Die vorliegende Erfindung betrifft immunmodulierende Zubereitungen, die Zubereitungen enthaltende pharmazeutische Mittel und die Verwendung der Zubereitungen und Mittel in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tieren.

Fortlaufend werden Therapien zur Prophylaxe und Behandlung von Krebs und infektiösen Erkrankungen wie die erworbene Immunabwehrschwäche (AIDS) entwickelt. In einigen dieser Therapien wird versucht, das Immunsystem therapeutisch zu verwenden. Ein Ansatz basiert auf den Antigen-spezifischen Komponenten des Immunsystems, nämlich Antikörpern und T-Zellen. Zum Beispiel wurde die Forschung auf das Entwickeln von Vakzinen gegen Fremdstoffe oder gegen bestimmte endogene chemische Messenger, wie z. B. Interleukine, gerichtet, um Antikörper-Reaktionen zu unterdrücken. Ein zweiter Ansatz basiert auf der Isolation, Klonierung, Expression und Herstellung von Peptiden und Proteinen aus den nicht-Antigen-spezifischen Teilen des Immunsystems. Zum Beispiel bieten Proteine wie z. B. Cytokine, die von weißen Blutzellen hergestellte Interleukine umfassen, und Interferone, die Lymphozyten und Abbauzellen, die fremde Proteine verdauen, stimulieren, Möglichkeiten für Therapien.

Die Behandlung von Krebs könnte bedeutend verbessert werden, wenn die frühe Immunantwort auf einen Tumor erhöht werden könnte, so dass der Tumor keine kritische Größe erreicht. Strategien, die zur Erhöhung der Immunantwort gegen einen Tumor angeregt wurden, schließen ein für tumorassoziierte Antigene spezifische Vakzine; die Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen, wie z. B. gegen den Interleukin-2-Rezeptor; die Verwendung von Antitumor-Antikörpern und Superantigene enthaltenden bispezifischen Molekülen.

Vor nicht allzu langer Zeit wurde die Rolle des physiologisch aktiven Polypeptids, bekannt als Tumornecrosefaktor („TNF") untersucht, insbesondere im Hinblick auf seine Fähigkeit, die Necrose von Tumoren zu induzieren, ohne eine Wirkung auf normale Gewebe des lebenden Körpers zu haben. Die Aminosäuresequenz von TNF wie auch die Basensequenz der für TNF kodierenden DNA wurden im US-Patent Nr. 4,879,226 offenbart.

Da von TNF gezeigt wurde, dass es eine Rolle bei der Induktion der Necrose von Tumoren spielt, besitzt jedes Mittel, das die Produktion oder Bioverfügbarkeit von TNF in vivo stimulieren kann, potenziell einen Nutzen als eine Behandlung verschiedener tumorhafter Zustände. Zusätzlich ist jedes Mittel, das menschliche Monozyten und Makrophagen zur Freisetzung von TNF in vitro stimulieren kann, als ein Mittel zur Bereitstellung von sowohl einer Quelle an TNF für die therapeutische Verabreichung wie auch für analytische und diagnostische Zwecke nützlich.

Die Galle, die von der Leber sekretiert und in der Gallenblase gespeichert wird, wurde für verschiedene Zwecke erforscht, einschließlich der Verwendung von Gallenextrakten zur Steigerung der Bioverfügbarkeit von Wirkstoff, die im Zuge der normalen Leberfunktion leicht metabolisiert werden siehe WO 90/12583), und zur Inhibition eines Fortschreitens der Leukocytose in einem Säuger siehe Shinoda et al., Chem. Pharm. Bull., 30 4429–4434 (1982)). Dennoch wurde die Galle nie für eine Quelle für therapeutisch verwendbare Zubereitungen im Hinblick auf neoplastische oder infektiöse Erkrankungen gehalten. Interessanterweise wurde gemäß dem britischen Patent Nr. 337,797 angeregt, die Gallenblase selbst als eine potenzielle Quelle für Antikrebs-Mittel zu verwenden, aber erst nachdem die Galle aus der Gallenblase entfernt worden war und die Galle sorgfältig gewaschen wurde.

Es ist nun entdeckt worden, dass die Galle eine wichtige Quelle für eine Zubereitung ist, die die Freisetzung und/oder Herstellung von TNF sowohl in vitro und in vivo stimulieren kann, und dass sie beim Behandeln verschiedener Carcinome, insbesondere Bauchspeicheldrüsenkrebs, wirksam ist.

Die zu verwendende Gallenzubereitung wird durch Extraktion der Galle mit einem wasserlöslichen oder wassermischbaren Lösungsmittel erhalten. Der so erhaltene Extrakt kann weiter verarbeitet werden, um unnötige oder ungewünschte Komponenten daraus zu entfernen.

Von dem durch das Verfahren des Extrahierens der Galle gewonnenen Produkt, das hierin weiter unten ausführlicher beschrieben ist, wurde gefunden, dass es TNF-stimulierende Aktivität besitzt und von ihm wird geglaubt, dass es Antikrebs-Aktivität besitzt, insbesondere gegen Bauchspeicheldrüsenkrebs oder andere Krebsarten. Offensichtlich muss nicht die gesamte, so erhaltene Zubereitung erforderlich sein, um eine solche Aktivität zu erhalten. Folglich ist es möglich, das so erhaltene Produkt weiter zu trennen, fraktionieren oder anderweitig zu verarbeiten und immer noch die gewünschte TNF-stimulatorische und Antikrebs-Aktivität beizubehalten. Weiterhin wird vorhergesehen, dass es möglich ist, synthetisch ein Produkt mit derselben oder einer ähnlichen TNF-stimulatorischen und Antikrebs-Aktivität zu erhalten. Daher wird vorhergesehen, dass die Komponenten des Produkts auf die Komponenten hin, oder Kombinationen hiervon, analysiert werden können, die für die gewünschte Aktivität verantwortlich sind, und ein auf einer solchen Analyse basierendes synthetisches Produkt hergestellt wird.

Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Offenbarung daher eine Zubereitung für die Verwendung als ein Immunmodulator, die niedermolekulargewichtige Komponenten von weniger als 3.000 Dalton umfasst und ein oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist:

• a) sie ist aus der Galle von Tieren extrahierbar;
• b) sie kann Monozyten und Makrophagen in vitro stimulieren;
• c) sie kann die Freisetzung und/oder Herstellung von Tumornecrosefaktor modulieren;
• d) sie enthält keinen messbaren Spiegel an IL-1&agr;, IL-1&bgr;, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF oder IFN-gamma;
• e) sie hat eine antiproliferative Wirkung in einer malignen Maus-Hybridom-Zelllinie;
• f) sie zeigt keine Cytotoxizität gegenüber menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen; und
• g) sie ist kein Endotoxin.

Genauer stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine aus der Galle extrahierte Zubereitung unter Anwendung eines wasserlöslichen oder wassermischbaren Lösungsmittel für die Verwendung als Immunmodulator zur Verfügung, umfassend mindestens eine Komponente von weniger als ca. 3.000 Dalton, die keine Cytotoxizität gegenüber menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen zeigt und mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) Sie kann Monozyten und/oder Makrophagen in vitro dazu stimulieren, ein oder meherere Cytokine freizusetzen und/oder zu produzieren; (b) oder sie kann Monozyten und/oder Makrophagen dazu stimulieren, Tumornecrosefaktor in vitro oder in vivo freizusetzen oder zu erzeugen; und worin es sich bei der Komponente nicht um ein Endotoxin, IL-1&agr;, IL-1&bgr;, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSE oder Interferongamma handelt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zubereitung aus der Galle von Rindern extrahiert und kann die Freisetzung von Tumornecrosefaktor stimulieren.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann hergestellt werden durch (a) Mischen von Galle aus einem Tier, vorzugsweise einem Rind, mit einem Lösungsmittel, das in Wasser löslich oder mit diesem mischbar ist, vorzugsweise einem Alkohol, und vorzugsweise mit einem gleichen Volumen von Alkohol, um eine Galle/Alkohollösung zu erzeugen; (b) Trennen der Lösung, die vorzugsweise eine Alkohol-lösliche Fraktion ist, und Isolieren einer im Wesentlichen von Alkohol freien Lösung hieraus, durch Entfernen des meisten Alkohols, z. B. durch die Verwendung von Hitze; (c) Entfernen der Gallenpigmente aus der Lösung, um eine farblose Flüssigkeit zu erhalten; (d) gegebenenfalls Behandeln der farblosen Flüssigkeit, um jeden rückständigen Alkohol im Wesentlichen zu entfernen; (e) Entfernen der fettigen organischen Stoffe durch Extrahieren der farblosen Flüssigkeit mit Ether und Isolieren der wässrigen Phase; und (f) gegebenenfalls Entfernen des rückständigen Ethers aus der wässrigen Phase.

Die Zubereitung kann ohne weitere Modifikation einfach durch Verpacken von ihr in Gefäße und Sterilisieren verwendet werden. Die Zubereitung kann auch in einer konzentrierten Form verwendet werden. Eine bevorzugte konzentrierte Form wird wie folgt hergestellt. Vor dem Schritt (e) kann die farblose Flüssigkeit gegebenenfalls auf ca. ein Achtel des Volumens der Galle/Alkohollösung konzentriert werden und nach Schritt (f) kann die wässrige Phase so konzentriert werden, dass sie nur ein Zehntel des Volumens der Galle/Ethanollösung beträgt.

Die Erfindung betrifft auch ein pharmazeutisches Mittel enthaltend die neue erfindungsgemäße Zubereitung.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung zum Behandeln eines Patienten durch Verabreichen einer wirksamen Menge dieser Zubereitung an den Patienten. Die Erfindung betrifft noch weiter eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung zur Verwendung in der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen und Zuständen, welche eine Modulation der Immunantwort erfordern; vorzugsweise infektiöse Erkrankungen und Neoplasien.

In verschiedenen weiteren Aspekten stellt die Erfindung die Verwendung von mindestens einer aus der Galle extrahierten Komponente mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 Dalton zur Verfügung, die keine Cytotoxizität gegen menschliche periphere mononukleäre Blutzellen zeigt und mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) Sie kann Monozyten und/oder Makrophagen in vitro dazu stimulieren, ein oder meherere Cytokine freizusetzen und/oder zu produzieren; (b) oder sie kann Monozyten und/oder Makrophagen dazu stimulieren, Tumornecrosefaktor in vitro oder an vivo freizusetzen oder zu erzeugen; und worin es sich bei der Komponente nicht um ein Endotoxin, IL-1&agr;, IL-1&bgr;, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF oder Interferon-gamma handelt, für die Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren des Immunsystems eines Patienten oder für die Prophylaxe und Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands, welche bzw. welcher die Modulation der Immunantwort erfordern.

Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen offenkundig werden.

Weitere Details der Erfindung sind unten mit der Hilfe der Beispiele beschrieben, die in den begleitenden Zeichnungen veranschaulicht werden, wobei:

1 ist ein HPLC-Profil für eine konzentrierte erfindungsgemäße Zubereitung;

2 ist ein HPLC-Profil für eine konzentrierte erfindungsgemäße Zubereitung;

3 ist ein HPLC-Profil für eine konzentrierte erfindungsgemäße Zubereitung;

4 ist ein HPLC-Profil für eine erfindungsgemäße Zubereitung;

5 ist ein HPLC-Profil für eine erfindungsgemäße Zubereitung;

6 ist ein HPLC-Profil für eine erfindungsgemäße Zubereitung;

7 ist ein HPLC-Profil für eine erfindungsgemäße Zubereitung;

8 ist ein Graph, der die Wirkung der Zubereitung auf die LPS-induzierte Freisetzung von TNF durch PBMN zeigt;

9 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung der Zubereitung auf die LPS-induzierte Freisetzung von TNF durch PBMN zeigt;

10 zeigt das C₁₈ RP-HPLC-Profil einer erfindungsgemäßen Zubereitung;

11 zeigt die RP-HPLC-Analyse von präzipitierten Fraktionen der erfindungsgemäßen Zubereitung;

12 zeigt die RP-HPLC-Analyse von löslichen Fraktionen der erfindungsgemäßen Zubereitung;

13 ist ein Graph, der das aus der Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Patienten hergenommene Überleben zeigt, welche mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden;

14 ist ein Graph, der das aus der Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Patienten hergenommene Überleben zeigt, welche mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden;

15 ist ein Graph, der das Überleben aller Melanom-Patienten zeigt, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden;

16 ist ein Graph, der das Überleben von Melanom-Patienten mit zwei oder mehr Tumorstellen zeigt, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden;

17 ist ein Graph, der das Überleben von Melanom-Patienten mit 3 oder mehr Tumorstellen zeigt, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden;

18 ist ein Graph, der das RP-HPLC-Profil der gesamten erfindungsgemäßen Zubereitung zeigt;

19 ist ein Graph, der das RP-HPLC-Profil eines Präzipitats der erfindungsgemäßen Zubereitung zeigt;

20 ist ein Graph, der das RP-HPLC-Profil eines Überstands der erfindungsgemäßen Zubereitung zeigt;

21 ist ein SDS-Gel der erfindungsgemäßen Zubereitung;

22 zeigt Bedingungen und Zeiten der Elution der erfindungsgemäßen Zubereitung auf einer hydrophilen HPLC (a) und das Elutionsprofil eines Überstands der erfindungsgemäßen Zubereitung (b);

23 zeigt die Elution eines Präzipitats der erfindungsgemäßen Zubereitung auf einer hydrophilen HPLC;

24 ist ein Graph, der die Dosiswirkung der erfindungsgemäßen Zubereitung bei der Stimulierung der Funktion von Monozyten des peripheren Bluts zeigt; und

25 ist ein Foto eines malignen Melanoms vor (25a) und nach (25b) Behandlung mit der erfindungsgemäßen Zubereitung.

Wie hierin oben erwähnt, betrifft die vorliegende Offenbarung eine Zubereitung für die Verwendung als ein Immunmodulator, die niedermolekulargewichtige Komponenten von weniger als 3.000 Dalton umfasst und ein oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist:

• a) sie ist aus der Galle von Tieren extrahierbar;
• b) sie kann Monozyten und Makrophagen in vitro stimulieren;
• c) sie kann die Tumornecrosefaktor-Herstellung modulieren;
• d) sie enthält keinen messbaren Spiegel an IL-1&agr;, IL-1&bgr;, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF oder IFN-gamma;
• e) sie hat eine antiproliferative Wirkung in einer malignen Maus-Hybridom-Zelllinie;
• f) sie zeigt keine Cytotoxizität gegenüber menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen; und
• g) sie ist kein Endotoxin.

Wie zuvor erwähnt, bezieht sich die beanspruchte Erfindung in einem ersten Aspekt auf eine aus der Galle unter Anwendung eines wasserlöslichen oder wassermischbaren Lösungsmittels extrahierte Zubereitung für die Verwendung als ein Immunmodulator, umfassend mindestens eine Komponente mit weniger als ca. 3.000 Dalton, die keine Cytotoxizität gegenüber menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen zeigt und mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) Sie kann Monozyten und/oder Makrophagen in vitro dazu stimulieren, ein oder mehrere Cytokine freizusetzen und/oder zu produzieren; (b) oder sie kann Monozyten und/oder Makrophagen dazu stimulieren, Tumornecrosefaktor in vitro oder in vivo freizusetzen oder zu erzeugen; und worin es sich bei der Komponente nicht um ein Endotoxin, IL-1&agr;, IL-1&bgr;, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF oder IFN-gamma handelt.

Genauer haben Untersuchungen gezeigt, dass zumindest einige erfindungsgemäße Zubereitungen normale Monozyten stimulieren werden, eine Cytotoxizität gegenüber der Chang-Hepatom-Zelllinie hervorzurufen, die zur Messung der Monozyten-Toxizität verwendet wird. Von Monozyten und Makrophagen aus Krebspatienten (Cervix- und Ovarkrebs) wurde auch berichtet, dass sie von der Zubereitung stimuliert werden, ihre eigenen speziellen Tumorzellen anzugreifen und zu zerstören.

Bestimmte erfindungsgemäße Zubereitungen können die Freisetzung und/oder Herstellung von Tumornecrosefaktor (TNF) modulieren. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zubereitung, die aus der Galle von Rindern isoliert wurde, fördert die Freisetzung von TNF aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen in Mengen, die physiologisch zu sein scheinen. Da von TNF bekannt ist, dass es eine Kaskade von inflammatorischen und Antitumor-Cytokin-Wirkungen auslöst, könnte die bevorzugte Zubereitung ihre antineoplastische Wirkung durch Stimulieren menschlicher Leukozyten zur TNF-Freisetzung (und möglicherweise andere Cytokine) ausüben. Folglich kann die vorliegende Erfindung auch die Lymphozyten- und Makrophagen-Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen erhöhen.

Von bestimmten erfindungsgemäßen Zubereitungen wurde auch gefunden, dass sie das Zellwachstum der Maus-Hybridom-Zelllinie #6-1 inhibieren. Die inhibitorische Wirkung der Zubereitung in den Maus-Hybridom-Zellen weist auf eine antiproliferative Aktivität hin.

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Zubereitung auf das Überleben von menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMN) wurde auch untersucht. Von der Zubereitung wurde gefunden, dass sie für menschliche PBMN nicht cytotoxisch ist.

Wie unten beispielhaft erläutert, kann die Zubereitung der vorliegenden Erfindung unter anderem die folgenden Eigenschaften aufweisen:

• 1) Die Zubereitung oder Zubereitungen, die für die TNF-Freisetzung aus PBMN verantwortlich ist/sind, eluierten früh aus einer C₁₈ RP-HPLC-Säule.
• 2) Die TNF-freisetzende(n) Komponente(n) wird (werden) zum Teil durch 80% Acetonitril präzipitiert.
• 3) Das Material, das durch 80% Acetonitril nicht präzipitiert wurde, behält etwas der TNF-freisetzenden Aktivität bei.
• 4) Die TNF-freisetzende Aktivität eluierte aus der RP-HPLC sowohl bei dem 80% Acetonitril Präzipitat als auch bei den Überstandfraktionen bei der gleichen frühen Zeit. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass aktive TNF-freisetzende Komponenten in der Zubereitung zu der gleichen molekularen Familie gehören mit möglicherweise einigen kleinen molekularen Unterschieden, die die Löslichkeitsunterschiede ausmachen.
• 5) Die Zubereitung verursacht die Freisetzung von Interleukin-1&bgr; (IL-1&bgr;), und die Komponente, die für die IL-1&bgr;-Freisetzung verantwortlich ist, eluiert früh aus der RP-HPLC, was darauf hinweist, dass es wahrscheinlich die gleiche(n) Substanzen) ist/sind, die TNF freisetzten.
• 6) Die Zubereitung verursacht auch die Freisetzung von geringen Mengen an Interleukin-2 (IL-2).
• 7) Die Zubereitung verursacht die Freisetzung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor (GM-CSF); die 80% Acetonitril-Präzipitationsfraktion ist aktiver als die Überstandsfraktion.
• 8) Das Verhältnis von TNF-Freisetzung zu GM-CSF-Freisetzung ist ca. 2 : 1.
• 9) Die 80% Acetonitril-Präzipitatsfraktion enthält (eine) Komponente(n), die ca. 3 mal mehr TNF und GM-CSF freisetzten als die Komponente(n) in der Überstandsfraktion.
• 10) Die Analyse der zuvor genannten Präzipitate und Überstandsfraktionen, die durch RP-HPLC aufgetrennt wurden, zeigt, dass die Freisetzungsaktivität für TNF, IL-1&bgr; und GM-CSF für sowohl das Präzipitat als auch den Überstand früh eluiert. Allerdings eluiert im Überstand ein wenig IL-1&bgr;-Aktivität spät.
• 11) Es ist wahrscheinlich, dass das/die gleiche(n) Molekül(e), d. h. Komponente(n), in der Zubereitung für die Freisetzung von TNF, IL-1&bgr; und GM-CSF verantwortlich ist/sind. Es ist möglich, dass die Zubereitung wirkt, in dem sie die Freisetzung vieler verschiedener Cytokine stimuliert oder alternativ, in dem die Zubereitung die Produktion und Freisetzung eines Cytokins triggert, das im Gegenzug die Produktion und Freisetzung anderer Cytokine stimuliert.
• 12) Die physikalisch-chemische Analyse der Zubereitung, einschließlich ihrer Präzipitate und Überstände, durch SDS-Gel-Elektrophorese und Molekularsieb-HPLC zeigt, dass die Hauptkomponenten weniger als 2500 Dalton haben.
• 13) Eine weitere physikalisch-chemische Trennung durch hydrophile (Polyhydroxyethyl) Molekularsieb-HPLC bestätigt das niedrige Molekulargewicht der Komponenten in der Zubereitung.
• 14) Die Aminosäure-Analyse vor und nach saurer Hydrolyse weist auf das Vorhandensein von Peptidbindungen hin, was die Anwesenheit von Peptiden anzeigt.
• 15) Der Aminosäuregehalt der aktiven Form aus der RP-HPLC zeigt hohe Spiegel an Glutamat/Glutamin und Glycin. Zusätzlich wurden Asparagin-, Threonin-, Serin- und Alanin-Reste nachgewiesen.
• 16) Es gab einige unidentifizierte Ninhydrin-positive Reste, die wahrscheinlich freie Aminosäuren sind.

Wie hierin oben erwähnt, kann die erfindungsgemäße Zubereitung hergestellt werden durch (a) Mischen von Galle aus einem Tier, vorzugsweise einem Rind, mit einem gleichen Volumen an Alkohol, um eine Galle/Alkohollösung herzustellen; (b) Abtrennen der Alkohol-löslichen Fraktion und Isolieren einer Lösung, die im Wesentlichen frei von Alkohol ist; (c) Entfernen der Gallepigmente aus der Lösung, um eine farblose Flüssigkeit zu erhalten, (d) Behandeln der farblosen Flüssigkeit, um im Wesentlichen jeden rückständigen Alkohol zu entfernen; (e) Extrahieren der farblosen Flüssigkeit mit Ether und Isolieren der wässrigen Phase; und (f) Entfernen des rückständigen Ethers aus der wässrigen Phase.

Die Zubereitung wird aus der Galle eines jeden Tiers, das Galle produziert, vorzugsweise nicht-menschlichen Tieren, erhalten. Während die Zubereitung eine unterschiedliche Aktivität gegenüber einer spezifischen Erkrankung haben kann, wenn die Galle von einer Spezies im Gegensatz zu einer anderen erhalten wurde, wird im Allgemeinen eine geeignete Quelle für Galle eine solche sein, die aus Rindern, Schafen oder Schweinen kommt. In den meisten Fällen ist es zweckmäßig, die Galle von geschlachteten gesunden Tieren für die Nahrung, wie z. B. Rindern, Schafen und Schweinen, zur Verwendung in der Herstellung einer erfindungsgemäßen Zubereitung zu erhalten. Die so gesammelte Galle sollte direkt aus der Gallenblase der geschlachteten Tiere kommen und sollte im Wesentlichen klar sein, wodurch angezeigt wird, dass die Gallenzubereitung einen niedrigen Schleimgehalt besitzt und im Wesentlichen frei von Eiter oder Blut ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Galle aus bovinen Quellen verwendet. Bovine Galle ist im Überfluss vorhanden, da zum Teil relativ große Mengen aus jedem Tier extrahiert werden können. Darüber hinaus werden Rinder routinemäßig geschlachtet und im Hinblick auf gesundheitsbezogene Vorschriften beschaut, so dass solche Tiere eine verlässliche Quelle für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitung bereitstellen. Darüber hinaus ist es für den Menschen weniger wahrscheinlich, eine allergische Reaktion auf Material bovinen Ursprungs zu haben.

Die Galle kann mit dem gleichen Volumen eines Alkohols gemischt werden, um eine Galle-Alkohol-Lösung herzustellen, die 50% Alkohol aufweist. Der Alkohol kann ein aliphatischer Alkohol, vorzugsweise Methanol, Ethanol oder Propanol, am meisten bevorzugt Ethanol, sein.

Eine Lösung, die im Wesentlichen frei von Material ist, das in 50% Alkohol unlöslich ist, kann durch Zentrifugation isoliert werden. Vorzugsweise wird das Galle/Alkohol-Gemisch bei 3.000 bis 5.000 UPM, am meisten bevorzugt 4.200 UPM, für mindestens 2 Stunden bei ca. 15–25°C zentrifugiert. Der Alkohol, der in der Galle/Alkohol-löslichen Fraktion enthalten ist, kann durch Ausnutzen der unterschiedlichen Flüchtigkeiten von Alkohol und Wasser unter Verwendung üblicher Verfahren, d. h. Erhitzen der Fraktion auf eine geeignete Temperatur, z. B. 80–85 °C, für eine ausreichende Zeit, z. B. bis zu 10 Stunden, entfernt werden.

Gallenpigmente können aus der Lösung zum Erhalt einer farblosen Flüssigkeit durch Verwendung von Aktivkohle, Polyamid-Mikrokügelchen oder Filtration entfernt werden. Vorzugsweise wird eine Aktivkohle-Behandlung verwendet. Das Arbeitsschritt kann wiederholt werden, damit die Lösung den Standards an die optische Dichte und Leitfähigkeit genügt.

Die farblose Flüssigkeit kann unter Verwendung üblicher Verfahren behandelt werden, um den rückständigen Alkohol im Wesentlichen zu entfernen. Vorzugsweise wird die farblose Flüssigkeit unter Verwendung eines Filters mit einer Retention von 1,0 bis 3,5 &mgr;m, am meisten bevorzugt einer Retention von 2,5 &mgr;m, filtriert.

Die farblose Flüssigkeit wird dann mit Ether extrahiert und die wässrige Phase isoliert. Der in diesem Schritt verwendete Ether ist vorzugsweise Dimethylether, Ethylether, n-Propylether, Isopropylether oder n-Buylether, am meisten bevorzugt Ethylether.

Der rückständige Ether kann aus der wässrigen Phase durch z. B. Erhitzen der Lösung auf bis zu 55°C, vorzugsweise auf bis ca. 40°C für ca. 5–15 Stunden, am meisten bevorzugt für ca. 10 Stunden, entfernt werden.

Die Zubereitung kann ohne weitere Modifikation einfach durch Verpacken von ihr in Gefäße und Sterilisation verwendet werden. Die Zubereitung kann auch in konzentrierter Form verwendet werden. Eine bevorzugte konzentrierte Form wird wie folgt hergestellt. Vor dem hierin oben beschriebenen Schritt(e) kann die farblose Flüssigkeit gegebenenfalls auf ca. ein Achtel des Volumens der Galle/Alkohol-Lösung durch z. B. Erhitzen auf eine Temperatur von weniger als 85 °C, vorzugsweise auf ca. 60 bis 70°C, konzentriert werden. Nach Schritt (f) kann die wässrige Phase durch z. B. Erhitzen auf ca. 80 bis 85°C konzentriert werden, so dass sie nur noch ein Zehntel des Volumens der Galle/Ethanol-Lösung ist.

In einem bevorzugten Verfahren zum Herstellen einer erfindungsgemäßen Zubereitung wird die gesammelte Galle mit einem gleichen Volumen an Ethylalkohol gemischt. Das Galle/Alkohol-Gemisch wird dann bei ca. 4.200 RPM für mindestens 2½ Stunden bei ca. 20 ± 2°C zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird dekantiert und auf seinen pH-Wert und Ethanolgehalt überprüft. Die Gallepigmente werden dann unter Verwendung von Aktivkohle entfernt. Die behandelte Galle/Ethanollösung wird dann auf ihre optische Dichte (O.D.) und Leitfähigkeit überwacht. O.D.-Werte und Leitfähigkeitswerte außerhalb der zulässigen Spezifikationen erfordern, dass die Galle/Ethanollösung einer zusätzlichen Behandlung zugeführt wird, um Gallepigmente zu entfernen, z. B. durch erneute Behandlung mit Aktivkohle, um einen abgelesenen Messwert innerhalb der Grenzen der Spezifikation zu erreichen.

Nach der Aktivkohle-Behandlung wird die Lösung durch einen Filter mit einer 2,5 &mgr;m-Retention gefiltert, der Alkohol durch Erhitzen auf weniger als 85°C abevaporiert und die Lösung auf ca. ein Achtel des ursprünglichen Volumens der Galle/Ethanollösung konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird auf zwischen ca. 20 und 25°C abgekühlt. Diese Lösung wird dann mit Ethylether gemischt und die Etherphase verworfen. Vorzugsweise werden relativ kleine Ethervolumina und starke Bewegung verwendet, wie z. B. 0,1 bis 1 Volumen, vorzugsweise 0,2 bis 0,5 Volumen. Dieser Schritt kann einmal wiederholt werden. Die wässrige Phase wird erhitzt, um rückständigen Ether durch Erhitzen auf bis zu 55°C für ca. 10 Stunden zu entfernen und weiter auf ein Zehntel des Volumens des ursprünglichen Galle/Ethanol-Volumens durch Erhitzen auf ca. 80–85°C reduziert. Diese Lösung wird dann auf ihr Erscheinungsbild, biologische Aktivität und Ethanol- und Ethergehalt überprüft.

Der pH-Wert der Zubereitung kann auf einen physiologischen pH, d. h. 7,4 bis 7,5, unter Verwendung von Salzsäure (1%) Lösung und Natriumhydroxid (1% Lösung) eingestellt werden und eine gepufferte Lösung kann unter Verwendung von dibasischen und monobasischen Natriumphosphatsalzen als Puffer unter Verwendung üblicher Verfahren erhalten werden.

Die Zubereitung kann ohne weitere Modifikation einfach durch Verpacken von ihr in Gefäße und Sterilisation verwendet werden. In einem bevorzugten Sterilisationsverfahren wird die Zubereitung drei Sterilisationszyklen durch Autoklavieren gefolgt von einer Inkubation unterzogen.

Die Zubereitung kann in konzentrierter Form verwendet werden. Die Herstellung der konzentrierten Form ist oben beschrieben. Die Zubereitung kann auch lyophilisiert werden.

Die Zubereitung und die konzentrierte Zubereitung sind klare farblose oder gelbliche Lösungen, die im Wesentlichen frei von Fremdstoffen sind, und nicht mehr als 10 ppm Ethanol und nicht mehr als 5 ppm Ether enthalten. In dem Bioassay, der in Beispiel 4 beschrieben ist, wurde von der Zubereitung gezeigt, dass sie mit 18 Einheiten pro ml nicht-proliferatives Wachstum verursacht.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können in einer gleich bleibend reproduzierbaren Form unter Verwendung des oben allgemein beschriebenen Verfahrens mit der gezeigten Identität, Potenz und Reinheit von Batch zu Batch hergestellt werden. Identität und Reinheit werden unter Verwendung von Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie bestimmt (siehe Beispiel 1). Die erfindungsgemäßen Zubereitungen haben ein gleich bleibend reproduzierbares Muster auf der Umkehrphasen-HPLC, in welchem Peaks früh in der Ausschlussfraktion bei ca. 27 und 32 Minuten zu sehen sind. Vor, zwischen und nach den hohen Peaks sind kleinere Peaks, die in ihrer Intensität variieren. Die abgelesenen HPLC-Messwerte für drei Chargen der konzentrierten erfindungsgemäßen Zubereitung sind in den 1 bis 3 gezeigt. Die RP-HPLC-Profile der Batches B0211 (4), B0209 (5), B29/3006 (6) und B15/1606 (7) zeigen auch ein sehr reproduzierbares Muster. Die Zubereitungen zeigen auch nicht-proliferatives Wachstum von ca. 18 Einheiten pro ml in dem in Beispiel 4 beschriebenen Bioassay. Die Zubereitungen können auch durch ihre hierin zuvor genannten Eigenschaften charakterisiert werden, z. B. ihre Fähigkeit, Monozyten und Makrophagen in vitro zu stimulieren, etc.

Verbindungen, die unter Berücksichtigung der Quelle in der vorliegenden Zubereitung wahrscheinlich vorhanden sind, schließen sulfonierte Gallensäuren, oxidierte Gallensäuren und andere natürlich vorkommende Gallensäuren und ihre Aminosäure- (insbesondere Glycin- und Taurin-)-Konjugate und Sterine ein. Folglich wird geglaubt, dass die vorliegende Zubereitung mindestens eine Verbindung einschließt der Formel

Insbesondere wurde die erfindungsgemäße Zubereitung auf ihre Komponentenverbindungen einschließlich organischer und anorganischer Komponenten untersucht. Solche Informationen wurden unter Verwendung von Standardverfahren der analytischen Chemie einschließlich Massenspektroskopie (MS) erhalten. Die Ergebnisse solcher Untersuchungen schließen zum Beispiel die Identifikation von spezifischen Gallensäureverbindungen ein, von denen gedacht wurde, dass sie anwesend sind, einschließlich Cholsäure, Glycocholsäure, Deoxyglycocholsäure, Ursodeoxycholsäure, Cholesterinsulfat, Deoxycholsäure, Chenodeoxycholsäure und Taurocholsäure.

Aus der MS ist nicht unterscheidbar, ob der Verlust von OH und H₂ einiger Verbindungen in der MS auftritt, oder ob die Deoxy-, Dideoxy- und ungesättigten Analoga solcher Verbindungen auch von Anfang an vorhanden waren. Diese Verbindungen können alle als Salze von Ammonium, Alkylammonium und anorganischen Kationen vorhanden sein.

Die MS-Analyse unterstützt auch die Identifikation der vorhandenen Verbindungen der Phospholipide, Sphingolipide und verwandter Mittel, die zur Micellenbildung in der Lage sind. Spezifische Verbindungen, von denen gedacht wird, dass sie vorhanden sind, schließen ein:

Stearinsäure CH₃(CH₂)₁₆COOH,

Palmitinsäure CH₃(CH₂)₁₄COOH

Ölsäure Z-9 Oktadekansäure:

CH₃(CH₂)₂CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₆COOH

oxiderte oder hydroxylierte/ungesättigte kurzkettige Fettsäuren: C₆H₈O₃ (z. B., CH₃CH=CHCOCH₂COOH oder eine C₆-Säure mit 2 Doppelbindungen und einem Hydroxid)

Essigsäure

Stearinsäurediglycerid

Palmitinsäurediglycerid

Stearinsäure, Palmitinsäurediglycerid

Stearinsäure-Monoglycerid-Phosphocholin (ein Lysolecithin)

Stearinsäuremonoglycerid

Stearinsäuretriglycderid

Palmitinsäuremonoglycerid

Phosphocholin

Phosphoserin

Phosphosphingosin

Stearinsäure-Sphingosin

Sphingosin

Stearinsäureamid

Stearinsäuremethylamid

Palmitinsäureamid

Lecithin

Sialinsäure-Glycerindimer

Zusätzlich wurde ein vorläufiger HPLC- und Titrationsbeweis erhalten, der zeigt, dass kurzkettige Fettsäuren auch vorhanden sind.

Phospholipid, Sphingolipid und verwandte Hydrolyseprodukt-Verbindungen, die wahrscheinlich unter Berücksichtigung der Quelle und der Informationen, die aus den MS- und HPLC-Analysen stammen, vorhanden sind, schließen mindestens eine Verbindung ein mit der Formel

Die Fettsäuren und ihre Konjugate können in dem vorgenannten wässerigen Extrakt als Salze vorhanden sein. Die Löslichkeit solcher Verbindungen wird auch durch andere Komponenten des Gemisches erhöht. Von Amiden der eingeschlossenen Carbonsäuren, RCONR¹R², wobei R¹ und R² gleich oder verschieden sind und H oder Alkyl sind, wird geglaubt, dass sie vorhanden sind.

Die dritte Klasse von Verbindungen, nämlich Mucin- und Proteoglycan-Hydrolyseprodukte, sind unter Berücksichtigung der Quelle der Zubereitung und der vorgenannten MS-Analyse hiervon wahrscheinlich auch vorhanden. Solche Verbindungen schließen die Hydrolyseprodukte von Mucoprotein aus der Galle und der Gallenblasenwand ein, wie z. B.: Chrondroitin 4- und 6-Sulfate, Dermatansulfat, Heparin, Heparinsulfat, Hyaluronsäure und die Hydrolyseprodukte (Monomere, Dimere, Oligomere und Polymere) dieser Mucine. Chitin und andere Mucine können in ähnlicher Weise hydrolysiert sein, wobei deren Hydrolyseprodukte einschließen würden:

N-Acetyl-D-glucosamin, N-Acetyl-D-galactosamin-4-sulfat, Galactose-6-sulfat, N-Acetyl-D-glucosamin-6-sulfat, Glucosamin-6-sulfat, D-Glucosamin-2-sulfat, D-Glucosamin-2,3-disulfat, D-Galactose-6-sulfat, Glucuronsäure-2-sulfat, N-Acetylneuraminsäure, Sialinsäure, N-Acetylchondrosin, Chrondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, D-Glucosamin, D-Galactosamin, Glucuronsäure, Glucose, Galactose, Mannose, Fucose, Iduronsäure, Hexose, Hexosamin, Estersulfat, Glucuronsäure, Chondrosamin, 2-Amino-2-deoxy-D-galactose, Serin, Prolin, Threonin, Alanin Glycin Taurin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Histidin und kleine Peptide.

Ähnliche Produkte würden durch Hydrolyse von Mucinen, wie z. B. Keratinsulfaten, Dermatansulfaten, erhalten werden, die natürlichen Zucker-Zucker-Brücken in den Dimeren, Oligomeren und Polymeren können durch -O-Si(OH)₂-O-Brücken zwischen den Zuckermonomeren und benachbarten Zuckerketten ersetzt werden.

Insbesondere schließen spezifische Mucin- und Proteoglycan-Hydrolyseproduktverbindungen, von denen gedacht wird, dass sie anwesend sind, ein:

Sialinsäuren und ihre mono- und diacetylierten und glycolylierten Monomere;

N-Acetylneuraminsäure;

Hexosamine;

L-Fucose;

Hexosamin-Hexuronsäure(Dimer)disulfat;

Glucuronsäure- oder Iduronsäuredisulfat, monoacetyliert;

Sialinsäure-Glycerin(Dimer); und

Dimere, Trimere, Oligomere und Polymere der obigen Monomere in acetylierter oder sulfatierter Form.

Eine vierte Klasse von Verbindungen, nämlich fettlösliche Vitamine, ist wahrscheinlich unter Berücksichtigung der Quelle und der vorgenannten MS-Analyse vorhanden, einschließlich A-, D- und K-Vitaminen (z. B. D1, D3, D4, K1, K2, K5, K6, K7, K-S(II) und Vitamin-E-Acetat, zum Beispiel).

Insbesondere schließen spezifische fettlösliche Vitaminverbindungen, von denen gedacht wird, dass sie vorhanden sind, mindestens eine aus der Gruppe bestehend aus Vitamin A2, Vitamin D1, Lumisterol (vorhanden aus seinem Vitamin-D1-Komplex), Vitamin E, Vitamin K1-Oxid und Vitamin K5, ein.

Verschiedene sonstige organische Verbindungen sind wahrscheinlich unter Berücksichtigung der Quelle und der vorgenannten MS-Analyse vorhanden. Solche Verbindungen schließen ein:

Bilirubin und sein Gluconuridkonjugat;

Biliverdin und sein Gluconuridkonjugat;

Spuren von Steroiden;

andere im Plasma gelöste Stoffe, wie zum Beispiel Zucker, Purine und Pyrimidine;

sonstige Nahrungslipide; und

Glutathion und seine Hydrolyseprodukte.

Insbesondere schließen spezifische sonstige organische Verbindungen, von denen geglaubt wird, dass sie in der Zubereitung vorhanden sind, mindestens eines aus der Gruppe ein, bestehend aus Harnstoff, Methylamin, Dimethylamin, Ethylamin, Methylethylamin, Diethylamin, Dipropylamin, Butylethylamin, Ammoniak, Cholin, Taurin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, P-Ser, P-EU, P-EA, Asp Thr Ser Sar, A-Aba, Cit, Val, Ile, Leu, B-Ala, G-Aba, OH-Lys, Orn, Lys, butyliertes Hydroxytoluol (BHT) und Polyethylenglycol.

Amine, die in der vorliegenden Zubereitung vorhanden sind, insbesondere sekundäre Amine, können Stickoxide aus der Luft einschließen und so Nitroso-Verbindungen bilden. N-Oxide und N-Carbamat-Nebenprodukte können auch eingeschlossen sein. Diese Reihe von oben zitierten Aminen sollte erweitert werden, um alle primären, sekundären und tertiären Alkylamine einzuschließen.

Bestimmte anorganische Elemente wurden identifiziert und wie folgt quantifiziert (mg/l): Wolfram 0,07 Zink 0,666 Phosphor 378 Cadmium 0,01 Kobalt 0,008 Nickel 0,022 Barium 0,032 Eisen 0,022 Mangan 0,039 Chrom 0,060 Magnesium 7,46 Aluminium 0,136 Calcium 5,97 Kupfer 0,087 Titan 0,01 Strontium 0,060 Natrium 9600 Kalium 483 Chlorid 15400 Ammoniak 218 Vanadium 1 ppm

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Zubereitungen die Freisetzung und/oder Produktion von Tumornecrosefaktor beeinflussen. Von den Zubereitungen wurde gezeigt, dass sie keine signifikante Toxizität und nur vorübergehende nachteilige Nebenwirkungen (z. B. leichtes Fieber, Polydipsie, Schmerz an der Injektionsstelle) verursachen. Von ihnen wurde auch gefunden, dass sie keine nachweisbaren Komponenten hohen Molekulargewichts (d. h. über circa 5.000 Dalton) enthalten, welche nachteilige Immunreaktionen verursachen können. Die Zubereitungen können als Mittel zur Prophylaxe und Behandlung von Zuständen verwendet werden, die eine Modifikation der Immunantwort erfordern, insbesondere infektiösen Erkrankungen, Neoplasien und Autoimmunerkrankungen. Sie können besonders nützlich in der Behandlung von verschiedenen Formen von Neoplasien, wie z. B. Leukämien, Lymphomen, Melanomen, Adenomen, Sarcomen und Carcinomen, sein. Insbesondere kann die Zubereitung nützlich zur Behandlung des malignen Melanoms, Bauchspeicheldrüsenkrebs, cervico-uterinem Krebs, Krebs der Niere, des Magens, der Lunge, des Rektums, der Brust, des Darms, des Magens, der Leber, der Schilddrüse, des Halses, der Cervix, der Speicheldrüse, des Beins, der Zunge, der Lippe, des Gallengangs, des Beckens, des Mediastinum, der Harnröhre, der Bronchien, der Blase, des Ösophagus und des Kolons, und Kaposi-Sarcom sein, das eine Form von Krebs ist, die mit HIV-infizierten Patienten mit erworbener Immunabwehrschwäche (AIDS) verbunden ist. Die Zubereitung kann auch für andere anti-proliferative Zustände verwendet werden, wie z. B. Arteriosklerose und virale Infektionen, insbesondere AIDS. Sie kann auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet werden, einschließlich Multipler Sklerose, rheumatischer Arthritis, systemischem Lupus erythematosus, Diabetes Typ I, Myasthenia gravis, Addison-Erkrankung, autoimmuner hämolytischer Anämie, Morbus Crohn, Goodpasture-Syndrom, Basedowsche Erkrankung, Hashimoto-Thyroiditis, idiopathische thrombocytopenische Purpura, perniziöse Anämie, poststreptokokkale Glomerulonephritis, Psoriasis, Skleroderma, Sjogren-Syndrom, spontane Unfruchtbarkeit und Pemphigus vulgaris.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können unter Verwendung von gebräuchlichen Verfahren in pharmazeutische Mittel umgewandelt werden. Die pharmazeutischen Mittel enthalten die erfindungsgemäße Zubereitung entweder alleine oder zusammen mit anderen aktiven Substanzen. Solche pharmazeutische Mittel können für die orale, topikale, rektale, parenterale, lokale, Inhalations- oder intrazerebrale Verwendung vorliegen. Sie können daher in fester oder halbfester Form, z. B. als Pillen, Tabletten, Cremes, Gelatinekapseln, Kapseln, Suppositorien, Weichgelatinekapseln, Gele, Membranen oder Röhrchen vorliegen. Für parenterale oder intrazerebrale Verwendungen können die Formen für intramuskuläre oder subkutane Verabreichung verwendet werden oder Formen für die Infusion oder intravenöse oder intrazerebrale Injektion können verwendet werden und daher können sie als Lösungen der Zubereitungen oder als Pulver der aktiven Zubereitungen zubereitet sein, um mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen oder Lösungsmitteln, die für die vorgenannten Verwendungen geeignet sind und mit einer Osmolarität, die mit den physiologischen Flüssigkeiten zusammenpasst, gemischt werden. Für die lokale Verwendung können solche Zubereitungen in Form von Cremes oder Salben für die topische Verwendung oder in Form von Sprays in Betracht gezogen werden; für Inhalationsverwendungen können Zubereitungen in Form von Sprays, z. B. Nasensprays, in Erwägung gezogen werden. Vorzugsweise wird die Zubereitung intramuskulär verabreicht.

Die pharmazeutischen Zubereitungen können durch per se bekannte Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch geeigneter Zubereitungen, die dem Patienten verabreicht werden können, hergestellt werden, und zwar so, dass eine wirksame Menge der aktiven Substanz in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger kombiniert wird. Geeignete Träger sind zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences (Nack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985).

Auf dieser Basis schließen pharmazeutische Mittel, wenn auch nicht ausschließlich, die erfindungsgemäße Zubereitung, gegebenenfalls in Verbindung mit ein oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Trägern oder Verdünnern, ein und können in einer gepufferten Lösung mit einem geeigneten pH und iso-osmotisch mit physiologischen Flüssigkeiten enthalten sein.

Die Zubereitungen werden als therapeutische Mittel indiziert, entweder allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln oder anderen Formen der Behandlung. Zum Beispiel kann im Falle eines malignen Tumors die vorliegende Behandlung einen Tumor hervorbringen, der zur chirurgischen Entfernung geeignet ist, wobei er vorher nicht operabel war. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen und Mittel sind zur Verabreichung an Menschen oder Tiere beabsichtigt.

Im Allgemeinen wird ein Dosisbereich der Zubereitung für die Verabreichung in der Humanmedizin von täglich circa 0,01 bis 20 mg/kg, vorzugsweise von circa 0,1 bis 10 mg/kg, am meisten bevorzugt 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Im Falle der intravenösen Verabreichung beträgt die Dosierung täglich circa 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht und im Falle der oralen Verabreichung beträgt die Dosierung täglich circa 1 bis 5 mg/kg Körpergewicht. Wo die konzentrierte Zubereitung verwendet wird, kann circa die Hälfte der oben genannten Dosierungen verwendet werden. Zum Beispiel kann für die intramuskuläre Verabreichung eine Dosis von täglich circa 0,2 bis 1,0 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise täglich 0,275–0,75 mg/kg Körpergewicht, verwendet werden.

Von praktischen Ärzten wird verstanden werden, dass es notwendig sein kann, von den oben genannten Mengen abzuweichen und insbesondere dieses zu tun als Funktion des Körpergewichts und der Verfassung des zu behandelnden Tieres, der jeweiligen zu behandelnden Erkrankung, der An des Verabreichungsweges und der gewünschten Therapie. Außerdem können der Typ des Tiers und sein individuelles Verhalten gegenüber der Medizin oder der An ihrer Formulierung und die Zeit oder das Intervall, bei welchem sie verabreicht wird, die Verwendung von anderen als den genannten Mengen anzeigen. So kann es in einigen Fällen ausreichen, mit weniger als den oben genannten Minimalmengen auszukommen, wogegen in anderen Fällen über die genannte obere Grenze hinausgegangen werden muss. Wo bedeutende Mengen verabreicht werden, kann es auch ratsam sein, diese in mehrere Verabreichungen über die Dauer des Tages aufzuteilen.

Folglich umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Immunmodulator-Zubereitung umfassend (a) Mischen von Galle aus einem Tier mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel zur Erzeugung einer Galle/Lösungsmittel-Lösung; (b) Isolieren einer wässrigen Lösung im Wesentlichen frei von Lösungsmittel aus der Galle/Lösungsmittel-Lösung; und (c) Entfernen der Gallenpigmente aus der im Wesentlichen lösungsmittelfreien Lösung, um eine farblose Flüssigkeit zu erhalten, wobei vorzugsweise das wasserlösliche Lösungsmittel ein Alkohol ist und die Galle aus dem Tier mit einem gleichen Volumen von Alkohol gemischt wird. Bevorzugte Aspekte des vorgenannten Verfahrens umfassen weiterhin auch die Konzentrierung der farblosen Flüssigkeit auf circa ein Achtel oder ein Zehntel des ursprünglichen Volumens der Galle/Lösungsmittellösung. Offensichtlich bilden Zubereitungen, die mittels des obigen Verfahrens gebildet werden, einen bevorzugten Aspekt der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Zubereitung für die Verwendung als ein Immunmodulator, umfassend mindestens eine Komponente mit einem Molekulargewicht von weniger als circa 3000 Dalton, die keine Cytotoxizität gegenüber menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen zeigt und mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:

• (a) sie kann Monozyten und/oder Makrophagen in vitro (und gegebenenfalls in vivo) dazu stimulieren, ein oder mehrere Cytokine freizusetzen und/oder zu produzieren;
• (b) sie kann Monozyten und/oder Makrophagen dazu stimulieren, Tumornecrosefaktor in vitro oder in vivo freizusetzen oder zu erzeugen; und

Die Zubereitung kann eine antiproliferative Wirkung in einer malignen Maushybridom-Zelllinie haben. Solche Zubereitungen können aus der Galle von Tieren, vorzugsweise von Rindern, oder von einer anderen Quelle erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Zubereitung stimuliert die Zubereitung die Tumornecrosefaktor-Produktion in vitro oder in vivo, und am meisten bevorzugt in Menschen, in der Abwesenheit von exogenem IL-1&agr;, IL-1&bgr;, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF und IFN-gamma.

Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung haben auch Komponenten, die durch Säulenchromatographie charakterisiert werden können, indem die Zubereitung zum Erhalt eines festen Rückstands getrocknet wird, und 2 Gramm dieses Rückstands in 20 ml einer 10%-igen konzentrierten Lösung von Ammoniumhydroxid in Methanol gelöst werden und nachdem jegliches unlösliches Material entfernt wurde, diese einer Säulenchromatographie in einer Methanolsäule mit Dimensionen von 5 cm × 12,5 cm und enthaltend 102 g eines 60 A Flash-Silikagels, betrieben bei einem Druck von 10 Pfund pro Quadratinch und einer Fließgeschwindigkeit von 11 ml/min mit einer 10% konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung in einer Methanollösungsmittel-Lösung unterzogen werden, wobei die Komponente aus der Säule in einer Fraktion eluiert wird, die entnommen wird, wenn die Gesamtelution der Säule sich zwischen circa 180 und circa 220 ml, zwischen circa 220 ml und circa 260 ml oder zwischen circa 260 ml und circa 300 ml befindet.

Die Charakterisierung der Komponenten kann auch mit einer Ionenaustauscherchromatographie erreicht werden, indem, wenn 10 ml dieser Zubereitung einer Ionenaustauscherchromatographie in einer Säule enthaltend Bio-Rad AG-1 Harz in Hydroxidform in einer ausreichenden Menge, um im Wesentlichen alle in diesen 10 ml dieser Zubereitung vorhandenen Anionen zu binden, unterzogen werden, diese Komponente von der Säule unter Anwendung eines Stufengradienten eines Ammoniumbikarbonatpuffers bei einer Pufferkonzentration von circa 0,5 M bis circa 1,5 M, vorzugsweise bei einer Pufferkonzentration von circa 1,0 M bis circa 1,5 M, und am meisten bevorzugt bei einer Pufferkonzentration von circa 1,5 M, eluiert wird.

Umkehrphasen-(C18)-HPLC kann auch zur Charakterisierung von Komponenten verwendet werden, indem, wenn die Zubereitung lyophilisiert und in 0,1% TFA in Wasser rekonstituiert wird und anschließend der Umkehrphasen-(C18)-HPLC in einer Phenomenex WP60009-C18-Säule mit Dimensionen von 250 × 4,6 mm unterworfen wird, wobei ein erster Puffer von 0,1% TFA in Wasser für etwa 10 Minuten durch die Säule läuft, anschließend ein linearer Gradient von 0 bis 80% eines zweiten Puffers von 0,1% TFA in Acetonnitril für etwa 55 Minuten laufen gelassen wird, gefolgt von einer 80%-igen Lösung des zweiten Puffers für etwa 5 Minuten und einem 80%–0% Gradienten des zweiten Puffers für etwa 5 Minuten und wobei die Fließgeschwindigkeit 1 ml/min beträgt und die Kapazität der Säule und der Puffer nicht überschritten wird, die Komponente aus der Säule bei einer Zeit von circa 2,4 Minuten bis circa 3,4 Minuten, nach Auftrag der rekonstituierten Zubereitung auf die Säule eluiert wird. Die Charakterisierung der Komponenten der Zubereitung kann auch durch ein zusätzliches Umkehrphasen-HPLC-Verfahren erreicht werden, indem, wenn diese Zubereitung dialysiert oder in einem ersten Puffer von 0,1% TFA in Wasser gelöst wird und anschließend der Umkehrphasen-(C18)-HPLC in einer Bio-Rad Hi-Pore RP 318 (C18) Säule mit Dimensionen von 250 × 4,6 mm unterworfen wird, wobei der erste Puffer für etwa 10 Minuten durch die Säule läuft und anschließend ein linearer Gradient aus 0-80% eines zweiten Puffers von 0,1% TFA in Acetonitril für etwa 55 Minuten laufen gelassen wird, gefolgt von einer 80%-igen Lösung des zweiten Puffers für etwa 5 Minuten und einem 80–0% Gradienten des zweiten Puffers für etwa fünf Minuten, und wobei die Fließgeschwindigkeit 1 ml/min beträgt und die Kapazität der Säule und der Puffer nicht überschritten wird, diese Komponente von der Säule bei einer Zeit von circa 2 Minuten bis circa 21,4 Minuten oder einer Zeit von circa 21,4 Minuten bis circa 25,6 Minuten eluiert wird, nachdem die dialysierte Zubereitung auf die Säule aufgetragen wurde.

Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können auch durch TLC charakterisiert werden, indem, wenn die Zubereitung einer Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten in 10% konzentriertem Ammoniumhydroxid in Methanol unterworfen wird und mit einem Ninhydrin-Spray sichtbar gemacht wird, eine positive Reaktion mit dem Ninhydrin bei einem R_f-Wert von circa 0,80 bis circa 0,90 auftritt.

Im Lichte dieser Charakterisierung zieht die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Stimulieren der Freisetzung und/oder Produktion des Tumornecrosefaktors im Menschen in Betracht, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge einer Zubereitung umfasst, die mindestens eine der folgenden Verbindungen umfasst:

• (a) eine Verbindung der Formel
  wobei die Bindungen zwischen A-B, B-C und C-D Einfach- oder Doppelbindungen sein können und wobei X = H, OH, =O oder OSO₃H; und Y =
  wobei R ein Aminosäurerest ist;
• (b) eine Verbindung der Formel
  wobei R¹, R² und R³H, COR⁴, CH=CH-R⁵, X, P(O)(OH)O- oder -S(O)₂O- sind;
  
  X Cholin, Ethanolamin, N-alkylierte Ethanolamine, Serin, Inositol, Zucker mit freien Hydroxylen, Aminozucker, sulfonierte Zucker oder Sialinsäuren ist; und
  
  R⁴ eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffkette von circa C₁ bis C₃₀, oder oxidierte und hydroxylierte Analoga hiervon ist; und
  
  R⁵ eine Alkylgruppe oder oxidierte oder hydroxylierte Analoga hiervon ist;
• (c) ein Mucinhydrolyseprodukt oder ein Proteoglycanhydrolyseprodukt; oder
• (d) ein fettlösliches Vitamin.

Vorzugsweise umfassen die Zubereitungen des erfinderischen Verfahrens mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taurocholsäure und ihren sulfatierten Derivaten; Glycocholsäure und ihren sulfatierten Derivaten; Sphingosin; einem Diacylglycerin; Lecithin, einem Oligosaccharid mit weniger als 10 Saccharideinheiten in der Länge, wobei dieses Oligosaccharid umfasst wird von Sialinsäure, Fucose, Hexosaminen oder sulfatierten Hexosaminen; Vitamin A; Retinolsäurederivaten; Retinolderivaten; Taurin und Glutaminsäure und ihren Konjugaten. Die Zubereitung kann auch zusätzlich mindestens eine Verbindung umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ammoniak; primären Alkylaminen; sekundären Alkylaminen; tertiären Alkylaminen und einer Carbonsäure R⁶COH, wobei R⁶ ein C₁-C₃₀-Alkyl ist, das gesättigt oder ungesättigt ist, und oxidierten und/oder hydroxylierten Derivaten hiervon.

Die vorliegende Offenbarung bezieht auch die Stimulation der Freisetzung und/oder Produktion von TNF ein durch Verabreichung einer Zubereitung umfassend mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taurocholsäure und ihren sulfatierten Derivaten; Glycocholsäure und ihren sulfatierten Derivaten; Sphingosin; ein Diacylglycerin; Lecithin; einem Oligosaccharid mit weniger als 10 Saccharideinheiten in der Länge, wobei dieses Oligosaccharid umfasst wird von Sialinsäure, Fucose, Hexosaminen oder sulfatierten Hexosaminen; Vitamin A; Retinolsäurederivaten; Retinolderivaten; Taurin und Glutaminsäure und ihren Konjugaten.

Die vorliegende Erfindung stellt, wie beansprucht, auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zubereitung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der Zubereitung an einen Patienten, der an diesem Krebs leidet, zur Verfügung.

Auch bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bildend sind solche beanspruchten Zubereitungen, die umfassen (1) Micellen von Sphingosin oder Sphingosin komplexiert mit einem Salz, oder (2) Micellen von Retinolsäure oder ihren Derivaten, die mindestens eine der folgenden Eigenschaften besitzen:

• (a) sie kann Monozyten und/oder Makrophagen in vitro dazu stimulieren, ein oder mehrere Cytokine freizusetzen und/oder zu produzieren;
• (b) sie kann Monozyten und/oder Makrophagen dazu stimulieren, Tumornecrosefaktor in vitro oder in vivo freizusetzen oder zu erzeugen.

Die Zubereitungen können eine antiproliferative Wirkung in einer malignen Maushybridom-Zelllinie haben.

Die Micellen können auch ein Diacylglycerid oder Lecithin umfassen und können weiter ein Salz einer Gallensäure und eine Quelle für Ammonium- oder Alkylammoniumionen umfassen.

Schließlich schließen die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch beanspruchte Zubereitungen ein, umfassend (1) Sphingosin, ein Gallensäuresalz und eine Quelle für Ammonium- oder Alkylammoniumionen, (2) ein Gallensäuresalz, Sphingosin, ein Diacylglycerin, eine Quelle für Ammonium- oder Alkylammoniumionen und ein Retinolderivat, (3) ein Diacylglycerid, Lecithin und ein Gallensäuresalz oder (4) (a) ein Diacylglycerid, (b) Lecithin und (c) ein Mucinhydrolyseprodukt oder ein Proteoglycanhydrolyseprodukt, das mindestens eine der folgenden Eigenschaften besitzt:

• (a) es kann Monozyten und/oder Makrophagen in vitro dazu stimulieren, ein oder mehrere Cytokine freizusetzen und/oder zu produzieren;
• (b) es kann Monozyten und/oder Makrophagen dazu stimulieren, Tumornecrosefaktor in vitro oder in vivo freizusetzen oder zu erzeugen.

Wiederum können die Zubereitungen eine antiproliferative Wirkung in einer malignen Maushybridom-Zelllinie haben.

Die folgenden nicht-begrenzenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung erläuternd:

Galle aus Rindern wird aus gesunden, mindestens eineinhalb Jahre alten Herden gesammelt, die zur Verwendung als Lebensmittel bei einem amtlich zugelassenen und geprüften Schlachthaus geschlachtet worden waren. Die Gallenblasen werden aus den geschlachteten Tieren gesammelt, die beschaut wurden, und die Gallenblasen werden von den Lebern getrennt und durch einen Veterinär untersucht, um zu bestätigen, dass die Gallenblasen frei von Parasiten und Hinweisen auf Infektionen sind und so zur Verwendung als eine Gallequelle geeignet sind.

Gallenblasen, die diese Prüfung bestanden haben, werden mit einer Lösung von 70%-igem Ethanol abgewischt, um das Äußere zu desinfizieren, und eine Spritze wird eingeführt, um die Galle zu entfernen. Die entfernte Galle wird optisch von einem Veterinär in der Spritze geprüft, um sicherzustellen, dass sie kein Blut oder keinen Eiter enthält und auch sonst zufrieden stellend ist. Die als zufrieden stellend befundene Galle wird in eine Messflasche aus Braunglas enthaltend Ethylalkohol überführt. Die Galle ist eine grünliche Flüssigkeit, die im Wesentlichen frei von Blut und Eiter ist. Die Galle wird zu jeder Flasche bis zu einem auf der Flasche markierten Füllstand, dem doppelten Füllstand des vorhandenen Ethanols, zugeführt, um eine 50% Galle/Ethanol-Lösung zu ergeben. Die Galle/Ethanol-Lösung ist eine grünliche Flüssigkeit, die im Wesentlichen frei von Fremdstoff ist, in einer ungefähr 50%/50% Galle/Ethyl-Lösung. Sie zeigt sich auch positiv für Ethylalkohol USP XXII Teil B. Diese Flaschen werden mit dem Datum der Sammlung markiert, das als Chargennummer dient. Ein Minimum von fünfzig Tieren dient als Pool für jede Charge. Teile der Lebern, Milz und Lymphknoten werden auch aus den Tieren gesammelt, deren Galle den Pool bildete, und die Teile werden auf Gegenwart von Parasiten oder anderen Hinweisen auf Erkrankungen überprüft.

Das Galle/Alkohol-Gemisch wird dann bei 4200 UpM für mindestens 2½ Stunden bei 20 +/– 2°C zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird dekantiert und auf den pH und Ethanolgehalt geprüft. Die dekantierte Flüssigkeit wird dann einer Aktivkohlebehandlung unterzogen. Das behandelte Galle/Ethanol wird dann auf die optische Dichte („O.D.") und Leitfähigkeit hin kontrolliert. O.D.-Werte oder Leitfähigkeitswerte außerhalb annehmbarer Spezifikationen werden erfordern, dass die Galle/Ethanol-Lösung einer zusätzlichen Behandlung mit Aktivkohle zugeführt wird, um einen Messwert innerhalb der Spezifikationsgrenzen zu erreichen.

Nach der Aktivkohlebehandlung wird die Lösung durch einen Filter (z. B. unter Verwendung eines Filters mit einer 2,5 um Retention) gefiltert, der Alkohol wird abevaporiert (z. B. durch Erhitzen auf weniger als 85°C) und die Lösung wird auf ca. ein Achtel des ursprünglichen Galle/Ethanol-Lösungsvolumens aufkonzentriert. Die konzentrierte Lösung wird auf 20–25°C abgekühlt. Diese Lösung wird dann mit Ethylether gemischt und die Etherphase verworfen. Dieser Schritt kann einmal wiederholt werden. Die wässrige Phase wird erhitzt, um den rückständigen Ether zu entfernen (z. B. durch Erhitzen auf bis zu ca. 55 °C für ca. 10 Stunden) und weiter im Volumen auf ein Zehntel des ursprünglichen Galle/Ethanolvolumens durch Erhitzen auf ca. 80–85 °C reduziert. Die resultierende Zubereitung wird dann auf das Erscheinungsbild, die biologische Aktivität und den Ethanol- und Ethergehalt getestet. Die Zubereitung ist eine klare gelbliche Lösung, die im Wesentlichen frei von Fremdstoffen ist, und enthält nicht mehr als 10 ppm Ethanol und nicht mehr als 5 ppm Ether. In dem in Beispiel 4 beschriebenen Bioassay ist das nicht-proliferative Wachstum 18 +/– Einheiten/ml.

Die Identität und Reinheit werden unter Verwendung von Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Wirksamkeit wird unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen antiproliferativen Verfahrens untersucht.

Die anfänglichen Batches der erfindungsgemäßen Zubereitung wurden als eine nicht-gepufferte Flüssigkeit gefertigt. Nachfolgende Batches wurden als gepufferte Flüssigkeit gefertigt, hergestellt durch Einstellen des pHs der Zubereitung auf ca. 7,4 +/– 0,05 unter Verwendung einer Salzsäure-(1%)-Lösung und Natriumhydroxyd (1% Lösung) wie auch unter Verwendung von dibasischen und monobasischen Natriumposphatsalzen als Puffern. Die Reduktion der Gesamtkeimzahl wird in einem Dampfautoklaven bei 104 +/– 2 °C für 60 Minuten durchgeführt. Die Bulklösung wird in sterile 5 ml- oder 10 ml-Fläschchen abgefüllt und verdeckelt. Die gefüllten und verdeckelten Fläschchen werden 3 Sterilisationszyklen unterzogen, indem sie bei 104°C +/– 2°C für 60 Minuten gefolgt von einer Inkubation bei 35°C für 23 +/– 1 Stunden autoklaviert werden. Zwischen jedem Zyklus (Autoklavieren + Inkubation) werden Proben genommen und auf ihre Gesamtkeimzahl getestet. Nach dem letzten Zyklus werden die Fläschchen optisch gegen einen schwarzen und einen weißen Hintergrund geprüft, um jedwelche Partikel, die vorhanden sein können, nachzuweisen.

Nach der Überprüfung wird die Charge erprobt und auf ihre Übereinstimmung mit den Spezifikationen getestet. Die Tests schließen Identität, Sterilität, Pyrogenizität, Endotoxin, Bioassay, HPLC und allgemeine Sicherheit (siehe Tabelle 1) ein.

Eine Reihe der physikochemischen Eigenschaften der Zubereitung (Leitfähigkeit, Osmolarität und gesamte Feststoffe) sind in Tabelle 2 gezeigt. Genauer wurden die Testergebnisse für 3 gefertigte Batches einer in Übereinstimmung mit Beispiel 1 hergestellten Zubereitung ausgeführt. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse zeigen die Sterilität, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit des gefertigten Produkts. Es wird festgestellt, dass Ethylalkohol und Ethylether nur in prozessinternen Tests gemessen werden. Eine Zusammenfassung des Verfahrens zum Nachweis der biologischen Aktivität ist in Beispiel 4 zur Verfügung gestellt.

Physikalische und chemische Eigenschaften wie z. B. Leitfähigkeit, Osmolarität und gesamte Feststoffe sind mit einer Zubereitung von mehr als 99% Salz in Übereinstimmung. Weniger als 1% der Feststoffe in der Zubereitung ist organisches Material, es gibt keine Lipide, ungefähr die Hälfte sind Kohlenhydrate und der Rest Aminosäuren. Proteine und Peptide sind vorhanden. Die SDS-Gel-Elektrophorese bestätigte, dass mehr Peptide als Proteine in der Zubereitung sein könnten. Hohe Molekulargewichte wurden nicht nachgewiesen. Dies ist ein wichtiges Merkmal eines Peptidwirkstoffs, da von ihm nicht erwartet wird, dass er immunogen ist.

HPLC- und Bioassay-Testverfahren für die erfindungsgemäße Zubereitung wurden unter Verwendung von nicht-gepufferten Produkten entwickelt. Diese Tests wurden verwendet, um das Produkt als gepufferte Flüssigkeit und die konzentrierte Formulierung zu charakterisieren. Die unten beschriebenen HPLC-Ergebnisse zeigen an, dass das Produkt in allen Darstellungen das gleiche ist. Der Bioassay zeigt, dass die Aktivität der konzentrierten Zubereitung zweieinhalb Mal größer ist als die der Originalzubereitung. Daher wurde von dem Produkt, das in den Studien verwendet wurde, gezeigt, dass es äquivalent ist.

Die erfindungsgemäße Zubereitung hat ein beständig reproduzierbares Muster auf einer Umkehrphasen-HPLC, in der Peaks früh in der Ausschlussfraktion und bei ca. 27 und 32 Minuten zu sehen sind. Vor, zwischen und nach den hohen Peaks gibt es kleinere Peaks, die in ihrer Intensität variieren. Die HPLC-Messungen für drei verschiedene Chargen der konzentrierten erfindungsgemäßen Zubereitung sind in den 1 bis 3 gezeigt. RP-HPLC-Profile für die Batches B0211 ( 4), B0209 (5), B29/3006 (6) und B15/1606 (7) zeigen auch ein sehr reproduzierbares Muster.

Die RP-HPLC zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Zubereitung wurde wie folgt durchgeführt. Eine Bio-Rad Hi-Pore-RP-318-Schutzsäule (C₁₈), 4,6 × 30 mm (Bio-Rad) und eine Bio-Rad Hi-Pore-RP-318-(C₁₈)-Säule, 4,6 × 250 mm wurden verwendet. Die Proben wurden in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA Pierce) in H₂O (Puffer A) einer Dialyse unterzogen und auf die Säule aufgetragen. Puffer A wurde für 10 Minuten laufen gelassen, dann wurde ein linearer Gradient 0-80% von Puffer B (0,1% TFA in 100% Acetonitril) für 55 Minuten laufen gelassen. Am Ende dieser Zeit wurde 80% Puffer B für 5 Minuten und 80–0% Puffer B für 5 Minuten laufen gelassen. Die Fließgeschwindigkeit war 1,0 ml/min. Fraktionen von aufeinanderfolgenden Läufen wurden gesammelt und gepoolt und in einer Speedvac (Modell SVC 200H, Savant Instruments, Farmington, N.Y.) konzentriert.

Peaks aus der HPLC wurden für eine Protein-Sequenzierung vorgelegt. Die anfängliche Probe, der HPLC-Hauptpeak, bezeichnet als RP-HPLC-31.00 min, Batch 0210 in TFA/CH₃CN scheiterte bei der Erbringung von Daten, als er einer N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen wurde. Diese Ergebnisse können entweder als ein Mengenproblem oder eine N-terminale Blockierung interpretiert werden. Die Quantifizierung des Proteingehalts jener Fraktion durch Aminosäure-Analyse nach saurer Hydrolyse ergab, dass eine ausreichende Menge der Sequenzanalyse unterzogen worden sein sollte; dennoch wurde auf Grund der Zubereitung gedacht, dass die Probe kein Protein sein könnte und daher würde eine N-terminale Blockierung nicht das Problem sein. Die Proben zeigten die folgende Zusammensetzung: ca. 70% Glx (Glutamat/Glutamin) plus ca. 15% Glycin (Gly). Weiterhin ergab eine äquivalente Probe aus RP-HPLC ähnliche Ergebnisse: 68% Glx und 15% Gly (Tabelle 3). Weitere Charakterisierungen nicht-fraktionierten Materials plus einiger anderer Fraktionen ergaben das Folgende. Das Ausgangsmaterial (32 mg/ml) ergab ein Sequenzsignal, das ein Polyglutamat Peptid/Protein anzeigte, was mit den Daten der Aminosäure-Zusammensetzung übereinstimmend ist.

Die Analyse von einigen HPLC-Fraktionen (Tabelle 3) ergab, dass alle sehr reich an Glx (Glu/Gln) (28–70 Mol%) und Gly (10–44 Mol%) sind. Jede Fraktion zeigte dennoch echte Unterschiede in den relativen Mengen an den anderen Aminosäuren.

Die biologische Aktivität der Fraktionen der Zubereitung wurde erforscht. Von der biologischen Aktivität der Zubereitung wird geglaubt, dass sie den niedermolekulargewichtigen Komponenten (M.G. weniger als 3.000 Dalton) zuzuschreiben ist. Dies wurde durch ein Experiment bestimmt, in welchem vier Fraktionen der Zubereitung und eine unfraktionierte Zubereitung auf ihre biologische Aktivität getestet wurden. Die erste Fraktion enthielt Proteine und Peptide mit Molekulargewichten von weniger als 3.000 Dalton, wogegen die restlichen drei Fraktionen zusätzlich Proteine und Polypeptide höheren Molekulargewichts enthielten. Alle Fraktionen enthielten zusätzlich Proteine und Polypeptide höheren Molekulargewichts. Alle Fraktionen und unfraktionierten Zubereitungen zeigten die gleiche biologische Aktivität. Da alle Fraktionen so effektiv wie das unfraktionierte Produkt waren, und da der gemeinsame Nenner aller Fraktionen die Gegenwart der gleichen Konzentration der Moleküle mit weniger als 3.000 Dalton war, führte dies zu dem Schluss, dass die biologische Aktivität der Zubereitung auf den Komponenten mit Molekülgewichten von weniger als 3.000 Dalton beruht.

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Zubereitung auf die Proliferation von Kulturen vierer maligner Zelllinien (menschliche Lymphomzellen Daudi, ME-180 menschliche Cervixcarcinom-Zellen, T-24 menschliche Blasencarcinom-Zellen und Maushybridom-Zellen #6-1) wurde gemessen. Die erfindungsgemäße Zubereitung hatte eine antiproliferative Wirkung auf die Maushybridom-Zellen. Die Studien legen die Vermutung nahe, dass die inhibitorische Wirkung der Zubereitung in Maushybridom-Zellen eher antiproliferativ als zellzerstörend ist.

Ein auf der reproduzierbaren antiproliferativen Wirkung der erfindungsgemäßen Zubereitung basierender Bioassay wurde in einem Maushybridomzell-Modell entwickelt, um die Charakterisierung der Zubereitung zu erleichtern. Der Bioassay wird wie folgt ausgeführt. Die Osmolarität und der pH der Zubereitung werden so eingestellt, dass er mit dem Zellkulturmedium übereinstimmt, um die biologische Aktivität der Zubereitung von ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften zu trennen. Verdünnungsreihen der isotonischen Zubereitung von 1 5 bis 1 : 10.000 werden im Zellkulturmedium hergestellt. Hybridomzell-Proben werden spezifisch quantifiziert. Die Zellen werden unter Verwendung eines Hämocytometers in einer 100 &mgr;l-Probe gezählt. Die Zellen werden durch Zentrifugation konzentriert und dann auf eine Zellkonzentration von 1.000 Zellen/ml (das Doppelte der gewünschten Endkonzentration) durch Zugabe des geeigneten Volumens frischen Mediums eingestellt. Hybridomzell-Suspensionen (1 ml) gemischt mit den entsprechenden Verdünnungen der Zubereitung (1 ml) werden in 24 Wellplatten bei 37°C in einem Feuchtklima mit einem auf 6% kontrollierten CO₂ inkubiert. Nach 96 Stunden werden 100 &mgr;l X 3 aus einem jeden Well als Probe entnommen und in eine 96 Wellplatte platziert. (Eine Leerprobe von 100 &mgr;l Medium ohne Zellen ist eingeschlossen.) Die Zelldichte wird unter Verwendung eines PROMEGA CellTiter 96^TM-Kits bestimmt. Die Zellkonzentration wird durch Ablesen der Absorption bei 595 nm (650 nm als Referenz) gemessen und durch einen „ELISA-Plate-Reader" aufgezeichnet. Für jeden Test wird eine Standardkurve der Zellkonzentration erstellt. Die kultivierten Zellen in der Log-Phase des Wachstums werden als Probe entnommen, gezählt, konzentriert und in Verdünnungsreihen resuspendiert. Von jeder Verdünnung wurde eine Probe von 100 &mgr;l X 3 genommen und in eine 96 Wellplatte platziert. Die Standardkurve wird durch Auftragung der Zelldichte gegen die „Netto"-OD bei 595 nm nach Subtraktion der Leerprobe ohne Zellen und des ODs bei 650 nm erstellt. Die Zelldichten unbekannter Proben werden durch Interpolation bestimmt.

Um die biologische Aktivität zu errechnen, wird die Zelldichte als Prozent der Kontrolle (keine Zubereitung) gegen die Endverdünnung der Zubereitung (in Log und linearer Skalierung) aufgetragen und unter Verwendung des Spline-Kurven-Fit-Verfahrens eine Kurve durch die Punkte gefittet. Dann wird die Verdünnung der Zubereitung, die einer 50%-igen Inhibition der Zellproliferation entspricht, manuell bestimmt und direkt in EINHEITEN der Zubereitung umgerechnet. Per Definition inhibiert eine Einheit der Zubereitung die Proliferation von 1 ml Zellkultur der Zelllinie HYB #6-1, ausgesät mit 500 Zellen/ml, nach 96 Stunden bei 37°C und 6% CO₂ zu 50%. Der Mittelwert der Aktivität der erfindungsgemäßen Zubereitung in dem Bioassay beträgt 18,24 +/– 1,82 Einheiten/ml.

Von der erfindungsgemäßen Zubereitung wurde gezeigt, dass sie nicht toxisch auf normale T- und B-Lymphozyten in Kultur wirkt. Das Wachstum von menschlichen Lymphozyten wurde unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen in Gegenwart und Abwesenheit der Zubereitung untersucht. Standardkonzentrationen von Lymphozyten wurden in Wells enthaltend verschiedene Konzentrationen der Zubereitung inkubiert. Wenn normale menschliche T- und B-Lymphozyten mit der Zubereitung in ähnlichen Konzentrationen, wie die die klinisch verwendet werden, inkubiert wurden, gab es keine Nebenwirkungen, was durch Trypan-Blau-Ausschluss beurteilt wurde.

Die Wirkung der Zubereitung auf das Überleben von menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen wurde überprüft. In diesem Experiment wurden PBMN für 24 und 48 Stunden in Plastik-Mikrowellplatten mit verschiedenen Volumina der Zubereitung und Gewebekulturmedien inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurde die Zahl der überlebenden Zellen durch Ausschluss des Trypan-Blau-Farbstoffs geschätzt. Tabelle 4 zeigt, dass die Zahl der überlebenden Zellen nach 24 und wiederum nach 48 Stunden fiel; dennoch war die Zahl der überlebenden Zellen in Gegenwart und Abwesenheit der Zubereitung nicht verschieden. Darüber hinaus hatten die steigenden Volumina der Zubereitung keine Wirkung auf das Überleben (Tabelle 4). Daher zeigte die Zubereitung keine Cytotoxizität gegenüber menschlichen PBMN.

ELISA-Tests auf TNF-&agr;, IL-1&agr;, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF und IFN wurden mit der erfindungsgemäßen Zubereitung durchgeführt. Es wurde bestimmt, dass die erfindungsgemäße Zubereitung keine messbaren Spiegel an Cytokinen (TNF, IL-1 alpha, IL-1 Beta, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF und IFN gamma) enthielt (siehe Tabelle 5).

Physikalische, chemische und biologische Eigenschaften wurden für eine Reihe von Batches der erfindungsgemäßen Zubereitung, die gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, bestimmt. Zusätzlich wurde die chemische Zubereitung der Batches bestimmt und eine Aminosäure-Analyse der Batches durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6–8 gezeigt.

Untersuchungen haben gezeigt, dass die erfindungsgemäße Zubereitung normale Monozyten aktivieren wird, um Cytotoxizität gegenüber der Chang-Hepatom-Zelllinie zu zeigen, die verwendet wird, um die Monozyten-Toxizität zu messen, und dass die Monozoten und Makrophasen von Krebspatienten (Cervix- und Ovarkrebs) von der Zubereitung stimuliert wurden, ihre eigenen bestimmten Tumorzellen anzugreifen und zu zerstören.

Genauer wurde die Tumor-zerstörende Funktion der Monozyten in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zubereitung getestet und das grundsätzliche Arbeitsverfahren für diese Experimente ist unten umrissen.

Venöses Blut wird in heparinisierten Vacutainer-Röhrchen gesammelt. Das Blut wird 3 : 1 in Hanks ausbalanzierter Salzlösung (HBSS) verdünnt, auf ein Lymphozytenn-Trennmedium geschichtet und zentrifugiert, um eine Bande peripherer mononukleärer Blutzellen zu erhalten. Nach der Zentrifugation wird die mononukleäre Zellschicht aus der Grenzfläche gewonnen, zweifach im Medium gewaschen und die Monozyten durch Latex-Ingestion gezählt. Monozyten werden durch Anlagerung in 96 Wellplatten (für 2 Stunden bei 37°C gefolgt von zwei Waschzyklen) isoliert. Die adhärenten Zellen werden auf mehr als 90% Monozyten geschätzt. Die adhärente Zellen enthaltenden Wells werden über Nacht in Gegenwart der Zubereitung (11 : 10 Verdünnung), Granulozyten-Makrophagen-Stimulationsfaktor oder PMA inkubiert. Dann werden die Zellen gewaschen und über Nacht mit Tumorzellen inkubiert. Für Studien unter Verwendung einer Standardzelllinie werden ⁵¹CR-markierte Chang-Hepatom-Zellen verwendet, da diese Zelllinie insensitiv gegenüber natürlicher Killerzell-Cytotoxizität ist. Diese Hepatom-Zieltumorzellen werden zu den adhärenten Zell-Monolayern mit einem Effektor : Ziel-(E : T)-Zellverhältnis von 20 : 1 zugefügt. Dieses E : T-Verhältnis wird verwendet, da es gut in den Plateaubereich einer Kurve fällt, die mittels verschiedener E : T-Verhältnisse von 5 : 1 bis 30 : 1 hergestellt war. Nach 24 Stunden werden die Überstände gesammelt und die ⁵¹Cr-Freisetzung quantifiziert. Die spezifische Toxizität in Prozent wird kalkuliert als: % spezifische Freisetzung = (E-S)/(T-S) × 100 wobei E = CPM-Freisetzung aus den Zielzellen in Gegenwart der Effektorzellen;

S = CPM-Freisetzung aus den Zielzellen in Abwesenheit der Effektorzellen; T = CPM-Freisetzung aus den Zielzellen nach Behandlung mit 2% Natriumdodecylsulfat.

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde von der Zubereitung gefunden, dass sie bei Monozyten gesunder Spender Cytotoxizität gegenüber der Chang-Hepatom-Zelllinie zeigt. Anschließend wurde untersucht, ob Monozyten und Makrophagen aus Krebspatienten von der Zubereitung stimuliert werden konnten, ihre eigenen bestimmten Tumore anzugreifen und zu zerstören. Unter Verwendung von Protokollen, die ähnlich dem für die Standardzelllinie (Chang-Hepatom-Zellen) beschriebenen waren, wurden Monozyten und/oder peritoneale Makrophagen aus Krebspatienten isoliert. (Peritoneale Makrophagen wurden aus den Peritoneal-Flüssigkeiten isoliert, die zum Zeitpunkt der Laparoskopie gesammelt worden waren). Von der Zubereitung wurde gefunden, dass sie periphere Monozyten und peritoneale Makrophagen aus Patienten mit Cervixkrebs aktiviert, Cytotoxizität gegen die dem Patienten eigenen Tumorzellen zu produzieren. Diese Wirkung war vergleichbar oder besser als die, die durch Interferon oder Lipopolysaccharid produziert war. Von peritonealen Makrophagen aus einem Patienten mit Ovarkrebs wurde aufgefunden, dass sie durch die Zubereitung stimuliert wurden, die Ovartumor-Zellen in Kultur anzugreifen und zu zerstören.

Studien wurden durchgeführt, um die Wirkung der erfindungsgemäßen Zubereitung auf die Cytokin-Freisetzung aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMN) zu beurteilen. ELISA-Assays auf TNF-&agr;, IL-1&agr;, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF und IFN wurden durchgeführt.

Die folgenden Verfahren wurden in Studien verwendet, die in den Beispielen beschrieben sind.

In den TNF-Studien wurde Vollblut von fünf gesunden Subjekten in heparinisierte Vacutainer-Röhrchen gezapft. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNs) wurden durch Gradienten-Zentrifugation auf Ficoll-Hypaque (Pharmacia) isoliert. Die PBMN wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, gezählt und in RPMI 1640 Kulturmedium (Gibco Labs) mit einer Konzentration von 10⁶ Zellen/0,5 ml resuspendiert. Diese Zellen wurden in 24 Well-Flachboden-Gewebekulturplatten (Falcon, Becton Dickinson) kultiviert. 0,5 ml der PBMN-Suspension wurden zu jedem Well zugefügt, das 50 ng Lipopolysaccharid (LPS) (aus E.coli), 10 &mgr;l fetales Kälberserum und die entsprechenden Volumina der getesteten Zubereitung (0–300 &mgr;l) enthielt. Um die hyperosmolare Wirkung der Zubereitung zu neutralisieren, wurde destilliertes Wasser zu den Kulturwells mit einem Volumen, das 10% des Volumens der verwendeten Zubereitung entsprach, zugefügt. Das Gesamtvolumen wurde dann auf 1 ml/Well mit RPMI ausgeglichen. Als Kontrolle wurde PBS anstelle der Zubereitung verwendet. Die Zellen wurden für 2, 6, 24, 48 und 72 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO-₂ Inkubator kultiviert. Am Ende einer jeden Inkubationsphase wurden die Zellen geerntet und zellfreie Kulturflüssigkeiten durch Zentrifugation bei 9.000 UpM für 10 Minuten erhalten. Die Proben wurden dann bei –70°C gelagert, bis der ELISA für Cytokine durchgeführt wurde (innerhalb von zwei Wochen).

Die Proteinbestimmung der Zubereitung wurde unter Verwendung der Pierce-Micro-BCA-Protein-Bestimmungstechnik (Smith et al., Anal. Biochem. 1985, 150: 76–85) durchgeführt. 10 &mgr;l einer Probe der Zubereitung wurden auf 1 ml mit destilliertem Wasser ausgeglichen. Fünf Konzentrationen bovines Serumalbumin (0,150 &mgr;g/ml) wurden hergestellt, um als Standard verwendet zu werden. Als Leerprobe wurde 0,1 N NaOH verwendet. Zu all diesen Proben wurde ein Gemisch von BCA, 2% Bicinchoninsäure-Natriumsalz (Pierce), Kupfersulfat 4% und Microreagens A (NaCO₃, NaHCO₃, Na-Tartrat in 0,2 N NaOH) zugefügt. Die Probengemische wurden für eine Stunde bei 60°C inkubiert, abgekühlt und die resultierende Absorption bei 562 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers abgelesen. Die Menge des Proteins in der Testprobe wurde dann mit der aufgetragenen Standardkurve verglichen und die entsprechenden Berechnungen durchgeführt. Es wurde gefunden, dass die Proteinkonzentration der Zubereitung niedrig war und sie wurde auf 32 &mgr;g/ml geschätzt.

Die Cytokin-Synthese in den Überständen wurde nach Stimulieren der menschlichen PBMN mit der erfindungsgemäßen Zubereitung in einem Volumen von 200 und 300 ml/Well gemessen. Die anfänglichen Bereifungen der Zubereitungen zeigen keine stimulatorische Wirkung auf die Cytokin-Produktion (Tabelle 9). Wenn es irgendeine Wirkung gab, läge dies die Vermutung nahe, dass die Cytokin-Produktion unterhalb des konstitutiven Spiegels war, wenn PBMN mit Medium alleine inkubiert wurden.

Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die erfindungsgemäße Zubereitung die LPS-stimulierte Freisetzung beeinträchtigt. LPS wurde als ein positiver Stimulus verwendet und die Fähigkeit der Zubereitung, die LPS-stimulierte Freisetzung von Cytokinen zu beeinträchtigen, für verschiedene Cytokine (Tabelle 10) verglichen. Die Zubereitung inhibiert eindeutig IL-1 alpha, IL-1 beta und TNF. Die Wirkungen auf die anderen Cytokine IL-6, IL-8, IFN-gamma und GM-CSF waren nicht so ausgeprägt. Unter keinen Umständen erhöhten die getesteten Zubereitungen allerdings die Wirkung der LPS-stimulierten Freisetzung der Cytokine.

Die Wirkung verschiedener Volumina der erfindungsgemäßen Zubereitung bei der Inhibierung der LPS-stimulierten TNF-Freisetzung wurde untersucht. 8 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Kurve der Zubereitung, die die TNF-Freisetzung durch mit LPS stimulierte PBMN inhibiert. Zehn &mgr;l der Zubereitung inhibierten ca. 10% und erhöhten die Inhibition um fast 30% bei 100 &mgr;l der Zubereitung. Ein anderes Batch (B0201) der Zubereitung inhibierte die LPS-induzierte TNF-Produktion mit 200 &mgr;l um 45, mit 100 &mgr;l um 21 und mit 10 &mgr;l um 12 Prozent.

In ähnlicher Weise war die IL-1-beta-Produktion in einer dosisabhängigen Weise durch die Zubereitung inhibiert: 100, 25 und 10 &mgr;l der Zubereitung inhibierten jeweils um 16, 10 und 9 Prozent.

Verschiedene Batches der Zubereitung wurden auf ihre Wirkung auf die LPS-induzierte TNF-Freisetzung untersucht. Zusammenfassend wurde gefunden, dass Batches der Zubereitung, die auf die gleiche Weise und aus dem gleichen Tier produziert wurden, eine identische Wirkung induzierten. Veränderungen des Herstellungsverfahrens oder die Zubereitung aus verschiedenen Tierspezies hatten jedoch unterschiedliche Wirkungen. Die Batches B29/3006, B0213 (B = bovin) und C0203 (Ziege) induzierten eine starke TNF-Freisetzung, über der, die durch LPS alleine induziert wurde (Tabelle 11).

Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse mit den Batches B15/1606 (konzentrierte Zubereitung) und B27/2806, die moderat stimulatorisch waren.

Tabelle 13 zeigt, dass Batch 013/2109 (Schaf) minimal stimulatorisch war.

Tabelle 14 zeigt, dass Batch R0201 (Hai) bei den meisten Konzentrationen für die LPS-induzierte TNF-Produktion inhibitorisch war.

Anfänglich wurde von der Zubereitung gezeigt, dass sie die LPS-induzierte Freisetzung von TFN aus menschlichen PBMN beeinflusst. Daher wurde in einer nächsten Reihe von Experimenten die zeitliche Wirkung der Zubereitung auf die LPS-induzierte TNF-Freisetzung untersucht (Tabelle 15). LPS stimulierte die Freisetzung von TNF. Nach 2 Stunden war der Spiegel auf 697 pg/ml angewachsen und peakte nach 6 Stunden bei circa 2006 pg/ml. Bei 24, 48 und 72 Stunden fiel die Freisetzung von TNF schrittweise. Tatsächlich war bei 48 und 72 Stunden die TNF-Freisetzung gerade über dem Spiegel der konstitutiven Produktion. Im Gegensatz dazu zeigte Batch 0213 der Zubereitung, das für die TNF-Freisetzung stark stimulatorisch war, keine TNF-Freisetzung über der, die nach 2 und 6 Stunden durch LPS alleine produziert wurde. Während LPS eine Spitzenfreisetzung von TNF bei 6 Stunden induzierte, induzierte die Zubereitung in Verbindung mit LPS eine Spitzenfreisetzung bei 24 Stunden, einer Zeit, zu der die stimulatorische Wirkung von LPS bereits zu fallen begonnen hatte. Im Gegensatz zu LPS alleine, setzte die Zubereitung + LPS die Stimulation der TNF-Freisetzung bei 48 und 72 Stunden fort, obwohl die Menge des freigesetzten TNF schrittweise fiel (Tabelle 15). Folglich war Batch 0213 stimulatorisch für die TNF-Freisetzung. Batch B15/1606, das nur moderat stimulatorisch war, inhibierte die LPS-induzierte Freisetzung bei 2 und 6 Stunden. Bei 24 Stunden war B15/1606 in Kombination mit LPS für die TNF-Freisetzung leicht stimulatorisch. Bei 48 und 72 Stunden hatte B15/1606 in Kombination mit LPS eine leicht stimulatorische Wirkung auf die TNF-Freisetzung. Folglich hatte Batch B15/1606 eine biphasische Wirkung; früh inhibierte es die LPS-induzierte TNF-Freisetzung und hauptsächlich bei 24 Stunden hatte es in Kombination mit LPS eine leicht stimulatorische Wirkung auf die TNF-Freisetzung. Folglich hatte Batch B15/1606 eine biphasische Wirkung; früh inhibierte es die LPS-induzierte TNF-Freisetzung und hauptsächlich bei 24 Stunden verursachte es eine leichte zusätzliche Wirkung in Kombination mit LPS beim Induzieren der TNF-Freisetzung.

Batch R0201, das inhibitorisch für die LPS-induzierte Freisetzung von TNF war, war deutlich inhibitorisch für die LPS-induzierte TNF-Freisetzung bei 2, 6 und 24 Stunden. Bei 48 und 72 Stunden induzierte LPS eine minimale TNF-Freisetzung und Batch R0201 hatte minimale positive oder negative Wirkungen bei diesen Zeiten. Die direkte stimulatorische Wirkung von Batch B0203 wurde bei verschiedenen Volumina und dann bei verschiedenen Zeiten getestet.

Batch B0203 stimulierte bei circa 100 &mgr;l eine maximale TNF-Freisetzung (Tabelle 16). Die maximale Wirkung wurde bei 24 Stunden für ein Volumen von 200 &mgr;l beobachtet (Tabelle 17). Folglich war die Zubereitung in der Lage, die TNF-Freisetzung alleine zu stimulieren, das heißt in der Abwesenheit von LPS, und die Kurven für die TNF-Freisetzung waren ähnlich zu denen, in denen die Zubereitung und LPS kombiniert waren. Es scheint, dass die Zubereitung allein weniger stimulatorisch für die TNF-Freisetzung war als die zusätzliche Wirkung, die es hatte, wenn es mit LPS kombiniert wurde.

Zusammenfassend zeigen die experimentellen Ergebnisse, dass einige Batches der Zubereitung in der Lage sind, die TNF-Freisetzung zu inhibieren, wenn menschliche PBMN mit LPS stimuliert werden. Andere Batches haben biphasische Wirkungen, was die Vermutung nahelegt, dass sie partiell die LPS-induzierte TNF-Freisetzung inhibieren und dass sie als eine späte Wirkung die Fähigkeit besitzen, eine leichte TNF-Freisetzung zu induzieren. Eine dritte Zubereitung hatte keine inhibitorische Wirkung auf die LPS-induzierte Freisetzung von TNF; aber bei einem anderen Zeitpunkt als LPS war die Zubereitung in der Lage, menschliche PBMN zur Freisetzung von TNF zu stimulieren. Schließlich kann die erfindungsgemäße Zubereitung die Freisetzung und/oder Produktion von TNF, einem wichtigen Mediator der Antitumorantwort, modulieren. Eine Zusammenfassung der Daten ist in der 9 und in Tabelle 18 gezeigt.

Zusammenfassend zeigt dieses Beispiel Folgendes: Die Zubereitung hat eine TNF-&agr; freisetzende Aktivität und die TNF-&agr; freisetzende Aktivität steht nicht in Verbindung mit irgendeiner Kontamination mit Endotoxin. Ein Primen der Makrophagen verstärkt die Fähigkeit der Zubereitung, die Freisetzung von TNF-&agr; zu stimulieren. Die Hyperosmolarität der Zubereitung ist nicht verantwortlich für die TNF-&agr; freisetzende Aktivität. Die TNF-&agr; freisetzende Aktivität der Zubereitung kann zum Teil von anderen Komponenten getrennt werden. Die TNF-&agr; freisetzende Aktivität der Zubereitung bindet nicht oder kaum an C₁₈ RP-HPLC. Das meiste der Aktivität der Zubereitung eluiert früh aus der RP-HPLC. Weniger als 20% der Aktivität der Zubereitung wird aus Fraktionen gewonnen, die auf der RP-HPLC zurückgehalten werden und später eluieren. Die TNF-&agr; freisetzende Aktivität wird durch 80% Acetonitril, einer hohen Konzentration eines organischen Puffers, präzipitiert. Das präzipitierte Material zeigt, wenn es in wässerigem Puffer rekonstituiert und auf einer RP-HPLC analysiert wird, große Ähnlichkeit mit dem auf der RP-HPLC ausgeschlossenen Peak der Zubereitung. Es ist möglich, die aktive Komponente der Zubereitung zu trennen und in einer Fraktion zu konzentrieren, die ca. 30% des Originalmaterials ausmacht.

Um jede Möglichkeit einer Endotoxinwirkung der Zubereitung auszuschließen, wurden die Experimente mit Polymyxin durchgeführt, welches zu den Reaktanten zugefügt wurde. Polymyxin inhibiert die Wirkung von Endotoxin auf Leukozyten. Tabelle 19 zeigt, dass Polymyxin die LPS-induzierte Freisetzung von TNF-&agr; komplett inhibiert. In Abwesenheit von Polymyxin induziert LPS 517 pg/ml TNF-&agr;, wohingegen in Gegenwart von Polymyxin 11 pg/ml TNF-&agr; freigesetzt werden. Die Zubereitung setzt andererseits 1591 pg/ml TNF-&agr; in Gegenwart von Polymyxin frei. In Abwesenheit von Polymyxin zeigen LPS und die Zubereitung mehr als nur eine additive Wirkung der Stimulatoren, was die Vermutung nahe legt, dass die Zubereitung mit höherer Intensität wirkt, wenn Makrophagen geprimt werden.

10 zeigt das C₁₈ RP-HPLC-Profil der Zubereitung, Batch 0213 und den 5 einzelnen Fraktionen, die auf ihre TNF-Freisetzungsaktivität getestet wurden.

Anfänglich wurde die Wirkung von verschiedenen Fraktionen in Gegenwart von Polymyxin untersucht. Tabelle 20 zeigt, dass die früh eluierende Fraktion (2:05 bis 21:20 Minuten) aus der RP-HPLC die meiste der nachweisbaren TNF-freisetzenden Aktivität besaß. Diese Aktivität war aber nur ca. 50% der der Ausgangszubereitung. Die rechte Spalte von Tabelle 20 zeigt die Osmolarität der Proben. Batch B0213 war 369 und hoch. Fraktionen aus 21 Minuten und später hatten normale Osmolarität, wohingegen die erste Fraktion, die aktiv war, sogar hyperosmolarer war als das Ausgangsmaterial, was anzeigt, dass eine große Menge des Salzes der Zubereitung auch früh eluierte. Daher wurde, wie unten ausgeführt, untersucht, ob die Hyperosmolarität der Proben die TNF-&agr;-Freisetzung inhibierte oder erhöhte.

Tabelle 21 zeigt zusätzliche Tests an zwei Patienten mit den Fraktionen 1 (2:05-21:20) und 2 (21:20–25:32) der Zubereitung. Wiederum wurde die meiste der Aktivität in Fraktion 1 gewonnen, aber es gab eine gewisse Aktivität in Fraktion 2. Dennoch hatten die Fraktionen 1 und 2 nur circa 50% der Ausgangsaktivität der Zubereitung.

Um zu bestimmen, ob es irgendeine nichtspezifische Aktivität in den Fraktionen gab, wurde ein Lauf mit Leerproben durchgeführt und die gleichen Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und getestet. Die Leerfraktionen produzierten so gut wie keine TNF-Freisetzung. Dieses Ergebnis zeigt an, dass Fraktionen aus der RP-HPLC verwendet werden konnten, um auf TNF-&agr; freisetzende Aktivität ohne die Bedenken zu testen, dass die Säule oder die Puffer zur TNF-&agr; freisetzenden Aktivität betragen.

Als Nächstes wurden die Fraktionen der Zubereitung in Abwesenheit von Polymyxin getestet, um die primende Wirkung von LPS zu haben. Tabelle 2 zeigt, dass Batch B0213 eine deutliche Freisetzung von TNF-&agr; induziert. Es gab 5 Fraktionen der Zubereitung aus der RP-HPLC mit den wie angegebenen Elutionszeiten. Fraktion 1 hatte erneut die höchste TNF-&agr; freisetzende Aktivität. Mit der primenden Wirkung von LPS hatten aber die Fraktionen 2 bis 4 eine gewisse TNF-&agr; freisetzende Aktivität. Fraktion 2 (21:20–25:32) hatte circa 25% der Aktivität der Fraktion 1 und die doppelte Aktivität der späteren Fraktionen.

Während Tabelle 22 die Ergebnisse unter Verwendung von 200 &mgr;l Volumina zeigt, zeigt Tabelle 23 die Ergebnisse der Tests an zusätzlichen drei Patienten mit 100 &mgr;l der Zubereitung und 100 &mgr;l ihrer RP-HPLC-Fraktionen in Abwesenheit von Polymyxin. Obwohl die Freisetzung durch die Zubereitung niedriger ist als mit 200 &mgr;l der Zubereitung (Tabelle 22), sind die Ergebnisse ähnlich. Fraktion 1 enthält das Meiste der Aktivität bei einer gewissen Aktivität in den späteren Fraktionen 2 und 3.

Die erfindungsgemäße Zubereitung ist hyperosmolar. Die Wirkung der Hyperosmolarität der Zubereitung auf die TNF-&agr; freisetzende Aktivität wurde untersucht. Es wurde gefunden, dass die Zubereitung bei der Einstellung der Osmolarität sogar bis zu dem Punkt, an dem sie hypoosmolar war, weiterhin TNF-&agr; freisetzte.

Da das meiste der TNF freisetzenden Aktivität der Zubereitung nicht an die RP-HPLC gebunden hat, was durch ihre schnelle Eluierung bewiesen wurde, wurde beschlossen, eine Säule zu verwenden, die auf dem umgekehrten Prinzip der Umkehrphasenchromatographietrennung beruht, wo die Probe in einem hohen Gehalt von organischem Lösungsmittel ist und hydrophile Interaktion erlaubt. Diese Trennungstechnik wird für kleine polare Substanzen verwendet. Wenn die Zubereitung aber in 80% Acetonitril gebracht wurde, wurde ein Präzipitat gebildet. Folglich präzipitierte einiges des Gehalts der Zubereitung in einem hochorganischen Lösungsmittelpuffer. Das Präzipitat und die lösliche Fraktion wurden getrennt. Sowohl das Präzipitat als auch die lösliche Fraktion wurden durch Lyophilisation zur Trocknung gebracht. Das Präzipitat und die lösliche Fraktion wurden in wässerigen Lösungen rekonstituiert und sowohl durch RP-HPLC analysiert als auch auf die TNF-&agr; freisetzende Aktivität getestet. Tabelle 24 zeigt, dass das meiste der TNF-&agr; freisetzenden Aktivität in dem präzipitierten Material enthalten war.

Die RP-HPLC-Analyse von sowohl der präzipitierten (11) als auch der löslichen Fraktion (12) der Zubereitung zeigt, dass das Präzipitat hauptsächlich das in Fraktion 1 der RP-HPLC der Zubereitungen enthaltene Material ist ( 10) und das lösliche Material die anderen Fraktionen der RP-HPLC der Zubereitung enthält (10). So wurde auf zwei verschiedenen Wegen gezeigt, dass die Aktivität der Zubereitung in der Fraktion enthalten ist, die minimal durch RP-HPLC zurückgehalten wird. In der Tat hatte das Präzipitat die gleiche Aktivität wie die nicht präzipitierte Zubereitung, wenn mit 100 und 200 &mgr;l getestet wurde.

Nur das 200 &mgr;l Präzipitat hatte eine Osmolarität über der normalen. Folglich wurden das Präzipitat und die löslichen Fraktionen (Überstand) der Zubereitung durch RP-HPLC getrennt (11 und 12) und in zwei Fraktionen geteilt (siehe Profile der RP-HPLC). Fraktion 1 (2:00–21:10 min) war äquivalent mit der gleichen Fraktion 1 der Zubereitung, die durch RP-HPLC getrennt wurde, und Fraktion 2 war äquivalent mit den Fraktionen 2 bis 5 der Zubereitung, die durch RP-HPLC getrennt wurden. Die Isolate wurden dann auf ihre TNF-&agr; freisetzende Aktivität getestet. Tabelle 26 zeigt, dass für zwei Patienten weder das Präzipitat noch der Überstand nach RP-HPLC-Trennung irgendeine TNF-freisetzende Aktivität hatten. Die Ergebnisse für die anfänglichen zwei Patienten (Tabelle 25) legten aber die Möglichkeit nahe, dass das Präzipitat nicht im idealen Volumen getestet worden war. Folglich wurden die Fraktionen noch einmal an zwei zusätzlichen Patienten und bei einer niedrigeren Konzentration getestet. Tabelle 26 zeigt, dass bei 50 und 100 &mgr;l die Fraktion 1 des Präzipitats die meiste Aktivität hatte. Bei 50 &mgr;l setzte sie im Vergleich zu 50 ng LPS das Doppelte an TNF-&agr; frei. Eine geringere freisetzende Aktivität wurde aber auch in RP-HPLC-Fraktion 2 des Präzipitats gefunden, wie auch eine geringere Aktivität in den Fraktionen 1 und 2 der RP-HPLC des Überstands gefunden wurde.

Es wurde beobachtet, dass der Wechsel von RPMI 1640 zu Medium 199 in einer geringeren TNF-&agr;-Freisetzung resultierte, was in Medium 199 und RPMI 1640 beurteilt wurde (Tabelle 27). Diese Ergebnisse zeigen, dass LPD von 10 bis 200 ng viel wirksamer bei der Freisetzung von TNF-&agr; in RPMI 1640-Medium ist als in Medium 199. Vermutlich gibt die Zubereitung auch eine größere Freisetzung in RPMI 1640-Medium. Daher können Kultivierungsbedingungen den Grad der TNF-&agr;-Freisetzung beeinflussen.

Tabelle 28 zeigt die Osmolaritäten verschiedener Batches der Zubereitung. B0213 ist mäßig hoch mit 675 mOsm. B0222, von dem gezeigt wurde, dass es eine noch bessere TNF-freisetzende Aktivität hat als B0213, ist weniger hyperosmolar, 581 mOsm. Die Fraktionen B0226, BC11-05 und BC11-09 reichen von 540 bis 603 mOsm.

Wie in dem vorherigen Beispiel gezeigt, bildet mit 80% Acetonitril präzipitiertes Material eine erfindungsgemäße Zubereitung. Das präzipitierte Material und die unpräzipitierte (im Fortfolgenden Überstand genannt) Zubereitung wurden weiter getestet, um zu bestimmen, wo die TNF-freisetzende Aktivität sich befand.

Tabelle 29 zeigt, dass die TNF-freisetzende Komponente der Zubereitung durch 80% Acetonitril, ein organisches Lösungsmittel, präzipitiert wird. Während die gesamte Zubereitung bei 0,04 ml circa 15 pg/ml TNF freisetzte, setzten 0,05 ml der präzipitierten Batches der Zubereitung 58 (B0222), 0 (B0221) und 17 (B0213) pg/ml frei, was die Gewinnung der TNF-freisetzenden Komponente durch 80% Acetonitrilpräzipitation nahelegt. Die präzipitierte Zubereitung wurde in dem gleichen Volumen an Flüssigkeit, aus dem es präzipitiert worden war, rekonstuiert. Folglich kommen 0,1 ml Präzipitat aus 0,1 ml Gesamtzubereitung und entsprechen 0,1 ml Gesamtzubereitung.

Es ist interessant festzustellen, dass in früheren Studien im Allgemeinen zwischen 0,1 und 0,2 ml der Zubereitung verwendet wurden, um die TNF-Freisetzung zu stimulieren. Die Präzipitate von B0222, B0221 und B0213, die zu 0,1 und 0,2 ml rekonstituiert waren, setzten zwischen 205 und 821 pg/ml TNF frei. Bei 0,1 ml des Präzipitats setzten die Batches B0222, B0221 und B0213 zwischen 205 und 365 pg/ml TNF frei, eine sehr ähnliche Menge an TNF, was die Beständigkeit der TNF-freisetzenden Aktivität der drei verschiedenen Batches anzeigt.

An einer separaten Gruppe von Spenderleukozyten wurden die Überstände, die nach der Präzipitation der Zubereitung mit 80% Acetonitril übrig blieben, getestet. Während 0,04 ml der gesamten Batches der Zubereitung (B0222 und B0213) 175 bzw. 233 pg/ml TNF freisetzten, setzten 0,05 ml des Überstandes mit 42 bzw. 41 pg/ml circa 33% der Aktivität der gesamten Zubereitung frei. Leerproben, die in der gleichen Art mit 80% Acetonitril hergestellt wurden, hatten keine TNF-freisetzende Aktivität. Folglich war die TNF-freisetzende Aktivität in dem Präzipitat nicht das Ergebnis einiger Restsubstanzen im Puffer, der verwendet wurde, um das Präzipitat hervorzurufen.

Während in den zuvor beschriebenen Studien das Präzipitat und die Überstandsfraktionen an Leukozyten verschiedener Spender getestet wurden, wurde eine weitere Studie durchgeführt, in der zwei Fraktionen an Leukozyten des gleichen Spenders getestet wurden. Für zwei der getesteten Batches setzte die gesamte Zubereitung mit 0,04 ml zwischen 0 und 41 pg/ml TNF frei. Im Vergleich dazu setzte das Präzipitat der gleichen Batches der Zubereitung mit 0,05 ml 141 und 749 pg/ml TNF frei, wohingegen 0,05 ml der Überstandsfraktion zwischen 6 und 57 pg/ml TNF freisetzten. Folglich enthielt das Präzipitat viel der TNF-freisetzenden Aktivität. Die Überstandsfraktion hatte immer noch eine gewisse TNF-freisetzende Aktivität, aber viel weniger als das Präzipitat und nicht mehr als die gesamte Zubereitung.

Da von dem Präzipitat der Zubereitung gezeigt wurde, dass es viel der TNF-freisetzenden Aktivität besitzt, wurde das Profil des Präzipitats durch C₁₈ RP-HPLC untersucht. Die 18, 19 und 20 zeigen die RP-HPLC-Profile der gesamten Zubereitung, des Präzipitats bzw. des Überstandes. Das Profil des Präzipitats zeigt vornehmlich den früh eluierenden Peak der gesamten Zubereitung (19), wohingegen das Profil des Überstands (20) ähnlich mit dem der gesamten Zubereitung ist, außer, dass der frühe Peak weniger ausgeprägt ist.

In der nächsten Reihe von Experimenten wurde die Aktivität des Präzipitats und der Überstände nach ihrer Trennung durch C₁₈ RP-HPLC beurteilt. Das Präzipitat und der Überstand wurden als 2 Pools aus der RP-HPLC gesammelt: 2 bis 21 Min. und 21 bis 46 Min.. Frühere Studien von Fraktionen der gesamten Zubereitung, welche durch RP-HPLC getrennt worden waren, zeigten, dass die TNF-freisetzende Aktivität vornehmlich in der 2 bis 20 Min.-Fraktion eluiert. Tabelle 30 zeigt die Ergebnisse der Tests der gesamten Zubereitung und der RP-HPLC-Fraktionen des Präzipitats und des Überstands. In diesem bestimmten Experiment wurde nur 10 &mgr;l der gesamten Zubereitung verwendet und verursachte keine TNF-Freisetzung. Der Präzipitat-Pool aus 2 bis 21 Min. setzte TNF frei, wohingegen der 21 bis 46 Min. Pool dies nicht tat (Tabelle 30). Der Überstandspool aus 2 bis 21 Min. setzte ebenfalls TNF-Aktivität frei, wohingegen der 21 bis 46 Min. Pool minimale Mengen an TNF freisetzte (Tabelle 30). Folglich befindet sich sowohl für das Präzipitat als auch den Überstand die TNF-freisetzende Aktivität vornehmlich in der früh eluierenden Fraktion aus C₁₈ RP-HPLC.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die TNF-freisetzende Substanz im Präzipitat und Überstand wahrscheinlich nah verwandte Moleküle sind, wenn sie nicht identisch sind, mit dem einzigen Unterschied, wenn überhaupt, der vielleicht der Grad der Löslichkeit in 80% Acetonitril sein könnte.

In einem weiteren Experiment wurde die TNF-freisetzende Aktivität der zwei RP-HPLC-Pools des Präzipitats für drei Batches der Zubereitung getestet. Tabelle 31 zeigt wiederum, dass für die drei verschiedenen Batches (B0222, B0221 und B0213) die TNF-freisetzende Aktivität hauptsächlich in dem Pool 2 bis 21 Min. ist. Daher sind die verschiedenen Batches stimmig.

In einem weiteren Experiment wurde die Wirkung eines Waschens des Präzipitats mit 80% Acetonitril untersucht. Der Punkt des Experiments war zu beweisen, dass die TNF-freisetzende Aktivität nicht einfach eingeschlossen wird. Die gesamte Zubereitung, 0,04 ml, setzte 325 pg/ml TNF frei. Der Präzipitatspool von 2 bis 24 Min. bei 0,1 ml setzte 324 pg/ml TNF und bei 0,05 ml 3 pg/ml TNF frei. Der Pool von 24 Min. bis 46 Min. setzte kein TNF frei. Genauso setzte der Überstandspool von 2 bis 24 Min. bei 0,1 und 0,05 ml TNF frei, wohingegen der Pool von 24 bis 46 Min. eine gewisse, aber beträchtlich geringere TNF-freisetzende Aktivität auf RP-HPLC hatte.

Um sicher zu sein, dass das Handling der RP-HPLC-Isolate der Zubereitung nicht für das Vorhandensein der TNF-freisetzenden Aktivität verantwortlich war, wurden Proben in der gleichen Weise, aber ohne die Zubereitung hergestellt. Die RP-HPLC-Profile von PBS- und H₂O-Leerproben, ihrer Präzipitate und Überstände waren im Wesentlichen frei von jeglichen Peaks.

Unter Verwendung mononuklearer Zellen aus identischen Spendern wurden Proben an Leukozyten von den gleichen Spendern getestet. Die Gesamtzubereitung und das Präzipitat, welches von 2 bis 24 Min. eluierte, setzten TNF frei, wohingegen PBS, H₂O oder ihre Präzipitate, die auf RP-HPLC getrennt wurden, keine TNF-freisetzende Aktivität in dem Pool von 2 bis 23 Min. hatten. Daher bewirken die Präzipitate, die zwischen 2 und 24 Min. eluieren, eine spezifische TNF-Freisetzung.

Der Präzipitatspool der Zubereitung, der zwischen 24 und 46 Min. eluiert, setzte kein TNF frei. Die Kontrollen mit Wasser und PBS zeigten eine Freisetzung von 114 bzw. 40 pg/ml. Folglich gab es keine spezifische Freisetzung von TNF aus dem Präzipitatspool 24 bis 46 Min.

Der Pool der Überstandsfraktion 2 bis 24 Min. und 24 bis 46 Min. setzte 82 bzw. 68 pg/ml TNF frei. Die Pools der Wasser- und PBS-Leerproben aus der RP-HPLC setzten eine gewisse TNF-Aktivität frei. Der Wasser-Pool 2 bis 25 Min. und 25 bis 46 Min. setzte 149 bzw. 216 pg/ml TNF frei, und die PBS-Pools setzten 0 bzw. 126 pg/ml frei.

Folglich hatten sowohl die präzipitierte als auch die Überstandsfraktion TNF-freisetzende Aktivität. Die RP-HPLC-Trennung der TNF-freisetzenden Aktivität zeigte, dass beide früh aus der RP-HPLC eluierten, was die Vermutung nahe legt, dass die aktiven Komponenten physikalisch sehr ähnlich, wenn nicht identisch, sind.

Tabelle 32 stellt eine Zusammenfassung der Ergebnisse weiterer Tests für 80% Acetonitril-Präzipitate und -Überstände nach RP-HPLC-Trennung minus der Aktivität in ähnlich hergestellten Leerproben zur Verfügung.

Die Gesamtzubereitung setzt TNF, GM-CSF und IL-1&bgr; in vitro aus mononukleären Zellen bei 24 h frei. Das 80% Acetonitrilpräzipitat enthält die gleiche freisetzende Aktivität und das meiste eluiert in der frühen Fraktion aus der RP-HPLC. Die Überstandsfraktion behält freisetzende Aktivität bei und das meiste eluiert in der frühen Fraktion aus der RP-HPLC. Die Überstandsfraktion behält freisetzende Aktivität bei, aber sie eluiert ebenso in der früh eluierenden RP-HPLC-Fraktion für TNF und GM-CSF. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass wahrscheinlich die gleiche Komponente die drei Cytokine freisetzt. Für GM-CSF und IL-1&bgr; legt die Tatsache, dass eine gewisse freisetzende Aktivität in der späten Fraktion aus der RP-HPLC eluiert, die Vermutung nahe, dass es eine weitere Substanz in der Zubereitung geben könnte, die auf Monozyten wirken könnte, um GM-CSF und IL-1&bgr; freizusetzen.

Nachdem identifiziert wurde, dass TNF-, IL-1&bgr;- und GM-CSF-freisetzende Aktivität, zum Teil, durch 80% Acetonitril präzipitiert werden kann und viel dieser freisetzenden Aktivität früh aus der C₁₈ RP-HPLC eluiert, wurden die physikochemischen Eigenschaften der Präzipitatsfraktion studiert und mit denen der Gesamtzubereitung und der Überstandsfraktion der Zubereitung verglichen.

21 zeigt eine SDS-Gelelektrophorese der gesamten Zubereitung und Präzipitate und Überstände der Zubereitung. In allen drei Fällen läuft die Zubereitung in der Nähe der SDS-Front, was ein geringes Molekulargewicht anzeigt. Der kleinste verwendete Standard war 14.400 Dalton.

Die molekulare Größe der Zubereitung wurde durch Bestimmen seiner Elutionszeit aus einer Molekularsieb-HPLC-Säule untersucht. Die Elutionszeiten der gesamten Zubereitung, des Präzipitats und des Überstands wurden mit Standards verglichen. Alle drei eluierten später als Insulin, das bei 24,5 Min. eluierte. Noch einmal zeigt die physikochemische Analyse ein Mol.Gew. von weniger 2.400 Dalton an.

Die TNF-freisetzenden Komponenten eluieren früh. Folglich wurde eine Säule mit entgegen gesetzter Wirkung ausgewählt, eine hydrophile Säule in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels. Die idealen Eluierungsbedingungen für die Polyhydroxyethylsäule ist 80% Acetonitril. Einige der Substanzen in der Zubereitung präzipitierten aber, wie in dem vorherigen Beispiel angezeigt, bei dieser Konzentration. Folglich wurde die Zubereitung bei einer niedrigen Konzentration von Acetonitril analysiert, bei der die Säule hauptsächlich als eine Molekularsiebsäule fungiert. Die 22 und 23 zeigen das Profil des gesamten Überstands und Präzipitats. Das Deckblatt fasst die Elutionszeit für die verschiedenen Peaks zusammen. Die Elutionszeiten zeigen, dass die aktive Komponente der Zubereitung ein niedriges Molekulargewicht besitzt.

Zwei Proben wurden einer Proteinanalyse durch Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung vor und nach saurer Hydrolyse unterworfen: das Acetonitrilpräzipitat und der 2–20 Min. RP-HPLC-eluierte Pool des Präzipitats. Die zwei Proben waren bei Vergleich des Aminosäuregehalts vor und nach der sauren Hydrolyse sehr ähnlich. Es gibt aber dennoch signifikante Unterschiede zwischen der Aminosäure-Zusammensetzung (nach saurer Hydrolyse) und dem freien Aminosäuregehalt, was die Vermutung nahe legt, dass Peptidbindungen hydrolysiert wurden. Die Zusammensetzung der Proben war besonders, in der Hinsicht, dass sie sehr reich an Glycin plus Glutamat/Glutamin war.

Aus dem Vorangegangenen kann spekuliert werden, dass mindestens eine der aktiven Komponenten proteinös ist. Die Analyse ergibt potenziell signifikante Mengen unidentifizierter Ninhydrin-positiver Verbindungen (am wahrscheinlichsten Aminosäureverbindungen, aber andere Verbindungen können auch eine Antwort ergeben), die gegenüber saurer Hydrolyse stabil zu sein scheinen. Die Hauptaminosäuren pro 1000 Reste in der Probe sind Asx (Asparagin) 143, Thr (Threonin) 31, Glx (Glutamat) 381, Gly (Glycin) 187 und Ala (Alanin) 170.

Ein Vergleich wurde zwischen freien und freigesetzten (saure Hydrolyse) Aminosäuren angestellt. Dieser zeigt die folgenden Aminosäuren pro 1000 Reste: Asx (Asparagin) 51, Threonin 8,6, Serin 18, Glx (Glutamin) 375, Pro (Prolin) 17, Glycin (Gly) 429 und Alanin 86.

Das Verhältnis von frei/1000 ist wie folgt:

Es gab 5 nicht identifizierte (Ninhydrin-positive) Komponenten. Hochspekulative Zuordnungen sind Cysteinsäure, Glucosaminsäure und Sarcosin. Es könnte auch Methioninsulfoxid und Methioninsulfon sein. Die hauptsächliche nicht identifizierte Ninhydrin-Komponente scheint eine freie Komponente in der Probe zu sein.

Tabelle 33 zeigt, dass die erfindungsgemäße Zubereitung menschliche mononukleare Zellen in Kultur stimuliert, IL-1&bgr; freizusetzen und dass das 80% Acetonitrilpräzipitat der Zubereitung mehr als der verbleibende Überstand freisetzt. Während die Gesamtzubereitung die IL-8-Freisetzung nicht stimuliert, scheint die fraktionierte Zubereitung etwas IL-8 freizusetzen. Die in Tabelle 33 gezeigten Ergebnisse sind abzüglich der Freisetzung von IL-1&bgr; und IL-8 mit Scheinproben.

Die Zubereitung und ihr Präzipitat und Überstand wurden durch Ionenaustauscher-HPLC getrennt. Sowohl durch AX300-(Anionenaustauscher)-Chromatographie als auch durch CMX300-(Kationenaustauscher)-Chromatographie gab es keine signifikante Trennung der Komponenten. Hydrophobe Umkehrphasen-Chromatographie trennte die Peaks nicht.

Das Präzipitat wurde durch Kapillarelektrophorese analysiert. Bei hohem pH wurde ein W-absorbierender Peak bei 190 nm beobachtet, der aber komplett bei 200 nm verschwand. Es gab keine signifikanten Peaks bei 214 nm UV-Absorption.

Freie Aminosäuren werden nicht visualisiert, wenn sie nicht derivatisiert sind. Es wird angenommen, dass der W-Peak bei 190 nm wahrscheinlich ein Salz ist.

Die Zubereitung wurde auf ihre stimulatorische Aktivität in den folgenden 3 Indikatorsystemen evaluiert: 1) Stimulation der Lymphozyten-DNA-Synthese; 2) Induktion der Lymphozyten-medüerten cytotoxischen Funktion; und 3) Induktion der Monozyten/Makrophagen-medüerten cytotoxischen Funktion. Diese Tests wurden für den Screen ausgewählt, da sie die immunologischen Funktionen messen, von denen gezeigt wurde, dass sie mit verschiedenen klinischen Parametern in Patienten mit malignen Erkrankungen assoziiert sind. Diese Indikatoren der Immunfunktion können in Krebspatienten auch moduliert werden, die mit verschiedenen Mitteln, die die biologische Antwort modifizieren, wie z. B. Interferon oder Interleukin-2, behandelt werden. Die Ergebnisse der anfänglichen Screening-Verfahren sind unten dargestellt.

Ergebnisse: Im Gegensatz zum prototypischen Mitogen, PHA, stimuliert die Zubereitung Lymphozyten nicht, eine Blastogenese und Zellteilung durchzumachen.

Ergebnisse: Im Gegensatz zum prototypischen Stimulator der cytotoxischen Funktion von Lymphozyten, Interleukin-2, löst die Zubereitung keine Lymphozytencytotoxizität aus.

Ergebnisse: Die Zubereitung ist in der Lage, Monozyten des peripheren Bluts zu stimulieren, um eine Tumor-zerstörende Funktion in einer dosisabhängigen Weise zu exprimieren. Die Größenordnung der Stimulation ist vergleichbar mit der, die durch die prototypische Makrophagenaktivator-Kombination von &ggr;IFN + LPS ausgelöst wird. Es ist wichtig zu erkennen, dass die Wirkung der Zubereitung in diesen in-vitro-Tests keine Zugabe von Endotoxin wie im Falle irgendeines anderen Makrophagenaktivators benötigt. Wenn die Zubereitung von einer Endotoxinkontamination frei wäre, könnte ihre biologische Aktivität in diesem Test der Makrophagenaktivierung als biologisch signifikant angesehen werden.

Da die Screeningverfahrensschritte zeigten, dass die Zubereitung die Lymphozytenfunktionen nicht stimuliert, aber die Monozytenfunktionen stimulieren kann, zielten weitere Studien auf eine weitere Charakterisierung der Monozyten/Makrophagen-stimulatorischen Aktivitäten dieser Verbindung. Eine Zahl von Vergleichsstudien, die die Bestimmung der Dosiswirkungseigenschaften der Verbindung bei der Stimulierung der Monozyten/Makrophagen-Tumor-zerstörenden Funktion bezweckten, wurde durchgeführt wie auch ein Testen verschiedener Batches der Verbindung. Ein Hauptaugenmerk der Studien war, die Kapazität der Zubereitung zum Simulieren der Tumor-zerstörenden Funktion in Monozyten und Makrophagen aus verschiedenen anatomischen Stellen von Krebspatienten zu testen. Die zentrale Hypothese, die diese Studien leitete, ist, dass die therapeutische Wirksamkeit eines jeden biologischen Stimulators zu einem großen Teil von seiner Fähigkeit abhängt, eine Tumor-zerstörende Funktion in Umgebungen auszulösen, die eine maligne Erkrankung beinhalten. Das könnte durch direkte Stimulation der angesiedelten Immunzellen in Tumormikroumgebungen geschehen. Alternativ könnte dies durch Stimulation der zirkulierenden Immunzellen geschehen, wenn jene Zellen dann in der Lage wären, sich auf die Stellen der malignen Erkrankung auszurichten und in dieser Umgebung zu wirken. Diese Untersuchungen beruhten auf Folgendem: 1) Monozyten des peripheren Bluts aus Krebspatienten und Kontrollsubjekten; 2) alveolare Makrophagen aus Lungenkrebspatienten und Kontrollpatienten mit nicht-malignen Lungenerkrankungen; und 3) peritoneale Makrophagen aus Patienten mit gynäkologischen bösartigen Tumoren.

Diese Studien beruhen auf Monozyten des peripheren Bluts, um die stimulatorischen Aktivitäten verschiedener Dosen und verschiedener Batches der Zubereitung zu testen. Drei Batches der Zubereitung wurden zum Testen bereitgestellt. Diese wurden bezeichnet als Batch # 216, 219 und 222. Jedes Batch der Zubereitung wurde ohne Verdünnung (rein), in einer 1 : 10-Verdünnung und in einer 1 : 50-Verdünnung des Materials getestet. Die Ergebnisse sind grafisch in 24 dargestellt.

Erebgnisse: Batch #222 und 216 stimulieren die Tumor-zerstörende Funktion der Monozyten, Batch #219 tat es nicht. Es scheint, dass #222 in diesen vorläufigen Untersuchungen 216 überlegen war. Batch #222 scheint äquivalente Niveaus Tumor-zerstörender Funktion bei der unverdünnten (reinen) und der 1 : 10-Verdünnungskonzentration zu stimulieren, mit einer geringeren, aber noch nachweisbaren Aktivität bei der 1 : 50-Verdünnung. Batch #216 ergab die größte Stimulation der Tumor-zerstörenden Funktion bei der unverdünnten (reinen) Konzentration, mit weniger Aktivität bei der 1 : 10-Verdünnung und keiner nachweisbaren Aktivität bei der 1 : 50-Verdünnung. Wie oben ausgeführt, löste Batch #219 keine nachweisbare Tumor-zerstörende Funktion der Monozyten bei irgendeiner untersuchten Konzentration aus.

Tests wurden an 4 Monozytenproben peripheren Bluts aus Kontrollpatienten durchgeführt. Diese Tests verwendeten eine optimale stimulierende Konzentration der Zubereitung (1 : 10-Verdünnung von Batch #222) und eine optimale stimulierende Konzentration von &ggr;-IFN + LPS. Die Zielzellen in diesen Studien waren eine kultivierte, NK-insensitive Zelllinie, das Chang-Hepatom.

Ein Test wurde auch an 1 Monozytenprobe aus einem Patienten mit Cervixkrebs durchgeführt. Dieser Test war wichtig, da die dem Patienten eigenen Tumorzellen zur Verfügung standen, um als Zielzellen in dem Test verwendet zu werden. Wie zuvor wurde in diesem Test eine optimale stimulierende Konzentration der Zubereitung (1 : 10-Verdünnung von Batch #222) und eine optimale stimulierende Konzentration an &ggr;-IFN + LPS verwendet. Außerdem wurde das Effektor/Zielzell-Verhältnis auf 15/1 reduziert, um Patiententumorzellen zu sparen.

Ergebnisse: In Monozoten des peripheren Bluts aus Kontrollpatienten stimulierte die Zubereitung die Tumor-zerstörende Funktion der Monozoten gegen das Chang-Hepatom auf ein Niveau, das gleich oder größer war als das Niveau, das durch eine optimale stimulierende Konzentration von &ggr;-IFN + LPS ausgelöst wurde. In Monozyten des peripheren Bluts aus einem Patienten mit Cervixkrebs stimulierte die Zubereitung die Tumor-zerstörende Funktion gegen die dem Patienten eigenen Tumorzellen auf ein Niveau, das jenes um > 30% überstieg, das durch &ggr;-IFN + LPS ausgelöst wurde.

Diese Tests wurden an peritonealen Makrophagenproben durchgeführt, die aus den Lavage-Flüssigkeiten aus 1 Patienten mit Cervixkrebs und 1 Patienten mit Ovarkrebs isoliert wurden. Diese Tests wurden mit den patienteneigenen Tumorzellen als Zielzellen in dem Test verwendet. Wie zuvor wurden eine optimale stimulierende Konzentrationen der Zubereitung (1 : 10-Verdünnung von Batch #222) und eine optimale stimulierende Konzentration an &ggr;-IFN + LPS verglichen. Außerdem wurde das Effektor/Zielzell-Verhältnis auf 15/1 reduziert, um Patiententumorzellen zu sparen.

Ergebnisse: Diese Testergebnisse heben die Tatsache hervor, dass die lokale Tumorumgebung ein bestimmender Faktor der Antwort der Immunzellen auf immunologische Aktivatoren sein kann. In diesem Fall von Cervixkrebs gab es keinen pathologischen Hinweis auf eine maligne Erkrankung innerhalb der Peritonealhöhle und die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion gegen den autologen Tumor war mit &ggr;-IFN + LPS besser als mit der Zubereitung. In den Patienten mit Ovarkrebs war ein signifikanter Tumor in der Peritonealhöhle. Die Antwort auf &ggr;-IFN + LPS gegen den patienteneigenen Tumor war höchstens minimal, wohingegen die Antwort auf die Zubereitung größer war.

Diese Tests wurden an alveolaren Makrophagenproben durchgeführt, die aus bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten von einem Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und 3 Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen der Lunge isoliert waren. In diesen Tests wurde eine optimale stimulierende Konzentration der Zubereitung (1 : 10-Verdünnung von Batch #222) und eine optimale stimulierende Konzentration von &ggr;-IFN + LPS verwendet. Die Zielzellen in diesen Studien waren die Chang-Hepatomzellen und das Effektor/Zielzell-Verhältnis war 2011.

Ergebnis: Alveolarmakrophagen aus Lungenkrebspatienten werden in ihrer Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion in Antwort auf konventionelle Makrophagenaktivatoren wie z. B. &ggr;-IFN + LPS beeinträchtigt. Diese Ergebnisse sind übereinstimmend mit dieser Beobachtung; sie zeigen, dass die Tumor-zerstörende Funktion von Alveolarmakrophagen aus Lungenkrebspatienten im Vergleich zu Kontrollsubjekten stark reduziert ist. Sie zeigen auch, dass die Zubereitung die Tumor-zerstörende Funktion entweder in den Alveolarmakrophagen der Lungenkrebspatienten oder in den Alveolarmakrophagen der Kontrollsubjekte mit nicht-malignen Lungenerkrankungen nicht aktiviert.

Diese vorläufigen in-vitro-Tests mit der Zubereitung zeigen, dass es sich um einen Makrophagen-Aktivator handelt. Das zur Verfügung gestellte Material war in der Lage, die Tumor-zerstörende Aktivität in einem Standardcytotoxizitätstest sowohl gegen NK-insensitive Zelllinien als auch gegen frisch dissoziierte menschliche Tumorzellen auszulösen. Von der ausgelösten Aktivität wurde auch gefunden, dass sie konzentrationsabhängig in diesen Tests ist. Die Kapazität der Zubereitung bei der Aktivierung der Tumor-zerstörenden Funktion der Makrophagen in vitro ist vergleichbar mit derjenigen der besten Makrophagen-aktivierenden Kombination, die gegenwärtig vorhanden ist, nämlich &ggr;IFN + Endotoxin. Wie oben dargelegt würde die Kapazität der Zubereitung, die dieses Niveau an Tumor-zerstörender Funktion in Abwesenheit von Endotoxin auslösen kann, als biologisch bedeutend betrachtet werden, wenn das Material frei von einer Endotoxinkontamination wäre.

Wie für andere Makrophagenaktivatoren gefunden wurde, variiert die Aktivität der Zubereitung bei der Stimulierung der Tumor-zerstörenden Funktion der Makrophagen mit der Quelle der Makrophagen. Es erscheint, dass die Zubereitung ein exzellenter Aktivator von Monozyten des peripheren Blutes ist, der bei normalen Spendern mit &ggr;IFN + LPS äquivalent ist und möglicherweise bei Krebspatientenspendern &ggr;IFN + LPS überlegen ist. Die maligne Erkrankung hat in Abhängigkeit von dem verwendeten Aktivator einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion der Monozyten (Braun et al, 1991). Ein bestimmender Faktor der biologischen Aktivität von verschiedenen Makrophagenaktivatoren in Monozyten von Krebspatienten ist die Sensitivität des Aktivators gegenüber dem Arachidonsäuremetabolismus und der Sekretion von Prostaglandinen durch die Zelle. Hinsichtlich dieser anfänglichen Studien mit der Zubereitung scheint es, dass die Aktivität, die mit der Verbindung ausgelöst wird, nicht sensitiv gegenüber den inhibitorischen Wirkungen von Prostaglandinen ist. Wenn die Prostaglandininsensitivität definitiv für die Monozyten von Krebspatienten, die mit der Zubereitung stimuliert wurden, nachgewiesen werden kann, würde dies als therapeutisch wichtig angesehen werden, da die Wirksamkeit vieler anderer biologischer Aktivatoren durch Prostaglandine begrenzt wird. Vorläufige Studien mit 2 Einzelproben weisen darauf hin, dass die Zubereitung eine gute Aktivität in peritonealen Makrophagen haben könnte, insbesondere wenn die maligne Erkrankung in der Peritonealhöhle auftritt.

Diese vorläufigen Ergebnisse verdeutlichen auch das, was beim Vergleich der Kapazität verschiedener Aktivatoren bei der Stimulation Tumor-zerstörender Funktion in peritonealen Makrophagen von Patienten mit verschiedenen gynäkologischen bösartigen Tumoren gefunden wurde. In jenen Studien wurde gefunden, dass die Gegenwart einer malignen Erkrankung innerhalb der Peritonealhöhle die Ansprechbarkeit der peritonealen Makrophagen gegenüber spezifischen Aktivatoren beeinflusst. In Patienten mit Cervixkrebs ist eine maligne Erkrankung im Allgemeinen in der Peritonealhöhle nicht vorhanden, und daher ist die Antwort der angesiedelten Makrophagen auf &ggr;IFN + LPS normal. Wenn die Krankung in der Höhle vorhanden ist, wie dies bei Ovarkrebs der Fall ist, wird die Antwort auf &ggr;IFN + LPS aber unterdrückt. Dies steht, zum Teil, in Verbindung mit Veränderungen in dem Arachidonsäuremetabolismus der peritonealen Makrophagen, wenn die maligne Erkrankung vorhanden ist (Braun et al, 1993). Die Tatsache, dass die Zubereitung offensichtlich die Tumor-zerstörende Funktion in peritonealen Makrophagen aus Ovarkrebspatienten gegen die dem Patienten eigenen Tumorzellen aktivieren kann, könnte wiederum einen Mechanismus zur Aktivierung widerspiegeln, der unabhängig von dem Arachidonsäure-Stoffwechselweg ist.

Auf der anderen Seite aktiviert die Zubereitung eindeutig nicht alveolare Makrophagen dahingehend, Tumor-zerstörend zu werden, egal, ob die maligne Erkrankung in der Lunge vorhanden ist oder nicht. Von alveolaren Makrophagen aus Lungenkrebspatienten wurde gefunden, dass sie signifikant in ihrer Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion im Vergleich zu entweder Monozyten des peripheren Blutes aus dem gleichen Patienten oder zu alveolaren Kontrollmakrophagen aus Patienten mit nicht malignen Lungenerkrankungen inhibiert werden (Siziopikou et al., 1991). Daher ist das Fehlen der Aktivität der Zubereitung in diesem Fall nicht überraschend.

Die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion als Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung und andere Makrophagen-Aktivatoren wurde in Monozyten des peripheren Bluts und peritonealen Makrophagen aus Patienten mit gynäkologischen Erkrankungen untersucht. Genauer bestand die Patientenpopulation aus 7 Patienten, 3 mit gutartiger Erkrankung und 4 mit maligner Erkrankung (2 Ovarkrebse, 1 endometrialer Krebs und 1 Cervixkrebs). Die Proben wurden aus den Patienten zum Zeitpunkt des chirurgischen Eingriffs entnommen. Die Monozyten peripheren Bluts enthaltenden Präparationen wurden aus Blutproben unter Verwendung der Verfahrensschritte, wie in Braun et al. Cancer Immunol. Immunother 32: 55–61, 1990 ausgeführt, isoliert, und die peritoneale Makrophagen enthaltenden Präparationen wurden wie in Braun et al., Cancer Research 53: 3362, 1993 ausgeführt, isoliert. Die Tumorzellcytotoxizität als Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung (1 : 10-Verdünnung des Stock-Batches 222) und andere Aktivatoren, nämlich Gamma-Interferon (100 U/ml), Interleukin-12 (500 U/ml) und Monozyten-CSF (500 U/ml) wurde unter Verwendung des in Braun et al., Cancer Immunol. Immunother 32: 55–61, 1990 beschriebenen Monozytencytotoxizität-Assays bewertet.

Die in Tabelle 34 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäße Zubereitung die Tumor-zerstörende Funktion sowohl in Monozyten des peripheren Bluts als auch in peritonealen Makrophagen aus Patienten mit malignen und nicht malignen gynäkologischen Erkrankungen stimuliert. Die Tumorcytotoxizität, die durch die erfindungsgemäße Zubereitung ausgelöst wurde, ist gleich oder größer als die, die durch andere biologische Stimulatoren, die getestet wurden, ausgelöst wurde.

Die Wirkung von Indomethacin, einem Prostaglandinsyntheseinhibitor, auf die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion als Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung und andere Makrophagenaktivatoren in Monozyten des peripheren Bluts aus Krebspatienten wurde auch untersucht. Proben aus den Patienten mit maligner Erkrankung in Beispiel 14 wurden unter Verwendung des in Beispiel 14 beschriebenen Assaysystems getestet, mit der Ausnahme, dass Indomethacin (bis zu 5 ng/ml) gleichzeitig mit der erfindungsgemäßen Zubereitung, Interleukin-12 (500 U/ml) und Monozyten-CSF (500 U/ml) zugegeben wurde.

Die in Tabelle 35 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass Indomethacin die Cytotoxizität in Antwort auf IFNa, GM-CSF und N-CSF erhöht. Folglich wird die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion als Antwort auf IFN-&ggr;, GM-CSF und M-CSF durch eine Indomethacin-sensitive Funktion reguliert. Im Gegensatz dazu wird die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion in Antwort auf Phorbolester (PNA), IL-12 und die erfindungsgemäße Zubereitung nicht durch eine Indomethacin-sensitive Funktion reguliert, d.h. Indomethacin erhöhte die Cytotoxizität als Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung, IL-12 und PNA nicht.

Die Wirkung von Prostaglandin E₂ auf die Entwicklung der Tumor-zerstörenden Funktion in Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung in Gegenwart von Indomethacin wurde untersucht. Die Population der Subjekte bestand aus einem normalen und acht Patienten (einem Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs, zwei Patienten mit Kopf- oder Halstumoren, einem mit Endometriose und vier mit HIV). Präparationen enthaltend Monozyten peripheren Bluts wurden aus Blutproben der Patienten unter Verwendung der Verfahrensschritte, die in Braun et al., Cancer Immunol. Immunother 32: 55–61, 1990 ausgeführt sind, isoliert. Die Tumorzellcytotoxizität als Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung (1 : 10-Verdünnung des Stock-Batches 222) und Indomethacin (bis zu 5 ng/ml), mit und ohne PGE₂ (10⁸ M), wurde unter Verwendung des in Braun et al., Cancer Immunol. Immunother 32: 55–61, 1990 beschriebenen Monozytencytotoxizitätsassay beurteilt.

Die Ergebnisse in Tabelle 36 zeigen, dass 36 pathophysiologische Spiegel von PGE₂ (10⁸ M) bei der Unterdrückung des Niveaus der Tumor-zerstörenden Funktion versagten, welches sich als Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung entwickelte. Dies steht im Gegensatz zu der Kapazität von PGE₂, die Tumor-zerstörende Funktion in Monozyten, die mit &ggr;-Interferon stimuliert wurden, zu unterdrücken (Braun et al., Cancer Research 53: 3362, 1993).

Die Entwicklung einer Tumor-zerstörenden Funktion gegen autologe Tumorzellen in Monozyten, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung stimuliert wurden, wurde untersucht. Monozyten des peripheren Bluts enthaltende Präparationen wurden aus Blutproben aus 6 Patienten (drei Ovarkrebse, ein endometrialer Krebs, ein Cervixkrebs und ein HNO-Krebs) unter Verwendung der in Braun et al., 1990 ausgeführten Verfahrensschritte isoliert. Die Tumorzellcytotoxizität in Antwort auf die erfindungsgemäße Zubereitung (1 : 10-Verdünnung des Stock-Batches 222) und Indomethacin (bis zu 5 ng/ml), mit und ohne PGE (10⁸ N) wurde unter Verwendung des in Braun et al., 1990 beschriebenen Monozytencytotoxizitätsassays beurteilt, mit der Ausnahme, dass die Tumorzellen der Patienten anstelle der Chang-Hepatom-Zellen verwendet wurden. Die Tumorzellen der Patienten wurden mit Collagenase und DNAse behandelt, einzelne Zellpräparationen wurden hergestellt und die Zellen wurden wie in Braun et al., 1990 beschrieben markiert.

Die in Tabelle 37 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäße Zubereitung in der Lage ist, die dem Patienten eigenen Monozyten zur Abtötung des Tumors des Patienten zu aktivieren. Die erfindungsgemäße Zubereitung ist mindestens so wirksam wie die biologischen Standardaktivatoren, die gegenwärtig benutzt werden.

Die Ergebnisse der Experimente in den Beispielen 14 bis 17 weisen darauf hin, dass die erfindungsgemäße Zubereitung in der Lage ist, Monozyten zu aktivieren, ihre Tumor-zerstörende Funktion zu exprimieren, und dass sie mindestens so effektiv ist, wie andere Aktivatoren, die gegenwärtig in der klinischen Praxis verwendet werden; sie funktioniert in dem Blut mit peritonealen Makrophagen; und sie scheint nicht Gegenstand der inhibitorischen Wirkungen der Prostaglandine zu sein, was eine der Hauptformen der Immunsuppression im Patienten ist. Die experimentellen Daten unterstützen den Nutzen der Zubereitung in der Behandlung von peritonealen und gynäkologisch bösartigen Tumoren.

Toxizitätsstudien wurden mit einer Auswahl verschiedener Tierspezies durchgeführt. Die Studien sind in Tabelle 38 zusammengefasst. Alle Tiere wurden auf der Basis täglicher klinischer Beobachtung beurteilt, während sie danach die Injektionen an den Tagen 14, 21 und 30 erhielten. Nebenwirkungen wurden während der Dauer, in der die Injektionen verabreicht wurden, oder der darauf folgenden Zeit (ein Monat für alle Spezies, mit Ausnahme der Hunde, die über 4 Monate beobachtet wurden) nicht bemerkt.

Hämatologische Daten gesammelt jeden dritten Tag für die ersten 30 Tage und danach ein Mal im Monat.

Eine Toxizitätsstudie wurde durchgeführt, um die Wirkung einer einzigen großen intramuskulären Dosis der Zubereitung zu bestimmen. 13 Ratten erhielten eine einzelne intramuskuläre Dosis von 5 ml/kg der Zubereitung. 3 Ratten wurden für 7 Tage beobachtet. 10 Ratten wurden für 14 Tage beobachtet, gefolgt von Tötung und Obduktion. Keine Symptome einer Cytotoxizität wurden in jeder der Gruppen beobachtet und keine krassen pathologischen Befunde wurden bei den Tieren beobachtet, die einer Obduktion unterzogen wurden. Basierend auf diesen Beobachtungen, wurde die LD₅₀ für die intramuskuläre Verabreichung der Zubereitung als mehr als 5 ml/kg bestimmt. Tabelle 39 fasst diese Ergebnisse zusammen.

In einer vom „Ontario Veterinary College" durchgeführten Studie wurde die Zubereitung an zwei gemischtrassige Hunde verabreicht. Das Protokoll ist in Tabelle 40 zusammengefasst. In jedem dieser Fälle wurde eine Dosis in das rechte Bein gegeben und die zweite Dosis 7 Tage später in das linke Hinterbein gegeben. Beide Hunde wurden 14 Tage lang nach der ersten Injektion beobachtet. Appetit, Aktivität, Temperatur, Pulsfrequenz, Atmungsfrequenz wurden zwei Mal täglich während der gesamten Studie beobachtet. Routinemäßige Urinanalysen, Hämatologie und chemische Profile des Serums wurden vor der Behandlung sowie 24 Stunden, 72 Stunden, 7 Tage und 14 Tage nach der ersten Injektion durchgeführt. Keines der Tiere zeigte Anzeichen von Schmerz, der mit einer der Injektionen assoziiert war. Es gab keinen Hinweis auf Anaphylaxie, die mit der zweiten Injektion assoziiert ist. Keine Abnormalitäten oder Veränderungen in den körperlichen oder Laborparametern wurden beobachtet, die dem Wirkstoff zuzuordnen wären. Der Wirkstoff schien von gesunden Hunden gut toleriert zu werden.

Die erfindungsgemäße Zubereitung wurde klinisch in einem veterinärmedizinischen Krankenhaus zur Behandlung verschiedener maligner Tumore in Haustieren verwendet. Elf Katzen und zehn Hunde mit neoplastischen Erkrankungen im fortgeschrittenen Stadium, die nicht auf konventionelle Therapie ansprachen, wurden mit der Zubereitung behandelt, die intramuskulär in wöchentlichen Dosen verabreicht wurde. Tabelle 41 fasst die einzelnen klinischen Fälle dieser Studie zusammen. Die Zahl der Injektionen variierte zwischen 2 und 69, mit Volumina von bis zu 7,5 ml, die an eine einzelne intramuskuläre Stelle abgegeben wurden. Die Protokolle der wöchentlichen Injektionen erlaubten Untersuchungen und sorgfältiges Beobachten der einzelnen Fälle mit diagnostischen Tests, die einzeln für jeden Fall bestimmt wurden. Der Klinikarzt bemerkte, dass weder lokale Irritationen noch stärkere allergische Reaktionen, einschließlich Anaphylaxie, auftraten. Der Klinikarzt und die Besitzer der Tiere beobachteten keine systemischen Nebenwirkungsreaktionen. Die Erfinder bemerkten einige klinische Verbesserungen, bestehend in geringen Reduktionen, Verbesserung des Appetits und der Aktivitätsspiegel, signifikanter Gewichtszunahme in wenigen Tieren und einem Abnehmen an Schmerz und/oder Unbehagen.

Die klinischen Ergebnisse werden wie folgt zusammengefasst: Sechs Tiere (3/10 Hunde und 3/11 Katzen) erfuhren eine komplette Antwort. Ein Tier (1/11 Katzen) hatte anfänglich eine große partielle Antwort. Elf Tiere (5/10 Hunde und 6111 Katzen) erfuhren eine geringe partielle Antwort. Ein Tier (1/10 Hunde) blieb stabil und ein Tier (1/11 Katzen) antwortete nicht. Tabelle 42 stellt Definitionen einer jeden Behandlung zur Verfügung. Die klinische Erfahrung in Tieren legt eine potenzielle Rolle der Zubereitung in der Behandlung von malignen Neoplasmen nahe.

Patienten mit unbehandelbaren Tumoren wurden mit 0,11 ml pro Kilogramm der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt, die gemäß den in Beispiel 1 ausgeführten Verfahren hergestellt war. Die Zubereitung wurde intramuskulär alle drei bis fünf Tage verabreicht. Es gab überhaupt keine signifikante Toxizität bei den 58 behandelten Patienten. In den 37 evaluierbaren Patienten hatten drei Patienten geringe Antworten, d. h. Tumorschrumpfung zwischen 25 und 50 Prozent, und fünf Patienten hatten eine stabile Erkrankung für eine Dauer von mindestens acht Wochen. Die interessantesten Ergebnisse waren in Bauchspeicheldrüsenpatienten, die die ermutigendsten Ergebnisse zu haben schienen. Von den sieben Patienten hatte ein Patient die Krankheitsstabilisierung für volle 11 Monate. Ein zweiter Patient mit extrem fortgeschrittener Erkrankung hatte eine Krankheitsstabilisierung für vier Monate. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde das Carcinom der Bauchspeicheldrüse für eine grundlegende Studie der erfindungsgemäßen Zubereitung ausgewählt. Das Ziel der Studie war, die Sicherheit und Wirksamkeit der Zubereitung in dieser Gruppe von Patienten zu bestimmen.

Die Behandlung bestand in der erfindungsgemäßen Zubereitung 0,11 ml pro Kilogramm mit einer Minimaldosis von 7,5 ml, die als eine einzelne tiefe intramuskuläre Injektion in den Gluteus maximus gegeben wurde. Die Patienten erhielten die Behandlung drei Mal wöchentlich während der ersten Woche und dann zwei Mal pro Woche bis zur Progression der Erkrankung. Insgesamt schrieben sich 22 Patienten für diese Studie ein und alle waren für die Toxizität evaluierbar. Nur 17 Patienten waren für die Wirksamkeit evaluierbar. Bei insgesamt 570 Injektionen gab es keine Toxizität irgendeiner berichteten Art sowohl lokal als auch systemisch. Es gab auch keine objektiven Antworten. Sechs Patienten zeigten jedoch eine stabile Erkrankung für drei Monate oder mehr, aber die übrigen Patienten zeigten eine Progression innerhalb der ersten drei Monate. Das durchschnittliche Überleben betrug acht Monate von der Zeit der Diagnose. Es gab ein durchschnittliches Überleben von vier Monaten nach der ersten Injektion. Es gab drei Patienten, die eine stabile Erkrankung für mehr als sechs Monate hatten. Ein Patient, ein 75 Jahre alter Mann, erlitt mit Lebermetastasen 18 Monate nach einem liberalen Vorgehen einen Rückfall. Er blieb mit der Zubereitung für acht Monate vor einer Progression absolut stabil. Eine 71 Jahre alte Frau mit einer nicht durch Resektion entfernbaren Krankheit blieb für mindestens 10 Monate stabil und fuhr fort, Vollzeit zu arbeiten. Eine 64 Jahre alte Frau, die vier Monate nach der Behandlung einen regionalen Rückfall erlitt, war für mindestens acht Monate stabil.

Ein vierter Patient, der ein inoperables Bauchspeicheldrüsencarcinom hatte und nicht in die Studie aufgenommen werden konnte, da kein Gewebe für eine pathologische Diagnose erhalten werden konnte, war für fast ein Jahr stabil, obwohl sein Tumor trotz höherer Dosen der Zubereitung eine Progression zeigte. Zusammenfassend hat die Zubereitung kein Gebiet toxischer Aktivität gegen Bauchspeicheldrüsenkrebs bei diesem Dosierungsplan. Es gab die Vermutung einer temporären antiproliferativen Aktivität in einer Minderzahl von Fällen mit dieser Erkrankung, wenn diese Zubereitung verwendet wird.

Eine Phase-II-Studie mit der erfindungsgemäßen Zubereitung wurde für Patienten mit messbarem, Biopsie-bestätigtem Bauchspeicheldrüsenkrebs begonnen. Die Zubereitung wurde als eine 7,5 ml (0,11 ml/kg) intramuskuläre Injektion drei Mal wöchentlich für 1 Woche und dann zwei Mal wöchentlich bis zur Progression der Erkrankung verabreicht.

Details der Studie sind unten ausgeführt.

Die Behandlung bestand aus der Zubereitung, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wobei 0,11 ml/kg (Minimaldosis 7,5 ml} mit einer einzelnen tiefen intramuskulären Injektion in den Gluteus maximus, mit alternierenden Gesäßseiten für jede Dosis, verabreicht wurden. Die Patienten erhielten drei Injektionen während der ersten Woche, gefolgt von zwei Injektionen pro Woche bis zur Tumorprogression.

Die Antwort wurde unter Verwendung von Standardkriterien definiert. (Miller et al., Cancer 1981; 47: 207–214). Eine komplette Antwort (complete response, CR) wurde definiert als komplettes Verschwinden aller Hinweise auf die Erkrankung für mindestens 4 Wochen. Eine partielle Antwort (partial response, PR) wurde definiert als eine ≥ 50%-ige Reduktion des Produkts der zwei größten senkrecht aufeinander stehenden Durchmesser der größten messbaren Läsion, ohne neue Läsionen oder Progression einer Läsion, für mindestens 4 Wochen. Progressive Erkrankung wurde definiert als eine 25% oder mehr Vergrößerung in der Größe einer oder mehrerer messbarer Läsionen oder das Auftreten neuer Läsionen. Erkrankungen, die diesen Kriterien für die Antwort oder die progressive Erkrankung nicht entsprachen, wurden als stabile Erkrankung bezeichnet.

Eine Gesamtzahl von 22 Patienten wurde in diese Studie eingeschrieben, aber fünf Patienten wurden als für die Wirksamkeit nicht evaluierbar betrachtet. Es gab keine vollständigen oder partiellen Antworten. Drei Patienten hatten eine Progression der Erkrankung innerhalb des ersten Monats. Sechs Patienten hatten eine Krankheitsstabilisierung für mehr als 3 Monate (3,5, 3,5, 5, 8, 12+, 14+). Das durchschnittliche Überleben der gesamten Gruppe betrug 8 Monate vom Tag der Diagnose und 5 Monate vom Beginn der Behandlung. Ein Patient mit Biopsiebestätigten Lebermetastasen und einer CEA von 37 ng/ml (normal < 3 ng/ml) hatte eine absolute Stabilisierung der Lebermetastasen und des CEA für 8 Monate. Einer hatte eine stabile Erkrankung für 5 Monate. Eine Patientin erlitt einen Rückfall in ihrem pankreatischen Bett (engl.: pancreatic bed) 4 Monate nach einer Whipple-Behandlung und war mit der Zubereitung für mindestens ein Jahr stabil, mit der Ausnahme eines langsam anwachsenden CEA. Ein dritter Patient hatte einen transkutan eingeführten Stent und setzte die Vollzeitarbeit für mindestens 14 Monate ohne einen Hinweis auf Tumorprogression fort.

Alle 22 Patienten waren für die Toxizität evaluierbar, wobei sie insgesamt über 500 Injektion erhielten. Keiner entwickelte irgendeinen klinischen oder Laborhinweis auf eine wirkstoffbezogene Toxizität. Es gab keine schädliche Wirkung auf die Lebensqualität, welche im Allgemeinen mit der Erkrankungsaktivität parallel verläuft. Keine signifikanten Veränderungen in der Gesamtzahl der weißen Blutzellen, den Zählungen der absoluten Lymphocyten oder Serumimmunglobuline wurde beobachtet.

Überlebenskurven, die die Überlebenszeit von der Diagnose und vom Beginn der Behandlung darstellen, sind in den 13 bzw. 14 dargestellt. Zum Vergleich wurde eine historische Überlebenskurve für Gudjonsson (1987) in 13 einkopiert. Ein anderes Beispiel einer vergleichbaren historischen Überlebenskurve kann in Bakkevold, Petterson, Arnesjo und Espenhaug (1990) gefunden werden.

Die Ergebnisse der Überlebensanalysen sind in Tabelle 43 zusammengefasst. Der Mittelwert der Überlebenszeit für die Diagnose war 281 Tage (13). Der Median des Überlebens betrug 182 Tage (ungefähr 5 Monate). Zum Vergleich berichtete Gudjonsson (1987) einen Mittelwert des Überlebens bei seinen 188 chirurgischen Patienten von 208 Tagen mit einem Median des Überlebens von 120 Tagen. Die mittlere Überlebenszeit vom Behandlungsbeginn betrug 166 Tage (14). Der Median des Überlebens betrug 133 Tage (ungefähr 4 Monate und 1 Woche).

Die Überlebenszeiten wurden auch innerhalb einer Teilmenge der evaluierbaren Patienten geschätzt, von denen jeder mindestens 13 Injektionen erhalten hatte. Vierzehn der 22 Patienten waren evaluierbar. Bei diesen Patienten (Tabelle 43) betrug der Median des Überlebens von der Diagnose 219 Tage (ungefähr 7 Monate und 1 Woche). Der Median des Überlebens vom Behandlungsbeginn betrug 146 Tage (ungefähr 5 Monate).

Ein fortgeschrittenes malignes Melanom wurde so definiert, dass alle Stadium-III-oder -IV-Patienten und alle lokoregional oder entfernten Rückfälle, die nach einer Erstbehandlung auftraten, eingeschlossen waren. Die Standardbehandlung, nach der alle anderen Behandlungen beurteilt werden, ist DTIC (Dacarbazin), das eine berichtete Antwortsrate von etwa 15% hat. Die Medianantwort ist 3–6 Monate, und es führt schwere Nausea und Erbrechen und eine potenziell letale Nebenwirkung von akuter Lebernecrose durch Thrombose der Lebervenen mit sich. Diese Behandlung versagt darin, irgendwelche definitiven Überlebensvorteile zu zeigen.

Diese Studie wurde durchgeführt, um die Sicherheit und Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zubereitung zu bestimmen und ihre Wirkung auf Überleben und Lebensqualität zu bestimmen, wenn sie bei Patienten mit fortgeschrittenen malignen Melanomen verwendet wird. Die Studie war eine nicht vergleichende, multizentrische Prüfung.

Der anfängliche Dosierungsplan von 7,5 ml-Injektionen der erfindungsgemäßen Zubereitung intramuskulär 3 Mal pro Woche wurde verwendet. Nachdem keine Organ- oder Knochenmarkstoxizität beobachtet wurde, wurde der Beladungsplan auf tägliche Injektionen für 15 Tage, gefolgt durch Beibehaltung von 3 Injektionen pro Woche, erhöht. Anschließend wurde die Beladungsdosis auf 30 Tage erhöht. Die Dauer der Behandlung war 36 Wochen und dann reduziert auf 16 Wochen, nach denen den Patienten die Möglichkeit gegeben wurde, in ein Fortsetzungsprotokoll einzusteigen.

Dreiunddreißig Patienten mit fortgeschrittenem Melanom, die sich im Altersbereich von 17 bis 85 Jahren befanden, wurden in die Studienpopulation (17 Frauen und 16 Männer), aufgenommen. 64% waren zuvor behandelt worden und 36% waren unbehandelt. Von diesen in die Studienpopulation eingeschlossenen 33 Patienten waren 25 evaluierbar. Der Karnofsky-Leistungsfähigkeitsstatus (Grundlinie) war im Bereich von 40–100%, Median 80%. Elf Patienten waren am Ende der Studiendauer am Leben und fünf von diesen in Behandlung.

Eine geringe partielle Antwort wurde in 16/33 Patienten (48%) beobachtet. Ein Patient hatte eine Reduktion von 33% in der Lunge, sechs Patienten hatten Schmerzreduktionen und acht Patienten nahmen mehr als 1000 Gramm Gewicht über mehr als einen Monat zu (Bereich 1000–2600 Gramm). Ein stabiler Zustand wurde in 19/33 Patienten (58%) beobachtet (Bereich 60–170 Tage, Median 77 Tage).

Die 15, 16 und 17 zeigen das Überleben der Patienten, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden, im Vergleich zu historischen Kontrollen, die als Überleben ab der Diagnose der Metastasen/des Rückfalls in Tagen gemessen ist. Die durchgezogene Linie stellt die Überlebenskurve für Patienten dar, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden, und die gestrichelte Linie stellt die historische Überlebenskurve dar (Balch, C. M. et al., Cutaneous Melanoma, 2. Aufl. 1992, Kapitel 14 und 39, S. 165–187 & 499–508, Lippincott Co., Philadelphia, Penn.). Das Überleben aller mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelten Patienten, einschließlich der Patienten mit einer oder mehr als drei Tumorstellen, ist in 15 gezeigt. Das Überleben der Patienten mit zwei Tumorstellen und mit drei oder mehr Tumorstellen ist in den 16 bzw. 17 gezeigt.

Die Gruppe aller mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelten Patienten hatte bei einem Jahr ein 39%-iges Überleben (Kaplan-Meier-Schätzung). Die Überlebensrate bei einem Jahr für alle Patienten mit fortgeschrittenen malignen Melanomen (AMM) ist ungefähr 11% in der historischen Kontrolle (angepasst an die Zahl der Tumorstellen). Die Gruppe hatte einen Median des Überlebens von 315 Tagen im Vergleich zu dem historischen Median von 89 Tagen.

Mit zwei Tumorstellen betrug das Ein-Jahres-Überleben 49% bei mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelten Patienten im Vergleich zu 13% in den historischen Kontrollen. Diese Gruppe hatte einen Median des Überlebens von 360 Tagen im Vergleich zum historischen Median von 120 Tagen. Mit drei oder mehr Tumorstellen betrug das Ein-Jahres-Überleben 31% in den mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelten Patienten im Vergleich zu 0% in den historischen Kontrollen. Die Gruppe mit drei oder mehr Tumoren hatte einen Median des Überlebens von 205 Tagen im Vergleich zum historischen Median von 60 Tagen.

Die Lebensqualität wurde durch die Gewichtszunahme, den Zustand der Leistungsfähigkeit (Karnofsky), den Lebensqualitätsindex (Spitzer) und die Schmerzskala (lineares Analog) beurteilt. Die Gewichtszunahme über die Zeit ist in Tabelle 39 gezeigt.

Die Karnofsky- und Spitzer-Skalen sind beide subjektiv und es wurde von ihnen gefunden, dass sie bei jedem Individuum ungefähr übereinstimmen. Fünfzehn Patienten berichteten keine Veränderung in diesen Parametern. Vier Patienten zeigten Fluktuationen, die später zu dem ursprünglichen Niveau zurückkehrten. Ein Patient hatte einen Abfall (von 40–20%).

Die Ergebnisse der Schmerzevaluierung zeigten, dass in sechs Patienten bis zur Woche 4 der Schmerz von 5 (schlimmstmöglich} auf 2 (gemäßigt) oder 0 (kein Schmerz) gefallen war. Ein Patient hatte einen Abfall des Schmerzes von 3 auf 0. Ein Patient mit Lebermetastasen hatte eine Schmerzreduktion auf 0 und eine Stabilisierung für 11 Monate. Neun Patienten, die an der Studie mit 0 Schmerz teilnahmen, behielten dieses Niveau über die Studie bei. Fünf Patienten hatten einen mäßigen (2 Einheiten) Anstieg an Schmerzen. Drei Patienten hatten vorübergehende Schmerzanstiege (1 bis 2 Einheiten) während des zweiten oder dritten Monats.

Bei 1734 an 33 Patienten verabreichten Injektionen hatten 21 Patienten keine Wirkstoffnebenwirkungen. Vierzehn Wirkstoffnebenwirkungen wurden in 12 Patienten berichtet. Die Wirkstoffnebenwirkungen traten gewöhnlich bei den Wochen 4 oder 8 auf und waren mild bis vorübergehend und meistens gab es ein Fieber niedrigen Grads.

Der Unterschied im Überleben zwischen den historischen Gruppen und den Protokollgruppen, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden, legt die Vermutung eines Überlebensgewinns für Patienten nahe, die mit der erfindungsgemäßen Zubereitung behandelt wurden. Der Krebs schien sich in 19 Patienten zu stabilisieren. Alle für AMM behandelten Patienten wurden in die Überlebensdaten eingeschlossen. Auch eingeschlossen wurden 21 zuvor behandelte Patienten (viele klinische Studien benötigen unbehandelte Patienten auf Grund der schlechten Prognose der fehlgeschlagenen Vorbehandlungen). Die Tumorbelastung war hoch (82% hatte mehr als eine Metastasestelle).

Die Überlebens- und Lebensqualität-Daten legen die Vermutung nahe, dass die meisten Patienten einen gewissen Nutzen aus der Behandlung gezogen haben. Elf Patienten waren am Ende der Studiendauer noch am Leben, wobei 5 der 11 mit der Behandlung fortführen.

Es folgt ein Bericht einer 73 Jahre alten Frau mit progressivem malignem Melanom des harten Gaumens und des Zahnfleischs. 25 zeigt zwei Ansichten des malignen Melanoms, wie es unter dem Mikroskop zu sehen war. In 25a kann man beim Blick von oben nach unten die Epithelschicht mit dem begleitenden Keratin sehen, neben dem die malignen Zellen anfangen, sichtbarer zu werden. Diese Melanomzellen können als rund oder oval mit einem übermäßigen eosinophilen Cytoplasma und pleomorphen hyperchromatischen Nuklei gesehen werden. Diese Zellen haben das normale submuköse Gewebe ersetzt. Die Blutgefäße, die zu sehen sind, erscheinen normal, und es gibt einen Mangel jeglicher Art einer inflammatorischen/Immunantwort, was durch die Gegenwart von Leukocyten (polymorphnuklearen und mononuklearen Zellen) dargestellt werden würde. Dies ist ein Beispiel eines Tumorgewebes, das wachsend ist, d. h. die Tumorarchitektur ist intakt.

In 25(b) ist eine Tumorgewebeprobe der gleichen Patientin gezeigt, die mit der Zubereitung für zwei Monate behandelt worden war. Ausgehend von oben nach unten kann man sehen, dass die Kontinuität des Epitheliums durch einen necrotischen Prozess durchbrochen wurde. Während diese Necrose im Zentrum eines jeden Tumors üblich ist, der eine kritische Masse erreicht hat, wird sie kaum an der Peripherie, insbesondere in malignen Melanomen, gesehen und ist ein Zeichen, dass die Immunantwort des Wirts einen Angriff gegen den Tumor anbringt. Über das ganze Foto gibt es eine große Zahl von Zellen, die unterschiedlich von den ursprünglichen Tumorzellen sind. Diese sind die Immunzellen – Neutrophile, Lymphocyten, Makrophagen –, die die Zersetzung der typischen Tumorarchitektur orchestrieren. Die Wände der Blutgefäße sind dicht mit einer großen Zahl von Wirtsimmunzellen (Pfeil) infiltriert worden. Diese zelluläre Infiltration wird nachfolgend die Zerstörung des Blutgefäßes bewirken, welche wiederum den Tumor daran hindert, seinen Bedarf an Nährstoffen und Sauerstoff (ischämische Necrose) zu erhalten. Diese Immunantwort, die zur tumoralen Zersetzung, die in dem Dia des Gewebes dieses Patienten zu sehen ist, beiträgt, stimmt mit den berichteten Veränderungen, von denen bekannt ist, dass sie von TNF (Tumornecrosefaktor) vermittelt werden, und mit den Ergebnissen der Arbeit, die in den vorigen Beispielen beschrieben wurden, überein.

Die Immunantwort, die in dem Dia nach der Behandlung mit der Zubereitung ( 25b) gezeigt wurde, verknüpft die in-vitro-TNF-Immunmodulation durch die Zubereitung stark mit den bekannten in-vivo-Anti-Tumor-TNF-Wirkungen.

Aus dem Vorangegangen wird eingesehen werden, dass, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zur Beschreibung zu Zwecken der Illustrierung verwendet worden sind, eine Vielzahl von Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und dem Umfang der Erfindung abzuweichen. Folglich wird die Erfindung nicht begrenzt, außer durch die angefügten Ansprüche.

Eine 300 ml-Probe der Zubereitung wurde bis zur Trockenheit auf einem Rotationsverdampfer evaporiert, in dem die Temperatur des Bades 40°C nicht überstieg. Um sicherzustellen, dass die Lösung während der Evaporation basisch blieb, wurden 5 Tropfen einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung jede halbe Stunde zu der Zubereitung zugefügt, bis die Evaporation abgeschlossen war. Der resultierende Rückstand hatte ein Gewicht von 11,6 g.

20 ml einer 10%-igen konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung in Methanol wurden dann zu 2 g des obigen Rückstands zugefügt. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und das Filtrat durch 101,93 g eines 60 Å Flash-Silikagels in einer Säule mit Dimensionen von 5 cm × 12,5 cm chromatographiert. Das verwendete Lösungsmittelsystem war 10% konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung in Methanol. Die Säule wurde bei einem Druck von 10 p.s.i. und einer Fließgeschwindigkeit von 11 ml/min laufen gelassen. Nachdem 100 ml des Lösungsmittels durch die Säule gelaufen waren, wurden zwölf 20 ml-Fraktionen gesammelt. Die Sammlung dieser Fraktionen korrelierte mit dem Auftreten einer cremefarbenen Bande, die sich schnell die Säule hinab bewegte.

Eine Dünnschichtchromatographie (thin layer chromatography, TLC) dieser Fraktionen auf Silikagelplatten in einer 10% konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung in Methanol wurde durchgeführt und mit einem Ninhydrin-Spray sichtbar gemacht. Die Fraktionen mit ähnlichen TLC-Profilen wurden kombiniert, was zu den folgenden Fraktionskombinationen führte, die in einem Rotationsverdampfer getrocknet wurden.

Die Fraktionen 5–6, 7–8 und 9–10 hatten eine positive Reaktion mit Ninhydrin bei einem R_f-Wert von 0,81.

Die Fraktionen 5–6 und 9–10 aus Beispiel 23 wurden in vitro auf TNF-Stimulation (gemäß Beispiel 9) getestet. Die Ergebnisse sind unten gezeigt:

Folglich war die Fraktion 9–10 ein extrem aktiver TNF-Stimulator.

Proben der Fraktion 5–6 wurden mittels Elektronenstoßmassenspektroskopie (Electron Impact Mass Spectroscopy, EI MS) und Elektrospraymassenspektroskopie analysiert, um spezifische Verbindungen zu identifizieren, die wahrscheinlich in der Fraktion vorhanden sind. Die Elektrospray-MS wurde auf einem Perkin-Elmer Sciex API-III-Spectrometer unter Verwendung von 5% Essigsäure in Wasser als Lösungsmittel durchgeführt. In einigen Fällen wurde Methanol zugefiigt, um die Auflösung zu begünstigen. Die EI MS wurde unter Verwendung einer Direkteinfügungsprobe auf einem VG-Analytical-Model ZAB-SE-Spektrometer unter Verwendung von Glycerin als eine Matrix und unter Verwendung einer DCI-Probe auf einem Kratos-Analytical-Profile-Massenspektrometer durchgeführt.

Eine Durchsicht der resultierenden Spektren wies darauf hin, dass die folgenden Verbindungen wahrscheinlich in Fraktion 5–6 anwesend waren: Phosphocholin, Taurocholsäure, Cholin-Stearinsäurediglycerid, Stearinsäure, Stearinsäurediglycerid, Palmitinsäure-Stearinsäurediglycerid und ein Sphingosin-Ölsäurekonjugat.

100 ml der Zubereitung wurden mit 4 ml einer 1 N HCl-Lösung angesäuert, so dass der pH der Zubereitung gleich 3 war. Die Zubereitung wurde dann mit drei 100 ml-Portionen Dichlormethan mit HPLC-Reinheit extrahiert. Die Dichlormethanfraktionen wurden dann kombiniert und über einer kleinen Menge wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Dichlormethanlösung wurde dann über Papier in einen Rundkolben gefiltert und bis zur Trockenheit auf einem Rotationsverdampfer evaporiert, um 0,0049 g eines braunen Belags zu ergeben.

0,0017 g dieses Belags wurden in einer 214 ppm NH₃·H₂O-Lösung bei pH 7 gelöst und dann auf antiproliferative Aktivität wie in Beispiel 4 ausgeführt gescreent. Dieser Screen ergab, dass die Lösung aktiv antiproliferativ mit einer Aktivität von 14 Einheiten/mg war.

Beispiel 23 wurde in einem größeren Maßstab wie folgt wiederholt. 10 ml einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung wurden zu 900 ml der Zubereitung zugefügt und die resultierende Lösung bis zur Trockenheit auf einem Rotationsverdampfer evaporiert, in welchem die Temperatur des Bads 40°C nicht überstieg. Um sicherzustellen, dass die Lösung während der Evaporation basisch blieb, warden 5 Tropfen einer konzentrieren Ammoniumhydroxidlösung jede halbe Stunde zu der Zubereitung zugefügt, bis die Evaporation abgeschlossen war, wobei ein Rückstand übrig blieb.

150 ml einer 10% konzentriertem Ammoniumhydroxidlösung in Methanol wurden dann zu dem gesamten Rückstand zugefügt. Die Lösung wurde 15 Min. ultraschallbehandelt und das unlösliche Material abfiltriert. Das Filtrat wurde durch 1695 g eines 60 Å Flash-Silikagels in einer Säule mit Dimensionen von 30 cm × 12 cm chromatographiert. Das verwendete Lösungsmittelsystem war eine 10% konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung in Methanol. Die Säule wurde bei einem Druck von 6 p.s.i. und einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/min laufen gelassen. Die Ergebnisse der Säule sind in der Tabelle unten zusammengefasst.

TLC wurde auf Silikagelplatten in einer 10% Konzentration einer Ammoniumhydroxidlösung laufen gelassen und mit einem Ninhydrinspray sichtbar gemacht. Die Fraktionen mit ähnlichen TLC-Profilen wurden kombiniert, was in den folgenden Fraktionskombinationen resultierte, die auf einem Rotationsverdampfer getrocknet wurden.

Alle Fraktionskombinationen von 15–16 bis Fraktion 31–34 zeigten eine positive Reaktion mit Ninhydrin bei einem R_f-Wert von 0,87, einem Wert, der sehr ähnlich zu dem R_f-Wert der aktiven Fraktionen von Beispiel 23 ist. Die Fraktionen 24–30 und 31–34 zeigten zusätzlich eine positive Reaktion mit Ninhydrin bei einem R_f-Wert von 0,85.

Die Fraktionen 4–5, 15–16 und 17–18 wurden in vitro auf die antiproliferative Wirkung (gemäß Beispiel 4) und die TNF-Stimulation (gemäß Beispiel 9) getestet. Die Ergebnisse sind unten gezeigt:

Folglich zeigten die Fraktionen 4–5, 15–16 und 17–18 eine antiproliferative Aktivität, aber keine TNF-Stimulationsaktivität. Eine Elementaranalyse der obigen Fraktionen zeigte von ihnen, dass sie viel NH₄Cl enthielten, das die TNF-Freisetzung und/oder Produktion inhibiert.

Proben der Fraktionen 15–16 und 24–30 wurden einer Dialyse unterzogen und dann durch Massenspektroskopie unter Verwendung der in Beispiel 25 beschriebenen Verfahren analysiert. Undialysierte Proben aus den Fraktionen 17–18 und 24–30 wurden auch analysiert. Eine Durchsicht der resultierenden Spektren wies darauf hin, dass die folgenden Verbindungen wahrscheinlich vorhanden waren: Glycocholsäure, ein Trihexosamintrimer und Taurocholsäure (Fraktion 15–16); Stearinsäure und ein Hexosamindimer; und Glycocholsäure (Fraktion 24–30).

Die Zubereitung wurde in einem separaten Dialyseschlauch wie folgt einer Dialyse unterzogen:

100 ml der Zubereitung wurden in einen Spektra/Por® CE Membranschlauch gegeben, der ein Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 100 besaß. Die Enden des Schlauchs wurden mit Klammern verschlossen und der Schlauch in ein gerührtes Bad mit 10 l destilliertem Wasser gegeben. Die Dialyse wurde täglich durch Entfernen von 1 ml Lösung aus dem Dialyseschlauch und Zugeben von 3–4 Tropfen einer 1/10 N-Silvernitratlösung beobachtet. Die Gegenwart von Chlorid wies darauf hin, dass die Dialyse nicht vollständig war. Wenn die Dialyse nicht vollständig war, wurde das Bad durch frisches destilliertes Wasser ersetzt. Die Beendigung der Dialyse erfolgte nach 3–4 Tagen. Nachdem die Dialyse vollständig war, wurde das dialysierte Material auf einem Rotationsverdampfer getrocknet, um im Mittel 0,3 mg Feststoff pro ml Ursprungsvolumen zu ergeben.

Eine Probe des festen Materials wurde dann in Wasser mit HPLC-Reinheitsgrad gelöst und eine TLC auf Silikagelplatten in einer 10% konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung in Methanol durchgeführt und mit einem Ninhydrinspray sichtbar gemacht. Eine positive Reaktion mit Ninhydrin wurde bei einem R_f-Wert von 0,83 erhalten.

Eine Probe des festen Materials aus Beispiel 30 wurde auch durch Massenspektroskopie unter Verwendung der in Beispiel 25 beschriebenen Verfahren analysiert. Eine Durchsicht der resultierenden Spektren wies darauf hin, dass die folgenden Verbindungen wahrscheinlich anwesend waren: ein Sphingosin-Ölsäurekonjugat, Diacetylsialinsäure, ein Fucose-Hexosamindimer, Deoxyglycocholsäure, Taurocholsäure, ein Sialinsäure-Fucosedimer und ein Di(fucose)hexosamintrimer.

Die vorangegangenen Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die aktiven Komponenten der Zubereitung (zumindest gemäß dem TNF&agr;-Freisetzungsassay) in den ungebundenen Fraktionen (Ausschlußvolumen) nach Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) auf einer C18 &mgr;Bondapack-Säule vorhanden waren. Ebenso eluierte das Meiste der Masse (70%) des Extrakts der Zubereitung, der auf eine C 18 &mgr;Bondapack-Säule geladen war, in dem Ausschlußvolumen. Diese Ergebnisse legten die Vermutung nahe, dass die aktiven Komponenten der Zubereitung sehr wahrscheinlich sehr polare oder sogar ionische Moleküle sind.

Um die obigen Ergebnisse weiter zu untersuchen, wurde eine Reinigung der aktiven Komponenten durch Ionenaustauscherchromatographie durchgeführt. Negativ geladene aktive Komponenten (beurteilt durch ihre Antiproliferationswirkung auf Tumorzellen und nicht auf normale Zellen wie auch durch ihre TNF&agr;-Freisetzung-induzierende Aktivität), falls vorhanden, würden an ein Anionenaustauscherharz gebunden werden.

10 ml des gesamten Virulizin-Extrakts wurden auf eine Anionenaustauscherchromatographiesäule (Bio-Rad AG-1, Hydroxidform, das gesamte Harznassvolumen betrug 10 ml (Säulendimensionen 1,5 cm × 6,0 cm), equilibriert mit Millipore deionisiertem Wasser) geladen. Das Volumen des verwendeten Harzes wurde so berechnet, dass es ausreichend zur Bindung aller Anionen war, die in dem Extrakt vorhanden waren. Die ungebundene Fraktion wurde gesammelt und wieder auf die Säule geladen, um die Bindung an das Harz zu maximieren. Die ungebundene Fraktion aus dieser zweiten Passage wurde gesammelt und aufbewahrt. Jegliches ungebundenes Material, das in dem Ausschlußvolumen der Säule blieb, wurde durch Waschen mit deionisiertem Wasser (2 × 20 ml) entfernt. Gebundene Moleküle wurden mit einem Stufengradienten von Ammoniumbikarbonat (NH₄HCO₃) (20 ml/Schritt) eluiert.

Proben aller Fraktionen aus Beispiel 32 wurden auf ihre Antiproliferationsaktivität und TNF-Stimulationsaktivität gemäß dem Ablauf von Beispiel 4 bzw. 9 analysiert.

Die Ergebnisse sind unten gezeigt:

Die Ergebnisse aus den Aktivitätsassays zeigen, dass die Stimulation der TNF-Produktion in den 0,6 M, 1,0 M, 1,5 M Fraktionen gefunden wurden. Die antiproliferative Aktivität wurde in den Fraktionen 0,4 M (geringe Aktivität) und 0,5 M (große aktive Fraktion) gefunden.

Die Dünnschichtchromatographieanalyse der aktiven Fraktionen ergab ein Gemisch einiger Komponenten. Eine Probe der 1,0 M Fraktion aus Beispiel 32 wurde durch Massenspektroskopie gemäß Beispiel 25 analysiert. Eine Durchsicht der erzeugten Spektren legte die Vermutung nahe, dass die folgenden Verbindungen vorhanden sein könnten: ein Sialinsäure-Glycerindimer, Cholesterinsulfat und Taurocholsäure.

Eine Umkehrphasen-(C18)-HPLC-Analyse wurde an einer Probe der Zubereitung gemäß dem Ablauf von Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass (1) eine Phenomenex WP60009-C18-Säule, 250 × 4,6 mm, verwendet wurde, (2) die Proble lyophilisiert und dann in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser rekonstituiert war und (3) 150 &mgr;l der rekonstituierten Probe auf die Säule aufgetragen wurde.

Verschiedene Fraktionen des Eluents wurden gesammelt, einschließlich einer Fraktion, die bei ungefähr 2,40–3,40 Minuten, nachdem die rekonstitutierte Probe auf die Säule aufgetragen war, eluierte.

Eine Probe der Fraktion aus Beispiel 35, die bei ungefähr 2,40–3,40 Minuten eluierte, wurde drei Mal gemäß dem Ablauf von Beispiel 9 auf die TNF-Stimulationsaktivität analysiert. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.

Eine Probe der Fraktion aus Beispiel 35, die bei ungefähr 2,40–3,40 Minuten eluierte, wurde wie folgt einer Tandemsäulen-Umkehrphasen (C18) HPLC unterzogen. Die Säule aus Beispiel 35 wurde im Tandem mit einer Phenomenex Prime-Sphere HC-C18-Säule, 250 × 4,6 mm, verwendet. Die Probe wurde lyophilisiert, in 0,1% TFA in Wasser (Puffer A) rekonstituiert und 150 &mgr;l der rekonstituierten Probe wurden auf die Säule aufgetragen. Puffer A wurde für zwanzig Minuten laufen gassen, dann wurde ein linearer Gradient von 0-80% 0,1% TFA in Acetonitril (Puffer B) für 35 Minuten laufen gelassen. Am Ende dieser Dauer wurde 80-0% Puffer B für 5 Minuten laufen gelassen. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,9 ml/min. Sechs Eluentfraktionen wurden zu den folgenden ungefähren Zeiten nach der Injektion gesammelt:

Eine Probe von Fraktion 1 („1") und eine Probe von Fraktion 2 („2") aus Beispiel 37 wurden lyophilisiert und in 214 ppm NH₃·H₂O rekonstituiert. Diese rekonstituierten Proben wurden dann auf die antiproliferative Wirkung gemäß dem Ablauf von Beispiel 4 analysiert. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Proben jeder der sechs Fraktionen von Beispiel 37 wurden durch Massenspektroskopie gemäß Beispiel 25 analysiert. Eine Durchsicht der resultierenden Spektren für die sechs Fraktionen zeigte an, dass die folgenden Verbindungen wahrscheinlich vorhanden waren: Taurocholsäure, ein Sialinsäure-Glycerindimer, NaCl, Trimethylamin, Methylethylamin und Propylamin.

Die antiproliferative Wirkung gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 wurde für die folgenden drei Proben gemessen: (1) 10–11 mg Taurocholsäure in 2 ml H₂O; (2) 214 ppm NH₃·H₂O; und (3) 0,7 mg Taurocholsäure in 4,0 ml 214 ppm NH₃·H₂O. Weder Probe (1) noch Probe (2) hatte irgendeine nachweisbare antiproliferative Wirkung. Probe (3) hatte allerdings eine antiproliferative Wirkung von 14 Einheiten/mg.

Dieses Ergebnis zeigt an, dass Gallensäuren, wie zum Beispiel Taurocholsäure, in Kombination mit Ammoniumionen, eine antiproliferative Aktivität bei Konzentrationen zeigen, die unter jenen liegen, bei denen die einzelnen getesteten Komponenten keine Aktivität zeigen. Daher beeinflusst die Kombination dieser beiden Komponenten die antiproliferative Aktivität offensichtlich synergistisch.