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Dokumentenidentifikation DE69720410T2 27.11.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0862918
Titel Therapeutisches Mittel zur Behandlung hartnäckiger Hundedermatitis
Anmelder Toray Industries, Inc., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Uchino, Tomiya, Tokyo, JP;
Yamada, Katsushige, Nishikasugai-gun, JP;
Okano, Fumiyoshi, Nagoya-shi, JP;
Satoh, Masahirro, Kanagawa, JP;
Kawakami, Isao, Tokyo, JP
Vertreter Kador und Kollegen, 80469 München
DE-Aktenzeichen 69720410
Vertragsstaaten CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 24.12.1997
EP-Aktenzeichen 971228648
EP-Offenlegungsdatum 09.09.1998
EP date of grant 02.04.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.11.2003
IPC-Hauptklasse A61K 38/21

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines therapeutischen Mittels, das aus Interferon-γ vom Hund besteht, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis.

Allgemeiner Stand der Technik

Interferon-γ (hier nachstehend als "IFN" bezeichnet) wird hauptsächlich von T-Zellen erzeugt und hat bekanntlich drei hauptsächliche Funktionen, d. h. eine antivirale Aktivität, eine Aktivität gegen die Zellproliferation bzw. -wucherung und die Immunosteuerung (Referenz 1). Mit der neuesten Entwicklung in der Genmanipulationstechnik wurden nicht nur Human-LFN-Gene sondern auch IFN-Gene vom Tier, wie vom Rind, Pferd und der Katze, abgetrennt, und in bezug auf Hunde wurde von IFN-α, -β und -γ berichtet (Referenzen 2 und 3). Im Vergleich mit Human-IFN-γ oder IFN-γ von der Maus wurden jedoch aus in vitro und in vivo Untersuchungen bei IFN-γ vom Hund nur wenige Erkenntnisse erhalten (Referenz 12), und es gibt keinen Bericht, IFN-γ vom Hund als therapeutisches Mittel für bestimmte Hundekrankheiten zu verwenden.

Beim Menschen wurde IFN-γ bereits als therapeutisches Mittel für bösartige Tumore praktisch verwendet, und in Hinblick auf Hauterkrankungen berichteten Hanifin et al. (Referenz 4) und Rheinhold et al. (Referenzen 5 und 6) und WO 91/07984 von dessen Wirksamkeit bei der Behandlung von atopischer Dermatitis und einem von Steroiden abhängigem Asthma. Aus folgenden Gründen gibt es jedoch in Hinblick auf die Verwendung von Human-IFN-γ für atopische Dermatitis beim Menschen Zweifel (Referenz 7): für die effektive Behandlung atopischer Dermatitis beim Menschen mit Human-IFN-γ ist eine tägliche Verabreichung sechs Wochen hintereinander oder länger erforderlich; IFN-γ hat Nebenwirkungen, wie Fieber und Kopfschmerz, und führt bei den Patienten zu einer ziemlich starken Belastung, wohingegen seine Wirkungen relativ gering sind; und IFN-γ-Formulierungen sind teuer. Bei der Dermatitis beim Menschen wurden Diagnosekriterien aufgestellt (Referenz 8), und ein genetischer Hintergrund wird als wichtiges Kriterium angesehen. Außerdem ist bekannt, daß atopische Dermatitis beim Menschen eine allergische Reaktion vom Typ I ist, bei der die Erzeugung einer Überschußmenge von IgE als Reaktion auf Lebensmittel, Schuppen von Tieren, Insektengiften und dergleichen sehr stark beteiligt ist (Referenz 9). Es gab jedoch keine systematischen Untersuchungen zur atopischen Hundedermatitis (Referenz 13). Deshalb sind die Auswertungskriterien unklar, und der Zusammenhang zwischen der Erzeugung eines IgE-Überschusses beim Hund und der atopischen Dermatitis ist nicht klar.

Im allgemeinen schließen Hauterkrankungen von Hunden Ekzeme, Urtikarie, allergische Dermatitis, traumatische Dermatitis, Räude, Gehörgangsentzündung, eine den Pruritus betreffende Dermatitis und dergleichen ein. Herkömmlich wurden für die vorstehend genannten Erkrankungen folgende Mittel verwendet: Antihistamine (Diphenhydramine), Antiphlogistika (Dibucainhydrochlorid, usw.), Insektizide und Bakteriozide (Malathion, Benzalkoniumchlorid, usw.) und Steroide (Dexamethason, usw.).

Bei den herkömmlichen therapeutischen Mitteln, die für die Behandlung von Hauterkrankungen beim Hund verwendet wurden, gibt es jedoch bei der Verwendung von nicht-steroiden Mitteln Nachteile, da deren Wirkungen unzureichend sind und deren therapeutische Effekte sehr gering sind, und obwohl steroide Mittel extrem starke pharmakologische Effekte haben, zeigen sie gelegentlich Nebenwirkungen, wie eine Zunahme von Infektionen in den erkrankten Bereichen und eine verstärkte Brüchigkeit der Gefäßwände, und bei einer Langzeitanwendung können sie aufgrund von Einflüssen auf andere Organe zur Fettsucht oder systematischen Nebenwirkungen führen.

Im allgemeinen können Hauterkrankungen beim Hund als auch beim Menschen wegen der schlechten häuslichen Bedingungen nicht geheilt werden; deshalb werden Hunde häufig mit wiederholten Dosen der vorstehend beschriebenen herkömmlichen therapeutischen Mittel behandelt. Die Behandlungszeiträume sind somit lang, und gelegentlich werden die Erkrankungen nicht vollständig geheilt, selbst wenn die Behandlung mehr als ein halbes Jahr andauert, und in einigen Fällen wird die Behandlung über einige Jahre ausgedehnt, was zu einer starken Belastung für den Hundebesitzer führt. Deshalb besteht Bedarf nach einem therapeutischen Mittel mit einer starken und anhaltenden Wirkung bei hartnäckiger Hundedermatitis, die durch eine Langzeitbehandlung mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln nicht vollständig geheilt werden kann.

Somit besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines wirksamen therapeutischen Mittels für hartnäckige Hundedermatitis.

Offenbarung der Erfindung

Die hier genannten Erfinder gelangten zur vorliegenden Erfindung, indem sie feststellten, daß Hauterkrankungen beim Hund, die nach dem Stand der Technik schwer geheilt werden konnten, deutlich verbessert wurden, wenn eine Formulierung von IFN-γ vom Hund verabreicht wird. Mit anderen Worten besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines therapeutischen Mittels, das IFN-γ vom Hund als Wirkstoff enthält, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis.

Beste Art und Weise der Durchführung der Erfindung

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete IFN-γ vom Hund ist zum Beispiel ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 dargestellt ist. Selbst wenn diese Aminosäuresequenz die Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten aufweist, liegt das Polypeptid jedoch innerhalb der vorliegenden Erfindung, solange es die biologische Aktivität des ursprünglichen IFN-γ zeigt, wie sie in der Referenz 1 angegeben ist, der Grund ist, daß das Polypeptid in diesem Fall als mit der vorliegenden Erfindung ähnlichen Effekten angesehen wird.

Obwohl IFN-γ vom Hund durch ein Isolations- und Reinigungsverfahren von natürlichen Biomaterialien, durch chemische Synthese oder durch Genrekombinationsverfahren erzeugt werden kann, ist die Verwendung von IFN-γ vom Hund, das durch Genrekombinationsverfahren erzeugt worden ist, aus ökonomischer Sicht bevorzugt. Das Verfahren zur Herstellung von IFN-γ vom Hund durch Genrekombinationsverfahren ist nicht besonders begrenzt, IFN-γ von. Hund kann zum Beispiel hergestellt werden, indem Wirtszellen oder Wirtstiere verwendet werden, in die ein Gen, das die Aminosäuresequenz von IFN-γ vom Hund, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 dargestellt ist, vollständig oder teilweise codiert, durch ein bereits anerkanntes herkömmliches Verfahren aufgenommen worden ist. Zum Beispiel kann nach der Proliferation von Escherichia coli, in die die cDNA der ganzen oder eines Teils der Basensequenz von IFN-γ vom Hund, die in der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 gezeigt ist, aufgenommen worden ist, IFN-γ vom Hund durch Abtrennung und Reinigung von Bakterienzellen oder Überständen von Bakterienkulturen erhalten werden. Nach der Infektion einer gezüchteten Insektenzellinie, wie Zellen von Spondoptera frugiperda und Bombyx mori oder Seidenraupen mit dem Baculovirus, in die die cDNA der gesamten oder eines Teils der Basensequenz von IFN-γ vom Hund, die in der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 gezeigt ist, aufgenommen worden ist, kann zudem IFN-γ vom Hund durch Abtrennung und Reinigung aus den gezüchteten Zellen, den Überständen von Zellkulturen oder der Hämolymphe der Seidenraupen erhalten werden. In den vorstehenden Fällen ist die Basensequenz des IFN-γ vom Hund nicht auf die Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 begrenzt, solange sie in die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 aufgenommen werden kann. Außerdem kann IFN-γ vom Hund, das der vorliegenden Erfindung ähnliche Effekte hat, unter Verwendung der cDNA erzeugt werden, die eine ein Polypeptid kodierende Basensequenz hat, selbst wenn die Aminosäuresequenz eine Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäurenresten aufweist.

Das Verfahren zur Isolation und Reinigung von IFN-γ vom Hund, das durch Genrekombinationsverfahren erzeugt worden ist, ist nicht besonders begrenzt, und es können herkömmliche Proteinreinigungsverfahren angewendet werden. Mit der antiviralen Aktivität von IFN-γ vom Hund als Index kann IFN-γ vom Hund zum Beispiel gereinigt und abgetrennt werden, wenn die folgenden Verfahren zum Entsalzen oder Konzentrieren kombiniert werden: Chromatographie unter Verwendung von Kieselgelträgern, Ionenaustauschträgern, Gelfiltrationsträgern, Chelatträgern, Pigment-Ligand-Trägern oder dergleichen; Ultrafiltration; Gelfiltration; Dialyse; Aussalzen und dergleichen. Im vorstehend genannten Verfahren kann die antivirale Aktivität von IFN-γ vom Hund nach dem CPE-Verfahren der Referenz 10 gemessen werden, wobei der vesikuläre Stomatitisvirus (VSV) als Virus und MDCK vom Hund (ATCC CCL-34) als empfindliche Zellen verwendet werden.

In der vorliegenden Erfindung wird die hartnäckige Hundedermatitis als eine Gruppe von Hauterkrankungen definiert, die durch Behandlung mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln für Hauterkrankungen beim Hund über mindestens mehr als ein halbes Jahr nicht deutlich verbessert werden oder die wieder auftreten, nachdem die Symptome einmal vermindert worden waren; Beispiele herkömmlicher therapeutischer Mittel für die Behandlung von Hauterkrankungen beim Hund sind folgende: von außen auf die Haut aufgebrachte bakteriozide Desinfektionsmittel, Antihistamine, Steroidhormone, Analgetika, Antipuriginosa, Adstringens, entzündungshemmende Mittel und Mittel für parasitäre Hauterkrankungen. Die hartnäckige Hundedermatitis wird durch Steroidhormone häufig nicht deutlich verbessert, oder selbst wenn die Symptome geringer werden, treten sie nach dem Ende der Verabreichung bald wieder auf. Hartnäckige Hundedermatitis schließt allergische Dermatitis, Pemphigus, hypertrophe Dermatitis, Mycodermatitis, atopische Dermatitis, hartnäckiges Arzneimittelexanthem und dergleichen ein.

Zusätzlich zum IFN-γ vom Hund kann das therapeutische Mittel für hartnäckige Hundedermatitis, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wahlfrei andere Komponenten enthalten. Die dem Mittel zugesetzten Komponenten werden hauptsächlich in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg bestimmt. Wenn das Mittel als Feststoff verwendet wird, können zum Beispiel Füllstoffe, wie Lactose, Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und Gelatine, Färbemittel und Beschichtungsmittel, verwendet werden; ein solches Mittel, das in fester Form vorliegt, kann für die orale Verabreichung geeignet sein. Außerdem kann das Mittel eine Formulierung sein, die extern auf die Schädigungen aufgebracht wird, wie eine Creme, eine Lotion, ein Latex und dergleichen, indem Träger oder Exzipientien, wie weißes Petrolatum, Cellulosederivate, oberflächenaktive Mittel, Polyethylenglycol, Silicon oder Olivenöl, zugesetzt werden. Wenn das Mittel als Flüssigkeit verabreicht wird, kann es im allgemeinen verwendete physiologisch verträgliche Lösungsmittel, Emulgatoren und Stabilisatoren enthalten.

Beispiele von Lösungsmitteln sind Wasser, PBS und eine isotonische physiologische Kochsalzlösung; Beispiele der Emulgatoren sind oberflächenaktive Mittel aus Polyoxyethylen, oberflächenaktive Mittel aus einer Fettsäure und Silicon; und Beispiele der Stabilisatoren sind Proteine, wie Serumalbumin vom Hund, und Gelatine, Polyole, wie Polyethylenglycol und Ethylenglycol, und Saccharide, wie Sorbitol und Trehalose. Obwohl der Verabreichungsweg des erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels nicht besonders begrenzt ist, können durch Injektion stärkere therapeutische Wirkungen erwartet werden. Es kann irgendein Injektionsverfahren angewendet werden, einschließlich der intravenösen Verabreichung, der intramuskulären Verabreichung, der subkutanen Verabreichung, der intraperitonealen Verabreichung und der intrapleuralen Verabreichung, die subkutane Verabreichung ist jedoch bevorzugt, da deren Verfahren einfach ist und bei den erkrankten Hunden weniger Streß hervorruft.

Obwohl die Behandlungsdosis je nach Größe des Individuums, Verabreichungsweg, Symptomen und dergleichen geeignet bestimmt wird, wird im allgemeinen eine Dosierung verabreicht, die ausreicht, um die Symptome der hartnäckigen Hundedermatitis zu verringern. Im Hinblick auf die Effektivität und aus ökonomischer Sicht zeigt zum Beispiel eine Verabreichung von 0,002 bis 1,0 ME/kg IFN-γ vom Hund und vorzugsweise von 0,005 bis 0,5 ME/kg pro Tag ausreichende Wirkungen. Vorstehend ist kg die Einheit für das Gewicht des erkrankten Hundes und U ist eine Zahleneinheit, die durch die antivirale Aktivität von IFN-γ bestimmt wird, die nach dem CPE-Verfahren der Referenz 10 wie folgt gemessen wird, wobei der vesikuläre Stomatitisvirus (VSV) als Virus und MDCK vom Hund (ATCC CCL-34) als empfindliche Zellen verwendet werden: die Menge von IFN-γ, die die zytopatische Wirkung von VSV gegen MDCK vom Hund (ATCC CCL- 34) um 50% verringern kann, wird als eine Einheit definiert.

Außerdem wird auch die Häufigkeit der Verabreichung in Abhängigkeit von der Größe des Individuums, dem Verabreichungsweg, den Symptomen und dergleichen bestimmt, es wird jedoch allgemein angenommen, daß durch die ein- oder zweimalige Verabreichung pro Woche die Symptome in der zweiten Woche nach Beginn der Behandlung deutlich abnehmen. Obwohl es möglich ist, die Häufigkeit oder die Anzahl der Verabreichung zu verändern, wobei der Behandlungsverlauf beobachtet wird, ist in Hinblick auf das Ausmaß der Belastung für den Hundebesitzer und die therapeutische Wirkung eine zwei- bis zehnmalige Verabreichung alle zwei Tage oder sieben Tage bevorzugt.

Bei diesem Behandlungsverfahren kann ein herkömmliches therapeutisches Mittel für die Behandlung von Hauterkrankungen beim Hund hilfsweise in Kombination verwendet werden. In diesem Fall werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten therapeutischen Mittel mit anderen Mitteln verabreicht, die aus Antihistaminen (Diphenhydraminen), Antiphlogistica (Dibucainhydrochlorid, usw.), Insektiziden und Bakterioziden (Malathion, Benzalkoniumchlorid, usw.), Steroiden (Dexamethason, usw.) und dergleichen ausgewählt sind.

Wie vorstehend ausführlich erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines therapeutischen Mittels für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis bereit, das als Wirkstoff IFN-γ vom Hund aufweist. Durch die Verabreichung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten therapeutischen Mittels können Hauterkrankungen beim Hund, die durch herkömmliche therapeutische Mittel für Hundedermatitis schwer geheilt werden konnten, wirksam ohne Nebenwirkungen behandelt werden.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele ausführlicher erläutert, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt.

BEISPIEL 1 Messung der antiviralen Aktivität von IFN-γ vom Hund

Die antivirale Aktivität von IFN-γ vom Hund wurde grundsätzlich nach dem in der Referenz 10 beschriebenen Verfahren gemessen, wobei MDCK-Zellen vom Hund (ATCC CCL-34) und der VSV verwendet wurden. Mit anderen Worten wurde eine verdünnte Lösung einer Probe, die IFN-γ vom Hund enthielt, MDCK-Zellen vom Hund (ATCC CCL- 34) zugegeben, die bei 37ºC auf einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen gezüchtet worden waren, bis sie den Zusammenfluß erreichten, und die Zellen wurden dann außerdem 20 bis 24 Stunden bei 37ºC inkubiert, wodurch die antivirale Aktivität eingeleitet wurde. Die Zellen wurden mit dem VSV gemischt und 24 Stunden bei 37ºC gezüchtet, die lebenden MDCK-Zellen vom Hund, die an der Mikroplatte hafteten, wurden mit einer Kristallviolettlösung gefärbt, die 20% Formalin enthielt. Die Menge des Kristallvioletts auf der Mikroplatte wurde durch Messen der Absorption bei 570 nm erhalten, um die Menge von IFN-γ vom Hund auszuwerten, bei der 50% der Zellen am Leben waren. Die erhaltene Menge von IFN-γ vom Hund wurde als eine Einheit (1 E) der antiviralen Aktivität definiert.

BEISPIEL 2 Produktion von IFN-γ vom Hund durch Escherichia coli dessen DNA IFN-γ vom Hund codiert

Nach einem herkömmlichen Verfahren wurde die cDNA von IFN-γ vom Hund, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 5 angegeben ist, in pET8c eingefügt, das ein Manifestationsvektor von Escherichia coli ist, und dann wurde Escherichia coli HB101 nach einem herkömmlichen Verfahren transformiert. Die erhaltenen Transformanten wurden in ein LB-Medium geimpft, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Transformanten wurden bei 37ºC gezüchtet, bis der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert etwa 0,7 erreichte, wurden mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM gemischt und dann weitere 1,5 h gezüchtet. Die erhaltenen 11 l des Kulturmediums wurden 5 Minuten mit 200 s&supmin;¹ (12000 U/min) zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen, der Rest wurde in 60 ml 10 mM Tris-Cl (pH = 7,5) suspendiert, und die bakteriellen Zellen wurden durch Beschallen auf Eis vollständig aufgebrochen. Das entstandene Produkt wurde 30 Minuten mit 333 s&supmin;¹ (20000 U/min) zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen, wodurch 54 ml einer löslichen Proteinfraktion erhalten wurden. Diese Fraktion wies eine antivirale Aktivität von nicht weniger als 10&sup6; E/ml auf.

BEISPIEL 3 Erzeugung von IFN-γ vom Hund durch Zellen von Bombyx mori oder Seidenraupen, die beide eine DNA aufweisen, die IFN-γ vom Hund codiert

Nach einem herkömmlichen Verfahren wurde die cDNA von IFN-γ vom Hund, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 angegeben ist, in einem Vektor (Referenz 11) aufgenommen, wodurch ein rekombinantes Plasmid pBMγ erhalten wurde. Rekombinante Baculoviren wurden nach dem Verfahren der Referenz 11 präpariert. Mit anderen Worten wurden sowohl die DNA des Kerns des Stammes BmNPV T3 des Polyhedrosevirus von Bombyx mori (Referenz 11) als auch die DNA des rekombinanten Plasmids pBMγ für die Cotransfektion in Zellen von Bombyx mori, Bm-N-Zellen nach dem Calciumphosphatverfahren, verwendet und danach wurden rekombinante Baculoviren rBNVγ mit einer DNA, die IFN-γ vom Hund codiert, durch ein eingeschränktes Lösungsverfahren mit folgender Tatsache als Index geklont: mikroskopisch, wenn eine Virusinfektion beobachtet wurde und wenn keine Polyhedrinpartikel entstanden. Jeweils 0,5 ml der Lösung des erhaltenen rekombinanten Virus wurden zu etwa 3 · 10&sup6; Bm-N-Zellen gegeben, die in einem 25 cm² Gewebekulturkolben im Medium TC- 100, das 10% FBS enthielt, gezüchtet worden waren. Nach 30 Minuten wurde das Medium durch 5 ml frisches Medium TC-100, das 10% FBS enthielt, ersetzt und 3 Tage bei 27ºC gezüchtet. Der zentrifugierte Überstand des Mediums wurde aufgefangen und es zeigte sich, daß er eine antivirale Aktivität von 10&sup4; E/ml aufwies.

Seidenraupen erhielten am zweiten Tag ihres fünften Stadiums eine Injektion von 50 ul/Raupe der Flüssigkeit des rekombinanten Baculovirus rBNVγ mit einer DNA, die IFN-γ vom Hund codiert, sie erhielten 4 Tage bei 25ºC eine handelsübliche künstliche Nahrung (Kanebo Silk Elegance Co.), dann wurde der Unterbauch von zehn dieser Seidenraupen aufgeschnitten, um ihre Hämolymphe in einem Eppendorf- Röhrchen aufzufangen, das auf Eis gekühlt wurde. Die entstandene Hämolymphe wurde zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde durch Filtration mit einem 0,22 um Filter sterilisiert, was zu einer gemessenen antiviralen Aktivität von 10&sup7; E/ml führte.

BEISPIEL 4 Herstellung von IFN-γ vom Hund

20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) wurden verwendet, um eine zweifache Verdünnung von 50 ml der in Beispiel 2 erhaltenen löslichen Proteinfraktion zu erhalten, und danach wurde sie in eine Säule gegeben, die mit 20 ml Kieselgel gepackt war, das mit dem gleichen Puffer ausgeglichen worden war; die Säule wurde mit einer ausreichenden Menge 20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) gewaschen. Die absorbierten Komponenten wurden mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) eluiert, der 3 M Ammoniumchlorid und 5% Polyethylenglycol enthielt, wodurch 45 ml Eluat aufgefangen wurden. Das erhaltene Eluat enthielt etwa 30 mg Protein, und die Proteinausbeute betrug etwa 30%. Nachdem 40 ml des Eluats zweimal mit dem 10-fachen Volumen von 20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) dialysiert worden waren, wurde das entstandene Produkt in eine Säule gegeben, die mit 10 ml SP Sepharose FF gepackt war, und die Säule wurde mit 100 ml 20 mM Phosphat- Puffer (pH = 7,0) gewaschen. Die absorbierten Komponenten wurden mit einem Gradienten der NaCl-Konzentration eluiert, wodurch eluierte Fraktionen aufgefangen wurden, die IFN-γ vom Hund enthielten. Die erhaltene Eluatfraktion enthielt etwa 15 mg Protein, und die Reinheit des IFN-γ vom Hund betrug etwa 30%. Das Eluat wurde außerdem nach einem ähnlichen Verfahren erneut chromatographiert, und das erhaltene Eluat wurde nach einem herkömmlichen Verfahren entsalzt, wobei eine Gelfiltrationssäule verwendet wurde, die mit 80 ml Sephadex G-25 gepackt war, wodurch 10 ml einer gereinigten Fraktion von IFN-γ vom Hund erhalten wurden. Durch die Analyse mittels SDS-PAGE wurde nachgewiesen, daß diese Fraktion 5 mg Protein enthielt und die Reinheit des IFN-γ vom Hund nicht weniger als 80% betrug.

Etwa 2 mg des IFN-γ vom Hund, das eine Reinheit von mehr als 85% aufwies, wurden aus 100 ml der in Beispiel 3 erhaltenen Hämolymphe von der Seidenraupe erhalten, in der die rekombinanten Baculoviren inaktiviert worden waren.

BEISPIEL 5 Herstellung einer Formulierung von IFN-γ vom Hund

Eine physiologische Kochsalzlösung für die Injektion, Gelatine mit geringem Molekulargewicht für die Injektion (Nitta Gelatin Inc.) und Sorbitol wurden zu der in Beispiel 4 erhaltenen gereinigten Lösung von IFN-γ vom Hund gegeben, bis eine Endkonzentration von Gelatine von 0,5% und eine Endkonzentration von Sorbitol von 30% erreicht wurde. Das entstandene Produkt wurde dann mit POSIDYNE (Poll Filtron Co.) behandelt, um Pyrogene zu entfernen, und jeweils 1 ml Filtrat wurde in Glasampullen gegeben, die 2 Stunden durch trockene Wärme mit 250ºC sterilisiert worden waren. Durch aseptisches Gefriergetrocknen wurde dann eine Formulierung von IFN-γ vom Hund erhalten, wobei jede Ampulle 0,1 bis 2,5 ME IFN-γ vom Hund enthielt. Diese Formulierung von IFN-γ vom Hund war im Dunklen bei Raumtemperatur stabil und in Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung stark löslich.

BEISPIEL 6 Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis durch IFN-γ vom Hund

Für diese Untersuchung wurden Hunde benutzt, die 0,5 bis 7 Jahre mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln behandelt worden waren, ohne daß sie eine deutliche Verringerung der Symptome der Hauterkrankungen zeigten oder bei denen sie immer wieder auftraten. Die Hunde für diese Untersuchung schlossen jene ein, die die Komplikation einer Mykose aufwiesen, die vermutlich auf die nachteiligen Einflüsse von Steroidhormonen zurückzuführen ist. Die in Beispiel 5 hergestellte Formulierung von IFN-γ vom Hund wurde für die Injektion in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und den Hunden subkutan verabreicht; die therapeutischen Wirkungen wurden ausgewertet, indem die klinischen Symptome der Hauterkrankungen und Nebenwirkungen beobachtet wurden. Tabelle 1 zeigt die Dosis pro Verabreichung und das Verabreichungsschema. Die Schwere der Hauterkrankungen der Hunde wurde wie folgt ausgewertet: 6 Parameter, d. h. Erythem, Papel, Ekzem, Flechte, Exkoriation und Schuppen wurden mit 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig) und 3 (stark) bewertet; die Bewertungen der Parameter insgesamt wurden als gesamte klinische Schwere definiert. Die therapeutischen Effekte wurden anhand der Schwere der klinischen Symptome ausgewertet. Die therapeutischen Effekte sind in Tabelle 1, die eine Formulierung von IFN-γ vom Hund betrifft, die aus Escherichia coli hergestellt worden war, und in Tabelle 3 gezeigt, die die von Seidenraupen zeigt.

Wie aus den Tabellen 1 und 3 deutlich wird, war bei jedem für diese Untersuchung verwendeten Hund die klinische Schwere der Hauterkrankungen deutlich verringert worden, was darauf hinweist, daß IFN-γ vom Hund für die Behandlung von Hauterkrankungen äußerst wirksam ist. Außerdem waren die Symptome der in der Tabelle 1 aufgeführten fünf Hunde durch die Steroidhormon-Therapie nicht merklich abgeschwächt worden, von der angenommen wird, daß sie von den herkömmlichen therapeutischen Mitteln das wirksamste darstellt, oder zeigten bald nach Abbruch der Verabreichung von Steroidhormonen ein erneutes Auftreten, die Symptome wurden jedoch durch ein- oder zweimalige Verabreichung des erfindungsgemäßen LFN-γ vom Hund schnell geheilt. Außerdem wurden bei keinem dieser fünf Hunde irgendwelche Nebenwirkungen mit klinischer Bedeutung beobachtet.

BEISPIEL 7 Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis durch IFN-γ vom Hund in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln.

Ähnlich wie in Beispiel 6 wurden für diese Untersuchung Hunde benutzt, die mindestens ein halbes Jahr mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln behandelt worden waren, ohne daß sie eine merkliche Verringerung der Symptome der Hauterkrankungen zeigten oder bei denen es immer wieder zum Auftritt der Krankheit kam. Die Tests und die therapeutische Auswertung der Wirkung erfolgte nach ähnlichen Verfahren, wie sie in Beispiel 6 beschrieben sind, außer daß die in Tabelle 2 gezeigten therapeutischen Mittel in Kombination mit der in Beispiel 5 hergestellten Formulierung von IFN-γ vom Hund verwendet wurden. Anhand der in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse wird klar, daß IFN-γ vom Hund die klinischen Symptome aufgrund der hartnäckigen Hundedermatitis schnell verringert und effektiv ist, selbst wenn es in Kombination mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln verwendet wird. Außerdem geht der Trend dahin, daß IFN-γ vom Hund bei einer geringeren Dosis im Vergleich mit Beispiel 6 ausreichende therapeutische Effekte zeigt, wenn es in Kombination mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln verwendet wird. Außerdem wurden Nebenwir kungen aufgrund der kombinierten Therapie nicht besonders beobachtet.

Tabelle 1 (1) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (IFN-γ vom Hund allein)

1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.

2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).

Tabelle 1 (2) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (IFN-γ vom Hund allein)

1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.

2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).

Tabelle 2 (1) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (Kombination mit einem (mehreren) herkömmlichen therapeutischen Mittel(n))

1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.

2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).

Tabelle 2 (2) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (Kombination mit einem (mehreren) herkömmlichen therapeutischen Mittel(n))

1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.

2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).

Tabelle 3 (1) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (IFN-γ vom Hund allein)

1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.

2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).

Tabelle 3 (2) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (IFN-γ vom Hund allein)

1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.

2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).

Zitierte Referenzen

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13. Frank et al.: Clinics in Dermatology, 12, 565-571 (1994)

SEQUENZLISTE

INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 498 Basenpaare

(B) TYP: Nucleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA

(vi) ORIGINALQUELLE:

(A) ORGANISMUS: Hund

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(xi) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 2

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 498 Basenpaare

(B) TYP: Nucleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA

(vi) ORIGINALQUELLE:

(A) ORGANISMUS: Hund

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(xi) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 3

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 498 Basenpaare

(B) TYP: Nucleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA

(vi) ORIGINALQUELLE:

(A) ORGANISMUS: Hund

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(xi) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:

INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 4

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 498 Basenpaare

(B) TYP: Nucleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA

(vi) ORIGINALQUELLE:

(A) ORGANISMUS: Hund

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(xi) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:

INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 5

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 435 Basenpaare

(B) TYP: Nucleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA

(vi) ORIGINALQUELLE:

(A) ORGANISMUS: Hund

(xi) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..435

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:

INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 6

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 432 Basenpaare

(B) TYP: Nucleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA

(vi) ORIGINALQUELLE:

(A) ORGANISMUS: Hund

(xi) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid

(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..432

Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:

Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6:


Anspruch[de]

1. Verwendung von Interferon-γ vom Hund oder eines Polypeptids mit der gleichen biologischen Aktivität wie Interferon-γ vom Hund mit einer Aminosäuresequenz, bei der einer oder mehrere Aminosäurereste der Sequenz von Interferon-γ vom Hund ersetzt, eingefügt oder deletiert worden sind, für die Herstellung eines Medikamentes für die therapeutische Behandlung von allergischer Hundedermatitis, Pemphigus, hypertropher Dermatitis, Mycodermatitis und hartnäckigem Arzneimittelexanthem.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interferon-γ vom Hund oder das Polypeptid durch ein Genrekombinationsverfahren erzeugt wird.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Interferon-γ vom Hund oder das Polypeptid unter Verwendung von Zellen von Escherichia coli, Bombyx mori oder von Seidenraupen erzeugt worden ist, in die jeweils ein Gen aufgenommen worden ist, das eine Aminosäuresequenz von Interferon-γ vom Hund oder das Polypeptid codiert.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das therapeutische Mittel Interferon-γ vom Hund oder das Polypeptid und ein Protein und/oder ein Saccharid enthält.







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