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Dokumentenidentifikation DE69912291T2 29.04.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0001104446
Titel BIOLOGISCH AKTIVE FRAKTION PFLANZLICHEN MELANINS, SEINE HERSTELLUNG SOWIE SEINE VERWENDUNG
Anmelder Kerestes jun., Jan, Povazka Bystrica, SK;
Kerestes, Jan, Povazka Bystrica, SK
Erfinder KERESTES, Jr., Ján, 017 01 Povazská Bystrica, SK;
KERESTES, Ján, 017 01 Povazská Bystrica, SK;
VENGER, Andreevna, Ljubov, 017 01 Povazská Bystrica, SK
Vertreter Weickmann & Weickmann, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69912291
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.08.1999
EP-Aktenzeichen 999352677
WO-Anmeldetag 10.08.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/SK99/00013
WO-Veröffentlichungsnummer 0000009616
WO-Veröffentlichungsdatum 24.02.2000
EP-Offenlegungsdatum 06.06.2001
EP date of grant 22.10.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.04.2004
IPC-Hauptklasse C09B 61/00
IPC-Nebenklasse C09B 67/54   A61K 35/78   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung bezieht sich auf Melanine, die zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, Pharmazie, Medizin und Bioelektronik geeignet sind.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer engen molekularen Fraktion von Melanin aus Rohmaterialien pflanzlichen Ursprungs, sogenanntem Phytomelanin, welches definierte und reproduzierbare physikochemische Eigenschaften und eine höhere biologische Wirksamkeit zeigt als bekannte beschriebene pflanzliche Melanine, und welches dazu geeignet ist, in der Industrie und Pharmakologie praktisch verwendet zu werden.

Stand der Technik

Melanine-ein allgemeiner Name für eine Gruppe hochmolekularer schwarzer und brauner Pigmente, die im Verlauf der Oxidation und Polymerisation von Phenolen auftreten. Melanine treten normalerweise in der Natur auf, und sie sind welche der am häufigsten auftretenden Zoochrome. Sie kommen im Haar, in Augen, Haut, inneren Organen vor, und somit sind sie im Wesentlichen in den Oberflächenteilen des Organismus lokalisiert. Die Färbung von dunklen Kernen, Beeren, Blumenblättern und Pflanzen, menschliche Bräune, die Haut von Schwarzen, vielen Arten von Tieren ist hauptsächlich auf Melanine zurückzuführen, wie es z. B. in Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310; Lyiach S. P., Ruban R. D.: Mikrobnyie melaniny, Nauka, Moskau 1972, S. 184; und Bidzilja N. I.: Svobodnyie radikaly v oblutschennykh rastenyiach i semenakh, Naukova dumka, Kiev 1972, S. 210, erwähnt ist. Der Ausdruck "Melanin" selbst stammt von einem griechischen Wort ab und bedeutet "schwarz". Melanine sind einzigartige Biopolymere, die in einem lebenden Organismus eine Schutzfunktion gegen UV-Strahlung, ionisierende Strahlung, hohe und niedrige Temperaturen zeigen. Melaninogenese wurde gegenwärtig häufig als eine komplexe Anpassung lebender Organismen an die Grenze der Anpassungsfähigkeit des Lebens dargestellt. Es ist möglich, einzigartige Beispiele für die Beständigkeit lebender Organismen gegen geophysikalische und geochemische Faktoren in Extremsituationen zu finden. Diese schließen zuallererst Hochlandregionen, wo bei 4 bis 5 km Höhe schwarzgefärbte Pilze die einzige Mikroflora darstellen, und auch heiße Sand- und kalte Stein-Wüsten verschiedener Regionen ein. [Lyiach S. P.: Mikrobnyi melaninogenez I yiego funktsii, Nauka, Moskau 1981, S. 274; Ostrovskayia M., Dontsov A.: Fyziologitcheskyie funktsii melanina v organizme, Fyziologyia tscheloveka 1985, S. 670–679]. Es gibt auch bekannte Organismen, die stabil sind, wenn sie mit subletalen Dosen im Bereich von 900 Krad bestrahlt werden. Die Inaktivität gegen &ggr;-Strahlung nimmt auch mit dem Pigmentverlust ab. Die Frage der Melanin-Funktion in einem paläobiologischen Aspekt ist extrem interessant. Hochmelanisierte Pilzsporen treten in großen Mengen ungewöhnlich häufig in den Schichten der beginnenden "Kreidezeit" auf, als viele Tierarten und Pflanzen ausstarben. Diese Zeit ist identisch mit der Zeit, als die Erde die "magnetische Null" kreuzte und somit ihrer Unfähigkeit, sich selbst gegen kosmische Strahlung zu schützen [Bidzilja N. I.: Svobodnyie radikaly v oblutschennykh rastenyiach i semenakh, Naukova dumka, Kiev 1972, S. 210; Lyiach S. P.: Mikrobnyi melaninogenez i yiego funktsii, Nauka, Moskau 1981, S. 274; Ostrovskayia M., Dontsov A.: Fyziologitcheskyie funktsii melanina v organizme, Fyziologiya tscheloveka 1985, S. 670–679]. Folglich besteht auch eine wissenschaftlich bewiesene Basis dafür, dass Melanine das "nützliche" Material waren, welches der chemischen Evolution mancher polymerer präbiologischer Strukturen half. Die oben angegebene Möglichkeit folgt aus der Eigenschaft des Syntheseverfahrens dieser Substanzen und den Eigenschaften gegenwärtiger Melanine. Es sollte der Leichtigkeit, mit welcher die Pigmente synthetisiert werden, große Aufmerksamkeit geschenkt werden, wenn Bedingungen erstellt werden, von denen vermutet wird, dass sie in der Entstehungsphase komplizierter Substanzen aromatischer Strukturen existiert haben [Blois M. S.: Proischozhdenyie predbiologitscheskikh sistem, Mr, Moskau 1966, S. 494; Pavlovskayia T. E.: Abiogenez i natschalnyie stadii evolutsii zhizni, Nauka, Moskau 1968, S. 216; Blois M. S.: The Melanins, their synthesis and structure, Photochem. and Photobiol. Rev. 3, 151, 1978: Swan G. A.: Current knowledge of melanin structure, Pigment cell, Vol. 1, Harger, Basel 1973, S. 151 ]. In den englischen Abstracts von CN 1059540, RU 2069697 und RU 208321 sowie in dem WPI-Abstract von JP-A-4-175377 werden Verfahren beschrieben, um Melanin zu isolieren und aufzureinigen.

Klassifizierung von Melaninen

Abhängig von den biologischen Subjekten, die diese synthetisieren, werden Melanine in drei Hauptgruppen unterteilt: mikrobiell, tierisch und pflanzlich. Es bestehen auch synthetische Melanine, die durch Autoxidation von 3,4-Dihydroxydiphenylalanin (DOPA-Melanin) auftreten, wie es z. B. von Mason H. S. in Pigment Cell Growth, Acad. Press, NY 1953, S. 235; Peers E.: Hystochemistry, IL, Moskau 1962, S. 640; Keretz D., Ann. Intab. Dermatol. Din. Esperimentele 1961, S. 268; und Thomas M.: Modern methods of plant analysis, Springer Verlag 1953, 4, S. 661 angegeben ist. Mikrobielle Melanine werden nur in manchen Mikroorganismen aufgefunden, insbesondere solchen, die zu der Gattung: Bacillus, Pseudomonas und Azatobaster (Azotobacter) gehören. Diese sind schwarze und braune, manchmal rotbraune Pigmente, die im Allgemeinen unlöslich in organischen Lösungsmittel, löslich in Basen sind, mit nicht-spezifischen spektralen Charakteristiken. Viele Tatsachen beweisen, dass Oxidationsprozesse die Basis für den Ursprung bakterieller Melanine sind. Es sollte der Tatsache Aufmerksamkeit geschenkt werden, dass eine absolute Mehrheit von Mikroorganismen, die die Pigmente synthetisieren, zu aeroben Formen gehören. Die tierischen Melanine sind in Oberflächengeweben – Haut, Haar, Tierhaar, Federn und Retina – lokalisiert. Die pflanzlichen Melanine wurden nur selten beschrieben. Es ist bekannt, dass sie in Oberflächengeweben mancher Samen und Früchte auftreten. Bis jetzt sind drei Verfahren zur Isolierung pflanzlicher Melanine bekannt und beschrieben worden, nämlich das des Phytomelanins von Vitis Vinifera L. Nichtsdestotrotz sind die Präparationen eine Zusammenstellung von Produkten, die ein breites Spektrum physikochemischer Eigenschaften aufweisen, und folglich kann das Produkt nicht als Wirkstoffbasis verwendet werden, wie es in Zherebin J. L. et al.: Sposob polutschenyia vodorostvorimogo melanina, t. A. S. SSSR Patent Nr. 939446, 1983; Sendega R. V., Venger L. A., Baklanova L. V.: Sposob polutschenyia enomelanina, Patent A. S. SSSR Nr. 1345606, 1987; und Godzeenko A. I. et al.: Sposob polutschenyia enomelanina, Patent RU 07 09 93, bl. Nr. 33–36 angegeben ist. Das beste beschriebene und bekannte unter den Melaninen ist das sogenannte synthetische Melanin oder DOPA-Melanin, welches durch Autoxidation von 3,4-Dihydroxydiphenylalanin (DOPA) auftritt. Die DOPA-Oxidation verläuft so und über mehrere Stufen, wie die fermentative Autoxidation von Tyrosin in lebenden Organismen, welche zum Auftreten von tierischen und mikrobiellen Melaninen führt. Ein Schema des Verfahrens ist in Villee Claude A., Dethier Vincent G.: Biological principles and processes, Philadelphia-London-Toronto 1971, S. 822; und Brechtlová, Halčák, Chandoga et al.: Lerárska biochemial. (Medicinal biochemistry I), Asklepios 1992, S. 228 angegeben.

Schema:
Chemische Struktur und Melaninogenese

Die chemische Struktur natürlicher Melanine wurde bisher noch nicht aufgestellt, da sie eine sehr komplizierte polymere Struktur und eine Typenvielseitigkeit besitzen. Daher konnten wir keine vollständige Beschreibung erhalten, nicht mal für die Pigmente, die seit mehreren Jahren untersucht wurden. Gegenwärtig besteht keine einstimmige Meinung über das Problem, welche Verbindungen dem Ausdruck "Melanin" entsprechen. Mason beschreibt Melanine als hochmolekulare Polymere, die während der enzymatischen Oxidation von Phenolen, insbesondere Brenzcatechin, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, (DOPA) und 5,6-Dihydroxyindol auftreten [Mason N. S. in Pigment Cell Growth, Acad. Press Inc., NY 1953, S. 235].

Ein damit in Verbindung stehender Aufsatz wurde von Nicolaus geschrieben: "Natürliche Melanine sind komplizierte Makromoleküle, die im Verlauf der enzymatischen Oxidation von ortho-Diphenolen, hauptsächlich unsubstituiert, wie 5,6-Dihydroxyindol, Brenzcatechin (Pyrocatechinol) und 1,8-Dihydroxynaphthalin auftreten" [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310].

Peers und Keretz beschreiben Melaninpigmente, die im Verlauf der Oxidation von aromatischen Aminosäuren auftreten: Tyrosin und Dihydroxyphenylalanin [Peers E.: Hystochemistry, IL, Moskau 1962, S. 640; Keretz D., Ann. Intab. Dermatol. Din. Esperimentele 1961, S. 268]. Thomas schlägt vor, als Melanine nur Stickstoff-enthaltende Pigmente, d.h. Derivate von 5,6-Dihydroxyindol, welches entweder in oxidiertem oder in reduziertem Zustand auftritt, zu betrachten [Thomas M.: Modern methods of plant analysis, Springer Verlag 1953, 4, S. 661 ].

Gegenwärtig bestehen zwei grundlegende Theorien über den Ursprung und die Struktur von Zumelaninen. Die erste stellt fest, dass Zumelanine im Wesentlichen Homopolymere von Indol-5,6-chinon sind [Pulman B., Pulman A.: Kvanthovayia biokhimyia, Mir, Moskau 1965, S. 654]. Die zweite, die Interpretation von Nicolaus, resultiert aus vielen Experimenten, die in der Annahme durchgeführt wurden, dass in den Mechanismen der Melanogenese eine radikalische Polymerisation verschiedener Monomere stattfindet. Die Polyfunktionalität von Monomeren, die Abwesenheit einer genauen Bindungsstruktur zwischen Radikalen führen zu einer Synthese von Polymeren mit nicht-einheitlichem Gehalt und nicht-einheitlicher Organisationsstruktur. Dies führt schließlich zu der Meinung, dass in der Natur vermutlich keine zwei absolut identischen Melaninpigmente existieren [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310]. Daher ist Melanin ein dreidimensionales Polymer, für welches die Anzahl an möglichen Strukturen gleich der Anzahl an Typen von Melaninmolekülen in der Natur ist. Viele Jahre lang wurde das Pigment der Ustilago maydis Pilzsporen als das Basismodell betrachtet. Es ist praktisch das einzige (mikrobielle) Melanin, von welchem die Struktur im Allgemeinen untersucht und bestätigt wurde (Formel IIa).

Nicolaus folgert daraus, dass komplizierte cyclische Strukturen mit kondensierten Ringen, die in verschiedenen Oxidationszuständen auftreten, im Verlauf der Polymerisation von Brenzcatechin (Pyrocatechinol) zu Melanin auftreten [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310; Lyiach S. P., Ruban R. D.: Mikrobnyie melaniny, Nauka, Moskau 1972, S. 184).

Das zweite im Wesentlichen untersuchte Melanin ist das schwarze Pigment, das in reifen Sporen des Aspergillus niger Pilzes auftritt. Es gehört zu der Gruppe sogenannter Alomelanine und wird Aspergillus niger-Melanin genannt [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310; Blois M. S.: Proischozhdenyie predbiologitscheskich sistem, Mir, Moskau 1966, S. 464].

Gegenwärtig ist es möglich, dass die Basis für Melaninogenese in lebenden Organismen aus einem Prozess besteht, welcher auf der fermentativen Oxidation von Tyrosin via DOPA in Gegenwart von Tyrosinase zu Dopachinon, von welchem das Pigment durch eine Anzahl von Oxidation, Decarboxylierungen und Konjugationen entsteht. Dies ist der "klassische Weg".

Also durchläuft die Synthese manchmal einen unterschiedlichen Weg und das Melanogen kann nicht nur Tyrosin, sondern auch andere Phenole, z. B. Brenzcatechin (Pyrocatechinol), sein. Trotzdem sollte daran erinnert werden, dass die genetisch konditionierte Fähigkeit zur Bildung von Tyrosinase und Melaninpigmenten in lebenden Organismen insgesamt sehr stabil ist [Brechtlová, Halčik, Chandoga et al.: Lekárska biochemia I (Medicinal biochemistry I), Asklepios 1992, S. 228; Škárka B., Ferenčik M.: Biochémia, Alfa, Bratislava 1992, S. 846].

Identifizierung von Melaninen

Einer der Gründe für eine unzureichende Untersuchung von Melaninen ist das Problem ihrer Isolierung aus biologischen Objekten, da diese Pigmente in den meisten der bekannten organischen und mineralischen Lösungsmitteln unlöslich sind [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310; Lyiach S. P.: Mikrobnyi melaninogenez i yiego funktsii, Nauka, Moskau 1981, S. 274; Blois M. S.: The melanins, their synthesis and structure, Photochem. And Photobiol. Rev. 3, 151, 1978]. Darüber hinaus ist Melanin in biologischen Objekten in vivo vorhanden und bindet leicht an andere Polymere: Proteine, Polysaccharide, Lipide, andere Pigmente und Beimischungen.

Schwierigkeiten mit und Probleme der Isolierung von Melaninen bestehen auch in ihrem kolloidalen Charakter und ihrem Unvermögen, zu kristallisieren. Daraus folgt, dass zwei grundlegende Verfahren zur Isolierung von Melaninpigmenten existieren.

Die erste Gruppe von Verfahren besteht aus der Melaninextraktion mit geeigneten Lösungsmitteln und dann in der Entfernung begleitender Beimischungen. Das einzige, fast universelle Lösungsmittel für Melanine sind 0,5 bis 1,0 M wässrige Lösungen der Basen NaOH und KOH. Solche Eigenschaften von Melaninen werden durch ihre polyphenolische Struktur bestimmt. Daher wird auch die alkalische Extraktion zur Isolierung von Melaninen aus Zellen und Geweben von Tieren, mikrobiellen und manchen pflanzlichen Subjekten verwendet.

Die zweite Gruppe von Melanin-Extraktionsverfahren wird als Verfahren dargestellt, in welchem alle anderen Materialien außer Melanin entfernt werden. Diese Eliminierung nutzloser Materialien wird durch Hydrolyse mit einer Säure und Waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt, bis die erforderliche Präparation – Melanin – verbleibt [Lyiach S. P., Ruban R. D.: Mikrobnyie melaniny, Nauka, Moskau 1972, S. 184].

Daraus folgt, dass kein Standardverfahren, das für alle Arten von natürlichen Melaninen geeignet ist, vorgeschlagen und beschrieben werden kann, da die chemische Komplexität und Vielfalt biologischer Materialien und Besonderheiten von Melaninen allein einen individuellen Ansatz erfordern. Z. B. wird für die Extraktion von Ustilago-Melanin ein anderes Verfahren als präparative Technik verwendet. Sporen des Ustilago maydis Pilzes werden mit konzentrierter HCl behandelt, und dann werden unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel Beimischungen entfernt. Melanine mancher Subjekte werden im Wesentlichen leicht durch "sanfte Verfahren" isoliert. Dies betrifft z. B. Melanin von der Iris des Stierauges oder Melanin der Tinte des Tintenfisches Sepia officinalis – Sepiomelanin. Die Präparationen werden ohne die Behandlung mit einer Säure oder einer Base isoliert, da sie in dem biologischen Subjekt in Form von Natriumsalzen auftreten. Es gibt aber nur wenig solcher Beispiele. Im Prinzip wird das Verfahren der alkalischen Extraktion mit der folgenden Präzipitation durch eine Säure für Melanine von tierischem, mikrobiellem und pflanzlichem Ursprung verwendet [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310].

Der Melaningehalt in den Pilzzellen variiert in einem weiten Bereich: von 2 bis 3 Gew.-% bis zu 35 bis 40%. Der Melaningehalt in pflanzlichen Subjekten ist beträchtlich niedriger, nämlich von 0,2 bis 0,3 Gew.-% bis zu 6 bis 8 Gew.-%.

Einer der Tests zur Identifizierung von Melaninen sind die VIS-Spektren. Melanine zeigen deutliche Spektralabsorptionslinien, eine im Wellenlängenbereich von 1600 bis 1700 cm–1, die zweite im Bereich von 3000 bis 3500 cm–1. Die Spektrallinien entsprechen Carbonylgruppen (Absorption im Bereich von 1700 cm–1), Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (Absorption im Bereich von 1600 cm–1, NH4- und OH-Gruppen (Absorption im Bereich von 3300 bis 3500 cm–1). Melanine natürlichen sowie synthetischen Ursprungs zeigen ein charakteristisches UV-Spektrum, in welchem sie weder Peaks noch klare Absorptionsbanden, insbesondere im Bereich kurzer Wellenlängen zeigen. Ähnliche Charakteristiken treten im Bereich des sichtbarem Teils des Spektrums mit einer schiefen Diagonale innerhalb der Grenzen von –0,0019 bis –0,0040 auf. Solche optischen Charakteristika sind typisch für Melanine.

Es sind auch verschiedene chemische Reaktionen charakteristisch, durch welche es möglich ist, zu beurteilen, ob die Melaninmonornere in der Präparation vorkommen:

  • a/ Unlöslichkeit in Wasser und den meisten organischen Lösungsmitteln,
  • b/ vollständige Löslichkeit in 0,5 M NaOH oder KOH,
  • c/ Präzipitation aus Lösungen in Gegenwart von FeCl3,
  • d/ Entfärbung, wenn starke Oxidationsmittel (KMnO4, H2O2) verwendet werden,
  • e/ Fähigkeit, eine ammoniakalische Lösung von AgNO3 zu regenerieren.

Das wichtigste Charakteristikum von Melaninpigmenten ist das Vorhandensein paramagnetischer Zentren mit einer Konzentration von 1015 bis 1018 spin/g [Nicolaus R. A.: Melanins, Hermann, Paris 1968, S. 310; Bidzilja N. I.: Svobodnyie radikaly v oblutschennykh rastenyiach i semenakh, Naukova dumka, Kiev 1972, S. 210; Ostrovskayia M., Dontsov A.: Fysiologitcheskyie funktsii melanina v organizme, Fyziologyia tscheloveka 1985, S. 670–679].

Vom biologischen Standpunkt aus besteht die Bestimmung der Melanin-Natur von Pigmenten in der Isolierung von Tyrosinase und seinen Substraten in den gegebenen Subjekten und auch in der Bestimmung eines direkten Zusammenhangs zwischen Tyrosinaseaktivität und Melaninogenese (Pigmentogenese).

Daher ist die Identifizierung von Melanin basierend auf einem oder zwei Tests nicht eindeutig, sodass ein ganzer Komplex von Tests verwendet werden muss. Die Gegenwart eines unbesetzten unteren Energieniveaus in Melaninen und ihre Fähigkeit, ungepaarte Elektronen aus der Umgebung "zu fangen", führen zu der Tatsache, dass Melanin radioprotektive Eigenschaften zeigt, indem Elektronen von Radikalen aufgenommen werden, die in den Systemen unter Wirkung ionisierender Strahlung auftreten [Bidzilja N. I.: Svobodnyie radikaly v oblutschennykh rastenyiach i semenakh, Naukova dumka, Kiew 1972, S. 210; Godzenko A. I. et al.: Sposob polutschenyia enomelanina, Patent RU 07 09 93, bl. Nr. 33–36].

In den letzten Jahren wurden Ergebnisse experimenteller Studien veröffentlicht, die die radioprotektiven Eigenschaften von Melaninen bestätigt haben. Melanine zeigen die Eigenschaften, wenn sie in dem Subjekt natürlich vorkommen, aber auch wenn sie künstlich in einen lebenden Organismus eingebracht werden [Hill H. Z., Hill G. J.: Eumelanin Causes DNA Strand Breaks and Kills Cells, Pigments Cell Research 1, 163–170, 1987; Hill H. Z., Peak J. G., Peak M. J.: Induction of DNA-protein crosslinks in melanotic cloudman S91 mouse melanoma cells by monochromatic 254 and 405 nm light, Pigment Cell Research 2, 427–430, 1989; Tsuneaki Chida, Hugh D. Sisler: Effect of inhibitors of melanin biosynthesis on appresorial penetration and reductive reactions in Pyricularia oryzae and Pyricularia grisea, Pesticide Biochemistry and Physiology 29, 244–251, 1987; Jacobsohn M. K., Dobre V. C., Branam Ch., Jacobsohn G. M.: Oxidation of 2-hydroxyestradiol and its incorporation into melanin by mushroom tyrosinase, J. Steroid Biochem. 31(4A), 377–385, 1988; Giovanni Sichel: Biosynthesis and function of melanins in hepatic pigmentary system, Pigment Cell Research 1, 250–258, 1988]. Die Experimente, die an schwarzen Zellen enthaltend Melanin der Hefe Nadsomiela nigra durchgeführt wurden, zeigen, dass diese beträchtlich resistenter gegen Bestrahlung sind als die Zellen von Hefen, die keine Melanine enthalten. Durch künstliche Kultivierung von Hefen in biologischem Medium enthaltend Hexachloraceton, welches ein Inhibitor der Melaninogenese ist, wurde eine Kultur kultiviert, die die Resistenz gegen Bestrahlung vollständig verloren hat [Chrulyiova I. M.: Issledovanyie struktury i svoysty melanina i yego syntetitscheskikh analogov, Ref. Zh., Moskau 1973, S. 20; Baraboyi V.A.: Biologitscheskoyie deystvyie rastitelnykh fenolnykh soyiedinenyi, Naukova dumka, Kiev 1976, S. 260; Zherebin J. L. et al.: Farmakologitscheskyie svoystva enomelaninovykh pigmentov, Doklady AN SSSR, seryia B 1984, S. 64–68].

Die Ergebnisse der praktischen Experimente und ein Überblick der erhältlichen Literatur machen es möglich, eine Melaninpräparation zu entwickeln, welche als wirksamer Radioprotektor für lebende Zellen von Organismen dienen würde, hergestellt auf Basis natürlicher Materialien und von Metabolismusprodukten.

Antitumoraktivität von Melaninpigmenten

Gegenwärtig glauben die meisten Forscher und Wissenschaftler, dass sich eine Krebszelle von einer normalen Zelle nicht durch die Tatsache unterscheidet, dass ihr manche spezielle Substanzen fehlen, sondern durch das Verhältnis der Komponenten biologischer Systeme, die zu einer normalen Zelle gehören. Die Arbeiten von N. M. Emanuel et al. haben bestätigt, dass eine Änderung der Konzentration von Radikalen in biochemischen Komponenten der Zelle wesentlich ist für ein negatives Wachstum der Zelle und daher Antioxidantien den Verlauf der Prozesse beeinflussen müssen. Auf dieser Basis konnten die Autoren annehmen, dass eine solche physikochemische Eigenschaft von Melaninen, wie die Antioxidationsaktivität, ein wichtiger Indikator für den Prozess des Zellmetabolismus ist. Es ist eine Basis für die Fähigkeit von Phenolgruppen, mit radikal-aktiven Zentren des zellbiochemischen Systems zu reagieren. Eine elementare Wirkung des Zusammenwirkens eines Inhibitors mit einem Radikal R führt dazu, dass in dem System ein Inhibitorradikal gebildet wird, das stabiler und weniger reaktiv ist als das Radikal R [Chrulyiova I. M.: Issledovanyie struktury i svoysty melanina i yego synthetischeskikh analogov, Ref., Moskau 1973, S. 20].

Diese Hypothese wurde in wissenschaftlichen Studien bestätigt. Zu jener Zeit wurden synthetische, natürliche (tierische) und biosynthetische Melanine als Gegenstand für die Untersuchung ausgewählt. Das tierische Melanin wurde von dem Mausmelanom Harding-Passa durch ein sauer-alkalisches Verfahren erhalten. Das biosynthetische Melanin wurde von DOPA in Gegenwart von Tyrosinase, isoliert von dem Mausemelanom Harding-Passa, synthetisiert (Chrulyiova I. M., Berlin A. A.: Protivoopukholyievayia aktivnost synthetitscheskikh, biosyntetitscheskikh i prirodnykh melaninov, Izvestiya AN SSSR 1973, Nr. 3, S. 438–442]. Basierend auf den durchgeführten Experimenten konnte bewiesen werden, dass Melanine nicht karzinogen sind, und durch die Ergebnisse konnte bestätigt werden, dass Melanine bei Dosen von 150 bis 250 mg/kg eine Antitumoraktivität besitzen, wobei sie die Wirkung von 50 bis 60% Verzögerung des Tumorwachstums erreichen.

Immunogene Aktivität von Melaninpigmenten

Gegenwärtig existiert eine solche große Menge an medizinischen Präparationen wie nie zuvor. Normalerweise tauchen in der Literatur nach einiger Zeit Veröffentlichungen auf, die eine erhöhte Sensibilität gegenüber einer neuen Präparation feststellen. Es bestanden viele anerkannte Messungen und Experimente, die durchgeführt wurden, um jegliche Abhängigkeit zwischen den physikochemischen Eigenschaften und der immunogenen Aktivität [Vladimirov V. G., Krasilmikov I. J., Arapov O. B.: Radioprotektory, Naukova dumka, Liev 1980, S. 264; VIDAL cat.-Lekarstvennyie preparaty v Rossii, Astra-Pharm-Servis, Moskau 1997, S. 1166] medizinischer Verbindungen dafür festzustellen, um ihre Allergenität vorherzusehen und zu beurteilen. Bislang ist es aufgrund des Standes des gegenwärtigen wissenschaftlichen Wissens nicht möglich, solche Korrekturen durchzuführen. Nichtsdestotrotz wurden mehrere Tatsachen festgestellt, die wie folgt dargelegt werden können. Die immunogene Aktivität eines Antigens hängt von seinen physikochemischen Eigenschaften und von der Fähigkeit des immunisierenden (immunisierten) Organismus, auf ein gegebenes Antigen zu reagieren, ab. Gemäß der Fähigkeit, eine Immunantwort hervorzurufen, können die Antigene in zwei Gruppen klassifiziert werden – schwach und stark. Unter den Substanzen mit etablierter chemischer Natur sind die stärksten Immunogene Proteine, obwohl auch Polysaccharide, synthetische Polypeptide und andere Polymere unter bestimmten Bedingungen Immunogene werden können [Koen S., Word P., Mat-Classen R.: Immunology, Medicina, Moskau 1983, S. 400; Allergeny i immunopatologyia v klinike i experimente, Sbornik nautschnykh trudov, Moskau 1988, S. 164; Buc M. et al.: Klinická imunologia, Veda, Bratislava 1997, S. 364]. Ein ausreichend hohes Molekulargewicht ist auch eine Bedingung für eine ausreichende Immunogenität von Antigenen. Z. B. ist, wenn das Molekulargewicht kleiner als 10000 ist, die Substanz normalerweise schwach immunogen.

Die meisten der hochmolekularen Proteine haben ein Molekulargewicht von über 100000. Mit abnehmenden Dimensionen und abnehmendem Molekulargewicht von Antigenen geht die Individualität ihrer Struktur verloren, die Heterogenität und immunogene Aktivität nimmt ab. Es wurde beobachtet, dass das Antigen, je komplizierter die Struktur des Moleküls ist, umso immunogener ist. Ein Beispiel wurde im Fall der Immunogenität synthetischer Polypeptide gezeigt. Wenn das Polypeptid aus Resten einer Aminosäure gebildet war, war es schwach immunogen. Wenn es aus mehreren Arten von Resten von zwei oder drei Aminosäuren bestand, nahmen die immunogenen Eigenschaften zu. Das Vorhandensein aromatischer Aminosäuren (z. B. Tyrosin) in synthetischen Polypeptiden gewährleistet die Immunogenität des Moleküls. Es wurde gezeigt, dass die Fähigkeit, die Bildung von Antikörpern in großen Mengen hervorzurufen, den Substanzen eigen ist, welche Gruppen aufweisen, die an ihrer Oberfläche geladen sind.

In manchen Theorien wird die Immunaktivität von Verbindungen auch mit der Stärke ihres Moleküls in Zusammenhang gebracht. Von diesem Standpunkt aus hängt die Immunogenität, die Fähigkeit, die Zell- oder Flüssigkeit-Immunantwort zu induzieren, von der Individualität und den physikochemischen Eigenschaften des Antigens, von den Dimensionen seines Moleküls, von dem Charakter, der Menge und Lokalisierung der antigenen Determinanten in dem Antigenmolekül ab.

Basierend auf den oben angegebenen Tatsachen und anderem allgemeinem Wissen über die Eigenschaften von tierischen, mikrobiellen, pflanzlichen und synthetischen Melaninen weisen alle diese Substanzen die Eigenschaft der immunogenen Aktivität auf und können vermutlich in die Gruppe schwacher Antigene eingeordnet werden.

Pharmakologische Eigenschaften von Melaninen

Wenn Melanine für pharmakologische Zwecke verwendet werden, ist ihre Löslichkeit von großer Bedeutung. In den bislang beschriebenen Studien wurden Melaninpräparationen in Form wässriger Suspensionen oder Suspensionen in physiologischer Saline verwendet, sie wurden intramuskulär angewandt, jedoch wurden sie praktisch nie absorbiert, und deshalb wiesen sie nur lokale Wirkungen auf. Am wirksamsten sind lösliche Melanine, die peroral oder intravenös angewandt werden. Es wurden ähnliche Präparationen hergestellt, aber sie bestanden hauptsächlich aus Pseudoglobulin-Mclanoproteinen, d. h. Komplexen aus chromogenen Teilen mit Proteinen, welche Elektronen nicht transportieren können und eine verringerte Fähigkeit zum Schutz gegen den Einfluss von Strahlung und toxischen Radikalen aufweisen (Buc M. et al.: Klinická imunológia, Veda, Bratislava 1997, S. 364; Feren ik M., Štvrtinová V., Bernadi M., Jakubovský J., Hulin I.: Zápal, horúčka, botest, Slovak Academic Press, Bratislava 1997, S. 216; Mayer V., Hallauer J., Baum M. K.: Ochorenie, Spôsobené nákazou virusom HIV/AIDS, Vydavatelstvo Slovenskej akademie vied, Bratislava 1996, S. 364].

Es besteht ein Interesse an der Untersuchung der pharmakologischen Aktivität des wasserlöslichen (chromogenen) Teils des Pigments, das von pflanzlichen Kulturen extrahiert wird – Phytomelanin.

Melaninpräparationen auf der Welt

Gegenwärtig wurde insbesondere in den letzten 15 Jahren mehr und mehr Aufmerksamkeit auf Melanine als mögliche Präparationen für viele Bereiche in der Industrie und Medizin konzentriert. Melanine werden gegenwärtig durch eine Anzahl von Firmen hergestellt; die bekanntesten sind die Produkte, die von SIGMA CHEMICAL Corp., USA hergestellt und vertrieben werden [Sigma Chemical Co.: Biochemikalien und Reagenzien für die naturwissenschaftliche Forschung, Deutschland 1997, S. 2736; The Merck Index, An encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals, 12. Edition, Whitehouse Station, NY 1996, S. 2668].

Bis jetzt wurde die Herstellung von synthetischem Melanin (sogenanntem DOPA-Melanin) und Sepiomelanin, isoliert von der Tinte von Sepia officinalis, erreicht. Nichtsdestotrotz werden sie, da die Präparationen aufgrund exotischer Rohmaterialien sehr teuer sind, in unzureichenden Mengen hergestellt, und sie sind im Allgemeinen für eine breite Verwendung nicht erhältlich. Kleine Mengen verschiedener Arten von Melaninen tierischen und mikrobiellen Ursprungs werden in Labors hergestellt, jedoch stellen sie aufgrund der hohen Komplexität der Herstellung und aufgrund des Mangels an Grundrohmaterialien keine bedeutenden und billigen Möglichkeiten einer industriellen Produktion in großem Maßstab dar. Die Herstellung von Melaninen pflanzlichen Ursprungs in chemisch reiner Form ist bis jetzt nicht bekannt.

Alle bekannten Verfahren basieren auf der Isolierung von Melanin durch komplizierte Verfahren aus biologischen Strukturen, in welchen sie auftreten, oder auf synthetischen Verfahren, d.h. einer Hutoxidation von Tyrosin.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin, erhältlich durch ein Verfahren, in welchem ein pflanzliches Rohmaterial, das native Polymer- und/oder Basisbaueinheiten, wie Catechine und Leucoanthocyanidine, enthält, bei einer Temperatur von 15 bis 75°C mit 0,05 bis 0,3 M wässriger Lösung eines Alkalimetallhydroxids behandelt wird, der pH-Wert des Extrakts durch Zugabe einer auf Chlor basierenden anorganischen Säure auf 1 bis 2 eingestellt wird, wobei das abgeschiedene Sediment aufgereinigt und anschließend bei 100 bis 110°C getrocknet wird.

Die oben erwähnten Nachteile werden zum großen Teil durch die biologisch aktive Fraktion von Melanin gemäß dieser Erfindung eliminiert, wovon die Struktur aus der Polymerisation pflanzlicher Flavonoide, insbesondere Catechine und Leucoanthocyanidine (III), resultiert:

Da die Fraktion von Melanin eine amorphe Substanz ist, ist es unmöglich, ihre präzise Struktur zu bestimmen. Als Beispiel stellen wir eine der wahrscheinlichsten Strukturen (IV) dar, wobei die Pfeile weitere Wege einer möglichen Polymerisation anzeigen.

worin R unabhängig OH, -COOH oder -NH2 ist.

Die Basis für das Phytomelaninmolekül ist eine Struktur, die aus monomeren Einheiten pflanzlicher Flavonoide gemäß dieser Erfindung besteht, insbesondere aus Catechinen und Leucoanthocyanidinen. Da die Polymerisation selbst und deshalb die Anzahl an Möglichkeiten der Bildung verschiedener Strukturen ziemlich hoch ist, ist hier der limitierende Faktor das Molekulargewicht Mh = (5 ± 1).103 Da.

Die empirische Formel für eine der wahrscheinlichsten Strukturen, welche durch die Formel IV dargestellt ist, ist [C34-59O14-23N32-44N6-8]n , worin n = 6 bis 8 ist.

In der nächsten Tabelle 1 sind physikochemische Eigenschaften der Substanz, die als Ergebnis der Polymerisation pflanzlicher Flavonoide gemäß der Technologie, wie sie von uns vorgeschlagen wird, entsteht, angegeben.

Tabelle 1 : Physikochemische Eigenschaften von Phytomelanin Molekulargewicht (5 ± 1).103 Da -OH-Gruppen 4,02 bis 4,05 Gew.-% =O-Gruppen 1,04 bis 1,06 Gew.-% Gehalt einzelner Elemente (Gew.-%) C 49,44 bis 49,52 H 5,10 bis 5,73 N 1,15 bis 1,24 O 41,20 bis 42,10 Konzentration ungepaarter Elektronen (spin/g) 1018 bis 1022 Spektrum 3433, 1620, 1400 (cm–1) 1200 bis 1 100

"Melanine pflanzlichen Ursprungs" ist nur ein zusammenfassender Gesamtname für dunkelbraune und schwarze Pigmente von Pflanzen, welche vom chemischen Standpunkt aus Produkte der Oxidation von Flavan-3,4-diolen sind. Wenn berücksichtigt wird, dass die Reaktion der Oxidationspolymerisation durch eine Anzahl von Faktoren, wie Temperatur, pH-Wert der Umgebung, Hydromodul, Phasenverhältnis, Reaktionszeit, Gehalt und Konzentration der Komponenten und dgl., beeinflusst wird, können auch die Produkte davon teilweise unterschiedlich sein und sie weisen keine strikten physikochemischen Charakteristika auf, oder sie unterscheiden sich auch beträchtlich voneinander.

Die wahrscheinlichste Struktur von Melaninen ist die Struktur, wenn Polymerisationsbedingungen im Verlauf ihrer Synthese ausgehend von natürlichen pflanzlichen Rohmaterialien bereitgestellt werden, wie es weiter im Detail beschrieben wird, und wenn eine entsprechende technologische Verfahrensweise verwendet wird. Diese Bedingungen eliminieren praktisch den Weg der Kondensation von Flavonoiden unter Öffnung des Pyranrings (siehe Schema nach K. Freidenberg), aber sie entsprechen der Reaktion gemäß dem Schema nach D. E. Katueno mit Verbindungsmolekülen "Kopf an Kopf" und "Ende an Ende" [Kretovich V. A.: Osnovy biokhimii rastenyi, Vysschayia schkola 1970, S. 540].

Überdies ist die Basis des Moleküls bekannter Melanine eine Brenzcatechin(Pyrocatechinol)struktur (Formel II), die aus der Öffnung des Pyranrings der Leucoanthocyanidin-Moleküle und durch die folgende Polymerisation der gebildeten Fragmente resultiert. Dies kann durch "härtere" Bedingungen erklärt werden, in welchen einer der Hauptgründe die Verwendung hoher Konzentrationen an Basen, 0,25 bis 1,20 M, nicht angemessener thermischer Modi, die Verwendung nicht entmineralisierten Wassers in dem gesamten Prozess oder teilweise ist. Darüber hinaus gewährleistet die Technologie, welche wir vorgeschlagen haben, dass eine Struktur des Polymers entsteht, welche einen nicht sehr hohen Kondensationsgrad aufweist (n = 5 bis 7), woraus folgt, dass es möglich ist, chemisch homogenes Produkt zu synthetisieren – ein Polymer, Phytomelanin mit bestimmten physikochemischen und biologischen Charakteristika und reproduzierbaren Eigenschaften.

Die Isolierung von natürlichem Polymer aus biologischen Subjekten ist praktisch unmöglich. Dies bezieht sich insbesondere auf Melanine pflanzlichen Ursprungs, für welche kein inertes Lösungsmittel existiert. Die einzigen Lösungsmittel sind 0,5 bis 1,0 M wässrige Lösungen von NaOH oder KOH. Nichtsdestotrotz ist der Auflösungsprozess kein physikalischer Prozess, sondern eigentlich eine chemische Reaktion einer Base mit einem Polymer, was die Zerstörung des nativen Biopolymers verursacht. Dieser Vorgang stört die chemische Natur beträchtlich, was eigentlich zum Abbau einzelner Fragmente führt, welche weiter über eines der bekannten Schemata der Oxidationspolymerisation weiter "zusammengenäht" werden. Durch die darauffolgende Prozedur entstehen Beimischungen, und andere Reaktionsprodukte werden eliminiert.

Das auf diese Weise hergestellte Produkt ist nicht mehr in der ursprünglichen nativen Form, sondern ein synthetisches Polymer, welches auch durch die Eigenschaften gekennzeichnet ist, die zu ursprünglichen Melaninen und zu dieser Klasse an Verbindungen gehören. In dieser Hinsicht können wir daher von einer Synthese des Produkts auf biochemischem Weg auf der Basis der ursprünglichen pflanzlichen Rohmaterialien sprechen.

Identifizierung

Einer der Tests zur Identifizierung von Phytomelanin sind die VIS-Spektren. Starke spektrale Absorptionsbanden:

  • – im Wellenlängenbereich von 1600 bis 1700 cm–1
  • – im Wellenlängenbereich von 3300 bis 3500 cm–1.

Die Spektralbanden entsprechen Carbonylgruppen (Absorption im Bereich von 1700 cm–1), Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (Absorption im Bereich von 1600 cm–1), NH4- und OH-Gruppen (Absorption im Bereich von 3300 bis 3500 cm–1) (Tabelle 1).

Die weiteren Identifizierungsmerkmale oder Charakteristika sind wie folgt:

  • a/ Unlöslichkeit in Wasser und in den meisten organischen Lösungsmitteln,
  • b/ vollständige Löslichkeit in 0,5 M NaOH oder KOH,
  • c/ Präzipitation aus Lösungen in Gegenwart von FeCl3,
  • d/ Entfärbung, wenn starke Oxidationsmittel (KMnO4, H2O2) verwendet werden,
  • e/ Fähigkeit, eine ammmoniakalische AgNO3-Lösung zu regenerieren.

Die wichtigsten Charakteristika des Phytomelanins ist das Vorhandensein paramagnetischer Zentren (ungepaarter freier Elektronen) mit einer Konzentration von 1018 bis 1022 spin/g.

Das Verfahren zur Herstellung einer Fraktion pflanzlichen Melanins besteht darin, dass das pflanzliche Rohmaterial mit einer 0,05 bis 0,3 M wässrigen Lösung eines Alkalimetallhydroxids bei einer Temperatur von 15 bis 75°C behandelt wird, der pH-Wert des Extrakts durch Zugabe einer anorganischen Säure, basierend auf Chlor, auf 1 bis 2 eingestellt wird, und das abgeschiedene Sediment aufgereinigt und anschließend bei 100 bis 110°C getrocknet wird.

Die Aufreinigung wird vorzugsweise durchgeführt, indem mit einer Lösung einer Säure, basierend auf Chlor, mit einem pH-Wert von 1,0 bis 3, gewaschen wird, bis über dem Sediment eine farblose Flüssigkeit erhalten wird, anschließend mit Ethanol und mit weiteren polaren organischen Lösungsmitteln gewaschen wird. In all diesen Verfahren wird Wasser pharmakologischer Qualität verwendet.

Das Trockenprodukt kann ferner einer weiteren Aufreinigung unterzogen werden und Semichinonradikal wird aktiviert.

Das Verfahren zur Herstellung einer Substanz, von welcher die physikochemischen Parameter der in Tabelle 1 entsprechen, besteht aus den folgenden Schritten:

Isolierung des Gesamtprodukts

Das erhaltene Gesamtprodukt stellt eine Fraktion von pflanzlichen Melaninen mit einem Molekulargewicht Mh = (5 ± 2).103 Da dar. Eine weitere Stufe des technologischen Verfahrens ist die Entfernung der restlichen begleitenden Beimischungen und Produkte des nativen Polymerabbaus.

Resedimentation und zusätzliche Aufreinigung

Das Endprodukt kann in den folgenden Formen hergestellt werden:

  • a) trockenes amorphes Pulver mit dunkelbrauner Farbe, das einen charakteristischen metallischen Glanz aufweist, unlöslich in Wasser,
  • b) trockenes amorphes Pulver mit dunkelbrauner Farbe, das einen charakteristischen metallischen Glanz aufweist, löslich in Wasser,
  • c) wässrige Lösung von Phytomelanin mit einer maximalen Konzentration bis zu 3 bis 5 Gew.-%,
  • d) Paste mit dunkelbrauner Farbe, die 10 bis 15 Gew.-% des Basisprodukts enthält.

Die Natur der Erfindung besteht auch in einer pharmazeutischen Präparation, welche eine Fraktion des pflanzlichen Melanins gemäß dieser Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

Es wurde gefunden, dass eine Fraktion von pflanzlichem Melanin gemäß dieser Erfindung geeignet ist, um als Wirkstoff, insbesondere als Antioxidans, verwendet zu werden, um die Peroxidation von Lipiden zu blockieren, Leukozyten zu aktivieren, das Verhalten des Komplementsystems zu regulieren. Basierend auf den erreichten Ergebnissen, die unten beschrieben werden, und auf der Beschreibung biologischer Funktionen von Substanzen, die Melanincharakter besitzen [Feren ik M., Štvrtinová V., Bernadi M., Jakubbovský J., Hulin I.: Zapal, horú ka, Bolest', Slovak Academic Press, Bratislava 1997, S. 216; Mayer V., Hallauer J., Baum M. K.: Ochorenie, Spôsobene nákazou virusom HIV/AIDS, Vydavatel'stvo Slovenskej akademie vied, Bratislava 1996, S. 364; Sigma Chemical Co.: Biochemikalien und Reagenzien für die naturwissenschaftliche Forschung, Deutschland 1997, S. 2736; ura ková Z., Beregendi L'., Liptáková A., Muchová J.: Free radicals derived from oxygen and medicine, Bratislava Medical Journal 1993, Nr. 8, 419–434; ura ková Z., Felix K., Feniková L'., Kepstová 1., Labuda J., West U.: Superoxide dismutase mimetic activity of a cyclic tetrameric Schiff base N-coordinated Cu(II) complex, BioMetals, Nr. 5, 183–187, 1995; Novák M.: Neuroimmunology of the Alzheimer's Disease, Bratislava Medical (Journal 1997, 98, 303–314] können wir die folgende Schlussfolgerung ziehen: Eine Schädigung in einem menschlichen Organismus tritt durch die Wirkung externer oder innerer Faktoren auf. Es sollte so verstanden werden, dass der Ausdruck "Schädigung" messbare Änderungen einschließt, bei welchen die Homöostasie der intrazellulären Umgebung in einem solchen Ausmaß geschädigt wird, dass die intrazellulären Strukturen und die Zellen selbst nicht in der Lage sind, die Störung durch ihre eigenen Mechanismen zu halten und zu kompensieren. Zu diesem Zeitpunkt tritt eine Störung subzellulärer Strukturen und ein Verlust von Zellintegrität auf. Wenn der Prozess eine ausreichend hohe Anzahl an Zellen beeinträchtigt, äußern sich die irreversiblen Zellbedingungen durch den Verlust der entsprechenden Organfunktion. Dies führt zu einer Störung von Organen mit anschließenden Veränderungen von Funktionen des ganzen Organismus.

Melanine, einschließlich Phytomelanin, gehören zu einer Gruppe von Substanzen, die an Korrekturprozessen teilhaben. Dies bedeutet, dass es keine Substanz ist, die den Verlust oder die Störung auf irgend eine Weise kompensiert. Es ist auch keine Substanz, die als Faktor für den Ersatz der Unzulänglichkeit agieren würde. Es ist eine Substanz, die die Prozesse aktiv stört, welche beginnen, wenn die Homöostasie von Zellen und folglich die ganzen Organe geschädigt werden. Gemäß moderner medizinischer Konzepte ist die Lösung des Problems der Zell- und Organschädigungen eine prinzipielle Lösung. Dieser Ansatz befolgt die modernen Trends in der Entwicklung wissenschaftlicher Forschung auf dem Gebiet biologisch-medizinischer Wissenschaften. Das Prinzip des Zellhomöostasie-Verlustes ist die Basis für alle Störungen im menschlichen Organismus mit der Ausnahme genetisch konditionierter Störungen. Auch die Wirkung physikalischer Faktoren, wie Bestrahlung, die Wirkung extremer Temperaturen und physikalischer Faktoren verursacht eine Störung der Zellstruktur. Auch in diesen Fällen muss der Organismus eine Optimierung der Bedingungen im Sinne des Überlebens des Organismus gewährleisten. Das, was im Organismus anschließend passiert, ist ein Prozess, an welchem viele Mechanismen und Substanzen beteiligt sind. Die Substanz Phytomelanin spielt eine entscheidende Rolle in dem Prozess. Dies folgt aus der Tatsache, dass in dem schädigenden Prozess Mechanismen aktiviert werden, welche auf die Eliminierung des schädigenden Störfaktors gerichtet sind. Gleichzeitig entstehen Substanzen, die eine hohe bakterizide Wirksamkeit und die Fähigkeit aufweisen, sehr schnell mit anderen Substanzen zu reagieren, welche an der Stelle der Schädigung auftreten. Die Substanzen, die auf die Eliminierung des Störfaktors gerichtet sind, weisen keine Fähigkeit auf, die Schädigung von nützlichen oder nutzlosen Teilen des Organismus zu erkennen. Als Endkonsequenz schädigen diese Substanzen alle Strukturen, die am Ort ihres Entstehens, Bildens und ihrer Wirkung auftreten. In den meisten Fällen sind dies Substanzen mit kleinem Molekulargewicht. Ein ähnlicher Prozess der Schädigung tritt auch auf, wenn eine Störung ein Organ oder Gewebe betrifft, welches bereits geschädigt und angepasst wurde. Z. B. entsteht im Fall von Arteriosklerose eine bestimmte Art von Gleichgewichtszustand zwischen einem geschädigten Gefäß, Blutfluss und dem Gewebe, welches mit Blut von dem Gefäß versorgt wird. Wenn die Zellintegrität gestört wird (präarterioskleroser Prozess), beginnen wieder Mechanismen in dieser drastischen Situation zu agieren, die auf das Heilen und das Überleben des Organismus gerichtet sind. Diese und die oben erwähnten Prozesse der Heilung der Schädigung treten unter Bildung reaktiver Sauerstoffintermediate, Superoxidanion, Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikal, Singulettsauerstoff und reaktiver Stickstoffintermediate auf. Basierend auf den gegenwärtigen Analysen wirkt Phytomelanin als Mittel zur "Kontrolle" der Bildung dieser Substanzen. Diese Substanzen können mit dem schädigenden Faktor reagieren, aber ihre wichtige Rolle besteht darin, dass sie eine Kaskade von Veränderungen der Bildung anderer Substanzen auslösen, die als schädigende Substanzen und als Substanzen agieren, die die Aktivierung und Regulierung der Heilprozesse gewährleisten. Ein Austausch von Interzellinformation wird durch diese Substanzen beeinflusst. Die Substanzen, die bislang zur Behandlung verwendet wurden, besitzen einen Charakter von Substanzen mit abschwächender oder stimulierender Wirkung. Andere Substanzen weisen eine Funktion der Ergänzung oder kompetitiven Inhibierung auf.

Phytomelanin ist eine Substanz, von welcher die Wirkung von dem Aktivierungszustand im Fall der Schädigung und von dem Aktivierungszustand des Systems, das an diesen komplexen Prozessen teilnimmt, abhängt (Komplementsystem, Koagulationssystem und Kininsystem). Phytomelanin wirkt wirklich als Regulator, welcher für eine komplette Kontrolle von Prozessen, die spontan auftreten, dienen könnte. Zur Herstellung eines Forschungskonzepts, das eine Gesamtverwendung in der Medizin betrifft, das auf die Aufklärung der Rolle dieser molekularen Fraktion von Melaninen pflanzlichen Ursprung gerichtet ist, ist ferner notwendig, Beobachtungen einer Modellsituation an einem ganzen Organismus durchzuführen (Reperfusionsschädigungen, Sauerstoff- und Calciumparadoxon). Dies wären Studien, welche die Beteiligung von Phytomelanin in der Schädigung und Heilung eines Organismus definieren sollten. Die Phytomelanin-Substanz kann insbesondere durch ihre Bindung an Enzyme und an Substanzen, die Metallelemente enthalten, vielversprechend sein und zu einer sehr breiten Verwendung führen. Darüber hinaus kann eine Substanz, die sich als Prozessregulator verhält, nützlich sein, wenn sie bei vielen letalen Krankheiten und bei der Aufklärung des Ursprungs vieler Krankheiten verwendet wird, die bisher nicht aufgeklärt wurden.

Die Phytomelanin-Fraktion gemäß der vorliegenden Erfindung kann als wirksame Substanz zur Verwendung als Wirkstoff in den folgenden pharmakologischen Formen verwendet werden: wasserlösliche trockene Form, Injektionsform, trockene Substanz für perorale Verabreichung, Lösung zur Injektionsverabreichung, Lösung für perorale Verabreichung, Tabletten, Granalien, Kapseln, Dragees, Suspensionen, Sirup, Gel, Gelee, Salbe, Cremes, Lösung für externe Anwendung, Lösung für Infusionen, Aerosolformen, kosmetisches Additiv für Flüssigkeiten, Cremes, Shampoos.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

In der beigefügten Zeichnung ist eine Kalibrierungskurve gezeigt, die verwendet wird, wenn die Antioxidansfähigkeit von Phytomelanin gemessen wird.

Beispiele Beispiel 1 Verfahren zur Herstellung von Aesculus hippocastanum L.-Phytomelanin

Als Basisrohmaterial zur Produktisolierung wurden Schalen von Aesculus hippocastanum in einer Menge von 2000 g verwendet, welche vorher von den Kernen befreit wurden, mit Wasser gewaschen wurden und auf ein Maximum von 10 Gew.-% Wasser getrocknet wurden.

Die chemischen Substanzen, die verwendet wurden:

  • – entmineralisiertes Wasser pharmakologischer Qualität
  • – HCl 37% rauchend p. a.
  • – NaOH p. a.
  • – Ethanol p. a.
  • – Ethylester von Essigsäure p. a.
  • – Aceton p. a.
  • – Dimethylformamid p. a.

Zur Sedimentation und zum Waschen kann jede Säure, basierend auf Chlor, verwendet werden, jedoch ist aufgrund der Einfachheit die am meisten bevorzugte Chlorwasserstoffsäure.

Verwendete Ausrüstung:

  • – Laborglas
  • – Zentrifuge Heraeus Megafuge 2
  • – Vakuumrotationsverdampfer Heidolph VV 2000
  • – Entmineralisierungsanlage Werner Ro6
  • – Magnetrührer und Zubehör
  • – Kontroll- und Messausrüstung
  • – andere Vorrichtungen und Zubehör (Trockenschrank, ...)

Isolierung des Gesamtprodukts von Aesculus hippocastanum L.

Basisrohmaterial
  • – Getrocknete Schalen wurden in 10 Glasbehälter mit einem Volumen von 3500 ml aufgeteilt; jeder Behälter erhielt 200 g getrockneter Schalen von Aesculus hippocastanum,
  • – auf das präparierte Rohmaterial wurde eine 0,3 M-Lösung von NaOH gegossen, für 30 Minuten gerührt, und die ganze Mischung wurde auf eine Temperatur von 50°C erhitzt. Die Reaktionszeit betrug 10 Stunden.
Alkalisches Extrakt
  • – Nach 10 Stunden wurde das Extrakt auf einem Grobfilter von groben mechanischen Beimischungen gereinigt, und unter Verwendung der Zentrifuge mit 3500 U/min wurden kleine und mikroskopische mechanische Verunreinigungen entfernt
  • – insgesamt wurden 32 l des alkalischen Extrakts erhalten, und das Extrakt wurde gleichmäßig auf 10 Glasreaktionsflaschen mit jeweils einem Volumen von 20 l verteilt
  • – Jede der Flaschen wurde mit pharmakologisch reinem Wasser auf das volle Volumen aufgefüllt, und es wurde mit HCl ergänzt, um den pH-Wert von 1,5 zu erreichen
  • – Die gesamte Mischung wurde gerührt, und nach kurzer Zeit entstand ein Sediment mit einer rotbraunen bis dunkelbraunen Farbe, welches man für 12 Stunden absetzen ließ.

Sediment des Phytomelanins von Aesculus hippocastanum L.

  • – Das gebildete Sediment wurde von der flüssigen Komponente der Mischung in einer Zentrifuge abgetrennt
  • – Das Sediment wurde mit einer schwach sauren wässrigen Lösung von HCl bei einem pH-Wert des Mediums von pH 1,5 bis 3,0 weiter gewaschen, bis die Flüssigkeit über dem Sediment farblos war (10 × wiederholtes Waschen), bei einem Mischungsverhältnis von 1 : 8

Sediment des Phytomelanins von Aesculus hippocastanum L.-H-Form

  • – Das abgetrennte und konzentrierte Sediment wurde ferner mit Ethanol gewaschen und wurde in der Zentrifuge von der Flüssigkeit abgetrennt
  • – Das Waschen mit Ethanol wurde fortgeführt, während das Ethanol durch die Beimischungen, die in Ethanol löslich sind, gefärbt wurde
  • – Es wurde weiter nacheinander mit Ethylacetat und danach mit Aceton gewaschen, bis der Zustand erreicht wurde, dass die organischen Lösungsmittel nicht durch die Beimischungen, die darin löslich sind, angefärbt waren
  • – Das Produkt wurde an Luft bei Raumtemperatur getrocknet
  • – Das getrocknete Produkt wurde in einer Labormühle auf eine Korngröße von 0,200 bis 0,250 mm gemahlen
  • – Es wurde durch ein Laborsieb 0,25 mm gesiebt
  • – Es wurde bei einer Temperatur von 100 bis 110°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

H-Form des Phytomelanins von Aesculus hippocastanum Gesamtprodukt unlöslich in Wasser Dunkelbraunes Pulver mit metallischem Glanz

Das erhaltene Gesamtprodukt stellt eine Fraktion pflanzlichen Melanins mit Mh = (5 ± 2).103 Da dar. Die nächste Stufe des technologischen Verfahrens ist die Entfernung der restlichen begleitenden Beimischungen und Produkte des nativen Polymerabbaus.

Resedimentation und zusätzliche Aufreinigung H-Form des Phytomelanins von Aesculus hippocastanum (Gesamtprodukt)

Die erhaltene H-Form wurde wieder in 20 l 0,3 M NaOH gelöst, das erhaltene alkalische Extrakt wurde zentrifugiert, bis die mikroskopischen festen Verunreinigungen vollständig entfernt waren. Die Zentrifugation wurde bei 3500 U/Minute für 25 Minuten durchgeführt. Das erhaltene aufgereinigte Extrakt wurde mit einer 5-fachen Menge an pharmakologisch reinem Wasser verdünnt, und es wurde HCl bis zu einem pH-Wert von 2,0 zugegeben. Zur vollständigen Entfernung der Beimischungen war es ausreichend, 3 Mal mit wässriger HCl-Lösung bei einem pH-Wert von 2,0 bis 3,0 zu waschen.

Es wurde aufeinanderfolgendes Waschen mit organischen Lösungsmitteln in der Reihenfolge Ethanol, Ethylacetat, Aceton durchgeführt, während bis zu absolut farblosen Waschlösungen zentrifugiert wurde (D = 0,000). Das Produkt wurde bei 102 bis 105°C getrocknet.

Es wurde die H-Form des Phytomelanins Aesculus hippocastanum als dunkelbraunes Pulver mit einem charakteristischen metallischen Glanz erhalten, rein von Beimischungen und Produkten des nativen Polymerabbaus.

Endprodukt H-Form des Phytomelanins Aesculus hippocastanum, rein von Beimischungen und Produkten des nativen Polymerabbaus

Das erhaltene Produkt wurde für 6 Stunden mit 6 M HCl unter Rückfluss, Mischungsverhältnis 1 : 5, behandelt. Das Produkt wurde mit pharmakologisch reinem Wasser gewaschen, bis Cl vollständig entfernt wurde, was durch eine qualitative Reaktion für Cl bestätigt wurde.

Es wurde ein Produkt erhalten – H-Form von Phytomelanin, chemisch homogen. Um die biologische Aktivität zu erhöhen und das Semichinonradikal zu aktivieren, wurde das Produkt mit Dimethylformamid 1 : 5 suspendiert, die Suspension wurde durch Zentrifugation bei 2400 U/min für 10 Minuten aufgetrennt. Das Produkt wurde bei 102 bis 105°C für 120 Minuten getrocknet.

Um die wasserlösliche Form zu erhalten, wurde die Präparation in einer wässrigen Lösung NH4OH gelöst, welche so hergestellt wurde, dass der pH-Wert 10 bis 11 war, überschüssiger Ammoniak wurde in einem Vakuumverdampfer abgedampft, und ein Teil der Lösung wurde auf 1,375 Gew.-% aufkonzentriert.

Wasserlösliche Form von Phytomelanin, sogenanntes Aesculus hippocastanum-Melanin. Das erhaltene Produkt ist ein Pulver mit einer dunkelbraunen bis schwarzen Farbe, welches sich vollständig in redestilliertem (apyrogenem) Wasser löst, die maximale Konzentration ist ungefähr 5 Gew.%.

Die Eigenschaften der Präparation entsprechen der Tabelle 1, die Konzentration ungepaarter Elektronen beträgt 1019 spin/g.

Unter Verwendung dieser Technologie wurden 17,565 g des Endprodukts aus 2000 g Rohmaterial erhalten, d. h. 0,87 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Rohmaterials.

Abhängig von der Masse an Schalen von Aesculum hippocastanum, d.h. des Basisrohmaterials, können sich die Anzahl von Waschungen und die Menge der verwendeten Reagenzien von dem oben angegebenen Beispiel innerhalb bestimmter Grenzen unterscheiden. Deshalb kann auch die Gesamtmenge des Endprodukts innerhalb der Grenzen von 0,7 bis 1,15% differieren.

Diese Tatsache und leichte Unterschiede in der Technologie und dem Ertrag des Endprodukts werden durch die Tatsache verursacht, dass natürliche Rohmaterialien, wie im vorliegenden Fall von Aesculus hippocastanum L., keine identische chemische Zusammensetzung und Homogenität aufweisen, während manche Teile davon, abhängig von den klimatischen Bedingungen und den Bäumen (Pflanzen) selbst, sogar beträchtlich differieren können.

Beispiele 2 bis 9

Als Basisrohmaterial für die Phytomelanin-Herstellung wurden die folgenden Ausgangsprodukte verwendet:

Castanea sativa

Thea L.

Vitis vinifera L.

Fagopyrum esculentum L.

Heliantus annus L.

Hippophae ramnoides L.

Vicia faba L.

Junglas regia L.

Tabelle 2. Physikochemische Eigenschaften pflanzlicher Phytomelanine

Spektrum für alle Arten (cm–1): 3433, 1620, 1450, 1220–1100

Diese Ausgangsrohmaterialien wurden auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 verarbeitet. Die Eigenschaften der von diesen Rohmaterialien erhaltenen Fraktionen stimmten gut mit den Eigenschaften, die in Tabelle 1 angegeben sind, überein. Untersuchungen an gegebenen pflanzlichen Rohmaterialien haben gezeigt, dass es möglich ist, Phytomelanin aus all den Typen herzustellen – zu biosynthetisieren, wobei das Endprodukt das gleiche ist, und dass dies nicht von der Art des Basisrohmaterials abhängt. Es ist offensichtlich, ausgehend von den Tabellen und von der oben angegebenen Literatur, dass der wahrscheinliche Gehalt von Phytomelanin in pflanzlichen Subjekten niedriger ist als der Wert, welchen wir erreicht haben. Dies bestätigt die Tatsache, dass nicht polymerisierte monomere Einheiten pflanzlicher Flavonoide durch unsere Technologie zu dem Endprodukt – Phytomelanin polymerisiert wurden. Daher ist es möglich, Phytomelanin auch aus einem Rohmaterial herzustellen, welches nicht das ursprüngliche native Polymer, sondern nur Monomere der Basisbaueinheiten des Polymers – Phytomelanins enthält, herzustellen. In diesem Fall können wir von der Synthese des Produkts sprechen.

Auf Basis der oben angegebenen Tatsachen können wir annehmen, dass alle anderen, bis jetzt noch nicht untersuchten Melanin-haltigen Pflanzen (Rohmaterialien) auch Phytomelanin enthalten, welches in der beschriebenen Form erhalten werden kann, während der Unterschied nur in einer leicht unterschiedlichen Konzentration ungepaarter Elektronen (paramagnetischer Zentren) besteht, abhängig von dem Grad der Aktivierung des Semichinonradikals. Die Schlussfolgerung bezieht sich auch auf andere Arten von Rohmaterialien, welche eine ausreichende Menge an pflanzlichen Flavonoiden aufweisen, die zur Phytomelaninpolymerisation geeignet sind.

Um das Verfahren des Waschens mit schwach sauren wässrigen Lösungen (HCl) effektiver zu gestalten, ist es möglich, die Lösung aufgewärmt auf eine Temperatur von maximal 75°C zu verwenden, woraus eine niedrigere Anzahl an Waschungen folgt.

Basierend auf den erreichten Ergebnissen und der davon abgeleiteten Folgerungen nehmen wir an, dass unter Verwendung der neuen Verfahren der Aktivierung (elektrochemischer Weg, Bestrahlung, Waschen, Suspendieren mit anderen geeigneten polaren Lösungsmitteln und Säuren) des Semichinonradikals der EPR-Wert – Konzentration ungepaarter freier Elektronen von 1022 spin/g – erreicht werden kann. Gleichzeitig nehmen wir an, dass auf Basis der praktischen Ergebnisse, die wir unten angeben werden, eine Erhöhung dieses Wertes gleichzeitig die biologische Aktivität von Phytomelanin erhöht und deshalb auch seine Möglichkeiten und letzliche Verwendungsart potenziert.

Es ist nicht immer notwendig, eine Resedimentation durchzuführen, wenn das Ausgangsprodukt bereits nach der ersten Sedimentation der erforderlichen Qualität entspricht. Dies wird durch verschiedene Arten der eingesetzten Rohmaterialien und durch ihre unterschiedliche Qualität verursacht. Wenn wir z. B. als Rohmaterial schwarzen fermentierten vietnamesischen Tee verwenden, welcher bereits zur direkten Verwendung behandelt wurde, ist die Einsatzqualität des Rohmaterials so hoch und das Produkt ist so homogen, dass es nicht notwendig ist, eine Aufreinigung und Resedimentation durchzuführen, um ein Endprodukt zu erreichen, welches die Eigenschaften entsprechend der Tabelle 1 aufweist und durch eine biologische Aktivität gekennzeichnet ist.

Pharmakologische Eigenschaften von Phytomelanin

Basierend auf durchgeführten toxikologischen Tests wurde festgestellt, dass Phytomelanin nicht toxisch und keine mutagene Präparation ist. Seine Toxizität ist sehr gering, LD50 > 2500 mg/kg, woraus folgt, dass die Substanz basierend auf ersten Ergebnissen als Phytopharmakon verwendet werden kann. Als Standard für Basisstudien wurde Aesculus hippocastanum-Melanin (im Folgenden Phytomelanin) verwendet. Es wurde in die Ammoniakform überführt und bei einer Temperatur von 8 bis 10°C für 3 Monate aufbewahrt. Dann wurde die Probe verwendet, um ihre biologische Aktivität experimentell zu bestimmen. Die ursprüngliche Probe, welche in dem Komplex des Tests der biologischen Aktivität verwendet wurde, zeigte einen EPR-Level von 1,47.1018 spin/g. Die nächste Charge, die zum Vergleich verwendet wurde (SODähnliche Aktivität und IC50) zeigte den Wert von 2,8.1019 spin/g. Der Unterschied trat als Ergebnis einer besseren chemischen Aufreinigung der Präparation und der Aktivierung des Semichinonradikals durch wiederholtes Suspendieren in polaren organischen Lösungsmitteln auf.

Manche der Antioxidanseigenschaften von Phytomelanin wurden experimentell bestimmt, welche unter bestimmten Annahmen und unter Erklärung von Grundausdrücken zusammengefasst werden können.

Radikale sind hochreaktive Moleküle, abgeleitet von Sauerstoff oder Stickstoff, welche, neben einer positiven Rolle in manchen physiologischen Prozessen, vorwiegend eine negative Rolle spielen. Gegen die Toxizität freier Radikale bestehen in dem Organismus oder im Allgemeinen in der Natur Substanzen, die in der Lage sind, diese zu eliminieren. Diese Substanzen werden allgemein als Antioxidantien bezeichnet [Brechtlová, Hal ák, Chandoga et al.: Lekárska biochemial, Asklepios 1992, S. 228; ura ková Z., Bergendi L'., Liptáková A., Muchová J.: Free radicals derived from oxygen and medicine, Bratislava Medical Journal 1993, Nr. 8, 419–434; ura ková Z., Felix K., Feniková L'., Kepstová I., Labuda J., West U.: Superoxide dismutase mimetic activity of a cyclic tetrameric Schiff Base N-coordinated Cu(II)complex, BioMetals, Nr. 5, 183–187; 1995].

Durch eine Reihe praktischer Experimente, die auf den gegenwärtigen modernen und etablierten Methoden basieren, wurden manche grundlegende Antioxidanseigenschaften bestimmt, die die Perspektive und breiten Möglichkeiten der Verwendung auf diesem Gebiet bestätigten. Es wurden Antioxidanseigenschaften dieser Substanz, Phytomelanin mit EPR in der Größenordnung von 1018 spin/g bestimmt.

Bestimmung der Gesamt-Antioxidansfähigkeit (gesamter Antioxidansstatus) Um den Gesamt-Antioxidansstatus zu bestimmen, wurde das Set TAS von Randox, Großbritannien verwendet. Das Verfahren basiert auf der Bildung des Radikals Abts (2,2'-Azinodi(3-ethylbenzthiazolinsulfonat)). Das Radikal entsteht als Ergebnis der Wirkung von Wasserstoffperoxid auf Metmyoglobin, wobei Ferrylmyoglobin entsteht, welches mit Abts unter Bildung des Abts+-Radikals reagiert. HX-Fe3+ + H2O2 → X-(Fe4+ = O) + H2O Abts + X-(Fe4+ = 0) → Abts+ + HX-Fe3+ HX-Fe3+ Metmyoglobin X-(Fe4+ = 0) Ferrylmyoglobin

Es wurden Proben hergestellt und gemäß der in dem Set angegebenen Vorgehensweise pipettiert. Die Ergebnisse der Antioxidans-Fähigkeit der Substanz werden durch die Konzentration von Trolox ausgedrückt, welches als Standard für die Berechnung der Antioxidans-Aktivität verwendet wurde. Wir haben die Blindwert-Extinktion von den gemessenen Extinktionen subtrahiert und die Trolox-ähnliche Konzentration in der Probe gemäß der Formel:

berechnet.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben:

Tabelle 3

Die Antioxidans-Fähigkeit, bezogen auf Trolox, wurde von zwei Lösungen mit Konzentrationen von 0,1 und 0,01 mmol/l berechnet und ist wie folgt: 10,54 ± 1,02 mmol/l der Trolox-ähnlichen Aktivität.

Die Linearität wurde durch die Konzentrationsabhängigkeit überprüft; die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Die Beibehaltung der biologischen Aktivität wurde bestimmt, indem in der Lösung an den Tagen 0, 7 und 14 TAS gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4
Die Bestimmung der Antioxidans-Fähigkeit von Phytomelanin mittels wasserlöslicher Antioxidantien (ACW)

Zur Bestimmung wurden Lösungen des Sets FAT, Berlin für ACW (Antioxidans-Kapazität in wasserlöslichen Antioxidantien) verwendet

  • – Trolox-lösliche Form von Vitamin E wurde als Standard verwendet
  • – Es wurde die Vorgehensweise gemäß den Instruktionen in dem Set angewandt, während Phytomelanin-Lösungen mit den folgenden Konzentrationen für die Bestimmung verwendet wurden:
  • A = 1 mmol/l (5 mg/ml)
  • B = 0,1 mmol/l (10x verdünnte Lösung A)
  • C = 0,01 mmol/l (10x verdünnte Lösung B)

Wenn die ACW bestimmt wurde, wurde die Antioxidans-Fähigkeit als Verschiebung durch die "Lag-" Phasen der Kurve bewertet, was die Verschiebung der Kurven bei dem Trolox-Standard darstellt, von welchem eine Kalibrierungskurve konstruiert wurde, welche in der anhängenden Figur gezeigt ist.

Die ACW-Konzentration wurde von der Kalibrierungskurve mittels eines Computers berechnet. Nach der Wiederberechnung der ACW-Aktivität auf eine Konzentrationseinheit von Phytomelanin (0,0087 : 0,01) ist die Aktivität, welche durch ACW gekennzeichnet ist, die Aktivität von Phytomelanin = 0,87 der Aktivität von Vitamin E, wenn wir die Verschiebung der "Lag-" Phase, d. h. die Einfangaktivität, bewerten.

Andererseits, wenn wir den Bereich des Integrals der Chemilumineszenzkurve für die Bewertung verwenden, welche mehr der Fängeraktivität entspricht, ist dies, rückgerechnet auf die Einheitskonzentration von Phytomelanin, 5,56 der Fängeraktivität von Trolox.

Bestimmung der SOD-ähnlichen Aktivität und IC50 von Phytomelanin

Um die SOD-ähnliche Aktivität zu bestimmen, wurde ein chemiluminometrisches Verfahren unter Verwendung des Chemiluminometers PHOTOCHEM verwendet, wobei für die Bestimmung das Set FAT, Berlin für die SOD-Aktivität verwendet wurde. Die Messungen wurden mit der Messzeit von 3 Minuten durchgeführt, und der Integralbereich der Chemilumineszenzkurve wurde aufgezeichnet. Der Wert wurde auf die SOD-Aktivitätseinheit (in Gewicht) umgerechnet und stellt 0,2 der SOD-Aktivität dar. In der Mol-Konzentrations-Umrechnung auf die Einheitsaktivität ergibt die Phytomelaninaktivität 0,0316 der SOD-Aktivität. Der große Unterschied liegt an dem Unterschied in dem Molekulargewicht 5000 für Phytomelanin versus : 32000 für SOD.

Die SOD-Aktivität wird durch den Wert von IC50 ausgedrückt, welcher die Substanzkonzentration darstellt, welche die Detektion freier Radikale um 50% inhibieren kann. Nach der Berücksichtigung des Gewichts betrug der Wert 0,28 der SOD-Aktivität.

Jedoch erhielten wir, wenn Phytomelanin unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens mit erhöhter Konzentration freier ungepaarter Elektronen von 1019 spin/g verwendet wurde, die folgenden Ergebnisse, die in Tabelle 5 dargelegt sind.

Tabelle 5
Einfluss von Phytomelanin auf den DNA-Abbau

Um den Einfluss von Phytomelanin auf einen DNA-Abbau zu bestimmen, wurde chromosomale Rinder-DNA und ein System Xanthin-Xanthinoxidase zur Superoxidbildung verwendet.

Die Reaktionsmischung (1 ml) enthielt 0,25 mg DNA/RZ, Xanthin 3,1014 mol/l RZ. Der Reaktionsmischung wurde Xanthinoxidase so zugegeben, dass das Differenzdelta der Extinktion (510 nm) pro Minute, welches ein Indikator der Superoxidbildung ist, im Bereich von 0,03 bis 0,04 gehalten wurde.

Ein bestimmtes Volumen an Phytomelanin-Lösung wurde zugegeben, bzw. in der Kontrolle wurde sie nicht zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde mit 25 nM Phosphatpuffer bei pH 7,4 zu dem erforderlichen Volumen ergänzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 60 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde mit TCA (2,8% Vorratslösung) – 75 ml beendet. Nach einer Zugabe von 0,25 ml Thiobarbitursäure (TBA) wurde die Reaktionsmischung für 30 Minuten in geschlossenen Teströhrchen auf 95°C erhitzt. Nach dem Runterkühlen wurde sie spektrophotometrisch gegen eine Blindprobe und unter Verwendung von Tetraethoxypropan (TEP) als Standard untersucht, die Bildung des Endprodukts der oxidativen Schädigung von DNA-Malondialdehyd (MDA), bezogen auf 1 mg DNA, wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen wurde gefunden, dass:

  • a) Phytomelanin Radikale eliminieren kann.
  • b) Phytomelanin eine mindestens 10,00-fache Aktivität der löslichen Form von Vitamin E (Trolox) zeigt, wenn das organische Radikal ABTS von dem Set TAS, Randox, England verwendet wird.
  • c) Phytomelanin mehr Fänger- als Einfangaktivität besitzt.
  • d) Phytomelanin mindestens 5,5 der Fängeraktivität von Trolox zeigt.
  • e) Phytomelanin mindestens 0,87 der Einfangaktivität von Trolox zeigt.
  • f) Phytomelanin mindestens 0,20 der Aktivität von Superoxiddismutase zeigt.
  • g) Phytomelanin in der Lage ist, eine DNA-Spaltung durch Superoxid zu inhibieren. Mit der Konzentration von 0,01 mmol/l inhibiert es die DNA-Spaltung um mindestens 57,5%.
  • h) Die biologische Aktivität von Phytomelanin mit erhöhter Konzentration ungepaarter freier Elektronen (EPR) potenziert wird.

Durch Basisscreeningtests wurde ferner bestimmt, dass:

  • a) Phytomelanin in der Lage ist, eine Peroxidation von Lipiden vollständig zu blockieren.
  • b) Phytomelanin in der Lage ist, (anerge) Leukozyten zu aktivieren
  • c) Phytomelanin die Regulierung und den Verlauf des Komplementsystems beeinflusst.
  • d) Phytomelanin die Kontraktion von Blutgefäßen (Kapillaren) beeinflusst.
  • e) Phytomelanin stabile und reproduzierbare Eigenschaften für eine lange Zeit beibehält und diese nicht nach einer aggressiven chemischen Behandlung verliert.

Industrielle Anwendbarkeit

Physikochemische Eigenschaften und die biologische Aktivität zeigen die Möglichkeiten der Verwendung von Phytomelanin in einer Vielzahl von industriellen Gebieten, aber insbesondere in der Elektro- und elektrochemischen Industrie, Fleischindustrie, Landwirtschaftsindustrie, Nahrungsmittelproduktion und -verarbeitung, Verbraucherchemie und modernen Technologien neuer Materialien. In der ganzen Welt wird dem Gebiet der Verwendung ähnlicher Materialien, die zu Melaninen gehören, in Nukleartechniken große Aufmerksamkeit geschenkt. Eine sehr interessante Tatsache ist die Verwendung der Substanz in verschiedenen Modifikationen praktisch in allen Gebieten der Kosmetik aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften. Die gegenwärtige Tendenz der Anwendung neuer Biotechnologien in ökologischen und anderen Richtungen stellt breite Möglichkeiten auch in diesem Gebiet dar, welches wegweisend für das nächste Jahrtausend ist.

Biologische Verwendung

Ausgehend von dem gegenwärtigen Wissen nehmen wir an, dass es möglich sein wird, Phytomelanin bei der Behandlung verschiedener Arten maligner Krebstumoren, Störungen des Immunsystems einschließlich AIDS, Krankheiten, die mit dem Blut zusammenhängen und Störungen, die aus der gestörten Zellhomöostasie folgen, komplexen und schwerheilbaren mentalen Störungen (Schizophrenie, Epilepsie, ...), Nerven- und anderen regulatorischen Systemen, Drogenabhängigkeit zu verwenden. Es ist möglich, eine radioprotektive Präparation mit binärer Wirkung basierend auf dieser Substanz bereitzustellen.

Basierend auf den oben gegebenen Fakten der Literatur, die bislang veröffentlicht wurden, und basierend auf den in Basisscreeningtests erhaltenen praktischen Ergebnissen nehmen wir an, dass Phytomelanin als: Antioxidans, Radioprotektor, Phagostatikum, Cytostatikum, anticancerogene Präparation, zur Behandlung von Störungen des Immunsystems und dgl. verwendet werden wird.


Anspruch[de]
  1. Biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin, erhältlich durch ein Verfahren, in welchem ein pflanzliches Rohmaterial, das native Polymerund/oder Basisbaueinheiten wie Catechine und Leucoantocyanidine enthält, bei einer Temperatur von 15 bis 75°C mit 0,05 bis 0,3 M wässriger Lösung eines Alkalimetallhydroxids behandelt wird, der pH-Wert des Extrakts durch Zugabe einer auf Chlor basierenden anorganischen Säure auf 1 bis 2 eingestellt wird, wobei das abgeschiedene Sediment aufgereinigt und anschließend bei 100 bis 110°C getrocknet wird.
  2. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das pflanzliche Rohmaterial, das native Polymer- und/oder Basisbaueinheiten wie Catechine und Leucoantocyanidine enthält, bei einer Temperatur von 15 bis 75°C mit 0,05 bis 0,3 M wässriger Lösung eines Alkalimetallhydroxids behandelt wird, der pH-Wert des Extrakts durch Zugabe einer auf Chlor basierenden anorganischen Säure auf 1 bis 2 eingestellt wird, wobei das abgeschiedene Sediment aufgereinigt und anschließend bei 100 bis 110°C getrocknet wird.
  3. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung durchgeführt wird, indem mit einer Lösung einer auf Chlor basierenden Säure mit einem pH-Wert von 1,0 bis 3 gewaschen wird, bis über dem Sediment eine farblose Flüssigkeit erhalten wird, und anschließend mit einem organischen polaren Lösungsmittel gewaschen wird.
  4. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass geeignete organische Lösungsmittel Ethanol, Ethylacetat, Aceton, Dimethylformamid sind.
  5. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt nach dem Trocknen wieder einer Aufreinigung unterzogen wird und das Semiquichinonradikal ferner aktiviert wird.
  6. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine auf Chlor basierende anorganische Säure wie HCl und HClO4 verwendet wird, um die mineralische Komponente vollständig zu entfernen und ferner das Semiquichinonradikal zu aktivieren.
  7. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Fraktion von pflanzlichem Melanin nach den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in allen Verfahren Wasser pharmakologischer Qualität verwendet wird.
  8. Pharmazeutische Präparation, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
  9. Biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1 zur Verwendung als Wirkstoff.
  10. Biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1 zur Verwendung als Antioxidans.
  11. Biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1 zur Verwendung zur Blockierung von Lipidperoxidation.
  12. Biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1 zur Verwendung zur Regulierung der Leukozytenaktivität.
  13. Biologisch aktive Fraktion von pflanzlichem Melanin nach Anspruch 1 zur Verwendung zur Regulierung und für den Verlauf des Komplementsystems.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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