Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterienkomplexe, die zur Verwendung beim Abbau, der Zersetzung und der Umwandlung von Rückständen biologischen Ursprungs in Biomasse und stabile und nicht umweltschädliche organische Verbindungen geeignet sind, und ihre Anwendung zur Behandlung von Abfällen biologischen Ursprungs, beispielsweise von Fäkalien (Streu von Schweinen, Wiederkäuern, Einhufern oder Geflügel oder Güflüel, menschliche Fäkalien) oder Jauche, Kadavern, stehenden Gewässern, und ihre Umwandlung in Kompost oder andere stabile, bioabbaubare und nicht umweltschädliche Stickstoffverbindungen.

Heterotrophe Organismen verwerten Stickstoffverbindungen, darunter pflanzliche oder tierische Proteine, als Nährstoffquellen und geben den Stickstoff über ihre Ausscheidungen oder über die Zersetzungsprodukte nach dem Tod wieder an die Erde ab, hauptsächlich als Ammoniak oder Harnstoff, die durch nitrifizierende Bakterien im Boden, beispielsweise Nitrosomonas oder Nitrobacter, in Nitrite und Nitrate umgewandelt werden.

Eine starke Produktion gasförmiger oder flüssig-fester Stickstoffverbindungen, beispielsweise von Ammoniumsalzen, Ammoniak, Nitriten und Nitraten, stellt jedoch eine wichtige Ursache für die Verschmutzung der Atmosphäre, des Bodens, der Wasserläufe und des Grundwassers dar. All diese Abbauprozesse beinhalten die Bildung von Verbindungen mit besonders ekelhaftem Geruch (besonders NH₃, H₂S ...).

Bekannt ist das Patent JP-B-59 013175, das die anaerobe Fermentation eines Futtermittels betrifft und die Herstellung von Futter durch Fermentation von trockenem Stroh mit einem Bacillus (Bacillus subtilis) und Lactobacillus (Lactobacillus plantarum und Lactobacillus brevis) beschreibt.

Bekannt ist auch die Patentanmeldung JP-A-OS078663, die versucht, eine Zusammensetzung herzustellen, die den Boden verbessert und Maulwürfe abschreckt, und die die Herstellung einer Zusammensetzung beschreibt, die den Boden durch Inokulation eines Präparats auf Sojabasis mit Hilfe einerseits einer Kultur von Clostridium butyricum, Bacillus cereus, Lactobacillus casei subsp. casei und Lactobacillus fermentum und andererseits einer Kultur von Bacillus cereus, Lactobacillus casei subsp. phamnosus, Lactobacillus acidophilus und Acetobacter aceti verbessert.

Bekannt sind ferner Verfahren zur Behandlung von Gülle, Streu oder. Abwässern, die eine Bakterienkultur und Enzyme oder eine Bakterienkultur, Enzyme und Hefen einwirken lassen, insbesondere um die Bildung von Ammoniumsalzen und die Gerüche, insbesondere bei der Handhabung und beim Ausbringen (Gülle), zu verringern. Solche Zusammensetzungen enthalten als Bakterien insbesondere: Bacillus subtilis, als Enzyme: Batinase und Amylase, und als Hefen: Saccharomyces cerevisiae (Französische Patentanmeldung 2 658 077).

Die bekannten Zusammensetzungen zur Behandlung von Fäkalien erlauben jedoch keine Umwandlung von anorganischem Stickstoff (NH₄, NO₂ und NO₃) und von Uraten in Aminosäuren und Proteine (organischen Stickstoff), sondern verringern nur die Ammoniakbildung durch Adsorption oder Solubilisierung. Solche Umwandlungen beinhalten keine Reorganisation des Stickstoffs durch seine Verwertung im Stickstoffmetabolismus der Mikroorganismen.

Folglich ist eine wirkungsvolle Behandlung von Produkten biologischen Ursprungs erforderlich und entscheidend, um die Umwandlung des anorganischen Stickstoffs (NH₄, NO₂ und NO₃) und der Urate in organischen Stickstoff (Aminosäuren und Proteine) zu ermöglichen, um die Verschmutzung der Umwelt zu vermeiden und um die Abfälle wieder in den Kreislauf des Anabolismus zurückzuführen.

Zur Lösung dieses Problem hat die Anmelderin Bakterienkomplexe gewählt, die im wesentlichen die Umwandlung von anorganischem Stickstoff in organischen Stickstoff in Form von bakteriellen Proteinen ermöglichen {Stabilisierung des Stickstoffs und Steigerung der Biomasse), das heißt, die die Umwandlung der Fäkalien in Stickstoffverbindungen (Kompost und/oder stabile Stickstoffverbindungen) und, durch Abbau und Umwandlung der Fäkalien insbesondere bei Abfällen mit ausreichendem C/N-Verhältnis (in Bezug zur Menge Trockenmasse), in Zusammensetzungen ermöglichen, die reich an Fulvin- und Huminsäuren sind und nicht umweltschädlich sind, wobei die assoziierten pathogenen Keime, insbesondere Clostridium, Bacteroides, Kolibazillen, Listeria, Salmonellen und Staphylokokokken eliminiert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Bakterienkomplex, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er wenigstens einen nichtpathogenen Bacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. Iichenifornis und B. circulans, und wenigstens einen nichtpathogenen Lactobacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum und L. acidophilus, umfaßt, daß er als Stickstoffquelle hauptsächlich anorganischen Stickstoff, insbesondere Ammoniak, Nitrate, Nitrite, und organische Stickstoffmoleküle wie Harnstoff, Urate, Aminosäuren, Stickstoffbasen oder irgendeine andere niedermolekulare Stickstoffverbindung verwertet, und daß er fähig ist, diesen Stickstoff in organischen Stickstoff in Form von bakteriellen Proteinen umzuwandeln.

Erfindungsgemäß weist der vorliegende Bakterienkomplex wenigstens die folgenden enzymatischen Aktivitäten auf:

cellulolytische Aktivität, proteolytische Aktivität, amylolytische Aktivität, lipolytische Aktivität und pektinolytische Aktivität.

Unerwarteterweise wirkt die Kombination Bacillus/Lactobacillus, die in dem erfindungsgemäßen Bakterienkomplex vorliegt, synergistisch, um:

• – gleichzeitig anorganischen Stickstoff und organischen Stickstoff zu verwerten,
• - bakterielle Proteine neuzusynthetisieren und
• – die mit den zu behandelnden Produkten assoziierten pathogenen Mikroorganismen, wie Clostridium, Bacteroides, Kolibazillen, Listeria, Salmonellen und Staphylokokken, zu eliminieren.

Ein derartiger Bakterienkomplex erlaubt es also, die Abfälle effektiv in den Kreislauf des Anabolismus zurückzuführen (Organisation in trophischer Kette).

Erfindungsgemäß liegt das Verhältnis von Lactobacillus:

Bacilus in diesem Komplex, abhängig vom jeweiligen Fall, zwischen 100 : 1 und 1 : 100, vorzugsweise zwischen 10 : 1 und 1 : 10, beispielsweise 1 : 1.

Erfindungsgemäß liegen die Bakterienkonzentrationen zwischen 10² und 10⁸ CFU/g.

Der Bakterienkomplex umfaßt vorteilhaft wenigstens einen Bacillus in einer Konzentration zwischen 10² und 10⁷ CFU/g und wenigstens einen Lactobacillus in einer Konzentration zwischen 10³ kund 10⁸ CFU/g. Ein solcher Bakterienkomplex findet vorzugsweise bei der Behandlung der Streu von Wiederkäuern, Einhufern oder Schweinen Verwendung.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt der Bakterienkomplex wenigstens B. subtilis in einer Konzentration zwischen 10² und 10⁷ CFU/g und einen Lactobacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum und L. acidophilus, in einer Konzentration zwischen 10³ und 10⁸ CFU/g.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform dieses Komplexes umfaßt dieser die 5 folgenden Bacillus: B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. Iicheniformis und B. circulars, jeweils in einer Konzentration zwischen 10² und 10⁷ CFU/g, und die 4 folgenden Lactobacillus: L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum, L. acidophilus, jeweils in einer Konzentration zwischen 10³ und 10⁸ CFU/g.

wenn der Bakterienkomplex mehrere Bacillus und/oder mehrere Lactobacillus umfaßt, liegen die verschiedenen Stämme einer selben Gattung (Bacillus oder Lactobacillus) vorteilhaft in einem Verhältnis zwischen 1 : 1 und 1 : 100 vor.

In einer weiteren Ausführungsform des Bakterienkomplexes umfaßt dieser vorzugsweise wenigstens einen Bacillus, der als Stickstoffquelle Urate verwertet, insbesondere B. subtilis, in einer Minimalkonzentration von 10³ CFU/g, gegebenenfalls einen weiteren Bacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. licheniformis und B. circulans, und wenigstens einen Lactobacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum, L. acidophilus, in einer Konzentration zwischen 10² und 10⁸ CFU/g. Ein solcher Bakterienkomplex eignet sich besonders gut zur Behandlung der Streu von Geflügel oder anderen Monogastriden (Ausnahme Schwein).

In einer weiteren Ausführungsform des Bakterienkomplexes umfaßt dieser vorzugsweise wenigstens einen Lactobacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum, L. acidophilus, und wenigstens einen Bacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus B, subtilis, B. amyloliquefaciens, B, megaterium, B. licheniformis und B. circulans, wobei das Verhältnis von Lactobacillus : Bacillus zwischen 1 : 1 und 1 : 10 liegt. Ein solcher Bakterienkomplex eignet sich besonders zur Behandlung von Gülle, Klärteichen oder Klärgruben.

In einer weiteren Ausführungsform des Bakterienkomplexes umfaßt dieser vorzugsweise die folgenden zwei Bacillus: B. subtilis und B. megaterium, jeweils in einer Konzentration zwischen 10² und 10² CFU/g, und wenigstens einen Lactobacillus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum, L. acidophilus, in einer Konzentration zwischen 10³ und 10⁸ CFU/g. Ein solcher Bakterienkomplex ist insbesondere zur Behandlung von Tierkadavern besonders gut geeignet.

Überraschenderweise erlaubt die Assoziation von wenigstens einem Bacillus und wenigstens einem Lactobacillus, wie oben definiert, tatsächlich die Herstellung eines Bakterienkomplexes, der:

• – Fäkalienreste, Urinreste oder andere Abfälle biologischen Ursprungs mittels bakterieller Synthese, d. h. durch Verwertung des anorganischen Stickstoffs aus den verschiedenen Abfällen, entweder direkt oder durch Abbau in bakterielle Proteine umwandelt;
• - dem Mist den Geruch nimmt;
• - verschiedene Medien und/oder Wasser denitrifizieren kann;
• - die Kompostierung bei niedrigen Temperaturen (unter 45°C und ohne den Abbau von Masse signifikant beschleunigt.

Eine solche Wahl der Stämme führt im Lauf der Zeit auch nicht zum Verlust von Stickstoff (Stabilisierung der Stickstoffmasse).

Ferner ist der erfindungsgemäße Bakterienkomplex über die Zeit stabil.

In einer Variante umfaßt der Bakterienkomplex wenigstens einen nichtpathogenen Bacillus, wenigstens einen nichtpathogenen Lactobacillus und einen nichtpathogenen Pediococcus.

Wenn ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex einen Pediococcus umfaßt, liegt letzterer in denselben Konzentrationen wie die Lactobacillus vor.

Überraschenderweise weist ein solcher Bakterienkomplex neben den oben angegebenen Eigenschaften eine Inhibitorwirkung gegenüber Staphylococcus aureus auf.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Bakterienkomplex, der Gram+ Bacillus-Stämme umfaßt, die die folgenden Merkmale aufweisen:

• - sie sind fähig, als Stickstoffquelle anorganischen Stickstoff, insbesondere Ammoniak, Nitrate, Nitrite, und organische Stickstoffmoleküle wie Harnstoff, Urat, Aminosäuren, Stickstoffbasen oder andere niedermolekulare Stickstoffverbindungen zu verwerten,
• – sie weisen wenigstens eine der folgenden Aktivitäten auf: amylolytische Aktivität, cellulolytische Aktivität, lignocellulolytische Aktivität, pektinolytische Aktivität, lipolytische Aktivität, proteolytische Aktivität, keratolytische Aktivität, Bakteriozin- oder Bakteriozin-ähnliche Aktivität,
• - sie weisen wenigstens die folgenden biochemischen Merkmale auf: Gelatinase +, Catalase +, Urease -, Oxydase -, Indol -, und
• - sie sind vorzugsweise fakultative Aerobier/Anaerobier.

Solche Bacillus-Stämme werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans besteht.

Diese Bacillus-Stämme wurden am 8. Juni 1994 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) hinterlegt, nämlich Bacillus subtilis unter den Nummern I-1433, I-1438 und I-1440, Bacillus amyloliquefaciens unter den Nummern I-1434 und I-1435, Bacillus megaterium unter der Nummer I-1436, Bacillus licheniformis unter der Nummer I-1437 und Bacillus circulans unter der Nummer I-1439.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Bakterienkomplex, der Gram+ Lactobacillus-Stämme umfaßt, die die folgenden Merkmale aufweisen:

• - sie sind fähig, als Stickstoffquelle anorganischen Stickstoff, insbesondere Ammoniak, Nitrate, Nitrite, und organische Stickstoffmoleküle wie Harnstoff, Urat, Aminosäuren, Stickstoffbasen oder ändere niedermolekulare Stickstoffverbindungen zu verwerten,
• – sie weisen wenigstens eine Bakteriozin- oder Bakteriozin-ähnliche Aktivität auf,
• – sie weisen vorteilhaft wenigstens die folgenden biochemischen Merkmale auf: Catalase -, Oxydase -, und
• – sie sind vorzugsweise fakultative Aerobier/Anaerobier.

Solche Lactobacillus-Stämme werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus und Lactobacillus fermentum besteht Diese Lactobacillus-Stämme wurden am 28. Juli 1994 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) hinterlegt, nämlich Lactobacillus rhamnosus unter den Nummern I-1450, I-1452, I-1453, I-1454, I-1455, I-1456, I-1459, Lactobacillus paracasei unter den Nummern I-1451, I-1457 und I-1458, Lactobacillus acidophilus unter der Nummer I-1460, und Lactobacillus fermentum unter der Nummer I-1461.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Bakterienkomplex, der Gram-positive Pediococcus-Stämme umfaßt, die die folgenden Merkmale aufweisen:

• - sie weisen wenigstens gegenüber Staphylococcus aureus eine Bakteriozin- oder Bakteriozin-ähnliche Aktivität auf,
• - sie weisen vorteilhaft wenigstens die folgenden biochemischen Merkmale auf: Catalase -, Oxydase -, und
• – sie sind vorzugsweise fakultative Aerobier/Anaerobier.

Als Pediococcus-Stamm, der dieser Definition entspricht, ist insbesondere der Stamm Pediococcus pentosaceus zu nennen, der am 22. Dezember 1995 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) unter der Nummer I-1654 hinterlegt wurde.

Unerwarteterweise weisen Bakterienkomplexe, die wenigstens einen Bacillus und wenigstens einen Lactobacillus und gegebenenfalls einen Pediococcus in Kombination umfassen, die oben spezifizierten Merkmale auf, wirken synergistisch, um die in ihrer Gegenwart behandelten Produkte in eine nützliche Form zu überführen, und reduzieren so die Unannehmlichkeiten, Belästigungen und sogar die Umweltbelastung durch diese Produkte auf ein für die Böden, den Ackerbau und die gesamte Nahrungskette gesundheitlich verträgliches Niveau und stellen auf diese Weise vorteilhaft einen Teil der Abfallbehandlung dar.

Vorteilhaft wird der erfindungsgemäße Bakterienkomplex ausgehend von diesen Stämmen wie folgt erhalten:

• - Kultivierung und Produktion von jedem Stamm einzeln,
• – Herstellung von verschiedenen Kulturen, von denen jede eine Mikroorganismen-Konzentration im Bereich von 1010 bis 10¹¹ CFU/g besitzt,
• - Lyophilisieren jeder Kultur,
• - Verdünnung von jedem dieser lyophilisierten Stämme auf 1/100 bis 1/1 O0O 000 in Gegenwart eines neutralen Verdünnungsmittels (pflanzlich oder mineralisch wie Tonerde, Lithothamne-Maisgrit...), und
• Vermischen der verschiedenen so verdünnten Stämme zum Erhalt des gewünschten Bakterienkomplexes.

Er kann außerdem Additive wie einen chemischen oder mikrobiologischen Tracer umfassen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zusammensetzung zur Behandlung biologischer Rückstände (gebrauchsfertiges verdünntes Produkt), die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie in Assoziation einen erfindungsgemäßen Bakterienkomplex, wenigstens ein neutrales Verdünnungsmittel und wenigstens ein Fixiermittel für Mikropartikel umfaßt.

Tatsächlich stellen die Bakterienkomplexe, wie sie oben definiert sind, ein Bakterienkonzentrat dar, das zur Verwendung bei der Behandlung von Mist, Gülle, Kompost, Kadavern etc, vorzugsweise auf einem Träger fixiert sein kann.

Solche Zusammensetzungen umfassen also vorteilhaft ein neutrales Verdünnungsmittel, identisch oder verschieden von dem, das zur Herstellung des Bakterienkomplexes verwendet wird, und ein Fixiermittel für Mikropartikel, beispielsweise Melasse, die gleichzeitig die Rolle einer Energiequelle spielt und eine Haftwirkung auf die Partikel ausübt, Stärkederivate oder Derivate anderer Zucker (langsam abgebaute komplexe Zucker), ein Öl oder ein Fett zur Umhüllung.

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung im wesentlichen 5–15% Bakterienkomplex, 80-89% neutrales Verdünnungsmittel und 3–5% Fixiermittel für Mikropartikel, vorzugsweise 10% Bakterienkomplex, 87% neutrales Verdünnungsmittel und 3% Partikelfixiermittel.

Die Zusammensetzung zur Behandlung eignet sich bei niedrigeren, aber wirksamen Konzentrationen für die gleichen Applikationen wie der erfindungsgemäße Bakterienkomplex.

Sie kann insbesondere zum direkten Einbringen in Streu, Gülle oder jedes andere zu behandelnde organische Produkt [Mist, Pflanzenabfälle, organische Abfälle (Kadaver und Schlachtabfälle)] in Mengen von 0,2 bis 50 kg pro Tonne organisches Produkt verwendet werden.

Erfindungsgemäß schwanken die eingebrachten Mengen abhängig von der Applikation, insbesondere:

• – für Streu: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird in einer Menge von 10 kg/t Stroh in die Streu eingebracht; eine wöchentliche Versorgung in einer Menge von 3 kg/t Stroh wird empfohlen;
• – für Gülle: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird in einer Menge von 100 g bis 1 kg/t in die Gülle eingebracht; eine wöchentliche Versorgung in einer Menge von 100 g bis 3 kg/t wird empfohlen;
• – für zu kompostierenden Mist: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird auf einmal in einer Menge von 1 bis 5 kg/t in den zu kompostierenden Mist eingebracht;
• – für zu kompostierende Kadaver: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird auf einmal in einer Menge von 1 bis 10 kg/t in die zu kompostierenden Kadaver eingebracht;
• – für Klärteiche: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird einmal alle 3 Monate in einer Menge von 500 g/m² in die Klärteiche eingebracht;
• – für Klärgruben: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird in einer Menge von 100 g bis 1 kg/t in die Klärgruben eingebracht; eine wöchentliche Versorgung in einer Menge von 100 g bis 3 kg/t wird empfohlen;
• – zur Desinfektion von Räumen und insbesondere zur Desinfektion von Kloräumen: ein erfindungsgemäßer Bakterienkomplex oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung wird in Mengen von 10 g/l Wasser in Form einer Schicht (künstlicher Biofilm) auf die Wände und die Böden dieser Räumlichkeiten aufgebracht; die erhaltene Lösung wird vorzugsweise auf die Wände aufgesprüht.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Behandlung von biologischen Rückständen, beispielsweise von Fäkalien, Mist, Kadavern oder ähnlichem, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es das In-Kontakt-Bringen eines erfindungsgemäßen Bakterienkomplexes oder einer wie oben definierten Zusammensetzung mit einem zu behandelnden biologischen Rückstand umfaßt.

Neben den vorangehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung Beispiele für die Umsetzung des Verfahrens, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, die lediglich der Erläuterung des Gegenstandes der Erfindung dienen.

Die Stämme weisen die in den nachfolgenden Tabellen angegebenen morphologischen und biochemischen Merkmale auf:

Die Ergebnisse der Versuchsreihen gemäß API 50 CH, die das Fermentationsprofil der Zucker angeben (positive Merkmale nach maximal 48 h Inkubation) (Inokulation gemäß API) (Punkt 2 in der MacFarland-Skala), sind in den 1 bis 8 dargestellt.

Die Stämme weisen die in den nachfolgenden Tabellen angegebenen morphologischen und biochemischen Merkmale auf:

Die Ergebnisse der Versuchsreihen gemäß API 50 CH, die das Fermentationsprofil der Zucker angeben (positive Merkmale nach maximal 48 h Inkubation) (Inokulation gemäß API) (Punkt 2 in der MacFarland-Skala), sind in den 9 bis 20 dargestellt.

Der Stamm Pediococcus pentosaceus weist die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen morphologischen und biochemischen Merkmale auf:

Die Ergebnisse der Versuchsreihen gemäß API 50 CH, die das Fermentationsprofil der Zucker angeben (positive Merkmale nach maximal 48 h Inkubation) (Inokulation gemäß . API) (Punkt 2 in der MacFarland-Skala), sind in der 29 dargestellt.

Die Wahl von Stämmen mit einer enzymatischen Aktivität erlaubt insbesondere einen kontrollierten Abbau von Fäkalien.

In den meisten Tests wurden die enzymatischen Aktivitäten für die Bacillus-Stämme auf Minimalmedium (MMB) auf Agarbasis und für die Lactobacillus-Stämme auf Rogosa-Medium nachgewiesen.

Die Stämme werden auf dem MMB-Medium oder dem Rogosa-Medium ausgestrichen, denen jeweils 1% (Gewicht/Volumen) Magermilchpulver zugesetzt war, das reich an hydrolyseempfindlichem Casein war.

Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 30°C im Brutschrank für Bacillus und von 5 Tagen bei 37°C im anaeroben Brutschrank für die Milchflora zeigt sich die proteolytische Aktivität aufgrund der Hydrolyse des Caseins in einem Klarwerden des Mediums.

wie zuvor werden die Bakterienstämme auf den zwei Medien ausgestrichen, denen 1% (Gewicht/Volumen) unlösliche Getreidestärke zugesetzt war. Nach Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie oben zeigt sich die amylolytische Aktivität aufgrund der Hydrolyse der Stärke in einem Klarwerden des Mediums um die ausgestrichenen Kolonien.

Das Versuchsprotokoll ist das gleiche wie für die Untersuchung der amylolytischen Aktivität. Das eingesetzte Kohlenstoffsubstrat ist Carboxymethylcellulose.

Das Prinzip ist das gleiche wie für den Abbau der Stärke, wobei die Harnsäure in einer Konzentration von 1% (Gewicht/Volumen) zugesetzt wird, die Hydrolyse der Harnsäure zeigt sich, in einem Klarwerden des Mediums.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse und die erhaltenen Reaktionsprodukte:

Die Ergebnisse zeigen, daß mit Ausnahme des Stammes ISB11, alle Bacillus-Stämme in der Lage sind, Harnsäure bis zum Ammoniak abzubauen.

sDie Hydrolyse von Harnstoff zeigt sich in der Verwertung des Mediums von Stuart. Dieses Medium enthält einen Farbindikator: Phenolrot, das in jedem Reagenzglas von Gelb nach Dunkelrosa umschlägt, wenn der Harnstoff hydrolysiert wird.

Die verschiedenen Stämme werden auf einem Tributyrin-Agarmedium angesetzt. Vor der Verwendung werden die Medien, aufgeteilt in Reagenzgläschen, geschüttelt, um das Tributyrin, zu emulgieren, und dann in Petrischalen gegossen. Nach Inkubation unter den oben angegebenen Bedingungen zeigt sich die Hydrolyse des Tributyrins in einem Klarwerden des Mediums um die Kolonie herum.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die oben genauer beschriebenen verschiedenen Aktivitäten.

Die verschiedenen Bazillen zeigen daneben weitere enzymatische Aktivitäten, die in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt sind:

Die ausgewählten Lactobacillus zeigen keine amylolytische, proteolytische oder lipolytische Aktivität.

Die Untersuchung von Inhibitorsubstanzen erfolgt für alle ausgewählten Stämme.

Die Bakteriozine sind Proteine plasmidischen Ursprungs, deren Besonderheit es ist; daß sie eine bakterizide Wirkung haben, die gegen Bakterien derselben Spezies oder homologer Spezies gerichtet ist. Die Produktionsstämme für Bakteriozine besitzen ein Immunitätsgen gegen ihr eigenes Bakteriozin. Bei bakteriziden Wirkungen gegen heterologe Bakterien spricht man von Bakteriozin-ähnlicher Aktivität.

Die Selektion von Stämmen, die zur Produktion von Inhibitorsubstanzen vom Bakteriozin-Typ fähig sind, erfolgt auf einer Petrischale, indem das Klarwerden um eine Bakterienkolonie herum beobachtet wird. Dieses Klarwerden geht auf die Inhibierung der pathogenen Bakterien im Agar durch die selektionierten Stämme zurück.

Die für diese Untersuchung verwendeten pathogenen Bakterien sind:

• – Escherichia coli (Serotyp O78K82)
• – Salmonella enteritidis
• – Salmonella typhimurium
• – Staphylococcus aureus
• – Clostridium perfringens
• – clostridium septicum
• – Listeria monocytogenes.

Es handelt sich um die wesentlichen Pathogene, die in kontaminierter Streu vorkommen.

Die zur Kultivierung der pathogenen Bakterien eingesetzten Medien sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.

Die Lactobacillus-Stämme sind Milchsäureproduzenten, die die Hauptquelle für die in vitro-Inhibierung der pathogenen Bakterien ist.

Um diesen Faktor zu auszugleichen, wird Rogosa-Medium das mit einem Phosphatpuffer auf pH 6,1 gepuffert ist, zur Kultivierung der Lactobacillus-Stämme eingesetzt.

Nach Ansetzen der verschiedenen Lactobacillus-Stämme und S h Inkubation bei 37°C unter anaeroben Bedingungen wird jede Kolonie mit einem Tropfen Medium, das für das. zu testende pathogene Bakterium spezifisch ist, aufgenommen.

20 ml Agarmedium für die spezifischen pathogenen Stämme, dem 5 ml einer pathogenen Bakterienkultur zugesetzt wurden, werden in die Schale gegossen.

Die Petrischalen werden nach 24 h Inkubation bei 37°C gelesen.

Die Größe der gebildeten Inhibierungshöfe wird gemessen; der berechnete Inhibierungsdurchmesser entspricht der Differenz zwischen dem Durchmesser des Inhibierungshofs und dem Durchmesser der Lactobacillus-Kolonie. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.

Zur Untersuchung der Bakteriozin-Wirkung von Bacillus sind die. Bedingungen wie folgt:

10 ml PCA-Medium werden in Petrischalen gegossen; 24 h-Kulturen der ausgewählten Bacillus-Stämme werden auf Spots umgepickt; nach 24 h Inkubation bei 30°C wird der Agar mit. einem sterilen Spatel abgelöst und in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gegeben; 20 ml agarhaltiges, für die pathogenen Stämme spezifisches Medium, dem 5 ml einer Vorkultur der gleichen Bakterien zugesetzt waren, werden in die Petrischale gegossen.

Die Petrischalen werden nach 24 h Inkubation wie oben für Lactobacillus beschrieben gelesen.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Keiner der ausgewählten Stämme zeigt eine Inhibitorwirkung gegenüber Staphylococcus aureus. Die verschiedenen ausgewählten Stämme zeigen vielmehr besonders interessante Inhibierungsspektren sowie sämtliche untersuchten enzymatischen Aktivitäten.

Die Ergebnisse zeigen, daß die getesteten Lactobacillus-Stämme resistenter sind als die Bacillus-Stämme; man stellt eine starke Inhibierung der Bacillus-Stämme durch Avotan und Sacox fest, wobei die MIC-Werte <0,625 bzw. 1,25 sind.

Der Stamm ISL44 ist gegen die meisten Wachstumsfaktoren resistent.

Nach Kultivierung von Pediococcus in MRS-Medium (de Man, Rogosa und Sharpe) mit 4% NaCl wird eine Verdünnungs/Suspensionsreihe bis auf 10^-7 hergestellt; die Verdünnungen 10^-1 bis 10^-5 werden auf Petrischalen, die MRS-Medium enthalten, in einer Menge von 0,1 ml pro Verdünnung angesetzt und anschließend verteilt. Der Ansatz erfolgt für jede Verdünnung zweifach. Die Schalen werden bei 37°C im Brutschrank unter anaeroben Bedingungen (10% CO₂ und 90% N₂) 48 h inkubiert.

Vor Gewinnung des Kulturüberstandes wird die Reinheit des Stammes festgestellt, indem man die Stämme nach der Quadrantenmethode auf MRS-Agarplatten ausstreicht (Kultivierung 48 h bei 37°C im Brutschrank unter anaeroben Bedingungen). Eine sauber isolierte Kolonie wird zum Animpfen eines Röhrchens mit 10 ml MRS-Nährlösung verwendet, welche anschließend unter Anaerobiose 24 h bei 37°C in den Brutschrank gestellt wird. 1 ml jeder Vorkultur wird in 50 ml MRS-Nährlösung angesetzt und die Inkubation erfolgt über 16 h unter den gleichen Bedingungen; am Ende der 16-stündigen Inkubation werden 20 ml Kulturüberstand entnommen und bei 10 000 g zentrifugiert. Der zellfreie Überstand, der die sekretierten Produkte enthält, wird gesammelt.

Der erhaltene Überstand wird mehrfach behandelt, um sicherzustellen, daß die Inhibierung auf die Anwesenheit eines Bakteriozins zurückzuführen ist; tatsächlich zeigt der Überstand einen sauren pH (um 4,5), enthält organische Säuren, die von dem Stamm produziert wurden (Essigsäure und Milchsäure), Wasserstoffperoxid (Abwesenheit von Catalase):

• Inhibierung der pH-Wirkung: Neutralisierung auf pH 6, 5–7, 5 (pH-Test) ;
  
  Feststellen der Wirkung der organischen Säuren: Kontrolle, die lediglich diese Säuren enthält (Säuretest);

• Inhibierung der Wirkung des Wasserstoffperoxids: Kontrollen mit Catalase (Inkubation von 0,5 ml Catalase mit 0,5 ml Kulturüberstand von Pediococcus pentosaceus über 1 h bei 37°C, dann vor Durchführung des Inhibierungstests 1 Stunde Abkühlen auf Raumtemperatur) (Catalase-Test);
  
  Feststellen der Temperaturwirkung (Hitze oder Kälte) (Kälte- und Hitzetests);
  
  Feststellen der Wirkung der proteolytischen Enzyme (Trypsin, &agr;-Chymotrypsin, Pronase E) nach einer Vorschrift, die der für die Catalase identisch ist (Trypsin-, Pronase- und &agr;-Chymotrypsin-Tests);
  
  Bestimmung des Molekulargewichts des produzierten Bakteriozins (Dialysetest).

Sämtliche hergestellten Proben (Kulturüberstand und verschiedene Kontrollen) werden mit Hilfe von 0,2 &mgr;m-Filtern sterilisiert; der Test wird wie folgt durchgeführt:

In zwei Petrischalen werden 100 ml BNG gegossen, das auf 45°C gehalten wurde und dem 0,5 ml einer 16-Stunden-Kultur von S. aureus zugesetzt waren. Man läßt das Ganze festwerden; mittels eines Locheisens werden 9 Vertiefungen in jede Schale gemacht. Man läßt die Schalen erneut während etwa 1 h bei 4°C festwerden. Jede Vertiefung wird dann, wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt, mit 100 &mgr;l Probe aufgefüllt (Kulturüberstand oder Kontrolle).

Die Schalen werden etwa 2 h bei 4°C stehen gelassen, damit das Bakteriozin in den Agar diffundiert, dann wird das Ganze 24 h bei 37°C in den Brutschrank gestellt.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Diese Ergebnisse zeigen, daß Pediococcus pentosaceus ein Bakteriozin. produziert, das effektiv gegen S. aureus wirkt.

• 1) Vergleich der Generationszeiten (Tg), der Zahl der CFU/ml und der Überlebensrate für einige Lactobacillus-Stämme in Monokultur/in Assoziation in einem erfindungsgemäßen Bakterienkomplex (in einem Medium aus Kot, steril und mit den angegebenen Bakterien angeimpft):
  
  

• 2) Vergleich der Generationszeit und der Zahl der CFU/ml von Bacillus-Stämmen in Monokultur und in Cokultur:
  
  

• 3) Abbau von Harnsäure

Die Streu wird derart angesät, daß die Bacillus-Konzentration 100 CFU/g Stroh beträgt (2 × 10³ CFU-Bacillus auf 20 g Produkt zur Behandlung von Streu (erfindungsgemäßer Komplex oder erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung)).

Es wurden unterschiedliche experimentelle Methoden zum Ansäen der Streu verwendet.

Eine erste Methode besteht darin, daß man 400 g Streu, die in eine luftdicht verschlossene Schachtel gegeben wurde, mit einem erfindungsgemäßen Bakterienkomplex ansät. Die Inkubation erfolgt bei 30°C. Nach 3 bis 7 Tagen Inkubation werden 20 g Streu entnommen. Die Proben werden anschließend wie folgt verarbeitet: 20 g zu analysierendes Produkt werden mit 180 ml Trypton-Salz als Verdünnungsmittel vermischt und dann 2 min im Stomacher (Labormischer) homogenisiert. Ausgehend von dieser Stammsuspension (-Verdünnung auf 1/10) wird eine Verdünnungsreihe zur Mikrobenanalyse hergestellt.

Bei der zweiten eingesetzten Methode werden zur Verbesserung der Homogenität des Anssäens 20 g Streu in einen Stomacher-Beutel mit Filter gegeben, mit dem sich die Entnahme von Streuresten für die Verdünnung vermeiden läßt. Das Ansäen erfolgt direkt in den Beuteln, die anschließend bei 30°C für die gewünschte Zeit inkubiert werden, wobei jede Zeit einem Beutel zugeordnet ist. Anschließend werden 60 ml Trypton-Salz als Verdünnungsmittel in die Streu gemischt, dann wird eine Zehner-Verdünnungsreihe hergestellt.

Die Auswertungen erfolgen für:

• – die thermoresistente Flora (Bacillus)
• – die fäkalischen Coliforme,
• – die Sulfit-reduzierenden Anaerobier, (Clostridium),
• – die Milchflora (Lactobacillus),

entsprechend üblichen Kultivierungsvorschriften.

Die Anwesenheit von Salmonella wird ebenfalls untersucht.

Die 21 bis 23 zeigen die Entwicklung der Trockenmasse (in Prozent), des C/N-Verhältnisses, des pH, des Gesamtstickstoffs (in Prozent), der Löslichkeit des Stickstoffs (in Prozent), des Prozentsatzes von Ammoniakstickstoff im Verhältnis zum Gesamtstickstoff, des Prozentsatzes von Aminstickstoff, der Nitratkonzentrationen und der Menge an Phosphor, Phosphaten und Kalium im Laufe der Zeit.

In diesen Figuren zeigen die Spalten A die 2 Wochen lang unbehandelte Streu, die Spalten B, C und D zeigen die mit einem Bakterienkomplex nach Beispiel 4 7 Wochen lang behandelte (Spalte B), 16 Wochen lang behandelte (Spalte C) und 12 Wochenlang behandelte und 8 Wochen lang aufbewahrte Streu (Spalte D) .

Diese Figuren zeigen, daß es nach Behandlung mit einem erfindungsgemäßen Bakterienkomplex eine Stabilisierung des Stickstoffs, eine signifikante Abnahme von Stickstoff in löslicher Form und eine prozentuale Zunahme von Aminstickstoff gibt (22).

Da ein normales Verfaulen im übrigen eine Hydrolyse und ein Absinken der Trockenmasse beinhaltet, ermöglicht es die erfindungsgemäße Behandlung, eine solches Absinken zu vermeiden (21).

24 stellt die Entwicklung des Nitratgehalts von Mist entsprechend der Behandlung, der er unterzogen wurde, genauer dar.

Spalte 1 entspricht dem Mist, der mit einem Handelsprodukt (BIO-SUPER®) behandelt wurde, Spalte. 2 entspricht einer mit einem Bakterienkomplex nach Beispiel 7 behandelten Streu vor Kompostierung, und Spalte 3 zeigt die Nitratmengen, die mit erfindungsgemäß behandelter und kompostierter Streu erhalten wurden.

Diese Figur zeigt die Kapazität der erfindungsgemäßen Bakterienkomplexe, Nitrate als Stickstoffquelle zu verwerten.

25 zeigt den Vorteil der Kompostierung des Mists für die Verringerung der Verunreinigung des Grundwasserspiegels und zeigt insbesondere die signifikante Abnahme an löslichem Stickstoff und Ammoniak in einem erfindungsgemäß behandelten und kompostierten Mist.

In dieser Figur zeigen die Spalten 1 bis 3 die Entwicklung von löslichem Stickstoff: Spalte 1 zeigt die Menge an löslichem Stickstoff (in Prozent) eines Kontrollmists (55%), Spalte 2 zeigt die Menge an löslichem Stickstoff (in Prozent) einer mit einem Bakterienkomplex nach Beispiel 7 behandelten, aber nicht kompostierten Streu (33,4%), und Spalte 3 zeigt die lösliche Stickstoffmenge (in Prozent) einer mit einem Bakterienkomplex nach Beispiel 7 behandelten und kompostierten Streu (16,72%); die Spalten 4 bis 6 zeigen die Entwicklung des Verhältnisses von Ammoniak/Gesamtstickstoff (in Prozent) Spalte 4 zeigt dieses Verhältnis für einen Kontrollmist (45,66%), was 83 löslichem Stickstoff entspricht, Spalte 5 zeigt das Verhältnis für eine mit einem Bakterienkomplex nach Beispiel 7 behandelte, aber nicht kompostierte Streu (28,37% , was 84,9% löslichem Stickstoff entspricht, und Spalte 6 zeigt das gleiche Verhältnis für eine mit einem Bakterienkomplex nach Beispiel 7 behandelte und kompostierte Streu (4,24%), was 25,4 löslichem Stickstoff entspricht.

Die 26, 27 und 28 zeigen die Stickstoffentwicklung und -verteilung im Vergleich: Referenzwerte und Werte, die mit einem erfindungsgemäß behandelten Mist erhalten wurden.

In den 26 und 27 ist die Verteilung des Stickstoffs wie folgt:

• (1) nicht quantifizierbarer verflüchtigter Ammoniakstickstoff, (2) verlorener Stickstoff: NH3 in die Luft, NH3 in den Boden, (3) Ammoniakstickstoff im Mist, (4) Proteinstickstoff.

In 26 sind die Ergebnisse als Zahleneinheiten ausgedrückt, während sie in 27 in Prozent ausgedrückt sind.

In diesen beiden Figuren entspricht Spalte A einem frischen, unbehandelten Kontrollmist, Spalte B entspricht einem zum Ausbringen bereiten, unbehandelten Kontrollmist, Spalte C entspricht einem erfindungsgemäß,behandelten Mist nach der Ausstallung, Spalte D entspricht einem erfindungsgemäß behandelten und kompostierten Mist, die Spalten E (26 und 27) und F (26) sind Standardwerte von ITCF, (Spalte E) und INRA (Spalte F).

Diese 26 und 27 zeigen:

• – das Fehlen von verlorenem Stickstoff in einem erfindungsgemäß behandelten Mist (Spalten C und D),
• – eine sehr geringe Anwesenheit von Ammoniakstickstoff in einem erfindungsgemäß behandelten und kompostierten Mist (Spalte D) (4,24% gegenüber 31,5% für den ITCF-Mist (Spalte E)) und eine bedeutende Menge Proteinstickstoff (95,76%) (Spalte D).

28 gibt die Vergleichswerte für Stickstoff/Trockenmasse an: Kontrollmist (Spalte A), ITCFwerte (Spalten B und C), INRA-Werte (Spalte D) und erfindungsgemäße Werte (Spalten E und F) und zeigt das Fehlen von Stickstoffverlust in einem erfindungsgemäß behandelten Mist.