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Dokumentenidentifikation DE69815282T2 06.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000937497
Titel Magnetischer Träger, seine Herstellung, und Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Yamauchi, Syoichi, Yokohama-shi, Kanagawa, JP;
Kasai, Kiyoshi, Yokohama-shi, Kanagawa, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69815282
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.12.1998
EP-Aktenzeichen 981244510
EP-Offenlegungsdatum 25.08.1999
EP date of grant 04.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.05.2004
IPC-Hauptklasse B01J 20/28
IPC-Nebenklasse B01J 20/32   C07H 1/06   C12Q 1/68   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen magnetischen Träger, der auf seiner Oberfläche Polyacrylamid hat und der kontrollierte Eigenschaften des Gehalts an magnetischen Material, eine Partikelform, einen Partikeldurchmesser und einen Porendurchmesser hat und der für Absorption und Extraktion geeignet ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren unter Verwendung des magnetischen Trägers

Kieselerde in Partikelform, und ähnliche Materialien in Partikelform, als Absorptionsmittel und ein fester Träger zur Unterstützung des Absorptionsmittels sind wohlbekannt. Nach der Verwendung wird der Träger mittels Zentrifugation, Filtration oder einem ähnlichen Verfahren wiedergewonnen, was nicht günstig ist. Bei dem Absorptions- oder Extraktionsverfahren sollte die fragliche Substanz aus dem Absorbat oder Extrakt isoliert werden. Jedoch dauert die herkömmliche Abtrennung mittels Zentrifugation, Säulentrennung oder einem ähnlichen Verfahren lange Zeit, und benötigt eine große Apparatur, was nicht günstig ist.

Zur Abtrennung der fraglichen Substanz offenbart zum Beispiel die JP-A-60-244251 ("JP-A" bedeutet hier eine nicht geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung) ein Verfahren zur Gewinnung der fraglichen Partikel, bei dem ein ferromagnetisches Material zu den Partikeln zugegeben wird und ein magnetisches Feld darauf angewendet wird. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass das ferromagnetische Material bei der Durchführung der Absorption, Extraktion, Reaktion und so weiter Selbstaggregation bewirken kann, insbesondere bei Einwirken eines magnetischen Felds, und dass der Zustand der Partikel nicht kontrolliert werden kann, wie es für die einheitliche Verteilung bei dem Verfahren gewünscht ist.

Zur Verhinderung der Selbstaggregation des ferromagnetischen Materials offenbart die JP-A-61-181967 die Verwendung eines superparamagnetischen Materials als magnetisches Material, und Tokuhyo 4-501957 ("Tokuhyo" bedeutet hier die veröffentlichte japanische Übersetzung der internationalen PCT-Offenlegungsschrift für eine Patentanmeldung) offenbart die Verwendung von magnetischen Partikeln, die ein superparamagnetisches Material als feste Phase haben zum Festhalten einer Probe bei der Trennung und bei der Analyse von Proteinen, Zellen und DNA. Das japanische Patent Nr. 2554250 offenbart einen hoch beweglichen Reagenzträger, der aus einer Gelmatrix besteht, auf dem eine superparamagnetische reaktive Substanz fixiert ist. Bei diesen Verfahren wird die superparamagnetische Substanz in einem Zustand von feinen Mikropartikeln, dessen Größe kleiner ist als jene der magnetischen Domänen, um einen magnetischen Körper, wie Eisenoxid, permanent magnetisch zu halten, und die Partikel in einer Lösung werden durch Anlegen eines externen magnetischen Felds zur Aggregation gebracht. Bei diesen Verfahren sind die Eigenschaften der magnetischen Partikel jedoch nicht ausreichend kontrollierbar. Es ist daher ein Verfahren erwünscht, das magnetische Partikel produziert, die für die jeweiligen Verwendungen am besten geeignet sind, indem man ihre Eigenschaften, insbesondere den Partikeldurchmesser, den Porendurchmesser, das Porenvolumen und die spezifische Oberfläche des magnetischen Partikels, die Menge des magnetischen Materials in dem magnetischen Partikel, und die Kieselgelkonzentration der Partikeloberfläche, kontrolliert.

Für die Verwendung als Absorptionsmittel oder Extraktionsmittel wird Kieselerde in Partikelform zunächst durch Einführung einer spezifischen funktionellen Gruppe oder Absorption von Nucleinsäure oder dergleichen an der Oberfläche modifiziert. Zum Beispiel wird das Gel für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie durch Einführung einer spezifischen funktionellen Gruppe modifiziert. Bei einer herkömmlichen Modifikation kann sich jedoch die eingeführte funktionelle Gruppe ablösen und eine Abnahme der Menge der funktionellen Gruppe verursachen, was in der Zerstörung der Eigenschaft des Absorptionsmittels resultiert, was nachteilig ist.

Bei einem Verfahren der Einführung von Polyacrylamid in magnetische Kieselerde in Partikelform wird das Gel mit Acrylamid gemischt und das Acrylamid wird polymerisiert, um das Polyacrylamid auf dem Gel niederzuschlagen. Bei diesem Verfahren bedeckt das Polyacrylamid einfach nur das Gel, ohne direkte Bindung zwischen dem Gel und dem Polyacrylamid, mit der Tendenz der Ablösung von dem Gel beim Verfahren der Absorption oder Extraktion, was nachteilig ist.

Für die Bildung einer Bindung zwischen einem Träger wie dem Gel und Polyacrylamid sollte eine Reaktion zwischen dem Gel und dem Polyacrylamid stattfinden. Bei der Reaktion ist es schwierig, durch eine direkte Reaktion mit den funktionelle Gruppen auf dem Gel Polyacrylamid in einer spezifizierten Menge einzuführen, und die Menge an eingeführtem Polyacrylamid ist nicht reproduzierbar. Es ist daher ein Verfahren zum Einführen von Polyacrylamid auf dem Gel mit einer hohen Reproduzierbarkeit der Menge der Einführung erwünscht.

JP-A-9-19292 offenbart ein Verfahren, das Kieselerde in Partikelform als Träger für die Absorption von Nucleinsäuren verwendet. Bei diesem Verfahren nimmt man an, dass die Nucleinsäure durch Wasserstoffbindungen zwischen den Hydroxylgruppen der Kieselerdepartikel und den basischen Gruppen der Nucleinsäure an den Kieselerdepartikeln an die Kieselerdeoberfläche absorbiert werden. Die Kieselerdepartikel absorbieren jedoch die Nucleinsäure nicht in ausreichender Menge an ihrer Oberfläche, oder die Menge an Absorption ist wegen der sterischen Behinderung wegen der Größe der Nucleinsäure nicht reproduzierbar.

Tokuhyo 4-501959 offenbart molekulare Oligonucleotide auf der Oberfläche eines magnetischen Partikels. Bei diesem Verfahren sollte ein Oligonucleotid, das eine Sequenz hat, die komplementär ist zu der Nucleinsäure, die absorbiert oder extrahiert werden soll, auf der Oberfläche des magnetischen Partikels immobilisiert werden. Deshalb sollte magnetisches Material in Partikelform bereitgestellt werden, das ein Nucleotid hat, das komplementär zu der fraglichen Nucleinsäure ist, die daran fixiert ist. Zur Anwendung dieses Verfahrens in klinischen Tests müßten viele Arten an Nucleotide-tragenden magnetischen Partikeln hergestellt werden, was andere Probleme wie die Kosten aufwirft.

Bei der Durchführung eines klinischen Tests können biologische Proben wie Serum, Plasma und Körperflüssigkeit infektiöse Viren oder Bakterien enthalten. Wenn die Nucleinsäure manuell aus der Probe extrahiert wird, ist der Ausführende der Gefahr einer Infektion ausgesetzt. Deshalb sollte das Verfahren für die manuelle Extraktion einer Nucleinsäure bevorzugt einfach sein, mit geringer Chance der Bildung eines Aerosols oder dergleichen von der Probe, oder mehr bevorzugt sollte die Verfahren automatisiert sein.

Herkömmliche Verfahren der Extraktion von Nucleinsäuren sind jedoch kompliziert und können nicht einfach automatisiert werden.

Nach umfänglichen Versuchen zur Lösung der vorstehenden Probleme fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass Kieselerdepartikel, die ein magnetisches Material enthalten (hier nachstehend als "magnetische Kieselerde in Partikelform" bezeichnet), durch Einführung einer vorgeschriebenen Menge an Polyacrylamid und eine Anpassung der Eigenschaften verbessert werden, um die Absorptionskapazität und Absorptionsgeschwindigkeit zu erhöhen, damit sie als Absorptionsmittel und Extraktionsmittel für verschiedene Verwendungen geeignet sind. Es wurde auch gefunden, dass die Polyacrylamid enthaltende magnetische Kieselerde in Partikelform einfach durch Reaktion der magnetischen Kieselerde in Partikelform mit einem Kopplungsmittel und dann Reaktion mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid produziert werden kann. Es wurde weiterhin gefunden, dass eine Nucleinsäure in einer biologischen Probe unter Verwendung der so hergestellten magnetischen Kieselerde in Partikelform leicht und effektiv extrahiert werden kann. Folglich wurde die vorliegende Endung erreicht.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines magnetischen Trägers, der kontrollierte Eigenschaften des Gehalts einer magnetischen Substanz, eine Form, einen Partikeldurchmesser und einen Porendurchmesser hat, ohne die obrigen Nachteile des Stands der Technik.

Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines vereinfachten Verfahrens für die Produktion des vorstehenden magnetischen Trägers.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines vereinfachten automatisierbaren Verfahrens für die Extraktion einer Nucleinsäure mit dem vorstehenden magnetischen Träger.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung umfaßt Kieselerde in Partikelform, die ein magnetisches Material enthält, und der auf seiner Oberfläche Polyacrylamid in einer Menge hat, die von 0,3 bis 5 mmol/g hinsichtlich monomeren Acrylamids reicht.

Das Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung umfaßt die Schritte von (a) Bereitstellen von magnetischer Kieselerde in Partikelform durch Zugabe eines magnetischen Materials zu der Kieselerde oder einem Kieselerdequellenmaterial; (b) Umsetzen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (a) mit einem Kopplungsmittel; (c) Waschen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (b); Umsetzen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (c) mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid; und (e) Waschen und Trocknen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (d).

Das Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfaßt das Vermischen des vorstehenden magnetischen Trägers mit einer Probe, um der Nucleinsäure in der Probe zu ermöglichen, von dem magnetischen Träger adsorbiert zu werden, und die Trennung des magnetischen Trägers von der Probe unter Verwendung einer magnetischen Kraft.

Die Nucleinsäure in der vorliegenden Erfindung bedeutet DNA (Desoxyribonucleinsäure) und/oder RNA (Ribonucleinsäure), die einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, und sie kann eine Gemisch davon sein.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.

Der magnetischen Träger der vorliegenden Endung umfaßt Kieselerde in Partikelform, der ein magnetisches Material enthält und Polyacrylamid auf seiner Oberfläche hat. Die Materialien, aus denen der magnetischen Träger besteht, sind nachstehend beschrieben.

[Magnetisches Material]

Das magnetische Material, das für den Aufbau des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jedes Material sein, das eine magnetische Kraft hat. Von den magnetischen Materialien werden superparamagnetische Materialien bevorzugt, die bei Anlegen eines magnetischen Felds stark magnetisiert werden und bei Entfernen des magnetischen Felds demagnetisiert werden. Die superparamagnetischen Materialien umfassen Spinellferrite, Plumbitferrite und Legierungen, die vor allem aus Eisen, Nickel, Kobalt oder dergleichen bestehen. Zur einheitlichen Einbringung des magnetischen Materials in die Kieselerde in Partikelform wird vorzugsweise eine magnetische Flüssigkeit verwendet, die durch Suspension von ultrafeinen Partikeln von Magnetit oder Ferrit in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel hergestellt wird.

[Kieselerde in Partikelform]

Die Kieselerde in Partikelform für den magnetischen Träger der vorliegenden Erfindung ist ein Polymer, das durch Bindung von Si (Silizium) und 0 (Sauerstoff) gebildet wird, einschließlich Kieselerdegel, Kieselerdeglas, Quarzglas, Siliziumoxid und Silikatsalze. Von diesen wird Kieselerdegel wegen seiner relativ großen spezifischen Oberfläche und der einfachen Kontrolle seiner Porenstruktur bevorzugt. Diese Materialien sind wegen des geringeren Einflusses einer Verunreinigung beim Verfahren der Extraktion oder Absorption der Nucleinsäure vorzugsweise synthetische Produkte. Es können jedoch natürliche Materialien nach Reinigung verwendet werden.

Der durchschnittliche Partikeldurchmesser der Kieselerde in Partikelform bewegt sich zwischen 1 bis 200 &mgr;m. Innerhalb diese Bereichs kann das magnetische Material in einer größeren Menge in die Kieselerde in Partikelform eingebracht werden, die Trennung unter Verwendung des magnetischen Trägers kann in kürzerer Zeit durchgeführt werden, und das Gel behält vorteilhaft stabil seine Form mit weniger Wahrscheinlichkeit der Zerstörung bei der praktischen Anwendung. Mehr bevorzugt bewegt sich der durchschnittliche Partikeldurchmesser zwischen 1 bis 20 &mgr;m, wegen der höheren Dispersionsfähigkeit unter Rühren in der die Probe enthaltenden Lösung und mit weniger Tendenz zur Sedimentation. Insbesondere ist in einem Bereich des durchschnittlichen Partikeldurchmessers, der von 4 bis 20 &mgr;m reicht, diese Partikelgröße angemessen, und der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung kann einfach von der die Probe enthaltenden Lösung abgetrennt werden, und er ist ausgezeichnet bei der magnetischen Sammlung, bei der Formstabilität, bei der Dispersionsfähigkeit in einer Lösung und bei der Abtrennung von einer Lösung.

Der durchschnittliche Porendurchmesser der Kieselerde in Partikelform bewegt sich für die Stabilität der Partikelform, der höheren Absorptionskapazität, der höheren Absorptionsgeschwindigkeit und der höheren Reaktionseffizienz bei der Absorption oder für Extraktion vorzugsweise zwischen 1 bis 200 nm. Mehr bevorzugt bewegt sich der durchschnittliche Porendurchmesser zwischen 1 bis 100 nm für die Beibehaltung von ausreichender Stärke der Partikel bei der praktischen Anwendung über einen langen Zeitraum, noch mehr bevorzugt zwischen 1 bis 80 nm für die Beibehaltung der Stärke der Partikel über einen längeren Zeitraum.

Das Porenvolumen der Kieselerde in Partikelform bewegt sich für die Stabilität der Partikelform der höheren Absorptionskapazität, der höheren Absorptionsgeschwindigkeit und der höheren Reaktionseffizienz bei der Absorption oder Extraktion vorzugsweise zwischen 0,1 bis 2,5 ml/g, basierend auf dem Trockengewicht. Mehr bevorzugt bewegt sich das Porenvolumen zwischen 0,1 bis 1,5 ml/g für die Beibehaltung von ausreichender Stärke der Partikel bei der praktischen Anwendung über einen langen Zeitraum zusätzlich zu den vorstehenden Effekten, noch mehr bevorzugt zwischen 0,1 bis 1,2 ml/g für die Beibehaltung der Stärke der Partikel über einen längeren Zeitraum.

Die BET-spezifische Oberfläche der Kieselerde in Partikelform bewegt sich für die Stabilität der Partikelform, der höheren Absorptionskapazität, der höheren Absorptionsgeschwindigkeit und der höheren Reaktionseffizienz bei der Absorption oder Extraktion vorzugsweise zwischen 10 bis 800 m2/g, basierend auf dem Trockengewicht. Mehr bevorzugt bewegt sich die BET-spezifische Oberfläche zwischen 10 bis 400 m2/g für die Beibehaltung von ausreichender Stärke der Partikel über einen langen Zeitraum bei der praktischen Anwendung.

[Magnetische Kieselerde in Partikelform]

Die magnetische Kieselerde in Partikelform, die für die magnetischen Träger in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, setzt sich zusammen aus dem magnetischen Material und der vorstehend erwähnten Kieselerde in Partikelform. Das Verfahren ihrer Herstellung ist nicht spezifisch beschränkt. Das Verfahren umfaßt zum Beispiel ein erstes Verfahren, bei dem Si-Alkoxid in ein Si-Alkoxid-Polymer umgewandelt wird und es dem Polymer gestattet wird, durch Zugabe eines Alkali zusammen mit einem magnetischen Material zu gelieren; ein zweites Verfahren, bei dem ein magnetisches Material zu einer Kieselerde in Partikelform, wie Kieselerdegel, mittels Immersion zugegeben wird; und ein drittes Verfahren, bei dem ein Alkalisilikat zu einem magnetischen Material zugegeben wird, und wobei hinzu Säure gegeben wird, um ein Gel zu bilden.

Der Gehalt des magnetischen Materials in der magnetischen Kieselerde in Partikelform bewegt sich vorzugsweise zwischen 5 bis 50 Gew.-% der magnetischen Kieselerde in Partikelform. Innerhalb dieses Gehaltsbereichs hat die erhaltene magnetische Kieselerde in Partikelform ausreichende magnetische Eigenschaften für die praktische Anwendung, um exzellente Wirkungen zu zeigen; das magnetische Material aggregiert nicht so stark und kann einheitlich in die Kieselerdepartikel eingebracht werden; und die Kontrolle der sphärischen Form und der Porosität der Kieselerdepartikel und die Modifikation der Partikeloberfläche durch Polyacrylamid werden erleichtert. Mehr bevorzugt bewegt sich der Gehalt des magnetischen Materials zwischen 5 bis 25 Gew.-% in der magnetischen Kieselerde in Partikelform. Innerhalb dieses niedrigeren Konzentrationsbereichs werden, neben den vorstehenden Wirkungen, ausreichende magnetische Eigenschaften erhalten und die Konzentration der Kieselerdekomponente wird erhöht, entsprechend des niedrigeren Gehalts des magnetischen Materials, was die Kontrolle der Partikelform und der Porosität erleichtert.

[Magnetische Träger]

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung besteht aus der magnetischen Kieselerde in Partikelform, die mindestens Polyacrylamid auf ihrer Oberfläche gebunden hat. Spezifischer wird der magnetische Träger durch Polymerisation von Acrylamid und/oder Polyacrylamid auf der magnetischen Kieselerde in Partikelform hergestellt, um das Acrylamid und/oder Polyacrylamid an die Oberfläche der Partikel zu binden, oder durch Bindung von Polyacrylamid an die magnetische Kieselerde in Partikelform. Deshalb hat der endgültige magnetische Träger Polyacrylamid mindestens auf der Oberfläche des Trägers. Oberfläche bedeutet hier die äußerste Fläche der Partikel, umfaßt aber auch die Oberfläche der Poren, wenn im Innern der Partikel Poren vorhanden sind.

Der Gehalt des Polyacrylamid in dem magnetischen Träger der vorliegenden Erfindung bewegt sich vorzugsweise zwischen 0,3 bis 5 mmol/g, basierend auf dem Trockengewicht. Der Gehalt des Polyacrylamid wird durch Bestimmung von N (Stickstoff) durch Elementaranalyse oder andere Verfahren gemessen und wird durch Mole N in einem Gramm des magnetischen Trägers dargestellt, da die Anzahl an Molen N gleich der Anzahl an Molen Acrylamidmonomer ist. Somit wird der Gehalt des Polyacrylamid in dem magnetischen Träger durch die Gesamtmenge des Acrylamid und des Polyacrylamid gezeigt, der in dem magnetischen Träger vorhanden ist. Innerhalb dieses Gehaltbereiches ist die Menge an Acrylamid geeignet, um die Wirkungen der Amidgruppen des Acrylamid und des Polyacrylamid effektiv zu zeigen, und die Stärke ist praktisch ohne überschüssiges Acrylamid und Polyacrylamid zufriedenstellend. Darüber hinaus ist innerhalb des Gehaltbereiches von 0,5 bis 3,0 mmol/g die Menge des mittels Synthese eingeführten Polyacrylamid reproduzierbar, so dass die Durchführung der Absorption oder Extraktion sicher reproduzierbar ist. Mehr bevorzugt ist der Gehalt für die höhere Stabilität der Durchführung der Absorption oder Extraktion im Bereich von 1,0 bis 3,0 mmol/g.

Der durchschnittliche Partikeldurchmesser des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung bewegt sich zwischen 1 bis 200 &mgr;m. Innerhalb dieses Bereichs kann das magnetische Material in einer größeren Menge in den Träger eingebracht werden, die Trennung unter Verwendung des magnetischen Trägers kann in kürzerer Zeit durchgeführt werden, und die Form der Trägerpartikel ist in der praktischen Anwendung stabil ohne Gelzerstörung. Mehr bevorzugt bewegt sich der durchschnittliche Partikeldurchmesser des magnetischen Trägers zwischen 1 bis 20 &mgr;m für eine höhere Dispergierbarkeit in einer eine Probe enthaltenden Lösung, um die Dispersion unter Rühren mit wenig Tendenz zur Sedimentation zu erhalten, zusätzlich zu den vorstehenden Wirkungen. Insbesondere innerhalb eines Bereichs des durchschnittlichen Partikeldurchmessers von 4 bis 20 &mgr;m kann der endgültige magnetische Träger leicht von der eine Probe enthaltenden Lösung abgetrennt werden, und ist exzellent bei der magnetischen Sammelbarkeit, der Formstabilität, der Dispergierbarkeit in einer Lösung und der Abtrennbarkeit aus einer Lösung.

Der mittlere Porendurchmesser des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung bewegt sich vorzugsweise zwischen 1 bis 200 nm wegen der Formstabilität der Partikel und der höheren Absorptionskapazität und der höheren Absorptionsgeschwindigkeit und der höheren Reaktionseffizienz bei der Absorption oder Extraktion. Mehr bevorzugt bewegt sich der mittlere Porendurchmesser zwischen 1 bis 100 nm für die Beibehaltung von ausreichender Stärke der Partikel über einen langen Zeitraum bei der praktischen Anwendung, noch mehr bevorzugt zwischen 1 bis 80 nm für die Beibehaltung der Stärke der Partikel über einen längeren Zeitraum.

Das Porenvolumen des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung bewegt sich vorzugsweise zwischen 0,1 bis 2,5 ml/g, basierend auf dem Trockengewicht, wegen der Formstabilität der Partikel und der höheren Absorptionskapazität und der höheren Absorptionsgeschwindigkeit und der höheren Reaktionseffizienz bei der Absorption oder Extraktion. Mehr bevorzugt bewegt sich das Porenvolumen zwischen 0,1 bis 1,5 ml/g für die Beibehaltung von geeigneter Stärke der Partikel über einen langen Zeitraum bei der praktischen Anwendung, neben den vorstehenden Effekten, noch mehr bevorzugt zwischen 0,1 bis 1,2 ml/g für die Beibehaltung der Stärke der Partikel über einen längeren Zeitraum.

Die BET-spezifische Oberfläche des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung bewegt sich vorzugsweise zwischen 10 bis 800 m2/g, basierend auf dem Trockengewicht, wegen der Formstabilität der Partikel, der höheren Absorptionskapazität, der höheren Absorptionsgeschwindigkeit und der höheren Reaktionseffizienz bei der Absorption oder Extraktion. Mehr bevorzugt bewegt sich die BET-spezifische Oberfläche zwischen 10 bis 400 m2/g für die Beibehaltung von ausreichender Stärke der Partikel über einen langen Zeitraum bei der praktischen Anwendung.

Der Gehalt des magnetischen Materials in dem magnetischen Träger ist um die Menge des eingebrachten Polyacrylamid niedriger als der der Kieselerde in Partikelform, üblicherweise um etwa 10% bis 20%.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung ist von Nutzen für die Absorption-Trennung oder Extraktion von Nucleinsäuren, Der Ausdruck "Absorption-Trennung" bedeutet hier die Absorption der Nucleinsäure durch den magnetischen Träger aus einer Reaktionslösung und ihre anschließende Abtrennung aus der Reaktionslösung. Der Ausdruck "Extraktion" bedeutet hier die Absorption der Nucleinsäure durch den magnetischen Träger und die anschließende Elution der absorbierten Nucleinsäure von dem magnetischen Träger, um die fraglichen Nucleinsäuren zu erhalten.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung für die Absorption-Trennung oder Extraktion einer Nucleinsäure aus einer Lösung hat einen mittleren Partikeldurchmesser, der vorzugsweise von 1 bis 20 &mgr;m reicht, mehr bevorzugt von 1 bis 15 &mgr;m, noch mehr bevorzugt von 3 bis 10 &mgr;m, in Anbetracht der Dispergierbarkeit für die einfache Handhabung und Trennfähigkeit des magnetischen Trägers. Der magnetische Träger, der einen mittleren Durchmesser von weniger als 1 &mgr;m hat, kann wegen des außergewöhnlich kleinen Partikeldurchmessers längere Zeit für die Trennung benötigen, während der magnetische Träger, der einen mittleren Durchmesser von mehr als 20 &mgr;m hat, wegen der niedrigen Stabilität der Dispersion in der eine Nucleinsäure enthaltenden Lösung keine stabile Funktion ergibt, und der magnetische Träger, der einen mittleren Durchmesser von mehr als 200 um hat, tendiert leichter zur Sedimentation, was den Betrieb schwieriger macht.

Der Polyacrylamidgehalt des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung reicht vorzugsweise von 0,5 bis 5 mmol/g, basierend auf dem Trockengewicht. Innerhalb dieses Polyacrylamidgehalts zeigen sich die Eigenschaften der Amidgruppen des Acrylamids und des Polyacrylamids wirkungsvoll und die Stärke ist wegen der geeigneten Menge an eingebrachtem Polyacrylamid ausreichend für den beabsichtigten Zweck. Mehr bevorzugt kann im Bereich des Polyacrylamidgehalts von 0,5 bis 3,0 mmol/g das Polyacrylamid hoch reproduzierbar eingebracht werden, neben den vorstehenden Effekten. Noch mehr bevorzugt ist im Bereich des Polyacrylamidgehalts von 1,0 bis 3,0 mmol/g die Wirkung bei der Absorption und Extraktion stabiler.

Die Menge an Stickstoffatomen, die auf der Oberfläche des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung existieren, ist vorzugsweise nicht weniger als 5 Atom-% für die hohe Wirksamkeit und die Reproduzierbarkeit bei der Absorption-Trennung und Extraktion einer Nucleinsäure. In diesem Bereich an Stickstoffatomgehalt ist die Oberfläche des magnetischen Trägers fast vollständig mit Polyacrylamid bedeckt, was eine stabile Wirksamkeit einschließlich der Absorptionskapazität ergibt. Mehr bevorzugt reicht die Menge an Stickstoffatomen auf der Oberfläche von 5 bis 10 Atom-%, um die Oberfläche des magnetischen Trägers wirksam für eine Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht bei der Absorption-Trennung und Extraktion einer Nucleinsäure zu nutzen, und um das Polyacrylamid effektiv zum ausreichenden und nicht exzessiven Bedecken der Oberfläche des magnetischen Trägers zu nutzen. Die Menge an Stickstoffatomen auf der Oberfläche des magnetischen Trägers wird zum Beispiel durch Messung der Oberflächenstickstoffatome mittels Röntgen-Photoelektronenspektroskopie bestimmt.

[Herstellung des magnetischen Trägers]

Das Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung umfaßt (1) Schritt (a) der Zugabe eines magnetischen Materials zu Kieselerde oder einem Kieselerdequellenmaterial, um magnetische Kieselerde in Partikelform herzustellen, und (2) die Schritte (b) bis (e) des Einbringens von Polyacrylamid zu der magnetischen Kieselerde in Partikelform. Die Schritte der Herstellung sind nachstehend aufeinanderfolgend beschrieben.

[(1) Schritt der Herstellung von Kieselerde in Partikelform]

Die Kieselerde in Partikelform zur Herstellung des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung kann mittels jedes bekannten Verfahrens hergestellt werden. Sie kann jedoch leichter mit dem Verfahren hergestellt werden, das die nachstehenden Schritte umfaßt.

  • (i) Hydrolyse von Si-Alkoxid mit einer Säure, um ein Si-Alkoxid-Polymer zu erhalten,
  • (ii) Zugabe eines magnetischen Materials zu dem Si-Alkoxid-Polymer,
  • (iii) Dispersion einer Lösung eines Gemischs des Si-Alkoxid-Polymeren und des magnetischen Materials in einem Zustand von Kügelchen in Wasser, und seine Umwandlung in ein Gel mittels Alkali, und
  • (iv) Waschen des Gels mit Wasser, Substitution des Wassers mit einem Lösungsmittel wie eines organischen Lösungsmittels oder eines Gemischs aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, und Trocknung des Gels.

Jedes Si-Alkoxid, das in der Lage ist, durch Hydrolyse ein Polymer zu bilden, ist ohne Einschränkung von Nutzen beim Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Das Si-Alkoxid umfaßt Si(OCH3)4, Si(OC2H5)4, Si(O-n-C3H7)4, Si(O-i-C3H7)4, Si(O-n-C4H9)4 und Si(O-i-C4H9)4. Ein anderes Metall-Alkoxid kann hinzugegeben werden.

Bei den vorstehenden Schritten wird das Si-Alkoxid in einer sauren Lösung partiell hydrolysiert, zu einem Maße, damit es kein Gel bildet. Die saure Lösung ist vorzugsweise ein Gemisch aus einer Säure, Wasser und einem organischen Lösungsmittel.

Nach der partiellen Hydrolyse wird das Si-Alkoxid in Lösung polymerisiert. Das Ausmaß der Polymerisation des Si-Alkoxid-Polymeren kann durch Anpassung der Menge an Wasser, der Polymerisationstemperatur, der Polymerisationszeit und anderer Polymerisationsbedingungen kontrolliert werden. Die Viskosität des Si-Alkoxid-Polymeren hängt vom Ausmaß der Polymerisation ab, wobei bei einem höheren Ausmaß der Polymerisation die Viskosität höher ist. Das Ausmaß der Polymerisation wird kontrolliert, um eine Viskosität der Reaktionslösung von nicht weniger als 10 Centipoise zu erhalten, um keine Gelierung zu erhalten. Die Viskosität kann zum Beispiel gemäß JIS-K-7117-1987 bei 25°C gemessen werden.

Die resultierende Si-Alkoxid-Polymerlösung kann mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt werden. Wenn das Polymer mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt wird, wird die Konzentration des Si-Alkoxid-Polymeren kontrolliert, damit sie vorzugsweise nicht niedriger als 20 Gew.-% ist, basierend auf der verdünnten Gesamtlösung, um kugelförmige Gelpartikel zu erhalten.

Anstelle des vorstehend erhaltenen Si-Alkoxid-Polymeren kann kommerzielle Kieselerde in Partikelform ohne Behandlung verwendet werden.

Anschließend wird ein magnetisches Material zu dem Si-Alkoxid-Polymeren zugegeben. Das magnetische Material kann im Zustand der Dispersion oder Lösung in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel verwendet werden. Als magnetisches Material wird angesichts der Dispergierbarkeit in dem Si-Alkoxid-Polymeren eine magnetische Flüssigkeit bevorzugt. Die magnetische Flüssigkeit kann ein kommerzielles Produkt ohne Behandlung sein oder sie kann nach der Behandlung des Lösungsmittelaustausches verwendet werden.

Dann wird das Gemisch des Si-Alkoxid-Polymeren oder seiner verdünnten Lösung und das magnetische Material unter Rühren im Zustand von Kügelchen in Wasser dispergiert. Ein Dispersionsmittel wie ein oberflächenaktives Mittel und Polyvinylalkohol können zur Dispersion des Gemischs zum Wasser zugegeben werden.

Die gebildeten Kügelchen werden durch Zugabe eines basischen Materials zu dem Gemisch in Gelpartikel umgewandelt.

Die gebildeten Gelpartikel werden mittels Filtration, Zentrifugation oder einem ähnlichen Verfahren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Wasser zum Waschen kann üblicherweise Wasser oder üblicherweise heißes Wasser sein.

Um das Zusammenziehen oder die Aggregation des Gels durch das direkte Verdunsten von Wasser von der Oberfläche und dem Inneren des Gels zu vermeiden wird das Wasser vor dem Trocknen vorzugsweise durch ein organisches Lösungsmittel ersetzt.

Wie vorstehend beschrieben wird das magnetische Kieselerdegel für den magnetischen Träger der vorliegenden Endung hergestellt.

[(2) Schritt des Einbringens von Polyacrylamid in die magnetische Kieselerde in Partikelform, um den magnetischen Träger zu erhalten]

Der magnetische Träger kann mittels jedes bekannten Verfahrens aus der Kieselerde in Partikelform hergestellt werden. Der magnetische Träger kann mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens leichter hergestellt werden.

  • (b) Umsetzen der magnetischen Kieselerde in Partikelform mit einem Kopplungsmittel;
  • (c) Waschen der magnetischen Kieselerde in Partikelform, die das eingebrachte Kopplungsmittel nach Schritt (b) enthält;
  • (d) Umsetzen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (c) mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid;
  • (e) Waschen und Trocknen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (d).

Bei der vorliegenden Erfindung kann jede magnetische Kieselerde in Partikelform, die magnetisches Material enthält, verwendet werden.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung wird durch Reaktion eines Kopplungsmittels mit der Oberfläche der magnetischen Kieselerde in Partikelform und anschließendem Einbringen von Polyacrylamid in die magnetischen Kieselerde in Partikelform durch Reaktion mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid produziert.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Kopplungsmittel ist nicht eingeschränkt, mit der Maßgabe, dass es in der Lage ist, an die in Formel (1) dargestellten Silanolgruppen zu binden, die auf der Oberfläche der magnetischen Kieselerde vorhanden sind, und gleichzeitig in der Lage ist, an das Acrylamid und/oder Polyacrylamid zu binden. Das Kopplungsmittel kann eine einzige Verbindung oder eine Kombination von zwei oder mehr Verbindungen sein. Das Kopplungsmittel der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eines, das eine Vinylgruppe gemäß Formel (2), eine Methacrylgruppe gemäß Formel (3) und eine Epoxygruppe gemäß Formel (4) einführt. Die eingeführte Gruppe reagiert mit dem Acrylamid gemäß Formel (5) oder dem Polyacrylamid gemäß Formel (6), um den magnetischen Träger der vorliegenden Erfindung zu bilden. Das Polyacrylamid umfaßt Polymerisationsprodukte von zwei oder mehr Molekülen von monomerem Acrylamid.

Spezifischer kann das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Kopplungsmittel jede Verbindung sein, die in der Lage ist, beim nachstehend beschriebenen Produktionsverfahren an Acrylamid und/oder Polyacrylamid zu binden. Das Kopplungsmittel umfaßt Silan-Kopplungsmittel, die eine Vinylgruppe, eine Methacrylgruppe oder eine Epoxygruppe enthalten, wie Vinyltrichlorsilan, Trimethoxyvinylsilan, Triethoxyvinylsilan, Tris-(2-methoxyethoxy)-vinylsilan, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan, Diethoxy-3-glycidoxypropylmethylsilan. Diese Kopplungsmittel können einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr von ihnen verwendet werden.

Zwei oder mehr verschiedene Arten von Verbindungen können kombiniert als das Kopplungsmittel verwendet werden. In diesem Fall führt ein Kopplungsmittel (A) durch das Silanol auf der Oberfläche der Partikel der magnetischen Kieselerde eine funktionelle Gruppe ein, und dann führt ein anderes Kopplungsmittel (B) eine Vinyl-, Methacryl- oder Epoxygruppe zu der eingeführten funktionellen Gruppe ein.

Das Kopplungsmittel ist wegen der Vereinfachung des Produktionsverfahrens des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine einzelne Verbindung.

Bei der Produktion des magnetischen Trägers wird die vorstehend erwähnte magnetische Kieselerde in Partikelform getrocknet, um absorbiertes Wasser zu entfernen. Es ist erwünscht, dass das absorbierte Wasser so vollständig wie möglich entfernt wird, bis zu einem Wassergehalt von nicht mehr als 5 Gew.-%. Die getrocknete magnetische Kieselerde in Partikelform und ein Kopplungsmittel werden in einem organischen Lösungsmittel unter Rühren gemischt. Dann wird eine Säure, eine Base oder eine Säure und eine Base zugegeben, um die Reaktion zwischen der magnetischen Kieselerde in Partikelform und dem Kopplungsmittel einzuleiten. Das verwendete Lösungsmittel wird vorzugsweise aus den Kohlenwasserstoffen ausgewählt, wie Benzol, Toluol, Cyclohexan und Hexan. Die Säure für die Reaktion umfaßt Phenole und organische Säuren wie Ameisensäure und Essigsäure. Die Base für die Reaktion umfaßt organische basische Verbindungen wie Amine und Harnstoffe. Das Lösungsgemisch wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 30 bis 90°C für eine Zeit von 30 Minuten bis 6 Stunden für eine einheitliche Reaktion der magnetischen Kieselerde in Partikelform mit dem Kopplungsmittel gerührt.

Anschließend wird die magnetische Kieselerde in Partikelform, die das eingeführte Kopplungsmittel enthält, gewaschen, um das nicht reagierte Kopplungsmittel zu entfernen. Für die Entfernung wird die magnetische Kieselerde in Partikelform, die das eingeführte Kopplungsmittel enthält, mittels Filtration, Zentrifugation oder einem ähnlichen Verfahren gesammelt. Die gesammelte magnetische Kieselerde in Partikelform wird mit einem organischen Lösungsmittel gemischt und dann erneut gesammelt. Dieser Vorgang wird vorzugsweise zweimal bis fünfmal wiederholt. Dann wird die gewaschene magnetische Kieselerde in Partikelform vorzugsweise in einem Lösungsmittel dispergiert, um in Schritt (c) verwendet zu werden, und gesammelt. Dieser Vorgang wird einmal bis viermal wiederholt. Das Sammeln mittels Filtration kann mit einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.

Im anschließenden Schritt wird die magnetische Kieselerde in Partikelform nach der Behandlung mit dem Kopplungsmittel mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid zur Reaktion gebracht. Das Acrylamid und/oder Polyacrylamid kann direkt mit der magnetischen Kieselerde in Partikelform zur Reaktion gebracht werden. Das Acrylamid und/oder Polyacrylamid wird jedoch vorzugsweise während der Reaktion mit der magnetischen Kieselerde in Partikelform polymerisiert, um die eingebrachte Menge zu erhöhen oder um das Molekulargewicht des Polyacrylamid zu kontrollieren. Bei dieser Reaktion wird vorzugsweise monomeres Acrylamid verwendet, da die Herstellung erleichtert wird und zu erwarten ist, dass das an die Oberfläche der Kieselerdepartikel gebundene Acrylamid als lineares Polymer polymerisiert. Insbesondere ist zu erwarten, dass das lineare Polyacrylamid für die Extraktion einer Nucleinsäure, die ein lineares Moleküle ist, geeigneter ist. Die Einführung des Acrylamid an der Oberfläche der Kieselerdepartikel wird mittels jeder Polymerisation durchgeführt, vorzugsweise mittels der radikalischen Polymerisation.

Das Lösungsmittel für die vorstehende Reaktion wird vorzugsweise aus Wasser, Alkoholen und Gemischen von Wasser und einem Alkohol ausgewählt. Der Alkohol ist vorzugsweise wasserlöslich und umfaßt Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol und 2-Butanol.

Das Reaktionsmedium ist vorzugsweise sauerstofffrei, oder enthält gelösten Sauerstoff bei einer niedrigen Konzentration, vorzugsweise zwischen 0 bis 1 mg/l.

Die Reaktion wird durch Mischen von magnetischer Kieselerde in Partikelform, Acrylamid und/oder Polyacrylamid und einem Initiator durchgeführt. Der Initiator umfaßt Azo-Initiatoren wie Azoisobutylonitril, anorganische Peroxid-Initiatoren wie Kaliumpersulfat und Ammoniumpersulfat, und organische Peroxid-Initiatoren wie Benzoylperoxid und di-t-Butylperoxid als einfache Initiatoren; und eine Kombination von Wasserstoffperoxid und Eisensalz als binären Initiatoren.

Für die einheitliche Reaktion von magnetischer Kieselerde in Partikelform mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid wird eine Lösung, die die mit dem Kopplungsmittel behandelte magnetischer Kieselerde in Partikelform, Acrylamid und/oder Polyacrylamid und einen Initiator enthält, bei einer Temperatur von 30 bis 90°C für eine Zeit von 30 Minuten bis 24 Stunden gerührt. Das nach der Reaktion in der Lösung verbleibende Polyacrylamid hat ein zahlenmäßig gemitteltes Molekulargewicht, das vorzugsweise von 1,000 bis 1,000,000 reicht. Wenn das Polyacrylamid in der Lösung nach der Reaktion ein zahlenmäßig gemitteltes Molekulargewicht von weniger als 1,000 hat, kann die Reaktion zwischen der bei der magnetischen Kieselerde in Partikelform eingeführten funktionellen Gruppe und dem Acrylamid und/oder Polyacrylamid nicht genügend fortgeschritten sein. Wenn andererseits das Polyacrylamid in der Lösung nach der Reaktion ein zahlenmäßig gemitteltes Molekulargewicht von mehr als 1,000,000 hat ist die Viskosität der Lösung zu hoch, um das Polyacrylamid einheitlich in die magnetische Kieselerde in Partikelform einzubringen.

Der resultierende magnetische Träger wird gewaschen, um nicht gebundenes Acrylamid und Polyacrylamid zu entfernen. Der magnetische Träger wird mittels Filtration, Zentrifugation oder ein ähnliches Verfahren gesammelt und auf herkömmliche Weise gewaschen. Das Lösungsmittel für das Waschen umfaßt übliches kaltes Wasser, heißes Wasser, hydrophile Alkohole wie Methanol, Ethanol und Propanol, und Gemische von Wasser und Alkohol. Das Entfernungsverfahren entfernt das nicht gebundene Acrylamid und Polyacrylamid so vollständig wie möglich, um die Bindung des Objekts der Absorption daran zu verhindern. Nicht an die magnetische Kieselerde in Partikelform gebundenes Acrylamid und Polyacrylamid ist vorzugsweise mit einem Gehalt von nicht mehr als 1 ppm in dem magnetischen Träger vorhanden.

Der gewaschene magnetische Träger wird auf herkömmliche Weise getrocknet, um den getrockneten magnetischen Träger der vorliegenden Erfindung zu erhaltenen.

Vor dem Trocknen kann der magnetische Träger wegen des Austausches des Lösungsmittels behandelt werden, da das direkte Verdampfen von Wasser von der Oberfläche und dem Inneren des Gels Zusammenziehen, Aggregation oder Zerstörung des Gels verursachen können. Bei dem Verfahren des Austausches des Lösungsmittels wird das Wasser in dem Gel durch ein organisches Lösungsmittel ersetzt und danach wird das organische Lösungsmittel durch Erhitzen entfernt. Das organische Lösungsmittel hat vorzugsweise eine niedrigere Oberflächenspannung als die des Wassers und ist vorzugsweise in jedem Mischungsverhältnis mit Wasser mischbar. Wasser hat eine Oberflächenspannung von 72 dyn/cm (dyn/cm = 10–3Nm–1) in Luft bei 25°C gemäß dem Wilhelm-Verfahren. Ein organisches Lösungsmittel, das eine niedrigere Oberflächenspannung als diese hat, wird ausgewählt. Das organische Lösungsmittel umfaßt Formamid, N,N-Dimethylformamid, Ethylenglycol, Propylenglycol, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, 1-Pentanol und 2-Pentanol. Das Wasser oder das Lösungsmittel wird unter Atmosphärendruck verdampft, kann aber unter reduziertem Druck verdampft werden.

Bei dem vorstehenden Verfahren kann die magnetische Kieselerde in Partikelform, die eingeführtes Polyacrylamid hat, nach dem Waschen ohne Trocknen in demselben Lösungsmittel aufbewahrt werden, wie das für das Waschen verwendete.

Bei der Einführung des Polyacrylamids kommt es mit steigenden Mengen der Zugabe von Polyacrylamid zu dem magnetischen Träger bei einer gewissen Grenze zu einer Sättigung des eingeführten Polyacrylamid, gemäß der Messung der Stickstoffatome mittels Röntgenstrahl-Photoelektronenspektroskopie. Aus dieser Tatsache wird gefolgert, dass bei dem magnetischen Träger der vorliegenden Erfindung das Polyacrylamid mit steigender Menge an Polyacrylamid mit einer gewissen Menge gebunden wird, um fast vollständig die Oberfläche des Partikels an magnetischer Kieselerde zu bedecken.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung wird in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung ist bei der Absorption und Extraktion von Zuckern, niedermolekularen hydrophoben organischen Verbindungen und Nucleinsäuren von Nutzen. Der magnetische Träger ist auch als Träger bei Analysemessungen von Nucleinsäuren, Zuckern und so weiter, und Träger bei Trennmitteln wie der Affinitätschromatographie für Zucker, niedermolekulare hydrophobe organische Verbindungen, Nucleinsäuren und dergleichen von Nutzen.

Insbesondere bei der Verwendung bei der Absorption und Extraktion von Nucleinsäuren wird der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung mit einer Probe die eine Nucleinsäure enthält gemischt, um die Nucleinsäure in der Probe zu absorbieren, und der magnetische Träger wird unter Verwendung eines magnetischen Felds von der Probe abgetrennt, um die Nucleinsäure einfach zu extrahieren. Nach der Extraktion wird die Nucleinsäure durch Zugabe eines Desorptionslösungsmittel wie Wasser von dem magnetischen Träger desorbiert, um die Nucleinsäure abzutrennen. Die mittels Desorption abgetrennte Nucleinsäure wird direkt amplifiziert oder mittels der Polymerase-Kettenreaktion, wodurch die Menge der Nucleinsäure bestimmt werden kann.

Wie vorstehend beschrieben, ist der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung bei der Absorption und Extraktion von Nucleinsäuren von Nutzen. Dies wird nachstehend behandelt. Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung hat Polyacrylamid auf der Oberfläche, so daß die polaren funktionellen Gruppen, wie Amid, die in der Lage sind, mit einer Nucleinsäure eine Wechselwirkung einzugehen, nicht nur auf der Oberfläche des Trägers fixiert sind, sondern sich als hochmolekulare Polyacrylamidketten von der Oberfläche des Trägers weg erstrecken, wobei das Ende des Polyacrylamidmoleküls an die Trägeroberfläche gebunden ist. Somit sind die aktiven Stellen für die Wechselwirkung mit der hochmolekularen Nucleinsäure erhöht und die einmal gebildete Wechselwirkung wird durch Überlagerung mit dem Polyacrylamid stark gehalten. Die vorstehende Überlegung beschränkt die vorliegende Erfindung jedoch nicht.

[Beispiele]

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend detaillierter unter Bezug auf Beispiele beschrieben, ohne die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken. Die Auswertungen wurden wie nachstehend gezeigt durchgeführt.

Die in den Beispielen verwendete magnetische Kieselerde in Partikelform war gemäß den Messungen der magnetische Hysterese mittels eines vibrierenden Probenmagnetometers (Modell BHV-50, hergestellt von Riken Denshi K.K.) superparamagnetisch.

-Gehalt an magnetischem Material-

Für die Bestimmung von Si wurde die magnetische Kieselerde in Partikelform durch Königswasser zersetzt und mit Perchlorat behandelt und der Gehalt würde durch gravimetrische Analyse bestimmt. Für die Bestimmung von Fe (Eisen) wurde die magnetische Kieselerde in Partikelform mit Salpetersäure-Salzsäure zersetzt und mit Perchlorat behandelt und der Gehalt wurde durch ICP-Emissionsspektrometrie bestimmt.

-Mittlerer Partikeldurchmesser-

Die Probe wurde in Wasser dispergiert und die Dispersion wurde der Messung mit dem Teilchengrößenverteilungstestgerät LS-130 (hergestellt von Coulter Co.) unterworfen. Die Größe wurde durch einen Volumen-gemittelten Partikeldurchmesser dargestellt.

-Mittlerer Porendurchmesser und mittleres Porenvolumen-

Die Messung wurde durch ein Verfahren der Quecksilberdurchdringung mit einem Porengrößenmeßgerät 9320 (hergestellt von Micromeritics Co.) durch Anwendung eines Drucks durchgeführt, der von 0 bis 207 Mpa reichte.

-BET-spezifische Oberfläche-

Die Messung wurde mittels eines BET-Einpunkt-Verfahrens mit Monosorb (hergestellt von US Quanatachrome Co.) durchgeführt.

-Oberflächenanalyse-

Fe, Si, N, C und O auf der Oberfläche des Probenpartikels wurden mittels eines Röngenstrahl-Photoelektronenspektrometers (ESCA 5400MC, hergestellt von Perkin-Elmer Co.) bestimmt. Die Zusammensetzung wurde durch die Oberflächenelementzusammensetzung (Atom-%) in Relation zu der Gesamtmenge (100%) an Fe, Si, N, C und O dargestellt.

-N-Gehalt (Polyacrylamidgehalt)-

Stickstoff wurde mittels eines Elementaranalysegeräts bestimmt.

-Konzentration an gelöstem Sauerstoff-

Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Reaktionslösung wurde mit einem Konzentrationstestgerät für gelösten Sauerstoff (Modell UC-12, hergestellt von Central Kagaku Co.) gemessen.

-Polymerisationsgrad von Polyacrylamid-

Der Polymerisationsgrad von Polyacrylamid wurde mit einem Satz an Hochleistungs-Flüssigchromatographiegeräten (AS-8000, CCPM, CO-8010, RI-8010 und SC-8010, hergestellt von Tosoh Corporation) unter Verwendung eines Standard-Polyethylenoxid-Kits (hergestellt von Tosoh Corporation) als Standard für das Molekulargewicht gemessen. Das Molekulargewicht wurde als zahlenmäßig gemitteltes Molekulargewicht dargestellt.

-Durchführung der Extraktion der Nucleinsäure (typisches Verfahren)-

Die verwendete Nucleinsäure war pAW 109 DNA (hergestellt von Perkin-Elmer Co.) mit einer Probenkonzentration von 2 × 107 Molekülen/ml.

Zu 200 &mgr;l der Nucleinsäureprobenlösung wurden 400 &mgr;l der nachstehend gezeigten Extraktionsflüssigkeit zugegeben, die feste Phase enthielt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten gerührt. Dann wurde der magnetische Träger unter Verwendung eines Magneten in der Ecke des Gefäßes zusammengebracht und die Lösung durch Absaugen entfernt. Das verbleibende Gel wurde erneut in 0,4 ml Waschlösung (wäßrige 40 Vol.-%-ige Isopropanollösung) suspendiert, die zugegeben wurde. Dann wurde das Gel mit einem Magneten erneut in der Ecke des Gefäßes zusammengebracht und die Lösung durch Absaugen entfernt. Der magnetische Träger wurde in 200 &mgr;l Elutionslösung (Wasser) suspendiert und das Gel wurde in der Ecke des Gefäßes zusammengebracht und die Elutionslösung durch Absaugen entfernt. Die Lösung wurde vakuumgetrocknet, um einen festen Stoff zu erhalten. Dieser feste Stoff wurde erneut in 200 &mgr;l Wasser aufgelöst. Ein Teil von 50 &mgr;l von dieser Lösung wurde einer Polymerase-Kettenreaktion (nachstehend als "PCR" bezeichnet) in der nachstehend gezeigten Weise unterworfen.

Der magnetische Träger wurde in einer Menge von 2,5 mg/ml zu wäßrigem 50 Vol-%-igem Isopropanol zugegeben, um die vorstehend erwähnte Extraktionsflüssigkeit herzustellen, die feste Phase enthält. Es wurden zwei Primer verwendet: Sequenz Nr. 1 und Sequenz Nr. 2, nachstehend gezeigt. Bei der Zusammensetzung der PCR-Reaktionslösung war die Nucleinsäure von Sequenz Nr. 1 0,2 &mgr;M-Vorwärtsprimer DM 151, die Nucleinsäure von Sequenz Nr. 2 0,2 &mgr;M-Rückwärtsprimer DM 152, und andere Komponenten waren 2,2 mM MgCl2, 0,29 mM dNTP und 2,25 Einheiten/75 &mgr;l Taq-Polymerase (Ampli Taq Gold). Sie wurde der PCR bei 95°C 10 Minuten 45 Sekunden unterworfen, und 45 Zyklen bei 95°C 15 Sekunden, und bei 60°C 30 Sekunden, und danach bei 72°C 7 Minuten. Nach Vollendung der PCR wurde ein Teil der Reaktionslösung einer Agarose-Elektrophorese unterworfen und die Anwesenheit der erwarteten Größe der Banden wurde visuell überprüft.

Der vorstehende Extraktionstest wurde für jede Probe zehnmal wiederholt. Das Maß des Nachweises der extrahierten Nucleinsäure (Banden der erwarteten Größe) wurde als Nachweisverhältnis als ein Maß der Nucleinsäureextraktion gezeigt. Nachweisverhältnis (%) = [(Mal Nachweis der extrahierten Nucleinsäure)/(Gesamtzahl mal Extraktionstests)] × 100

Beispiel 1

Ein Lösungsgemisch von 150,0 g Si (OC2H5)4 und 62,7 g Ethanol wurde bei 40°C 30 Minuten gerührt. Zu der Lösung wurden tropfenweise unter Rühren bei einer Temperatur von 40°C 14,9 g wäßrige 1/100 N Salzsäurelösung zugegeben. Die Lösung wurde eine Stunde gerührt und dann bei 90°C 4 Stunden und bei 165°C 12 Stunden unter Entfernen des Destillats, um ein Si-Alkoxid-Polymer zu erhalten. Die vorstehende Reaktion wurde unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Das erhaltene Si-Alkoxid-Polymer hatte bei Raumtemperatur gemäß dem vorstehend erwähnten Meßverfahren eine Viskosität von 50 Centipoise. 70,0 g des erhaltenen Si-Alkoxid-Polymeren wurden in 70,0 g 1-Pentanol gelöst. Dazu wurden 20 ml einer kommerziellen magnetischen Flüssigkeit (hergestellt von Ferro Tech K.K.: enthaltend 35 Gew.-% eines magnetischen Materials, 10 Gew.-% eines oberflächenaktiven Mittels und der Rest 1-Butanol (gesamt 100%) zugegeben, um eine einheitliche Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde zu 560,0 g wäßrigem 5%-igem Polyvinylalkohol zugegeben und unter Rühren bei 80°C gehalten. Nach 30 Minuten Rühren des Gemischs wurden 12,5 ml wäßriger 5 Gew.-%-iger NH4OH zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 80°C gerührt. Die resultierende flüssige Suspension wurde in 1000 ml heißes Wasser von 70°C gegossen. Der gebildete Feststoff wurde mittels Filtration gewonnen und mit warmem Wasser gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Lösungsmittel dreimal durch 2-Propanol ersetzt und der Feststoff wurde vakuumgetrocknet, um kugelförmige magnetische Kieselerde in Partikelform zu erhalten.

Zehn Gramm dieser magnetischen Kieselerde in Partikelform wurde 15 Stunden bei 150°C getrocknet. Die getrocknete Kieselerde wurde zu 100 ml Toluol zugegeben und das Gemisch wurde gerührt. Zu der Lösung wurden 4 ml Methacryloxypropyltrimethoxysilan, 0,7 ml Dimetylaminoethanol und 50 &mgr;l Phenol zugegeben und das Gemisch wurde gerührt. Nach 3 Stunden Rühren bei 85°C wurde diese Lösung gefiltert, um eine magnetische Kieselerde in Partikelform zu erhalten, die die 3-Methacrylgruppe hat. Diese Kieselerde wurde mit 50 ml Toluol gewaschen und einer zweifachen Filtration unterworfen, um eine magnetische Kieselerde in Partikelform zu erhalten, die die 3-Methacrylgruppe hat. Sie wurde mit 50 ml Methanol gewaschen und dreimal gefiltert und weiterhin mit 50 ml einer wäßrigen 40 Vol.-%-igen Methanollösung gewaschen und zweimal gefiltert. Diese magnetische Kieselerde in Partikelform wurde zu 100 ml einer wäßrigen 40 Vol.-%-igen Methanollösung zugegeben und wurde gerührt. Zu der Lösung wurden 9 g Acrylamid-Monomer und 0,3 g Kaliumpersulfat zugegeben und das Gemisch wurde gerührt. Die Lösung wurde 15 Stunden bei 60°C unter einem Stickstoffstrom von 50 ml/Min. gerührt. Dazu wurden 200 ml warmes Wasser zugegeben. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten, der einen magnetischen Träger zu erhalten, der mit Polyacrylamid modifiziert ist. Der Niederschlag wurde mit 100 ml warmem Wasser gewaschen und viermal filtriert. Weiterhin wurde der Lösungsmittelaustausch und die Filtration unter Verwendung von 50 ml 2-Propanol dreimal durchgeführt. Der behandelte Niederschlag wurde vakuumgetrocknet, um einen magnetischen Träger zu erhalten.

Der erhaltene magnetischen Träger wurde der Messung des Gehalts an Polyacrylamid (Mole bezüglich monomerem Acrylamid), des Partikeldurchmessers, der Menge der Stickstoffatome an der Oberfläche, des mittleren Porendurchmessers gemäß des Quecksilberdurchdringungsverfahrens, des Porenvolumens, des mittleren Molekulargewichts des Polyacrylamid in der Reaktionslösung und des gelösten Sauerstoffs in der Reaktionslösung unterworfen, gemäß der vorstehend beschriebenen Meßverfahren. Tabelle 1 zeigt die Meßergebnisse. Die erhaltene Polyacrylamid-gebundene magnetische Kieselerde in Partikelform (magnetischer Träger) wurde auf seine Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion überprüft. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Mit diesem magnetischen Träger wurde die Bande der erwarteten Größe beobachtet, was die Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion zeigt. Das Nachweisverhältnis war 100%. Somit wurde die Nucleinsäureextraktion mit ausreichender Reproduzierbarkeit durchgeführt.

Beispiel 2

Eine an Polyacrylamid-gebundene magnetische Kieselerde in Partikelform (magnetischer Träger) wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, außer dass 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan durch Triethoxyvinylsilan ersetzt wurde. Der erhaltene magnetische Träger enthielt Polyacrylamid mit einem molaren Gehalt von 1,4 mmol/g bezüglich monomerem Acrylamid auf der Basis des Trockengewichts. Der erhaltene magnetische Träger wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bewertet. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Dieser magnetische Träger wurde hinsichtlich seiner Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bewertet. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die Leistungsfähigkeit dieses magnetischen Trägers bei der Nucleinsäureextraktion wurde durch die Anwesenheit der Bande der erwarteten Größe im Leistungstest bestätigt. Das Nachweisverhältnis war 100%. Somit wurde die Nucleinsäureextraktion mit ausreichender Reproduzierbarkeit durchgeführt.

Beispiel 3

Eine an Polyacrylamid-gebundene magnetische Kieselerde in Partikelform (magnetischer Träger) wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, außer dass 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan durch Dimethoxy-3-glycidoxypropylmethylsilan ersetzt wurde. Der erhaltene magnetische Träger enthielt Polyacrylamid mit einem molaren Gehalt von 3,5 mmol/g bezüglich monomerem Acrylamid auf der Basis des Trockengewichts. Der erhaltene magnetische Träger wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bewertet. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Dieser magnetische Träger wurde hinsichtlich seiner Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bewertet. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die Leistungsfähigkeit dieses magnetischen Trägers bei der Nucleinsäureextraktion wurde durch die Anwesenheit der Bande der erwarteten Größe im Leistungstest bestätigt. Das Nachweisverhältnis war 100%. Somit wurde die Nucleinsäureextraktion mit ausreichender Reproduzierbarkeit durchgeführt.

Vergleichsbeispiel 1

Die magnetische Kieselerde in Partikelform vor der Modifikation mit dem Kopplungsmittel in Beispiel 1 ohne weitere Behandlung wurde hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Mit dieser magnetischen Kieselerde in Partikelform wurde die Extraktion der Nucleinsäure bestätigt, aber die Dichte der Bande der erwarteten Größe war niedrig, und das Nachweisverhältnis war so niedrig wie 20% mit niedriger Reproduzierbarkeit und instabiler Leistung.

Vergleichsbeispiel 2

Eine magnetische Kieselerde in Partikelform, bei der die 3-Methacrylgruppe unter Verwendung von 3- Methacryloxypropyltrimethoxysilan auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 eingeführt wurde, wurde ohne weitere Behandlung verwendet. Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften der magnetischen Kieselerde in Partikelform. Die magnetische Kieselerde in Partikelform wurde hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 getestet. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die Nucleinsäure konnte mit dieser magnetischen Kieselerde in Partikelform, das Nachweisverhältnis war null Prozent.

Beim Vergleich der Vergleichsbeispiele 1 und 2 mit den Beispielen zeigte die magnetische Kieselerde in Partikelform, die kein Polyacrylamid eingeführt hat, eine geringe Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion. Die Einführung der 3-Methacrylgruppe bei der magnetischen Kieselerde in Partikelform vermindert die Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion noch weiter. Die weiter Einführung von Polyacrylamid zu dieser magnetischen Kieselerde in Partikelform wird die Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion ergeben.

Vergleichsbeispiel 3

Eine an Polyacrylamid-gebundene magnetische Kieselerde in Partikelform wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, außer dass die Reaktion der magnetischen Kieselerde in Partikelform, die eine 3-Methacrylgruppe hat (die Eigenschaften sind in Tabelle 1 gezeigt), mit Acrylamid an Luft durchgeführt wird. Der erhaltene magnetische Träger enthielt Polyacrylamid mit einem molaren Gehalt von 0,2 mmol/g bezüglich monomerem Acrylamid auf der Basis des Trockengewichts. Das Polyacrylamid wurde weniger eingeführt.

Die Konzentration an N (Stickstoff) an der Oberfläche war so niedrig wie 1,3 Atom-%. Dieser magnetische Träger wurde auf seine Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bewertet. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion dieses magnetischen Trägers wurde durch die Anwesenheit der Bande der erwarteten Größe im Leistungstest bestätigt. Das Nachweisverhältnis war jedoch so niedrig wie 20% und die Extraktionsleistung war instabil.

Beim Vergleich von Vergleichsbeispiel 3 mit den Beispielen ergibt die niedrigere Menge an eingeführtem Polyacrylamid eine niedrigere Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion.

Beispiel 4

Der in Beispiel 1 hergestellte magnetische Träger wurde mit gepoolten Serum von HCV-infizierten Personen als praktischem Beispiel auf seine Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion bewertet. Das Verfahren der Bewertung war wie nachstehend.

Zu 150 &mgr;l gepooltem Serum von HCV-infizierten Personen wurden 300 &mgr;l einer Extraktionsflüssigkeit gegeben, die eine feste Phase enthält, die nachstehend gezeigt ist. Das Gemisch wurde 12 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde der magnetische Träger unter Verwendung eines Magneten in der Ecke des Gefäßes zusammengebracht und die Lösung durch Absaugen entfernt. Das verbleibende Gel wurde erneut in 0,3 ml Waschlösung (ein Gemisch von Isopropanol (40%) und einer wäßrigen 0,33 M KCl-Lösung (60%)) suspendiert, die zugegeben wurde. Dann wurde das Gel mit einem Magneten wieder in der Ecke des Gefäßes zusammengebracht und die Lösung durch Absaugen entfernt. Der magnetische Träger wurde in 100 &mgr;l Elutionslösung (destilliertes Wasser zur Injektion) suspendiert und das Gel in der Ecke des Gefäßes zusammengebracht, und 10 &mgr;l der Flüssigkeit vom Boden des Gefäßes wurden für die Umwandlung in DNA einer Reaktion mit reverser Transkriptase unterworfen. Dazu wurde für die Durchführung der PCR eine Polymerase-Lösung zugegeben.

Die vorstehend erwähnte Extraktionslösung, die eine feste Phase enthält, die Zusammensetzung der Reaktionslösung für die reverse Transkription und die PCR-Reaktionslösung und die Temperaturbedingungen für die PCR sind nachstehend gezeigt.

Die Extraktionslösung, die eine feste Phase enthält, war ein 1 : 1 Gemisch von 6 M Guanidinthiocyanat/37,5 mM Natriumcitratlmagnetischer Träger (1,2 mg/ml) und Isopropanol. Die reverse Transkription wurde mit einer Nucleinsäure der Sequenz Nr. 3 (1,2 &mgr;M HCV reverser Primer), 4,5 mM MgCl2, 3,4 mM NaCl, 1,4 mM dNTP, 0,87 mM DTT, 1,3 Einheiten/&mgr;l RNase-Inhibitor (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und 2,0 Einheiten/&mgr;l MMLV RTase (hergestellt von BRL Co.). Dann wurde die PCR mit einem Nucleinsäureprimer der Sequenz Nr. 4 (240 nM HCV Vorwärtsprimer), 2,2 mM MgCl2, 0,29 mM dNTP und 2,25 Einheiten/75 &mgr;l Taq-Polymerase (Ampli Taq Gold) durch 45 mal Wiederholung des Zyklus bei 95°C für 20 Sekunden, und bei 60°C 30 Sekunden, und danach 60 Sekunden Behandlung bei 72°C. Nach Vollendung der PCR wurde ein Teil der Reaktionslösung einer Agarose-Elektrophorese unterworfen und die Anwesenheit der erwarteten Größe der Banden wurde visuell überprüft.

Der vorstehende Extraktionstest wurde zehnmal wiederholt. Das Maß des Nachweises der Nucleinsäureextraktion (Banden der erwarteten Größe) wurde als Nachweisverhältnis als ein Maß der Nucleinsäureextraktion gezeigt. Nachweisverhältnis (%) = [(mal Nachweis der extrahierten Nucleinsäure)/ (mal Extraktionstests)] × 100

Die Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Bande der erwarteten Größe wurde nachgewiesen, womit die Leistungsfähigkeit bei der Nucleinsäureextraktion bestätigt wurde. Das Nachweisverhältnis war 100%, was die Reproduzierbarkeit der Extraktion bei einem praktischen Beispiel zeigt.

Der magnetische Träger der vorliegenden Erfindung, der Acrylamid und/oder Polyacrylamid einheitlich auf seiner Oberfläche gebunden hat, zeigt charakteristische Absorptions- und Extraktionsleistung, die von der magnetischen Kieselerde in Partikelform selbst nicht gezeigt werden. Darüber hinaus ist er in kugelförmiger Form, enthält eine ausreichende Menge an magnetischem Material und hat offensichtliche eine hohe Stärke, so dass er als Absorptionsmittel und Extraktionsmittel von Nutzen ist. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann magnetischen Kieselerde in Partikelform, die eine gewünschte Menge an Acrylamid und/oder Polyacrylamid entsprechend dem Anwendungsgebiet hat, leicht hergestellt werden. Darüber hinaus kann eine Nucleinsäure unter Verwendung des magnetischen Trägers der vorliegenden Erfindung mit guter Reproduzierbarkeit leicht extrahiert werden.

[Sequenztabelle]

Anspruch[de]
  1. Magnetischer Träger, der Kieselerde in Partikelform umfasst, enthaltend ein magnetisches Material, der auf seiner Oberfläche Polyacrylamid in einer Menge von 0,3 bis 5 mmol/g in Bezug auf monomeres Acrylamid aufweist.
  2. Magnetischer Träger nach Anspruch 1 zur Adsorption-Abtrennung oder -Extraktion einer Nucleinsäure, wobei der magnetische Träger Polyacrylamid in einer Menge von 0,5 bis 5 mmol/g in Bezug auf monomeres Acrylamid enthält.
  3. Magnetischer Träger nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Menge an Stickstoffatomen auf der Oberfläche des magnetischen Trägers nicht weniger als 5 Atom-% beträgt.
  4. Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

    (a) Bereitstellen von magnetischer Kieselerde in Partikelform durch Zugabe eines magnetischen Materials zu der Kieselerde oder einem Kieselerdequellenmaterial;

    (b) Umsetzen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (a) mit einem Kopplungsmittel;

    (c) Waschen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (b);

    (d) Umsetzen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (c) mit Acrylamid und/oder Polyacrylamid; und

    (e) Waschen und Trocknen der magnetischen Kieselerde in Partikelform nach Schritt (d).
  5. Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers nach Anspruch 4, wobei in Schritt (e) nach dem Waschen der magnetischen Kieselerde in Partikelform mit Wasser das Lösungsmittel ersetzt wird und das Gel dann getrocknet wird.
  6. Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers nach Anspruch 4 oder 5, wobei in Schritt (d) die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Reaktionslösung, die die magnetische Kieselerde in Partikelform und Acrylamid und/oder Polyacrylamid enthält, so kontrolliert wird, dass sie nicht höher als 1 mg/l ist.
  7. Verfahren zur Herstellung des magnetischen Trägers nach Anspruch 5 oder 6, wobei in Schritt (d) das Polyacrylamid in der Lösung nach der Umsetzung ein Molekulargewicht-Zahlenmittel im Bereich von 1.000 bis 1.000.000 hat.
  8. Verfahren zur Extraktion einer Nucleinsäure, umfassend das Mischen des in einem der Ansprüche 1 bis 3 genannten magnetischen Trägers mit einer Probe, Adsorbieren einer Nucleinsäure in der Probe durch den magnetischen Träger, Abtrennen des magnetischen Trägers von der Probe durch Verwendung einer magnetischen Kraft.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






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