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Dokumentenidentifikation DE69530683T2 25.03.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000751765
Titel SULFONAMID DERIVATE UND DEREN VERWENDUNG
Anmelder Pharmacopeia, Inc., Princeton, N.J., US
Erfinder BALDWIN, J., John, Gwynedd Valley, US;
OHLMEYER, H., Michael, Plainsboro, US;
HENDERSON, Ian, Plainsboro, US
Vertreter Patentanwälte Wallach, Koch & Partner, 80339 München
DE-Aktenzeichen 69530683
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.03.1995
EP-Aktenzeichen 959137019
WO-Anmeldetag 10.03.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/US95/03223
WO-Veröffentlichungsnummer 0095024186
WO-Veröffentlichungsdatum 14.09.1995
EP-Offenlegungsdatum 08.01.1997
EP date of grant 07.05.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.03.2004
IPC-Hauptklasse C07B 61/00
IPC-Nebenklasse A61K 31/095  

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft feste Träger zum Konstruieren kombinatorischer Bibliotheken und betrifft insbesondere nicht-oligomere kombinatorische Bibliotheken.

Ausgangspunkt der Erfindung

Es besteht ein Interesse an Verfahren zur Synthese großer Mengen unterschiedlicher Verbindungen, die bezüglich verschiedener möglicher physiologischer oder anderer Aktivitäten gescreent werden können. Es wurden Techniken entwickelt, bei denen man einzelne Einheiten aufeinander folgend als Teil der chemischen Synthese zusetzt, um alle oder eine beträchtliche Anzahl der möglichen Verbindungen zu erzeugen, die sich aus all den unterschiedlichen Wahlmöglichkeiten ergeben können, die in jedem aufeinander folgenden Stadium der Synthese möglich sind. Damit diese Techniken erfolgreich sein können ist es notwendig, dass die Verbindungen Verfahren zugänglich sind, durch die man die Struktur der so hergestellten Verbindungen bestimmen kann. Brenner und Lerner (PNAS USA 81: 5.381–83 (1992)) und WO 93/20242 beschreiben beispielsweise eine Synthese, bei der die Oligonucleotide parallel miteinander erzeugt werden und chemisch als genetische Markierungen an Oligopeptide als den interessierenden Verbindungen gebunden werden. WO 93/06121 lehrt Verfahren zur Synthese von Zufalls-Oligomeren auf Teilchenbasis, wobei die Identifizierungsmerkmale auf den Teilchen dazu verwendet werden, die Identifizierung der Oligomersequenz, die synthetisiert wird, zu erleichtern. Ein ablösbares bzw. abtrennbares Markierungssystem ist in 0hlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10.922–10.926, Dez. 1993 beschrieben. Ein weiteres ablösbares Markierungssystem ist in der WO-A-94/08051 offenbart.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Erkenntnis, dass die Verwendung von Divinylbenzol-vernetzten, mit Polyethylenglykol gepfropften Polystyrol-Kügelchen als festen Trägern in den Festphasensynthesen bestimmte Vorteile bzgl. der Ausbeute gegenüber Divinylbenzol-vernetzten Polystyrol als festen Trägern, denen die PEG-Funktionalität fehlt, mit sich bringen kann.

Demgemäß stellt die Erfindung gemäß einem ersten Grundgedanken die Verwendung von Divinylbenzol-vernetztem Polyethylenglykol gepfropften Polystyrol-Kügelchen als feste Träger zum Konstruieren nicht-oligomerer kombinatorischer Bibliotheken bereit.

In einer Ausführungsform wird der Ligand von den festen Trägern durch Photolyse abgelöst.

Das Divinylbenzol-vernetzte Polyethylenglykol-gepfropfte Polystyrol kann mit Amino-, Hydroxy-, Carboxy- oder Halogen-Gruppen funktionalisiert sein und wird in einer bevorzugten Ausführungsform mit Amino- oder Hydroxy-Gruppen, besonders bevorzugt mit Amino-Gruppen funktionalisiert.

Bei einem weiteren Grundgedanken stellt die Erfindung eine nicht-oligomere kombinatorische Bibliothek bereit, in der die festen Träger in Form von Divinylbenzol-vernetzten Polyethylenglykol-gepfropften Polystyrol-Kügelchen vorliegen, wie sie hierin vorstehend definiert wurden.

Kombinatorische Bibliotheken, die unter Verwendung der festen Träger der vorliegenden

Erfindung herstellt werden können, werden durch die Formel I repräsentiert: wobei
ein fester Träger ist; T'-L- ein Identifikationsrest ist;

L'-&Pgr;' ein Ligand/Linkenest ist; und

q 3–30 ist.

Bevorzugte Verbindungen der Formel 1 sind solche, bei denen:

T'-L- die folgende Formel aufweist:

wobei n = 3–12, wenn Ar Pentachlorphenyl ist und

n = 4–6, wenn Ar 2,4,6-Trichlorphenyl ist.

q 3–13 ist; und -L'
ist, wobei die linke Bindung, wie dargestellt, der Befestigungs- bzw. Bindungspunkt des festen Trägers ist und die rechte Bindung der Befestigungspunkt des Liganden ist und B O oder NH ist, unter dem Vorbehalt, dass in (b) B NH ist, wenn es im Liganden an eine Carbonyl-Gruppe gebunden ist.

Abhängig von der Wahl von L' (siehe Tabelle 1) können die Liganden der Formel II durch photolytische, oxidative oder andere Spalttechniken abgelöst werden. Wenn beispielsweise – L' (a) ist und B O ist, kann eine photolytische Ablösung durch folgendes dargestellt werden:

wobei L'' der Rest von L' ist und II'BH II ist.

Deswegen werden die Verbindungen, die unter Verwendung der festen Träger der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können ebenfalls durch die nachfolgende Formel II dargestellt Y-A-CO-R1 wobei R'

R2 der Rest am &agr;-Kohlenstoff von Methionin, O-t-Butylserin, Serin, S-trityl-Cystein, Cystein, Asparaginsäure-&bgr;-t-butylester, der Asparaginsäure, Glutaminsäure-&bgr;-t-butylester, Glutaminsäure, Nim-trityl-Histidin, Histidin, N&egr;-Boc-lysin, Lysin, N9-Mtr-arginin, Arginin, N-&bgr;-trityl-Asparagin, Asparagin, N-&ggr;-trityl-Glutamin, Glutamin, Nin-Boc-Tryptophan, Tryptophan, Isoleucin, Phenylalanin, Glycin, Alanin, Valin oder Leucin ist;

R3 ein niederes Alkyl ist oder -(CH2)m-Q-X ist;

R4 -Q(R7,R8)-SO2NH2,-(CH2)m-R10 ist, unter dem Vorbehalt, dass, wenn m = 0 ist, R10 nicht OH, niederes Alkyl, ein 6-gliedriger aromatischer heterozyklischer Ring ist, der 1 oder 2 N-Atome enthält, Heteroaryl-niederes Alkyl,
R5 niederes Alkyl, niederes Cycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, ein mono- oder bizyklisches 6- bis 10-gliedriges aromatisches Ringsystem, oder ein mono- oder bizyklisches 5- bis 10-gliedriges heteroaromatisches Ringsystem ist, das 1 oder 2 N-Atome enthält, wobei jedes System unsubstituiert ist oder mit 1-2 Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus Halogen, Alkoxy, Alkyl, CF3, CN, -N(niederalkyl)2 und Acylamino;

R6 H oder niederes Alkyl ist;

R7, R8 jeweils unabhängig H, Halogen, niederes Alkyl, Alkoxy, CN, -NO2, -CO-niederes Al-kyl, -N(niederes Alkyl)2, oder NH-CO-niederes Alkyl ist;

R9 OH, CONH2 oder COOH ist;

R10 Alkoxy, OH, oder COOH ist;

m 0–6 ist; A-NH-CHR2-, -NH(CH2)2-12
oder der Decarboxyrest einer primären oder sekundären Aminosäure ist;

Q ein 5- oder 6-gliedriger aromatischer oder heteroaromatischer Ring ist, der 0–3 Heteroatome enthält, ausgewählt aus O, N und S, oder ein bizyklisches 9- oder 10-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem ist, das 0–3 Heteroatome enthält, ausgewählt aus O, N und S;

X H, niederes Alkyl, Alkoxy, CF3, CN, -NO2, -CO-niederes Alkyl, -N(niederes Alkyl)2, NH-CO-niederes Alkyl, oder COOH ist;

Y -SO2R3, -COR4, -CO-CH(R2)-NHSO2R3, -CO-CH(R2)-NHCOR4, -CO-NHR5, oder – COOR5 ist;

Z -O-, -S-, oder N(niederes Alkyl) ist;

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon.

Die Verbindung der Formel II kann beispielsweise eine Verbindung sein, bei der:

n-BuSO2-, (CH3)2CHSO2- ist oder
ist, wobei R11 CH3, (CH3)3C-, oder Cl ist;

A -NH-CHR2-, -NH(CH2)2-12-,
oder der Decarboxyrest einer primären oder sekundären Aminosäure ist; und

Die Verbindung der Formel II kann ebenfalls eine Verbindung sein, bei der

Die kombinatorische Bibliothek bzw. Bank der Formel kann in Assays dazu verwendet werden, biologisch aktive bzw. wirksame Verbindungen (Liganden) der Formel &Pgr; zu entdecken. Es wird somit ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereitgestellt, die ein erwünschtes Charakteristikum aufweist, und das ein Synthetisieren einer kombinatorischen Bibliothek der Formel I und ein Testen der Verbindungen der Formel I und der Liganden der Formel II, jeweils an den festen Träger gebunden oder von diesem abgelöst, in einem Assay einschließt, der die Verbindungen mit den erwünschten charakteristischen Strukturen jeder so identifizierten Verbindung aufweist.

Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Divinylbenzol-vernetzten, mit Polyethylenglykol gepfropften Polystyrol-Kügelchen bereit, die wahlweise mit Amino-Gruppen (beispielsweise TentaGel® S NH2, Rapp Polymere) als feste Träger funktionalisiert ist, zum Konstruieren von kombinatorischen Bibliotheken. Die Verwendung dieser Kügelchen erhöht die Ausbeute an Liganden in großem Maße, beispielsweise der Verbindungen der Formel II, die von den festen Trägern abgelöst werden. Ausbeuten von Liganden von Trägern wie beispielsweise DVB-vernetztem Polystyrol sind relativ gering (< 10%). Die Verwendung von DVB-vernetzten PEG-gepfropften Polystyrol-Produkten ergibt Ausbeuten von > 60%.

Definitionen

Die nachfolgenden Abkürzungen haben die angezeigte Bedeutung:

c- = Cyclo

DEAD = Diethylazodicarboxylat

DCM = Dichlormethan = Methylenchlorid

DIC = Diisopropylcarbodiimid

DMAP = 4-N,N-Dimethylaminopyridin

DMF = N,N-Dimethylformamid

DVB = 1,4-Divinylbenzol

EDT = Ethandithiol

FACS = Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren

Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

GC = Gaschromatographie

HOBt = N-Hydroxybenzotriazol

im = Imidazol

in = Indol

m- = Meta

Me = Methyl Mtr = 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl

PEG = Polyethylenglykol

Ph = Phenyl

r.t. = Raumtemperatur

sat'd = gesättigt

s- = sekundär

t- = tertiär

TFA = Trifluoressigsäure

THF = Tetrahydrofuran

Der Begriff Alkyl soll lineare, verzweigtkettige oder zyklische Strukturen und Kombinationen hiervon einschließen. "Niederes Alkyl" schließt Alkyl-Gruppen von 1-8 Kohlenstoffatomen ein. Beispiele für niedere Alkyl-Gruppen schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Sund t-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl und dergleichen ein. "Niederes Cycloalkyl" schließen Cycloalkyl-Gruppen von 3-8 Kohlenstoffatomen ein. Beispiele für niedere Cycloalkyl-Gruppen schließen c-Butyl, c-Pentyl, 2-Methylcyclopropyl, Cyclopropylmethyl, Adamantyl und dergleichen ein.

"Alkenyl" ist ein C3-C6 Alkenyl einer linearen, verzweigtkettigen oder zyklischen (C5-C6) Konfiguration und Kombinationen hiervon. Beispiele für Alkenyl-Gruppen schließen Allyl, Isopropenyl, Pentenyl, Hexenyl, C-Hexenyl, 1-Propenyl, 2-Butenyl, 2-Methyl-2-butenyl und dergleichen ein.

"Alkinyl" ist ein C3-C6 Allkinyl einer linearen oder verzweigtkettigen Konfiguration und Kombinationen hiervon. Beispiele für Alkinyl-Gruppen schließen Propin, Butin, Pentin, 3-Methyl-1-butin, 3,3-Dimethyl-1-butin und dergleichen ein.

"Alkoxy" bedeutet Alkoxy-Gruppen von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen einer geradkettigen, verzweigtkettigen oder zyklischen Konfiguration. Beispiele für Alkoxy-Gruppen schließen Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Cyclopropyloxy, Cyclohexyloxy und dergleichen ein.

"Acylamino" bedeutet Acylamino-Gruppen von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen einer geradkettigen, verzweigtkettigen oder zyklischen Konfiguration. Beispiele für Acylamino-Gruppen sind Acetylamino, Butylamino, Cyclohexylamino und dergleichen.

Halogen schließt F, Cl, Br und I ein.

R2 soll Racemate und alle optischen Isomere einschließen. Die Aminosäurereste R2 sind beispielsweise Methyl (Alanin), Hydroxymethyl (Serie), Phenylmethyl (Phenylalanin), Thiomethyl (Cystein), Carboxyethyl (Glutaminsäure) etc.

In R4 bedeutet "Heteroaryl" ein aromatisches 5- bis 10-gliedriges mono- oder bizyklisches heterozyklisches Ringsystem, das 1 oder 2 N-Atome enthält, wobei die Systeme entweder unsubstituiert sind oder mit 1-2 Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus Halogen, Al-koxy, Alkyl, CF3, CN, -N(niederes Alkyl)2, und Acylamino; in R5 schließen die aromatischen 6- bis 10-gliedrigen carbozyklischen Ringe Benzol und Naphthalen ein und die 5- bis 10-gliedrigen aromatischen heterozyklischen Ringe schließen Imidazol, Pyridin und Indol ein.

In A sollen die primären oder sekundären Aminosäuren Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Arginin, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Sarcosin, L-Alanin, Chlor-L-alaninhydrochlorid, 2-Aminoisobuttersäure, 2-(Methylamino)isobuttersäure, DL-3-Aminoisobuttersäure, DL-2-Aminoisobuttersäure, (R)-(-)-2-Aminoisobuttersäure, (S)(+)-2-Aminoisobuttersäure, D-t-Leucin, L-t-Leucin, D-Norvalin, L-Norvalin, L-2-Amino-4-pentensäure, D-Isoleucin, L-Isoleucin, D-Norleucin, 2,3-Diaminopropionsäuremonohydrochlortd, L-Norleucin, DL-2-Aminocaprylsäure, &bgr;-Alanin, DL-3-Aminobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, 4-(Methylamino)buttersäure-hydrochlorid, 5-Aminomonovalertansäure, 7-Aminoheptansäure, 8-Aminocaprylsäure, 11-Aminodecansäure, 12-Aminododecansäure, Carboxymethoxylamin-Hemihydrat, D-Serin, D-Homoserin, L-Homoserin, L-(+)-Canavaninsulfat-homohydrat, D-Allothreonin, L-Allothreonin, D-Threonin, L-Threonin, DL-4-Amino-3-hydroxybuttersäure, DL-3-Hydroxynorvalin, (3S, 4S)(-)-Statin, 5-Hydroxy-DL-lysinhydrochlorid, 5-Aminoleucinsäurehydrochlorid, 1-Amino-1cyclopropancarbonsäure, 1-Amino-1-cyclopentancarbonsäure, 1-Amino-1-cyclohexancarbonsäure, 5-Amino-l,3-cyclohexadien-l-carbonsäurehydrochlorid, 2-Amino-2-norbornancarbonsäure, (S)-(-)-2-Azetidincarbonsäure, Cis-4-hydroxy-D-prolin, Cis-4-hydroxy-L-prolin, Traps-4-hydroxy-L-prolin, 3,4-Dehydro-DL-prolin, 3,4-Dehydro-L-prolin, D-Pipecolinsäure, L-Pipecolinsäure, Mimosin, 2,3-Diaminopropionsäure-monohydrobromid, DL-2,4-Diaminobuttersäuredihydrochlorid, (S)-(+)-Diaminobuttersäure-hydrochlorid, D-Ornithinhydrochlorid, L-Ornithinhydrochlorid, 2-Methylornithinhydrochlorid-monohydrat, N-&egr;-Methyl-L-lysinhydrochlorid, N-Methyl-D-asparaginsäuremonohydrat, DL-2-Methylglutaminsäurehemihydrat, DL-2-Aminoadipinsäure, D-2-Aminoadipinsäure, L-2-Aminoadipinsäure, (+/-)-3-Aminoadipinsäure, D-Cysteinhydrochloridmonohydrat, D-Penicillamin, L-Penicillamin, DL-Homocystein, S-Methyl-L-Cystein, L-Methionin, D-Ethionin, L-Ethionin, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-(+)-2-Phenylglycin, (R)-(-)-2-Phenylglycin, N-Phenylglycin, N-(4-Hydroxyphenyl)glycin, D-Phenylalanin, (S)-(-)Indolin-2-carbonsäure, &agr;-Methyl, DL-Phenylalanin, &bgr;-Methyl-DL-phenylalaninhydrochlorid, D-Homophenylalanin, L-Homophenylalanin, DL-2-Fluorphenylglycin, DL-2-Fluorphenylalanin, DL-3-Fluorphenylalanin, DL-4-Fluorphenylalanin, DL-4-Chiorphenylalanin, L-4-Chlorphenylalanin, 4-Brom-DL-phenylalanin, 4-Iod-D-phenylalanin, 3,3',5-Triiod-Lthyronin, (+)-3,3',5-Triiod-L-Thyronin-Natriumsalz, D-Thyronin, L-Thyronin, DL-m-Tyrosin, D-4-Hydroxyphenylglycin, D-Tyrosin, L-Tyrosin, O-Methyl-L-tyrosin, 3-Fluor-DL-tyrosin, 3-Iod-L-tyrosin, 3-Nitro-L-tyrosin, 3,5-Diiod-L-tyrosindihydrat, DL-Dopa, L-Dopa, 2,4,5-Trihydroxyphenyl-DL-alanin, 3-Amino-L-tyrosindihydrochloridmonohydrat, 4-Amino-D-Phenylalaninhydrat, 4-Amino-L-phenylalaninhydrat, 4-Amino-DL-phenylalaninhydrat, 4-Nitro-L-phenylalaninmonohydrat, 4-Nitro-DL-phenylalanin, 3,5-Dinitro-Ltyrosinmonohydrat, DL-&agr;-Methyltyrosin, L-&agr;-Methyltyrosin, (-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methyl-L-alanin-sesquihydrat, DL-Threonin-3-phenylserinhydrat und DL-DOPS, einschliessen.

Q soll Phenyl, Thienyl, Furanyl, Thiadiazolyl, Pyridyl und Pyrimidyl einschließen.

L und L' sind in Tabelle 1 dargestellt, die ebenfalls Spaltreagenzien darstellt. Bei der Bezeichnung eines Syntheseschemas sind L und L' so ausgewählt, dass sie orthogonal reaktiv sind, d. h. sie müssen die Entfernung entweder von T oder II ermöglichen (wobei T = T'-OH) ohne Entfernung des anderen, weil eine gleichzeitige Spaltung sowohl von T als auch II vom festen Träger nachteilhaft ist. In den wie dargestellten Strukturen ist die linke Bindung der Befestigungspunkt des festen Trägers und ist die rechte Bindung der Befestigungspunkt von entweder T oder II.

Die Markierungen T sind chemische Einheiten, die mehrere Eigenschaften besitzen: Sie müssen von den festen Trägem abspaltbar bzw. ablösbar sein, vorzugsweise durch Photolyse oder Oxidation; sie müssen individuell unterscheidbar sein und vorzugsweise abtrennbar sein; sie müssen unter den Synthesebedingungen stabil sein; sie müssen dazu in der Lage sein, in sehr niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden zu können, beispielsweise 10–18–10–9 Mol; sie sollten mit leicht verfügbaren Geräten identifizierbar sein, die für ihren Betrieb keine komplexen technischen Fähigkeiten erfordern; und sie sollen relativ ökonomisch sein. Die Markierungen können strukturell verwandt oder unverwandt sein, beispielsweise ein homologe Reihe, sich wiederholende funktionelle Gruppen, verwandte Elemente des Periodensystems, unterschiedliche Isotope, Kombinationen hiervon und dergleichen. Am Ende der kombinatorischen Synthese werden an jeden festen Träger üblicherweise zumindest 0,01 Femtomol, üblicherweise 0,001–50 pmol jeder Markierung angelagert. Die Markierungen können aliphatische, alizyklische, aromatische, heterozyklische Markierungen sein oder Kombinationen hiervon. Unterscheidungsmerkmale können die Anzahl der Wiederholungseinheiten wie beispielsweise Methylen-Gruppen in einer Alkyl-Komponente; Alkylenoxy-Gruppen in einer Polyalkylenoxy-Komponente; Halogen-Gruppen in einer Polyhalo-Verbindung; &agr;- und/oder &bgr;-substituierte Ethylen-Gruppen, wenn die Substituenten Alkyl-Gruppen sein können, Oxy, Carboxy, Amino, Halogen oder dergleichen sein; Isotope; etc.

Es ist beabsichtigt, dass die Definitionen jedes Substituenten oder Symbols (beispielsweise R2, R8, m, etc.) in einem speziellen Molekül von dessen Definitionen an anderer Stelle im Molekül unabhängig sind.

Tabelle 1 Linker-Gruppen
Optische Isomere – Diastereomere – geometrische Isomere

Einige der hierin beschriebenen Verbindungen enthalten ein oder mehrere Asymmetriezentren und können somit Enantiomere, Diastereomere und andere stereoisomere Formen entstehen lassen, die bezüglich der absoluten Stereochemie als (R) oder (S) oder als (D) oder (L) für Aminosäuren definiert werden können. Soweit der Kontext nichts anderes angibt sollen Bezugnahmen auf solche Verbindungen alle derartigen möglichen Diastereomere ebenso wie ihre razemischen und optisch reinen Formen umfassen. Optisch aktive (R) und (S) oder (D und L) Isomere können unter Verwendung chiraler Synthone oder chiraler Reagenzien hergestellt werden oder können unter Verwendung herkömmlicher Techniken getrennt werden. Wenn die hierin beschriebenen Verbindungen olefinische Doppelbindungen enthalten und soweit nichts anderes angegeben ist, sollen sie sowohl E als auch Z geometrische Isomere einschließen.

Salze

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel II als aktiven Inhaltsstoff oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon enthalten können ebenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder wahlweise andere therapeutische Inhaltsstoffe enthalten. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" betrifft Salze, die aus pharmazeutisch verträglichen untoxischen Säuren oder Basen hergestellt wurden, was organische und anorganische Säuren oder Basen einschließt.

Wenn eine Verbindung der Formel II sauer ist, können Salze aus pharmazeutisch verträglichen untoxischen Basen hergestellt werden. Salze, die aus allen stabilen Formen anorganischer Basen gewonnen werden, schließen Aluminium, Ammonium, Kalzium, Kupfer, Eisen, Lithium, Magnesium, Mangan, Kalium, Natrium, Zink etc. ein. Besonders bevorzugt sind die Ammomum-, Kalzium-, Magnesium-, Kalium- und Natriumsalze. Salze, die von pharmazeutisch verträglichen organischen und toxischen Basen abgeleitet sind, schließen Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, substituierte Amine, einschließlich natürlich vorkommender substituierter Amine, zyklische Amine und basische Ionenaustauscherharze wie beispielsweise Arginin, Betain, Koffein, Cholin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Diethylamin, 2-Diethylaminoethanol, 2-Dimethylaminoethanol, Ethanolamin, Ethylendiamin, N-Ethylmorpholin, N-Ethylpiperidin, Glucamin, Glucosamin, Histidin, Isopropylamin, Lysin, Methylglucosamin, Morpholin, Piperazin, Piperidin, Polyamin-Harze, Procain, Purin, Theobromin, Triethylarnin, Trimethylamin, Tripropylamin etc. ein.

Wenn eine Verbindung der Formel II basisch ist, können Salze aus pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Säuren hergestellt werden. Solche Säuren schließen Essigsäure, Benzolsulfonsäwe, Benzoesäwe, Camphersulfonsäure, Citronensäure, Ethansulfonsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Glutaminsäure, Hydrobromsäure, Salzsäure, Isethionsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Mucinsäure, Salpetersäure, Pamoasäure, Panthothensäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Schwefelsäure, Weinsäure, p-Toluolsulfonsäure etc. ein. Besonders bevorzugt sind Citronensäure, Hydrobromsäure, Mal- einsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Weinsäure.

Anwendungsgebiete

Das Vermögen der Verbindungen der Formel II, Serinproteasen zu hemmen, macht diese zur Vorbeugung und Umkehrung der Symptome brauchbar, die von diesen Enzymen in einem Säugetier induziert werden. Diese Enzymhemmung zeigt an, dass die Verbindungen dazu von Nutzen sind, Hyper-Koagulationserkrankungen in Säugetieren, insbesondere in Menschen zu behandeln oder vorzubeugen und sie sind in der Herzinfarktnachbehandlung und in der Post-Angioplastiebehandlung von Nutzen.

Das Vermögen von Verbindungen, Metalloproteasen, wie beispielsweise das Angiotensin umwandelnde Enzym zu hemmen, macht diese zur Vorbeugung oder Umkehrung der Symptome nützlich, die von diesen Enzymen in einem Säugetier induziert werden. Diese Enzymhemmung zeigt an, dass die Verbindungen zur Behandlung, Vorbeugung oder Linderung der Hypertension bzw. des Hochdrucks in Säugetieren, insbesondere von Menschen von Nutzen sind.

Die Fähigkeit der Verbindungen der Formel II, Carboanhydrase-Isoenzyme zu hemmen, macht diese zur Vorbeugung oder Umkehrung der Symptome nützlich, die von diesen Enzymen in einem Säugetier induziert werden. Diese Enzymhemmung zeigt an, dass die Verbindungen dazu nützlich sind, Augenerkrankungen, insbesondere ein Glaukom in Säugetieren, insbesondere in Menschen zu behandeln, vorzubeugen oder zu lindern.

Diese Verbindungen können ebenfalls als Bibliotheken zur Entdeckung neuer Leitstrukturen durch Evaluierung über einen Array biologischer Assays hinweg verwendet werden, einschließlich der Entdeckung selektiver Hemmmuster quer durch Isozyme. Die Bibliotheken sind somit Werkzeuge zur Arzneistoffentdeckung, d. h. als Mittel zur Entdeckung neuer Leitverbindungen durch Screening der Bibliotheken gegen eine Vielzahl biologischer Targets und zur Entwicklung von Struktur-Wirkungsbeziehungen in großen Familien verwandter Verbindungen. Die Bibliotheken können mit den an den festen Trägern befestigten Liganden getestet werden, wie in Formel I dargestellt, oder die individuellen Verbindungen II können vor der Evaluation abgelöst werden. Bei den Verbindungen der Formel I können Screening-Assays wie beispielsweise FACS-Sorting und Cell-Lawn-Assays verwendet werden. Wenn eine Verbindung vor der Ausweitung abgelöst wird, wird deren Beziehung zu ihrem festen Träger aufrechterhalten, beispielsweise durch Lokalisierung innerhalb eines Gitters einer Standard-96-Wellplatte oder durch Lokalisierung der Wirkung auf einem Zellrasen. Der feste Träger, der mit einer Bioaktivität assoziiert ist oder der feste Träger, der mit dem abgelösten Liganden in Bezug steht, kann dann zur Enthüllung der Struktur- und Synthese-Geschichte der aktiven Verbindung dekodiert werden (Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90; 10.922-10.926, Dez. 1993).

Assays zur Bestimmung der biologischen Aktivität Xanthinoxidasehemmung – Die folgenden Materialien werden verwendet:

3,9 &mgr;m Hypoxanthin

0,3 mM 4-Aminoantipyren

2 mM 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat

50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5

5 U/ml Meenettichperoxidase (Sigma P-6782, 5500 U/5 mg)

3 nM Xanthinoxidase (Buttermilch, Sigma X-4500, 16 U/ml) Inhibitor

Die Reaktionen wurden in einem 24 &mgr;l Gesamtvolumen in 96-Well-U-Boden Polypropylenmikrotiterplatten (Costar) durchgeführt, die die Testverbindungen enthielten. 8 &mgr;l Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde jedem Well zugesetzt. Ein Substratgemisch wird auf Eis hergestellt, indem 0,53 ml Natriumphosphatpuffer, 0,4 ml 4-Aminoantipyren (0,61 mg/ml), 0,4 ml 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat (5,3 mg/ml), 4 &mgr;l Meerrettichperoxidase (Sigma P-6782, 5500 U/5 mg), und 128 &mgr;l Hypoxanthin 920 &mgr;g/ml, vermischt werden. 8 &mgr;l des Substratgemisches wird dann in jedes Well pipettiert. 8 &mgr;l Xantinoxidase (Buttermilk, 9,0 nM, Sigma X-4500, 16 U/ml) in Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 (oder in Puffer alleine als Kontrolle) wird zuletzt direkt dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Platten werden dann kurz in einer Tischzentrifuge Impuls-zentrifugiert, bevor die Extinktion abgelesen wird. Die Extinktion wird unter Verwendung eines dualen Kinetikprogramms (490 minus 650 nm) für 15 Minuten bei Raumtemperatur ohne Automix in einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices Thermomax) abgelesen. Die initialen Raten bzw. Geschwindigkeiten wurden berechnet (Vmax Programm) und mit denjenigen der Reaktionen ohne Inhibitor verglichen.

Andere Assays zum Evaluieren der Verbindungen sind in der Technik wohl bekannt. Repräsentative Beispiele von Referenzen, die diese Assays lehren sind wie folgt:

ACE Inhibition – Hohnquist et al., "A Continuous Spectrophotometric Assay for Angiotensin Converting Enzyme", Biochem., 95, 540–548 (1979).

Thrombin Inhibition – Lottenberg et al., "Assay of Coagulation Proteases Using Peptide Chromogenic and Fluorogenic Substrates", Meth. in Enzymol., 80, 341–361, (1981).

Carbonic Anhydrase Inhibition – Maren and Couto, "The Nature of Anion Inhibition of Human Red Cell Carbonic Anhydrases", Archiv. of biochem. and Biophy., 196, Nr. 2, Sept., 501–510 (1979).

Carbonic Anhydrase Inhibition – Ponticello et al., "Thienothiopyran-2-sulfonamides: A Novel Class of Water-Soluble Carbonic Anhydrase Inhibitors", J. Med. Chem., 30, 591597 (11987).

Syntheseverfahren

Die Bibliotheken der vorliegenden Erfindung können gemäß der folgenden Verfahren hergestellt werden. Bei jedem Schritt der Synthese wird jeder feste Träger, auf den eine Verbindung synthetisiert wird, in einzigartiger Weise markiert, um die speziellen chemischen Ereignisse (Ereignis) zu definieren, die während dieses Schrittes auftreten. Die Markierung wird unter Verwendung von Identifikatoren, wie solchen der Formel IV erreicht, die die aufeinanderfolgenden Ereignisse aufzeichnen, denen der Träger während der Synthese ausgesetzt wird, wodurch eine Reaktionsgeschichte für die auf jedem Träger erzeugte Verbindung bereitgestellt wird. Die Identifikatoren werden in Verbindung miteinander verwendet, um ein binäres Kodierungsschema oder ein Kodierungsschema höherer Ordnung zu bilden, das es ermöglicht, dass eine relativ kleine Anzahl von Identifikatoren eine relativ große Anzahl von Reaktionsprodukten kodiert. Wenn sie beispielsweise in einem binären Code verwendet werden, können N Identifikatoren bis zu 2N unterschiedliche Verbindungen und/oder Zustände kodieren. Durch Verbinden jeder Variablen oder Kombination von Variablen in jedem Schritt der Synthese mit einer Kombination von Identifikatoren, die die gewählten Variablen in einzigartiger Weise definieren, wie beispielsweise Reaktant, Reagenz, Reaktionsbedingungen oder Kombinationen von diesen kann man die Identifikatoren zur Definierung der Reaktionsgeschichte jedes festen Trägers verwenden.

Bei der Durchführung der Synthese beginnt man mit zumindest 103, wünschenswerter Weise zumindest 104 und im Allgemeinen nicht mehr als 1015 festen Trägern. Abhängig von der vorherbestimmten Anzahl von R1 Wahlmöglichkeiten für den ersten Schritt teilt man die Träger demgemäß in genauso viele Behälter auf. Die geeigneten Reagenzien und Reaktionsbedingungen werden für jeden Behälter angewendet und die Kombination der Identifikatoren, die jede R1-Wahlmöglichkeit kodiert wird zugesetzt und befestigt. Abhängig von der involvierten Chemie kann die Markierung vor, gleichzeitig mit oder nach den Reaktionen erfolgen, die jede Wahlmöglichkeit umfassen. Als Kontrolle können Probenträger in jedem Stadium aufgesammelt werden und ein Anteil ihrer Markierungen kann abgelöst und zur Verifizierung kodiert werden, dass die korrekten Markierungen an die Probenträger gebunden sind. Nach Bedarf kann man die Kügelchen von allen überschüssigen Reagenzien oder Nebenprodukten vor dem Fortfahren frei waschen. Am Ende jedes Schrittes werden die Träger kombiniert, vermischt und wiederum aufgeteilt, dieses Mal in so viele Behälter, wie es für die Anzahl von A-Wahlmöglichkeiten für den zweiten Schritt in der Synthese vorherbestimmt ist. Dieses Verfahren von Aufteilen, Umsetzen, Markieren und erneutem Vermischen wird wiederholt, bis die kombinatorische Synthese abgeschlossen ist.

Schema 1

Funktionalisierte Träger, wie beispielsweise Amino-funktionalisierte oder Hydroxyterminierende PEG gepfropfte Polystyrol-Kügelchen werden gleichmäßig in einer vorherbestimmten Anzahl von Reaktionsgefäßen aufgeteilt und werden entweder a) mit einem abspaltbaren Linker/Ligandenelement umgesetzt, das so vorgeformt wurde, dass 2 erzeugt wird, wenn das abgelöste Ligandenelement in OH- endet oder b) mit einem abspaltbaren Linker bzw. Verbindungselement umgesetzt wird, gefolgt von einer Reaktion mit einem Ligandenelement, um 3 in dem Fall zu erzeugen, in dem das abgelöste Ligandenelement in COOH endet. Die Verbindungen 2 und 3 werden dann mit Piperidin/DMF behandelt, um der Amino-Gruppe des Ligandenelementes R1 den Schutz zu entziehen, so dass 4 gewonnen wird. (Schema 1, Schritt (c)). Das einzigartige Markieren der Träger in jedem Reaktionsgefäß wird mit Kombinationen aus Identifikatoren erreicht, die in einem binären Schema kodiert sind, wie es beispielsweise in Tabelle 1–1 für sieben Auswahlmöglichkeiten von R1 dargestellt ist. Die Identifikatoren werden durch Zusatz einer Lösung der Identifikatoren (in einem 5% G/G Identifikator/festen Träger-Verhältnis) zu einem Ansatz von Trägern befestigt, der in CH2Cl2 suspendiert ist und durch Schütteln des Gemisches für 30 Minuten. Eine verdünnte Lösung von Rhodiumtrifluoracetat-dimer wird zugesetzt und das Gemisch sofort geschüttelt. Das Gemisch wird weiter über Nacht geschüttelt und in CH2Cl2 gewaschen.

Schema 2

Die Verbindungen 4 werden gepoolt, gemischt und dann in einer vorherbestimmten Anzahl von Reaktionsgefäßen aufgeteilt, wobei jede von diesen mit einem Reagenz behandelt wird, das einem Ligandenelement A entspricht, in Gegenwart von HOBt/DMF, um 5 zu erzeugen. Die Reaktionsgefäße werden dann mit Piperidin/DMF behandelt, um die terminale Amino-Gruppe ihrem Schutz zu entziehen, wodurch sich 6 ergibt. Die einzigartige Markierung der Träger in jedem Reaktionsgefäß wird mit Kombinationen zusätzlicher Identifikatoren erreicht, die in einem binären Schema kodiert sind, wie es beispielsweise in Tabelle 1-2 für 31 Wahlmöglichkeiten von A dargestellt ist.

Schema 3

Die Verbindungen 6 werden gepoolt, gemischt und dann in einer vorherbestimmten Anzahl von Reaktionsgefäßen aufgeteilt, von denen jede mit einem Reagenz behandelt wird, das dem Ligandenelement Y entspricht, in Gegenwart von Lösungsmitteln wie beispielsweise CH2Cl2 und DMF und, falls erforderlich, von Kondensationsreagenzien wie beispielsweise DIC, Acylierungs-Katalysatoren wie beispielsweise DMAP und Basen, wie beispielsweise Triethylamin, um 7 zu produzieren. Die einzigartige Markierung der Träger in jedem Reaktionsgefäß wird mit Kombinationen zusätzlicher Identifikatoren erreicht, die in einem binären Schema kodiert sind, wie es beispielsweise in Tabelle 1–3 für 31 Wahlmöglichkeiten von Y dargestellt ist. Verbindung 7 wird dann entweder UV-Licht (~ 360 nm) in einem niederen Alkanol wie beispielsweise McOH gegenüber ausgesetzt, um die geschützte Form der Verbindungen der Formel II aus dem Träger/Linkerkomplex abzuspalten oder zuerst mit TFA/Thioanisol/EDT behandelt, um die Schutzgruppen an den R2-Seitenketten zu entfernen und dann gegenüber UV-Licht in einer niederen Alkanol wie beispielsweise McOH auszusetzen, um Verbindung 2 zu spalten.

Schema 1

Zusatz von R1

a. Carbonat-gebundene Komponenten
Schema 1 (Fortsetzung)

b. Ester-gebundene Komponenten
Schema 2

Zusatz von A
Schema 3

Zusatz von Y
Repräsentative Verbindungen

Tabelle 2 stellt repräsentative Verbindungen der Formel 1 dar. Y-A-CO-R1 II

Tabelle 2 Repräsentative Verbindungen
Tabelle 2 (Forts.)

Tabelle 3 stellt zusätzliche Verbindungen der Formel II dar, die Inhibitoren der Carbonanhydratase sind: Y-A-CO-R1

Tabelle 3 Repräsentative Verbindungen
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 3 (Fortsetzung)

Die Erfindung ist weiter durch Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele definiert, die als veranschaulichend, jedoch nicht als einschränkend aufgefasst werden sollen.

Zubereitung 1

Identifikatoren

Dreizehn Verbindungen der allgemeinen Formel
wobei

n = 3–12 und Ar Pentachlorphenyl ist oder

n = 4–6 und Ar 2,4,6-Trichlorphenyl ist wurden gemäß Schema 4 und des nachfolgenden illustrativen Beispiels hergestellt.

  • a) Methylvanillat (0,729 g, 4,0 mmol), 1-Hydroxy-9-(2,3,4,5,6,-pentachlorphenoxy)nonan (1,634 g, 4,0 mmol) und Triphenylphosphin (1,258 g, 4,8 mmol) wurden in 20 ml wasserfreiem Toluol unter Argon gelöst. DEAD (0,76 ml, 0,836 g, 4,8 mmol) wurden tropfenweise zugesetzt und das Gemisch wurde bei 25°C für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde auf das halbe Volumen konzentriert und durch Flash-Chromatographie mit DMC gereinigt, so dass sich 1,0 g (1,7 mmol, 43%) des Produktes als weißer kristalliner Feststoff ergaben.
  • b) Der Methylester aus Schritt a) (1,0 g, 1,7 mmol) wurde in 50 ml THF gelöst, 20 ml Wasser wurden zugesetzt, gefolgt von LiOH (1,2 g, 50 mmol). Das Gemisch wurde bei 25°C für eine Stunde gerührt, dann für 5 Stunden unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Abkühlen auf 25 °C wurde das Gemisch auf Ethylacetat (200 ml) gegossen und die Lösung wurde mit 1 M HCl (3 × 50 ml) gewaschen, darauf mit gesättigter wässriger NaCl (1 × 50 ml) und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und die rohe Säure einmal mit Toluol azeotropiert.
  • c) Das Rohmaterial bzw. Ausgangsmaterial aus Schritt (b) wurde in 100 ml Toluol gelöst, 10 ml (1,63 g, 14 mmol) Thionylchlorid wurden zugesetzt und das Gemisch für 90 Minuten unter Rückflusskühlung erhitzt. Das Volumen der Lösung wurde auf ungefähr 30 ml durch Destillation reduziert, darauf wurde das verbleibende Toluol durch Abdampfen entfernt. Das rohe Säurechlorid wurde in 20 ml wasserfreiem DCM gelöst und auf –70°C unter Argon abgekühlt und eine Lösung von ungefähr 10 mmol Diazomethan in 50 ml wasserfreiem Ether wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 90 Minuten gerührt. Argon wurde durch die Lösung für 10 Minuten hindurch geblasen, darauf wurden die Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt und das Rohmaterial wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, unter Elution mit 10–20% Ethylacetat in Hexan. Das Diazoketon (0,85 g, 1,4 mmol, 82% Ausbeute über drei Schritte) wurde als blassgelber Feststoff gewonnen.

Eine Verbesserung bezüglich des endgültigen Diazomethylierungsschrittes wurde durchgeführt, wobei das Säurechlorid mit (Trimethylsilyl)diazomethan umgesetzt wurde und mit Triethylamin, um den Identifikator zu ergeben, der dann ohne weitere Aufreinigung verwendet wurde. Dies war eine bedeutende Verbesserung bezüglich der ursprünglichen Reaktion mit Diazomethan, weil der Identifikator nun in hoher Ausbeute ohne Chlormethylketon-Nebenprodukt gewonnen wurde. Ebenfalls war eine Reinigung durch Flash-Chromatographie nicht mehr länger notwendig, was in einigen Fällen eine signifikante Säure-katalysierte Zersetzung des Identifikators zur Folge hatte.

Alternativer Schritt c): einer Lösung des Acylchlorids (3,8 mmol, 1,00 äq.) und 1,85 ml (13,3 mmol, 3,50 äq.) Triethylamin in wasserfreiem THF/Acetonitril (1 : 1) bei 0 °C unter Argon wurden 5,7 ml (11,4 mmol, 3,00 äq.) einer 2,0 M Lösung von (Trimethylsilyl)diazomethan in Hexanen zugesetzt. Die sich ergebende orange Lösung wurde bei 0°C für 2 Stunden gerührt, dann bei 25°C für 17 Stunden. (Wenn sich unmittelbar nach Zusatz von (Trimethylsilyl)diazomethan ein Präzipitat bzw. eine Ausfällung bildete, wurde CH2Cl2 zugesetzt, bis das Präzipitat erneut gelöst war). EtOAc wurde zugesetzt (250 ml) und die organische Schicht mit gesättigter wässriger NaHCO3 (100 ml) und H2O (100 ml) gewaschen, darauf getrocknet (wasserfreies MgSO4). Die Entfernung der flüchtigen Stoffe im Vakuum ergaben das Produkt als gelbe Kristalle in einer Ausbeute von 60–100%.

Die weiteren 12 Identifikatoren der Formel N wurden durch analoge Synthesewege hergestellt, durch Schritte (a), (b) und (c).

In der Synthese von Beispiel 1 wurden 13 Identifikatoren verwendet, um die kombinatorische Bibliothek zu kodieren. In Schritt 1 wurden Pentachlorphenyl-Identifikatoren, bei denen n = 10–12 (abgekürzt C10Cl5, C11Cl5, und C12Cl5) in dem nachfolgenden binären Kodierungsschema verwendet: 001 = (n = 12), 010 = (n = 11), und 100 = (n = 10). In Schritt 2 wurden Pentachlorphenyl-Identifikatoren verwendet, bei denen n = 5–9 (abgekürzt C5Cl5, C6Cl5, C7Cl5, C8Cl5, und C9Cl5) und wurden wie folgt kodiert: 00001 = (n = 9), 00010 = (n = 8), 00100 = (n = 7), 01000 = (n = 6), und 10000 = (n = 5). In Schritt 3 wurden Pentachlorphenyl-Identifikatoren verwendet, bei denen n = 3–4 (abgekürzt C3Cl5 und C4Cl5) und wurden wie folgt kodiert: 00001 = (n = 4) und 00010 = (n = 3). Ebenfalls in Schritt 3 wurden Trichlorphenyl-Identifikatoren verwendet, bei denen n = 4–6 (abgekürzt C4Cl3, C5Cl3 und C6Cl3) und wurden wie folgt kodiert: 00100 = (n = 6), 01000 = (n = 5'), und 10000 = (n = 4).

Somit wird in Schritt 1 Reagenz 3 (Tabelle 1–1) "011" kodiert, was eine Markierung dieser Wahlmöglichkeit in der Synthese mit den beiden Pentachlorphenyl-Identifikatoren repräsentiert, bei denen n = 11 und 12. Desgleichen wird in Schritt 3 das Reagenz 52 (Tabelle 1–3) "01110" kodiert, was eine Markierung dieser Wahlmöglichkeit in der Synthese mit dem Pentachlorphenyl-Identifikator repräsentiert, bei dem n = 3 und mit den beiden Trichlorphenyl-Identifikatoren, bei denen n = 5 und 6.

Schema 4

Identifikatoren
Herstellung 2 t-Butyl-4-(hydroxymethyl)-3-nitrobenzoat

t-Butyl-4-(acetoxymethyl)-3-nitrobenzoat wurde wie von Barany und Albericio, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 4.936–4.942 beschrieben hergestellt. Jedoch erzeugten Versuche, auch dem Endverfahren zur Hydrazinolyse des Acetats unter Verwendung von Hydrazinhydrat in CHCl3 bei 25°C gemäß der Literatwstelle zu folgen lediglich Spurenmengen des erwünschten Hydroxymethyl-Endproduktes, das der t-Butylester-Vorläufer des hierin verwendeten lichtspaltbaren Linkers ist. Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass die Hydrazinolyse unter Verwendung von Hydrazinhydrat in McOH oder DMF bei 25°C t-Butyl-4-(hydroxymethyl)-3-nitrobenzoat in hoher Ausbeute verwendet, daß jedoch ein Nebenprodukt in DMF durch eine zusätzliche Diimidreduktion der Nitro-Funktionalität zu einer Amino-Gruppe dieses Lösungsmittel unerwünscht macht. Von McOH als Lösungsmittel wurde nur das erwünschte Endprodukt in nahezu quantitativer Ausbeute gewonnen.

Dieses neue Hydrazinolyse-Verfahren wurde ebenfalls dazu verwendet, den lichtspaltbaren Linker zu erzeugen, wenn er an ein TentaGel S NH2-Harz gebunden war.

t-Butyl-4-(hydroxymethyl)-3-nitrobenzoat: einer Lösung von 14,1 g (47,7 mmol, 1,00 äq.) von t-Butyl-4-(acetoxymethyl)-3-nitrobenzoat in McOH (200 ml) wurden 27,0 ml (477 mmol, 10,0 äq.) Hydrazinhydrat (55% Hydrazin) zugesetzt. Die sich ergebende gelbe Lösung wurde bei 25 °C für 4 Stunden gerührt. EtOAc (250 ml) und gesättigte wässrige NaCl (85 ml) wurden zugesetzt und die organische Schicht nach Schütteln gesammelt. Die organische Schicht wurde weiter mit gesättigter NaCl (2 × 85 ml) gewaschen und darauf getrocknet (MgSO4). Eine Entfernung von flüchtigen Stoffen im Vakuum ergab das Produkt in 93%iger Ausbeute als gelbe Kristalle. TentaGel S NH2-gebundenes 4-(Hydroxymethyl)-3-nitrobenzamid: siehe Beispiel 1, Schritt 1a.

Die Reaktion ist in Schema 5 dargestellt.

Schema 5

Hydrazinolyse
Beispiel 1 6727 Verbindungs-Bibliothek Schritt 1 a) Herstellung Ester-gebundener Harzansätze.

TentaGel S NH2 (10 g, 2,9 mmol, 0,29 mmol/g) wurde in 60 ml Methylenchlorid, 4-Acetoxymethyl-3-nitrobenzoesäure (2,77 g, 11,6 mmol, 4 äq.), DMAP (1,42 g, 11,6 mmol, 4 äq.) und DIC (1,81 ml, 1,46 g, 11,6 mmol, 4 äq.) in dieser Reihenfolge zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 25°C mit einem Wrist-Action-Shaker für 5 Stunden gerührt und zu diesem Zeitpunkt ergab das Harz einen negativen Kaiser-Test. Das derivatisierte Harz wurde gewaschen (Methylenchlorid 5 × 50 ml, Isopropanol 5 × 50 ml, darauf Methylenchlorid 5 × 50 ml), im Vakuum getrocknet und in der Dunkelheit aufbewahrt.

Das obige Acetoxymethyl-Harz wird mit Methanol (1 × 150 ml) gewaschen, darauf in 150 ml 10% Hydrazin/Methanol suspendiert. Das Harz wird 44 Stunden lang bei 45 °C geschüttelt bzw. gerührt, filtriert, darauf gewaschen (Methanol, 5 × 100 ml, darauf Methylenchlorid, 5 × 100 ml) und im Vakuum getrocknet.

Drei Ansätze des obigen Hydroxymethyl-Harzes (jeweils 3 g, 0,84 mmol, 4,28 mmol/g) wurden in 100 ml Synthesegefäßen angeordnet und wurden jeweils in 60 ml Dichlormethan suspendiert. Entweder N-Fmoc-Isonipecotinsäure (0,885 g, 2,52 mmol, 3 äq.), N-Fmoc-Nipecotinsäure (0,885 g, 2,52 mmol, 3 äq.) und N-Fmoc-&egr;-aminocapronsäure (0,890 g, 2,52 mmol, 3 eq.) wurden jedem der drei Ansätze zugesetzt. DMAP (0,031 g, 0,252 mmol, 0,3 äq.) und darauf DIC (0,4 ml, 0,318 g, 2,52 mmol, 0,3 äq.) wurden jeweils zugesetzt und die Harzansätze wurden bei 25°C für 22 Stunden gerührt. Die Harzansätze wurden filtriert, gewaschen (Methylenchlorid (5 × 50 ml) und Isopropanol (2 × 50 ml), darauf Methylenchlorid (5 × 50 ml)) und im Vakuum getrocknet.

b) Herstellung von Carbonat-gebundenen Harz-Chargen

N-Fmoc-2-hydroxymethylpiperidin (1,35 g, 4 mmol, 1 äq.) wurden in 20 ml Methylenchlorid gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Phosgen (8 ml, 2 M Lösung in Toluol, 16 mmol, 4 äq.) wurde gefolgt von 2,6-Lutidin (1,86 ml, 1,71 g, 4 äq.) zugesetzt und darauf wurde das Gemisch 30 Minuten lang gerühr. Das Gemisch wurde auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, so dass sich eine Viskoseaufschlämmung ergab und dieser Rückstand wurde erneut in 30 ml Methylenchlorid gelöst (die Lösung enthielt ein wenig ungelösten Feststoff). T-Butyl-4-hydroxymethyl-3-nitrobenzoat (0,51 g, 2 mmol, 0,5 eq.) wurden zugesetzt und das Gemisch bei 25 °C zwei Stunden gerührt. Das rohe Reaktionsgemisch wird auf 200 ml Ethylacetat gegossen und diese Lösung wird mit 1 M HCl (2 × 100 ml), gesättigter wässriger NaHCO3 (2 × 100 ml) und gesättigter wässriger NaCl (1 × 100 ml) gewaschen. Die Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und abgedampft, so dass sich das Rohprodukt ergibt. Dieses wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, unter Elution mit 10–30% Ethylacetat/Hexan, so dass sich das Produkt (1,22 g, 1,97 mmol, 99%) als blassgelber Feststoff ergab.

Das obige Carbonat wurde in 20 ml Methylenchlorid gelöst, 10 ml TFA wurden zugesetzt und das Gemisch wurde bei 25 °C für 16 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit 50 ml Toluol verdünnt und abgedampft, so dass sich die Carbonsäure als viskoses gelbes Öl ergab, das einmal mit Toluol azeotropiert wurde, und darauf im Vakuum getrocknet wurde.

Die obig hergestellte Säure (–2 mmol, 2 äq.) wurde in 30 ml Methylenchlorid gelöst und diese Lösung wurde zu TentaGel S NH2 (3 g, 0,32 mmol/g, 1 mmol, 1 äq.) zugesetzt. Das Harz wurde durch Rühren suspendiert und darauf wurde DMAP (40 mg, 0,3 mmol, 0,3 äq.), und DIC (0,47 ml, 0,4 g, 3 äq.) in dieser Reihenfolge zugesetzt. Das Harz wurde bei 25 °C für 19 Stunden gerührt und zu diesem Zeitpunkt ergab sich ein negativer Kaiser-Test. Das Harz wurde filtriert und gewaschen (Methylenchlorid 10 × 50 ml), darauf im Vakuum getrocknet.

Die drei anderen Carbonat-gebundenen Harzansätze wurden in einer analogen Weise hergestellt, unter Verwendung der Reagenzien der Tabelle 1–1.

c) Kodierung von Schritt 1

Ein Gramm Ansatz der sieben Harzansätze aus Schritt 1 (a) und 1 (b) mit in geeigneter Weise gebundenen N-Fmoc-geschützter Aminosäure oder Amino-Alkohol wurden in sieben getrennten Synthesegefäßen angeordnet und wurden jeweils in 20 ml Methylenchlorid suspendiert.

Stammlösungen von 200 mg C12Cl5, C11Cl5 und C10Cl5-Linker-Diazoketon (Zubereitung 1) wurden in 4 ml Methylenchlorid hergestellt. Teilmengen (1 ml) der Stammlösungen wurden dazu verwendet, die geeigneten binären Kodierungs-Gemische für jedes der sieben Harz-Ansätze herzustellen. Das geeignete Kodierungs-Gemisch wurde jedem Harzansatz zugesetzt und das Harz wurde für 1 Stunde gerührt. Rhodiumtrifluoracetat-Dimer (1 ml einer 1 mg/ml Lösung in Methylenchlorid) wurde jedem der Gefäße zugesetzt und das Harz wurde bei 25°C über Nacht gerührt. Jeder Harzansatz wurde mit Ethylenchlorid (1 × 50 ml) gewaschen, darauf wurden die Ansätze kombiniert und die gesamte Bibliothek (sieben Verbindungen) wurde mit Methylenchlorid gewaschen (10 × 50 ml).

d) Schutzentziehung

N-Fmoc-Schutzgruppen wurden durch Waschen des Harzes einmal mit DMF, Filtern, darauf Suspendieren des Harzes in 60 ml 50% Piperidin/DMF und Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten entfernt. Das Harz wurde filtriert, gewaschen (DMF (5 × 50 ml) und Methylenchlorid (10 × 50 ml)) und im Vakuum getrocknet.

Schritt 2 a) Zusatz von A

Das getrocknete Harz aus Schritt 1 (d) wurde in 31 Chargen bzw. Ansätze von 210 mg (0,07 mmol) aufgeteilt, von denen jeder in 20 ml Synthesegefäßen angeordnet wurde. Jedes der Reagenzien (0,25 g, < 0,4 mmol, < 6 äq.) (Tabelle 1-2), die im zweiten Schritt der Synthese verwendet wurden (N-Fmoc-Aminosäure mit einem säurelabilen Seitenketten-Schutz, falls erforderlich) wurden in 10 ml Methylenchlorid gelöst. HOBt (1 ml 1 mg/ml DMF) wurden zugesetzt und die Lösungen wurden kurz geschüttelt. Weiteres DMF wurde denjenigen Aminosäuren zugesetzt, die sich nicht vollständig gelöst hatten. Jede Reagenz-Lösung wurde einem der 31 Harzansätze zugesetzt. DIC (0,2 ml, ~ 1 mmol) wurden jedem Gefäß zugesetzt und das Harz wurde bei 25 °C über Nacht gerührt. Jeder der Harz-Ansätze wurde filtriert und getrennt gewaschen (DMF (1 × 15 ml) und Methylenchlorid (10 × 15 ml)). Das Harz wurde in 10 ml Methylenchlorid suspendiert.

b) Kodierung von Schritt 2

Stammlösungen aus 160 mg C9Cl5, C8Cl5, C6Cl5, C6Cl5 und C5Cl5-Linker-Diazoketon (Zubereitung 1) wurden in 16 ml Methylenchlorid hergestellt. Teilmengen (1 ml) der Stammlösungen wurden dazu verwendet, die geeigneten binären Kodierungs-Gemische für jeden der 31 Harz-Ansätze (Tabelle 1-2) herzustellen. Das geeignete Kodierungs-Gemisch wurde jedem der Harz-Ansätze zugesetzt und das Harz wurde für 30 Minuten gerührt. Rhodiumtrifluoracetat-Dimer (1 ml einer 1 mg/ml Lösung in Methylenchlorid) wurde jedem der Gefäße zugesetzt und das Harz wurde bei 25 °C über Nacht gerührt. Jeder Harzansatz wurde filtriert, dann getrennt mit Methylenchlorid (1 × 15 ml) gewaschen. Die Ansätze wurden kombiniert und die gesamte Bibliothek (217 Verbindungen) wurde mit Methylenchlorid (5 × 50 ml) gewaschen.

c) Schutzentziehung

Die N-Fmoc-Schutzgruppen wurden durch Waschen des Harzes einmal mit DMF, durch Filtern, darauf durch Suspendieren des Harzes in 60 ml 50% Piperidin/DMF und Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten entfernt. Das Harz wurde filtriert, gewaschen (DMF 5 × 50 ml) und mit Methylenchlorid (10 × 50 ml)) und im Vakuum getrocknet.

Schritt 3 a) Zusatz von Y

Das getrocknete Harz aus Schritt 2 (c) wurde in 31 Ansätze von 150 mg (~ 0,05 mmol) aufgeteilt, von denen jeder in einem 20 ml Synthesegefäße angeordnet wurde. Jedes der Reagenzien (0,25 g, < 0,4 mmol, < 8 äq.), das im dritten Schritt der Synthese verwendet wurde, wurde in Methylenchlorid oder DMF oder einem Gemisch der beiden, wie geeignet, gelöst (Tabelle 1–3). Jede Reagenz-Lösung wurde einem der 31 Harzansätze zugesetzt, dann wurden alle Co-Reagenzien wie erforderlich zugesetzt (siehe Tabelle). Die Harz-Ansätze wurden bei 25°C über Nacht gerührt, darauf wurde jeder von ihnen gewaschen (DMF (1 × 10 ml) und Methylenchlorid (10 × 10 ml)).

b) Kodierung von Schritt 3

Stammlösungen aus 200 mg CaCl5 und C3Cl5-Linker-Diazoketon (Zubereitung 1) wurden in 16 ml Methylenchlorid hergestellt. Stammlösungen aus 600 mg C6Cl3, CSCl3 und CaCl3-Linker-Diazoketon (Zubereitung 1) wurden in 16 ml Methylenchlorid hergestellt. Teilmengen (1 ml) der Stammlösungen wurden dazu verwendet, die geeigneten binären Kodierungs-Gemische für jeden der 31 Harz-Ansätze herzustellen (Tabelle 1–3). Das geeignete Kodierungs-Gemisch wurde jedem der Harz-Ansätze zugesetzt und das Harz wurde 30 Minuten lang gerührt. Rhodiumtrifluoracetat-Dimer (1 ml einer 1 mg/ml Lösung in Methylenchlorid) wurde jedem der Gefäße zugesetzt und das Harz wurde bei 25 °C über Nacht gerührt. Jeder Harzansatz wurde filtriert, dann separat mit Methylenchlorid (1 × 15 ml) gewaschen. Die Ansätze wurden kombiniert und die gesamte Bibliothek (6.727 Verbindungen) wurde mit Methylenchlorid (5 × 50 ml) gewaschen, darauf im Vakuum getrocknet.

c) Schutzentziehung

Die kombinierten Harze aus Schritt 3 (b) (–2 g) wurden in 60 ml TFA/ThioanisoUEDT (50/50/5) suspendiert und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Die Harze wurden filtriert, gewaschen (Methylenchlorid 10 × 50 ml) und im Vakuum getrocknet.

d) Dekodierungsverfahren

Ein Kügelchen wird in einer Pyrex-Kapillare mit einem Durchmesser von 13 mm mit 2 &mgr;m Acetonitril angeordnet. Cerammoniumnitratlösung (2 &mgr;l in einer 0,1 M wässrigen Lösung) und Hexan (3 &mgr;l) werden zugesetzt und das Zwei-Phasen-Gemisch kurz zentrifugiert. Das Rohr wird abgedichtet und bei 35 °C 16 Stunden belassen, darauf geöffnet. Die organische Schicht wird durch eine Spritze entfernt und mit 1 &mgr;l N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid vermischt. Die silylierte Markierungslösung (1 &mgr;l) wird durch GC unter Elektroneneinfang (electron capture = EC) Detektion analysiert.

Die GC-Analyse wird mit einem Hewlett Packard 5890 plus Gas-Chromatographen durchgeführt. Eine Säuleninjektion in eine 5 m, 032 mm Retentionslücke, angeschlossen an eine 25 m, 0,2 mm vernetzte 5% Phenylmethylsilikon-Säule wird verwendet. Die Temperatur und die Druckprogramme für die Analyse sind 200–320°C, 15°C/min, darauf 320°C für 10 Minuten und 20–40 psi bei 2 psi/min, darauf 40 psi für 10 Minuten. Der EC-Detektor wird bei 400 °C gehalten und das Hilfsgas wird bei 35 psi eingestellt.

Tabelle 1–1

R1 Reste und Kodierungsschema
Tabelle 1–2

R2 Reagenzien und Kodierungsschema
Tabelle 1–2 (Fortsetzung)
Tabelle 1–2 (Fortsetzung)
Tabelle 1–2 (Fortsetzung)
Tabelle 1–2 (Fortsetzung)
Tabelle 1–3

Y Reagenzien und Kodierungsschema
Tabelle 1–3 (Fortsetzung)
Tabelle 1–3 (Fortsetzung)
Tabelle 1–3 (Fortsetzung)
Tabelle 1–3 (Fortsetzung)
Beispiel 2 DVB-vernetzte vs. PEG-gepfropfte Polystyrol-Festträger

Eine Verbindung der Formel II der Struktur V:
wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, jedoch ohne Zusatz bzw. Addition der Identifikatoren. Die Synthese wurde unter Verwendung von ungefähr 100 &mgr;m 1% DVB-vernetzte Polystyrol-Kügelchen und 130 &mgr;m DYB-vernetzte, PEG-gepfropfte Polystyrol-Kügelchen durchgeführt. Am Ende jedes Schrittes wurde der Ligand oder der Zwischenligand von einem Teil der Kügelchen abgespalten. Am Ende von Schritt 3 wurde ein Teil des Liganden auf dem PEG-gepfropften Träger abgespalten, wohingegen er noch geschützt war und einem anderen Anteil wurde vor der Spaltung der Schutz entzogen. Der Liganbd auf dem DVB-vernetzten Träger wurde vor der Spaltung einer Schutzentziehung unterworfen. Tabelle 2–1 repräsentiert die Ausbeutedaten für beide Synthesen. Die Ausbeuten wurden auf Grundlage der verfügbaren Funktionalitäten auf jedem Kügelchen (~ 300 pmol) berechnet.

Tabelle 2–1

Anspruch[de]
  1. Verwendung von Divinylbenzol-vernetzten, mit Polyethylenglykol gepfropften Polystyrol-Kügelchen als feste Träger zum Konstruieren nicht-oligomerer kombinatorischer Bibliotheken.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Ligand durch Photolyse von den festen Trägem abgetrennt wird.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Divinylbenzol-vernetzte, mit Polyethylenglykol gepfropfte Polystyrol mit Amino-, Hydroxy-, Carboxy- oder Halogen-Gruppen funktionalisiert ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Divinylbenzol-vernetzte, mit Polyethylenglykol gepfropfte Polystyrol mit Amino- oder Hydroxy-Gruppen funktionalisiert ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Divinylbenzol-vernetzte, mit Polyethylenglykol gepfropfte Polystyrol mit Amino-Gruppen funktionalisiert ist.
  6. Nicht-oligomere kombinatorische Bibliothek, bei der die festen Träger in Form von Divinylbenzol-vernetzten, mit Polyethylenglykol gepfropften Polystyrol-Kügelchen vorliegen, die wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert sind.
Es folgt kein Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
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