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Dokumentenidentifikation DE69811628T2 18.12.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0937735
Titel Verfahren zur Entfernung von Erregern übertragbarer spongiformer Encephalophatien aus Proteinlösungen
Anmelder ZLB Bioplasma AG, Bern, CH
Erfinder Morgenthaler, Jean-Jacques, 3067 Boll, CH;
Maring, Jacques-Andre, 3053 Münchenbuchsee, CH;
Rentsch, Markus, 3400 Burgdorf, CH
Vertreter Weickmann & Weickmann, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69811628
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.02.1998
EP-Aktenzeichen 988101085
EP-Offenlegungsdatum 25.08.1999
EP date of grant 26.02.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 18.12.2003
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 14/47   B01D 15/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Entfernung von Agentien, welche übertragbare spongiforme Enzephalopthien (TSE) verursachen, aus Proteinlösungen, insbesondere aus Blutprodukten, welche für therapeutische oder andere medizinische Zwecke verwendet werden. Die Proteinlösung wird in Kontakt mit einem Adsorbens gebracht, an welches die Agentien oder das Agens gebunden werden.

Im zweiten Weltkrieg wurde in den USA ein Verfahren für die Isolierung von Proteinen aus humanem Plasma entwickelt. Diese isolierten Proteine werden medizinisch als therapeutische Mittel verwendet. Albumin, Imunglobuline, Fibrinogen, Coagulartionsfaktoren und zahlreiche andere Proteine sind Beispiele und Produkte dieses Verfahrens. Albumin wird z. B. bei Verbrennungspatienten verwendet oder allgemein bei Krankheiten verwendet, in welchen das Blutvolumen zunehmen muss. Immunglobuline können bei Patienten verwendet werden, welche nicht fähig sind selbst protektive Antikörper zu synthetisieren. Koagulationsfaktorkonzentrate (insbesondere Faktor VIII und Faktor IX) werden für hämophilie Patienten verwendet. In vielen Fällen sind diese Präparate lebensrettend und haben demzufolge keinen Ersatz.

Das Verfahren für die Abtrennung von Blutplasma in individuelle Proteine basiert auf verschiedenen unterschiedlichen Prinzipien. Die älteren Verfahren, welche immer noch grosstechnisch verwendet werden, basieren auf der fraktionierenden Fällung von Proteinen mit Ethanol und der anschliessenden Trennung der Phase durch Zentrifugation oder Filtration. In neueren Franktionsschemen werden auch andere Trennmethoden verwendet z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die (Immun-) Affinitätschromatographie. Ein integriertes Trennschema enthält normalerweise verschiedene unterschiedliche Methoden, welche in einem optimierten Prozess kombiniert werden.

In den ersten Jahren der Verwendung von Plasmaproteinen für Menschen wurde klar, dass die Produkte, welche aus menschlichem Blut hergestellt wurden, ebenso Nachteile besitzen. Sie können einige infektiöse Krankheiten übertragen, welche durch Viren verursacht werden. Das wichtigste Virus war zu Beginn virale Hepatitis (Hepatitis B). Später wurden andere Hepatitisformen bekannt (nicht A und nicht B Hepatitis welche kürzlich identifiziert wurde und als Hepatitis C bezeichnet wurde). Das bekannteste Virus, welches durch Blut und Blutprodukte übertragen wird ist das HIV (Humanimmunschwächevirus) welches dass Agens ist, welches AIDS verursacht (Acquired Immune Deficiency Syndrome). Neben den genannten gibt es noch einige andere Viren, welche ebenfalls durch Plasma oder Plasmaderivate übertragen werden können.

In den letzten Jahren wurden andere übertragbare Krankheiten mit einigen gemeinsamen Merkmalen bekannt. Sie werden als TSE bezeichnet und es wird angenommen, dass sie durch nicht konventionelle übertragbare Agentien (NCTA) übertragen werden. Die humanen Krankheiten Creutzfeldt- Jakob Krankheit (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker Krankheit (GSS), die fatale familiäre Insomnie (FFI) und kuru gehören alle zu dieser Gruppe wie auch einige Tierkrankheiten, die am besten bekannte ist Scrapie bei den Schafen und die bovines spongiforme Enzephalopathie (BSE; "Rinderwahnsinn) im Vieh. Betroffene Menschen und Tiere zeigen alle die Symthome der Neurodegeneration und die Krankheiten sind unweigerlich tödlich. CJD, die bestbekannte humane Krankheit dieser Gruppe, entwickelt sich meistens sporadisch; in einigen Fällen jedoch wurde bei gewissen Familien eine Anhäufung beobachtet. Iatrogene Übertragungen durch Hypophysen-Extrakte, kontaminierte Instrumente, welche in neurochirurgischen Verfahren verwendet werden und Transplantationen von Hornhaut oder Hirnhaut wurde ebenfalls beschrieben. Eine Übertragung von irgendwelchen humanen Krankheiten durch Bluttransfusion trat nie in Erscheinung. Eine retrospektive epidemiologische Studie unter den Empfängern von transfundiertem Blut zeigte keine zunehmende Rate von CJD, wenn sie mit nicht transfundierten Kontrollen verglichen werden. [T:F. G: Esmond, R. G. Will, J. M. Slattery et al. Creutzfeldt- Jakob disease and blood transfusion. Lancet 1993, 341: 205-207]. Ein Rückblick unter den Empfängern von Erythrocyten-Konzentraten, welche durch Menschen gespendet wurden, welche später an bestätigter CJD starben, zeigte nicht einen einzigen Fall von abnormalen neurologischen oder psychiatrischen Befunden [N. Heye, S. Hensen, N. Müller: Creutzfeldt-Jakob disease and blood Transfusion. Lancet 1994, 343 : 298-299]. Übertragung von TSE durch Bluttransfusion muss demzufolge aussergewöhnlich selten oder aussergewöhnlich uneffizient oder beides sein. Die Öffentlichkeit und die regulatorischen Behörden sind sich jedoch des potentiellen Problems bewusst und es ist eine Rückversicherung erforderlich, dass höchste Vorsicht angewandt wird um die Patienten von einer möglichen NCTA-Aussetzung zu schützen.

Die Existenz von infektiösen Agentien ist jenseits eines Schattens eines Zweifels bewiesen. Die exakte Natur dieses Agens wird jedoch immer noch diskutiert. In der Vergangenheit glaubten die meisten Forscher, dass die Krankheit durch ein langsames Virus verursacht wurde; umso populärer ist die Hypothese heutzutage, dass das infektiöse Agens ein Proteinpartikel ist, welches Nukleinsäure enthalten kann oder nicht, ein so genanntes Prion. Prionen kommen in mindestens zwei unterschiedlichen Formen vor, eine wird normalerweise in Zellen gefunden, welche als PrPC bezeichnet werden und eine andere Form welche nur in Individuen vorkommt welche durch die Krankheit befallen sind, welche als PrPres oder PrPres bezeichnet wird wegen ihrer Assoziation mit Scrapie oder ihrer Widerstandsfähigkeit gegen Abbau durch Proteasen, am bemerkenswertesten Protease K. Der Unterschied zwischen PrPc und PrPres liegt in der Änderung ihrer Faltstruktur oder tertiären Struktur des Proteins, eine vorwiegend a-helikale Konformation, welche meistens in β Faltblätter umgewandelt wird. PrPres ist damit assoziiert oder kann die Ursache von TSE sein. Die Involvierung von andern Faktoren (Cofaktoren, d. h. Nukleinsäure, andere Proteine) wird ebenfalls diskutiert.

Die Sicherheit von Blut und Blutderivaten kann durch fünf Massnahmen auf verschiedenen Ebenen erhöht werden: (1) Die Sammelstellen versuchen Donoren auszuschliessen, von welchen bekannt ist, dass sie ein hohes Risiko für die Übertragung von infektiösen Krankheiten darstellen. Dies wird durchgeführt mit Hilfe von Fragebogen, welche den Ausschluss von Leuten mit erhöhten Risikofaktoren erlauben. Personen mit erhöhten Risikofaktoren sind zum z. B. diejenigen, welche an bestimmten Krankheiten leiden, diejenigen welche kurz vor der Spende gewisse Länder besuchten, diejenigen welche Risiken bezüglich ihrem sexuellen Verhalten eingehen oder Drogenabhängige, welche kontaminierte Spritzen verwenden, Empfänger von Hornhaut oder Hirnhaut oder Hirnhauttransplantaten, Leute welche mit Hypophysenhormonen behandelt wurden oder welche CJD-Fälle in ihren Familien haben. (2) Laboranalysen ermöglichen die Bestimmungen von infektiösen Spenden, welche dann vom weiteren Verfahren entfernt werden können. Diese beiden Massnahmen zusammengenommen führen zur Entfernung der meisten infektiösen Spenden, jedoch nicht von allen: (a) die Empfindlichkeit der Testmethoden kann ungenügend sein; (b) ein Test auf ein besonderes infektiöses Agens kann noch nicht erhältlich sein; aus praktischen und ökonomischen ist es nicht möglich ein Screening auf alle potentiellen infektiösen Agentien durchzuführen; (c) der Test weist nicht das infektiöse Agens selbst nach, sondern die Antikörper; welche bei der infizierten Person als Antwort auf die Infektion hervorgerufen werden. Von der Zeit der Infektion bis nachweisbare Antikörper erscheinen, verstreichen normalerweise einige Tage oder Wochen (das so genannte Fenster). Anikörpertests sind nutzlos während dieser Zeitperiode; (d) eine infizierte Spende kann wegen einem Fehler freigegeben werden. (3) Die Sicherheit bezüglich der Übertragung von infektiösen Agentien wird weiter erhöht durch spezielle Schritte, welche in den Produktionsprozess eingeführt werden, welche entweder die infektiösen Agentien inaktivieren oder eliminieren. (4) Die strikte Befolgung einer guten Herstellungspraxis (GMP) garantiert die Wirksamkeit der Schritte, welche unter (3) erwähnt sind. (5) Eine vollständige Verfolgbarkeit jeder Spende auf entsprechende Produkte und von den Endprodukten zurück zur individuellen Spende erlaubt direkte Rückrufe von Produkten, falls dies erforderlich wird. Verfahren für den Nachweis, die Inaktivierung und Elimination von infektiösen Viren im Blut und Plasma sind nun weitgehend eingeführt.

Kommerzielle Nachweissysteme werden weltweit für den Nachweis z. B. von Antikörpern auf das humane Immunschwäche-Virus oder das Hepatitis C-Virus verwendet. Die Inaktivierung von Viren kann durchgeführt werden durch verschiedene Wärmebehandlungen (entweder in Lösung oder in trockenem Zustand; bei verschiedenen Temperaturen und während verschiedenen Zeitperioden, chemisch durch eine Kombination von Lösungsmitteln und Dergentien oder mit Jod), oder photochemische Behandlungen (z. B. Aussetzung an β-Propiolacton und Ultraviolettlicht; Bestrahlung einer Proteinlösung, zu welcher ein zweckmässiger Farbstoff zugeführt wurde), oder durch einen oder viele andere gut bekannte Methoden. Neue Methoden werden weiter entwickelt. Die Übertragung von bekannten Viren durch pharmazeutische Produkte aus humanem Plasma kann heutzutage mit nahezu vollständiger Sicherheit ausgeschlossen werden, die Übertragung von unbekannten Viren ist mindestens höchst unwahrscheinlich.

Die Situation ist unglücklicherweise schwieriger mit den Agentien, welche übertragbare schwammförmige Encephalopatihien (TSE) verursachen. Blutspender werden routinemässig befragt, mit dem Ziel, diejenigen zu eliminieren, die einem erhöhten Risiko ausgesetzt sind, später in ihrem Leben mit CJP in Kontakt zu kommen (haben Familienmitglieder schon an CJD oder ähnlichen Krankheiten gelitten? Wurde der Spender je einmal Hypophysenhormonen ausgesetzt? oder einer Hornhaut- oder Hirnhauttransplantation). Es besteht kein Zweifel, dass dieser Befragungsablauf einige potentielle iatrogene Fälle eliminieren kann, er kann jedoch potentielle sporadische Fälle nicht beeinträchtigen. Die Elimination von Hochrisiko- Spendern durch Befragung ist demzufolge bestenfalls zufällig und es ist voraussehbar, dass viele Fälle durchschlüpfen. Das Screening von Spendern ist noch nicht möglich. Obschon monoclonale Antikörper entwickelt wurden, welche PrP erkennen, können jedoch die meisten nicht unterscheiden zwischen PrPc und PrPres; ein Test müsste demzufolge eine Protease-Verdauung einschliessen, was ihn für den routinemässigen Gebrauch zu mühsam macht. Schlimmer noch, es ist überhaupt nicht sicher ob PrPres im Blut oder im Plasma gefunden würde; eine bessere Quelle für eine Gewebeprobe wäre eine Gehirnbiopsie, was eindeutig bei Blutspendern nicht möglich ist. Es könnte möglich sein einen Test auf Basis von neu beschriebenen monoclonalen Antikörpern, welche spezifisch PrPres reagieren, zu entwickeln [Korth et al. Prion (PrPSc)-specific eptiope defined by a monoclonal antibody. Nature 1997, 390 : 74-77]; dies wurde jedoch noch nicht gemacht.

Unglücklicherweise sind die TSE Agentien ungewöhnlich stabil gegen Inaktivierung. Die oben erwähnten Methoden für die Inaktivierung von Viren vermindern die Infektivität von NCTA nicht. Tatsächlich überleben sie sogar die Autoklavierung (Dampfbehandlung bei 121ºC während 15 min) und das Eingraben in den Boden während einigen Jahren. Es sind wenige Bedingungen bekannt für eine zuverlässige Inaktivierung von NCTA: Autoklavierung bei einer erhöhten Temperatur (≥134ºC während mindestens 18 min. Behandlung mit ein Mol/L Natriumhydroxidlösung vorzugsweise bei erhöhten Temperaturen; stark oxidierende Bedingungen (Natriumhypochlorid); stark chaotrope Bedingungen (Guanidinisothiocyanat). Wenn solche Bedingungen auf eine Lösung von humanen Plasmaproteinen angewandt werden, würden die Proteine selbst mindestens so schnell wie NCTA inaktiviert. Die einzige Alternative scheint die physikalische Entfernung der NCTA zu sein. Da Monomere von infektiösen Verbindungen eine ähnliche Grösse haben können wie humane Plasmaproteine, können sie nicht leicht entfernt werden, beispielsweise durch Nanofiltration oder Zentrifugation. Es hat sich in der Tat gezeigt, dass die Nanofiltration fähig ist NCTA zu entfernen, jedoch hängt die Entfernung von der Gegenwart oder von der Absenz von gewissen Soluten ab; zum Beispiel gingen infektiöse Agentien in der Gegenwart von oberflächenaktiven Mitteln durch das Filter hindurch.

Gesellschaften, welche humanes Blut oder Blutplasma verarbeiten haben demzufolge einen Bedarf an industriell anwendbaren Verfahren, welche die sichere Entfernung von NCTA aus Proteinlösungen erlauben. Um das theoretische Risiko der Infektion von Patienten, welche mit solchen Produkten behandelt werden, zu minimalisieren ist es demzufolge das Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zu beschreiben, welches die Abtrennung von NCTA aus Proteinlösungen in einem industriellen Massstab erlaubt; dieses Verfahren kann ein Teil irgendeines geläufigen Plasmafraktionierungsablaufs sein.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht demzufolge darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen für die sichere Entfernung von Agentien, welche übertragbare schwammförmige Enzephalopatien (TSE) verursachen, aus Proteinlösungen, welche diese verursachenden Agentien enthalten.

Es wurde gefunden, dass verursachende Agentien von übertragbaren schwammförmigen Enzephalopathien (TSE), welche in Proteinlösungen vorhanden sein können, auf gewissen Materialien absorbiert werden, z. B. auf modifizierter Zellulose, Diatomeenerde, Bentoniten, Vulkanerde, Partikel aus künstlichen Polymeren usw. Wenn die Proteinlösungen in Kontakt mit diesen Materialien während genügend langer Zeit gebracht werden, führt die Abtrennung einer Lösung in ein Präzipitat und einen Überstand zu einer weiteren Entfernung von NCTA, zusätzlich zur Entfernung, welche durch den Ausfällungsschritt als solchen verursacht wird. Die oben erwähnten Materialien wurden schon früher bei der Plasmafraktionierung als sogenannte Filterhilfen eingeführt, um die Abtrennung des Präzipitats und des Überstandes während der Ethanolfraktionierung zu erleichtern. Die Filterhilfen verhüten das Verstopfen der Filterporen durch kleine Proteinpartikel.

Die Entfernung von verschiedenen Viren aus Proteinlösung durch eine ähnliche Methode wurde in einem früheren Patentdokument (EP 0 679 405 A1) beschrieben. In Anbetracht der Tatsache dass die Natur der verursachenden Agentien von übertragbaren schwammartigen Enzephalophatien (TSE), wie oben erwähnt, noch debattiert wird, war es überhaupt nicht naheliegend, dass sie sich in gleicher Weise verhalten sollten wie Viren.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Anspruch 1 definierte Verfahren und die speziellen Ausführungsformen welche in den abhängigen Ansprüchen beansprucht sind.

Gemäss der vorliegenden Erfindung werden die verursachenden Agentien von übertragbaren schwammartigen Encephalopathien (TSE) aus einer Proteinlösung durch Adsorption an eine feste Phase entfernt, wobei die feste Phase entweder suspendiert ist in der Lösung um die verursachenden Agentien von übertragbaren schwammartigen Encephalopathien (TSE) zu adsorbieren oder schon vor einem porösen Filter ausgebildet ist. Die Proteinlösung muss mindestens einmal, vorzugsweise mindestens zweimal, mit einem Adsorbens in Kontakt gebracht werden ausgewählt aus der Gruppe Kieselguhr, Diatomeenerde, Kieselsäure, Tonmineralien, Metallhydroxyd oder - Oxyhydrat, Zellulose, Perlit und wasserunlösliche synthetische Polymere oder eine Mischung oder eine Kombination von diesen Materialien; die Kontaktzeit ist mindestens 10 min. Anschliessend wird die Suspension durch Filtration oder eine andere zweckmässige Methode in Überstand und Niederschlag aufgetrennt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Lösung dreimal mit einem frischen Anteil Adsorbens kontaktiert.

Feste Phasen für diese Technologie sind z. B. die Filterhilfen Cellit (Johns-Manville Corp.) Aerosil® (Degussa), Perlit, wärmeexpandiertes Perlit, Bentonit oder im Allgemeinen fein verteilte Feststoffe, welche durch Filtration oder Zentrifugation aus der Suspension entfernt werden können. Substanzen wie Metallhydroxydgele (z. B. Alhydroge) Al(OH)&sub3; als Gel in Wasser) sind ebenfalls zweckmässig.

Die Adsorbation von verursachenden Mitteln von übertragbaren schwammförmigen Enzephalopathien (TSE) auf den erwähnten Materialien hängt ab vom verwendeten Material, den verursachenden Mitteln und der Umgebung. Bei der systematischen Änderung der Umgebung kann die "Klebrigkeit" eines bestimmten verursachenden Mittels am gleichen Material verändert werden. Es kann möglich sein die Adsorption von NCTA auf einem besonderen Material zu ändern, beispielsweise durch Änderung des pH Wertes des Mediums. Andere Lösungsparameter wie Temperatur, Konzentration des einen oder mehreren Soluten, Ionenstärke, Salze und organischen Lösungsmitteln können ebenfalls die Adsorption des verursachenden Mittels verändern und können verwendet werden um die Adsobtion zu verbessern und demzufolge zur Entfernung des verursachenden Mittels aus der Proteinlösung.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH der Suspension im Bereich von 4 bis 7.

Sogar eine kurze Behandlung der Proteinlösung während nur 10 Minuten kann zu einer wesentlichen Entfernung der verursachenden Agentien führen. Es kann jedoch vorteilhaft sein während einer längeren Zeit zu behandeln um die Entfernung der verursachenden Mittel zu verbessern. Die Behandlungszeiten können innerhalb des Bereiches von 3 min. und 48 h, zwischen 30 min und 12 h oder zwischen 3 h und 48 h sein, z. B. etwa 5 min. 30 min. etwa 1 h, etwa 2 h, etwa 6 h, etwa 8 h, etwa 12 h, etwa 14 h, etwa 16 h, etwa 20 h.

In einer weiteren Ausführungsform liegt die Temperatur der Proteinlösung im Bereich von 0 bis 20ºC und vorzugsweise bei etwa 2ºC.

Die Entfernung des Adsorbens einschliesslich des adsorbierten verursachenden Agents wird entweder durch Zentrifugation oder Filtration durchgeführt. Die Zentrifugation kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, z. B. durch Batchverfahren oder eine kontinuierliche Zentrifugation. Die Zentrifugationskraft und die Zeit der Zentrifugation müssen so eingestellt werden, dass eine saubere Trennung von suspendierten Material und Überstand garantiert wird. Im Labormassstab kann die Filtration mit einer Nutsche oder einem ähnlichen Apparat durchgeführt werden. In grösserem Massstab (Produktion) werden andere Ausrüstungen bevorzugt, z. B. Filterpressen oder Rotationsfilter.

Experimentelles

Aus naheliegenden Gründen ist es nicht möglich Experimente mit verursachenden Mitteln von CJD oder ähnlichen menschlichen Krankheiten durchzuführen. Um etwas zu lernen über das Verhaften von NCTA ist es demzufolge erforderlich von Modellsystemen Gebrauch zu machen. Ein gut eingeführtes Modellsystem ist ein Hamsterscrapiemodell. Das Folgende ist eine ist eine kurze Beschreibung des Modells: Zuerst wird ein Inoculum aus dem Gehirn eines kranken Tieres hergestellt; das Gehirn wird sorgfältig entfernt und durch Beschallung mit 9 Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung homogenisiert. Diese Zubereitung kann die Krankheit übertragen wenn 5 uL intracranial in gesunde Hamster inokuliert werden. Abhängig von der Potenz des Inoculums entwickelt sich die Krankheit innerhalb weniger Wochen oder einigen Monaten. Sämtliche Tiere müssen während einem Jahr oder bis zu ihrem Tod beobachtet werden, was zuerst eintrifft. Die Krankheit manifestiert sich selbst durch charakteristische Verfahrensänderungen, z. B. durch eine zunehmende Reaktion auf Lärm und durch Bewegungsstörungen. Durch Verdünnung des Inoculums in den Stufen 1 bis 10 mit Puffer und die Inokulierung der Verdünnungen in Tiere ist es möglich einen Titer des Inoculums zu definieren; der Titer ist reziprok zur letzten Verdünnung, welche die Krankheit in der Hälfte der inokulierten Tiere verursachte. Ein wie oben beschrieben hergestelltes Inoculum besitzt einen Titer von etwa 10¹². Der Vorteil dieses Modells liegt darin, dass keine Annahmen betreffend der Natur des infektiösen Agents gemacht werden, da der Test auf einer klinischen Krankheit beruht. Die infektiösen Agentien können demzufolge eines oder mehrere Proteine sein, mit oder ohne involvierte Nukleinsäuren, ein langsames Virus oder eine andere Einheit es ist immer das infektiöse Agents, welches gemessen wird. Dieses System kann demzufolge verwendet werden um entweder die physikalische Entfernung oder die Inaktivierung des verursachenden Agents von TSE abzuschätzen. Es werden Experimente in Analogie zu Bewertungsexperimenten mit Viren durchgeführt, welche im Einzelnen vor ca. zehn Jahren in der Literatur beschrieben wurden. Eine kleine Menge von infektiösem Material (sogenannte Spike) wird in einem besonderen Schritt des Reinigungsverfahrens des Produktes unter Auswertung und ihrer Aktivität gemessen. Der nächste Verfahrensschritt wird dann durchgeführt (z. B. eine Ausfällung gefolgt durch Abtrennung von Niederschlag und Überstand; eine thermische Inaktivierung) und die verbleibende Aktivität wird titriert, in beiden Phasen im Fall von physikalischer Trennung, oder als Funktion der Zeit im Falle einer Inaktivierung. Die Inaktivierungsfaktoren können aus diesen Messungen berechnet werden, vorausgesetzt die Bilanz stimmt oder die Kintetik wurde korrekt verfolgt. Im Fall wenn die NCTA Titration extrem schwierig ist, da jeder Titrationspunkt die Verwendung von mehreren Tieren erfordert, wurde die Versuchsanordnungen entsprechend geändert. Das Resultat der Experimente ist erst nach einigen Monaten bekannt, wenn die infizierten Tiere entweder erkrankten oder gesund blieben.

Beispiele

Das Gehirnhomogenat, welches in den folgenden Beispielen verwendet wurden, wurden sorgfältig titriert, indem die Lösungen in Hamsterhirne injiziert wurden. Nach 187 Tagen der Beobachtung war die Verteilung von kranken und gesunden Tieren in den verschiedenen Gruppen wie folgt:

Aus diesen Daten kann ein Titer von etwa 10&sup9; für das Homogenat berechnet werden. Ähnliche Tabellen wurden für jede der Lösungen analysiert. Aus diesen Daten konnten die Clearencefaktoren für jedes Beispiel berechnet werden; sie sind bei jedem Beispiel angegeben.

Beispiel 1 (für dieses und die folgenden Beispiele wird ebenfalls auf Fig. 1 verwiesen, welches ein Diagramm der Plasmafraktionierungsmethode nach Kistler/Nietschmann zeigt)

58 ml humanes Blutplasma wurden gerührt und auf 1ºC abgekühlt. 0,58 ml Hirnhomogenat wurde zugegeben. Ethanol wurde auf eine Endkonzentration von 19% zugegeben, unter gleichzeitiger Kühlung des Plasma auf -5,5ºC. Nach der Einstellung des pH auf 5,58 wurde Perlit zugegeben und die Suspension wurde zentrifugiert. Die Inefektivität des Überstandes wurde mit einem Faktor von etwa 10&sup5; reduziert.

Beispiel 2

40 mg Filtrat wurden bei -5,5ºC gerührt. 0,4 ml Gehirnhomogenat wurde zugegeben, wonach Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 40% zugegeben wurden. Die Temperatur wurde auf -7ºC reduziert und pH wurde auf 5,95 eingestellt. Eine Mischung von Perlit und Cerlit wurde zugegeben. Die Suspension wurde zentrifugiert. Die Infektivität des Überstandes wurde durch einen Faktor von 10&sup5; reduziert.

Beispiel 3

52 ml Präcipitat A wurden bei 1ºC gerührt. 0,52 ml Hirnhomogenat wurde zugegeben. Der Puffer wurde zugegeben und der pH auf 5,1 eingestellt. Es wurde Wasser zugegeben, dann Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 25%. Die Temperatur wurde gleichzeitig auf -3ºC reduziert. Perlit wurde zugegeben und die Suspension wurde zentrifugiert. Die Infektivität im Überstand wurde durch einen Faktor von 106 reduziert.

Beispiel 4

33 ml resuspendiertes Präcipitat GG (welches Filterhilfe aus dem vorhergehenden Schritt enthält) wurde auf 4ºC abgekühlt. 0,33 ml Hirnhomogenat wurde zugegeben. Die Suspension wurde zentrifugiert. Die Infektivität des Überstandes wurde durch einen Faktor von 10&sup7; reduziert.

Beispiel 5

50 ml Immunglobulin G Lösung wurde bei 4ºC gerührt. 0,5 ml Hirnhomogenat wurde zugegeben, gefolgt durch Filterhilfe (Cellit 577). Die Suspension wurde zentrifugiert. Die Infektivität im Überstand wurde durch einen Faktor von 10&sup6;, reduziert.

Beispiel 6

33 ml resuspendiertes Precipitat GG wurde auf 4ºC abgekühlt und gespiked wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand wurde weiter wie in Beispiel 5 behandelt. (Zugabe von Filterhilfe, gefolgt von Zentrifugation; entsprechende Volumenkorrektur), jedoch ohne zusätzliches Spiking mit Hirnhomogenat. Nach 200 Tagen Beobachtung zeigte keines der Tiere, welches mit dem zweiten Überstand injiziert wurde irgendwelche Krankheitszeichen. Dies demonstriert, dass die zweifache Filtration in Sequenz die Gegenwart eines zweckmässigen Filterhilfsmittels wesentlich mehr infektiöses Agens entfernt, als dies bei einem einzigen Filterschritt der Fall wäre.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Abtrennung von Erregern von übertragbaren spongiformen Encephalopthien (TSE) aus einer Proteinlösung, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Proteinlösung, welche den Erreger enthält, mindestens ein Adsorbens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kieselguhr, Diatomeenerde, Kieselsäure, Tonmineralien, Metallhydroxid, Metalloxihydrat, Cellulose und Bentonit suspendiert wird, während einer Zeitdauer von mindestens 10 Minuten, während welcher die erhaltene Suspension gerührt wird, und anschliessend das Adsorbens von der Proteinlösung abgetrennt wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Adsorbens von der Proteinlösung durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt wird. 3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin die Proteinlösung ein Präparat auf Basis von humanem Blutplasma ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1 bis 3, worin das Adsorbens ein unlösliches Metallhydroxid oder Metalloxihydrat ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin das Adsorbens Magnesium- oder Aluminiumhydroxid ist.

6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 worin das Adsorbens Aluminiumhydroxidgel oder Cellulose enthält.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Adsorbens Diatomeenerde, Perlit, wärmeexpandiertes Perlit, Sentonit oder Talk ist.

8. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Adsorbens in Form eines Gels vorhanden ist.

9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Proteinlösung mindestens zweimal mit einer frischen Portion Adsorbens in Kontakt gebracht wird.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, worin die Lösung dreimal mit einer frischen Portion Adsorbens in Kontakt gebracht wird.

11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der pH der Suspension im Bereich von 4 bis 7 liegt.

12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11, worin einer oder mehrere der Parameter der Lösung mindestens einmal während der Kontaktzeit der Proteinlösung mit dem Adsorbens geändert wird.

13. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin die Parameter der Proteinlösung die Temperatur, die Konzentration eines oder mehrerer gelösten Stoffe und die Ionenstärke sind.

14. Verfahren gemäss einer der Ansprüche 1 bis 13, worin die Kontaktzeit der Lösung mit dem Adsorbens im Bereich von 10 min bis 48 h liegt.

15. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Temperatur der Proteinlösung im Bereich von 0ºC bis 20ºC und vorzugsweise etwa bei 2ºC liegt.







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