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Dokumentenidentifikation DE69718094T2 20.11.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0802411
Titel Verfahren und Kit zur Messung von Hämoglobin A1c
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Maruo, Naoko, Yokohama-shi, Kanagawa, JP;
Inoue, Masuo, Kawasaki-shi, Kanagawa, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69718094
Vertragsstaaten DE, FR, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.03.1997
EP-Aktenzeichen 971044003
EP-Offenlegungsdatum 22.10.1997
EP date of grant 02.01.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.11.2003
IPC-Hauptklasse G01N 33/72

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine einstufige Immunoassay-Methode zur Messung des prozentualen Anteils von Hämoglobin A1c in einer Probe.

Hämoglobin A1c (HbA1c) ist ein glycosyliertes Hämoglobin, das durch Verbindung zwischen der Aminogruppe des N-terminalen Valins der β-Kette von Hämoglobin einerseits und der Aldehydgruppe der Glucose andererseits entsteht, wobei zuerst eine Schiff'sche Base und anschließend durch Amadori-Umlagerung ein stabiles Ketoamin entsteht. Da der prozentuale Gehalt von HbA1c (im folgenden: HbA1c%) den Blutzuckergehalt ein bis zwei Monate vor der Messung wiederspiegelt, ist er allgemein zur Kontrolle des Blutzuckerspiegels anerkannt.

Bisher wurde die Messung des HbA1c% meist mit einem Glycohämoglobin-Analyzer vorgenommen, einem Meßinstrument auf der Basis von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Anwendung von Ionenaustausch-Chromatographie. Obwohl diese Methode eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit ergibt, weist sie einige Nachteile auf: Sie erfordert ein spezielles HPLC-Analyzer-System, ihre Kapazität ist beschränkt, die Meßergebnisse bei anderen Hämoglobinformen sind ungenau und der technische Wartungsaufwand sehr hoch.

Um diese Probleme zu lösen, wurden in den letzten Jahren HbA1c-Meßtechniken entwickelt, die die HPLC vermeiden, und entsprechende Reagenzien wurden auf den Markt gebracht. Aufgrund seiner hohen Spezifität wurde besonders der Immunoassay zur Messung des HbA1c% verwendet.

Ein Immunoassay-Verfahren für HbA1c, das in Betracht gezogen wurde, war z. B. der "Sandwich-Assay" unter Verwendung zweier Antikörper. Wohlbekannt ist auch eine Adsorptions-Immunoassay-Technik, bei der die Hämoglobine einer Probe, darunter auch HbA1c, physikalisch an eine feste Phase adsorbiert werden, und das adsorbierte HbA1c mit einem Antikörper hoher Spezifität ermittelt wird. Bei dieser Methode, bei der Hämoglobine direkt an eine feste Phase adsorbiert werden, nimmt man an, daß der Anteil des adsorbierten HbA1c dessen Anteil im Gesamt-Hämoglobin entspricht, wenn ein Überangebot Hämoglobin an die begrenzte Oberfläche der festen Phase zugegeben wird. Da HbA1c auf klinischem Gebiet als prozentualer Anteil (%) der Gesamthämoglobinmenge ausgedrückt wird, kann sein Prozentanteil im Blut bestimmt werden, ohne die absolute Menge von HbA1c oder des Gesamthämoglobins zu messen, wenn der Prozentanteil von HbA1c des an eine feste Phase adsorbierten Hämoglobins gleich dessen Anteil im Blut ist. Bei dieser Methode müssen die Hämoglobine hinreichend an die feste Phase adsorbiert sein. Daher wird in aufeinanderfolgenden Schritten verfahren, und zwar werden die Hämoglobine zunächst an die Oberfläche einer festen Phase, wie Latexteilchen oder Polystyrenkügelchen adsorbiert, die so erhaltene feste Phase wird gewaschen oder wenn nötig von nicht adsorbiertem Material getrennt, und das an der festen Phase adsorbierte HbA1c wird spezifisch duch Anti-HbA1c-Antikörper ermittelt, die spezifisch HbA1c binden. Im Handel sind Enzym-Immunoassay(EIA)-Reagenzien erhältlich, die nach dieser Methode arbeiten.

Bei diesem zweistufigen Test mit einem handelsüblichen EIA-Kit ist ein Waschvorgang zwischen dem ersten Schritt (Adsorption) und dem zweiten Schritt (Immunreaktion) erforderlich, was das Verfahren komplexer und zeitaufwendiger macht, als den simultanen oder einstufigen Immunoassay. Weiterhin besteht auch die Gefahr, daß das an die feste Phase adsorbierte Hämoglobin im Zug des Waschvorganges ausgewaschen werden könnte. Darüberhinaus können bei Kits dieser Art, da sie den glycosylierten N-terminalen Rest der β-Kette des Hämoglobins für die Reaktion mit einem spezifischen HBA1c-Antikörper verwenden, in vielen Fällen stark denaturierende Bedingungen erforderlich sein, um die glycosylierten N-terminalen Reste während oder vor der Adsorption an die feste Phase freizulegen. Da jedoch die Enzym-Antikörper-Verbindung unter diesen Bedingungen mit hoher Wahrscheinlichkeit inaktiviert würde, kann ein gleichzeitiger Adsorptions-Immunreaktions-Schritt wegen dieser möglichen Inaktivierung des Enzyms und/oder des Antikörpers beim enzymmarkierten Anti-HbA1c-Antikörper nicht angewandt werden. Aufgrund der stark denaturierenden Bedingungen in solchen handelsüblichen Kits muß die denaturierte Blutprobe sofort nach ihrer Herstellung verwendet werden, denn im Verlauf der Zeit treten Streuungen der Meßwerte durch Bildung von Niederschlag usw. auf, was den Erhalt genauer Meßwerte unmöglich macht. Daher eignet sich diese Methode nicht zur Bearbeitung einer großen Probenzahl.

Andererseits wurde ein Immunoassay auch schon für Agglutination an Latex statt in Form eines EIA angewandt. Eine hämolyslierte Probe wird zunächst zu einer unsensibilisierten Latexsuspension hinzugefügt, damit sich die Hämoglobine an die Oberfläche des Latex adsorbieren, dann werden HbA1-spezifische monoklonale Antikörper von Mäusen und schließlich polyklonale Anti-Maus-IgG-Antikörper hinzugefügt. Es kommt zur Agglutination, wobei der Grad dieser Agglutination den HbA1c% der Probe widerspiegelt. Obwohl dieses Verfahren kein Waschen erfordert, kann es, da eine große Menge Latex zur Adsorption der Hämoglobine benötigt wird, zur unspezifischen Agglutination von Latex und damit zum Auftreten abnorm hoher Meßwerte kommen, oder es besteht das Risiko, daß verstärkte Agglutination aufgrund der Antikörper-Antigen-Reaktion des HbA1c schwer zu entdecken ist.

Mit dem steigenden Anteil älterer Menschen an der Gesamtbevölkerung nimmt auch die Verbreitung von Diabetes und anderen Alterskrankheiten stetig zu. Damit kommt Diagnoseparametern wie dem HbA1c%, der weithin als Indikator für den Blutzuckerspiegel anerkannt ist, besondere Bedeutung zu. Aufgrund des geschilderten Trends erscheint es nötig, die Durchsatzkapazität der Testverfahren zu steigern. Es besteht daher ein gewaltiger Bedarf für die Entwicklung eines Diagnosereagens, das die Bearbeitung der Proben leicht, exakt und in großer Stückzahl ermöglicht. Die derzeit verfügbare HPLC-Methode hat eine geringe Durchsatzkapazität und erfordert spezielle Instrumente mit hohem Wartungsaufwand. Die EIA und die Latex-Agglutinationsmethode andererseits, die ebenfalls verfügbar sind, erfordern komplexe Verfahren und geben aufgrund der obenerwähnten Gründe ungenaue Ergebnisse.

Auf der Suche nach einer Methode zur leichten und exakten Messung des HbA1c% einer Probe aufgrund eines hochspezifischen Immunoassays wurde mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren entwickelt, das die Messung des HbA1c% in einem einzigen Schritt erlaubt, wobei die Adsorption der Hämoglobine an die feste Phase und die Reaktion des Antigen- HbA1c mit dem Anti-HbA1c-Antikörper gleichzeitig stattfinden und damit die vorliegende Erfindung vollenden.

Die vorliegende Erfindung offenbart eine Meßmethode für HbA1c%, die folgende Schritte umfaßt: Die Probe, die HbA1c enthält, wird gleichzeitig mit einer festen Phase und mit markierten Anti-Hämoglobin A1c-Antikörpern in Kontakt gebracht, wobei adsorbiertes, an die markierten Antikörper gebundenes HbA1c entsteht. Die markierten Anti-HämoglobinA1c- Antikörper, gebunden an Hämoglobin A1c, das seinerseits wiederum an die feste Phase gebunden ist, werden von den ungebundenen markierten Anti-HämoglobinA1c-Antikörpern abgetrennt. Der Betrag des Markers des gebundenen Anti-HämoglobinA1c-Antikörpers wird festgestellt.

Fig. 1 zeigt eine Standard-Meßkurve von HbA1c% unter Verwendung der einstufigen, 40minütigen Inkubationsreaktion aus Beispiel 1.

Fig. 2 ist ein Korrelationsdiagramm zwischen der einstufigen 40minütigen Immunoassay- Methode aus Beispiel 2 und einer konventionellen HPLC-Methode.

Fig. 3 zeigt eine Standard-Meßkurve von HbA1c% unter Verwendung der einstufigen, 10minütigen Inkubationsreaktion aus Beispiel 4.

Fig. 4 ist ein Korrelationsdiagramm zwischen der einstufigen Immunoassay-Methode mit auf 10 Minuten verkürzter Inkubationszeit (aus Beispiel 4), und einer konventionellen HPLC- Methode.

Für die vorliegenden Erfindung ist es nötig, Blutproben vor der HbA1c%-Messung zu hämolysieren. Es gibt keine besondere Einschränkung hinsichtlich der Hämolysemethode; verschiedene Verfahren können angewandt werden, z. B. die Verwendung einer hypotonischen Flüssigkeit wie Wasser oder ein Tensid.

Nach der Hämolyse erfolgt die Vorbehandlung der Probe. Das HbA1c wird denaturiert, instabiles HbA1c kann durch diese Vorbehandlung auch entfernt werden. Es gibt keine besondere Einschränkung hinsichtlich der Vorbehandlungsmethode; auch hier können verschiedene Verfahren angewandt werden, z. B. KSCN oder andere Chemikalien. Jedoch sollte, um störende Einflüsse auf die im nächsten Schritt erfolgende Immunoassay-Methode zu minimieren (nämlich die Niederschlagsbildung aufgrund noch verbliebener Vorbehandlungslösung im Reaktionsgemisch), und um die Inaktivierung des Enzyms und/oder der Antikörper bei der Verwendung enzymmarkierter Antikörper zu verringern, die Vorbehandlung vorzugsweise unter milden Verhältnissen und mit geringerer Chemikalienmenge durchgeführt werden. Somit ist eine Vorbehandlung z. B. unter schwach sauren Bedingungen vorzuziehen. "Schwach sauer" bedeutet hierbei vorzugsweise pH 3,0 bis 6,9; noch besser 4,0 bis 6,0.

Unter diesen Bedingungen können zur Vorbehandlung beispielsweise aliphatische Carboxylatpuffer oder Boratpuffer verwendet werden. Aliphatische Carboxylatpuffer sind z. B. Mono- und Dicarboxylatpuffer, genauer gesagt Succinat-, Malonat-, Fumarat-, Malat-, Glutarat- oder Acetatpuffer. Succinat-, Glutarat- oder Acetatpuffer sind vorzuziehen, Succinatpuffer sind besonders vorzuziehen.

Die Vorbehandlung unter leicht sauren Bedingungen ermöglicht die Denaturierung von HbA1c bei gleichzeitiger Beibehaltung der α2β2-Struktur des Hämoglobins und die Entfernung des instabilen HbA1c. Hämolyse und Vorbehandlung können hintereinander oder gleichzeitig erfolgen.

Nachdem die Probe hämolysiert und vorbehandelt wurde, wird sie gleichzeitig mit einer festen Phase und mit markierten Anti-HbA1c-Antikörpern in Kontakt gebracht. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der festen Phase zur Adsorption des Hämoglobins; es kann sich z. B. um Röhrchen, Kügelchen, Plättchen, Mikropartikel oder Papierfilter und um Materialien wie Glas, Polystyren, Latex oder Papier handeln. Unabhängig davon, welche feste Phase verwendet wird, ist eine möglichst große Oberfläche vorzuziehen, da eine solche mehr Hämoglobin adsorbieren kann und damit eine genauere Messung ergibt.

Auch für den Anti-HbA1c-Antikörper, der zur Reaktion verwendet wird, besteht keine besondere Beschränkung, vorausgesetzt er erkennt spezifisch HbA1c. Monoklonale oder Polyklonale Antikörper können ebenso verwendet werden wie Teilstücke von solchen. Der Anti- HbA1c-Antikörper wird markiert, um seine Entdeckung nach der Immunreaktion zu erleichtern. Es besteht keine besondere Beschränkung hinsichtlich des Markers, vorausgesetzt es handelt sich um einen, der normalerweise für die Feststellung von Immunreaktionen eingesetzt wird, z. B. Enzyme, radioaktive Isotope oder fluoreszierende Stoffe, wobei Enzymmarker besonders zu bevorzugen sind. Beispiele für solche Enzyme sind alkalische Phosphatase, Peroxidase und β-D-Galactosidase, ein Beispiel für radioaktive Isotope ist ¹²&sup5;I eins für fluoreszierende Stoffe Fluorescin. Obwohl dies nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, kann man einen weiteren Antikörper, der Anti-HbA1c-Antikörper erkennt (zweiter Antikörper), markieren, an der Reaktion teilnehmen lassen und für die Feststellung verwenden. In diesem Fall werden die gleichen Marker verwendet, wie vorhin beschrieben. Außerdem sollte eine angemessene Menge von Anti-HbA1c-Antikörpern zur Bindung an das festkörperadsorbierte HbA1c zugegeben werden.

In der vorliegenden Erfindung wird das zu analysierende HbA1c einer Probe reagieren gelassen, indem die Probe gleichzeitig mit der festen Phase und den Anti-HbA1c-Antikörpern in Kontakt gebracht wird. Charakteristisch ist dabei, daß die Adsorption des HbA1c an die feste Phase und seine Reaktion mit den Anti-HbA1c-Antikörpern in einem einzigen Inkubationsschritt ausgeführt werden. Dies kann z. B. erreicht werden, indem die feste Phase und die Anti-HbA1c-Antikörper gleichzeitig der Probe hinzugefügt werden oder aber indem die feste Phase und die Anti-HbA1c-Antikörper zuerst vermischt und dann der Probe hinzugefügt werden. Es bestehen keine besonderen Einschränkungen hinsichtlich der Bedingungen für die Adsorption des HbA1c der Probe an die feste Phase und für die Reaktion mit den Anti- HbA1c-Antikörpern; es können also die Bedingungen für gewöhnliche Immunoassay- Reaktionen angewandt werden. Jedoch sollte die Reaktionszeit so kurz gehalten werden wie ohne Beeinträchtigung der Feststellung möglich. Normalerweise dauert die Reaktion 5 bis 60 Minuten, vorzuziehen sind 5 bis 50 und noch stärker vorzuziehen 5 bis 15 Minuten. Dies geschieht nicht nur, um die Wirksamkeit der Messung zu verbessern, sondern auch um die Bildung von Niederschlägen in der Probe zu verringern, die durch im Reaktionsgemisch verbliebene Reste der Vorbehandlungslösung verursacht werden. Verwendet man enzymmarkierte Anti-HbA1c-Antikörper, so ist die kurze Inkubationsdauer auch nötig, um die Inaktivierung des Enzyms und/oder der Antikörper durch die Vorbehandlungslösung möglichst gering zu halten.

Nach Adsorption des HbA1c an die feste Phase und der Reaktion mit den Anti-HbA1c- Antikörpern wird der Komplex Antikörper-Hämoglobin-feste Phase von nichtgebundenem Material abgetrennt und nötigenfalls gewaschen. Als nächstes werden Anti-HbA1c- Antikörper bestimmt, die mit dem an der festen Phase adsorbierten HbA1c verbundenen sind, um so den HbA1c% der Probe festzustellen. Diesmal erfolgt die Bestimmung über den Marker am Anti-HbA1c-Antikörper. Dazu kann jede Methode angewandt werden, die zur Bestimmung eines solchen Markers geeignet ist.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, den HbA1c% mit einem einstufigen Immunoassay zu messen. Demzufolge kann die für die Messung erforderliche Zeit im Vergleich zu den zweistufigen HbA1c-Messungen konventioneller Immunoassay-Methoden reduziert werden. Folglich wird die Kontaktzeit mit der noch im Reaktionsgemisch verbliebenen Vorbehandlungslösung verkürzt, um der Niederschlagsbildung in der Probe vorzubeugen. Außerdem kann man mit einer kürzeren Inkubationszeit, falls die enzymmarkierten Anti-HbA1c- Antikörper in einem einstufigen Immunoassay verwendet werden, die Inaktivierung des Enzyms und/oder der Antikörper durch die verbliebene Vorbehandlungslösung verringern. Da nur ein Arbeitsschritt zur Abtrenung der gebundenen Anti-HbA1c-Antikörper vom ungebundenen Material in Lösung erforderlich ist, besteht darüberhinaus ein geringeres Risiko, das Hämoglobin aus der festen Phase auszuwaschen.

Nicht zuletzt ermöglicht es die vorliegende Erfindung, die jeweils aktuellsten HbA1c%- Meßwerte zur Verfügung zu haben, indem man dem Patienten vor der Sprechstunde Blut abnimmt und dessen HbA1c% mißt. Selbst wenn man das Blut während der Sprechstunde selbst abnimmt, muß der Patient aufgrund der kürzeren Inkubationszeit der vorliegenden Methode nicht so lange auf das Ergebnis warten.

Wird die vorliegende Methode in Verbindung mit einem handelsüblichen automatisierten Immunoassay-System angewandt, läuft der Vorgang mit Ausnahme der anfänglichen Hämolyse und der Vorbehandlung vollautomatisch ab. Da die Notwendigkeit eines Waschvorganges während der Immunreaktion entfällt, kann auch die Meßzeit verkürzt werden, was den Nutzen für die Diagnose gewaltig erhöht.

Darüberhinaus können, da die Messung mit einem handelsüblichen automatisierten Immunoassay-System erfolgen kann, gleichzeitig weitere Diabetes-Marker, wie Insulin und C-Peptide untersucht werden. Man erhält also eine größere Menge an Informationen leicht und in einem Arbeitsgang.

Nachstehende Beispiele veranschaulichen die Erfindung:

Beispiel 1: Einrichtung der HbA1c-Meßmethode und Ausarbeitung einer Standardkurve

Es wurden mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-HbA1c-Antikörper nach folgender Beschreibung hergestellt: Nach Bindung von 2 mg monoklonalen Anti-HbA1c-Antikörpern von Mäusen (DAKO) mit 2 mg handelsüblicher alkalischer Phosphatase, gewonnen durch S- S-Bindung aus Rinderdünndarm (Biozyme), wurde das resultierende Produkt durch Gelfiltration (Säule: G3000SW, Tosoh; Elution: 50 mM Phosphatpuffer (pH 7) mit 150 mM NaCl) gereinigt (siehe Ishikawa, E. ed., Enzyme Immunoassay Methods, 3. Aufl., Igaku Shoin, S. 117). Die damit hergestellten, mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-HbA1c- Antikörper wurden zu 0,1 M Tris-Puffer (pH 8,0), enthaltend 5% Rinderserumalbumin, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; und 0,1% NaN&sub3; hinzugefügt, bis zu einer Konzentration von 1,5 mA (1 mA ist jene Konzentration, deren Absorption bei 280 nm 0,001 beträgt). 100 ul dieser Reaktionslösung wurden in einen Becher gefüllt, und anschließend wurden 12 Polystyrenkügelchen (Durchmesser 1,4 bis 1,6 mm) hinzugefügt.

Die Eichproben wurden vorbereitet, indem die roten Blutkörperchen von sechs Patienten mit unterschiedlichen HbA1c%-Konzentrationen abgetrennt, gewaschen, mit gereinigtem Wasser hämolysiert und schließlich gefriergetrocknet wurden. Nach ihrer Wiederherstellung mit gereinigtem Wasser wurden die HbA1c%-Konzentrationen dieser Eichproben mittels eines handelsüblichen Glycohämoglobin-Analyzers (HLC-723GHbIII, Tosoh) bestimmt. Um die Probelösungen für den Immunoassay herzustellen, wurde jeweils 20 ul der wiederhergestellten Eichproben zu 580 ul 0,1 M Succinatpuffer (pH 5,0), enthaltend 0,1% Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; hinzugegeben, anschließend umgerührt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.

Diese Probelösungen (jeweils 10 ul) wurden den Bechern mit den obenerwähnten markierten Antikörpern und den Kügelchen hinzugefügt, dann erfolgte der einstufige Immunoassay mittels eines handelsüblichen vollautomatischen Immunoaanlyzers (AIA-1200, Tosoh). Und zwar wurden nach 40minütiger Inkubation bei 37ºC die Kügelchen mit dem adsorbierten Antigen-Antikörper-Komplex (bestehend aus den enzymmarkierten Anti-HbA1c-Antikörpern und dem HbA1c-Antigen) gewaschen, dann wurden 220 ul Substratlösung (pH 10), enthaltend 0,26 mg/ml 4-Methylumbelliferyl-Phosphat (4-MUP) zugegeben. Dann wurde die Bildungsrate von 4-Methylumbelliferon (4-MU) bei einer Exzitations-Wellenlänge von 362 nm und einer Emissions-Wellenlänge vom 447 nm gemessen. Anmerkung: Die alkalische Phosphatase wandelt 4-MUP in ein Fluorogen, eben 4-MU um.

Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Die HbA1c%-Konzentration der Eichproben, wie mit dem Glycohämoglobin-Analyzer bestimmt, ist auf der waagerechten Achse eingetragen, die Rate der 4-MU-Bildung, umgewandelt durch die alkalische Phosphatase, auf der senkrechten Achse. Die 4-MU-Bildungsrate steigt in Abhängigkeit von der Konzentration des HbA1c (%) und ermöglicht somit die Ausarbeitung einer Standardkurve.

Beispiel 2: Korrelation mit der konventionellen HPLC-Methode

Voll-Blutproben von 20 ul von normalen Erwachsenen und von Diabetespatienten, mit EDTA als Gerinnungshemmer wurden zu 580 ul 0,1 M Succinatpuffer (pH 5,0), enthaltend 0,1% Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; hinzugegeben, umgerührt und die Gemische 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um Hämolyse und Vorbehandlung der Proben geschehen zu lassen. Die so erhaltenen Lösungen wurden wie die Probelösungen für den Immunoassay verwendet. Die HbA1c-Konzentration der Voll-Blutprobe eines Patienten wurde vorher mit einem handelsüblichen Glycohämoglobin-Analyzer (HLC-723GHbIII, Tosoh) mit HPLC- Technik bestimmt. Die einstufige Immunoassay-Messung zur Bestimmung der HbA1c%- Konzentration wurde mit dem AIA-1200 nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ausgeführt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die Figur zeigt die Meßergebnisse von 50 Diabetiker-Proben. Die HbA1c-Konzentrationen (%), die mit dem HPLC-Verfahren ermittelt wurden, sind auf der waagerechten, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ermittelten Konzentrationen auf der senkrechten Achse eingetragen. Es wurde eine gute Korrelation zwischen den beiden Methoden beobachtet; es ergab sich eine Korrelationsgleichung von y = 1,63 + 0,69x und ein Korrelationskoeffizient von r = 0,907. Somit bestätigte sich der Trend der Übereinstimmung der HbA1c%-Messungen zwischen der Methode der vorliegenden Erfindung und der konventionellen HPLC-Methode.

Beispiel 3: Intra-Assay- und Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit der oben beschriebenen einstufigen Immunoassay- Methode wurde mit Hilfe von Proben von Patienten mit vier verschiedenen HbA1c- Konzentrationen bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit war gut; sie hielt sich für alle Konzentrationen innerhalb des Bereichs von 3,5 bis 4,3%.

Die Inter-Assay-Reproduzierbarkeit wurde mit Proben von zwei verschiedenen Konzentrationen beurteilt; es ergaben sich günstige Resultate (4% oder weniger), wie in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Beispiel 4: Einrichtung eines 10-Minuten-Assay-Systems

Obwohl die einstufige Immunoassay-Methode aus den Beispielen 1 bis 3 eine Inkubationszeit von nur 40 Minuten benötigt, wurde diese Methode so weiterentwickelt, daß die Inkubationszeit auf 10 Minuten gesenkt werden konnnte. Dazu wurde der Immunoassay mit der Alkali- Phosphatase markierten Anti-HbA1c-Antikörper-Lösung aus Beispiel 1 durchgeführt, deren Konzentration auf 5 mA erhöht worden war. Die Standardkurve für diese Methode ist in Fig. 3 dargestellt. Die Konzentration der Eichproben (bestimmt mit dem Glycohämoglobin- Analyzer) ist auf der waagerechten Achse eingetragen, während die 4-MU-Bildungsrate (durch die Einwirkung der Alkali-Phosphatase) auf der senkrechten Achse eingetragen sind. Weiterhin sind in Fig. 4 die Resultate zur Untersuchung der Korrelation zwischen der konventionellen HPLC-Methode und diesem 10-Minuten-Assay-System unter Verwendung der gleichen Proben von Patienten wie in Beispiel 2 dargestellt. Dies sind die Meßergebnisse für Material von 50 Patienten. Die mit der konventionellen Methode (HLC-723GHbIII) ermittelten HbA1c%-Konzentrationen sind auf der waagerechten, die Meßergebnisse nach der Methode der vorliegenden Erfindung auf der senkrechten Achse eingetragen. Die Korrelation mit der HPLC-Methode war gut; es ergab sich eine Korrelationsgleichung von y = 0,579x + 1,125 und ein Korrelationskoeffizient von r = 0,933.

Die Untersuchung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit in diesem 10-Minuten-Assay- System (Beispiel 3) geschah in der gleichen Weise wie beim 40-Minuten-Assay-System, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt, während die Ergebnisse der Inter-Assay- Reproduzierbarkeit in Tabelle 4 gezeigt werden.

Tabelle 3
Tabelle 4

Die Ergebnisse waren gut; es ergab sich eine Intra-Assay-Reprodzuzierbarkeit von 2,7 bis 4,0% und eine Inter-Assay-Reproduzierbarkeit von weniger als 4%. Die Korrelation zwischen dem 40-Minuten-System aus Beispiel 2 und diesem 10-Minuten-Assay-System war ebenfalls gut; es ergab sich eine Korrelationsgleichung von y = 0,493 + 0,721x und r = 0,921

Beispiel 5: Reaktivität mit Hämoglobinvarianten

Es wurde die Messung der Konzentration glycosylierter Hämoglobinvarianten mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode der vorliegenden Erfindung versucht. Dazu wurden sechs Hämoglobinvarianten beschafft (UBE2, HAMADEN, TAKAMATSU, CAPE TOWN, RIYADH UND HIKARI; davon sind UBE2 und CAPE TOWN α-Ketten-Varianten, während die übrigen β-Ketten-Varianten sind). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Name HbA1c% Meßergebnisse nach der vorliegenden Erfindung (40-Minuten-System)

UBE2 4,62

HAMADEN 2,13

TAKAMATSU 0

CAPE TOWN 0,22

RIYADH 0,42

HIKARI 0,78

Die Ergebnisse zeigen, daß diese Hämoglobin-Varianten mit dem vorliegenden Verfahren überhaupt nicht erkannt werden, woraus sich schließen läßt, daß das vorliegende Verfahren für normales HbA1c spezifisch ist und von der Anwesenheit von Hämoglobin-Varianten überhaupt nicht beeinträchtigt wird.

Beispiel 6: Vergleich verschiedener Vorbehandlungslösungen

Es wurden 580 ul Vorbehandlungslösung A in 0,1 M Succinatpuffer (pH 5,03), enthaltend 0,1% Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; oder 580 ul Vorbehandlungslösung A in destilliertem Wasser (pH 7,15), enthaltend 0,1% Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; zu jeweils 20 ul Blutproben (vollständiges Blut) von normalen Erwachsenen zugegeben, wobei EDTA als Gerinnungshemmer verwendet wurde. Die Gemische wurden umgerührt und 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um die Hämolyse stattfinden zu lassen. Diese Lösungen wurden dann als Probelösungen für den Immunoassay verwendet. Der Einstufen-Immunoassay wurde mit dem AIA-1200 wie in Beispiel 4 ausgeführt, um die HbA1c-Konzentrationen zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6

Wie aus der Tabelle klar hervorgeht, führt eine Vorbehandlung unter schwach sauren Bedingungen zu einer höheren 4-MU-Bildungsrate.

Die HbA1c-Konzentration der Blutprobe, gemessen mit einem Glycohämoglobin-Analyzer (HLC-723GbIII, Tosoh) betrug 5,4%.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Messung von Hämoglobin A1c, umfassend die Schritte des gleichzeitigen Inkontaktbringens einer Probe, die das zu messende Hämoglobin A1c enthält, mit einer Festphase und einem markierten Anti-Hämoglobin A1c- Antikörper, resultierend in der Bindung des markierten Anti-Hämoglobin A1c- Antikörpers mit dem Hämoglobin A1c, welches an der Festphase immobilisiert ist, der Trennung des erhaltenen immobilisierten markierten Anti-Hämoglobin A1c-Antikörpers vom markierten Anti-Hämoglobin A1c-Antikörper in Lösung und des Nachweises der Markierung des immobilisierten Anti-Hämoglobin A1c- Antikörpers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Vorbehandlung der Probe unter schwach sauren Bedingungen durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die schwach sauren Bedingungen einen pH- Wert von 3,0 bis 6,9 bedeuten.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei ein aliphatischer Carbonsäure- oder ein Boratpuffer für die Vorbehandlung der Probe verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der aliphatische Carbonsäurepuffer ein Succinat-, Malonat-, Fumarat-, Maleat-, Glutarat- oder Acetatpuffer ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Probe eine Blutprobe ist und eine Hämolyse der Probe vor oder gleichzeitig mit der Vorbehandlung durchgeführt wird.







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