von Denaturierungsmittel erhält, die auch für den Schritt der gemeinsamen Faltung brauchbar ist.

Beim einstufigen Denaturierungsprozeß beträgt die Konzentration des Denaturierungsmittels, wenn dieses Harnstoff ist, vorzugsweise ungefähr 1 bis 2 molar. Beim zweistufigen Denaturierungsprozeß beträgt die Konzentration des Denaturierungsmittels, wenn dieses Harnstoff ist, vorzugsweise ungefähr 5 bis 7 molar und sie wird für den Vorgang der gemeinsamen Faltung auf vorzugsweise ungefähr 1 bis 2 molar verdünnt.

Die Reduktion des IGF-I und IGFBP-3 kann gleichzeitig mit der Denaturierung erfolgen oder, gegebenenfalls, anschließend. Die Reduktion des IGF-I und IGFBP-3 kann mit einer Vielzahl verschiedener Mittel erfolgen, darunter Dithiothreit (DTT), 2-Mercaptoethanol, Cystein, Cysteamin, (2-Aminoethanthiol), Dithioerythrit oder reduziertes Glutamion, aber auch mit anderen Mitteln. Vorzuziehen ist DTT als Reduktionsmittel. Wie schon bei der Denaturierung erörtert, kann die Reduktion von IGF-I und IGFBP-3 in einem ein- oder in einem zweistufigen Prozeß erfolgen, in dem die Polypeptide entweder bei einer Reduktionsmittel konzentration, die auch im Prozeß der gemeinsamen Faltung brauchbar ist, reduziert werden, oder aber indem die Polypeptide mit einer hohen Reduktionsmittelkonzentration reduziert werden, die anschließend so weit verdünnt wird, daß sie im Prozeß der gemeinsamen Faltung brauchbar ist. Wenn das Reduktionsmittel DTT ist, liegt die hohe Reduktionsmittelkonzentration vorzugsweise bei etwa 30 bis 50 millimolar und die im Prozeß der gemeinsamen Faltung brauchbare Konzentration vorzugsweise bei etwa 5 bis 15 millimolar.

Die Lösung von denaturiertem und reduziertem IGF-I und IGFBP-3 wird dann oxidiert, um Disulfidbindungen zu bilden. Verträgliche Oxidationsmittel sind unter anderen Glutathion, oxidiertes Dithioerythrit, oxidiertes DTT, Sauerstoff, Cystein und Cysteamin. Als Oxidationsmittel vorzuziehen ist Cysteamin, das in einer Konzentration von 5 bis 15 millimolar angewandt werden kann.

Die Reaktion der gemeinsamen Faltung kann beliebig lange weiterlaufen. Jedoch haben die Erfinder festgestellt, daß die gemeinsame Faltung von IGF-I und IGFBP-3 die Kinetik des Rückfaltens wesentlich beschleunigt. Dementsprechend kann die Reaktionsdauer beträchtlich verkürzt werden, nämlich bis herab auf 1 bis 2 Stunden. Vorzugsweise wird die Reaktion der gemeinsamen Faltung bis zu 4 Stunden lang laufen gelassen, noch stärker vorzuziehen ist eine Frist von etwa 1 bis 3 Stunden.

Nach Abschluß der Reaktion der gemeinsamen Faltung kann der IGF-I/IGFBP-3-Komplex gereinigt werden. Der Komplex aus nativem IGF-I/IGFBP-3 kann mittels einer Vielzahl verschiedener Verfahren gereinigt werden, darunter unter anderen Größenausschluß, Ionenaustauschchromatographie und hydrophobe Interaktionschromatographie. Vorzugsweise wird der native IGF-I/IGFBP-3-Komplex mittels Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung einer sulfopropyl-derivatisierten Säulenchromatographiematrix (z. B. SP-Sephadex, Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt. Gegebenenfalls können natives IGF-I und IGFBP-3 weiter aus dem Komplex gereinigt werden, wozu diverse, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren angewandt werden können. Vorzugsweise werden IGF-I und IGFBP-3 aus dem Komplex gereinigt, indem der Komplex vorzugsweise in saurem Milieu dissoziiert wird und anschließend eine Größenausschlußchromatographie erfolgt. Der gereinigte Komplex oder IGF-I oder IGFBP-3 kann mit einem der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in verschiedene Puffer ausgetauscht und/oder konzentriert werden.

Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung gedacht.

Beispiele Beispiel 1 Expressionsvektoren, die IGF-I- und IGFBP-3-Sequenzen enthalten und zur Herstellung von IGF-I und IGFBP-3 dienen

Die zur Herstellung von IGF-I und IGFBP-3 verwendeten Expressionskonstrukte ähneln pJU1002 und pJU1003 (Squires et al., (vorst.) J. Biol. Chem. 263: 16297-16302), mit Ausnahme der Tatsache, daß die stromabwärts des Translationskupplungselements insertierten Gene Ubiquitin-IGF (pER10088) und IGFBP-3 (pDJ12833) sind. Zusätzlich unterscheiden sich pER10088 und pDJ12833 von pJU1003 dadurch, daß ihnen die synthetische 16-Bp- Adaptersequenz am 5'-Ende des tet-Gens in diesem Plasmid fehlt; jedoch enthalten sie DNA- Insertionen an der einzigen Pvu-II-Site des pBR322-abgeleiteten Grundgerüsts: pER10088 enthält einen 5'...CCTCGAGG...3'-Linker an dieser Stelle, pDJ12833 wiederum ein 385- Bp-Fragment mit dem par-Locus von pSC101 (Meacock und Cohen (1980) Cell 20: 529- 542).

pER10088 enthält einen offenen Leserahmen (ORF), der (von 5' nach 3') ein ATG-Triplett (Startcodon), die 76 Codons von Hefe-Ubiquitin, 70 synthetische Codons für reifen menschlichen Insulin-Wachstumsfaktor I und ein Terminationscodon umfaßt.

pDJ12833 enthält einen offenen Leserahmen, der ein ATG-Triplett und die 264 Codons für reifes menschliches IGBP-3 umfaßt. Die aminoterminalen 95 Codons sind synthetischer Natur; die übrigen wurden aus der natürlichen cDNA für dieses Gen abgeleitet.

In beiden Fällen ist der ORF relativ zum Translationskupplungselements genau so positioniert, wie bei Squires et al. (1988) für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor beschrieben.

Beispiel 2 Rekombinante Herstellung von IGF-I

IGF-I kann unter Verwendung von Expressionsvektor-Konstrukten wie die in Beispiel 1 beschriebenen hergestellt werden. Ein Expressionskonstrukt zur Herstellung eines IGF-I- Fusionsproteins (pER10088) wurde in E. coli vom Stamm W3110DE3 mit Hilfe der Calciumchloridtransfektion (Sambrook, vorst.) eingeschleust.

Die W3110DE3/pER10088 wurden in 100 Liter Flüssigkeit bei 37ºC gezüchtet, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von wenigstens etwa 25 erreicht hatte. Die Expression von IGF-I wurde durch die Zugabe von Isopropylthiogalactosid (IPTG) bis zu einer Konzentration von 0,4 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden weiter gezüch tet und dann durch Zentrifugieren gewonnen. Die abgesetzten Zellen wurden in Natriumacetatpuffer (50 mM, pH 5,5) mit Etylendiamintetraacetat (EDTA) wieder suspendiert. Die Bakterien wurden mit einem Microfluidizer® (Modell M-210-EH, Microfluidics Corp.) lysiert. Da nicht das gesamte in diesen Wirtszellen produzierte IGF-I-Fusionsprotein unlöslich ist, wurde Polyethylenimin (PEI) bis zu einer Konzentration von 0,1% hinzugegeben, um lösliche und teilweise lösliche IGF-I- Fusionsproteine auszufällen.

Das unlösliche und ausgefällte IGF-I-Fusionsprotein wurde durch Zentrifugieren gewonnen, dann einmal mit 2 M Harnstoff, 50 mM Kaliumphosphat, 2 mM DTT, pH 5,8-5,9 gewaschen und durch Zentrifugieren wiedergewonnen. Das IGF-I-Präzipitat wurde dann mit 6 M Harnstoff, 20 mM Tris, 30 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8,0 solubilisiert. Die DNA wurde durch Zugeben von Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,14% aus der Lösung ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand, der das IGF-I-Fusionsprotein enthielt, wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf Q- Sepharose weiter gereinigt. Das IGF-I-Fusionsprotein wurde mit Ubiquitinhydrolase verdaut (die von E. coli durch Expression von pER1011 erhalten worden war; ein Expressionsvektor, der Hefe-Ubiquitinhydrolase codiert (die Codierungssequenz der Hefe-Ubiquitinhydrolase ist in Fig. 8 dargestellt)), mit anschließender Reinigung gemäß Liu et al. ((1989) J. Biol. Chem. 264: 20331-20338; pER1011 ist analog zu pJU1002, mit Ausnahme des Vorhandenseins des 5'...CCTCGAGG...3'-Linkers, an der PvuII-Site), womit sich reifes IGF-I ergab.

Das IGF-I wurde anschließend denaturiert und in 2 M Harnstoff, 10 mM DTT und 20% Ethanol in Gegenwart von 10 mM Cysteamin rückgefaltet. Das IGF-I wurde durch Kationenaustauschchromatographie auf SP-Sepharose und Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) in einer C&sub1;&sub8;-Säule (Vydac) weiter gereinigt.

Beispiel 3 Rekombinante Herstelllung von IGFBP-3

IGFBP-3 kann unter Verwendung von Expressionsvektor-Konstrukten wie den in Beispiel 1 gezeigten hergestellt werden. Ein Expressionskonstrukt zur Herstellung von IGFBP-3, pDJ12833 wurde in E. coli vom Stamm W3110DE3 eingeschleust, und die Clone wurden mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren (wie die bei Sambrook, vorst. und Ausubel, vorst. beschriebenen) isoliert.

W3110DE3/pDJ12833-Clone wurden in 100 Liter Flüssigkeit bei 37ºC gezüchtet, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von 25 erreicht hatte. Die Expression von IGFBP-3 wurde durch die Zugabe von Isopropylthiogalactosid (IPTG) bis zu einer Konzent ration von 0,4 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden weiter gezüchtet und dann durch Zentrifugieren gewonnen. Die abgesetzten Zellen wurden in Natriumacetatpuffer (50 mM, pH 5,5) mit Ethylendiamintetraacetat (EDTA) wieder suspendiert. Die Bakterien wurden mit einem Microfluidizer® (Modell M-210-EH, Microfluidics Corp.) lysiert.

Das unlösliche IGFBP-3 wurde durch Zentrifugieren gewonnen, dann einmal mit 2 M Harnstoff, 50 mM Kaliumphosphat, 2 mM DTT, pH 5,8-5,9 gewaschen und durch Zentrifugieren wiedergewonnen. Das IGFBP-3-Präzipitat wurde dann mit 6 M Guanidin-HCl, 100 mM Tris, 25 mM DTT, 5 mM EDTA, pH 8,0 solubilisiert, die IGFBP-3-haltige Lösung würde mit einem Volumen 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8 verdünnt. Die DNA wurde durch Zugeben von Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,14% aus der Lösung ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugieren entfernt, und der IGFBP-3- haltige Überstand wurde mit 50 mM Tris, pH 10,6 weiter verdünnt. Nach der Zugabe von Cysteamin bis zu einer Endkonzentration von 6 mM wurde das IGFBP-3 über Nacht rückfalten gelassen.

Die IGFBP-3-Lösung wurde durch Ultrafiltration konzentriert, das Lösungsmittel durch Diafiltration gegen 2 M Harnstoff, 20 mM Tris, pH 7 ausgetauscht. Das IGFBP-3 wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose und anschließend SP-Sepharose gereinigt. Eine weitere Reinigung erfolgte durch RP-HPLC in einer C&sub1;&sub8;-Säule (Vydac).

Beispiel 4 Gemeinsames Zusammenfalten von IGF-I und IGFBP-3

Rekombinant hergestelltes IGF-I und IGFBP-3 wurden in äquimolarem Verhältnis gemischt und dann durch Lyophilisierung getrocknet. Das getrocknete Proteingemisch wurde in denaturierendem/reduzierendem Puffer (80 mM Tris, pH 8,3, 1,5 M Harnstoff, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) bis zu einer Proteinendkonzentration von 1 mg/ml aufgelöst. Es wurde Cysteaminhydrochlorid bis zu einer Endkonzentration von 10 mM Cysteamin zugegeben. Zur Kontrolle wurden sowohl IGF-I als auch IGFBP-3 allein rückfalten gelassen. Die Reaktionen des gemeinsamen bzw. einzelnen Rückfaltens wurden bei 5ºC inkubiert. Stichproben wurden unmittelbar vor (0 Stunden) und 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Zugabe des Cysteamins genommen und mittels RP-HPLC analysiert. Die RP-HPLC-Analyse der Probe von Stunde 0 zeigte, daß sowohl IGF-I als auch IGFBP-3 vollständig reduziert waren. Die RP-HPLC wurde mit einem Waters 626-1-HPLC-Instrument auf einer Porös R2/H-Säule (4,6 mm Durchmesser, 100 mm Länge) mit einem linearen Acetonitrilgradienten (mit 0,1% Trifluoressigsäure) von 13,5% bis 54% Acetonitril durchgeführt.

IGF-I und IGFBP-3 allein rückgefaltet ergaben niedrige Ausbeuten an nativem Protein. IGF-I ergab allein rückgefaltet eine Ausbeute von nur 13%, und IGFBP-3 eine von 45,1% nativen Proteins. Im Gegensatz dazu wurde bei der gemeinsamen Faltung praktisch das gesamte (99,6%) des IGF-I und der größte Teil (83%) des IGFBP-3 richtig gefaltet. Diese Ergebnisse zeigen, daß das gemeinsame Falten von IGF-I und IGFBP-3 zu einer synergistischen Steigerung der Ausbeute an nativem IGF-I und IGFBP-3 führt.

Eine weitere Untersuchung der gemeinsamen Faltungsreaktion zeigte, daß die gemeinsame Faltung nicht nur die Ausbeute an nativem Protein steigert, sondern auch die Kinetik der Rückfaltung ändert. Die Fig. 9 und 10 zeigen den zeitlichen Verlauf der Rückfaltung von IGF-I und IGFBP-3 jeweils allein und in der gemeinsamen Zusammenfaltungsreaktion. Der Prozeß der gemeinsamen Faltung steigert die anfängliche und die maximale Rückfaltungsrate ebenso wie die Gesamtausbeute der Rückfaltung.

Beispiel 5 Bioaktivitätstest des gemeinsam gefalteten IGF-I und IGFBP-3

Dieses Beispiel zeigt, daß das IGF-I, das IGFBP-3 und der IGF-I/IGFBP-3-Komplex, die gemäß der vorliegenden Erfindung rückgefaltet wurden, biologische Aktivität aufweisen.

MG 63-Zellen aus menschlichem Osteosarkom (5 · 10&sup5; Zellen) wurden in einem T-175- Kolben ausplattiert und in Zellkulturmedium (RPMI-Medium angereichert mit 10% fötalem Rinderserum, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin, nichtessentiellen Aminosäuren und 2 mM L-Gmtamin) gezüchtet. Der Kolben wurde 2-3 Tage lang bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft inkubiert. Bevor die Zellkultur konfluent wurde, wurden die Zellen durch Inkubation in Trypsin/EDTA-Lösung vom Kolben abgelöst. Es wurde Kulturmedium zugegeben (6 ml), um die Wirkung des Trypsins zu stoppen und die Zellen wurden in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Zellen wurden 5 bis 10 Minuten lang bei 800 · g zentrifugiert und in 10 ml Testmedium (RPMI-Medium angereichert mit 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin, nichtessentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 2,5 ug/ml Rinder-Fibronectin, 5 ug/ml menschliches Transferrin, 75 ug/ml Ovalbumin und 3 uM Dexamethason) resuspendiert.

Der IGF-I-Referenzstandard und die gemeinsam gefalteten IGF-I- und IGFBP-3-Proben wurden seriell mit dem Testmedium in Platten mit 96 Vertiefungen verdünnt. Es werden der IGF-I/IGFBP-3-Komplex, das IGF-I und das IGFBP-3, die durch das Verfahren der gemeinsamen Faltung erhalten wurden, getestet. Jede Vertiefung enthält 50 ul der Standard- bzw. der Probeflüssigkeit. Der Konzentrationsbereich des IGF-I-Referenzstandards beträgt 0,244- 500 ug/ml .

Die im Testmedium zubereiteten MG 63-Zellen aus menschlichem Osteosarkom wurden in Konzentrationen von 5000 Zellen/Vertiefung und in Volumina von 50 ul/Vertiefung plattiert. Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt 100 ul. Die Platten wurden 4 Tage lang bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft inkubiert.

Am Ende der Inkubationszeit wurde das Zellwachstum durch Messung der Säurephosphatase-Aktivität, die proportional zur Anzahl der Osteosarkomzellen ist, geprüft. Die Platten wurden aus dem Inkubator genommen und das Kuturmedium aus den Vertiefungen abgesaugt. Jede Vertiefung wurde mit 200 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul 10 mM p-Nitrophenylphosphat, 100 mM Natriumacetat, 1% Triton X-100, pH 5, 5 zugegeben und die Platte 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Hydrolyse des p-Nitrophenylphosphats durch Säurephosphatasen wird durch Zugabe von 10 ul 1,0 N Natriumhydroxid in jede Vertiefung gestoppt. Die Platten werden wenigstens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird die Absorption bei 405 nm gemessen, während diejenige bei 490 nm als Bezug genommen wird.

Die Hintergrundabsorption wurde von der für jede Vertiefung gemessenen Absorption subtrahiert. Die durchschnittliche Absorption wurde als Funktion der IGF-I-Konzentration aufgetragen. Für jede Probe und für den Referenzstandard wurde aufgrund des Dosis-Wirkungs- Diagramms der ED&sub5;&sub0;-Wert berechnet, d. h. jene IGF-I-Konzentration, bei der sich die halbmaximale Absorption ergibt. Die Aktivität jeder Probe wurde als Verhältnis des ED&sub5;&sub0;-Wertes der jeweiligen Stichprobe zu dem des Referenzstandards ausgedrückt.

Die vorliegende Erfindung wurde sowohl mittels direkter Beschreibung als auch mittels Beispielen ausführlich dargelegt.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Herstellen eines Komplexes aus nativem IGF-I und IGFBP-3, umfassend:

Denaturieren eines Gemisches von IGF-I und IGFBP-3;

Reduzieren des Gemisches von IGF-I und IGFBP-3, dadurch Erzeugen einer Lösung von reduziertem, denaturiertem IGF-I und IGFBP-3;

Zugeben eines Oxidationsmittels zu dem Gemisch von IGF-I und IGFBP-3; und

Erzeugen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3.

2. Verfahren zum Herstellen eines Komplexes aus nativem IGF-I und IGFBP-3, umfassend:

Denaturieren von IGF-I;

Reduzieren des IGF-I, dadurch Herstellen von denaturiertem, reduziertem IGF-I;

Denaturieren von IGFBP-3;

Reduzieren des IGFBP-3, dadurch Herstellen von denaturiertem, reduziertem IGFBP-3;

Mischen des denaturierten, reduzierten IGF-I mit dem denaturierten, reduzierten IGFBP-3, dadurch Erzeugen eines Gemisches von denaturiertem, reduziertem IGF-I und IGFBP-3;

Zugeben eines Oxidationsmittels zu dem Gemisch von denaturiertem, reduziertem IGF-I und IGFBP-3; und Erzeugen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3.

3. Verfahren zum Herstellen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3, umfassend:

Denaturieren von IGF-I, dadurch Erzeugen von denaturiertem IGF-I;

Denaturieren von IGFBP-3, dadurch Erzeugen von denaturiertem IGFBP-3;

Mischen des denaturierten IGF-I mit dem denaturierten IGFBP-3, dadurch Erzeugen eines Gemisches von denaturierten IGF-I und IGFBP-3;

Reduzieren des Gemisches von denaturiertem IGF-I und IGFBP-3, dadurch Erzeugen eines denaturierten, reduzierten Gemisches von IGF-I und IGFBP-3;

Zugeben eines Oxidationsmittels zu dem Gemisch von denaturiertem, reduziertem IGF-I und IGFBP-3; und

Erzeugen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3.

4. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Isolieren des Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3 aus dem Gemisch von IGF-I und IGFBP-3.

5. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Isolieren von nativem IGF-I aus dem Komplex von nativem IGF-I und IGFBP-3.

6. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Isolieren von nativem IGFBP-3 aus dem Komplex von nativem IGF-I und IGFBP-3.

7. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Verdünnens des Gemisches von denaturiertem, reduziertem IGF-I und IGFBP-3 vor dem Zugeben des Oxidationsmittels.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von IGF-I und IGFBP-3 ein molares Verhältnis von etwa 1 : 3 bis 3 : 1 hat.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von IGF-I und IGFBP-3 ein molares Verhältnis von etwa 1, 5 : 1 bis 1 : 1, 5 hat.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von IGF-I und IGFBP-3 mit Harnstoff oder Guanidin denaturiert wird, das Gemisch von IGF-I und IGFBP-3 mit Dithiothreit, 2-Mercaptoethanol, Dithioerythrit, Cystein, Cysteamin, oder reduziertem Glutathion reduziert wird, und das Oxidationsmittel Cystin, Cystamin, Sauerstoff, oxidiertes Dithiothreit, oxidiertes Dithioerythrit oder oxidiertes Glutathion ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von IGF-I und IGFBP-3 mit Harnstoff bei einer Konzentration von etwa 1 bis 2 molar denaturiert wird, das Gemisch von IGF-I und IGFBP-3 mit Dithiothreit bei einer Konzentration von etwa 5 bis 15 millimolar reduziert wird, und das Oxidationsmittel Cystamin bei einer Konzentration von ungefähr 5 bis 15 millimolar ist.

12. Verfahren zum Herstellen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3, umfassend:

Denaturieren von IGF-I;

Reduzieren des IGF-I;

Zugeben von nativem IGFBP-3, dadurch Erzeugen einer Lösung von IGFBP-3 und reduziertem, denaturiertem IGF-I;

Zugeben eines Oxidationsmittels zu dem Gemisch von IGF-I und IGFBP-3; und

Erzeugen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3.

13. Verfahren zum Herstellen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3, umfassend:

Denaturieren von IGFBP-3;

Reduzieren des IGFBP-3;

Zugeben von nativem IGF-I, dadurch Erzeugen einer Lösung von IGF-I und reduziertem, denaturiertem IGFBP-3;

Zugeben eines Oxidationsmittels zu dem Gemisch von IGF-I und IGFBP-3; und

Erzeugen eines Komplexes von nativem IGF-I und IGFBP-3.







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