Die Erfindung betrifft Wachsester, die an ω-3-ungesättigten Fettsäuren angereichert sind, Verfahren zu ihrer Herstellung, deren besonderes chemisches Verhalten es ermöglicht, dass sie als Arzneimittel- und Nahrungsmittelzusatzstoffe verwendet werden können, und Zubereitungen, die sie enthalten, sowohl für pharmazeutische als auch für diätetische Lebensmittelzwecke.

Der Name "Wachs" bedeutet üblicherweise eine große Klasse von Lipiden, die stärker nach ihren physikalischen Merkmalen als nach ihren chemischen Strukturen charakterisiert werden. Üblicherweise wird ein Material als Wachs klassifiziert, wenn es wie ein Honigwabenmaterial ausschaut.

Im Gegensatz dazu sind vom rein chemischen Standpunkt aus Wachse insbesondere Carbonsäureester (Wachsester). Sie sind Ester langkettiger aliphatischer Säuren (Fettsäuren) mit langkettigen aliphatischen Alkoholen. Sowohl die Säuren als auch die Alkohole können entweder gesättigt oder ungesättigt sein. Eine vollständige Beschreibung der Natur und der Eigenschaften von Wachsestern findet sich in einem Bericht von P. E. Kolattukudy, "Chemistry and Biochemistry of Natural Waxes", Elsevier (1976), Amsterdam.

Das Ausgangsmaterial, das zur Herstellung der hier beschriebenen Produkte verwendet wird, ist ein Gemisch aus Estern, angereichert an ω-3 ungesättigten Fettsäuren. Dieses Gemisch wird üblicherweise bei derzeitigen industriellen Verfahren aus Naturquellen wie Fischöl, erhalten, das eine relativ hohe Menge an ungesättigten ω-3-Fettsäuren wie EPA (Eicosapentaensäure) und DHA (Docosahexaensäure) enthält. In üblichen Verfahren werden die Fischöltriglyceride durch Behandlung mit niedrig siedenden Alkoholen in Anwesenheit eines Katalysators gespalten. Nach Entfernung des Glycerins werden die so erhaltenen Ester weiter an ω-3 ungesättigten Fettsäuren, gemäß einigen Verfahren wie Destillation und Harnstofffraktionierung angereichert.

Methyl- und Ethylester, angereichert an EPA und DHA, zusammen mit natürlichen oder synthetischen Triglyceriden und freien Fettsäuren, ebenfalls angereichert an EPA und DHA, liegen in Formen, die soweit verfügbar sind als Material, das an ω-3 polyungesättigter Fettsäure angereichert ist, vor, das sowohl in Pharmazeutika als auch in Nahrungsmittel- Integratoren verwendet wird.

Diese Formen besitzen starke Nachteile, hauptsächlich bedingt durch ihre Oxidationstendenz. Diese Produkte werden leicht ranzig, wenn sie Luft ausgesetzt sind. Oxidationsnebenprodukte, selbst in niedrigem Gehalt, bewirken, dass das Hauptmaterial riecht, reizend und unangenehm ist, so dass dieses nicht leicht gehandhabt und verwendet werden kann.

Von einem technischen Standpunkt aus sind weiterhin polyungesättigte Fettsäuren, ihre Glyceride und ihre Ester mit niedrigsiedenden Alkoholen dicke, ölige Flüssigkeiten, die schwer zu formulieren sind. Die beste Lösung, die bis heute verwendet wird, besteht darin, sie in weichen Gallertkapseln zu formulieren, und in diesem Verfahren kann die Unbequemlichkeit nicht beseitigt werden, wie ein Aufstoßen nach dem Verzehr.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Wachsester, die hier beschrieben werden, diese Schwierigkeiten leicht beseitigen können. Die hier beschriebenen Produkte sind leicht handhabbar, da sie fest sind und eine geringere Oxidationsgefahr besteht. Trotzdem verbleiben die biologischen Eigenschaften die gleichen wie im Falle aller oben erwähnten öligen Derivate. Überraschenderweise wurde als Tatsache gefunden, dass Wachsester, angereichert mit ω-3-polyungesättigten Fettsäuren wesentlich leichter absorbiert und metabolisiert werden als Wachsester, die natürlich vorkommen und die durch niedrige Gehalte an ω-3-Fettsäuren charakterisiert sind.

Die hier beschriebenen Produkte sind feste wachsartige Materialien, so dass die Oxidation nur auf die Oberflächenschicht beschränkt ist. Daher können sie auf verschiedene Arten formuliert werden, wobei ihre biologischen und organoleptischen Eigenschaften erhalten bleiben.

Die günstigen Wirkungen der ω-3-Fettsäuren, insbesondere von EPA und DHA, sind für Pathologien, die das Herz-Kreislaufsystem beeinflussen (Thrombose, Atherosclerose, Plättchenhyperaggregation, Hyperlipidämle, Hypercholesterinämie), wie auch für Pathologien, die das Immunsystem beeinflussen, bei inflammatorischen Zuständen und Tumoren gut bekannt. Weiterhin wurden die Auswirkungen eines Mangels an Nahrungsmittel-DHA beschrieben (Tacconi M. T., Lligona L., Salmona M., Pitsikas M. und Algen S., Neurobiol, of Aging, 12 : 55-59, 1990).

Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung von Estern, die aus freien Fettsäuren, angereichert an ω-3 polyungesättigten Fettsäuren, und Alkoholen, die in natürlichen Wachsestern vorkommen, gebildet sind, dadurch gekennzeichnet ist, dass der Gehalt an Acyl-Resten von DHA und/oder EPA höher ist als 12% beziehungsweise 18%.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der hier beschriebenen Wachsester zur Herstellung von Arzneimittel, die zweckdienlich bei den zuvor erwähnten Pathologien, wie auch bei der Herstellung von Diät- und Lebensmittelprodukten verwendet werden können.

Die hier beschriebenen Wachsester werden aus einem Gemisch von Estern von freien Fettsäuren, angereichert an ω-3-polyungesättigten Fettsäuren, gebildet, wobei die Alkoholgruppierung üblicherweise Methyl- oder Ethylalkohol ist, oder allgemeiner ein niedrig siedender Alkohol. Dieses Gemisch wird mit einem oder mehreren Alkoholen gemäß einer Umesterungsreaktion, vorausgesetzt, dass diese Alkohole die gleichen sind wie in Naturwachsprodukten, entsprechend dem folgenden Schema umgesetzt:

RCOOR" + R'OH = RCOOR' + R"OH

worin R der Rest einer ω-3-ungesättigten Fettsäure bedeutet, R" Methyl, Ethyl oder der Rest eines niedrig siedenden Alkohls bedeutet, R' der Rest eines Alkohols bedeutet, der in dem Naturwachsester vorkommt, vorausgesetzt, dass die Ester von EPA und DHA in diesem Gemisch in Prozentgehalten höher als 18% beziehungsweise 12% enthalten sind, entsprechend den Prozentgehalten von diesen zwei Säuren, die üblicherweise in Naturprodukten gefunden werden.

Für R" sind Methyl und Ethyl bevorzugt. Für R' sind Reste gesättigter Alkohole mit einer Kohlenstoffatomzahl im Bereich von 12 bis 40 bevorzugt. Ein anderer bevorzugter Alkohol ist Oleylalkohol.

Optimal wird die Reaktion, beginnend mit einer fast stöchiometrischen Menge der Reaktionsteilnehmer, durchgeführt, und sie wird durch Basen katalysiert, entsprechend dem Verfahren, das üblicherweise für Umesterungen verwendet wird. Das Produkt wird mit der höchsten Ausbeute erhalten, wenn der niedrig siedende Alkohl R"OH als Reaktionsprodukt durch Destillation bei verringertem Druck entfernt wird.

Nach Beendigung wird das Reaktionsgemisch mit heißem Wasser, das eine geringe Menge an Säure, bevorzugt Citronensäure, enthält, behandelt, um den Katalysator abzuschrecken und zu entfernen, zusammen mit geringen Spuren an während der Reaktion gebildeter Seife. Durch die Zugabe von heißem Wasser wird der Wachsester als geschmolzene flüssige Phase abgetrennt, die sich abtrennen und verfestigen kann.

Die erfindungsgemäß beschriebenen Wachsester können in kleine, farblose, nadelförmige Kristalle umkristallisiert werden. Sie können ebenfalls ohne irgendeine Kristallisation einfach durch Wiederholung des Waschens der öligen Phase mit etwas mehr Wasser und Citronensäure gereinigt werden. Das so erhaltene Produkt wird einer Endbehandlung der Desodorierung unterworfen, um Nebenprodukte der Oxidation zu entfernen, gemäß Verfahren, die üblicherweise in der Lebensmittelöltechnologie verwendet werden.

Gemäß dem so beschriebenen Verfahren, ist der Gehalt an ω-3-polyungesättigten Fettsäuren im Endwachsester gleich wie in dem Ausgangsgemisch der Ester, was durch Analyse der sauren Gruppierung, erhalten durch Hydrolyse der Wachsester, gezeigt wird.

Die Umesterungsreaktion ist das bestgeignetste Verfahren zur Herstellung von Wachsestern, die an ω-3-polyungesättigten Fettsäuren stark angereichert sind. Andere Reaktionen können ebenfalls die gleichen Produkte ergeben, ausgehend von Estern, angereichert an ω-3-polyungesättigten Säuren, und von freien Fettsäuren, erhalten durch Hydrolyse dieser Ester. Einige dieser Reaktionen können erwähnt werden, wie die direkte Veresterung von freien Fettsäuren mit Alkoholen, die Behandlung der Alkohole mit reaktiven Derivaten von Säuren, wie den Anhydriden, Chloriden, Isopropenylestern und so weiter, die Umesterung von entweder Methyl- oder Ethylestern von Fettsäuren mit entweder Essig- oder Propionsäureestern langkettiger Alkohole.

Wachsester, die hier beschrieben werden, sind gegenüber der Luftoxidation stabiler als die Ausgangsester, was durch die Parallelbestimmung der Peroxidzahl, bestimmt bei steigenden Zeiten einer Probe aus Ethylester, angereichert an EPA und DHA, und des entsprechenden Wachsesters, bestätigt wird, wenn beide Proben in einem offenen Behälter stehengelassen werden. Nach einer Woche der Einwirkung von Luft nimmt die Peroxidzahl um das fünf- bis siebenfache im Falle des Ehtylesters zu, verglichen mit dem Fall der Wachsester; die Werte wurden auf der Basis des tatsächlichen Gewichts der polyungesättigten Fettsäure in der Molekularformel der Ethylester und der Wachsester korrigiert.

Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Bildung von Formaldehyd als Oxidationsnebenprodukt verfolgt wurde. Die Tests wurden gemäß Wilbur et al., Arch. Biochem. Biophys, 24: 305,1949, modifiziert durch Kikugawa et al. Anal. Biochem. 202: 249, 1992, durchgeführt und sie sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Hinsichtlich der Absorption und Biotransformation von Wachsestern, die erfindungsgemäß beschrieben werden, wurde gefunden, dass diese Verbindungen gut absorbiert werden und dass sie tatsächlich metabolisiert werden, im Gegensatz zu dem, was von Naturwachsestern beschrieben wurde, die nicht mit ω-3-polyungesättigten Fettsäuren angereichert sind.

Die Verdaubarkeit der erfindungsgemäß beschriebenen Produkte wurde in vitro in Versuchen geprüft. Nach der Digestion mit Pancreaslipase wurde die Hydrolyse der Wachsester auf der Grundlage der Bildung sowohl der Alkohol- als auch der Säuregruppierungen verfolgt. Als Vergleich wurde Jojobaöl verwendet, das ein Naturöl ist, das eine Säuregruppierung, bei der die monoungesättigte Fettsäure die Hauptmenge darstellt, und eine Alkoholgruppierung, die überwiegend gesättigte Ketten enthält, enthält. Die Dünnschicht-Chromatographie-Analyse zeigt klar, dass die Wachsester, angereichert an ω-3- polyungesättigten Fettsäuren bereits nach 6 Stunden vollständig in ihre Bestandteile hydrolisiert sind, wohingegen Jojobaöl kaum reagiert hatte.

In-vivo-Tests wurden mit Ratten, die mit einer Einzeldosis von 5 g/kg Wachsestern (akute Behandlung) behandelt waren, durchgeführt. Die Tiere wurden 6 bzw. 16 Stunden nach der Behandlung getötet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

Tabelle 2 zeigt, dass die Plasmatriglyceride erhöht werden, im Vergleich mit den nicht behandelten Tieren, bei beiden Zeiten nach der Behandlung. Tabelle 3 zeigt eindeutig, dass das Plasma der behandelten Tiere bemerkenswert in EPA und DHA 6 Stunden nach der Behandlung im Vergleich mit den nicht behandelten Tieren angereichert ist. Keine Wirkung ist nach 16 Stunden nach der Behandlung erkennbar, möglicherweise wegen des schnellen Metabolismus der Lipide.

Ein Prokoll wurde ebenfalls angewendet, um die Wirkungen der chronischen Behandlung zu untersuchen. Mit einer Dosis von 0,3 g/kg, wiederholt während 15 Tagen, wurde keine Änderung im Gewicht der Tiere beobachtet. Der Futterverbrauch nahm etwas ab, wohingegen der intestinale Durchgang nicht verändert war, was aus Tabelle 4 hervorgeht. Diese Ergebnisse stehen in scharfem Gegensatz zu den Ergebnissen im Falle der Naturwachse, bei denen polyungesättigte Fettsäuren nicht die Hauptbestandteile der Säuregruppierung sind (vergleiche die oben angegebene Zusammenfassung von P. E. Kolattukudy). Die in-vivo-Tests stehen in Übereinstimmung mit den in-vitro-Ergebnissen, und alle verstärken den Beweis, dass die Anreicherung der Wachsester an ω-3-ungesättigten Säuren eine vollständige Absorption und Verdaubarkeit ergibt.

Als Ergebnis zeigen die Untersuchungen, sowohl in vivo als auch in vitro, die Wirksamkeit der erfindungsgemäß beschriebenen Produkte als Quelle für ω-3-ungesättigte Fettsäuren, wobei diese Produkte so gut wie andere Produkte sind, die derzeit auf dem Markt sind. Zusätzlich, im Gegensatz zu den derzeitigen Produkten, zeigen die neuen Produkte unter technologischen und Rezepturgesichtspunkten viele Vorteile auf.

Einige Zubereitungsaspekte, die alle hier beschriebenen Produkte betreffen, sollen besonders erwähnt werden. Beispielsweise können die Wachsester in geschmolzener Form versprüht werden und in kaltes Wasser injiziert werden, wobei sich Tröpfchen des Produkts in Form kleiner Kügelchen mit einem vorgegebenen Radius verfestigen. Das Verfahren kann mit Wasser, behandelt mit Salz und natürlichen Duftstoffen, durchgeführt werden, um synthetischen Kaviar herzustellen.

Als Alternative können die Wachsester auf einer festen Matrix (Mehl, Kleie, Granulate und so weiter) absorbiert werden, um Nahrungsmittelprodukte herzustellen, die mit ω-3- ungesättigten Fettsäuren angereichert sind.

Auf dem pharmazeutischen Gebiet können die erfindungsgemäßen Produkte unter Verwendung bekannter Exzipientien und Verfahren, wie in "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook" Mack Publishing Company, New York, USA, beschrieben, formuliert werden.

Die Erfindung betrifft daher ebenfalls diätetische und pharmazeutische Zubereitungen, die Wachsester, angereichert an ω-3-ungesättigten Fettsäuren, enthalten, die nach dem hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden können.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung einiger Wachsester, angereichert an ω-3-ungesättigten Fettsäuren, und erläutern die Erfindung in Einzelheiten.

25 g angereicherter Fischölester (Verseifungszahl = 170 mg KOH/g, durchschnittliches Molekulargewicht 330, EPA 33%, DHA 22%, bestimmt durch gaschromatographische Prozentanalyse) wurden mit 25 g Behenylalkohol (Molekulargewicht 326) vermischt. Das Gemisch wurde mit 0,3 g Natriummethoxid behandelt und der Kolben wurde mit einer Vakuumpumpe (40 mbar) verbunden. Die Temperatur wurde auf 120ºC erhöht. Das gerührte Gemisch verdunkelte sich, als das Ethanol bei circa 80ºC zu sieden begann. Die Temperatur von 120ºC wurde während einer halben Stunde gehalten. Während dieser Zeit hörte die Ethanol-Entwicklung fast auf. Das Gemisch wurde darauf auf 40ºC abgekühlt, dann wurde das Vakuum durch Füllen des Kolbens mit Stickstoff aufgehoben. Das flüssige Gemisch wurde in eine 1%-ige Citronensäurelösung (200 ml) gegossen und unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde das Gemisch weiter gerührt, auf 5ºC abgekühlt, wobei eine Kristallisation stattfand. Das feste Material wurde im Vakuum abfiltriert, mit Wasser auf dem Filter gewaschen und aus 400 ml Aceton umkristallisiert. Nach dem Abkühlen des Gemisches auf -10ºC in einer Stünde wurde das weißliche kristalline Produkt im Vakuum abfiltriert und bei verringertem Druck über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute: 42,5 g(89%). Das Produkt ergibt einen klaren Fleck im TLC (Silicagelplatten, Eluierungssystem; n-Hexanethylether 9 : 1, Rf = 0,87, wobei Rf des Ausgangsethylester = 0,75, Rf von Behenylalkohol = 0,11). Der Schmelzpunkt des Wachses war 47ºC.

Der gleiche Ethylester von Beispiel 1 (33 g) wurde mit 27 g Stearylalkohol (Molekulargewicht 270) umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie bei Beispiel 1. Ausbeute: 43,5 g (67,5%), nach Umkristallisation aus 200 ml Aceton. Es wurde ein klarer Fleck im TLC nachgewiesen (Silicagel, m-Hexanethylether 49 : 1, Rf = 0,23). Durch Überlagern dieses Produkts mit einem Produkt von Beispiel 1 konnte keine Trennung beobachtet werden. Schmelzpunkt: 39ºC.

25 g Ethylester, angereichert an EPA (74% EPA), ohne DHA, (Verseifungszahl: 170, durchschnittliches Molekulargewicht 330) wurden mit 25 g Behenylalkohol umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie bei Beispiel 1. Das aus Wasser erhaltene Produkt war selbst in großen Mengen an heißem Aceton nicht vollständig löslich, so wurde es filtriert, wie es war, eine geschmolzene Phase, durch ein Papierfilter, und bei verringertem Druck getrocknet. Ausbeute: 39,4 g (82,7%). Schmelzpunkt: 40ºC.

25 g Ethylester (der gleiche wie in Beispiel 1) wurden mit 16,2 g 1-Tetradecanol (Molekulargewicht 214) umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie bei Beispiel 1. Nach dem Gießen des Gemisches in saures Wasser wurde die ölige Phase zweimal bei 45ºC mit 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Abtrennen wurde die ölige Phase bei verringertem Druck getrocknet. Ausbeute: 35 g (90%). Schmelzpunkt: 23ºC. Die Dünnschicht-Chromatographie zeigte einen reinen Flecken mit dem gleichen Rf wie die Produkte der Beispiele 1, 2 und 3.

33 g des gleichen Ethylesters von Beispiel 1 (33% EPA, 22% DHA) wurden gemäß dem gleichen Verfahren von Beispiel 1 mit 24 g 1-Hexadecanol (Cetylalkohol) umgesetzt. Der bei 3ºC aus Wasser abfiltrierte Feststoff wurde in 50 ml kaltem Aceton (bei -10ºC) eine halbe Stunde gerührt, im Vakuum filtriert und bei verringertem Druck getrocknet. Ausbeute: 47 g (89%). Schmelzpunkt: 31ºC.

33 g des gleichen Ethylesters von Beispiel 1 wurden mit 29 g 1-Eicosanol umgesetzt. Nach dem gleichen Verfahren und der gleichen Aufarbeitung wie in Beispiel 1 wurden 42 g Wachsester erhalten (75%). Schmelzpunkt: 43ºC.

Das gleiche Herstellungsverfahren wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde wiederholt. Die Kristallisation aus Aceton wurde weggelassen, aber das Rohprodukt, das nach der Trennung des geschmolzenen Wachses aus heißem Wasser erhalten wurde, wurde erneut gemäß dem gleichen Verfahren gewaschen. Es wurde ein Produkt erhalten, das den gleichen Schmelzpunkt und die gleiche Reinheit besaß, wie das in Beispiel 2 beschriebene. Die Ausbeute erhöhte sich auf 96%.

Alle Proben (Beispiele 1-7) wurden der Hydrolyse gemäß den Bedingungen unterworfen, wie sie für die Analyse von Naturwachsestern beschrieben sind (Linskens, H. J. und Jackson, L. J., Essential Oils and Waxes, Springler Verlag, Berlin (1991)). Anschließend erfolgte die geeignete Aufarbeitung und Analyse der Zusammensetzung aus freien Fettsäuremolekülteilen. Die Analysen zeigten die gleichen EPA- und DHA-Gehalte in Wachsestern wie in den Estern, die als Ausgangsmaterial verwendet worden waren.

Die Wirkung von Pancreaslipase auf Wachsester wurde gemäß dem Verfahren von Neumann (U. Neumann, P. Kaspar, und J. Ziegenborn, "Methods in Enzymatic Analysis", Bergmayer HV, 1984, Bd. 4, S. 34-36) verifiziert. 800 mg Wachses er, angereichert an ω-3- polyungesättigten Fettsäuren, und parallel zum Vergleich 800 mg Jojobaöl wurden in einem Tris-Puffer, 0,125 M, pH 9,2, der Humane-Pancreaslipase, Colipase und Deoxycholsäure enthielt, bei unterschiedlichen Zeiten bei 37ºC inkubiert. Nach der Extraktion der Lipide wurden Teile der organischen Phasen, die Lipide enthielten, getrocknet, und auf eine Silicagel-TLC-Platte mit Konzentrationsbande gegeben. Die Platten wurden mit n-Hexan- Ethylether-Essigsäure 80 : 20 : 1 eluiert. Die Flecken wurden durch Einwirkung von Iod und Besprühen mit Schwefelsäure sichtbar gemacht.