PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69812347T2 19.02.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000981359
Titel ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR VERSTÄRKUNG DER PHARMAKOLOGISCHEN AKTIVITÄT VON IMMUNOSUPPRESSIVA
Anmelder Zavialov, Vladimir Petrovich, Lyubuchany, RU;
Vasilenko, Raisa Nikolaevna, Lyubuchany, RU;
Dolgikh, Dmitry Aleksandrovich, Moskau/Moscow, RU;
Kirpichnikov, Mikhail Petrovich, Moskau/Moscow, RU;
Navolotskaya, Elena Vitalievna, Pushchino, RU;
Korpela, Timo Kalevi, Turku, FI
Erfinder Zavialov, Vladimir Petrovich, Moscow Region, RU;
Vasilenko, Raisa Nikolaevna, Moscow Region, RU;
Dolgikh, Dmitry Aleksandrovich, Moscow, RU;
Kirpichnikov, Mikhail Petrovich, Moscow, RU;
Navolotskaya, Elena Vitalievna, Pushchino, RU;
Korpela, Timo Kalevi, 20500 Turku, FI
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69812347
Vertragsstaaten AT, DE, ES, FI, FR, GB, IT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.05.1998
EP-Aktenzeichen 989215280
WO-Anmeldetag 18.05.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/FI98/00418
WO-Veröffentlichungsnummer 0098052594
WO-Veröffentlichungsdatum 26.11.1998
EP-Offenlegungsdatum 01.03.2000
EP date of grant 19.03.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.02.2004
IPC-Hauptklasse A61K 38/04
IPC-Nebenklasse A61K 38/13   A61K 38/21   A61P 37/06   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Arzneimittel für Menschen oder Tiere und genauer die Verbesserung der therapeutischen Wirkung herkömmlicher immunsuppressiver, entzündungshemmender und/oder antiparasitischer Arzneistoffe, wobei die wirksamen Bestandteile Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin umfassen. Diese Erfindung stellt neue Zusammensetzungen zur wirksamen Verstärkung der Aktivität der Komponenten bereit, um ihre therapeutische Dosis zur Vermeidung von Nebenwirkungen davon zu verringern.

Hintergrund der Erfindung

Cyclosporine sind cyclische Peptide, bestehend aus 11 Aminosäureresten, die vorher unbekannte N-methylierte Aminosäurereste einschießen. Cyclosporine sind kommerziell wichtige Produkte, die aus Kulturbrühen der Pilzart Tolypocladium isoliert werden. Cyclosporine werden verwendet, um das Überleben aliogener Transplantate einschließlich Haut, Niere, Bauchspeicheldrüse, Knochenmark, Dünndarm und Lunge zu verlängern. Gegenwärtig ist bekannt, daß die Wirksamkeit der Cyclosporine auf die spezifische und reversible Hemmung von immunkompetenten Zellen, vorwiegend T-Helferzellen, zurückzuführen ist. Unglücklicherweise ist die systemische Anwendung von Cyclosporinen mit einem häufigen Auftreten von Nephrotoxizität (Nierenversagen), einigen Fällen von Hepatotoxizität, einer erhöhten Häufigkeit von lymphatischen Tumoren und einer erhöhten Häufigkeit von opportunistischen Infektionen verbunden gewesen: Die Nebenwirkungen der Cyclosporine sind so schwer und so häufig, daß deren Anwendungen auf lebensbedrohliche oder schwere das Sehvermögen bedrohende Erkrankungen begrenzt ist.

Cyclosporine wie FK506 und andere verwandte Moleküle binden spezifisch an bestimmte physiologisch wichtige Molekülarten in Geweben und im Blutkreislauf (Denesyuk A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 197 (1993), S. 1438–1442; Denesyuk A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 194 (1993), S. 280 286; Denesyuk A, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1993), S. 912–917). Nach der Identifizierung von Cyclosporin A sind andere Cyclosporine, B, C, D, E und G, beschrieben worden, die geringfügige Unterschiede in der Molekülstruktur der Cyclosporine enthalten. Viele dieser Cyclosporine zeigen einen mit Cyclosporin A in Beziehung stehenden pharmazeutischen Nutzen, und die Literatur beinhaltet zahlreiche Beispiele und Vorschläge für ihre Verwendung als Therapeutika.

Cyclosporine wurden zuerst zur Verwendung als antifungale Mittel erwähnt, aber es wurde festgestellt, daß ihre immunsuppressive Wirkung von größerer Wichtigkeit ist. Cyclosporine hemmen spezifisch und reversibel immunkompetente Zellen, vorwiegend T-Helferzellen, durch spezifische Wechselwirkungen mit Peptidyl-prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase; vgl. Schreiber S. und Grabtree G., Immunol. Today 13 (1992), S. 136–142; Zav'yalov V. et al., Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 103 (1995), S. 401–415). Diese multifunktionellen PPIase-Proteine können auch als ATP-unabhängige molekulare Chaperone wirksam sein, welche die Faltung von Zielproteinen und die Zusammenlägerung von Proteinkomplexen aus mehreren Untereinheiten ermöglichen (Schmid F. et al., Adv. Protein Chem. 46 (1993), S. 25–65), aber ihre Hauptfunktion ist die Bindung der immunsuppressiven Arzneistoffe Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin. Die PPIasen mit einer derartigen Aktivität wurden als Immunophiline (ImPs) bezeichnet. Diese Proteinrezeptoren werden hinsichtlich ihrer Struktur in zwei Hauptgruppen eingeteilt: die Cyclosporin-Bindungsproteine, auch als Cyclophiline (CyPs) bezeichnet, und die FK506-Bindungsproteine, bezeichnet als FKBPs; wobei einige der letzteren bevorzugt Rapamycin binden (Trandini C. of al., FASEB J. 6 (1992), S. 3410–3420; Liu J., Immunol. Today 14 (1993), S. 290–295). Es ist festgestellt worden, daß Ca2+ und die Calmodulin-abhängige Proteinphosphatase Calcineurin (CaN) mit hoher Affinität an biologisch aktive ImP-Arzneistoffkomplexe binden. Die Versuchsdaten legen nahe, daß das cytoplasmatische NF-AT-Protein (NF-ATc), entweder direkt oder indirekt, über eine Phosphatase-Kaskase ein Substrat für CaN ist. NF-AT ist ein komplexes Protein, das aus mindestens zwei Untereinheiten besteht. Eine Untereinheit von NF-AT (NF-ATp), ein DNA bindendes Phosphoprotein, ist ein Substrat für CaN in vitro und interagiert mit Fos- und Jun-Proteinen im Kern von aktivierten T-Zellen (Jain J. et al., Nature 365 (1993), S. 352–355): Die Dephosphorylierung durch CaN könnte die nukleare Translokation von NF-ATc direkt induzieren. Die aktive Form dieses Proteins interagiert mit funktionellen Sequenzen innerhalb des IL-2-Ehancers. Gemäß einer Hypothese blockieren die Komplexe Cyclosporin A-CyP oder FK506-FKBP-12 die nukleare Translokation von NF-ATc und die Aktivierung der IL-2-Genexpression infolge der Hemmung der CaN-Aktivität.

Die immunsuppressiven Eigenschaften der Cyclosporine führten dazu, daß sie weitreichende routinemäßige Anwendung bei Erkrankungen in Verbindung mit dem Immunsystem fanden, wie zum Beispiel in der Finnischen Patentveröffentlichung 900604 beschrieben ist. Demgemäß ist die Anzahl der Patente über Cyclosporne für diesen Zweck unter verschiedenen Gesichtspunkten groß. Außerdem hat die Augenheilkunde von Cyclosporinen profitiert. Das US-Patent Nr. 4,649,047 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von phakoantigener Uveitis und Uveitis in der vorderen oder hinteren Augenkammer, bei dem Cyclosporin topisch an das Auge verabreicht wird. Bei anderen ophthalmischen Anwendungen ist Cyclosporn topisch nur zur Behandlung von äußerlichen Erkrankungen des Auges verwendet worden. BenEzra et al., Amer. J. Ophthalmol. 101 (1986), S. 278–282, beschrteben die Wirkung von Augentropfen mit 2% Cyclosporin auf eine schwere Frühjahrskeratokonjunktivitis, welche eine saisonale allergische Erkrankung ist, die nicht mit einem Tränenmangel in Beziehung steht. Hunter et al., Clin. Exp. Immunol. 45 (1981), S. 173–177, beschrteben die topische Verabreichung von Cyclosporin in einem Kaninchenmodell der Hornhaut-Transplantatabstoßung mit positiven Ergebnissen. Boisjoly et al., Arch. Ophthalmol. 102 (1984), S. 1804–1807, berichteten, daß die topische Anwendung von Cyclosporin einen vorteilhaften prophylaktischen Effekt bei der Behandlung einer schweren stromalen Herpes-Keratitis hatte. Mosteller et al., Investigative Ophthalmol. Supp. 25 (1984), S. 3–38, behandelten eine Hornhaut-Allotransplantatabstoßung in Kaninchen durch die Applikation einer Einfachdosis einer Salbe mit 10% Cyclosporin A in den unteren Blindsack der Augenlider. Cyclosporine sind auch bei anderen ophthalmischen Anwendungen systemisch verwendet worden, wobei die behandelte Erkrankung nicht auf die Augenoberfläche begrenzt ist. Zum Beispiel berichteten Nussenblatt et al., Amer. J. Ophthalmol. 96 (1983), S. 275–282, über die klinische Besserung bei einigen Patienten mit einer nichtinfektiösen hinteren Uveitis nach einer systemischen Behandlung mit Cyclosporin.

Cyclosporine werden vorwiegend oral oder mittels Injektion verabreicht. Unglücklicherweise ist die systemische Anwendung von Cyclosporinen mit einem häufigen Auftreten von Nephrotoxizität (Nierenversagen), einigen Fällen von Hepatotoxizität, einer erhöhten Häufigkeit von lymphatischen Tumoren und einer erhöhten Häufigkeit von opportunistischen Infektionen verbunden gewesen. Cyclosporine sind nur in geringem Maße weniger toxisch als andere Immunsuppressiva wie Cytoxan oder Aziothioprin. Die systemischen Nebenwirkungen der Cyclosporine sind so schwer und so häufig, daß ihre Anwendung auf lebensbedrohliche oder; in einigen Fällen, schwere das Sehvermögen bedrohende Erkrankungen begrenzt ist.

Wie in US-Patent Nr. 4,117,118 (Harri et al., 1978) beschrieben, ist Cyclosporin in den meisten der üblichen organischen Lösungsmittel leicht löslich und in Petrolether und Wasser praktisch unlöslich. Die schlechte Löslichkeit der Cyclosporine hat zur Folge, daß die Absorption im Darm bei oraler Verabreichung sowie die Wirkungen bei intravenösen Anwendungen von Patient zu Patient verschieden sind. Falls ein sehr hoher und konstanter Spiegel der Cyclosporine im Blutkreislauf erforderlich ist, ist die Verabreichung von Cyclosporinen schwiertg. Cyclosporin zur oralen Verabreichung, vertrieben durch Sandoz Ltd. unter dem Handelsnamen Sandimmune, ist in Olivenöl zur weiteren Verdünnung mit Nahrungsmitteln und in polyoxyethyliertem Rizinusöl und Ethanol zur intravenösen Injektion gelöst. Die Freisetzung der Cyclosporine aus den Trägerstoffen ist patientenabhängig, wobei die Dosis entweder therapeutisch unwirksam oder toxisch ist. Wie angegeben, erhöht die anhaltende systemische Verabreichung der Cyclosporine in Verbindung mit einer Transplantation und damit in Beziehung stehenden Anwendungen das rtsiko für andere Erkrankungen einschließlich Krebs. Es ist daher sehr wichtig, daß wirksame Cyclosporin-Dosen verwendet werden können, die erheblich geringer als die toxische Konzentration sind.

In letzter Zeit rtchtete sich die Aufmerksamkeit auf die lang übersehene Rolle von Typ I-Interferonen (INF ?, ß, ? und ?) bei der Modulation der Immunantwort (Belardelli F. und Gresser I., Immunol. Today 17 (1996), S. 369–372). Die immunmodulierende Aktivität von INF α, β, ω und τ ist sehr komplex und umfaßt: Hemmung der Lymphocytenproliferation nach Stimulation mit Lectinen oder allogenen Zellen;

  • – Verlängerung des Überlebens von Hauttransplantaten;
  • – Hemmung einer Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ;
  • – Differenzierung auf eine Th1-Typ-Immunreaktion;
  • – in vivo-Stimulation einer lang anhaltenden antigenspezifischen Gedächtnis-CD8+-Zellcytotoxizität;
  • – Hemmung von Suppressor-T-Zellen;
  • – Erhöhung der natürlichen Killer (NK)-Zellcytotoxizität;
  • – Erhöhung der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse I-Antigen-Expression.

Die ersten drei immunmodulierenden Eigenschaften von Typ I-IFNs (Hemmung der Lymphocytenproliferation nach Stimulation mit Lectinen oder allogenen Zellen; Verlängerung des Überlebens von Hauttransplantaten; und Hemmung einer Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ) sind zur Verstärkung der Aktivität von Immunsuppressiva (Cyclosporine, FK506 und Rapamycin) nützlich. Jedoch können die anderen immunmodulierenden Eigenschaften von Typ I-IFNs (Differenzierung auf eine Th1-Typ-Immunreaktion; in vivo-Stimu-lation einer lang anhaltenden antigenspezifischen Gedächtnis-CD8+-Zellcytotoxizität; Hemmung von Suppressor-T-Zellen; Erhöhung der natürlichen Killer (NK)-Zellcytotoxizität; und Erhöhung der MHC-Klasse I-Antigen-Expression) eine entgegengesetzte Wirkung hervorrufen. In der Tat wurde beobachtet, daß ein gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen (h)IFN-α-Rezeptors gerichteter monoclonaler Antikörper, der sowohl die Bindung als auch die biologische Aktivität aller getesteten Typ I-IFNs hemmt, eine dosisabhängige Hemmung der Lymphocytenmischkultur-Reaktion bewirkt und ein anhaltendes Überleben von Haut-Allotransplantaten in MHC-divergenten Cynomologus-Affen induziert, die mit einer subeffektiven Dosis von Cyclosporin A behandelt wurden (Tovey M.G. et al., Leukocyte Biol. 59 (1996), S. 512–517).

In der vorliegenden Endung beobachteten die Erfinder überraschend, daß die physiologischen Wirkungen von Immunsuppressiva (Cyclosporine, FK506 und Rapamycin) durch die gleichzeitige Verabreichung eines beliebigen Immunsuppressivums und des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von IFN-? entsprtcht, oder des rekombinanten Proteins mit der Aminosäuresequenz, welche der Stelle entspricht, erheblich erhöht werden kann. Peptide sind besonders bevorzugte Zusatzstoffe, da sie keine gesundheitsschädlichen Symptome hervorrufen und die Aktivität infolge der Erzeugung von Antikörpern gegen größere Polypeptide, z.B. natürliche Interferone, nicht unterdrücken.

Vor langer Zeit wurde die Primärstrukturhomologie der hINFs ? und ß und des Thymushormons Thymosin α1 (TMα1) entdeckt (Zav'yalov V. und Denesyuk A., Doklady Akademii Nauk SSSR 275 (1984), S. 242–246). Der Vergleich der Primärstrukturen von proTM? und der hINFs ? und ß zeigte eine Homologie des Prohormons mit den Stellen der INFs auf, welche die C-terminalen Helices D und E ausmachen. Die größte Homologie wird jedoch für den C-terminalen Teil von Helix D und dem N-terminalen Teil von Schleife DE beobachtet (Zav'yalov V. et al., Immun. Lett. 22 (1989), S. 173–182; Zav'yalov V. et al., Biochim. Biophys. Acta 1041 (1990), S. 178–185). Eines der synthetisierten Peptide (α-Peptoferon), das sich mit der TMα1-ähnlichen Sequenz von hIFN-?2 deckt, konkurrtert wirksam mit hIFN-α2, TMα1 und proTM? um gemeinsame Rezeptoren auf Maus-Thymocyten (d.h. der Ki-Wert der Bindung des rekombinanten (r)hIFN-?2 durch ?-Peptoferon entspricht etwa 10-12 M) (Zav'yalov V. et, al., FEBS Lett. 278 (1991), S. 187–189; Zav'yalov V. et al., Molec. Immun. 32 (1995), S. 425–431). Vor kurzem wurde das erste Beispiel einer erfolgreichen Transplantation der TMα1-ähnlichen Stelle von hIFN-?2 in das de novo konstruierte Protein Albeferon beschrieben (Dolgikh D. et al., Protein Engin. 9 (1996), S. 195–201). Das IFN-α2-Fragment, das der TMα1-ähnlichen Sequenz 130–137 entsprach, wurde in die N-Termini eines Albebetinmoleküls direkt nach dem Initiator-Met-Rest insertert. Das chimäre Protein (Albeferon) wurde in einem Weizenkeimzellen-freien Translationssystem exprimiert und auf seifte Kompaktheit und Stabilität getestet. Es ist gezeigt worden, daß Albeferon praktisch so stabil ist wie natürliche Proteine des entsprechenden Molekulargewichts und eine hohe Stabilität gegen eine Harnstoff induzierte Entfaltung besitzt. Um die Affinität von Albeferon für den murinen Thymocytenrezeptor zu bestätigen, ist die Proteinhemmwirkung auf die Bindung von radiomarkiertem [125I]-?-Peptoferon an die Rezeptoren untersucht worden. Der kompetitive Hemmkoeffizient (IC50) und die berechnete Hemmkonstante (Ki) von Albeferon kommen den Werten von rhIFN-α2 sehr nahe. Es wurde gezeigt, daß die Zeltoberflächen-Bindungseigenschaften mit der erhöhten anti-lymphoproliferativen Aktivität von Konsensus-Typ I-IFN auf menschliche periphere polymorphkernige Zellen korreliert (Klein S. et al., J. Interferon and Cytokine Res. 16 (1996), S. 1–6; Dhib-Jalbut S. et al., J. Interferon and Cytokine Res. 16 (1996), S. 195–200).

Die vorliegende Erfindung umfaßt Zusammensetzungen zur wirksamen Verstärkung der immunsuppressiven Aktivität der Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin durch Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs, α, β, ω und τ entsprechen, oder rekombinante Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, um die therapeutische Dosis der beiden Verbindurtgsgruppen zu verringern und somit ihre unerwünschten Nebenwirkungen während der Organ- oder Gewebetransplantation und während der Behandlung verschiedener Erkrankungen zu vermeiden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen zur wirksamen Verstärkung der immunsuppressiven Aktivität der Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin bereit, um die therapeutische Dosis von Immunsuppressiva zu verringern und somit ihre unerwünschten Nebenwirkungen während der Organ- oder Gewebetransplantation und während der Behand- lung verschiedener Erkrankungen zu vermeiden.

Diese Zusammensetzungen schließen Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin und biologisch aktive Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs α, β, ω und τ entsprechen, oder rekombinante Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, ein.

Genauer betrifft die Erfindung Zusamensetzungen, bestehend aus Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin mit einem oder mehreren der Peptide, die mindestens 5 identische Aminosäurereste aus der folgenden Tabelle enthalten:



wobei jeder Aminosäurerest in der obersten Sequenz durch einen beliebigen Aminosäurerest darunter modifiziert werden kann.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1: Wirkung von rhIFN-α2 und des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hINF-?2 entsprtcht (?-Peptoferon), auf die Mitogen (PHA)-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen.

2: Wirkung von rhIFN-α2 und des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hINF-?2 entspricht (?-Peptoferon), auf die Proliferation der IFN-empfindlichen menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4.

3: Wirkung von rhIFN-α2, Albeferon und Albebetin auf die Mitogen (PHA)gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen.

4: Wirkung von rhIFN-?2, Albeferon und Albebetin auf die Proliferation der IFN-empfindlichen menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4.

5: Wirkung von rhIFN-α2 und des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphopioliferativen Stelle von hINF-?2 entspricht (?-Peptoferon), auf die Mitogen (PHA)-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polym?rphkernigen Zellen in Gegenwart von 20 mM Cyclosporin A im Kulturmedium.

6: Wirkung von Albeferon auf die Mitogen (PHA)-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen in Gegenwart von 10 mM Cyclosporin A im Kulturmedium.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Cyclosporine, FK506 und Rapamycin sind häufig verwendete, kommerziell wichtige Arzneistoffe zur Behandlung verschiedener Erkrankungen bei Menschen und höheren Tieren. Jedoch weist die Verwendung dieser Arzneistoffe wegen ihrer Toxizität und ihres engen wirksamen Dosisbereiches schwere Nachteile auf. Dies bildet die Grundlage für entweder die Entwicklung von anderen verwandten Arzneistoffen, die wirksamer und weniger toxisch sind, oder die Erhöhung ihrer Aktivität durch andere Bestandteile. Der letztere Ansatz ist nur ausprobiert worden, indem Arzneistoffformulierungen hergestellt wurden, die entweder eine wirksamere Absorption im Darm oder eine anhaltende Abgabe im Darm oder bei der intravenösen Verabreichung bereitstellert.

In dieser Erfindung wurde überraschend beobachtet, daß bestimmte günstige physiologische Wirkungen von Cyclosporinen, FK506 und Rapamycin auf menschliche Zellen durch biologisch aktive Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs ?, ß, ? und ? entsprechen, oder rekombinante Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, verstärkt werden können. Die vorstehend erwähnten Peptide und rekombinanten Proteine können ohne weiteres durch allgemein zugängliche Synthese- oder Rekombinationstechniken hergestellt werden. Die vorliegenden Erfindung stellt bestimmte Verbesserungen von Zusammensetzungen für Arzneistoffe auf der Basis von Cyclosporinen, FK506 und Rapamycin, welche für Menschen und höhere Tiere bestimmt sind, vor. Diese Zusammensetzungen schließen Immunmodulatoren und biologisch aktive Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-proliferativen Stelle der INFs ?, β, ω und τ entsprechen, oder rekombinante Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, ein. Obwohl es nicht möglich, war, sämtliche der potentiellen bioaktiven Peptide oder der rekombinanten Proteine, enthaltend die Aminosäuresequenzen der Peptide, hier mit den Immunmodulator-Arzneistoffen (Cyclosporine, FK506 und Rapamycin) expertmentell zu testen, wurden derartige Strukturen durch umfassende Vergleiche von zugänglichen Aminosäuresequenzen von Interferonen aus verschiedenen Spezies mittels Computer und durch Molekülnachbildungtechniken unter Berücksichtigung der Versuchsdaten über die Lage der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs ?, ß, ? und τ und der Versuchsdaten über die Kompetition von Typ I-IFNs um die gemeinsamen Rezeptoren aufgezeigt. Die erfindungsgemäßen Peptide weisen den Vorteil auf, daß sie keine Antikörper wie große Polypeptide und natürliche Interferone hervorrufen. So können die Peptide als solche oder gebunden an Trägermoleküle über lange Zeiträume verwendet werden.

In vorhergehenden Studien (Zav'yalov V. et al., FEBS. Lett. 278 (1991), S. 187– 189; Zav'yalov V. et al., Molec. Immun. 32 (1995), S. 425–431) wurde gezeigt, daß nur das Octapeptid, welches den Aminosäureresten 130–137 von hIFN-&agr;2 entspricht, die gleiche oder eine höhere Affinität für die spezifischen Rezeptoren im Vergleich zu dem rekombinanten hIFN-α2 aufwies. Es ist gut bekannt, daß alle Typ I-IFNs um die gleichen Rezeptoren konkurrteren und die gleichen Typ I-IFN-Aktivitäten induzieren können. Daher ist es vernünftig anzunehmen, daß im Verlauf der natürlichen Selektion die Veränderungen in der Aminosäuresequenz der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs ?, β, ω und τ selektiert wurden, um die biologische Aktivität der Stelle nicht aufzuheben. IFNs sowie Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle davon entsprechen, und rekombinante Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, könnten die anti-proliferative Aktivität. reproduzieren und die immunsuppressive Aktivität der Cyclosporine verstärken.

Um das Zusammenwirken von Cyclosporin, FK506 oder Rapamycin und von Peptiden, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs α, β, ω und τ entsprechen, oder von rekombinanten Proteinen mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, zu untersuchen verwendeten die Erfinder das klassische antilymphoproliferative Testsystem mit menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen und der menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4. Die Zellkulturbedingungen und die Bedingungen der humoralen Zellen im Blutkreislauf sind eng miteinander verbunden. In der Tat werden in Zellkulturen, die häufig zum Testen potentieller Arzneistoffe verwendet werden, die Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert, Puffer, Mineralien, CO2- und O2-Partialdruck usw. ähnlich dem Blutkreislauf genau beibehalten. Andererseits liegen in diesem besonderen Fall die Zielzellen der Cyclosportne oder der anderen Immunsuppressiva und der Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs α, β, ω und τ entsprechen, oder der rekombinanten Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, welche als Arzneistoffe verwendet werden, besonders im Blutkreislauf in sehr ähnlichen Bedingungen wie in den Zellkultwert vor. Folglich ist sehr leicht voraussagbar, daß die erfindungsgemäßen Arzneistoffzusammensetzungen als Arzneimittel für Zwecke verwendet werden können, die vorher für Immunsuppressiva allein als Wirkstoff in den Arzneistoffformulierungen bestimmt waren.

Obwohl der wichtigste experimentelle Beweis der vorliegenden Endung auf der Verwendung von Peptiden, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs α, β, ω und τ entsprechen, oder rekombinanten Proteinen mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, mit Cyclosporinen beruht, können FK506 und Rapamycin mit einer gleichartigen Verstärkungswirkung wie mit Cyclosporinen verwendet werden. Obwohl die vorliegende Endung die Wirkungen von Peptiden, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs α, β, ω und τ entsprechen, oder rekombinanten Proteinen mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, auf Immunsuppressiva wie Cyclosporine, FK506 und Rapamycin beschreibt, ist offensichtlich, daß die Peptide, welche der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle der INFs ?, ß, ? und ? entsprechen, oder die rekombinanten Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die der Stelle entsprechen, in gleicher Weise die Aktivität irgendeines anderen Immunsuppressivums erhöhen.

Beispiel 1

95 ml Blut wurden einem jeden der 10 freiwilligen Spender abgenommen, und 5 ml 3–5%iges EDTA wurden sofort zu dem Blut zugegeben und vorsichtig vermischt, um ein Gerinnen zu verhindern. Das Blut wurde dann mit einem gleichen Volumen von Medium 199 oder mit gepufferter physiologischer Salzlösung gemischt. Ficoll-Paque (Pharmacia) wurde in Kunststoff-Zentrifugenteströhrchen mit Verschlüssen (Costar) gegossen (3 ml Ficoll-Paque pro Teströhrchen; das Volumen eines Teströhrchens beträgt 15 ml, Durchmesser 13 mm, bei Raumtemperatur) und anschließend wurden 6–7 ml verdünntes Blut vorsichtig überschichtet. Die Teströhrchen wurden bei 20°C für 40 Minuten bei 400 g zentrifugiert, wobei die Bremse der Zentrtfuge ausgeschalten war. Die einkernigen Zellen bildeten eine Schicht an der Grenze der Flüssigkeitsmarke, und die Zellen wurden mit einer Pasteurpipette in einem Zentrifugenteströhrchen mit 5 ml RPMI 1640, enthaltend 2% inaktiviertes fötales Kälberserum und Penicillin (100 Einheiten/ml) mit Streptomycin (100 Einheiten/ml), gesammelt: Anschließend wurden die Zellen mit physiologischer Pufferlösung (PBS) unter Zentrifugieren bei 400 g für 5 Minuten bei einer Temperatur von +8°C dreimal gewaschen. Wenn die Konzentration der Zellen 2,5 × 106 Zellen/ml betrug, wurden sie in RPMI 1640-Medium, enthaltend 5% fötales Serum (erhitzt für 30 Minuten bei 56°C), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Einheiten/ml Streptomycin, 1 ml 200 mM L-Glutamin pro 100 ml Serum, überführt. Alle Reagenzien wurden von Gibco hergestellt. Die Zellen wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen (100 &mgr;l pro Platte) mit dem Mitogen Phytohämagglutinin (PHA) (Endkonzentration - 2 mg/ml) getropft. Die zu untersuchenden Präparationen und die Immunsuppressiva (Cyclosporin A, FK506 oder Rapamyc n) in Konzentrationen von 5–20 mM wurden in die vorstehenden Röhrchen pipettiert. Die Platte wurde für 72 Stunden in einen CO2-Brutschrank bei 5% CO2 mit einer feuchten Atmosphäre gestellt. 12–18 Stunden vor Beendigung der Inkubation wurde 1 mCi [3H]-Thymid n zu jeder Vertiefung zugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit einem halbautomatischen Erntegerät (Titertec Flow Lab) unter Verwendung von Filtern (Whatman) gewaschen. Jeder Filter wurde vorsichtig in eine Flasche überführt, die 5 ml Szintillationsflüssigkeit (Sigma) enthielt. Die Anzahl der Zerfälle pro Minute wurde unter Verwendung eines Minibeta-Zählers (LKB) gezählt. Der Stimulationsindex wurde durch das artthmetische Mittel aus mindestens drei parallelen Messungen ±SD gegen die entsprechende Kontrolle bestimmt.

1 zeigt die Wirkung von rhIFN-?2 bzw. des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hINF-?2 entspricht (?-Peptoferon), auf die Mitogen (PHA)-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen. PHA induzierte eine starke lymphoproliferative Reaktion, die durch rhIFNα2 und α-Peptoferon in einer dosisabhängigen Weise gehemmt wurde. rhIFN-?2 und α-Peptoferon zeigten ähnliche Wirkungen. rhIFN-? hatte entweder keine Wirkung oder eine minimale verstärkende Wirkung auf die lymphoproliferative Reaktion. (1) rhIFN-?2; (2) α-Peptoferon; (3) Kontrolle: Kulturmedium; (4) Kontrolle: PHA.

Beispiel 2

2 zeigt die Wirkung von rhIFN-?2 und des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hINF-?2 entspricht (?-Peptoferon), auf die Proliferation der IFN-empfindlichen menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4. Die Proliferation der menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4 wurde durch rhIFN-?2 und α-Peptoferon in einer dosisabhängigen Weise gehemmt. rhIFN-?2 und ?-Peptoferon zeigten ähnliche Wirkungen. Es wurden ähnliche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet. (1) rhIFN-α2; (2) α-Peptoferon.

Beispiel 3

3 zeigt die Wirkung von rhIFN-α2 und des de novo konstruierten chimären Proteins Albeferon, enthaltend die TMα1-ähnliche Sequenz 130–137 von hIFN-?2, insertert in die N-Termini des Proteins direkt nach dem Initiator-Met-Rest (2) und des de novo konstruierten Proteins Albebetin ohne das hIFN-α2-Fragment (3) auf die PHA-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen. PHA induzierte eine starke lymphoproliferative Reaktion, die durch rhIFTV-α2 und Albeferon in einer dosisabhängigen Weise gehemmt wurde. rhIFN-α2 und Albeferon zeigten ähnliche Wirkungen. Albebetin hatte keine Wirkung auf die lymphoproliferative Reaktion. Die Ergebnisse zeigen, daß das hIFN-α2-Fragment, welches der TMα1-ähnlichen Sequenz 130–137 entspricht, für die anti-lymphoproliferative Wirkung von rhIFN-α2 verantwortlich ist. Es wurden ähnliche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet. (1) rhIFN-α2; (2) Albeferon; (3) Albebetin; (4) Kontrolle: Kulturmedium; (5) Kontrolle: PHA.

Beispiel 4

4 zeigt die Wirkung von rhIFN-?2, Albeferon und Albebetin auf die Proliferation der IFN-empfindlichen menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4. Die Proliferation der menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie MT-4 wurde durch rhIFN-?2 und Albeferon in einer dosisabhängigen Weise gehemmt. In diesem Expertment wies Albeferon eine höhere Aktivität als die verwendete Probe von rhIFN-?2 auf, die aber mit anderen Daten über rhIFN-α2 vergleichbar ist (vgl. 1-2 und die bei Dhib-Jalbu S. et al., J. Interferon and Cytokine Res. 16 (1996), S. 195–200, beschriebenen Daten). Albebetin hatte keine Wirkung auf die lymphoproliferative Reaktion. Die Ergebnisse zeigen, daß das hIFN-?2-Fragment, welches der TMα1-ähnlichen Sequenz 130–137 entspricht, für die anti-lymphoproliferative Wirkung von rhIFN-α2 verantwortlich ist. (1) rhIFN-α2; (2) Albeferon; (3) Albebetin.,

Beispiel 5

5 zeigt die Wirkung von rhIFN-?2 auf die PHA-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen in Gegenwart von 20 mM Cyclosporin A (CsA) im Kulturmedium. PHA induzierte eine starke lymphoproliferative Reaktion. Die gewählte Konzentration von CsA hatte eine verstärkende Wirkung auf die lymphoproliferative Reaktion. Die Verabreichung einer sehr gertngen Menge von rhIFN-&agr;2 (10-16) hob die durch PHA induzierte lymphoproliferative Reaktion vollständig auf. Eine ähnliche Wirkung auf die Mitogen-gesteuerte Proliferation von menschlichen T-Lymphocyten aus peripherem Blut in Gegenwart von 20 mM CsA im Kulturmedium wurde für das Octapeptid beobachtet, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hIFN-α2 entspricht (α-Peptoferon). Die Ergebnisse zeigen ein starkes Zusammenwirken einer antilymphoproliferativen Wirkung von, CsA und rhIFN-?2 oder des Peptids, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hIFN-α2 entspricht (α-Peptoferon). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Konzentrationen von 1–50 mM von FK506 oder Rapamycin anstelle von Cyclosporin A erhalten. Es wurden ähnliche Verfahren wie in Beispiel i angewendet. (1) rhIFN-?2 und 20 mM CsA; (2) ?-Peptoferon und 20 mM CsA; (3) Kontrolle: Kulturmedium; (4) Kontrolle: 20 mM CsA; (5) Kontrolle: PHA; (6) Kontrolle: 20 mM CsA und PHA.

Beispiel 6

6 zeigt die Wirkung von Albeferon auf die PHA-gesteuerte Proliferation von menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen in Gegenwart von 10 mM Cyclosporin A (CsA) im Kulturmedium. PHA induzierte eine starke lymphoproliferative Reaktion. Die gewählte Konzentration von CsA hatte eine verstärkende Wirkung auf die lymphoproliferative Reaktion. Die Verabreichung einer sehr gertngen Menge von Albeferon (10-12) hob die durch PHA induzierte lymphoproliferative Reaktion vollständig auf. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Konzentrationen von 1–50 mM von FK506 oder Rapamycin anstelle von Cyclosporin A erhalten. 6 zeigt auch, daß das Octapeptid, welches der mit hoher Affinität bindenden/anti-lymphoproliferativen Stelle von hIFN-?2 entspricht (?-Peptoferon), das an den makromolekularen Träger genetisch immobilisiert wurde (d.h. an das de novo-Protein Albebetin), biologisch aktiv ist. Es wurden ähnliche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet. (1) Albeferon; (2) Albeferon und 10 mM CsA; (3) Kontrolle: Kulturmedium; (4) Kontrolle: PHA; (5) Kontrolle: PHA und 10 mM CsA.


Anspruch[de]
  1. Arzneistoffzusammensetzung, bestehend aus den Immunsuppressiva Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin und den bioaktiven Peptiden, die der mit hoher Affinität-Bindungs-/anti-lymphoproliferativen Stelle der Interferone ?, ß, ?, ? entsprechen, oder rekombinanten Proteinen, die eine oder mehrere der Sequenzen tragen, die den Strukturen der bioaktivert Peptide entsprechen, die der mit hoher Affinität-Bindungs-/anti-lymphoproliferativen Stelle der genannten Interferone entsprechen, mit dem Ziel, die Wirkungen der Immunsuppressiva zu verstärken, um ihre therapeutische Dosis zu reduzieren und somit ihre unerwünschten Nebenwirkungen während, der Organ- oder Gewebetransplantation oder während der Behandlung verschiedener Krankheiten zu vermeiden, bei denen Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin ausgenutzt werden können.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bestehend aus den Immunsuppressiva Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin mit einem oder mehreren der Peptide, die mindestens 5 identische Aminosäurereste aus der folgenden Tabelle enthalten:


    wobei, jeder Aminosäurerest in der obersten Sequenz durch einen beliebigen Aminosäurerest darunter modifiziert werden kann.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bestehend aus den Immunsuppressiva Cyclosporine, FK506 oder Rapamycin und rekombinanten Proteinen, die eine oder mehrere Sequenzen tragen, die der Peptidvartante nach Anspruch 2 entsprechen.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, bestehend aus den Immunsuppressiva Cyclosporine, FK506 und Rapamycin und den bioaktiven Peptiden, wobei die aktiven Peptide genetisch oder chemisch modifiziert oder genetisch oder chemisch oder physikalisch an einen niedermolekularen oder makromolekularen Stoff gebunden sind, um die Stabilität der Peptide unter physiologischen Bedingungen zu erhöhen oder die Bioverfügbarkeit der Peptide zu regulieren.
Es folgen 6 Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com