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Dokumentenidentifikation DE10059151C2 16.10.2003
Titel Magnetische Partikel zur zielgerichteten regionalen Therapie und Verwendung derselben
Anmelder Alexiou, Christoph, Dr., 80796 München, DE;
Bergemann, Christian, 10777 Berlin, DE
Erfinder Alexiou, Christoph, Dr., 80796 München, DE
Vertreter Tiedtke, Bühling, Kinne & Partner GbR, 80336 München
DE-Anmeldedatum 29.11.2000
DE-Aktenzeichen 10059151
Offenlegungstag 13.06.2002
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 16.10.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.10.2003
IPC-Hauptklasse A61N 2/10

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft magnetische Partikel zur zielgerichteten, regionalen Therapie von Krankheiten, insbesondere zur Behandlung beim Menschen. Die Erfindung eignet sich besonders gut zur regionalen Behandlung gegen Tumore, lokale Infektionen und lokale Entzündungen und ähnliche lokale Krankheitszustände.

Die Therapie von Krankheiten ist in der Regel ein Balanceakt zwischen der Wirksamkeit und der Toxizität des eingesetzten Wirkstoffs. Dies gilt insbesondere für die Chemotherapie mit den in der Regel toxischen Cytostatika. Eine Reihe von Strategien wurden deshalb entwickelt, um diesem Dilemma zu begegnen.

Eine Strategie mit der Bezeichnung "Magnetic Drug Targeting" beruht darauf, therapeutisch wirksame Substanzen an magnetische Partikel als Trägersystem zu binden, um Magnetfeld- unterstützt die therapeutische Substanz regional bzw. lokal anzureichern und somit eine höhere Wirksamkeit am gewünschten Therapieort bei gleichzeitiger Reduzierung systemisch bedingter Nebenwirkungen zu erzielen. Dabei handelt es sich um spezielle Anwendungen der für breite technische Bereiche entwickelten, magnetischen Flüssigkeiten, den sogenannten Ferrofluiden.

Versuche, eine gezielte Chemotherapie mit magnetischen, Arzneimittel-beladenen Albumin-Mikropartikeln unter Zuhilfenahme von Magnetfeldern durchzuführen, werden von K. J. Widder et al. in "Eur. J. Cancer Clin. Onkol.", Vol. 19, S. 135-139 (1983) und P. K. Gupta und C. T. Hung in N. Willmot und J. Daly (Hrg.), "Microspheres and Regional Cancer Therapy", S. 71-116, CRC Press, Boca Rayton (FL) (1991), beschrieben. Dabei liegt der Wirkstoff im von Albumin beschichteten Kern vor, was jedoch eine Phagozytose notwendig macht, um den Wirkstoff frei zu setzen.

Die DE-A-196 24 426 beschreibt magnetische Partikel, die einen Kern mit nanokristallinen, magnetischen Teilchen und eine Hülle aus Polymeren mit solchen reaktiven Gruppen umfassen, die zur kovalenten Bindung oder zum Ionenaustausch befähigt sind. Es wird vorgeschlagen, therapeutische Wirkstoffe, wie z. B. die Cytostatika Doxorubicin oder Mitoxantron, beispielsweise über Ionentauscherreaktionen an die magnetischen Teilchen zu binden und anschließend in Form einer Dispersion intravenös zu applizieren. Unter Bezugnahme auf andere Dokumente des Stands der Technik wird in der DE-A- 196 24 426 einleitend erwähnt, dass dort - bedingt durch die Struktur und den Aufbau jener magnetischen Partikel - z. B. intraarteriell zu injizieren ist, was aber in der klinischen Praxis zu erheblichen Problemen führen soll. Die eigentliche Lehre der DE-A-196 24 426 nimmt daher von einem solchen Applikationsweg Abstand und zieht aufgabengemäß nur eine intravenöse Applikation in Betracht.

Ferner beschreiben A. S. Lübbe et al. in "Cancer Res.", Vol. 56, S. 4694-4701 (1996) präklinische Experimente an Tieren mittels Magnetfeld-unterstützten Wirkstoff-Targetings bei intravenöser Applikation. Ferner wurden durch A. S. Lübbe et al. in "Cancer Res.", Vol. 56, S. 4686-4693 (1996) Studien zur Bioverträglichkeit von mit 4'-Epidoxorubicin beladenen, magnetischen Partikeln beschrieben.

Die tatsächliche therapeutische Wirksamkeit von mit therapeutischen Substanzen beladenen, magnetischen Teilchen ist jedoch bisher noch nicht beschrieben worden. Insbesondere gibt der oben genannte Stand der Technik nicht die Bedingungen wieder, welche für eine effiziente und wirksame regionale bzw. lokale Therapie von Krankheiten bei gleichzeitiger Minimierung systemisch bedingter Nebenwirkungen erforderlich sind.

Es war daher Aufgabe vorliegender Erfindung, technische Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, um die regionale bzw. lokale Therapie von Krankheiten zu verbessern.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, die eine magnetische Substanz in Kombination mit einer therapeutischen Substanz umfassen, zur Magnetfeld-unterstützten, regionalen Therapie von Krankheiten mittels intraarterieller Applikation eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung und die bevorzugten Ausführungsformen werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt die Magnetresonanz-Bilddarstellung von Tumoren (VX-2-Karzinom) von Kaninchen nach intraarterieller (Fig. 1A) bzw. intravenöser (Fig. 1B) Applikation magnetischer Partikel und nach 60-minütiger Anwendung eines externen magnetischen Feldes (Magnetresonanz-Bildaufnahmen 6 h danach).

Fig. 2 zeigt einen histologischen Schnitt durch den VX-2- Tumor unmittelbar nach der Magnetfeld = unterstützten, regionalen Therapie gemäß der vorliegenden Erfindung.

Die Fig. 3A, 3B und 3C zeigen vergrößert unterschiedliche Bereiche der jeweils in Fig. 2 als Felder A, B und C dargestellten Sektionen.

Fig. 4 zeigt die reversible Bindung einer therapeutischen Substanz über ionische Wechselwirkung an ionisch geladene Gruppen der Polymerhülle der magnetischen Partikel gemäß einer Ausführungsform vorliegender Erfindung.

Die Fig. 5A bis 5G veranschaulichen die Wirkung der erfindungsgemäßen, Magnetfeld-unterstützten, regionalen Therapie mittels magnetischer Partikel im Vergleich zu verschiedenen Kontrollgruppen und Vergleichsproben.

Fig. 6 zeigt ein Beispiel einer Nebenwirkung (Leukozytenwerte) im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen, Magnetfeldunterstützten, regionalen Therapie mittels magnetischer Partikel im Vergleich zu Kontrollgruppen und Vergleichsproben.

Fig. 7A zeigt die Abwesenheit weiterer Nebenwirkungen im erfindungsgemäßen System im Gegensatz zum in Fig. 7B ersichtlichen Auftreten von Nebenwirkungen bei einer Kontrollgruppe.

Ein wesentliches Kriterium der erfindungsgemäßen Konzeptes besteht darin, dass die magnetischen Partikel, die die magnetische Substanz und die therapeutische Substanz kombiniert umfassen, in einer Ausgestaltung zur intraarteriellen Applikation vorliegen. Es hat sich überraschend herausgestellt, dass die lokale Anreicherung am gewünschten Zielort sowie die regionale Wirksamkeit der therapeutischen Substanz signifikant verbessert werden und gleichzeitig schädliche Nebenwirkungen minimiert werden, wenn eine intraarterielle Applikation vorgesehen ist und nicht wie im eingangs beschriebenen Stand der Technik intravenös.

Die wesentlich bessere regionale Anreicherung von mit einer therapeutischen Substanz beladenen, magnetischen Partikeln für die zielgerichtete, regionale Therapie im Falle einer intraarteriellen Applikation ist in Fig. 1A im Vergleich zu dem Ergebnis einer intravenösen Applikation (Fig. 1B) in Form von Magnetresonanzbild-Darstellungen am Beispiel eines Tumors in den hinteren Gliedmaßen (VX-2-Karzinom) von Kaninchen gezeigt. Die Magnetresonanz-Darstellung wurde aufgenommen 6 Stunden, nachdem magnetische Partikel, die mit einem Cytostatikum beladen waren, entweder intraarteriell oder intravenös in dafür jeweils geeigneten Flüssigkeiten appliziert wurden und anschließend 60 Minuten ein inhomogenes Magnetfeld, dessen Pol auf die Tumorstelle gerichtet war, angelegt wurde. Der Tumor im medialen Oberschenkelbereich der hinteren Gliedmaßen wird durch eine gepunktete, ovale Linie angezeigt, wobei die mit einem "f" markierte Fläche den Kopf des Oberschenkelknochens (Femur) anzeigt. Die in Fig. 1A ersichtlichen, auf den Tumorbereich beschränkten, definierten Extinktionssignale der Magnetresonanz-Darstellung belegt die hohe Anreicherung der mit der therapeutischen Substanz beladenen, magnetischen Partikel in stabilem Zustand auch 6 Stunden nach Applikation und zielgerichteter Anreicherung mittels Magnetkraft, während der Vergleich mit der intravenösen Applikation in Fig. 1B nahezu keine Signalextinktion zeigt.

Im Rahmen experimenteller Untersuchungen mit magnetischen Partikeln, die zum quantitativen Nachweis radioaktiv markiert waren, wurde nachgewiesen, dass sogar 80% bis 90% der erfindungsgemäß eingesetzten, magnetischen Partikel bei intraarterieller Applikation im Tumor oder im peritumoralen Gebiet konzentriert werden konnten. Dies belegt den signifikanten Vorteil der vorliegenden Erfindung, wonach für eine gleiche Wirksamkeit der herkömmlich applizierten therapeutischen Substanz eine verringerte Dosis, vorzugsweise eine wesentlich verringerte Dosis der entsprechenden therapeutischen Substanz erforderlich ist, was zu erheblich weniger Nebenwirkungen führt. Aufgrund dieser ausgezeichneten Anreicherung im Zielgebiet konnte erfindungsgemäß am Beispiel eines Tumors bereits bei einmaliger Applikation eine vollständige Remission des Tumors erreicht werden. Eine Embolisation aufgrund der eingesetzten magnetischen Partikel wurde nicht beobachtet.

Ferner wurde gefunden, dass mit der erfindungsgemäßen Ausgestaltung zur intraarteriellen Applikation der mit der therapeutischen Substanz beladenen, magnetischen Partikel eine ausgezeichnete Verteilung der magnetischen Partikel durch den gesamten Tumor erreicht wird. Dies wird anhand der in den Fig. 2 und den damit zusammenhängenden Fig. 3A, 3B und 3C dargestellten, histologischen Befunde gezeigt. Bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden die hohen Mengen an magnetischen Partikeln über den gesamten Tumorbereich hinweg erzielt, wie an den Gesamtschnitten des Tumors in Fig. 2 anhand der Ansammlungen der braun-schwarz sichtbaren, magnetischen Partikel deutlich wird. Es gibt eng lokalisierte Bereiche mit Ansammlungen magnetischer Partikel besonders hoher Dichte, aber auch über den gesamten Tumor zerstreute und verteilte, magnetische Partikel in geringerer Dichte. Eine genauere Untersuchung des in Fig. 2 mit "1" gekennzeichneten Bereiches zeigt ferner (s. Fig. 3A), dass das Blutgefäß, welches den Tumor versorgt, eine hohe intramurale Konzentration der zum Magnetfeld orientierten magnetischen Partikel aufweist. Im interstitialen Bereich des Tumorgewebes (s. mit "2" gekennzeichneter Bereich, das in Fig. 3B vergrößert dargestellt ist) liegen ebenfalls zahlreiche, hochkonzentrierte Anreicherungen von magnetischen Partikeln vor (in Fig. 3B durch Pfeile dargestellt). Schließlich zeigt auch der in Fig. 3C dargestellte Übergangsbereich zwischen Muskulatur und Tumorgewebe eine Vielzahl von hochkonzentrierten Ansammlungen magnetischer Partikel, die als schwarze Kondensationen innerhalb und außerhalb des Tumors ersichtlich sind.

Damit die magnetischen Partikel zur regionalen Therapie von Krankheiten über intraarterielle Applikation verabreicht werden können, liegen die magnetischen Partikel üblicherweise in einer zur intraarteriellen Applikation geeigneten Form vor, geeigneter Weise in einer dem Fachmann geläufigen, zur Infusion oder Perfusion ausgestalteten Flüssigkeit. Die Flüssigkeit sollte biokompatibel und nicht immunogen sein, insbesondere steril und pyrogenfrei.

Die magnetischen Partikel können im Hinblick auf die Kombination zwischen der magnetischen Substanz und der therapeutischen Substanz erfindungsgemäß grundsätzlich in Form von zwei alternativen Ausgestaltungen vorliegen. Im ersten Fall liegt die therapeutische Substanz reversibel gebunden an der Oberfläche der magnetischen Partikel mit einer magnetischen Kernsubstanz vor, wohingegen bei der zweiten Alternative die therapeutische Substanz fest mit der magnetischen Substanz verbunden ist. Während die erstgenannte Ausgestaltung für molekulare Substanzen vorgesehen ist, die nach Trennung der reversiblen Bindung ihre therapeutische Wirkung entfalten, wurde die zweite, alternative Ausgestaltung vornehmlich für die Strahlentherapie konzipiert, bei der es nicht auf eine direkte Einwirkung einer dissoziierten, molekularen Substanz, sondern auf das Aussenden einer biologisch wirksamen Strahlung ankommt.

Bei beiden Ausgestaltungen der magnetischen Partikel wird ein Kern, in dem die magnetische Substanz vorliegt, mit einem Polymeren umhüllt. Ein solcher Grundaufbau sowie Modifikationsmöglichkeiten magnetischer Partikel ist an sich bekannt, und insoweit kann auf bekannte Literatur und Offenbarungsquellen verwiesen werden, die sich auf den Aufbau und die Herstellung entsprechender magnetischer Partikel bzw. magnetischer Flüssigkeiten (Ferrofluide) beziehen, insbesondere die in die vorliegende Offenbarung mit einzubeziehenden Veröffentlichungen in "Encyclopedia of Physical Science and Technology", Vol. 9, S. 321 ff., Academic Press, New York (1992) sowie die eingangs erwähnte DE-A-196 24 426. Erfindungsgemäß ist es dabei bevorzugt, ein Polymer als Hüllmaterial einzusetzen, welches in wässrigen Medien, insbesondere im physiologischen Milieu, kompatibel ist und zur Stabilisierung im wässrigen Medium sowie bei der Anwendung dient.

Beispiele geeigneter Polymere schließen ein: Stärke, Stärkeester oder -etherderivate, deren Abbauprodukte wie Dextrine, ferner Dextrane, andere Polysaccharide, Pektine, Proteine wie Albumin, Casein, Kollagen, Gelatine und deren Derivate und Abbauprodukte, sowie synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylsäuren oder dergleichen. Als zum Aufbau der Hülle zum vorstehend genannten Zweck besonders geeignete Polymere sind insbesondere Stärke, Stärkeabbauprodukte und -derivate, Dextrane, Dextrine, Serumalbumin und Polyvinylalkohol zu nennen.

Die Teilchengröße der magnetischen Partikel, die mittels dynamischer Lichtstreuung ermittelt werden kann, wird im Rahmen der Erfindung im Hinblick auf den gewünschten Zielort eingestellt. Es hat sich herausgestellt, dass ein ausgezeichneter Kompromiss erzielt werden kann zwischen der Vermeidung einer Tendenz zur Embolie, einer guten Gängigkeit durch das vaskuläre System in Verbindung mit einer ausgezeichneten Anreicherung und Verteilung am gewünschten Zielort unter gleichzeitiger ausreichender Orientierungs- und Manövrierfähigkeit durch das anzulegende Magnetfeld nach intraarterieller Applikation, wenn die Teilchengröße im Bereich von größer als 50 nm bis kleiner als 200 nm liegt. Die Einstellung der Teilchengröße erfolgt auf an sich bekannte Weise (siehe oben genannte Quellen), vornehmlich durch Einstellung geeigneter Herstellungsbedingungen der magnetischen Teilchen (Nanopartikel).

Es wurde nachgewiesen, dass durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise eine vollständige Remission des Tumors bereits nach der kurzen Dauer einer einmaligen Behandlung erzielt werden konnte. Als besonders vorteilhaft erwies es sich, dass lediglich ein untergeordneter Anteil, gewöhnlich bereits bei 10-50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis der jeweils eingesetzten therapeutischen Substanz, die vollständige Remission des Tumors ohne das Auftreten von Nebenwirkungen erreicht werden konnte. Eine 50%ige Reduktion des Tumorvolumens ergab sich im Mittel je nach Dosis nach 4 bis 6 Tagen (bei einer Dosis, die 20% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis entspricht, ergab sich eine 50%-Reduktion nach 3-12 Tagen (im Mittel 6 Tage); im Fall einer Dosis von 50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis ergab sich eine 50%-Reduktion nach 3-6 Tagen (Mittel: 4,2 Tage). Insbesondere aufgrund der Möglichkeit, mit dem erfindungsgemäßen Konzept die Dosis der therapeutischen Substanz deutlich zu verringern und ggf. lediglich eine einmalige Applikation anzuwenden, werden die üblicher Weise mit der systemischen Therapie einhergehenden Nebenwirkungen minimiert bzw. völlig unterdrückt. Keines der behandelten Individuen entwickelte Nebeneffekte, wie Haarschwund (Alopecia), Geschwüre (Ulcus) oder Muskelatrophie, und der Allgemeinzustand (Gewicht, Nahrungsaufnahme, Kot- und Urinausscheidungen, Aktivität) blieb während der gesamten 3-monatigen Beobachtungszeit im Vergleich zu den physiologischen Zuständen gesunder Individuen normal. Es wurden keine signifikanten Änderungen im Serumeisengehalt oder bei den Leukozyten-Werten gefunden. Demgegenüber waren die Werte und Ergebnisse in Vergleichs- und Kontrollgruppen wesentlich schlechter. Im Falle der Applikation der therapeutischen Substanz ohne magnetische Substanz konnte zwar eine Remission bei hohen Dosen (bei 100% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis nach 33 Tagen und bei 75% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis nach 36 Tagen) erreicht werden; jedoch entwickelte sich Haarschwund (Alopecia) nach 33 Tagen. Ferner zeigte sich eine blaugrüne Urin-Färbung; die Muskulatur wurde atrophisch, und der haarlose Bereich entwickelte Hautentzündung und Geschwürbildung. Eine Reduzierung der allein angewandten, therapeutischen Substanz auf 20 bzw. 50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis konnte keine Remission des Tumors herbeiführen, und Metastasen entwickelten sich im Mittel nach 48 Tagen. Die Nebenwirkungen waren in diesem Fall zwar geringer, jedoch ging die Behandlung mit Gewichtsverlust und einer Leukozytopenie einher. Die andere Vergleichsgruppe mit der magnetischen Substanz alleine (Ferrofluide) zeigte einen äußerst schlechten Krankheitsverlauf, bei dem das Tumorvolumen sich progressiv erhöhte, mit tastbaren, vergrößerten Lymphknoten (Metastasen) nach 45 Tagen. Der Vergleich mit einer intravenösen Applikation (20 bzw. 50% Dosis der therapeutischen Substanz) zeigte lediglich eine sehr geringe Tumorremission, wobei die Volumenreduktion des Tumors nicht statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe war. Bei diesen Untersuchungen waren die Vergleichsbedingungen jeweils identisch (d. h. identische magnetische Substanz (Stärke-umhüllte Eisenoxidteilchen; Teilchendurchmesser 100 nm); Anlegen eines inhomogenen Magnetfelds mit maximaler, magnetischer Flussdichte von z. B. 1,7 Tesla und einem entsprechenden Magnetfeldgradienten).

Nachfolgend wird die vorstehend genannte, erste Ausgestaltungsform der erfindungsgemäß eingesetzten, magnetischen Partikel näher beschrieben.

Bei dieser Ausgestaltung ergeben sich deutliche Vorteile, wenn die therapeutische Substanz über ionische Wechselwirkung an die oben beschriebene Polymerhülle reversibel gebunden ist, wobei in diesem Fall das auf den magnetischen Kernpartikeln aufgebrachte Polymer ionisch geladenen Gruppen trägt. Weil die therapeutischen Effekte besonders günstig beeinflusst werden können, ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass der Assoziationsgrad bei der reversiblen Bindung zwischen der therapeutischen Substanz und den ionisch geladenen Gruppen der Polymerhülle durch geeignete Umgebungsbedingungen eingestellt ist. Zu diesen geeigneten Bedingungen gehören insbesondere, jeweils einzeln oder kombiniert, die Temperatur, der pH-Wert und insbesondere die Osmolalität. Durch diese Faktoren kann in günstiger Weise eine sehr rasche Dissoziation der therapeutischen Substanz von den magnetischen Trägerpartikeln erreicht werden, mit der Folge, dass die therapeutische Substanz nach der Lokalisierung im Zielort, z. B. einem Tumor, sehr rasch frei agieren kann und zu einem therapeutisch sehr effizienten, sprunghaften Anstieg der aktiven Wirkstoffkonzentration führt. So kann beispielsweise nach der intraarteriellen Applikation und der direkt anschließenden Lokalisierung und Anreicherung mithilfe des am Zielort konzentrierten Magnetfelds zu einem Zeitpunkt, an dem die magnetischen Partikel am Zielort in ausreichendem Maße angereichert sind (etwa nach 30 Minuten bis zu wenigen Stunden), die physiologischen Umgebungsbedingungen so geändert werden, dass eine Dissoziation der ionischen Bindung der therapeutischen Substanz vom magnetischen Träger begünstigt wird. So kann z. B., je nach Art der ionischen Wechselwirkung, die gewünschte Dissoziation gefördert werden durch eine lokale Temperatur-Einrichtung oder durch die Zufuhr von physiologisch verträglichen, jedoch hinsichtlich der jeweiligen Faktoren wie pH und/oder Osmolalität entsprechend eingestellten Infusionslösungen, die vorzugsweise an derselben intraarteriellen Applikationsstelle zugeführt werden.

Je nach Art der einzusetzenden therapeutischen Substanz kann das Polymer der Hülle so mit ionisch geladenen Gruppen oder ionisierbaren Gruppen ausgestaltet oder modifiziert sein, dass die ionische Wechselwirkung in reversibler Weise stattfinden kann. Weist die therapeutische Substanz z. B. anionische Gruppen, wie z. B. Carboxylat-, Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat- oder ähnliche Gruppen auf, sollte das Hüllpolymer entsprechend positiv geladene oder ionisierbare Gruppen tragen, was z. B. durch das Vorliegen oder Einbauen von primären, sekundären oder tertiären Aminogruppen oder quaternären Ammoniumgruppen oder durch Iminogruppen realisierbar ist. Andererseits besteht die Möglichkeit, bei therapeutischen Substanzen, die positiv geladenen oder ionisierbaren Gruppen wie primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Ammoniumgruppen besitzen, die entsprechend umgekehrt geladenen oder ionisierbaren Gruppen, wie Carboxylat-, Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat- oder ähnliche Gruppen im Hüllpolymer vorzusehen oder einzubauen. Eine besonders günstige Kombination wird dann erreicht, wenn die Polymerhülle negativ geladene Phosphatgruppen trägt und die therapeutische Substanz über eine oder mehrere Amino- oder Ammoniumgruppen an die Phosphatgruppen reversibel gebunden sind, weil dann einerseits anfänglich bei der Bereitstellung der beladenen, magnetischen Partikel eine stabile Assoziation zwischen der Substanzkombination, andererseits aber eine rasche Dissoziation unter physiologischen Umgebungsbedingungen ermöglicht und gleichzeitig eine sehr gute Verträglichkeit und Übereinstimmung mit natürlichen Systemen realisiert wird. Als sehr geeignete Polymersubstanzen zur Beschichtung magnetischer Kerne haben sich mit Phosphatgruppen veresterte Stärkepolymere erwiesen.

Obgleich die Wahl der therapeutischen Substanz grundsätzlich keiner Einschränkung unterliegt, kommt das erfindungsgemäße Konzept am besten zum Tragen, wenn die therapeutische Substanz eine regionale bzw. lokale Wirkung entfalten soll. Besonders geeignete therapeutische Substanzen schließen ein: niedermolekulare, synthetische oder natürliche bzw. semisynthetische Arzneimittel, Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper und gentechnologisch erzeugte, vorzugsweise humane oder teils humane Antikörper, ferner Peptide, Angiogenesefaktoren, Hormone, Lymphokine und Cytokine, Lektine sowie Oligonukleotide und DNAs wie z. B. Antisense- Oligonukleotide oder gentherapeutisch einzusetzende DNA- Substanzen, die jeweils als isolierte DNA, in Form von Plasmiden oder Vektoren oder in geeigneten Carrier-Systemen eingeschlossenen Formen vorliegen können. Ein besonders nützliches Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung ist die regionale Therapie gegen Tumoren, aber auch die Behandlung lokaler Entzündungen, lokaler Arteriosklerose, lokaler Infektionen, insbesondere Pilzinfektionen, und dergleichen. Neben einem gentherapeutischen Ansatz kommen hier als therapeutische Substanzen insbesondere Antitumoragentien, vor allem Cytostatika sowie solche Substanzen in Betracht, die energiereiche Strahlung aussenden oder durch Aktivierung aussenden können. Als sehr gut geeignetes Cytostatikum ist z. B. Mitoxantron zu nennen, welches stabil, jedoch günstig reversibel dissoziierbar an magnetische Teilchen gebunden werden kann. Der Aufbau eines solchen magnetischen Partikels ist in Fig. 4 beispielhaft bei mit Phosphatgruppen modifizierten, magnetischen Nanopartikeln gezeigt.

Die als Emittent energiereicher Strahlung zum Einsatz kommende, therapeutische Substanz kann generell ein biologisch wirksamer Strahler sein und ist vorzugsweise ein α- und/oder ein γ-Strahler oder eine solche Substanz, die durch Aktivierung, z. B. durch eine Neutronenquelle, in einen α- und/oder γ-Strahler umgewandelt bzw. überführt werden kann. Als sehr Erfolg versprechende, therapeutische Substanzen sind in diesem Zusammenhang Bor oder Borverbindungen zu nennen, die mittels Neutronenaktivierung in einen α-Strahler verwandelt werden können. Der Einsatz von Bor oder Borverbindungen lässt sich auf hervorragende Weise mit dem erfindungsgemäßen, magnetischen Trägersystem verwirklichen, wie nachfolgend näher beschrieben wird, und die dadurch ermöglichte Strahlentherapie ist einerseits sehr zielgerichtet als lokale Therapie realisierbar und bietet sich daher als nebenwirkungsarme Therapieform an.

Bei dieser Ausführungsform braucht die therapeutische Substanz nicht an der Oberfläche der magnetischen Teilchen reversibel assoziiert sein, wie dies oben im Rahmen der ersten Ausgestaltung der magnetischen Partikel für die Erfindung beschrieben wurde. Beim Einsatz einer eine energiereiche Strahlung emittierenden oder einer hierzu aktivierbaren, therapeutischen Substanz ist es bevorzugt, dass die Substanz direkt im magnetischen Kern der Partikel integriert ist, oder dass der magnetische Kern mit der therapeutischen Substanz beschichtet ist. Dies kann ohne weiteres zum Beispiel realisiert werden, indem im ersten Fall geeignete, magnetische Eisen-Substanz-Legierungen oder -Verbindungen unter Bildung einer festen chemischen Verbindung zwischen der magnetischen Substanz und der therapeutischen Substanz bereitgestellt werden, wobei die Bezeichnung "Substanz" das zur Emission energiereicher Strahlung befähigte oder aktivierbare Element einschließt, z. B. magnetische Eisenbor-Legierungen, Eisenboride, Eisenborate oder magnetische, gemischte Oxide oder Mischoxide wie Borferrite, Bormagnetite, oder indem im zweiten Fall magnetische Teilchen aus z. B. Ferriten, Magnetiten oder ähnlichen Doppeloxiden beschichtet werden mit dem Metall, dem Metalloxid oder einer anderen Verbindung des Elementes, welches zur Emission intensiver Strahlung befähigt ist oder aktiviert werden kann, z. B. mit Boroxid, Borsäure, Borationen oder Borsäureester. In den vorstehend genannten Legierungs- und Verbindungsbeispielen können wahlweise alternative oder weitere, ggf. die Magnetisierung, die Materialbeschaffenheit oder die Herstellung günstig beeinflussende Elemente in chemischer Verbindung vorliegen, z. B. Nickel, Kobalt, Seltenerdelemente, Silizium und/oder Kohlenstoff.

Ansonsten gelten die obigen allgemeinen Beschreibungen zur ersten Ausführungsform der magnetischen Teilchen hier entsprechend, insbesondere in Bezug auf die vorgesehene Umhüllung mit geeigneten Polymeren, die bevorzugt eingestellte Teilchengröße der magnetischen Partikel sowie dem Einsatz einer bevorzugten, gegenüber der herkömmlich angewandten Strahlendosis verminderten Dosis, die über die erfindungsgemäße, gezielt regionale Therapie realisierbar ist.

Die zur Therapieunterstützung einsetzbare Magnetfeldeinrichtung sollte ein inhomogenes Magnetfeld erzeugen. Zur günstigen Zielorientierung der magnetischen Partikel sind insbesondere stark inhomogene Magnetfelder erzeugende Elektromagnete mit einem Maximum bis 2,5 Tesla, vorzugsweise bis 2,0 Tesla, insbesondere im Bereich von über 1,0 Tesla bis 1,8 Tesla geeignet, wobei sich ausgehend vom festgelegten Maximum ein entsprechend starker Magnetflussgradient einstellt. Solche starken Magnetfelder sind in Kombination mit den oben beschriebenen magnetischen Partikeln sehr effizient. Dabei sollte sich das zuvor genannte Maximum vorzugsweise in einer Entfernung bis 20 mm, weiter bevorzugt bis 15 mm vom Polschuh des Elektromagneten einstellen. Bei einer solchen Ausgestaltung ergeben sich besonders günstige Magnetfluss- und Orientierungsbedingungen und insbesondere entsprechend günstige Gradienten, die die Anreicherung der magnetischen Partikel im gewünschten Zielorgan oder -gewebe unterstützen. Um die magnetischen Partikel effizienter in tieferen Körperbereichen, z. B. beim Pankreas-Karzinom, zu fokussieren, können auch rotierende Magnetfelder in vorteilhafter Weise zum Einsatz kommen.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, die jedoch nicht einschränkend aufzufassen sind, näher erläutert:

Die im Rahmen der Beispiele und Vergleichsbeispiele zum Einsatz kommenden magnetischen Partikel (magnetische Nanopartikel für flüssige Zusammensetzungen/Ferrofluide [FF]) wurden gemäß DE-A-196 24 426 hergestellt (erhältlich von chemicell, Berlin, Deutschland). Sie bestehen aus einer kolloidalen Dispersion von magnetischen Partikeln, die durch nasschemische Verfahren aus Eisenoxiden und -hydroxiden unter Erzeugung von speziellen Multidomänen-Teilchen erhältlich sind. Die Teilchen waren von mit Phosphatgruppen modifizierten Stärkepolymeren umhüllt, um diese unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu stabilisieren und eine ionischen Beindung an die therapeutische Substanz zu ermöglichen. Als therapeutische Substanz kam das Cytostatikum Mitoxantron zum Einsatz, welches kationische bzw. positiv ionisierbare Gruppen trägt und in der Lage ist, an die mit veresterten Phosphatgruppen modifizierten Stärkepolymere der Umhüllung der Magnetitpartikel unter Ausbildung reversibler ionischer Wechselwirkungen reversibel zu binden.

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Charakteristiken der verwendeten, beispielhaften Ferrofluide. Tabelle 1



Die als repräsentatives Beispiel zum Einsatz kommende Kombination zwischen Mitoxantron und Phosphatgruppen- tragenden magnetischen Teilchen ist in Fig. 4 schematisch dargestellt, wobei die relevanten, chemischen Strukturen der therapeutischen Substanz sowie der Phosphatgruppen in der Abbildung in Einzelteile aufgelöst und vergrößert dargestellt sind. Die positiv geladenen NH+-Gruppen der Hydrochloridformen des Mitoxantrons (MTX-HCl) sind bei einem in der Zusammensetzung eingestellten pH von 7,4 mit den Phosphatgruppen des Stärkederivats assoziiert. Die beladenen Ferrofluide enthielten 6,5 mg Mitoxantron pro 10 ml der flüssigen Zusammensetzung. Da die Bindung der therapeutischen Substanz über die ionische Wechselwirkung reversibel war, konnte die Dissoziation mittels geeigneter Faktoren der physiologischen Umgebungsbedingungen wie pH, Osmolalität und Temperatur über die Veränderung der Blutelektrolyt-Konzentration gemäß den spezifischen Erfordernissen und der gewünschten Dissoziation eingestellt werden. In den nachfolgend beschriebenen Versuchen dissoziierte die therapeutische Substanz nahezu vollständig nach 60 Minuten.

Die Wirksamkeitstests wurden an einem aussagekräftigen Tiermodell durchgeführt, und zwar beim in Kaninchen etablierten VX-2-Schuppenzellkarzinom (A. Hough et al., Am. J. Pathol., 87, S. 537 (1977); C. S. Galasko und D. S. Muckle, Br. J. Cancer, 29, S. 59 (1974)). Nach Implantation in Weichgewebe vergrößert sich der Tumor rasch mit zunehmender Vaskularität in dessen Umgebung. Die Tiere entwickeln bald (innerhalb 2-3 Wochen) eine zentrale Tumornekrose, lokoregionale Lymphknotenmetastasen und hämatogene Metastasen in den Lungen. Zur Übertragung des Tumors wurden Fragmente von vitalem VX-2- Gewebe mit 1 mm Größe aus der Tumorperipherie von Donortieren entnommen, in ein spezielles Medium (RPMI 1640, 2,0 g/l NaHCO3, L-Glutamin) überführt und unmittelbar unter sterilen Bedingungen in den hinteren Gliedmaßen von anästhesierten Empfängerkaninchen (Gesamtanzahl n = 26) im Zufuhrbereich der femoralen Arterie implantiert. Die Chemotherapie wurde begonnen, wenn die Tumoren ein Volumen von etwa 3500 mm3 erreichten. Zur Chemotherapie wurden die Tiere mit einer intramuskulären Injektion von 35 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg/kg Körpergewicht Xylazin anästhesiert, dann wurde die Oberschenkel-bezügliche Arterie kanülisiert, und ein Verweilkatheter (0,8 mm Durchmesser) wurde nach Abtrennung der Oberschenkel-bezüglichen Vene vom saphenischen Nerv etwa 2 cm distal von der Leisten-bezüglichen Furche eingebracht. Die Mitoxantron-gebundenen Ferrofluide (FF-MTX) in unterschiedlicher Dosis, Mitoxantron allein (MTX) oder Ferrofluide allein (FF) wurden mittels Perfusion über einen Zeitraum von 10 min verabreicht. Ferner wurden zum Vergleich Mitoxantron- gebundene Ferrofluide in verschiedenen Dosen intravenös verabreicht. In einer Kontrollgruppe wurde keine therapeutische Substanz angewandt.

Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt einen Überblick über das experimentelle Protokoll. "n" bezeichnet die Anzahl der jeweils pro Gruppe untersuchten Tumor-tragenden Tiere. Die Spalte "Dosis" gibt an, welcher Anteil an therapeutischer Substanz gegenüber der normalen systemischen Mitoxantron- Dosis (10 mg/m2) durch einmalige Applikation verabreicht wurde. Die intraarterielle Applikation erfolgte über die femorale Arterie, die intravenöse Applikation erfolgte über die Ohrvene. Das externe magnetische Feld wurde über dem Tumor konzentriert. Tabelle 2



Zur Erzeugung eines inhomogenen, externen Magnetfelds wurde ein Elektromagnet mit einer magnetischen Flussdichte im Maximum von 1,7 Tesla eingesetzt. Die magnetische Flussdichte wurde auf die Tumorregion fokussiert mit einem speziell adaptierten Polschuh, welcher in Kontakt mit der Oberfläche des Tumors gebracht wurde. Dabei betrug die magnetische Flussdichte im Bereich der Tumoroberfläche etwa 1,7 Tesla und etwa 10 mm unterhalb der Spitze des Polschuhs ungefähr 1,0 Tesla. Das Magnetfeld wurde über dem Tumor während der oben beschriebenen Applikation der Infusionslösung konzentriert und für insgesamt 60 min angelegt.

Zur Blutuntersuchung wurden Blutproben mittels Venenpunktur einmal wöchentlich entnommen und bei 2000 × g innerhalb von zwei Stunden zentrifugiert. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurden Messungen verschiedener Parameter der Klinischen Chemie (Eisen, Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, γ-Glutamyltransferase, Alkalische Phosphatase und Laktatdehydrogenase) sowie von Blutzahl-Parametern (Zellwerte von Gesamtblut und differentiellem Blut) durchgeführt.

Die statistische Auswertung verlief folgendermaßen:

Das Tumorvolumen wurde unter Verwendung der Formel für elliptische Massen (1/6 πa2b; a = Weite der Horizontalachse, b = Länge der Vertikalachse) berechnet. Volumenänderungen wurden als Prozentwerte in Bezug auf 100% Tumorvolumen zu Beginn der Behandlung ausgedrückt. Statistische Analysen der relativen Tumorvolumina wurden unter Verwendung des Einmalproben-t-Tests (mit einem konservativen, festen Wert von 100% für die Kontrollgruppe) sowie einem t-Test für zwei unabhängige Proben (Welch-Test) durchgeführt. Für Blutparameter (Absolutwerte) wurden der t-Test für zwei unabhängige Proben angewandt. Die resultierenden, zweiseitigen p-Werte wurden als signifikant angesehen bei einem Wert von 0,05 oder darunter. Das Ergebnis war signifikant bei Werten von 0,01 bis 0,05 und hochsignifikant bei Werten unter 0,01. Die p- Werte wurden unter Verwendung der "Statistical Package for Social Sciences" (SPSS), Version 9,0, auf einer Microsoft- Excel-Version 97 berechnet.

Die Ergebnisse für die in der obigen Tabelle 2 dargestellten Gruppen sind in den jeweiligen Fig. 5A bis 5G grafisch dargestellt, wobei die Entwicklung des mittleren Tumorvolumens (mit den jeweils als Balken dargestellten, maximalen und minimalen Werten) gegen dem zeitlichen Verlauf aufgetragen ist. Die Bezeichnung "Metastasen" bedeutet den Beginn der Metastasenbildung. Entsprechend bedeutet "Alopezie" den Beginn des festgestellten Haarschwunds. "Behandlung" zeigt die anfängliche, einmalige Behandlung an.

Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Gruppen 1a und 1b mit der intraarteriellen Applikation einer im Vergleich zur herkömmlich systemisch angewandten Dosis lediglich 20%-igen bzw. 50%-igen Dosis an Cytostatikum (Mitoxantron), die auf magnetischen Teilchenträgern mittels ionischer Wechselwirkung reversibel gebunden waren, zeigen eine hoch signifikante Reduktion des Tumorvolumens bereits nach wenigen Tagen (vgl. Fig. 5A und 5B). Es wurden weder Metastasenbildungen noch Alopezie-Erscheinungen beobachtet. Demgegenüber war eine intraarterielle Gabe von Mitoxantron alleine mit schlechten Resultaten verbunden, da eine gegenüber systemischen Dosen verminderte Dosis (20 bzw. 50%) zu keiner Tumor-Remission, aber zur Metastasenbildung führte, während höhere Dosen (75 bzw. 100%) zwar eine Reduzierung des Tumorvolumens herbeiführte, jedoch im zeitlichen Verlauf wesentlich später einsetzte und zur Alopezie führte. (s. Fig. 5C) Ferrofluide alleine zeigten praktisch keine therapeutischen Wirkungen. Die entsprechende Fig. 5D zeigt eine progressive Vergrößerung des Tumorvolumens mit tastbaren, vergrößerten Lymphknoten in der Leistengegend (Metastasen). Ferner zeigte der Vergleich mit der intravenösen Applikation (Gruppen 4a und 4b, Fig. 5E und 5F) keine statistisch signifikanten Tumor- Remissionen im Vergleich zur erfindungsgemäßen intraarteriellen Applikation. Fig. 5G zeigt in Bezug auf die Vergleichsgruppe 5 die Bedeutung der Unterstützung durch ein magnetisches Feld, in dem wie in den erfindungsgemäßen Gruppen 1a und 1b, jedoch ohne Anlegen des externen Magnetfeldes verfahren wurde. Zwar konnte ein weiteres Tumorwachstum und die Metastasenbildung verhindert werden, jedoch wurde keine Remission des Tumors beobachtet. Zum Zeitpunkt der Behandlung zeigten weniger als 5% der Tiere eine geringe nekrotische Fraktion im Bereich des Tumors.

Die Resultate zu den lokalen und systemischen Nebeneffekten sind in den Fig. 6A und 6B zusammengefasst. Bei der Kontrollgruppe 6 verschlechterte sich im Beobachtungszeitraum der allgemeine Zustand. Die tumorerkrankten Tiere entwickelten Pneumonien, was die in den Fig. 6A und 6B bzgl. der Kontrollgruppe zu beobachtende Erhöhung der Leukozytenzahl erklärt. Demgegenüber zeigten sich keine signifikanten Änderungen bei den Leukozyten-Werten in den erfindungsgemäßen Gruppen 1a und 1b (s. Fig. 6A und 6B). Auch die übrigen untersuchten Parameter blieben im Beobachtungszeitraum von drei Monaten normal. Die Fig. 7A zeigt anschaulich die auch nach außen sichtbare, normale Erscheinung der Hinterläufe nach der Tumorbehandlung der erfindungsgemäßen Gruppe. Bei den Vergleichsgruppen wurden teils starke Nebenwirkungen beobachtet, etwa den oben bereits erwähnten Alopezie- Erscheinungen, Entfärbung des Urins, Entzündungserscheinungen, Geschwürbildung und Gewichtsverlust. Im Gegensatz zur äußerlich normalen Erscheinung in der erfindungsgemäßen Gruppe (vgl. Fig. 7A) sind die starken Nebenwirkungen einer intraarteriellen Applikation mit dem Cytostatikum alleine (Vergleichsgruppe 2) deutlich in Fig. 7B zu sehen.

Zur histologischen Beurteilung und zur Magnetresonanz- Darstellung (vgl. die jeweiligen Fig. 3 und 1) wurden unmittelbar nach der einmaligen Applikation von 50% FF-MTX in die femorale Arterie und dem Anlegen des magnetischen Felds für 60 min der Tumor entfernt und in 3,7%-igem Formalin fixiert. 5 µm dicke Paraffin-Schnitte des Tumors wurden geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin angefärbt. Die histologische Anfärbung führte zu den in den Fig. 2 und 3A bis 3C dargestellten histologischen Befunden.

Daneben wurden nach einer entsprechenden Applikation und 6 h nach Anlegen des externen magnetischen Feldes eine Magnetresonanz-Bildanalyse an vier Tumor-tragenden Tieren durchgeführt. Die Bilddarstellungen wurden bei 1,5 Tesla mittels eines klinischen Magnetresonanz-Scanners (ACS-NT; Philips) ausgeführt. Eine Fett unterdrückende, T1-gewichtete Turbospin- Echosequenz wurde zur Bilddarstellung (TR 535, TE 20, Echozugklänge 5) verwendet. Dies führte zu den in Fig. 1A und 1B gezeigten Magnetresonanz-Bilddarstellungen.


Anspruch[de]
  1. 1. Magnetische Partikel, die eine magnetische Substanz in Kombination mit einer therapeutischen Substanz umfassen, zur Magnetfeld-unterstützten, regionalen Therapie von Krankheiten mittels intraarterieller Applikation, wobei die Teilchengröße der magnetischen Partikel größer als 50 nm und kleiner als 200 nm beträgt, und dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Kern, in dem die magnetische Substanz vorliegt, sowie eine Hülle aus einem Polymer umfassen.
  2. 2. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz in einer Dosis vorliegt, berechnet auf Basis der partikelgebundenen Menge, die 10 bis 50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis entspricht.
  3. 3. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz über ionische Wechselwirkung an die Polymerhülle reversibel gebunden ist, die ionisch geladene Gruppen trägt.
  4. 4. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerhülle negativ geladene Phosphatgruppen trägt und dass die therapeutische Substanz über eine oder mehrere Amino- oder Ammoniumgruppen an die Phosphatgruppen reversibel gebunden ist.
  5. 5. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerhülle aus mit Phosphatgruppen veresterten Stärkepolymeren gebildet ist.
  6. 6. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Assoziationsgrad der reversiblen Bindung zwischen der therapeutischen Substanz und den ionisch geladenen Gruppen der Polymerhülle durch Bedingungen der Temperatur, des pH-Werts und/oder der Osmolalität eingestellt ist.
  7. 7. Magnetische Partikel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche mit einem Cytostatikum als therapeutischer Substanz.
  8. 8. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytostatikum Mitoxantron ist.
  9. 9. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer DNA-Substanz als therapeutischer Substanz.
  10. 10. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz ein biologisch wirksamer Strahler ist oder durch Aktivierung in einen biologisch wirksamen Strahler umgewandelt werden kann.
  11. 11. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz ein α- und/oder ein γ-Strahler ist oder durch Aktivierung in einen α- und/oder einen γ-Strahler umgewandelt werden kann.
  12. 12. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz Bor oder eine Borverbindung ist, die mittels Neutronenaktivierung in einen α-Strahler umgewandelt werden kann.
  13. 13. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz im magnetischen Kern der Partikel integriert ist, oder dass der magnetische Kern mit der therapeutischen Substanz beschichtet ist.
  14. 14. Magnetische Partikel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Therapie unterstützt wird von einem inhomogenen Magnetfeld mit einem Maximum von über 1,0 Tesla bis 2,0 Tesla.
  15. 15. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel in einer zur Infusion oder Perfusion ausgestalteten Flüssigkeit vorliegen.
  16. 16. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur regionalen Therapie gegen Tumoren.
  17. 17. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur regionalen Therapie gegen lokale Infektionen.
  18. 18. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur regionalen Therapie gegen lokale Entzündungen.






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