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Dokumentenidentifikation DE10237317A1 11.03.2004
Titel Enzymhaltige Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
Anmelder 3M ESPE AG, 82229 Seefeld, DE
Erfinder Häberlein, Ingo, Dr., 82362 Weilheim, DE;
Guggenberger, Rainer, Dr., 82211 Herrsching, DE;
Weinmann, Wolfgang, Dr., 82205 Gilching, DE
Vertreter Kahlhöfer - Neumann - Herzog - Fiesser, 80331 München
DE-Anmeldedatum 15.08.2002
DE-Aktenzeichen 10237317
Offenlegungstag 11.03.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.03.2004
IPC-Hauptklasse C12N 9/14
IPC-Nebenklasse A61K 7/28   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine biologisch wirksame Glucosidase, wobei die Proteasen und die Glucosidasen in einem Aktivitätsverhältnis von 1000000 : 1 bis 1 : 1000000 vorliegen und die Zusammensetzung eine Gesamtenzymaktivität von mindestens 2 U/ml aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer solchen enzymhaltigen Zusammensetzung und Verfahren zur Entfernung von Karies. Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung von einer oder mehreren enzymhaltigen Zusammensetzungen zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung enthaltend mindestens eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine biologisch wirksame Glucosidase, wobei die Proteasen und die Glucosidasen in einem Aktivitätsverhältnis von 1.000 000 U : 1 U bis 1 U : 1000000 U vorliegen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser enzymhaltigen Zusammensetzung und Verfahren zur Entfernung von Karies. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von enzymhaltigen Zusammensetzungen zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.

Karies, auch Zahnfäule genannt, ist eine der häufigsten Erkrankungen des Menschen. Karies ist eine bakterielle Schädigung des Zahnes, die bis zum Zahnausfall führen kann. Zähne werden äußerlich von einer Hülle von hartem Zahnschmelz geschützt, der das weichere Dentin umgibt welches wiederum die sogenannte Pulpa umschließt. Der Zahnschmelz selbst besteht aus ca. 95 % anorganischen Substanzen, insbesondere Hydroxylapatit, und ca. 5% organischen Substanzen sowie Wasser. Dentin ist weicher als Zahnschmelz und besteht aus etwa 65 % anorganischen Substanzen (vorwiegend Hydroxylapatit), etwa 20 % organischen Substanzen (vorwiegend Kollagen und Polysaccharide) und etwa 15 % Wasser. Die Pulpa stellt ein Gefäß-Nervenbündel mit Blut- und Lymphgefäßen dar.

Eine Karieserkrankung beginnt häufig mit der Bildung von Plaque und dem sich aus Plaque entwickelnden Zahnstein. Plaque sind weißliche Zahnbeläge, hauptsächlich bestehend aus einer schwer abwischbaren Bakterien enthaltenden Eiweiß- und Polysaccharid-haltigen Masse. Als „Plaque" wird die Gesamtheit der auf der Zahnoberfläche angesiedelten Mikroorganismen und ihrer organischen Matrix bezeichnet. Aus Plaque heraus kann sich Karies und der für das Zahnfleisch so schädliche Zahnstein entwickeln, wobei Zahnstein aus verkalkter Plaque besteht. Zahnstein kann auch durch sorgfältiges Putzen nicht von der Zahnoberfläche entfernt werden.

Karies entsteht nun in mehreren Schritten durch die bakterielle Vergärung von Kohlenhydraten, insbesondere durch die bakterielle Vergärung von Zucker zu Säuren. Während Bakterien hauptsächlich die organischen Bestandteile, wie am Zahn haften gebliebene Speisereste, angreifen, lösen die im Rahmen der bakteriellen Vergärung entstehenden Säuren zunächst den haften Zahnschmelz auf.

Wird der Zahnschmelz durch die bakterieninduzierte Säureeinwirkung porös und weich, können Nahrungsreste und Bakterien auch Zugang zu der unter dem Zahnschmelz liegenden Dentinschicht gelangen und diese mit Karies infizieren. Eine Karieserkrankung an der Dentinschicht zieht dabei häufig eine Entzündung der unter dem Dentin liegenden Pulpa nach sich. Eine Entzündung der Pulpa ist äußerst schmerzhaft und kann den Erkrankten in eine gesundheitsbedrohliche Situation bringen, wenn die Entzündung nicht schnell behandelt wird.

Der Bereich der stärksten Schmelzauflösung wird Kariesläsion genannt. Eine Kariesläsion besteht in der Regel aus einer Vielzahl unterschiedlicher Substanzen, die teilweise bakteriellen Ursprungs sind und teilweise aus dem Speichel sowie aus Nahrungsresten stammen.

Körpereigene Reparaturmaßnahmen gegen die durch Karies verursachten Zahnschäden gibt es, im Gegensatz zu Schäden an sonstigem lebenden Körpergewebe, nicht. Lediglich im Anfangsstadium der Karieserkrankung ist eine Ausheilung durch Remineralisation der Zahnhartsubstanz möglich. In einem fortgeschrittenen Stadium der Karieserkrankung muss eine Behandlung erfolgen, bei der ein durch Karies geschädigter Zahnbereich entfernt wird. Der durch die Entfernung des kranken Zahngewebes entstandene Hohlraum wird Kavität genannt. Ab einer bestimmten Größe einer Kavität wird nach der Entfernung des kranken Zahngewebes die Kavität in der Regel mit einer künstlichen Zahnfüllung aufgefüllt.

Die Entfernung der durch Karies verursachten Zahnschäden erfolgt in der Regel durch Ausbohren des kariösen Zahngewebes mit einem Dentalbohrer. Je nach Indikation und Technik werden Bohrgeschwindigkeiten bis zu 400.000 Umdrehungen pro Minute erreicht. Als Bohrer dienen Hartmetall- oder Diamant-Instrumente. Da beim Bohren eine große Hitzeentwicklung stattfindet und die abgetragenen Zahnsubstanzen die Behandlungsstelle verunreinigen, ist zur Kühlung und Reinigung der Kavität meistens ein Wasser-Luft-Gemisch erforderlich.

Diese Behandlungsmethode zur Entfernung von Karies unter Verwendung eines Dentalbohrers weist aber mehrere Nachteile auf.

Ein schwerwiegender Nachteil besteht beispielsweise darin, dass diese Behandlungsmethode in der Regel mit erheblichen Schmerzen für den Patientenverbunden ist. Als Bohrschmerz werden vom Patienten vor allen Dingen die feinen Vibrationen der rotierenden Bohrinstrumente an dem in vielen Fällen entzündeten Zahnbereich empfunden. Hinzu kommt ein als sehr unangenehm empfundenes pfeifendes Bohrgeräusch. Daher warten viele Patienten oft zu lange, bevor sie den mit Karies befallenen geschädigten Zahn behandeln lassen.

Ein weiterer Nachteil dieser Behandlungsmethode besteht darin, dass beim Bohren gesunde Zahnsubstanz in Mitleidenschaft gezogen und abgetragen werden kann. Ein solcher Abtrag des gesunden Zahnmaterials ist jedoch in der Regel unerwünscht.

Nachteilig am Ausbohren eines mit Karies infizierten Zahns ist weiterhin, dass trotz Ausbohren des kariösen Zahngewebes häufig noch bakterielle Rückstände an der geschädigten Stelle verbleiben. Solche bakteriellen Rückstände verursachen oft schwere Folgeschäden, wie Zahnwurzelentzündungen, deren Behandlung in häufig weit schmerzhafter ist als die vorhergegangene Erstbehandlung.

Neben der oben beschriebenen klassischen Therapie des Bohrens wurden in den letzten Jahren zunehmend Zahnhartsubstanz schonende Behandlungsarten beschrieben.

In der WO 98/20838 wird beispielsweise eine chemo-mechanische Methode zu einer wesentlich schmerzfreien und bohrerfreien Entfernung von Karies offenbart. Zur Auflösung von Karies wird das aggressive Oxidationsmittel Natriumhypochlorid in Kombination mit Aminosäuren verwendet. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass Natriumhypochlorid als starkes Oxidationsmittel unspezifisch nicht nur mit kariösem Gewebe bzw. Zahnbestandteilen, sondern auch mit gesunder Zahnsubstanz reagiert und diese schädigt. Weiterhin erlaubt dieses Verfahren nur das oberflächliche Anlösen und Aufweichen der kariösen Bereiche. Sobald die oxidative Wirkung nachlässt, muss die Natrumhypochloridlösung erneuert werden. Daher ist ein häufiges Auftragen erforderlich.

Die klinische Erfahrung belegt, dass die beschriebene chemo-mechanische Methode sehr zeitaufwendig und nicht immer erfolgreich ist, so dass letztendlich doch auf einen Dentalbohrer zurückgegriffen werden muss.

In der WO 96/07329 wird ein Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Karies und paradontitischen Krankheiten beschrieben. Es wird vorgeschlagen, Keime in der Mundhöhle mit über gentechnische Methoden gewonnenen Enzymen zu bekämpfen. Als geeignete Enzyme werden Lysozym und Dextranase genannt. Als Ansatzpunkt zur Behandlung und Vorbeugung von Zahnkaries soll mit den Enzymen Plaque abgebaut werden. Die Behandlung von Karies selbst wird in der Druckschrift nicht genannt.

In ähnlicher Weise beschreibt die EP 0 824 910 A2 die Verwendung von bestimmten Enzymen zur Behandlung von Plaque. Zur Entfernung von Karies sind die dort beschriebenen enzymhaltigen Lösungen jedoch nicht geeignet.

In der WO 92/10165 wird eine Zusammensetzung offenbart, die neben anderen Substanzen Proteasen und Komplexierungsmittel für Kalzium in einer bestimmten Menge beinhaltet, um Plaque auf Prothesen zu entfernen. Im neutralen oder basischen Milieu arbeitende Proteasen werden dabei bevorzugt. Die dort beschriebenen enzymhaltigen Lösungen besitzen jedoch keine ausreichende Kariesauflösende Wirkung.

Die WO 97/38669 betrifft eine Zusammensetzung zur Vermeidung der Bildung von Plaque bzw. zur Entfernung von Plaque, welche die Glucosidasen Dextranase und Mutanase sowie optional noch weitere Enzyme wie Proteasen beinhaltet. Es wird ausgeführt, dass die verwendeten Enzyme alle im Bereich von pH 6 bis pH 8 arbeiten. Die Zusammensetzung lässt sich in Form von Zahnpaste, Zahnpulver oder einer Mundspülung anwenden. Auch die hier beschriebenen enzymhaltigen Lösungen sind für eine Entfernung von Karies nicht geeignet.

In der WO 98/26807 wird ein Verfahren zur Reinigung und Desinfektion von Oberflächen beispielsweise Arbeitsflächen aus Kunststoff oder Metall beschrieben, die von einem Biofilm überzogen sind, wobei die verwendete Zusammensetzung Enzyme enthält. Die dort beschriebenen Zusammensetzungen weisen allerdings ebenfalls keine ausreichende Karies-auflösende Wirkung auf.

Die Verwendung von Lysozym in Verbindung mit dem Komplexierungsmittel EDTA (Ethylene-Diamino-Tetraacetic-Acid) zur vorbeugenden Behandlung von Karies ist in der US 4,355,022 beschrieben. Auch hier ist eine Entfernung von Karies mit den dort beschriebenen enzymhaltigen Lösungen nicht möglich.

Es bestand daher ein Bedürfnis nach einer Zusammensetzung, mit der auf einfache und schmerzfreie Art und Weise Karies in der täglichen Praxis entfernt werden kann. Weiterhin bestand ein Bedürfnis nach einer Zusammensetzung zur Entfernung von Karies, mit der das gesunde und erhaltenswerte Zahnmaterial nicht oder nicht mehr als vermeidbar angegriffen und beschädigt wird. Darüber hinaus bestand ein Bedürfnis nach einer Zusammensetzung zur Entfernung von Karies, mit der sichergestellt wird, dass nach der Behandlung zur Entfernung von Karies im wesentlichen keine bakteriellen Rückstände verbleiben. Es bestand darüber hinaus ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur schmerzfreien und einfachen Behandlung von Karies.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine Zusammensetzung bereitzustellen, mit der eines oder mehrere der oben genannten Bedürfnisse erfüllt werden. Weiterhin lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Behandlungsmethode zur Entfernung von Karies bereitzustellen, mit der eines oder mehrere der oben genannten Bedürfnisse erfüllt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zusammensetzung enthaltend mindestens eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine biologisch wirksame Glucosidase wobei die Enzymaktivitätsverhältnisse der Proteasen zu den Glucosidasen in der Zusammensetzung in einem Bereich von 1.000.000 : 1 bis 1 : 1.000.000 liegen und die Gesamtenzymaktivität mehr als 2 U / ml beträgt.

Eine Enzymunit (abgekürzt U) ist jeweils die Menge eines Enzyms, die benötigt wird, um bei Standardbedingungen für das jeweilige Enzym ein &mgr;Mol eines entsprechenden Enzymsubstrates pro Minute umzusetzen. Im Fall von Proteinase K bezieht sich die Angabe U auf die Einheit mAnson. Der Einfachheit halber wird die Abkürzung U im Rahmen des vorliegenden Textes auch für Proteinase K benutzt, wobei die Abkürzung U in diesem Fall füe die Einheit mAnson steht. Die Zahlenangaben der Enzymaktivitätsverhältnisse für die Enzymunits (U) gelten im Fall des Enzyms Proteinase K daher auch für die ausschließlich für Proteinase K verwendete Enzymeinheit mAnson.

Die Gesamtenzymaktivität in [U /ml] bezieht sich im vorliegenden Fall sowohl auf flüssige als auch auf pastöse oder trockene Produkte, die beispielsweise ausschließlich aus einem Enzymgemisch und gegebenenfalls einem oder mehreren ebenfalls trockenen Zusatzstoffen bestehen.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Enzyme können grundsätzlich aus Pflanzen, Tieren oder aus Pilzen, sowie aus Bakterien oder Hefen gewonnen werden. Sie können auch biotechnologisch hergestellt worden sein. Geeignet sind Enzyme, die aus Tieren, Bakterien oder Hefen gewonnen wurden, beispielsweise Enzyme, die aus Schwein oder Huhn gewonnen wurden. Ebenfalls geeignet sind weiterhin Enzyme, die aus den Hefegattungen Streptomyces oder Penicillium oder aus den Bakteriengattungen Clostridium, Aspergillus oder Triotirachium gewonnen wurden. Bevorzugt werden Enzyme, die aus Streptomyces griseus, Clostridium hostolyticum, Aspergillus nidulans, Penicillium species oder Triotirachium album gewonnen wurden.

Unter den Begriff „Proteasen" fallen im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Enzyme, die Proteine proteolytisch verändern können. Eine Protease bindet ihr Substrat, also das jeweilige Protein, spezifisch an einer Peptidbindung der Aminoseitenketten. Die Peptidbindungen der Aminoseitenketten des Substrates werden von den Proteasen vom N-Terminus in Richtung C-Terminus gespalten.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Proteasen dienen dazu, die Zersetzung von Proteinbestandteilen, die in einer Kariesläsion vorhanden sein können, zu katalysieren. Grundsätzlich sind dafür alle Proteasen geeignet, die eine proteolytische Peptiddegradierung katalysieren. Es eignen sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch besonders alle diejenigen Proteasen, die in der Lage sind, die Zersetzung von Kollagenfasern, wie sie beispielsweise im Zahnmaterial vorkommen, zu katalysieren oder wenigstens die eine Änderung der Struktur der Kollagenfasern derart zu katalysieren, dass die Kollagenfasern nach der Proteasereaktion ein besseres Löslichkeitsverhalten zeigen.

Erfindungsgemäß eingesetzte Proteasen sind beispielsweise Peptidasen, Peptidylpeptidasen, Dipeptidasen, Dipeptidylpeptidasen, Oligopeptidasen, Proteinasen, Endopeptidasen, Exopeptidasen.

Eine Klassifizierung von erfindungsgemäß geeigneten Proteasen kann auch hinsichtlich der an der proteolytischen Katalyse beteiligten Aminosäuren oder Cofaktoren erfolgen. So können im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich alle Proteaseklassen wie Serinproteasen, Matrixmetalloproteasen, Aspartatproteasen und Cysteinproteasen verwendet werden. Grundsätzlich sollen die in der Zusammensetzung enthaltenden Proteasen unter Bedingungen eingesetzt werden, die es den jeweiligen Proteasen ermöglichen, die Degadation der in einer Kariesläsion befindlichen Proteinbestandteile zu katalysieren.

Eine erfndungsgemäße Zusammensetzung kann grundsätzlich nur eine Protease enthalten, sie kann aber ebenso gut zwei oder mehr unterschiedliche Proteasen beinhalten.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine Zusammensetzung beispielsweise eine Protease. Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ungefähr 1 bis 10 unterschiedliche Proteasen, vorzugsweise etwas 1 bis 6, weiter bevorzugt etwa 1 bis 4 und weiter bevorzugt 2 bis 3 und weiter bevorzugt 2 unterschiedliche Proteasen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine Zusammensetzung mindestens zwei Proteasen. Im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung beispielsweise Kollagenase und Pronase, im Rahmen einer weiteren Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung beispielsweise Kollagenase und Proteinase K.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, drei Proteasen, nämlich Kollagenase, Pronase und Proteinase K. Bevorzugt wird der Einsatz von Kollagenase aus Clostridium hostolyticum und Pronase aus Streptomyces griseus und Proteinase K aus Triotirachium album. Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung nur eine Protease, vorzugsweise eine Aspartatprotease, wobei Pepsin bevorzugt wird, insbesondere Pepsin aus Schwein.

Als im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbare Glucosidasen kommen prinzipiell alle solche in Betracht, die in der Lage sind, Polysaccharidstrukturen innerhalb einer Kariesläsion aufzuspalten und zu zersetzen. Dabei katalysieren die Glucosidasen die hydrolytische Spaltung glykosidischer Bindungen der in einer Kariesläsion befindlichen Polysaccharidstrukturen.

Der katalytische Mechanismus der Glucosidasen funktioniert nur, wenn die jeweilige Glucosidase spezifisch an das Substrat gebunden ist. So katalysiert beispielsweise die Glucosidase Lysozyrn die Hydrolyse von &bgr;-1,4-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetyl-D-glucosamin in Polysaccharidstrukturen. Die Glucosidase &agr;-Amylase katalysiert dagegen die Hydrolyse von &agr;-1,4-Bindungen zwischen zwei D-Glucoseeinheiten in Polysaccharidstrukturen. Die Glucosidase Dextranase katalysiert die Hydrolyse von &agr;-1,6-Bindungen in Dextran. Dextran ist ein Polysaccharid, das insbesondere in Bakterienzellwänden und extrazellulären Strukturen vorkommt.

In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung können grundsätzlich alle Typen von Glucosidasen einzeln oder in Kombination mit anderen Glucosidasen enthalten sein, beispielsweise &agr;-Glucosidasen oder &bgr;-Glucosidasen oder retentive Glucosidasen oder invertierende Glucosidasen.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann grundsätzlich beispielsweise nur eine Glucosidase enthalten, sie kann aber ebenso gut zwei oder mehr unterschiedliche Glucosidasen beinhalten. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine Zusammensetzung beispielsweise eine Glucosidase. Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung 1 bis etwa 10 unterschiedliche Glucosidasen, beispielsweise etwa 1 bis etwa 6 oder etwa 1 bis 4 oder 2 bis 3, beispielsweise 2 unterschiedliche Glucosidasen.

Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden mindestens 2 verschiedene Glucosidasen in einer Zusammensetzung eingesetzt. Bevorzugte Glucosidasen sind Lysozym, &agr;-Amylase oder Dextranase oder ein Gemisch aus zwei oder mehr davon. Ebenfalls geeignet ist der gemeinsame Einsatz von Lysozym und Dextranase. Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Einsatz von mindestens zwei verschiedenen Glucosidasen, insbesondere Lysozym aus Hühnereiweiß, &agr;-Amylase aus Aspergillus nidulans und Dextranase aus Penicillium species.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zeichnet sich durch eine bestimmte Relation der Aktivität der Proteasen zur Aktivität der Glucosidasen aus. Grundsätzlich liegen in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Enzymaktivitätsverhältnisse der Proteasen zu den Glucosidasen in einem Bereich von 1.000.000: 1 bis 1: 1.000.000 vor.

Die oben genannten Aktivitätsverhältnisse beziehen sich dabei immer auf die jeweiligen Standardbedingungen für das entsprechende Enzym. Dabei gelten folgende Standardbedingungen:

Pronase: 1 Unit entspricht dem Umsatz von 25 &mgr;g Tyrosin pro Minute bei 40 °C und pH 7,5 wenn man Casein als Substrat benutzt.

Collagenase: 1 Unit entspricht dem Umsatz von 1 mmol L-Leucin in 5 h bei 37 °C und pH 7,5 wenn man Collagen als Substrat benutzt.

Pepsin: 1 Unit entspricht einem Delta E von 0,01 bei A280 nm pro Minute 37 °C von umgesetztem Hämoglobin mit TCA.

Lysozym: 1 Unit produziert eine Aktivität von 0,001 pro Minute bei pH 6,24 und 25 °C. Als Substrat werden M. lysodeikticus Zellen im Messvolumen von 2,6 ml benutzt.

Dextranase: 1 Unit entspricht dem Umsatz von 1 &mgr;mol Isomaltose pro Minute bei 37 °C und pH 6,0 wenn man Dextran als Substrat benutzt.

&agr;-Amylase: 1 Unit entspricht dem Umsatz von 1 mg Maltose in 3 Minuten bei 20 °C und pH 6,9 wenn man Stärke als Substrat benutzt.

ProteinaseK: 1 Anson Unit entspricht 1 &mgr;mol Folin positive Aminosäuren bei pH 7,5 und 35 °C wenn man Hämoglobin als Substrat benutzt.

Erfindungsgemäß geeignet sind beispielsweise Verhältnisse der Aktivität von Proteasen zu der Aktivität von Glucosidasen von etwa 10000: 1 bis 1: 1.000.000 oder von etwa 100: 1 bis 1: 1.000.000 oder von etwa 1: 1 bis 1: 1.000.000 oder Verhältnisse von etwa 1: 10 bis 1: 100.000 oder etwa 1: 100 bis 1: 100.000. Besonders geeignet sind beispielsweise Verhältnisse von etwa 1: 1000 bis 1: 100.000, weiter bevorzugt werden Verhältnisse von etwa 1: 3000 bis 1: 30.000. Bevorzugt werden beispielsweise Verhältnisse von etwa 1 : 100 bis 1 : 500.

Die oben genannten Aktivitätsverhältnisse beziehen sich dabei ausdrücklich auf die für das jeweilige Enzym geltenden Standardbedingungen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus sowohl eine Zusammensetzung enthaltend eine Glucosidase und eine Protease oder enthaltend eine Glucosidase und mindestens zwei und mehr Proteasen oder enthaltend mindestens zwei oder mehr Glucosidasen und eine Protease oder enthaltend mindestens zwei oder mehr Glucosidasen und zwei oder mehr Proteasen. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält beispielsweise etwa 1 bis etwa 10 Glucosidasen und etwa 1 bis etwa 10 Proteasen, bevorzugt etwa 6 Glucosidasen und etwa 1 bis etwa 10 Proteasen und weiter bevorzugt etwa 4 Glucosidasen und etwa 1 bis etwa 10 Proteasen, weiter bevorzugt etwa 2 Glucosidasen etwa 1 bis etwa 10 Proteasen, oder etwa 6 Glucosidasen und etwa 6 Proteasen oder etwa 6 Glucosidasen und etwa 4 Proteasen oder etwa 6 Glucosidasen und etwa 2 Proteasen und weiter bevorzugt etwa 4 Glucosidasen und etwa 6 Proteasen oder 4 Glucosidasen und etwa Proteasen oder 4 Glucosidasen und etwa 2 Proteasen und weiter bevorzugt etwa 2 Glucosidasen etwa 2 Proteasen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung die Proteasen Proteinase K und Collagenase in Verbindung mit den Glucosidasen Lysozym und Dextranase.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Lösung enthaltend eine erfindungsgemäße Zusammensetzung und mindestens ein Lösungsmittel. Grundsätzlich können alle Lösungsmittel als Bestandteil in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten sein, in denen sich Enzyme lösen lassen, ohne zu denaturieren. Als Lösungsmittel können alle wässrigen und organischen Lösungsmittel eingesetzt werden, welche die Aktivität der Enzyme nicht soweit beeinträchtigen, dass deren erfindungsgemäßer Einsatz unmöglich gemacht wird.

Als Lösungsmittel geeignet sind beispielsweise Wasser, lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Alkohole mit 2 bis etwa 10 C-Atomen sowie Ketone, Ester, Carbonsäuren und Gemische aus zwei oder mehr der genannten Lösemitteltypen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise Dialkylketone oder Alkohole oder niedrigviskose polymerisierbare Substanzen wie Hydroxyethylmethacrylat oder (2,3-Epoxypropyl)-methacrylat sowie Mischungen davon als Lösungsmittel verwendet werden. Besonders bevorzugte alkoholische Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol, Isopropanol und Propanol. Weitere geeignete organische Lösungsmittel sind Glycerin, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Aceton, Methylethylketon, Cyclohexanol, Toluol, Methylenchlorid, Chloroform, Alkane und Essigsäurealkylester, insbesondere Essigsäureethylester.

Grundsätzlich ist es möglich, die oben genannten Lösemittel jeweils alleine oder als Gemisch aus zwei oder mehr beliebigen Lösemitteln einzusetzen, sofern die Lösemittelgemische die Enzymaktivität nicht soweit beeinträchtigen, dass das angestrebte Ziel nicht erreicht werden kann. Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden jedoch Lösemittelgemische eingesetzt, die Wasser als Bestandteil enthalten, insbesondere wässrig-alkoholische Lösemittelgemische.

Die Viskosität der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, sofern sie Lösemittel enthalten, kann im wesentlichen innerhalb beliebiger Bereiche, von dünnflüssig bis pastös, liegen. Häufig hat es sich bewährt, wenn die Zusammensetzungen eine ausreichend niedrige Viskosität aufweisen um innerhalb einer zu behandelnden Kariesläsion auch in nicht einfach zugängliche Bereiche zu fließen. Es kann jedoch auch vorteilhaft sein, beispielsweise wenn die Kariesläsion an einem seitlichen Bereich des Zahns liegt, wenn die erfindungsgemäße lösemittelhaltige Zusammensetzung eine höhere Viskosität aufweist, beispielsweise gelartig vorliegt, damit die Zusammensetzung nicht zu schnell abfließt.

Die Viskositätsbereiche der erfindungsgemäßen Lösung liegen beispielsweise in einem Bereich von etwa 0,5 mPa·s bis etwa 100 Pa·s bei +25°C oder beispielsweise in einem Bereich von etwa 5 mPa·s bis etwa 50 Pa·s bei +25°C.

Als im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbare Verdickungsmittel können grundsätzlich alle dem Fachmann bekannten Mittel zur Einstellung der gewünschten Viskosität einer Lösung eingesetzt werden, sofern sie den gewünschten Einsatzzweck nicht oder nur unwesentlich nachteilig beeinflussen. Geeignete Verdickungsmittel sind beispielsweise Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylpropylcellulose, Hydroxybutylmethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose Natriumcarboxymethylcellulose und anorganische Verdickungsmittel wie Kieselgele oder Schichtsilikate sowie Mischungen aus zwei oder mehr der genannten Verdickungsmittel.

Die erfindungsgemäßen Enzymlösungen können beispielsweise Gesamtenzymaktivitäten von etwa 2 U bis etwa 1.000.000 U pro ml Lösung enthalten. Die Untergrenze beträgt dabei beispielsweise etwa 3, 5, 7 oder 10 U /ml, wobei sich der erfindungsgemäße Effekt bei einer Untergrenze für die Gesamtenzymaktivität von etwa 20 oder etwa 25 oder etwa 30 oder etwa 40 oder etwa 45 oder etwa 50 U / ml Lösung in der Regel deutlich verbessert.

Vorzugsweise enthalten erfindungsgemäße Enzymlösungen etwa 60 U bis etwa 600.000 U / ml Lösungsmittel, beispielsweise etwa 100 U bis etwa 400.000 U / ml Lösungsmittel oder etwa 300 bis etwa 300.000 U / ml Lösungsmittel oder etwa 500 U bis etwa 200.000 U / ml Lösungsmittel oder etwa 700 bis etwa 150.000 U / ml Lösungsmittel oder etwa 1000 bis etwa 100.000 U / ml Lösungsmittel oder etwa 5000 bis etwa 50.000 U / ml Lösungsmittel. Die genannten Untergrenzen der einzelnen Bereiche sind im Rahmen des vorliegenden Textes darüber hinaus mit jeder der oben genannten Bereichsgrenzen kombinierbar, sofern die Vorteilhafte Wirkung einer erfindungsgemäßen Enzymlösung innerhalb eines solchen Bereichs besonders ausgeprägt auftritt.

Die einzelnen Enzyme liegen dabei beispielsweise in den Verhältnissen 1 U Proteasen : 1 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen : 1.000.000 U Glucosidasen oder Verhältnisse von etwa 1 U Proteasen : 10 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen 100.000 U Glucosidasen oder etwa 1 U Proteasen : 100 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen : 100.000 U Glucosidasen, jeweils bezogen auf die für das jeweilige Enzym geltenden Standardbedingungen. Besonders geeignet sind beispielsweise Verhältnisse von etwa 1 U Proteasen : 1000 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen 100.000 U Glucosidasen, weiter bevorzugt werden Verhältnisse von etwa 1 U Proteasen : 3000 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen : 30.000 U Glucosidasen.

Die Gesamtproteaseaktivität liegt dabei beispielsweise in einem Bereich von etwa 1 U / ml Lösungsmittel bis etwa 100.000 U / ml Lösungsmittel, bevorzugt in einem Bereich von etwa 5 U bis etwa 10.000 U / ml Lösungsmittel oder in einem Bereich von etwa 50 U bis etwa 1000 U / ml Lösungsmittel.

Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Zusammensetzung enthaltend eine Enzymkombination aus zwei Proteasen weist beispielsweise folgende Enzymaktivitäten auf Kollagenase in einem Bereich von 1 bis 5.000 U /ml Lösungsmittel, beispielsweise 1 bis 1.000 U /ml Lösungsmittel oder beispielsweise 1 bis 5 U /ml Lösungsmittel und Proteinase K in einem Bereich von 10 bis 300 mAnson / ml Lösungsmittel, bevorzugt 20 bis 100 mAnson / ml Lösungsmittel und besonders bevorzugt 20 bis 50 mAnson / ml Lösungsmittel. Ähnliche Konzentrationen und Verhältnisse gelten auch für den gemeinsamen Einsatz von Kollagenase mit einer anderen Protease als Proteinase K.

Grundsätzlich liegt die Gesamtglucosidaseaktivität in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einem Bereich von größer 1 U / ml. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Gesamtglucosidaseaktivität im Bereich von etwa 1 U bis etwa 1.000.000 U / ml Lösungsmittel liegen, bevorzugt wird eine Gesamtglucosidaseaktivität von etwa 10 U bis etwa 500.000 U / ml Lösungsmittel, beispielsweise eine Konzentration von etwa 50 U bis etwa 300.000 U / ml Lösungsmittel oder eine Konzentration von etwa 1000 U bis etwa 200.000 U / ml Lösungsmittel oder eine Konzentration von etwa 10.000 U bis etwa 100.000 U / ml Lösungsmittel.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist eine Zusammensetzung enthaltend eine Enzymkombination aus zwei Glucosidasen beispielsweise folgende Konzentrationen auf

  • – Lysozym in einem Bereich von 5.000 bis 200.000 U /ml Lösungsmittel, bevorzugt 10.000 bis 150.000 U /m1 Lösungsmittel weiter bevorzugt 70.000 bis 100.000 U /ml Lösungsmittel und
  • – Dextranase in einem Bereich von 10 bis 1.000 U / ml Lösungsmittel, bevorzugt 50 bis 500 u/ ml Lösungsmittel und weiter bevorzugt 90 bis 250 U / ml Lösungsmittel Dextranase.

Da ein Hauptproteinbestandteil einer Kariesläsion das Protein Kollagen ist, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Lösungen bevorzugt, die allein oder gemeinsam mit einer oder mehreren anderen Proteasen dazu in der Lage sind, Kollagen zu degradieren.

Im Rahmen einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet eine erfindungsgemäße Lösung zur Degradierung strukturell intakten Kollagens mindestens zwei Proteasen.

Der gemeinsame Einsatz von beispielsweise Kollagenase und einer weiteren Protease wie Proteinase K wirkt sich beim Abbau von strukturell nativem Kollagen vorteilhaft aus. Der Abbau von nativem Kollagen wird durch das Enzym Kollagenase eingeleitet. Das bedeutet, dass Kollagenase die Tertiärstruktur des Kollagens so verändert, dass danach auch die Sekundärstruktur von anderen Proteasen angegriffen werden kann. Kollagenase allein kann jedoch Kollagen nicht vollständig degradieren. Proteasen wie Proteinase K oder Pronase können dagegen ohne die vorhergehende Reaktion von Kollagen mit Kollagenase strukturell intaktes Kollagen nicht degradieren. Zum effizienten Abbau von Kollagen wirkt sich daher eine Kombination aus Kollagenase und anderen Proteasen vorteilhaft aus.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Auswahl und die Konzentrationen der Proteasen und Glucosidasen so gewählt, dass die Proteasen die Glucosidasen innerhalb der Nutzungsdauer nicht proteolytisch inaktivieren.

Je höher die Mineralisation des Substrates ist, desto mehr erschwert sich der Zugang einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an das Dentin-Kollagen. Dies hat zur Folge, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung nur dort aktiv und degradierend wirkt, wo die Zahnsubstanz geschädigt ist. Bereiche mit gesunder Zahnsubstanz werden nicht von der enzymhaltigen Zusammensetzung angegriffen. Die Wirkung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, enthaltend eine Kombination aus Proteasen und Glucosidasen wie vorstehend beschrieben, zur Verwendung bei einer Kariesbehandlung wird durch den Anteil an mineralischer Substanz im Zahn reguliert. Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Proteasen und Glucosidasen eingesetzt, die bakterizid wirken, beispielsweise indem sie Bestandteile der Bakterienzellwände degradieren.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, kann darüber hinaus mindestens einen Puffer oder eine zusammen mit einer zweiten Verbindung als Puffer wirkende Verbindung enthalten. Der in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltende Puffer dient dazu, den pH-Wert in einer erfindungsgemäßen Lösung, enthaltend ein erfindungsgemäßes Enzymgemisch, auf den für die jeweilige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gewünschten Wert einzustellen bzw. eine Änderung des pH-Werts über einen definierten Zeitraum zu verhindern und die entsprechende Lösung zu stabilisieren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als Puffer grundsätzlich alle üblichen Puffer, beispielsweise Phosphatpuffer, Carbonatpuffer, Acetatpuffer, Citratpuffer Tris-Puffer, Glycylglycinpuffer oder Glycinpuffer geeignet. Dabei werden Natriumphosphatpuffer, Natriumhydrogenphosphatpuffer, Natriumdihydrogenphosphatpuffer, Kaliumphosphatpuffer, Kaliumhydrogenphosphatpuffer, Kaliumdihydrogenphosphatpuffer oder Pyrophosphatpuffer bevorzugt. Ebenfalls geeignet sind Natriumcarbonatpuffer, Kaliumcarbonatpuffer, Natriumhydrogencarbonatpuffer oder Kaliumhydrogencarbonatpuffer. Besonders bevorzugt enthalten erfindungsgemäße Zusammensetzungen Phosphatpuffer bzw. deren Bestandteile. Ein besonders bevorzugter Phosphatpuffer ist ein Natriumdihydrogenphosphatpuffer.

Die Pufferkonzentration einer ein Lösungsmittel enthaltenden erfindungsgemäßen Lösung kann im Bereich von bis zu 100 Mol pro Liter liegen. Die Konzentration Mol pro Liter bezieht sich auf den Säureanteil in der Lösung. Bevorzugt wird ein Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 Mol pro Liter. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine enzymhaltige Lösung einen Puffer im Bereich von ca. 0,001 Liter bis ca. 5 Mol pro Liter. Bevorzugt wird der Bereich von ca. 0,01 bis ca. 3 Mol pro Liter und weiter bevorzugt der Bereich von ca. 0,02 bis ca. 1,0 Mol pro Liter. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine enzymhaltige Lösung einen Puffer in einem Bereich von ca. 0,03 bis ca. 10 Mol pro Liter, weiter bevorzugt in einem Bereich von ca. 0,05 bis ca. 5 Mol pro Liter und weiter bevorzugt ca. 0,08 bis 1 Mol pro Liter.

Eine ein erfindungsgemäßes Enzymgemisch enthaltende Lösung kann grundsätzlich einen pH-Bereich von etwa 1 bis etwa 10 aufweisen.

Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt der pH-Wert einer erfindungsgemäßen enzymhaltigen Lösung im Bereich von etwa pH 5 bis etwa pH 10 insbesondere von etwa pH 6 bis etwa pH 9, insbesondere von etwa pH 7 oder von etwa pH 1 bis etwa pH 4.

Der Einsatz der auf im Rahmen der oben genannten Werte eingestellten Proteasemischungen ist dann vorteilhaft, wenn die Proteine in der Kariesläsion aufgrund einer starken Demineralisierung innerhalb der Kariesläsion leicht zugänglich sind. Wenn eine solche Lösung jedoch auf mineralisches Material stößt, unterbleibt der proteolytische Abbau. Dadurch wird auch eine Limitierung der Wirkung durch eine Limitierung der Substratverfügbarkeit erreicht. Vorteilhaft wirkt sich dabei aus, dass daher im wesentlichen nur infiziertes Dentin und stärker demineralisiertes Dentin entfernt wird, gesundes, mineralisiertes Dentin wird dagegen nicht oder nur unwesentlich angegriffen. Die beschriebenen Lösungen bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 10 sind daher sehr schonend für das gesunde Zahnmaterial.

Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können noch weitere Hilfsstoffe wie Komplexierungsmittel, Enzymsubstrate oder Enzymeffektoren beinhalten. Enzymeffektoren beinhalten im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl Enzymaktivatoren als auch Enzyminhibitoren.

Komplexierungsmittel dienen im Rahmen der vorliegenden Erfindung dazu, den Zugang zur Kariesläsion durch unterstützenden Abbau des Hydroxylapatits zu erleichtern. Die Komplexierungsmittel können auch dazu beitragen, Zellwände der Bakterien aufzubrechen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Komplexierungmittel sind diejenigen, die mit 2-wertigen Metallionen stabile Komplexe bilden. Beispielsweise sind als Komplexierungsmittel EDTA (Ethylene-Diamino-Tetraacetic-Acid), EGTA, (Ethylene-Glycol-diaminoethyl-Tetraacetic-Acid), Citronensäure oder Salicysäure geeignet. Am meisten bevorzugt wird der Komplexbildner EDTA (Ethylene-Diamino-Tetraacetic-Acid).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung noch weitere Substanzen zugesetzt werden, welche die Funktionsfähigkeit der Enzyme optimieren können. Solche Enzymaktivierende oder inhibierenden Substanzen umfassen Diethylbarbitursäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Glycin, Glycylglycin, N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure (ACES), N-(2-Acetamido)-imino-diacetat (ADA), N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethan-sulfonsäure (BES), N,N-Bis-(2-hydroxy-ethyl)glycin (BICINE), 2,2-Bis(hydroxyethyl)-iminotris(hydroxymethyl)methan (BIS-TRIS), 2-(Cyclohexyl-amino)ethan-sulfonsäure (CHES), 2-[4-(2-Hydroxyethyl-l-piperazin)]-ethansulfonsäure (HEPES), 3-[4-(2-Hydroxyethyl-1-piperazinyl)]-propansulfonsäure (HEPPS), 2-Morpholino-ethansulfonsäure (MES), 3-Morpholino-propansulfonsäure (MOPS), Piperazin-l,4-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES), N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-2-aminoethansulfonsäure (TES), N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-glycin (TRICINE), Säuren wie Schwefelsäure, schweflige Säure, Phosphorsäure, Salzsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniak, Calciumhydroxid, Magnesiumoxid, Salze wie Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiumnitrat, Calciumchlorid, Calciumsulfat, Calciumnitrat, Eisen(III)-chlorid, Eisen(II)-chlorid, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphate, Kaliumphosphate, Coenzyme und Vitamine.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer enzymhaltigen Zusammensetzung wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, dadurch gekennzeichnet, dass eine geeignete Auswahl an Enzymen in einem geeigneten Verhältnis der jeweiligen Enzymaktivitäten miteinander vermischt wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer enzymhaltigen Zusammensetzung wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, dadurch gekennzeichnet, dass eine geeigneten Enzymmischung mit gegebenenfalls geeigneten Hilfsstoffen und gegebenenfalls mit einem oder mehreren geeigneten Lösungsmitteln versetzt wird.

Bei einem erfindungsgemäßes Herstellungsverfahren kann grundsätzlich auf alle dem Fachmann bekannten Verfahrenstechniken zur Behandlung von Enzymen bei der Herstellung und Lagerung zurückgegriffen werden. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung unter Verwendung von Chromatographietechniken, Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Granulierung, Zentrifugation, Präzipitation, Kristallisation oder Ultra- oder Nanofiltration erfolgen.

Außerdem können auch alle dem Fachmann bekannten Produktionshilfsstoffe für eine Verbesserung der Lagerstabilität eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Entfernung einer Karies bei dem eine enzymhaltige Zusammensetzung wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, auf den Karies aufweisenden Zahnbereich aufgebracht wird.

Bei der Auswahl der geeigneten Behandlungslösung, insbesondere der geeigneten Enzyme in der Lösung für die Behandlung zur Entfernung von Karies muss beispielsweise berücksichtigt werden, um welche Art von Karies es sich im Einzelfall handelt.

Grundsätzlich wird zwischen unterschiedlichen Arten von Karies differenziert. So lässt sich Karies beispielsweise in eingebrochene Kariesläsionen mit ungehindertem Zugang zum Dentin, Kariesläsionen bei denen kariöses Dentin noch mit Schmelz überdeckt ist, Schmelzkaries, Zahnhalskaries und Wurzelkaries einteilen.

Wenn die mit Karies befallene Stelle mit einer dicken Schmelzschicht oder einer alten Füllung umgeben ist und daher für die Behandlungs-Zusammensetzung nicht zugänglich ist, kann der Schmelzdeckel oder die alte Füllung mit einem schnell drehenden Bohrer entfernt werden. Wenn die Schmelzabdeckung jedoch beispielsweise aufgrund einer fortgeschrittenen Karieserkrankung, perforiert ist, kann diese auch ohne den Einsatz eines Dentalbohrers, mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Kombination mit mechanischer Unterstützung durchdrungen werden. Denkbare mechanische Werkzeuge zur Unterstützung der Durchdringung perforierter Schmelzabdeckungen umfassen eine Microbrush mit Kunststoff oder Metallbürstchen, Handstücke mit Metallspitze, Handstücke mit Löffel„ Handstücke mit Kugelkopf und andere in der Zahnarztpraxis üblicherweise vorhandene zahnärztlich verwendete Werkzeuge. Diese Werkzeuge dienen dazu, die erfindungsgemäße Lösung auf der zu behandelnden Stelle zu verteilen und einzumassieren, der Ablösung von erweichtem kariösen Dentin und zum taktilen Ertasten harter Dentin- und Schmelzoberflächen.

Wenn Zugang zum mit Karies infzierten Zahnbereich möglich ist, erfolgt die Behandlung üblicherweise, indem zunächst die kariösen Zahnbereiche im Mund des Patienten identifiziert werden. Die Identifizierung kann dabei nach die dem Zahnarzt bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise durch In-Augenscheinnahme, Sondierung, Röntgen, aber auch durch Anwendung diagnostischer Abformmassen. Die identifizierten kariesbefallenen Zahnbereiche werden gegebenenfalls grob gesäubert, beispielsweise mit einer Sonde oder einem Exkavator wobei gegebenenfalls auch Abrasionsmittel zugesetzt werden können. Anschließend wird der zu behandelnde Zahnbereich abgespült und trocken geblasen.

Nach diesen Vorbereitungen folgt die Entfernung des Karies, indem auf den vorbereiteten Zahnbereich die erfindungsgemäße enzymhaltige Lösung aufgebracht wird.

Die zu behandelnde Stelle sowie die gegebenenfalls vorhandene Kavität sollte immer vollständig mit der erfindungsgemäßen Lösung bedeckt bzw. gefüllt sein. Ein geeignetes Auftragvolumen für die Behandlung eines mit Karies befallenen Zahnbereichs beträgt beispielsweise ca. 100 &mgr;l. Allerdings sollte das geeignete Auftragvolumen dem Einzelfall also der Größe der Kavität und der Größe des mit Karies infizierten Zahnbereichs angepasst werden. Geeignete Auftragsvolumina liegen daher in einem Bereich von etwa 0,001 bis etwa 0,5 ml, vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 0,3 ml und weiter bevorzugt in einem Bereich von 0,02 bis 0,2 ml.

Die bevorzugte Einwirkzeit der erfindungsgemäßen enzymhaltigen Zusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 10 sec. bis etwa ca. 5 min., wobei je nach Größe der Kariesläsion die Einwirkzeiten verkürzt oder verlängert werden können. Die Einwirkzeit liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 15 sec. bis etwa 3 min., beispielsweise im Bereich von etwa 15 sec. bis etwa 2 min. oder im Bereich von etwa 20 sec. bis 1 min.

Während der Einwirkzeit werden die kariösen Bestandteile der Kariesläsion zersetzt, und es bildet sich eine größere Kavität aus. Nach dem Ablauf der Einwirkzeit wird der behandelte Zahnbereich abgespült und gegebenenfalls trockengeblasen.

Der kariesauflösende Behandlungsschritt erfolgt beispielsweise nach folgendem Schema. Es wird ein geeignetes Auftragsvolumen der erfindungsgemäßen enzymhaltigen Lösung auf den zu behandelnden Zahnbereich aufgebracht, die Lösung wirkt 5 sec. bis etwa 5 min. ein, und anschließend wird der Zahnbereich beispielsweise mit Wasser gespült. Ein solcher Handlungsablauf wird nachfolgend als ein Inkubationsschritt bezeichnet.

Grundsätzlich erfolgt der Inkubationsschritt so oft wie erforderlich, damit keine kariösen oder bakteriellen Reste am behandelten Zahnbereich zurückbleiben. Der Inkubationsschritt kann einmal erfolgen oder mehr als einmal, beispielsweise 2 oder 3 mal oder noch häufiger wiederholt werden. In den meisten Fällen wird es jedoch nicht erforderlich sein, den Inkubationsschritt mehr als 2 oder 3 mal zu wiederholen.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn der Inkubationsschritt mit der erfindungsgemäße Zusammensetzung zweimal hintereinander erfolgt. Die erfindungsgemäße Enzymlösung sollte dabei jeweils für etwa 10 bis etwa 30 sec., beispielsweise etwa 20 sec. auf den mit Karies befallenen Zahnbereich einwirkt.

Der vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Entfernung von Karies, bei der eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, insbesondere eine mindestens ein Lösungsmittel enthaltende erfindungsgemäße Zusammensetzung auf einen kariösen Zahnbereich aufgetragen wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Entfernung von Karies, dadurch gekennzeichnet, dass es in zwei oder mehr Inkubationsschritten durchgeführt wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus ein Verfahren zur Entfernung von Karies, bei dem in einem ersten und in einem oder mehreren weiteren Schritten jeweils eine erfindungsgemäße Zusammensetzung auf den kariösen Zahnbereich aufgebracht wird.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung herausgestellt, dass es in bestimmten Situationen vorteilhaft sein kann, eine enzymhaltige Behandlungslösung einzusetzen, die auf einen pH-Wert eingestellt ist, bei dem Zahnschmelz und Dentin angegriffen und gelöst werden. Beispielsweise kann dies dann der Fall sein, wenn sich die Kariesläsion unterhalb einer perforierten aber nicht völlig zerstörten Zahnschmelzkappe befindet. In solchen Fällen lässt sich durch eine sauer eingestellte enzymhaltige Behandlungslösung eine bohrerfreie Entfernung der Schmelzkappe erreichen, wobei das in einer solchen Lösung enthaltene Enzym den Abbau der in der unter der Schmelzkappe liegenden kariösen Bereiche einleitet oder durchführt.

Es kann weiterhin vorteilhaft sein, wenn eine bereits mit einer enzymhaltigen Zusammensetzung mit einem pH-Wert von 5 oder mehr behandelte Kariesläsion in einem Zwischenschritt oder abschließend mit einer enzymhaltigen Behandlungslösung behandelt wird, die auf einen pH-Wert eingestellt ist, bei dem Zahnschmelz und Dentin angegriffen und gelöst werden. Durch die auflösende Wirkung einer solchen sauren Lösung auf Dentin und Schmelz wird eine Aufrauung der Innenflächen der Kavität erreicht, welche eine nachfolgende Füllungstherapie vorbereitet und erleichtert.

Geeignete Behandlungslösungen weisen einen pH-Wert von weniger als etwa 4, insbesondere weniger als etwa 3 auf. Geeignete pH-Werte liegen beispielsweise innerhalb eines Bereichs von etwa 1 bis etwa 4, insbesondere etwa 1,2 bis etwa 3 oder etwa 1,5 bis etwa 2,5, beispielsweise etwa 2.

Eine derartige Behandlungslösung sollte als Enzym mindestens ein Enzym enthalten, das bei einem pH-Wert innerhalb des oben angegebenen Bereichs Aktivität aufweist. Besonders geeignet ist hierbei das Enzym Pepsin.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Entfernung von Karies, bei dem eine Behandlungslösung eingesetzt wird, die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält. Vorzugsweise liegt der pH-Wert bei dem die Protease ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweist bei höchstens etwa 5 oder höchstens etwa 4.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Entfernung von Karies, bei dem eine Kariesläsion mit mindestens einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und mindestens einer Behandlungslösung, die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält, in Kontakt gebracht wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine solche Behandlungslösung beispielsweise eine Aspartatprotease, vorzugsweise Pepsin. Der anfangs-pH-Wert der in diesem Verfahren eingesetzten Behandlungslösung beträgt vorzugsweise etwa 1,0 bis etwa 2,5. Eine solche im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Behandlungslösung enthält vorzugsweise einen Puffer.

Das Karies-Behandlungsverfahren mit einer solchen, vorzugsweise pepsinhaltigen Behandlungslösung erfolgt im wesentlichen gemäß dem bereits beschriebenen Verfahren, bei dem eine erfindungsgemäße Zusammensetzung eingesetzt wird.

Eine entsprechende saure Behandlungslösung kann durch eine bereits poröse Zahnschmelzüberdeckung Zugang zu den mineralisch eingehüllt Proteinanteilen in einer Kariesläsion gewähren. Gleichzeitig denaturiert die Säure die Proteine in der Kariesläsion. Dadurch wird der proteolytische Abbau unterstützt. Dies ist insbesondere für den hohen Kollagenanteil vorteilhaft, denn natives und strukturell intaktes Kollagen wird von Pepsin nur langsam angegriffen. Säure und Pepsin wirken in diesem Fall synergistisch.

Um zu vermeiden, dass die hier beschriebene Zusammensetzung zu tief in den Zahn eindringt, dass heißt auch gesundes Zahnmaterial schädigt, wird die alkalische Eigenschaft des Hydroxylapatits genutzt. Je mehr Hydroxylapatit gelöst wird, desto mehr wird der pH-Wert der Lösung nach pH 4 verschoben und die Hydroxylapatit auflösende Kapazität fällt stark ab. Daher stellt auch die saure pepsinhaltige Lösung keine Gefahr für gesunde Zahnbereiche dar. Vorteilhaft ist weiterhin, dass die saure Pepsinlösung keimabtötend wirkt.

Die beschriebene Behandlungslösung kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung alleine in einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zur Behandlung von Kariesläsionen eingesetzt werden. Es ist erfindungsgemäß jedoch ebenso möglich, die Behandlungslösung in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, insbesondere in Kombination mit einer Lösungsmittelhaltigen erfindungsgemäßen Zusammensetzung einzusetzen.

Die Abfolge von Behandlungsschritten mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und einer sauren Behandlungslösung ist dabei im wesentlichen beliebig. So können erfindungsgemäße Zusammensetzung und saure Behandlungslösung beispielsweise in 2 oder mehr Schritten jeweils abwechselnd oder mehrmals in Folge jeweils nacheinander eingesetzt werden. Der erste Behandlungsschritt kann dabei mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder mit einer sauren Behandlungslösung erfolgen.

Vorzugsweise findet dabei zwischen den einzelnen Behandlungsschritten ein Spülschritt statt, bei dem die Reste der aufgelösten Bestandteile der Kariesläsion zusammen mit der zur Behandlung eingesetzten Zusammensetzung oder Behandlungslösung entfernt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Karies, bei dem eine Kariesläsion mit mindestens einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und mindestens einer Behandlungslösung, die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält, in Kontakt gebracht wird. Die Behandlung erfolgt vorzugsweise in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Schritten.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat es sich beispielsweise als vorteilhaft erwiesen, wenn zuerst zwei Inkubationsschritte mit einer erfindungsgemäßen Lösung erfolgen und ein abschließender Inkubationsschritt mit der sauren Behandlungslösung erfolgt. Die saure Behandlungslösung ätzt die Zahnoberfläche leicht an, und eignet sich daher gut zur Vorbereitung für eine der Kariesentfernung folgende Füllungstherapie. Durch die harte und etwas raue Oberfläche, die durch die Ätzwirkung der sauren Behandlungslösung entsteht, haften die Füllmaterialien sehr gut am Zahn.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den ersten Inkubationsschritt mit einer sauren pepsinhaltigen Lösung vorzunehmen. Diese Vorgehensweise ist optimal bei einer Zahnschädigung, bei der die Zahnschmelzschicht zwar das infizierte Dentin überdeckt, jedoch selbst durch Karies schon so porös und weich geworden ist, dass die Säure ausreicht, um durch die poröse Zahnschmelzschicht einen Zugang zum Dentin herzustellen, Kollagen zu denaturieren und denaturiertes Kollagen zu degradieren.

Anschließend kann beispielsweise ein Inkubationsschritt mit einer erfindungsgemäßen Lösung erfolgen, um das denaturierte Kollagen abzubauen.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Behandlung von Karies bewirkt, dass im wesentlichen keine nachweisbaren bakteriellen Rückstände an dem zuvor mit Karies befallenen Zahnbereich verbleiben. Dies lässt sich beispielsweise durch mikroskopische Analysen nachweisen.

Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lösungen zur Kariesbehandlung können dem Anwender prinzipiell in beliebiger Form zur Verfügung gestellt werden. So kann dem Anwender im grundlegenden Fall beispielsweise ein Kit zur Verfügung gestellt werden, das zwei oder mehr der oben genannten Enzyme enthält, die der Anwender dann in der erforderlichen Menge selbst zusammenmischt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Kit enthaltend mindestens zwei Enzyme, die zu einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung vermischbar sind.

Um dem Anwender die Mischung zu erleichtern kann es vorteilhaft sein, dem Kit beispielsweise ein geeignetes Lösemittel beizufügen. Darüber hinaus ist es durchaus möglich und erleichtert die Anwendung, wenn die von Kit umfassten Enzyme bereits in einem geeigneten Mischungsverhältnis im Hinblick auf ihre Aktivität innerhalb der oben genannten Grenzen vermischt vorliegen.

Häufig ist es sinnvoll, die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und einer sauren Behandlungslösung zu kombinieren. Um dem Anwender auch hier die Anwendung zu erleichtern hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, die erfindungsgemäße Zusammensetzung und die saure Behandlungslösung ebenfalls als Kit zur Verfügung zu stellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Kit enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder mindestens eine saure Behandlungslösung, die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält oder enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Zusammensetzung und mindestens eine saure Behandlungslösung, die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7, vorzugsweise bei einem pH-Wert von höchstens 4, ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer mindestens eine Protease und eine Glucosidase enthaltenden Zusammensetzung zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens einer Protease, die im sauren pH-Bereich unter 7, insbesondere bei einem pH-Wert von höchstens 4, ihr proteolytisches Wirkungsoptimum hat, zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.

Die Erfindung wird nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Ausführungsbeispiele Verwendete Enzyme:

Die Enzyme Pepsin, Kollagenase, Lysozym, Pronase, Dextranase und alpha-Amylase wurden von der Firma SIGMA bezogen. Das Enzym Proteinase K wurde von der Firma ICN bezogen.

Beispiel 1: Rezepturen
Lösung 1
Lösung 2
Beispiel 2: Behandlungsverfahren

Die Untersuchungen zur Bestimmung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Lösungen wurden in vitro an extrahierten, kariösen Zähnen durchgeführt.

1. Zugang

Wenn nötig, wurde der Teil der den kariösen Bereich überdeckenden Schmelzschicht mit einem schnelldrehendem Bohrer entfernt

2. Gegebenenfalls grobe Säuberung

Die grobe Säuberung ist nicht notwendig, erleichtert jedoch dem behandelnden Zahnarzt die Überprüfung der Wirkung der Behandlung. Mit einem Exkavator oder Karieslöffel wurde eine grobe Säuberung der Kariesläsion vorgenommen.

3. Behandlung mit Enzymlösungen
  • a) 20 sec 100 &mgr;l Lösung 1
  • b) Spülen
  • c) 20 sec 100 &mgr;l Lösung 1
  • d) Spülen
  • e) 20 sec 100 &mgr;l Lösung 2
  • f) Spülen
  • g) danach gegebenenfalls Füllungstherapie

Da beide Lösungen alleine in der Lage sind, Bakterienfreiheit des mit Karies erkrankten Zahnbereich zu erzielen, kann eine Behandlung auch mit ausschließlich einer Lösung 1 oder 2 erfolgen oder auch in einer anderen Abfolge. Zu bevorzugen ist eine kombinierte Anwendung. Eine finale Anwendung der sauren Lösung 2 (pH-Wert 2,0) ist besonders vorteilhaft, wenn anschließend eine Füllungstherapie vorgenommen werden soll.

Beispiel 3: Nachweis der Bakterienfeiheit

Nach bestimmungsgemäßer Anwendung der erfindungsgemäßen Enzymlösungen zur Entfernung von infizierter Zahnhartsubstanz in der Kariesläsion wurde der extrahierte und behandelte Zahn mit Druckluft getrocknet und in einer Einbettmasse (cytofix, Fa. Struers) fixiert. Mit einer Innenlochsäge wurden schrittweise Zahnschnitte durch die behandelte Kariesläsion erstellt. Die Zahnschnitte wurden vom umgebenden Einbettmaterial befreit und jeweils in 1 ml lebend/tod-Färbelösung für Bakterien inkubiert (Live/Dead BacLight, Fa. Molecular Probes). Während der Inkubation wurden die Zahnschnitte lichtgeschützt aufbewahrt. Mit einem Fluoreszenzmikroskop (Fa. Zeiss, Axioplan 2) wurden die markierten Bakterien im Auflicht mit einem 24 FITC-Filter bei 630-facher und 1000-facher Vergrößerung beobachtet. Während bei einer unbehandelten Referenzprobe unter den gleichen Bedingungen ein Bakterienrasen erkennbar war, waren die erfindungsgemäß behandelten Proben völlig bakterienfrei.

Bei weniger stark mit Karies zerstörtem Zahnmaterial kann bereits ein einmaliges Auftragen nur einer erfindungsgemäßen oder einer Pepsin-haltigen Lösung zu Bakterienfreiheit des vorher mit Karies erkrankten Zahnbereichs führen.


Anspruch[de]
  1. Zusammensetzung enthaltend mindestens eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine biologisch wirksame Glucosidase, wobei die Proteasen und die Glucosidasen in einem Aktivitätsverhältnis von 1000000 : 1 bis 1 : 1000000 vorliegen und die Gesamtenzymaktivität mindestens 2 U / ml beträgt.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass sie als Protease mindestens eine Proteinase K, Kollagenase oder Pronase oder ein Gemisch aus zwei oder mehr davon enthält.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass sie als Glucosidase mindestens eine Glucosidase vom Typ Lysozym, &agr;-Amylase oder Dextranase oder ein Gemisch aus zwei oder mehr davon enthält.
  4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei Proteasetypen und mindestens einen Glucosidasetyp enthält.
  5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteinase K, Kollagenase, Lysozym und Dextranase enthält.
  6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Lösungsmittel enthält.
  7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie als Lösungsmittel mindestens ein polares Lösungsmittel enthält.
  8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Puffer enthält.
  9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Phosphatpuffer enthält.
  10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass sie mindestens einen Hilfsstoff ausgewählt aus einer oder zwei oder mehr der folgenden Hilfsstoffgruppen enthält

    i. Komplexierungsmittel,

    ii. Enzymsubstrate,

    iii. Enzymeffektoren

    iv. Verdickungsmittel

    v. Konservierungsstoffe

    vi. Stabilisatoren
  11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym eine Enzymaktivität in einem pH-Bereich von 1 bis 10 aufweist.
  12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym eine Enzymaktivität in einem pH-Bereich von 5 bis 8 aufweist.
  13. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem mindestens eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine biologisch wirksame Glucosidase so vermischt werden, dass die Proteasen und die Glucosidasen in einem Aktivitätsverhältnis von 1.000.000 : 1 bis 1 : 1000000 vorliegen und die Gesamtenzyrnaktivität mindestens 2 U /ml beträgt.
  14. Kit enthaltend mindestens zwei Enzyme, die zu einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 vermischbar sind.
  15. Kit gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es ein getrennt vorliegendes Lösemittel enthält.
  16. Kit, umfassend mindestens eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und mindestens eine Behandlungslösung, die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 4 ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält.
  17. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.
  18. Verwendung eines im pH Bereich unter 7 proteolytisch aktiven Enzyms zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.
  19. Verwendung nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym sein Wirkungsoptimum bei einem pH-Wert von höchstens 4 aufweist.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 oder 19 dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Pepsin ist.
  21. Verwendung einer Glucosidase zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.
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