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Dokumentenidentifikation DE69721292T2 13.11.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0938582
Titel ENZYMATISCHES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ASCORBINSÄURE,2-KETO-L-GULONSÄURE UND 2-KETO-L-GULONSÄURE-ESTERN
Anmelder Eastman Chemical Co., Kingsport, Tenn., US
Erfinder HUBBS, Clark, John, Kingsport, US
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69721292
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.05.1997
EP-Aktenzeichen 979256906
WO-Anmeldetag 16.05.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/08668
WO-Veröffentlichungsnummer 0097043433
WO-Veröffentlichungsdatum 20.11.1997
EP-Offenlegungsdatum 01.09.1999
EP date of grant 23.04.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.11.2003
IPC-Hauptklasse C12P 17/04
IPC-Nebenklasse C12P 7/60   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure, 2-Keto-L-gulonsäure (KLG) und Estern von KLG. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Enzymkatalysatoren bei der Herstellung von Ascorbinsäure, KLG oder Estern von KLG.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ascorbinsäure, auch als Vitamin C bekannt, ist ein Nahrungsmittelfaktor, der in der menschlichen Nahrung vorhanden sein muß, um Skorbut zu verhindern, und der als ein Mittel identifiziert worden ist, welches die Resistenz gegen Infektionen erhöht. Ascorbinsäure wird kommerziell zum Beispiel als Nahrungsergänzung, Farbfixiermittel, Geschmacks- und Konservierungsmittel in Fleisch und anderen Nahrungsmitteln, Oxidans in Brotteigen, bei der Abschnürung von Zitrusfrüchten bei der Ernte und als Reduktionsmittel in der analytischen Chemie verwendet.

Ein derzeitiges Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure verwendet eine Abwandlung der ursprünglichen Reichstein-Grossner-Synthese (Reichstein et al., Helv. Chim. Acta, 17: 311 (1934); US- Patent Nr. 2,301,811 an Reichstein). In diesem Verfahren wird eine Glucosequelle in Ascorbinsäure umgewandelt. Während der Umwandlung wird ein Zwischenprodukt, ein KLG-Diacetonid, erzeugt.

Die EP-A-0 292 303 betrifft einen Mikroorganismus, in den so genetisches Material übertragen worden ist, daß die Übertragung die Zelle in die Lage versetzt, die Umwandlung von Glucose oder eines anderen gewöhnlichen Metaboliten in 2-Keto-L-gulonsäure zu bewirken. Dieses Dokument offenbart, daß ein Expressionsvektor, der für eines oder mehrere der Enzyme D-Glucosedehydrogenase, G- Gluconatdehydrogenase, 2-Keto-D-gluconatdehydrogenase oder 2,5-DKG-Reduktase codiert, in die Bakterienzelle überführt wird.

Die EP-A-0 401 704 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines organischen Esters von Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure durch Umsetzung von Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure mit einer organischen Säure oder einem Ester derselben in einem organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer Esterhydrolase.

Die EP-A-0 207 763 offenbart die Produktion von Ascorbinsäure unter Verwendung von Chlorella als Mikroorganismus-Quelle und Züchten der Kultur unter einem gesteuerten Muster der Kohlenstoffquellen-Versorgung, wie Glucose.

Die WO-A-8 501 745 bezieht sich auf ein Verfahren zur Bioumwandlungsproduktion von L- Ascorbinsäure unter Verwendung von Mikroorganismen (zum Beispiel Candida Norvegensis oder Candida Utilis). Die Bioumwandlungsmedien und Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen oder des Enzyms L-Galactono-1,4-oxidase auf einer Matrix sind ebenfalls offenbart.

Es existieren mehrere zweistufige Verfahren für die Herstellung von Ascorbinsäure. In der ersten Stufe wird Glucose über Fermentationsprozesse entweder in ein isoliertes Zwischenprodukt, KLG, (Sonoyama et al., Applied and Envtl. Microbiology, 43: 1064-1069 (1982); Anderson et al., Science, 230: 144-149 (1985); Shinjoh et al., Applied and Faul. Microbiology, 61: 413-420 (1995)) oder in das Zwischenprodukt der Reichstein-Grossner-Synthese, das Diacetonid von KLG, umgewandelt.

Die zweite Stufe, welche beide Zwischenprodukte in Ascorbinsäure umwandelt, findet über einen von zwei mitgeteilten Wegen statt. Der erste Weg, eine Abwandlung der letzten Schritte der Reichstein- Grossner-Synthese, erfordert eine Mehrheit von Schritten, in denen das Zwischenprodukt unter stark sauren Bedingungen mit Methanol verestert wird, um Methyl-2-keto-L-gulonat (MeKLG) zu erzeugen. Das MeKLG wird dann mit Base umgesetzt, um ein Metallascorbat-Salz zu erzeugen. Schließlich wird das Metallascorbat-Salz mit einem Säuerungsmittel behandelt, um Ascorbinsäure zu erhalten. Der zweite Weg ist ein Einstufenverfahren, das die Säure-katalysierte Cyclisierung von KLG umfaßt, wie ursprünglich im GB-Patent Nr. 466548 an Reichstein offenbart und später von Yamazaki (Yamazaki, J. Agri. Chem. Soc. Japan, 28890-894 (1954) und Chem. Abs., 50: 5992d) und wiederum von Yodice (WO 87/00839) modifiziert. Das Yodice-Verfahren ist kommerziell unerwünscht, da es große Menge an gasförmigem Chlorwasserstoff verwendet, was eine sehr teuere Verfahrensausrüstung erfordert und ein Ascorbinsäure- Produkt erzeugt, das eine ausgiebige Reinigung erfordert.

Lipasen, eine Gruppe von Hydrolaseenzymen, sind mit einigem Erfolg bei der Synthese von Estern von organischen Säuren verwendet worden. Insbesondere sind Lipasen bei der Umesterung von Alkoholen verwendet worden, bei denen das Veresterungsmittel irreversibel ist, wie beispielsweise, wenn Vinylacetat als Veresterungsmittel verwendet wird (Thiel, Catalysis Today, 517-536 (1994)). Gutman et al. Tetrahedron Lett., 28: 3861-3864 (1987) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von einfachen 5- gliedrigen Ringlactonen aus gamma-Hydroxymethylestern unter Verwendung von Schweinepankreas- Lipase als Katalysator. Jedoch berichteten Gutman et al., Tetrahedron Lett., 28: 5367-5368 (1987) später, daß der Einsatz von delta-Hydroxymethylestern anstelle von gamma-Hydroxymethylestern und die Verwendung des gleichen Katalysators lediglich Polymere erzeugte. In der EP 0 515 694 A1 an Sakashita et al. umfaßt eine Synthese von Estern von Ascorbinsäure, die an der primären Hydroxylgruppe acyliert sind, die Umsetzung von Ascorbinsäure mit einer Vielfalt von aktiven Fettsäureestern (das heißt Fettsäurevinylestern) in einem polaren organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer Lipase.

Deshalb gibt es einen Bedarf in der Technik an Verfahren zur Herstellung (a) von Ascorbinsäure oder deren Metallsalzen aus KLG oder Estern von KLG, (b) von KLG aus Estern von KLG und (c) von Estern von KLG aus KLG, die eine hohe Ausbeute und hohe Reinheit mit wenig oder keiner Nebenproduktbildung liefern und unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung hauptsächlich auf die Bereitstellung derselben gerichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung offenbart einen Fortschritt auf dem chemischen und biologischen Gebiet, in dem ein Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure das Kontaktieren von KLG oder eines Esters von KLG mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator umfaßt.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von KLG das Kontaktieren eines Esters von KLG mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator in wäßriger Lösung.

In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von KLG-Estern aus KLG das Kontaktieren einer alkoholischen Lösung von KLG mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator. Die alkoholische Lösung enthält einen Alkohol, der einer Alkyl-Einheit des herzustellenden Esters von KLG entspricht.

In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von KLG-Estern aus KLG-Estern das Kontaktieren einer alkoholischen Lösung eines ersten Esters von KLG mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator. Die alkoholische Lösung enthält einen Alkohol, welcher der Alkyl-Einheit eines herzustellenden zweiten Esters von KLG entspricht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf die unerwartete Entdeckung gerichtet, daß Ascorbinsäure aus KLG oder bevorzugter Estern von KLG gebildet werden kann, indem man den Ringschluß von KLG oder KLG-Estern unter Verwendung eines Hydrolase-Enzyms als Katalysator induziert. Das Verfahren zur Herstellung der Ascorbinsäure kann in der Schmelze oder in Lösung durchgeführt werden. Das Verfahren kann auch in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Bei in-vivo-Verfahren kann der Hydrolase- Enzymkatalysator natürlich innerhalb einer Wirtszelle vorkommen oder kann durch rekombinante DNA- Verfahren in eine Wirtszelle oder einen Organismus eingeführt werden.

Die vorliegende Erfindung ist auch auf die unerwartete Entdeckung gerichtet, daß KLG in einer reversiblen Reaktion durch Umsetzung eines KLG-Esters in einer wäßrigen Lösung unter Verwendung eines Hydrolase-Enzyms als Katalysator hergestellt werden kann. Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auf die unerwartete Entdeckung gerichtet, daß ein KLG-Ester hergestellt werden kann, indem man KLG oder einen anderen KLG-Ester in einer alkoholischen Lösung unter Verwendung eines Hydrolase- Enzyms als Katalysator umsetzt. Der Alkohol, der verwendet wird, um die Lösung herzustellen, entspricht der Alkyl-Einheit des herzustellenden KLG-Esters.

Die Hydrolase-Enzyme zur Verwendung als Katalysatoren in den Verfahren der vorliegenden Erfindung können aus irgendeinem geeigneten Quellenorganismus abgeleitet oder isoliert sein. Beispiele dafür umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zusein, Pflanzen, Mikroorganismen und Tiere, wie Hefe, Bakterien, Schimmel, Pilz, Vögel, Reptilien, Fische und Säuger. Hydrolase-Enzyme für die Zwecke dieser Erfindung sind allgemein durch die Enzymklasse E.C.3.-.-.- definiert, wie in Enzyme Nomenclature (Academic Press, 1992) definiert, und sind im Handel erhältlich.

Bevorzugte Hydrolase-Enzyme sind diejenigen, welche die Hydrolyse von Molekülen bewirken können, die Carbonyl- oder Phosphat-Gruppen enthalten. Spezieller sind die bevorzugten Hydrolasen in der Lage, die Hydrolyse bei einem Carbonyl-Kohlenstoff, der eine Heteroatom-Einfachbindung trägt, zu bewirken. Beispiele für derartige Carbonyl-Kohlenstoffe, die eine Heteroatom-Einfachbindung tragen, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Ester, Thioester, Amide, Säuren, Säurehalogenide und dergleichen. Die bevorzugten Hydolasen umfassen die Enzymklasse E. C.3.1.-.-, welche Hydrolasen einschließt, die auf Ester-Bindungen einwirken, wie Esterasen und Lipasen; die Enzymklasse E. C.3.2.-.-, welche Glycosidasen einschließt; die Enzymklasse E. C.3.4.-.-., welche Peptid-Hydrolasen, wie Proteasen einschließt; und die Enzymklasse E. C.3.5.-.-, welche Amidasen einschließt, die auf Bindungen, die von Peptid-Bindungen verschieden sind, einwirken. Die bevorzugtesten Hydrolasen umfassen Proteasen, Amidasen, Lipasen und Esterasen.

Bevorzugtere Hydrolasen enthalten einen Wirkstellen-Serinrest, der in der Lage ist, eine Veresterung oder Umesterung mit KLG oder KLG-Estern einzugehen. Noch bevorzugter sind diejenigen Hydrolasen, welche die katalytische Triade Serin, Histidin und Asparaginsäure enthalten.

Bevorzugte Proteasen schließen diejenigen ein, die von Bakterien der Gattungen Bacillus oder Aspergillus abstammen. Besonders bevorzugte Proteasen sind diejenigen, die von den Bakterien Bacillus licheniformis erhalten werden. Bevorzugte Proteasen sind diejenigen, die eine mindestens 70%-ige Sequenzhomologie zu Subtilisin enthalten. Proteasen mit Sequenzhomologie zu Subtilisin werden in der Detergens Industrie verwendet und sind deshalb leicht verfügbar. Bevorzugter sind Proteasen mit mindestens 80%-iger Sequenzhomologie zu Subtilisin, noch bevorzugter sind Proteasen mit mindestens 90%-iger Sequenzhomologie zu Subtilisin und insbesondere Proteasen mit mindestens 95%-iger Sequenzhomologie zu Subtilisin. Eine hochbevorzugte Protease ist Subtilisin selbst mit einer Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 1), die von Smith et al., J. BioL Chem. 243: 2184-2191 (1968) beschrieben wurde und nachstehend angegeben ist:

Für die Bequemlichkeit des Lesers gibt Tabelle 1 eine Zusammenfassung der oben und im Rest der Beschreibung verwendeten Aminosäuren-Kurzschrift an.

Tabelle 1

Auch Proteasen, die einer bis sechs ortsspezifischen Mutationen, Sequenzadditionen und Sequenzdeletionen der oben angegebenen Sequenz entsprechen, können verwendet werden. Noch bevorzugter sind Proteasen, die null bis zwei ortsspezifischen Mutationen der oben angegebenen Subtilisin-Sequenz entsprechen.

Esterasen, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, umfassen diejenigen, die aus Schweineleberextrakt erhalten werden. Bevorzugte Esterasen sind diejenigen mit mindestens 70%-iger Sequenzhomologie zu Schweineleber-Esterase mit einer Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2), die in Matsushima et al., FEBS Lett, 293:27 (1991) beschrieben wurde und nachstehend angegeben ist:

Esterasen weisen bevorzugter eine mindestens 80%-ige Sequenzhomologie zu der Sequenz der oben angegebenen Schweineleber-Estetase, noch bevorzugter eine mindestens 90%-ige Sequenzhomologie, insbesondere bevorzugt eine mindestens 95%-ige Sequenzhomologie auf. Hoch bevorzugt ist die Schweineleber-Esterase mit der oben angegebenen Sequenz.

Ebenfalls können Esterasen, die einer bis sechs ortsspezifischen Mutationen, Sequenzadditionen und Sequenzdeletionen der oben angegebenen Sequenz entsprechen, verwendet werden. Noch bevorzugter sind Esterasen, die null bis zwei ortsspezifischen Mutationen der oben angegebenen Schweineleber-Esterasesequenz entsprechen.

Bevorzugte Lipasen schließen diejenigen ein, die aus Schweinen und anderen Säugern, Mikroorganismen und Pflanzen isoliert werden. Dies umfaßt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Lipasen, die von den Gattungen Aspergillus, Mucor, Candida, Pseudomonas, Humicola, Rhizopus, Chromobacterium, Alcaligenes, Geotricum und Penicillium erhalten werden. Bevorzugte Lipasen schließen auch extrazelluläre Lipasen, wie Cutinasen, ein. Bevorzugtere Lipasen weisen eine mindestens 70%-ige Sequenzhomologie zu Candida Antertica Typ B-Lipase, noch bevorzugter eine mindestens 80%-ige Sequenzhomologie, noch bevorzugter eine mindestens 90%-ige Sequenzhomologie und sogar noch bevorzugter eine mindestens 95%-ige Sequenzhomologie auf. Eine hochbevorzugte Lipase ist die Candida Antartica Typ B-Lipase selbst, die eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 3) aufweist, die von Uppenberg et al, Structure, 2: 293, 453 (1994) beschrieben wurde und nachstehend angegeben ist:

Auch Lipasen, die einer bis sechs ortsspezifischen Mutationen, Sequenzadditionen und Sequenzdeletionen der oben angegebenen Sequenz entsprechen, können verwendet werden. Noch bevorzugter sind Lipasen, die null bis zwei ortsspezifischen Mutationen der oben angegebenen Candida antartica Typ B-Sequenz entsprechen.

Bevorzugte Amidasen schließen diejenigen ein, die aus Bakterien der Gattung Penicillium isoliert werden. Eine bevorzugtere Amidase weist eine mindestens 80%-ige Sequenzhomologie zu Penicillin acylase auf. Eine besonders bevorzugte Amidase ist Penicillin acylase, die auch als Penicillin amidohydrolase, E. C. 3.5.1.11 bezeichnet wird (Duggleby et al., Nature, 373: 264-268 (1995)).

Man glaubt, daß bei Hydrolasen, die Serin an ihrer Wirkstelle enthalten, der erste Schritt in der Reaktion von entweder KLG oder KLG-Estern die Bildung eines KLG-Enzymesters über die Acylierung der Wirkstelle Serin durch KLG beinhaltet. Man glaubt, daß ein intramolekularer Ringschluß Ascorbinsäure (oder deren Salze) liefert, wohingegen die Alkoholyse einen Ester von KLG liefert und die Hydrolyse KLG liefert.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt das Kontaktieren von entweder KLG oder einem KLG-Ester mit einem Hydrolase-Enzym, um Ascorbinsäure zu biden. Vorzugsweise wird diese Reaktion in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittelsystems, eines wäßrigen Lösungsmittelsystems oder einer Mischung derselben durchgeführt. Das organische Lösungsmittel ist bevorzugt ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkohol. Das wäßrige Lösungsmittelsystem oder gemischte wäßrige und organische Lösungsmittelsystem ist mehr bevorzugt, da Ascorbinsäure, KLG und KLG-Ester im allgemeinen in wäßrigen Lösungsmittelsystemen löslicher sind. Bei der in-vitro-Erzeugung von Ascorbinsäure aus KLG-Estern werden die gemischten wäßrigen und organischen Lösungsmittelsysteme oder organischen Lösungsmittelsysteme bevorzugt, um die konkurrierenden Hydrolysereaktionen zu minimieren, die KLG als Nebenprodukt erzeugen können. Wäßrige Lösungsmittelsysteme sind besonders bevorzugt, wenn ganze Zellsysteme für die Herstellung von Ascorbinsäure in vivo verwendet werden.

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Ascorbinsäure in vivo in Produktionssystemen mit ganzen Zellen und ganzen Organismen in Anwesenheit des Hydrolase-Enzymkatalysators hergestellt. In einer Ausführungsform wird das Hydrolase-Enzym natürlich durch den Wirtsorganismus erzeugt. In einer anderen Ausführungsform wird das Hydrolase-Enzym durch den Wirtsorganismus über rekombinante DNA-Technologie erzeugt. Beispielsweise wird eine Gensequenz, die für ein Hydrolase-Enzym codiert, in einen Wirtsorganismus inseriert, wobei der Wirtsorganismus ein Mikroorganismus, eine Pflanze oder ein nicht-menschliches Tier ist, der bzw. die bzw. das das Hydrolase-Enzym exprimieren kann. Der Wirtsorganismus, der das Hydrolase-Enzym erzeugt, wird kultiviert, das heißt mit Nährstoffen und einer geeigneten Umgebung für Wachstum in Anwesenheit von KLG oder KLG-Estern versehen, um die Ascorbinsäure zu erzeugen. Bevorzugt ist der Wirtsorganismus Pantoea citrea, früher als Erwinia herbicola bezeichnet, wie im US-Patent Nr. 5,008,194 an Anderson et al. offenbart.

Ebenfalls bevorzugt ist der Wirtsorganismus derart, daß er KLG zusätzlich zur Erzeugung des Hydrolase-Enzyms erzeugt. Repräsentative Organismen stammen von der Gattung Pantoea oder Gluconobacter, wie in Shinjoh et al., Applied and Envtl. Microbiology, 61: 413-420 (1995) offenbart, und der Gattung Corynebacterium ab, wie in Sonoyama et al., Applied and Envtl. Microbiology, 43: 1064-1069 (1982) offenbart.

Wie hierin verwendet, schließt die rekombinante DNA-Technologie rekombinante in-vitro-DNA- Techniken, synthetische Techniken und rekombinante/genetische in-vivo-Rekombination ein und ist in der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel die Techniken, die in Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N. Y. (1989); Anderson et al., Science, 230: 144-149 (1985); und US-Patent Nr. 5,441,882 an Estell et al., beschrieben sind.

Für die Herstellungen von KLG aus KLG-Estern wird eine wäßrige Lösung des KLG-Esters mit dem Hydrolase-Enzym umgesetzt. Ein Hilfslösungsmittel kann bei der Herstellung von KLG verwendet werden und ist bevorzugt ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkohol.

Für Herstellungen der KLG-Ester aus KLG oder aus anderen Estern von KLG ist das Ausgangsmaterial eine alkoholische Lösung, in welcher der Alkohol der Alkyl-Einheit des herzustellenden KLG-Esters entspricht. Die Alkyl-Einheit R des Alkohols ROH, von dem der bevorzugte Ester von KLG abgeleitet ist, kann aus verzweigt- oder geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten Alkylen, Arylalkylen, Arylen und substituierten Arylen ausgewählt werden. Bevorzugte Gruppen R umfassen gerad- oder verzweigtkette, gesättigte oder ungesättigte C&sub1;-C&sub6;-Alkyle. Noch bevorzugtere Ester von KLG, die von Alkyl-Einheiten abstammen, umfassen MeKLG, Ethyl-KLG, n-Propyl-KLG; Isopropyl-KLG, n-Butyl-KLG, Isobutyl-KLG, t-Butyl-KLG und n-Pentyl-KLG. Die bevorzugtesten hergestellten KLG-Ester sind aufgrund ihrer Leichtigkeit der Herstellung MeKLG und aufgrund der vorteilhaften Verwendung des Butanol-Wasser- Azeotrops bei der Wasserentfernung Butyl-KLG. Bei der Herstellung der KLG-Ester kann ein Hilfslösungsmittel verwendet werden und ist bevorzugt Wasser, ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkohol oder eine Mischung derselben.

Bevorzugte Temperaturen für die Durchführung der Reaktionen der vorliegenden Erfindung betragen 5ºC bis 120ºC. Noch bevorzugtere Temperaturen liegen bei 25ºC bis 100ºC, und insbesonders bevorzugte Temperaturen betragen 38ºC bis 80ºC.

Der bevorzugte pH des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt zwischen 1,5 und 10, und ein bevorzugterer pH beträgt 3 bis 10. Für die Herstellung von Ascorbinsäure-Salzen aus Estern von KLG liegt ein besonders bevorzugter pH-Bereich zwischen 6 und 10. Für die Herstellung von Ascorbinsäure als freie Säure ist ein bevorzugter pH derjenige unter dem pKs von Ascorbinsäure und liegt bevorzugter unter 4,2. Für die Herstellung von KLG aus Estern von KLG beträgt ein besonders bevorzugter pH-Bereich 5 bis 10 aufgrund der allgemein erhöhten Geschwindigkeiten von Enzym-unterstützter Hydrolyse in diesem pH- Bereich. Alternativ ist ein pH zwischen 1,5 und 2,5 für die Erzeugung von KLG in protonierter Form besonders wünschenswert. Schließlich liegt für die Herstellung von Estern von KLG aus KLG ein besonders bevorzugter pH-Bereich bei 3 bis 6.

Jede Hydrolase weist ein Temperaturoptimum, ein pH-Optimum und einen pH- und Temperaturbereich auf, der mit der Aktivität verbunden ist.

So ist ein geeigneter pH- und Temperaturbereich für eine gegebene Hydrolase derjenige, der die Aktivität der Hydrolase gestattet und Bedingungen vermeidet, die für die Hydrolase denaturierend und inaktivierend sind. Bei Bedingungen, die denaturierend sein können, wie hohe Temperatur oder die Verwendung von denaturierenden Lösungsmitteln, wie Methanol oder dergleichen, kann eine minimale Menge an Tests erforderlich sein, um diejenigen Hydrolasen zu definieren, die unter einem gegebenen Satz von Bedingungen aktiv bleiben.

Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung angegeben.

BEISPIELE

Kernmagnetische Protonen- und Kohlenstoff-Resonanz-(NMR)-Spektren wurde auf einem Varian Gemini 300 NMR-Instrument aufgezeichnet, das im Protonenmodus bei 300 MHz und im Kohlenstoffmodus bei 75 MHz betrieben wurde. Alle NMR-Spektren wurden auf Tetramethylsilan (TMS) bei 0 Teilen pro Million (ppm) bezogen, und die Peak-Frequenzen wurden in ppm aufgezeichnet, falls nicht anders angegeben. HPLC-(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analysen wurden unter Verwendung von Ultraviolett-(UV)-Detektion durchgeführt. Massenspektren (MS) wurden unter Verwendung eines Fisons VG Analytical Ltd. Autospec Mass Spectrometer im FD-(Felddesorptions)-Modus erhalten.

Die in den Experimenten verwendete KLG wurde durch Fermentation gemäß dem Verfahren von Lazarus et al., Anderson et al., Science, 230: 144-149 (1985) erhalten und wurde durch Konzentration und Kristallisation gereinigt. KLG kann alternativ durch chemische Umwandlung aus L-Sorbose gemäß in der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. das US-Patent Nr. 2,301,811 an Reichstem). Ein Standard-Methyl-2-keto-L-gulonat wurde von Aldrich Chemical Company (Rare and Speciality Chemicals Catalog) erworben, zusätzlich zu seiner Herstellung durch Veresterung von KLG mittels Verfahren, die dem Verfahren ähnlich waren, das für die nachstehend beschriebene Herstellung von Butyl-KLG verwendet wurde.

Enzym-Hydrolase-Proben wurden aus kommerziellen Quellen erhalten, einschließlich Sigma Chemical Company, Altus Biologics, Recombinant Biocatalysis, Boehringer Mannheim, Novo Nordisk, Genencor International, Thermogen und Fluka.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Reinigung von Butyl-2-keto-L-gulonat.

KLG-Hydrat (51,62 g) wurde unter Argon in ein 500 ml-Reaktionsgefäß eingeführt. Der Reaktor war mit einer 30,48 em-(12"-)Vigreux-Kolonne ausgerüstet, die an einer Dean-Stark-Falle angebracht war. Der Reaktor wurde dann mit n-Butanol (310 g) und p-Toluolsulfonsäure (2,3 g) beschickt. Die Reaktionsmischung wurde unter mildem Vakuum [etwa 19,95 kPa (150 mm Hg)] unter Rühren zum Rückfluß (81-82ºC) gebracht. Der Rückfluß wurde insgesamt zwei Stunden und 40 Minuten aufrechterhalten. Man hörte auf zu heizen. Man ließ die Reaktion abkühlen und über etwa 3 Tage bei Raumtemperatur verbleiben. Die resultierenden Kristalle wurden durch ein grobes Glasfrittenfilter abfiltriert und mit zwei Portionen n-Butylalkohol (139 g, gefolgt von 37 g) gewaschen. Die resultierenden Feststoffe (24,4 g) wurden in heißem Ethylacetat (250 ml) gelöst und durch Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur umkristallisiert. Das umkristallisierte Butyl-KLG wurde durch Filtration isoliert und unter Vakuum [0,1995 kPa (1,5 mm Hg)] getrocknet, bis ein konstantes Gewicht (15,97 g) erreicht war.

Man fand, daß das so hergestellte Butyl-KLG eine Löslichkeit von mindestens 50 Gew.-% in Wasser aufwies, da es bei allen Konzentrationen unter 50 Gew.-% in Wasser löslich war. Das umkristallisierte Butyl-KLG dieser Probe wies zufriedenstellende Protonen- und Kohlenstoff-NMR-Spektren auf und ergab das vorhergesagte Molekulargewicht durch Felddesorptions-Massenspektrometrie.

¹H-NMR (DMSO, digitale Auflösung = 0,11 Hz, TMS bei halber Höhe = 0,5 Hz): 6,49 (OH, d, J = 1,4 Hz), 4,96 (OH, d, J = 5,0 Hz), 4,84 (OH, d, J = 4,8 Hz), 4,78 (OH, d, J = 7,4 Hz), 4,17-4,0 (m, 2H), 3,5-3,2 (m, etwa 5H), 1,64-1,5 (m, 2H), 1,4-1,35 (m, 2H), 0,89 (CH&sub3;, t, J = 7,3).

¹³C-NMR (DMSO, entkoppelt): 169,4, 96,3, 73,8, 72,8, 69,8, 64,5, 62,8, 30,0, 18,4, 13,5.

FDMS: M = 250

Beispiel 2

Das folgende Verfahren wurde verwendet, um Enzyme bezüglich ihrer Aktivitäten bei speziellem pH und unter wäßrigen Lösungsmittel-Zusammensetzungsbedingungen zu demonstrieren.

Anfängliche Enzym-Durchmusterungen wurden wie folgt durchgeführt. Enzym (typisch 10 mg), wäßriger Puffer (typisch 860 Mikroliter (ul) oder 550 ul), wäßriges 0,2 M CaCl&sub2; (10 ul), Methanol (typisch 90 ul oder 400 ul) und eine wäßrige Substratlösung (typisch 90 ul Butyl-KLG bei einer typischen Konzentration von 110.000 ppm) wurden in ein 2 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben. Die resultierende Lösung wurde kurz gewirbelt und bei 300 Upm bei 38ºC auf ein Schüttelbad gegeben (typisch über 18 Stunden oder mehr). Nach Inkubation wurden die Proben bei 14.000 g (14.000-facher Schwerkraft) 20 Minuten zentrifugiert, um Enzym zu entfernen, eine Probe (300 ul) wurde entnommen, und sie wurden mit destilliertem Wasser auf einen Milliliter verdünnt. Falls nicht innerhalb des Tages mittels HPLC analysiert, wurden die Proben vor der Analyse gefroren.

In der nachstehenden Tabelle 2 sind die HPLC-Daten der Produkte (und des verbleibenden Substrats) bei der Reaktion von Butyl-KLG (BuKLG) mit einer Vielfalt von Enzym-Hydrolasen in Wasser/Methanol-Lösung zusammenfaßt. Die Daten wurden als Teile pro Million KLG, MeKLG, Ascorbinsäure (ASA) und Butyl-KLG mitgeteilt. Die Angabe von 0 (Null) zeigte an, daß die Menge des vorliegenden Materials unterhalb der Nachweisschwelle des Instruments lag. Proben, die als "kein Enzym" bezeichnet sind, waren Kontrollen innerhalb eines gegebenen Ansatzes. Die Kontrollen enthielten Substrat, aber kein Enzym, und stellen so experimentelle und HPLC-Hintergrundsdaten dar.

Tabelle 2 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 41 Stunden/38% Methanol/Wasser (0,1 MES-Puffer)

Tabelle 2 veranschaulicht, daß die Hydrolasen, die von Recombinant Biocatalysis geliefert wurden (ESL-001-01 bis ESL-001-07), eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG in einer 38% Methanol-Wasser-Lösung zeigten, die mit Morpholinoethansulfonsäure-(MES-) heminatriumsalz bei einem pH, der zwischen 5,5 und 6 gesteuert wurde, gepuffert war. Diese Hydrolase- Enzyme werden kommerziell von Recombinant Biocatalysis als rekombinante Esterasen und Lipasen aus thermophilen Organismen unter der Handelsbezeichnung CloneZyme (eingetragene Marke) verkauft.

Beispiel 3

Die nachstehende Tabelle 3 veranschaulicht, daß eine Vielfalt von Acylasen, Esterasen, Lipasen und Proteasen in einer 38% Methanol-Wasser-Lösung, die bei pH 4,8 bis 5,8 mit MES-Puffer gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigten. Die Enzyme, die als ChiroClec (eingetragene Marke) bezeichnet sind, sind kristalline vernetzte Enzyme, die im Handel von Altus Biologics verkauft werden. ChiroClec -CR ist eine Lipase aus Candida rugosa, ChiroClec - BL ist eine kristalline Form von Subtüisin (einer Protease) und ChiroClec -PC ist eine Lipase aus Pseudomonas cepacia. Candida Antartica B (eine Lipase), Schweineleber-Esterase (eine Hydrolase) und Bacillus Species Protease zeigten besonders hohe Grade an Aktivität.

Tabelle 3 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 16 Stunden/38% Methanol-Wasser/0,1 M MES-Puffer)

Beispiel 4

Die nachstehende Tabelle 4 veranschaulicht, daß eine Vielfalt von Acylasen, Esterasen, Lipasen und Proteasen in einer 38% Methanol-Wasser-Lösung, die bei pH 5 bis 5,8 mit MES-Puffer gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigten. Schweineleber- Esterase, Subtilisin Carlsberg (eine Protease), Bacillus species-Protease, ChiroClec -BL und Candida Antartica 8-Lipase zeigten alle besonders hohe Grade an Aktivität.

Tabelle 4 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 47,5 Stunden/38% Methanol-Wasser/0,1 M MES-Puffer)

Beispiel 5

Die nachstehende Tabelle 5 veranschaulicht, daß eine Vielfalt von Lipasen und Proteasen in einer 38% Methanol-Wasser-Lösung, die mit MES-Puffer bei pH 5,7 bis 6,1 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigte. Im Vergleich mit den anderen Enzymen in dieser Tabelle zeigten Prozyme 6 (eine Protease aus Aspergillus oryzae), Protease 2A (aus Aspergillus oryzae) und GC899 (eine kommerzielle Detergens-Protease von Genencor International) höhere Grade an Aktivität.

Tabelle 5 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 19 Stunden/38% Methanol-Wasser/0,1 M MES-Puffer)

Beispiel 6

Die nachstehende Tabelle 6 veranschaulicht, daß eine Vielfalt von Lipasen und Proteasen in 8,6% Methanol-Wasser-Lösung, die mit MES-Puffer bei einem pH von 5,3 bis 6 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigte. Protease M (Aspergillus oryzae), Prozyme 6 (eine Protease aus Aspergillus oryzae), Protease N (Subtilisin) und Protease 2A (Aspergillus oryzae) zeigten alle besonders hohe Grade an Aktivität.

Tabelle 6 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 19 Stunden/8,6% Methanol-Wasser/0,1 M MES-Puffer)

Beispiel 7

Die nachstehende Tabelle 7 veranschaulicht, daß eine Vielfalt von Acylasen, Esterasen, Lipasen und Proteasen in einer 8,6% Methanol-Wasser-Lösung, die mit MES-Puffer bei einem pH von etwa 5 bis 6 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigte. Candida Antartica B-Lipase, Schweineleber-Esterase und Bacillus species Protease zeigten besonders hohe Grade an Aktivität.

Tabelle 7 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 19 Stunden/8,6% Methanol-Wasser/0,1 M MES)

Beispiel 8

Die nachstehende Tabelle 8 veranschaulicht, daß eine Vielfalt von Acylasen, Esterasen, Lipasen und Proteasen in einer 8,6% Methanol-Wasser-Lösung, die mit MES-Puffer bei einem pH von etwa 5,8 bis 6,2 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigte. Schweineleber-Esterase, Candida Antartica B-Lipase, Bacillus spec/es Protease und leicht vernetztes kristallines Subtilisin (ChirClec-BL) zeigten besonders hohe Grade an Aktivität.

Tabelle 8 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 21 Stunden/8,6% Methanol-Wasser/0,2 M MES)

Beispiel 9

Die nachstehende Tabelle 9 demonstriert die statistische Reproduktion der Aktivität, die für hochaktive Enzyme in den vorstehenden Beispielen nachgewiesen wurde. Acht der Enzyme aus den vorstehenden Beispielen, von denen gezeigt wurde, daß sie besonders hohe Grade an Aktivität zeigten, wurden unter enger pH-Steuerung verglichen. Alle zuvor identifizierten Enzyme mit hohen Graden an Aktivität behielten diesen hohen Grad an Aktivität bei der erneuten Analyse bei. Die Enzyme zeigten in einer 8,6%-Methanol-Wasser-Lösung, die mit 0,2 M MES-Puffer bei einem pH von etwa 5,6 bis 6 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG. Candida Antartica B-Lipase, Schweineleber-Esterase und Bacillus species-Protease zeigten innerhalb dieses vergleichenden Beispiels besonders hohe Grade an Aktivität. Schweineleber-Esterase zeigte eine Selektivität für die Umesterung sowie signifikante Umwandlungen in Ascorbinsäure.

Tabelle 9 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 19 Stunden/8,6% Methanol-Wasser/0,2 M MES-Puffer)

Beispiel 10

Die nachstehende Tabelle 10 vergleicht dieselben Enzyme wie in Beispiel 9, außer bei einer höheren Konzentration an organischem Lösungsmittel, Candida Antartica und Bacillus species-Protease zeigten besonders hohe Grade an Aktivität, indem sie in einer 38% Methanol-Wasser-Lösung, die mit 0,2 M MES-Puffer bei einem pH von etwa 5,6 bis 6,2 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG zeigten. Eine verringerte, obwohl immer noch beträchtliche Aktivität wird für Schweineleber-Esterase beobachtet, verglichen mit der in Beispiel 9 gezeigten.

Tabelle 10 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von Butyl-KLG (38ºC über 19 Stunden/38% Methanol-Wasser/0,2 M MES-Puffer)

Beispiel 11

Die nachstehende Tabelle 11 vergleicht dieselben Enzyme wie in Beispiel 9, außer bei einem pH, der bei etwa 5,2 gepuffert war. Candida Antartica B und Schweineleber-Estecase zeigten besonders hohe Grade an Aktivität, indem sie in 8,6% Methanol-Wasser-Lösung, die mit 0,2 M Pyridin/Pyridiniumhydrochlorid-Puffer bei einem pH von etwa 4,9 bis 5,3 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in MeKLG und KLG zeigten. Eine verringerte, obwohl immer noch beträchtliche Aktivität wird im Vergleich zu Beispiel 9 bei Bacillus species-Protease beobachtet.

Tabelle 11 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von BuKLG (38ºC über etwa 19 Stunden/8,6% Methanol-Wasser/0,2 M Pyridin/Pyridiniumhydrochlorid)

Beispiel 12

Die nachstehende Tabelle 12 vergleicht dieselben Enzyme wie in Beispiel 11, außer bei einer höheren Konzentration an organischem Lösungsmittel. Candida Antartica B zeigte besonders hohe Grade an Aktivität, indem es in 38% Methanol-Wasser-Lösung, die mit 0,2 M Pyridin/Pyridiniumhydrochlorid- Puffer bei einem pH von etwa 4,7 bis 5,1 gepuffert war, eine beträchtliche Umwandlung von Butyl-KLG in MeKLG und KLG zeigte. Alle Enzyme zeigten eine verringerte Aktivität relativ zu den Beispielen 9 und 11.

Tabelle 12 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von BuKLG (38ºC über etwa 19 Stunden/pH 4,9/38% Methanol-Wasser)

Beispiel 13

Die nachstehende Tabelle 13 vergleicht dieselben Enzyme wie in den Beispielen 9 und 11, außer bei einem pH, der bei etwa 2,3 gepuffert ist. Alle getesteten Enzyme zeigten in einer 8,6% Methanol- Wasser-Lösung, die mit 0,2 M Phosphatpuffer bei einem pH von etwa 2,3-2,7 gepuffert war, eine verringerte Aktivität relativ zu den Beispielen 9 und 11 für die Umwandlung von Butyl-KLG in Ascorbinsäure, MeKLG und KLG.

Tabelle 13 Enzym-Durchmusterung für die Hydrolyse/Methanolyse von BuKLG (38ºC über 20 Stunden/8,6% Methanol-Wasser/pH 2,3/0,2 M Phosphat-Puffer)

Beispiel 14

Die nachstehende Tabelle 14 vergleicht die ersten 5 Enzyme der Beispiele 9 und 11 bei einem gepufferten pH von etwa 6 in ihrer Fähigkeit, die Veresterung von KLG zu Methyl-KLG (MeKLG) zu katalysieren, oder ihre Fähigkeit, den Ringschluß von KLG zu Ascorbinsäure zu katalysieren. Relativ zu den Beispielen 9 und 11 werden niedrige Grade an Aktivität beobachtet.

Tabelle 14 Enzym-Durchmusterung für die Methanolyse von KLG (38ºC über 19 Stunden/8,6% Methanol- Wasser/0,2 M MES-Puffer)

Beispiel 15

Die nachstehende Tabelle 15 demonstriert die Erzeugung von MeKLG aus KLG unter Verwendung von Candida Antartica B-Lipase als Katalysator in 8,6%-igem wäßrigem Methanol bei einem pH von 3- 3,2. Der Puffer wurde als eine Mischung von KLG und dessen Natriumsalz (etwa 1/9) gewählt. Die ersten drei Einträge schließen Enzym-Katalysator ein und betreffen dieselben Bedingungen in dreifacher Ausführung. Die zweiten drei Einträge betreffen ebenfalls dreifache Ausführungen und die gleichen Bedingungen wie die ersten drei Einträge, außer daß kein Enzym anwesend war. Die ersten drei Einträge zeigen eine signifikante Veresterung von KLG zu MeKLG in Anwesenheit von Candida Antartica B-Lipase. Die zweiten drei Einträge demonstrieren, daß die Umwandlung in Abwesenheit von Candida Antartica B- Lipase nicht stattfindet.

Tabelle 15 Enzym-Durchmusterung für die Veresterung von KLG (68 Stunden bei 38ºC/8,6% Methanol in wäßriger Phase/Puffer = KLG + NaKLG)

Beispiel 16

Dieses Beispiel demonstriert die langsame Zersetzung von Ascorbinsäure unter den Bedingungen der HPLC-Analyse. HPLC-Probenstandards wurden hergestellt, indem man KLG, MeKLG, Ascorbinsäure (ASA) und Butyl-KLG zu der geeignete Konzentration in Wasser löste. Proben dieser Standards wurden in gefüllte und verschlossene Fläschchen gegeben, bei Raumtemperatur gelagert und periodisch analysiert. Die HPLC wurde mit der Flächenantwort für Standards kalibriert, die sobald wie möglich nach der Herstellung der Standards in die HPLC injiziert wurden. Die nachstehende Tabelle 16 zeigt die aufgezeichneten Antworten für KLG-, MeKLG-, Ascorbinsäure- und Butyl-KLG-Standards von 50, 100 und 500 ppm zur Zeit 0 (Kalibrierungszeit), bei etwa 6,5 Stunden und bei etwa 12 Stunden nach der Probenpräparierung.

Tabelle 16 hergestellte Menge gefundene Menge

Die Ascorbinsäure-Antworten waren im Lauf der Zeit nicht-linear bezüglich den anderen Standards und insbesondere bezüglich der Standards von 100 ppm oder weniger. Im Hinblick darauf, daß die Behandlung bei den Beispielen 2-16 etwa 16 Stunden oder mehr bei 38ºC auf einem Schüttelbad vor der HPLC-Analyse einschloß, folgt, daß die tatsächliche Menge an gebildeter Ascorbinsäure größer war als die mitgeteilte.

SEQUENZLISTE (1) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) ANMELDER: Hubbs, John C.

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure, 2-Keto-L-gulonsäure und 2-Keto-L-gulonsäureestern

(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 3

(iv) KORRESPONDENZADRESSE:

(A) ADRESSAT: Eastman Chemical Company

(B) STRASSE: P. O. Box 511

(C) STADT: Kingsport

(D) STAAT: Tennessee

(E) LAND: USA

(F) PLZ: 37662-5075

(v) COMPUTER-LESBARE FORM:

(A) ART DES MEDIUMS: *

(B) COMPUTER: *

(C) BETRIEBSSYSTEM: *

(D) SOFTWARE: *

(vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDUNG NR: *

(B) EINREICHUNGSDATUMG: *

(C) KLASSIFICATION: *

(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDUNG NR: US 60/017,879

(B) EINREICHUNGSDATUM: 17. MAI 1996

(viii) ANWALTSINFORMATION:

(A) NAME: Cheryl J. Tubach

(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: *

(C) ANWALTSZEICHEN: 70432

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION;

(A) TELEFON: 423-229-61189

(B) TELEFAX: 423-229-1239

(2) INFORMATION ZUR SEQ ID NR: 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 379 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLART: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID NR: 1:

(2) INFORMATION ZUR SEQ ID NR: 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 584 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLART: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID NR: 2:

(2) INFORMATION ZUR SEQ ID NR: 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 342 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLART: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID NR: 3:


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Keto-L-gulonsäure und einem Ester von 2-Keto-L-gulonsäure, mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator, um Ascorbinsäure zu bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Hydrolase-Enzymkatalysator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Protease, einer Esterase, einer Lipase und einer Amidase.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Protease aus einer Gattung erhalten wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bacillus oder Aspergillus.

4. Verfahren nach Anspruch 3, in dem die Protease aus Bacillus licheniformis Bakterien erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in dem die Protease eine mindestens 70%-ige Sequenz- Homologie mit einer Subtilisin-Protease mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, in dem die Protease die Subtilisin-Protease mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Esterase aus Schweineleber-Extrakt erhalten wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem die Esterase eine mindestens 70%-ige Sequenz- Homologie mit einer Schweineleber-Esterase mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem die Esterase die Schweineleber-Esterase mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Lipase aus einer Gattung erhalten wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aspergillus, Mucor, Candida, Pseudomonas, Humicola, Rhizopus, Chromobacterium, Alcaligenes, Geotricum und Penicillium.

11. Verfahren nach Anspruch 10, in dem die Lipase, die aus der Gattung Candida erhalten wird, eine Lipase ist, die eine mindestens 70%-ige Sequenz-Homologie mit einer Candida antartica B-Lipase mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Lipase die Candida antartica B-Lipase mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz ist.

13. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Amidase aus der Gattung Penicillium erhalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in dem die Amidase eine mindestens 80%-ige Sequenz- Homologie mit Penicillin acylase aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, in dem die Amidase die Penicillin acylase ist.

16. Verfahren nach Anspruch T, in dem der Hydrolase-Enzymkatalysator einen Serin-Rest an der aktiven Steile enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, in dem der Hydrolase-Enzymkatalysator eine katalytische Dreiergruppe von Serin, Histidin und Asparaginsäure enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 1, in dem vor dem Kontaktieren der Verbindung mit dem Hydrolase-Enzymkatalysator die Verbindung in eine Lösung in einem Lösungsmittel überführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, in dem das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser, einem C&sub1;- bis C&sub6;-Alkohol und einer Mischung derselben.

20. Verfahren nach Ansprüch 1, in dem das Kontaktieren der Verbindung mit dem Hydrolase-Enzymkatalysator bei einem pH zwischen 1,5 und 10 stattfindet.

21. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Kontaktieren der Verbindung mit dem Hydrolase-Enzymkatalysator bei einer Temperatur von 5ºC bis 120ºC stattfindet.

22. Verfahren nach Anspruch 1, in dem vor dem Kontaktieren der Verbindung mit dem Hydrolase-Enzymkatalysator der Hydrolase-Enzymkatalysator natürlich von einem Wirtsorganismus in vivo exprimiert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 1, in dem vor dem Kontaktieren der Verbindung mit dem Hydrolase-Enzymkatalysator eine Gensequenz, die für den Hydrolase-Enzymkatalysator kodiert, in einen Wirtsorganismus inseriert wird und der Wirtsorganismus kultiviert wird, um den Hydrolase-Enzymkatalysator in vivo zu exprimieren.

24. Verfahren nach Anspruch 23, in dem der Wirtsorganismus Pantoea citrea ist.

25. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, in dem der Wirtsorganismus 2-Keto-L-gulonsäure erzeugt.

26. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen einer wässrigen Lösung eines Esters von 2-Keto-L-gulonsäure und

(b) anschließendes Kontaktieren des Esters von 2-Keto-L-gulonsäure in Lösung mit 25 einem Hydrolase-Enzymkatalysator, um 2-Keto-L-gulonsäure zu bilden.

27. Verfahren nach Anspruch 26, in dem der Hydrolase-Enzymkatalysator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Protease, einer Esterase, einer Lipase und einer Amidase.

28. Verfahren nach Anspruch 26, in dem ein Hilfslösungsmittel bei der Herstellung der wässrigen Lösung verwendet wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, in dem das Hilfslösungsmittel ein C&sub1;- bis C&sub6;-Alkohol ist.

30. Verfahren zur Herstellung eines Esters von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen einer alkoholischen Lösung von 2-Keto-L-gulonsäure und einem Alkohol, der einer Alkyleinheit eines zu bildenden Esters von 2-Keto-L-gulonsäure entspricht; und

(b) anschließendes Kontaktieren der 2-Keto-L-gulonsäure in Lösung mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator, um den Ester von 2-Keto-L-gulonsäure zu bilden.

31. Verfahren nach Anspruch 30, in dem der Hydrolase-Enzymkatalysator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Protease, einer Esterase, einer Lipase und einer Amidase.

32. Verfahren nach Anspruch 30, in dem ein Hilfslösungsmittel bei der Herstellung der alkoholischen Lösung verwendet wird.

33. Verfahren nach Ansprüch 32, in dem das Hilfslösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser, einem C&sub1;- bis C&sub6;-Alkohol und einer Mischung derselben.

34. Verfahren zur Herstellung eines Esters von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen einer alkoholischen Lösung eines ersten Esters von 2-Keto-L- gulonsäure und eines Alkohols, der einer Alkyl-Einheit eines zu bildenden zweiten Esters von 2-Keto-L-gulonsäure entspricht; und

(b) anschließendes Kontaktieren des ersten Esters von 2-Keto-L-gulonsäure in Lösung mit einem Hydrolase-Enzymkatalysator, um den zweiten Ester von 2-Keto- L-gulonsäure zu bilden.

35. Verfahren nach Anspruch 34, in dem der Hydrolase-Enzymkatalysator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Protease, einer Esterase, einer Lipase und einer Amidase.

36. Verfahren nach Anspruch 34, in dem ein Hilfslösungsmittel bei der Herstellung der alkoholischen Lösung verwendet wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, in dem das Hilfslösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser, einem C&sub1;- bis C&sub6;-Alkohol und einer Mischung derselben.







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