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Dokumentenidentifikation DE69816064T2 22.04.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000977496
Titel VERWENDUNG VON KETOSÄURE ZUR GESCMACKSVESTÄRKUNG VON KÄSEPRODUKTEN
Anmelder Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, FR
Erfinder YVON, Mireille, F-78120 Rambouillet, FR;
GRIPON, Jean-Claude, F-78960 Voisins le Bretonneux, FR
Vertreter WINTER, BRANDL, FÜRNISS, HÜBNER, RÖSS, KAISER, POLTE, Partnerschaft, 85354 Freising
DE-Aktenzeichen 69816064
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 24.04.1998
EP-Aktenzeichen 989228663
WO-Anmeldetag 24.04.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/FR98/00828
WO-Veröffentlichungsnummer 0098048645
WO-Veröffentlichungsdatum 05.11.1998
EP-Offenlegungsdatum 09.02.2000
EP date of grant 02.07.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.04.2004
IPC-Hauptklasse A23L 1/226
IPC-Nebenklasse A23L 1/23   A23C 19/064   A23C 19/09   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel zum Verbessern des Geschmacks von Käsen und Käsespezialitäten.

Preflkäse ohne Schimmelschicht, die im wesentlichen mit Lactokokken hergestellt wurden, besitzen wenig Geschmack; ihre Entwicklung erfordert sehr lange Affinierungsperioden in der Gröflenordnung von 3 bis 6 Monaten und noch mehr für Käse vom Typ Gouda oder Cheddar, während die Mehrzahl dieser Weichkäse mit viel kürzeren Affinierungszeiten (in der Gröflenordnung von einigen Wochen) auf den Markt gebracht werden.

Eines der Hauptziele der Käsereien ist es, ohne größere technische Umrüstung und ohne eine Verlängerung der Affinierungszeit den Geschmack dieser Käse zu intensivieren.

Der enzymatische Abbau von Aminosäuren ist einer der Wege zur Erzeugung von aromatischen Molekülen. Die Aminosäuren, und insbesondere die aromatischen Aminosäuren, die verzweigten Aminosäuren, und die schwefelhaltigen Aminosäuren sind nämlich Vorläufer von Aromastoffverbindungen vom Typ Aldehyd, Alkohol, Säure oder Thiol. Bestimmte dieser Verbindungen wurden in Käsen identifiziert und tragen zu deren Geschmack bei [(DUMONT et al., Lait 54.31–43, (1974); MC CUGAN, J. Agric. Food Chem. 23: 1047–1050, (1975), GREEN und MANNING, J. Dairy Res. 49: 737–748, (1982), NEY und WIROTAMA, Z. Lebensm.-Unters.-Forsch. 146: 337–343, (1971)].

So wurde etwa vorgeschlagen, die Proteolyse in den Käsen so zu intensivieren, daß die Menge von freien Aminosäuren erhöht wird. Das proteolytische System der Lactokokken wurde weitgehend untersucht, mehrere Peptidasen wurden gereinigt und charakterisiert, und ihre Gene geklont und sequenziert [LAW und MULHOLLAND, Int. Dairy J. 5: 833–854, (1995)]. Es wurden genetisch veränderte Stämme konstruiert, welche diese Peptidasen überexprimieren; die Verwendung solcher Stämme für die Herstellung von Käsen vom Typ "Cheddar" wurde vor kurzem beschrieben [MC GARRY et al., Appl. Environ. Microbiol. 60: 4226–4233, (1994), CHRISTENSEN et al., Int. Dairy J. 5: 367–379, (1995)]. Obgleich jedoch die Überexprimierung der Peptidasen die Akkumulation von freien Aminosäuren erhöht, wirkt sie sich nicht auf bedeutende Weise auf die Entwicklung des Geschmack aus. Es scheint also, daß die Faktoren, welche die Entwicklung von Geschmack beschränken, nicht in der Erzeugung von freien Aminosäuren zu finden sind, sondern in deren Abbau vorkommen.

Es gibt jedoch bei den Lactokokken Aktivitäten der Überführung von Aminosäuren in Aromastoffverbindungen. ENGELS und VISSER, [Neth. Milk Dairy J. 50: 317, (1996)] haben gezeigt, daß durch Inkubieren von Zellextrakten von Lactokokken mit Methionin für Gouda typische Geschmacksnoten erzeugt werden konnten. Das Enzym, von dem angenommen wurde, daß es für diese Überführung verantwortlich ist, wurde gereinigt und charakterisiert: es handelt sich um eine Cystathionin-&bgr;-lyase [ALTING et al., Appl. Environ. Microbiol. 61: 4037–4042, (1995)].

Auch wurde beobachtet, daß Lactokokken in der Lage sind, aromatische Aminosäuren und verzweigte Aminosäuren in vitro in Aromastoffverbindungen vom Typ Hydroxylsäure und Säure abzubauen. Die erste Etappe des Abbaus dieser Aminosäuren ist eine Transaminierung, welche das Vorhandensein einer Empfänger-Ketosäure erfordert [THIROUIN et al., Abstr. M4, Club des Bacteries Lactiques – 7éme Colloque, Paris, Frankreich (1995)]. Die Transaminierung kommt auch beim Abbau von Methionin in Methanthiol vor [ALTING et al., Fifth Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and Applications, Veldhoven, Niederlande, 8.–12. September 1996].

Ausgehend von einem Stamm L. lactis ssp cremoris hat das Erfinderteam eine Aminotransferase gereinigt und charakterisiert und dabei festgestellt, daß dieses Enzym in einem einfachen, glucosehaltigen flüssigen Medium in Gegenwart von &agr;-Ketoglutarat in der Lage war, die Transaminierung der drei aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), von Leucin, und von Methionin zu katalysieren; dieses Enzym ist unter Bedingungen von Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke aktiv, die zu denjenigen analog sind, welche bei der Affinierung von Käse angetroffen werden [YVON et al., Appl. Env. Microbiol., 63, 414–419 (1997)]. Das Erfinderteam identifizierte andererseits zwei weitere Aminotransferasen, die auf verzweigte Aminosäuren wirken und &agr; -Ketoglutarat sowie in geringerem Maße Oxalacetat als Empfänger der Aminogruppe verwenden. Diese Ketosäuren können aus dem Abbau von Glutamat oder Aspartat stammen, die stets in großer Menge in den Käsen vorhanden sind, oder auch ausgehend von Acetyl-CoA synthetisiert werden, wobei bei Lactokokken der Abschnitt des Krebs-Zyklus zwischen dem Oxalacetat und dem &agr;-Ketoglutarat wirksam zu sein scheint [LOUBIERE et al., Le Lait 76 (1–2): 5–12, (1996)].

Die Erfinder stellten jedoch fest, daß in experimentellen Käsen, die mit dem oben erwähnten Stamm L. lactis ssp cremoris hergestellt worden waren, der Abbau der aromatischen Aminosäuren tatsächlich sehr gering war (2 bis 5%), was auf das Vorliegen von Faktoren schließen ließ, welche diesen Abbau in den Käsen einschränken. Von diesen einschränkenden Faktoren lag der wahrscheinlichste in der Diffusion der Aminosäuren und ihrem Transport im Inneren der energetisch erschöpften Bakterienzellen (aufgrund der Tatsache, daß so gut wie der gesamte als Energiequelle nutzbare Zucker zum Zeitpunkt der Affinierung bereits aufgebraucht ist).

Dennoch stellten die Erfinder die Hypothese auf, daß die Menge von in dem Käse vorhandenen Empfänger-Ketosäuren den ersten einschränkenden Faktor darstellt.

Um diese Hypothese zu verifizieren, untersuchten die Erfinder zuerst einmal in einfachen flüssigen Medien die Auswirkung der Zugabe von &agr;-Ketoglutarat und Oxalacetat auf den Abbau von aromatischen und verzweigten Aminosäuren durch vollständige Zellen von Lactokokken. Hierbei stellten sie fest, daß die Zugabe von &agr;-Ketoglutarat den Abbau von aromatischen und verzweigten Aminosäuren erhöhte, und daß die Zugabe von Oxalacetat denjenigen der verzweigten Aminosäuren erhöhte. Sie versuchten daraufhin, dieses Resultat in Käsen zu bestätigen, und stellten fest, daß in diesem Fall einzig die Zugabe von &agr;-Ketoglutarat eine Auswirkung auf den Abbau von Aminosäuren hatte.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Ketosäuren und insbesondere von &agr;-Ketoglutarat als Herstellungszusatz, um den Geschmack eines Käses oder eines Nahrungsmittelproduktes mit Käsearoma zu verstärken, dessen Herstellung einen Reifungsschritt (Affinierung) in Gegenwart von Lactobazillen und insbesondere von Lactokokken umfaßt. Diese Verstärkung des Geschmacks resultiert aus der Erhöhung des Katabolismus von Aminosäuren durch diese Bakterien.

Die vorliegende Erfindung kann im Rahmen der Herstellung verschiedener Käsearten angewendet werden. Sie ist insbesondere von Interesse für die Herstellung von Preßkäsen ohne Schimmelschicht, insbesondere von Käsen mit künstlicher Rinde. Sie ist des weiteren im Rahmen der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten anwendbar, denen ein Käsearoma verliehen werden soll, von denen insbesondere diejenigen Nahrungsmittelprodukte zu nennen sind, von denen mindestens eine der Zutaten aus einer Bruchmasse oder einem Konzentrat von Milcheiweißen (Casein + Molkeproteine) hergestellt ist, wie etwa die enzymatisch modifizierten Käsebasen ("Enzyme Modified Cheese"), Käsespezialitäten, Schmelzkäse, Käse mit verringertem Fettgehalt.

Die Erfindung hat insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Käses bzw. eines Nahrungsmittelproduktes mit Käsearoma zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zum Verstärken des Geschmacks des Produktes ein Herstellungszusatz verwendet wird, der mindestens eine Ketosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus &agr;-Ketoglutarat und den Ketosäuren, die direkte Vorläufer von aromatischen Verbindungen sind, wie &agr;-Ketoisocaproat, Ketoisovalerat und Phenylpyruvat.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der vorliegenden Erfindung weist die Herstellung des Produktes einen Reifungsschritt in Gegenwart von mindestens einem Lactobazillus auf, der zu einer der Gattungen Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus und Leuconostoc gehört, und der Zusatz wird dem Produkt vor dem Reifungsschritt oder in dessen Verlauf zugegeben.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der vorliegenden Erfindung ist das Lactobazillus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis, Lactobacillus delbrueckii lactis, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Streptococcus thermophilus.

Wenn dieser Zusatz &agr;-Ketoglutarat aufweist, erzeugt die Transaminierungsreaktion einerseits Vorläufer von Aromastoffverbindungen und andererseits Glutamat, bei dem es sich übrigens um einen Geschmacksverstärker handelt. Wenn er Ketosäuren aufweist, die direkte Vorläufer von Aromastoffverbindungen sind, können diese ebenso wie das &agr;-Ketoglutarat eine Empfängerrolle für die Transaminierungsreaktionen spielen, und ebenfalls direkt in verschiedene Aromastoffverbindungen abgebaut werden, was es ermöglicht, je nach der bzw. den ausgewählten Ketosäure(n) verschiedene Geschmacksnoten zu erhalten.

Die Menge von Zusatz, die man verwendet, kann je nach dem angestrebten Grad der Intensivierung des Geschmacks variieren. Beispielsweise kann &agr;-Ketoglutarat allgemein in einem Verhältnis von 0,5 bis 10 mg pro Gramm von nicht gereiftem Produkt verwendet werden (unter nicht gereiftem Produkt ist die entwässerte Bruchmasse zu verstehen bzw. im Fall von Produkten, die durch Ultrafiltration von Milch hergestellt werden, der Ultrafiltrationsrückstand).

Für die Anwendung der Erfindung kann der Zusatz im Verlauf der Herstellung direkt oder indirekt in das Produkt eingebracht werden. Die direkte Einbringung kann einfach durchgeführt werden z. B. mittels Eintauchen des nicht gereiften bzw. in der Reifung befindlichen Produktes in eine Lösung von &agr;-Ketoglutarat, oder Imprägnieren des Produktes mit einer konzentrierten Lösung von &agr;-Ketoglutarat vor oder nach dem Salzen, oder durch Zugabe der Ketosäure(n) in das zum Salzen verwendete Salz bzw. die betreffende Salzlake, oder im Fall von lactosefreien Käsemassen zum Zeitpunkt der Delactosierung, oder im Fall von mittels Ultrafiltration hergestellten Produkten auch durch Zugabe zum Ultrafiltrationsrückstand.

Wenn das &agr;-Ketoglutarat in die zum Salzen verwendete Salzlake eingebracht wird, wird es dieser vorteilhaft in einem Verhältnis von 10 bis 100 Gramm pro Liter Salzlake zugegeben.

Die indirekte Einbringung kann durch Zugabe eines Stammes vorgenommen werden, der in der Lage ist, aus dem in den Käsen vorhandenen Glutamat &agr;-Ketoglutarat zu erzeugen. Es könnte sich hierbei entweder um einen Stamm von Lactokokken oder eines weiteren Lactobazillus oder eines weiteren ausgewählten oder genetisch modifizierten Mikroorganismus für die Affinierung handeln.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt auch Käse, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar sind.

Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung ergibt sich anhand der nachfolgenden weiteren Beschreibung unter Bezugnahme auf Beispiele, welche die Auswirkung der Zugabe einer Ketosäure auf den Katabolismus der Aminosäuren durch Lactokokken zeigen, sowie der Zugabe von &agr;-Ketoglutarat in Käsen auf ihre organoleptischen Eigenschaften, sowie auf den Abbau von Aminosäuren in diesen Käsen.

BEISPIEL 1 – AUSWIRKUNG DER ZUGABE VON &agr;-KETOGLUTARAT ODER OXALACETAT AUF DEN ABBAU VON AMINOSÄUREN DURCH LACTOCOCCUS-ZELLEN IM FLÜSSIGEN MEDIUM.

Der Katabolismus von Aminosäuren durch Lactococcus-Zellen wurde in verschiedenen Medien in Gegenwart oder Abwesenheit von Ketosäuren untersucht.

Es wurden zwei Medienreihen verwendet.

  • – Eine erste Reihe ist zusammengesetzt aus Tris/HCl-Puffer 100 mM, pH8 mit 2 mM einer zu untersuchenden Aminosäure, die nicht markiert ist, und 0,05 &mgr;M der gleichen, tritiierten Aminosäure. Diesen Basismedien wurden 10 mM &agr;-Ketoglutarat oder Oxalacetat zugegeben.
  • – Die zweite Medienreihe ist zusammengesetzt aus dem gleichen Tris/HCl-Puffer 100 mM pH 8 mit 2 mM der nicht markierten Aminosäure und 0,05 &mgr;M der tritiierten Aminosäure, plus 0,3% Glucose. wie im vorausgegangenen wurden den Basismedien 10 mM &agr;-Ketoglutarat oder Oxalacetat zugegeben.

Die Zellen aus 4 ml einer Kultur des Stammes in einem chemisch definierten Medium [SMID and KONINGS, J. Bacteriol. 174: 5286–5292, (1990)] werden in 0,5 ml der verschiedenen Medien bei 37°C inkubiert. Nach 10, 20 und 40 h Inkubation werden Aliquots genommen, die Zellen durch Zentrifugieren (8000 g, 5 min) entfernt, und die Metaboliten mittels HPLC abgetrennt und durch Vergleich ihrer Rückhaltezeit mit denjenigen von Standardzusammensetzungen identifiziert. Die Abtrennung wird auf einer Umkehrphasensäule NOVAPACK (2 mm × 150 mm, WATERS), äquilibriert mit 95% Lösungsmittel A (Trifluoressigsäure 0,115%) und 5% Lösungsmittel B (Trifluoressigsäure 0,1%, Acetonitril 60%), mit einem Durchsatz von 0,3 ml/min vorgenommen. Die Metaboliten werden mit einem linearen Gradienten von 5 bis 20% von Lösungsmittel B während 35 min eluiert. Die Säule wird anschließend 5 min mit Lösungsmittel B gewaschen und erneut auf die ursprünglichen Bedingungen äquilibriert. Die Metaboliten werden durch das W-Absorptionsmaß bei 214 nm erfaßt, woraufhin das Elutionsmittel (0,3 ml/min) mit Szintillationsflüssigkeit ULTIMA-FLO AP (PACKARD) (0,7 ml/min.) für die Erfassung von Radioaktivität im Dauerstrom gemischt wird. Die verwendeten Standardverbindungen sind Phenylalanin, Phenylethylamin, Phenylpyruvat, Phenylacetaldehyd, Phenylethanol, Phenylacetat, und Phenyllactat.

Resultate

Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt, die für jede der untersuchten Aminosäuren die Menge von abgebauter Aminosäure (in % der anfänglichen Menge) nach 10-stündiger Inkubation angibt.

TABELLE 1

Diese Resultate zeigen, daß in flüssigen Medien, die kein Ketoglutarat enthalten, der Abbau der drei aromatischen Aminosäuren und von Leucin gering ist. Er liegt um 5% in 10 h in den Medien ohne Glucose und um 10 bis 20 in den Medien, die Glucose enthalten.

Die Zugabe von &agr;-Ketoglutarat zu diesen Medien erhöht den Abbau aller dieser Aminosäuren beträchtlich. In Medien ohne Glucose werden 40 bis 60% der Aminosäuren in 10 h abgebaut, und der Abbau erreicht 75 bis 80% in 40 h. In den Medien, die Glucose enthalten, werden 60 bis 80% der Aminosäuren in 10 h abgebaut, und ihr Abbau ist nach 40 h vollständig.

Die Zugabe von Oxalacetat hat keine Auswirkung auf den Abbau der aromatischen Aminosäuren, erhöht jedoch den von Leucin beträchtlich.

Die nachgewiesenen hauptsächlichen Metaboliten sind die jeweils den Aminosäuren entsprechenden Ketosäuren, sowie deren Abbauprodukte (Hydroxylsäuren und Carbonsäuren).

BEISPIEL 2. AUSWIRKUNG DER ZUGABE VON &agr;-KETOGLUTARAT IN DEN KÄSEN AUF DEN ABBAU VON PHENYLALANIN. Herstellung von Käse vom Typ eines nicht wärmebehandelten Preßkäses mit künstlicher Rinde.

Fünf kleine Käse vom Typ Saint-Paulin (250 g) wurden aus 10 l teilentrahmter Milch (32 g Fettanteil pro Liter) hergestellt und 1 min lang bei 75°C pasteurisiert. Die Milch wird in einem Verhältnis von 2% mit einer Übernacht-Kultur Lactococcus lactis (Stamm NCD0763 von Lactococcus lactis ssp cremoris) in entrahmter Milch beimpft. Das Zusetzen von Lab wird sofort bei 33°C durchgeführt unter Verwendung von 0,03% Labpräparat (520 mg/l Chymosin, SBI, Frankreich). Während des Rührens wird der Bruch zum Teil von Lactose befreit, indem 30% der Molke durch Wasser mit 32°C ersetzt wird. Der Bruch wird anschließend in Formen vom Typ KADOVA geformt und gepreßt.

Einlegen in Salzlake und Affinierung der Käse

Nach dem Auspressen wird einer der Käse in kleine Zylinder von ca. 3 g (Mini-Käse) geschnitten, um den Abbau von Phenylalanin zu analysieren.

Zwei Salzlaken wurden für die Mini-Käse verwendet, die für die Analyse des Abbaus von Phenylalanin bestimmt waren. Die erste enthält 0,1 g NaCl und 31,25 &mgr;Ci (0,25 nMol) tritiiertes Phenylalanin (L-[2,3,4,5,6-3H] Phenylalanin) pro ml. Die zweite Salzlake enthält des weiteren Bestandteile der ersten, 50 mg &agr;-Ketoglutarat pro ml. Der pH-Wert der beiden Salzlaken wird auf 5,7 eingestellt. Ein Mini-Käse wird 1 h lang in 8 ml einer jeden Salzlake getaucht.

Nach dem Salzen werden die Käse über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt; am Tag darauf werden sie mit Lebensmittelwachs umhüllt und bei 13°C eingekellert.

Extrahierung und Analyse der Abbauprodukte von Phenylalanin in den Käsen.

Nach 10-tägiger Reifung wird ca. 1 g Käse in 2,5 ml Citratpuffer (Natriumcitrat 0,2 M pH 2,2 0,2 g EDTA und 0,1 ml 5-iges Pentachlorphenol pro Liter) homogenisiert. Die Mischung wird über Papier filtriert, und das Filtrat in Gegenwart von Sulfosalicylsäure mit einer Endkonzentration von 3% ausgefällt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren (5 min. bei 18000 g) entfernt, und der Überstand über ein 0,45 &mgr;m-Filter filtriert. Die Abbauprodukte von Phenylalanin werden anschließend gemäß der Beschreibung im obenstehenden Beispiel 1 abgetrennt und mittels HPLC identifiziert.

Resultate

Die nach 10-tägiger Affinierung bei 13°C erhaltenen HPLC-Abtrennungsprofile zeigen, daß nur 3 bis 4% des markierten Phenylalanins im Vergleichskäse abgebaut wurden, während in dem in Gegenwart von &agr;-Ketoglutarat affinierten Käse 17% abgebaut wurden. Das Phenylpyruvat sowie seine Abbauprodukte Phenyllactat und Phenylacetat wurden unter den gebildeten Metaboliten identifiziert.

BEISPIEL 3. AUSWIRKUNG DER ZUGABE VON &agr;-KETOGLUTARAT IN DEN KÄSEN AUF IHRE ORGANOLEPTISCHE QUALITÄT.

Es werden Käse vom Typ Saint-Paulin mit einem Gewicht von 250 g gemäß der Beschreibung im obenstehenden Beispiel 2 hergestellt.

Zwei dieser Käse werden 3 h lang in 2 l Salzlake mit 250 g NaCl pro Liter getaucht, und 2 weitere in 2 l Salzlake, welche 250 g NaCl und 50 g &agr;-Ketoglutarat pro Liter enthält.

Darüber hinaus werden zwei weitere Käse jeweils in 10 Stücke von 25 g geschnitten. Zehn dieser Stücke werden 2 h 30 min lang in 0,75 l Salzlake mit 100 g NaCl getaucht, und die zehn weiteren in 0,75 l einer Salzlake, welche 100 g NaCl und 30 g &agr;-Ketoglutarat pro Liter enthält.

Der pH-Wert aller Salzlaken wird vorausgehend mit Milchsäure auf 5,7 eingestellt.

Nach dem Salzen werden die Käse über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt; am Tag darauf werden sie mit Lebensmittelwachs umhüllt und bei 13°C eingekellert.

Organoleptische Prüfungen

Diese Prüfungen werden an den 250 g schweren Käsen vorgenommen.

Der Käse mit &agr;-Ketoglutarat und der Vergleichskäse wurden nach 14- und 28-tägiger Affinierung bei 13°C durch eine Jury von 8 Personen verkostet. 13 Charaktere wurden nach ihrer Intensität mit 1 bis 10 bewertet.

Die bewerteten Charaktere sind: Intensität des Geruchs, allgemeine Qualität des Käses, die Geschmacksnoten salzig, säuerlich, süß, zuckrig und bitter, und die aromatischen Charaktere fruchtig, blumig, schwefelig, maltolartig, milchig, und Fuß. Die für den Käse mit &agr;-Ketoglutarat und den Vergleichskäse erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer Varianzanalyse verglichen.

Resultate

Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle II dargestellt, welche die Mittelwerte der Noten aufführt, welche jedem der Charaktere durch eine Jury von 8 Personen gegeben wurden.

1 stellt das Sternprofil der Noten dar, welche dem Vergleichskäse (--⧍--) und dem Käse mit &agr;-Ketoglutarat (-•-) nach 28-tägiger Affinierung gegeben wurden.

TABELLE II

Nach 14-tägiger Affinierung stellten die Koster wenig Unterschiede zwischen dem Vergleichskäse und dem Versuchsgegenstand fest. Einzig die Note für den blumigen Charakter war für den Versuchsgegenstand bedeutend höher.

Nach 28-tägiger Affinierung sind die Noten der aromatischen Charaktere: fruchtig, Fuß, blumig, maltolartig; die Geruchsintensität und die Qualitätsnote für den Versuchsgegenstand besser. 6 Jurymitglieder von 8 vergaben für den Versuchsgegenstand eine deutlich höhere Qualitätsnote, und 1 Jurymitglied stellte keinen Unterschied fest. Alles in allem unterstrich die Jury "einen ausgeprägteren Käsegeschmack" und "einen sehr wohlriechenden Käse" für den Käse mit &agr;-Ketoglutarat.

Es scheint somit, daß die Erhöhung des Abbaus von Phenylalanin, die durch die chemische Analyse aufgezeigt wird, sich auf den Geschmack der Käse auswirkt, da die blumige Note, die für die Abbauverbindungen aromatischer Aminosäuren charakteristisch ist, in dem nach 14 Tagen verkosteten Käse mit Ketoglutarat bedeutend höher ist.

Nach 28-tägiger Affinierung ist die Auswirkung der Zugabe von &agr;-Ketoglutarat auf den Geschmack deutlicher als nach 14-tägiger Affinierung. Insbesondere die Geruchsintensität, die mit der Erzeugung flüchtiger Moleküle zusammenhängt, ist bedeutend intensiver.

Des weiteren zeigt die allgemeine Qualitätsnote, daß die Intensivierung des Abbaus der Aminosäuren keine Geschmacksfehler hervorruft, sondern im Gegenteil die organoleptische Qualität der Käse verbessert.

Sensorische Prüfung der Aromen (Dreiecksprobe).

Diese Analyse wurde an 25 g-Stücken vorgenommen. Die Konzentration vom Ketoglutarat ist bei den Vergleichskäsen nahe Null, und nahe 5 mg pro g Käse bei den Käsen, die in Gegenwart von Ketoglutarat in Salzlake eingelegt waren.

Der Geruch der Käse mit und ohne Ketoglutarat wurde durch eine Dreiecksprobe verglichen, an der 24 Jurymitglieder teilnahmen.

Diese Probe besteht darin, den Jurymitgliedern 3 Proben vorzulegen, 2 von einem der Käse, und 1 des weiteren Käses.

Von ihnen wird verlangt:

  • – zuerst anzugeben, welche Probe von den beiden weiteren verschieden ist, und welche von diesen am geruchsintensivsten ist/sind;
  • – daraufhin die Intensität des wahrgenommenen Unterschieds auf einer Skala von 1 bis 10 anzugeben, und, falls möglich, diesen Unterschied zu charakterisieren.

Die statistische Interpretation besteht darin, die Anzahl von richtigen Antworten (welche die von den beiden weiteren verschiedene Probe erkannt hatten) zu erfassen, und den erhaltenen Wert mit demjenigen zu vergleichen, der in der Tabelle des Binomialgesetzes für eine Wahrscheinlichkeit von 1 zu 3 aufgeführt ist, um herauszufinden, ob ein signifikanter Unterschied besteht.

Resultate

Der in Gegenwart von Ketoglutarat affinierte Käse besitzt einen bedeutend intensiveren Geruch als der Vergleichskäse, bei dem Schwellwert von 0,1 (der Unterschied wurden von 18 von 24 Jurymitgliedern wahrgenommen). Die Intensität des wahrgenommenen Unterschiedes wurde im Mittel als 3,22/10 angegeben, und dieser Unterschied wurde zumeist als "mehr käseartiger Geruch" bewertet. Es scheint somit, daß die Zugabe von Ketoglutarat tatsächlich die Entwicklung von Aroma in den Käsen intensiviert.

BEISPIEL 4. AUSWIRKUNG DER ZUGABE VON &agr;-KETOGLUTARAT IN KÄSEN AUF DEN ABBAU VON AMINOSÄUREN.

Die Aminosäuren, die in den in Beispiel 3 verwendeten Käsen vorhanden waren, wurden nach 14-tägiger Affinierung bestimmt.

Extrahierung und Analyse der freien Aminosäuren.

Die freien Aminosäuren werden aus den Käsen extrahiert gemäß dem Protokoll, das für die Extrahierung von Abbauprodukten von Phenylalanin in Beispiel 1 beschrieben ist. Anschließend werden sie mit Hilfe eines Analyseautomaten für Aminosäuren LC3000 (BIOTRONIK) unter den vom Hersteller der Apparatur angegebenen Bedingungen analysiert.

Resultate

Die nachstehende Tabelle III gibt die Mengen einer jeden Aminosäure (in nMol/g Käse) im Vergleichskäse und im Käse mit Ketoglutarat an. Sie gibt auch den Unterschied zwischen diesen Mengen an, ausgedrückt zum einen in nMol/g Käse, und zum anderen in % der Menge im Vergleichskäse.

TABELLE III

Diese Resultate zeigen, daß die Mengen von Methionin, Isoleucin, Leucin und Phenylalanin in dem in Gegenwart von Ketoglutarat affinierten Käse ca. 10% geringer als im Vergleichskäse sind, und die Mengen von Aspartat, Alanin, Valin, Tyrosin und Ornithin ca. 5% geringer sind. Dies zeigt, daß die Zugabe von &agr;-Ketoglutarat in den Käsen deutlich den Abbau von verzweigten Säuren und aromatischen Aminosäuren intensiviert, obgleich in diesem Fall die enthaltene Menge von Ketoglutarat geringer ist (ca. 1 mg/g entwässerte Bruchmasse).

Die Mengen von Glutamat und &ggr;-Aminobutyrat (das vom Glutamat stammt) hingegen sind deutlich größer in dem Käse mit Ketoglutarat als im Vergleichskäse. Dies bestätigt, daß das zugegebene Ketoglutarat auch wirklich für die Transaminierungsreaktion verwendet und in Glutamat transformiert wurde (bei dem es sich übrigens um einen Geschmacksverstärker handelt).

Die weiteren Aminosäuren liegen in einer gleichwertigen Menge in den beiden Käsen vor.

BEISPIEL 5: AUSWIRKUNG DER ZUGABE VON &agr;-KETOGLUTARAT IN FLÜSSIGEN REAKTIONSMEDIEN UND IN PSEUDO-BRUCFIMASSEN AUF DEN ABBAU VON AMINOSÄUREN DURCH VERSCHIEDENE SPECIES VON LACTOBAKTERIEN.

Dieses Beispiel demonstriert die Auswirkung der Zugabe von Ketoglutarat auf den Katabolismus der Aminosäuren durch andere Lactobazillen als Lactokokken. Diese Studie wurde einerseits in flüssigen Medien und andererseits in einer Pseudo-Bruchmasse vorgenommen. Die Versuche an Pseudo-Bruchmassen stellen eine Alternative zu den Versuche in echten Käsen dar, die zum einen langwierig und kostspielig, und zum anderen mit reinen Stämmen von anderen Lactobazillen als Lactokokken schwierig durchführbar sind. In den Käsen sind nämlich die zur Gattung Lactobacillus gehörenden Lactobazillen immer mit Lactokokken oder Streptokokken vergesellschaftet. Beispielsweise die Lactobacilus delbrueckii und die Lactobacillus helveticus in wärmebehandelten Preßkäsen sind mit dem Streptococcus thermophilus vergesellschaftet. Die Lactobacilli vom Typ paracasei oder plantarum wiederum entwickeln sich im Verlauf einer ausreichend langen Affinierung von Preßkäsen, die entweder mit Lactokokken oder mit Streptokokken hergestellt sind. Diese letzteren werden übrigens im Gegensatz zu "Starter"-Lactobazillen, welche für die Säuerung verantwortlich sind, als "Nicht-Starter"-Lactobazillen bezeichnet. Bei dieser Untersuchung wurden Phenylalanin und Leucin, bei denen es sich um die hauptsächlichen freien Aminosäuren in Käsen handelt, als Markierungsaminosäuren für die aromatischen Aminosäuren bzw. die Aminosäuren mit verzweigter Kette gewählt.

Lactobazillenstämme und Präparierung der Zellen.

Die gewählten Lactobazillen gehören den Gattungen Lactobacillus und Streptococcus an. Es sind dies die Species, die am häufigsten in der Milchverarbeitungstechnik angetroffen werden. Lactococcus lactis NCDO 763 dient in dieser Studie als "Kontrolle".

Die sieben verwendeten Stämme, welche die Merkmale von herkömmlicherweise in der Milchverarbeitungstechnik verwendeten Stämmen besitzen, stammen aus der CNRZ-Sammlung (INRA, Jouy-en-Josas). Es sind dies:

Lactococcus lactis ssp. cremoris (Stamm NCDO 763)

Lactobacillus delbrueckii lactis (Stamm CNRZ 12)

Lactobacillus delbrueckii bulgaricus (Stamm CNRSRZ 752)

Lactobacillus plantarum (Stamm CNRZ 1228)

Lactobacillus helveticus (Stamm CNRZ 32)

Lactobacillus paracasei (Stamm CNRZ 316)

Streptococcus thermophilus (Stamm CNRZ 302).

Die Lactobazillen werden in einem MRS-Medium (DIFCO) kultiviert, die Streptokokken in einem M17-Medium (DIFCO), welches 10 g/l Lactose enthält, und die Lactokokken im M17-Medium mit Glucose. Die Kulturen werden bei 37°C kultiviert, mit Ausnahme von Lb. paracasei und Lb. plantarum, die bei 30°C kultiviert werden.

Die Zellen werden zu Beginn der stationären Wachstumsphase durch Zentrifugieren (8000 g, 10 min) gewonnen und 2-mal mit Glycerophosphatpuffer 50 mM pH 7 gewaschen.

Versuche in flüssigen Reaktionsmedien.

Das Basismedium ist zusammengesetzt aus Tris-HCl-Puffer 100 mM pH8 mit 2 mM der zu untersuchenden, nicht markierten Aminosäure (Phenylalanin oder Leucin) und 0,05 &mgr;M der gleichen, tritiierten Aminosäure (126 mCi/&mgr; mol) (L-[2,3,4,5,6-3H] Phenylalanin oder L- (4,5-3H] Leucin), daraufhin 0,3 Glucose. Für die Versuche mit Ketoglutarat werden dem Basismedium 10 mM dieser Verbindung zugegeben.

Die einem DO480 von 10 entsprechende Menge von Zellen wird in 500 &mgr;l Medium eingebracht, und 100 &mgr;l-Aliquots werden zum Zeitpunkt 0, daraufhin nach 10 h, 20 h und 40 h Inkubation bei 37°C genommen.

Versuche an Pseudo-Bruchmasse.

Der Abbau von markierten (tritiierten) Aminosäuren wurde ebenfalls in einer Pseudo-Bruchmasse untersucht, deren Zusammensetzung ähnlich derjenigen eines Käses ist.

Diese Pseudo-Bruchmasse wird bereitet durch Mischen von 4,5 ml einer sterilen (115°C, 10 min) 10%-igen Lösung von Calciumphosphocaseinat mit 20 &mgr;l einer 10 M-Lösung von Calciumchlorid und 0,5 ml einer Lösung von Aminosäuren, welche die Zusammensetzung an freien Aminosäuren eines Käses vom Typ St-Paulin mit einem Alter von 4 Wochen simuliert (s. nachstehende Tabelle IV) und 20 &mgr;Ci der zu untersuchenden, mit Tritium markierten Aminosäure enthält. Für die Versuche mit Ketoglutarat wird dieses in einem Verhältnis von 4 mg pro ml Medium zugegeben. Diese beiden Lösungen werden vorausgehend mittels Filtration sterilisiert.

Die Zellen aus einer 5 ml-Kultur werden dieser Mischung zugegeben, unmittelbar bevor das pulverförmige Gluconolaceton mit einer endgültigen Konzentration von 15 g/l eingebracht wird. 1 ml-Aliquots werden daraufhin in sterilen Röhrchen mit konischem Boden verteilt, und 3 &mgr;l von auf 1/10 verdünntem und durch Filtration sterilisiertem Labpräparat werden abschließend zugegeben. Die Mischung wird bei 30°C inkubiert bis zum Festwerden der Bruchmasse, daraufhin werden die Röhrchen für die "Affinierung" 2 und 4 Wochen lang in einem Ofen mit 13°C angeordnet.

TABELLE IV
Extrahierung und Verfolgung des Abbaus der Aminosäuren.

In den flüssigen Reaktionsmedien werden die Zellen durch Zentrifugieren (8000 g, 5 min) entfernt, und der Überstand unmittelbar mittels HPLC mit Erfassung von Radioaktivität im Dauerstrom analysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Analyse gestattet die Abtrennung der Aminosäure und der verschiedenen Abbauprodukte. Der Prozentsatz des Abbau der Aminosäure wird durch den Prozentsatz an Radioaktivität geschätzt, die im Elutionsvolumen der Abbauprodukte vorhanden ist.

Bei den Pseudo-Bruchmassen wird der Inhalt jedes Röhrchens (ca. 1 g) im ULTRA-TURAX in 2,5 ml Citratpuffer (Natriumcitrat 0,2 M pH 2,2, 0,2 g EDTA und 0,1 ml Pentachlorphenol 5% pro Liter) homogenisiert. Die Mischung wird anschließend 5 min lang bei 8000 g zentrifugiert, und der Überstand in Gegenwart von Sulfosalicylsäure mit einer endgültigen Konzentration von 3% ausgefällt. Nach 10 min bei 0°C wird das Präzipitat erneut durch Zentrifugieren (5 min bei 18000 g) entfernt, und der Überstand über ein 0,45 &mgr;m-Filter abfiltriert. Die Abbauprodukte der Aminosäuren werden daraufhin abgetrennt, identifiziert und mittels HPLC gemäß der obenstehenden Beschreibung quantifiziert.

Resultate

1. Die Prozentsätze des Abbaus von Phenylalanin und Leucin in den flüssigen Reaktionsmedien mit bzw. ohne Ketoglutarat nach 10- und 40-stündiger Inkubation bei 37°C sind in Tabelle V aufgeführt.

TABELLE V

Diese Resultate zeigen, daß für alle untersuchten Stämme mit Ausnahme von Lb. paracasei der Abbau von Aminosäuren in den kein Ketoglutarat enthaltenden Medien gering ist: er bleibt selbst nach 40-stündiger Inkubation bei 37°C unter 15%. Die Zugabe von Ketoglutarat in die Medien erhöht den Abbau der Aminosäuren durch alle der untersuchten Stämme beträchtlich. Der Prozentsatz des Abbaus ist mindestens verdoppelt. Ähnliche Resultate wurden in Medien erhalten, die keine Glucose enthielten.

Der in Abwesenheit von Ketoglutarat mit Lb. paracasei beobachtete Abbau deutet darauf hin, daß bei diesem Bakterium entweder das aus dem Abbau von Glucose stammende Pyruvat ein Empfänger für die Aminogruppe in der Transaminierungsreaktion ist, oder daß noch ein anderer Weg des Abbaus als die Transaminierung existiert. Nichtsdestoweniger intensiviert die Zugabe von Ketoglutarat auch mit diesem Stamm deutlich den Abbau der beiden überprüften Aminosäuren.

2. Die Prozentsätze des Abbaus von Phenylalanin und Leucin in den Pseudo-Bruchmassen nach 2- und 4-wöchiger Affinierung bei 13°C sind in Tabelle VI dargestellt.

TABELLE VI

Wie bei den flüssigen Medien ist der Abbau von Aminosäuren in den Pseudo-Bruchmassen ohne Ketoglutarat bei der Mehrzahl der Stämme von untersuchten Lactobazillen quasi Null. In Gegenwart von Ketoglutarat hingegen bauen alle Stämme Phenylalanin und Leucin ab, und der Abbau nach 4 Wochen variiert je nach den Stämmen und der betreffenden Aminosäure zwischen 2% und 22%. Es ist anzumerken, daß die Prozentsätze des Abbaus, die mit Lactococcus lactis in diesen Pseudo-Bruchmassen beobachtet wurden, nach 4 Wochen von der gleichen Größenordnung sind wie diejenigen, die in Käsen vom Typ St.-Paulin angetroffen werden, die mit diesem Stamm hergestellt und ebenfalls 4 Wochen in Gegenwart von Ketoglutarat (9,8 bzw. 12,8% für Phenylalanin und Leucin in den Käsen, im Vergleich mit 6% und 11% in den Pseudo-Bruchmassen) affiniert wurden. Folglich können die mit diesem Modell erhaltenen Resultate als repräsentativ dafür angesehen werden, was in den Käsen zu beobachten wäre.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Verstärken des Geschmacks eines Käses oder eines Nahrungsmittelproduktes mit Käsearoma, dessen Herstellung einen Reifungsschritt in Gegenwart von Lactobazillen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung des Katabolismus von Aminosäuren durch die Bakterien ein Herstellungszusatz verwendet wird, der mindestens eine Ketosäure aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus &agr;-Ketoglutarat, &agr;-Ketoisocaproat, Ketoisovalerat und Phenylpyruvat ausgewählt ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reifungsschritt in Gegenwart von mindestens einem Lactobazillus durchgeführt wird, der zu einer der Gattungen Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus und Leuconostoc gehört, sowie dadurch, daß der Herstellungszusatz dem Produkt vor dem Reifungsschritt oder in dessen Verlauf zugegeben wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Lactobazillus aus der Gruppe bestehend aus Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis, Lactobacillus delbrueckii lactis, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Streptococcus thermophilus ausgewählt ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ketosäure &agr;-Ketoglutarat ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz in einem Verhältnis von 0,5 bis 10 mg Ketosäure pro Gramm von nicht gereiftem Produkt zugegeben wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz in die zum Salzen verwendete Salzlake eingebracht wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz in einem Verhältnis von 10 bis 100 Gramm Ketosäure pro Liter Salzlake zugegeben wird.
  8. Käse oder Nahrungsmittelprodukt mit Käsearoma, der bzw. das mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 herstellbar ist.
  9. Verwendung von mindestens einer Ketosäure, die aus der Gruppe bestehend aus &agr;-Ketoglutarat, &agr;-Ketoisocaproat, Ketoisovalerat und Phenylpyruvat ausgewählt ist, zum Erhöhen des Katabolismus von Aminosäuren durch Lactobazillen, um den Geschmack eines Käses oder eines Nahrungsmittels auf Käsebasis zu verstärken, dessen Herstellung einen Reifungsschritt in Gegenwart der Bakterien umfaßt.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Käse ein Preßkäse ohne Schimmelschicht ist.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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