In Anbetracht des Standes der Technik war es nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus Gemischen, die lipophile Verbindungen umfassen, zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren eine schonende Reinigung (thermisch) labiler Verbindungen wie PUFAs oder deren Derivate ermöglichen. Das Verfahren sollte möglichst einfach durchführbar und kostengünstig sein und den gesetzlichen Auflagen betreffend Lebensmittel- Pharmaka- oder Kosmetikaqualität entsprechen.

Gelöst werden diese sowie weitere nicht explizit genannte Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend diskutierten Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch ein Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus einem Gemisch, das lipophile Verbindungen umfasst mit allen Merkmalen des Patentanpruchs 1. Zweckmäßige Abwandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüchen unter Schutz gestellt.

Dadurch, dass man verseifbare lipophile Verbindungen aus einem Gemisch, umfassend Antischaummittel auf Silikonbasis, verseift und anschließend die organische Phase, enthaltend die gereinigten Fettsäuren, von einer wässrigen Phase isoliert, gelingt es auf nicht ohne Weiteres vorhersehbare Weise, ein Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis von lipophilen Verbindungen zur Verfügung zu stellen.

Dieses Verfahren ist äußerst einfach und entsprechend kostengünstig durchzuführen. Auch ist das Verfahren denkbar schonend, was besonders für die Aufreinigung labiler Verbindungen, wie z. B. ungesättigter Verbindungen, wie PUFAs von Vorteil ist.

Das Gemisch aus dem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Antischaummittel auf Silikonbasis abgetrennt werden, umfasst neben dem Antischaummittel mindestens eine verseifbare lipophile Verbindung.

Zu den erfindungsgemäß bevorzugten verseifbaren lipophilen Verbindungen zählen natürliche Öle, wie Fischöle, Pflanzenöle, mikrobiell hergestellte Öle, aber auch prozessierte Öle, Estergemische, freie Fettsäuregemische, gesättigte oder ungesättigte organische Verbindungen und/oder Derivate solcher Verbindungen.

Das die verseifbaren lipophilen Verbindungen enthaltende Öl kann gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung durch die Fermentation (= Kultivierung) von Mikroorganismen erhalten werden. Die entsprechenden Techniken sind in der Fachwelt gut bekannt.

Insbesondere wird dies durch Animpfen eines geeigneten Kultivierungsmediums mit einem Mikroorganismus, Kultivierung des Mikroorganismus und anschließende Isolierung des Öls aus der die Mikroorganismen umfassenden Biofeuchtmasse erreicht.

Vor der Isolierung des Öls kann die Biofeuchtmasse aufgeschlossen werden, beispielsweise mittels Kugelmühle oder Hochdruckhomogenisator. Vor dem Aufschluss kann die Biofeuchtmasse aufkonzentriert werden, beispielsweise durch Zentrifugation, Tangentialfiltration, Mikrofiltration, Sedimentation, Flotation oder mittels Separatoren. Andere Methoden sind aber ebenfalls denkbar. Der Feuchteanteil der Biofeuchtmasse beträgt nach der Aufkonzentrierung bevorzugterweise 5–60%, bevorzugt 5–50%, besonders bevorzugt 10–40% und ganz besonders bevorzugt 10–30%. Dieser Feuchteanteil der Biomasse kann beispielsweise ermittelt werden, indem eine bestimmte Menge der Biofeuchtmasse im Trockenschrank bei 180°C für 24h getrocknet wird und anschließend der Gewichtsunterschied ermittelt wird, der dem Feuchteanteil entspricht.

Die Kultivierung selbst kann im Batch-, Fed-Batch aber auch in kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultivierung in einem Rühr-, Blasensäulen- oder Airliftfermenter oder in Spinnerflaschen durchgeführt. Während der Fermentation kann der pH-Wert reguliert werden, vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von pH 4 bis pH 9. Die Kultivierungstemperatur liegt ja nach Spezies der Mikroorganismen zwischen 10°C und 45°C.

Das Kultivierungsmedium (Fermentationsmedium) umfasst erfindungsgemäß alle zur Kultivierung der entsprechenden Mikroorganismen notwendigen Komponenten. Diese umfassen

Kohlenstoffquellen wie Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, Stärke, Fucose, Glucosamin, Lactose, Melasse, Dextran, Sojaöl, Sonnenblumenöl, Glycerin, Glutaminsäure, Mannitol; Magermilchpulver oder Acetat,

Stickstoffquellen, wie Peptone, Hefeextrakt, Malzextrakt, Fleischextrakt, Casamino Acids, Corn Steep Liquor, Harnstoff oder Ammoniumsalze,

Phosphatquellen, wie Kaliumphosphat oder Kalium-Dihydrogenphosphat

Vitamine,

Spurenelemente, wie Eisen, Kupfer, Calcium oder Magnesium

oder Wachstumsfaktoren.

Erfindungsgemäß kann es sich bei den Mikroorganismen, aus denen das Öl gewonnen wird, beispielsweise um Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Algen oder Protozoen handeln.

Bevorzugte Bakterien entstammen den Gattungen Butyrivibrio und Lactobacillus.

Bevorzugte Pilze entstammen den Gattungen Cunninghamella, Mortierella, Mucor, Phycomycetes, oder Rhizopus. Besonders bevorzugt sind die Spezies Mortierella ramanniana, Mucor rouxii, M. alpina, Phycomycetes blakesleeanus und Rhizopus arrhizus.

Bevorzugte Algen entstammen der Gattung Spirulina, besonders bevorzugt ist die Spezies S. platensis.

Bevorzugte Protozoen entstammen den Familien Amoebozoa, Apicomplexa, Choanozoa, Ciliophora, Dinozoa, Entamoeba, Euglenozoa, Haplosporidina, Heliozoa, Labyrinthulomycota, Mycetozoa, Opalozoa, Parabasalia, Paramyxia, Percolozoa, Radiozoa oder Rhizopoda, besonders bevorzugt Ciliophora ("Ciliaten").

Bevorzugte Ciliatenunterklassen sind Holotricha, Petritricha, Spirotricha und Suctoria.

Bevorzugte Gattungen sind Colpoda, Colpidium, Crypthecodinium, Cyclotella, Engelmanniella, Euglena, Euplotes, Glaucoma, Gonyoaulax, Gymnodinium, Navicula, Nitzschia, Paramecium, Parauronema, Stylonichia, Schizochytrium, Tetrahymena, Thraustochytrium und Ulkenia, besonders bevorzugt sind Colpidium, Tetrahymena, sowie Ulkenia.

Bevorzugte Arten sind Tetrahymena pyriformis, T. rostrata, T. setosa, T. thermophila und Colpidium campylum. (Klassifizierung der Protozoen nach K. Hausmann: Protozoologie, Thieme Verlag, 1985.) Ein besonders geeignetes Fermentationsverfahren von Ciliaten zur Produktion biogener Wertstoffe, wie beispielsweise ein Fettsäuren enthaltendes Öl, wird in der internationalen Patentanmeldung WO 99/15634 A1 beschrieben.

Ein weiteres geeignetes Verfahren zur Gewinnung von GLA aus Protozoen wird beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 1 024 199 A2 beschrieben.

Die Isolation des Öls kann durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmitteln erfolgen. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zu diesem Zweck ist n-Hexan, ev. unter Zusatz von Ethanol. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Isolation des Öls durch Zentrifugation, besonders bevorzugt ohne den vorherigen Zusatz von Lösungsmitteln. Andere Methoden, die in der Fachwelt gut bekannt sind, können auch zur Anwendung kommen.

Die im Öl enthaltenen verseifbaren lipophilen Verbindungen sind erfindungsgemäß bevorzugt Lipide, bzw. Fettsäurederivate, wie Mono-, Di- oder Triglyceride, Fettsäureester, oder -ether. Bevorzugte Fettsäureester sind Fettsäureethylester. Es kann sich bei den lipophilen Verbindungen erfindungsgemäß auch um Phospholipide, Taurolipide oder Tetrahymanol handeln.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind Fettsäuren mit einer Kettenlänge von bis zu 30 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind ungesättigte Fettsäuren, d.h. Fettsäuren die eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen, bzw. hochungesättigte Fettsäuren (PUFAs). Ganz besonders bevorzugt sind Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der &ohgr;-3-ungesättigten Fettsäuren und der &ohgr;-6-ungesättigten Fettsäuren.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Fettsäuren sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hexadecadiensäuren, Hexadecatriensäuren, Hexadecatetraensäuren, Linolsäure, &agr;-Linolensäure, &ggr;-Linolensäure (GLA), Stearidonsäure, Arachidonsäure (ARA), Eicosatriensäuren, Eicosatetraensäuren, Eicosapentaensäuren (EPA), Docosapentaensäuren, Docosahexaensäure (DHA), Tetracosadiensäuren, Octacosaoctaensäuren.

Die erfindungsgemäßen natürlichen Öle enthalten einen unterschiedlichen Anteil an den verschiedenen Fettsäuren. Fischöle können beispielsweise 10–20% DHA enthalten, Mikrobiell hergestellte Öle enthalten bis zu 60 % DHA und bis zu 33% GLA, Nachtkerzenöl enthält bis zu 14% GLA, Borretschöl bis zu 27% GLA.

Bei dem Antischaummittel auf Silikonbasis handelt es sich erfindungsgemäß bevorzugt um ein Siloxan.

Silikonentschäumer sind ölige, pastöse oder wässrige emulgierte Silikon-Präparate (gewöhnlich Polydimethylsiloxane), die bereits in sehr geringen Mengen (1 ppm) wirken und als Antischaummittel in der Textilveredlungs-, Kunststoff-, Lack-, Papier-, Seifen-, Nahrungsmittel-, Bio- und Mineralöl-Industrie verwendet werden.

Die Silikone stellen eine umfangreiche Gruppe von synthetischen polymeren Verbindungen, in denen Silicium-Atome über Sauerstoff-Atome ketten- und/oder netzartig verknüpft und die restlichen Valenzen des Siliciums durch Kohlenwasserstoff-Reste (meist Methyl-, seltener Ethyl-, Propyl-, Phenyl-Gruppen und andere) abgesättigt sind. Einfache linear-polymere Silikone sind nach dem Schema (R2SiO)x aufgebaut.

Systematisch werden die Silikone als Polyorganosiloxane bezeichnet; diese Namensbildung basiert auf der Benennung der Si-O-Si-Bindung als Siloxan-Bindung und hat sich in der wissenschaftlichen Literatur eingebürgert. Ein Polymer der allgemeinen Formel

Die Silikone nehmen eine Zwischenstellung zwischen anorganischen und organischen Verbindungen, insbesondere zwischen Silikaten und organischen Polymeren ein. Die Silikone können je nach Kettenlänge, Verzweigungsgrad und Substituenten niedrig- bis hochviskos oder fest sein. Sie sind wärmebeständig und hydrophob.

Silikone sind lineare Polydimethylsiloxane der oben dargestellten allgemeinen Struktur, die zu Emulsionen, Antischaummitteln, Pasten, Fetten und dergleichen verarbeitet werden; auch Poly(methylphenylsiloxane) kommen zum Einsatz. Die Silikon-Öle stellen gewöhnlich klare, farblose, neutrale, geruchsfreie, hydrophobe Flüssigkeiten dar mit MR 1000–150 000, Dichte: 0,94–0,97 g/l und Viskositäten zwischen 10 und 1 000 000 mPa s (nur wenig Temperatur-abhängig). Sie sind an der Luft dauerwärmebeständig bis ca. 180 °C, haben Stockpunkte von –80 °C bis –40 °C, Sdp. > 200 °C und sind löslich in Benzol, Toluol und aliphatischen, auch chlorierten Kohlenwasserstoffen.

Zum Nachweise der Silikone sind physikalische Analysenverfahren einsetzbar, z.B. die IR-Spektroskopie und die Pyrolyse-Gaschromatographie. Eine Analyse des Silkongehaltes läßt sich aber auch indirekt über eine Elementaranalyse von Silicium durchführen. Dabei kann jedes allgemein bekannte und offiziell anerkannte Verfahren zur Anwendung kommen (z.B. §35 Lebensmittelbedarfsgegenstände (LMBG), L00.00–19/1). Die Analyse erfolgt in diesem Falle – ev. nach Aufschluß der Probe – per Massenspektrometrie (ICP-MS).

Ein Siloxane mit einem geringen Molekulargewicht sind bevorzugt, da es beispielsweise bei der Kultur von Mikroorganismen, insbesondere von Ciliaten im Gegensatz zu Siloxanen mit höherem Molekulargewicht nicht zu einer negativen Beeinflussung des Biokatalysators kommt. So kann beispielsweise eine Wachstumsinhibierung oder ein Absterben der Mikroorganismen beobachtet werden. Darüber hinaus ist bekannt, dass bei geringer Verträglichkeit die Mikroorganismen keine Produkte bilden.

Das Gewichtsmittel des Molekulargewicht des Siloxans beträgt erfindungsgemäß bevorzugterweise ≤ 10000 Da, besonders bevorzugt ≤ 5000 Da und ganz besonders bevorzugt ≤ 1000 Da.

Die Molmassenverteilung ist mittels Gel-Penneations-Chromatographie bestimmbar.

Bevorzugte Antischaummittel auf Silikonbasis sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Shin-Etsu KM72-F oder M-Compound, Transchemco Trans-series (z.B.Trans-1030), New London Chemicals C-series (z.B. C-21030), Ambersil Antifoam 4016, Elkay LK-AF630.

Erfindungsgemäß kann das Gemisch weiterhin Wasser, Lösungsmittel, organische oder anorganische Verbindungen, Salze u.a. umfassen.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Verseifung durch Katalyse beschleunigt bzw. ermöglicht. Dies kann beispielsweise durch die Einwirkung von Säuren oder Laugen (= Alkali) erfolgen oder durch Einwirkung von Enzymen, bevorzugterweise Lipasen.

Die Temperatur, bei der verseift wird, ist an sich nicht kritisch. Sie ist naturgemäß von der Art des Katalysators abhängig. Nach unten hin ist der Temperaturbereich durch den entsprechenden Aggregatzustand bzw. die Viskosität des zu verseifenden Gemisches begrenzt, nach oben hin durch die Temperaturempfindlichkeit der zu reinigenden Verbindungen, bzw. des Katalysators. Im Allgemeinen erfolgt die Verseifung daher bei einer Temperatur zwischen 10°C und 95°C. Bevorzugt wird sie bei einer Temperatur zwischen 15°C und 60°C durchgeführt und ganz besonders bevorzugt zwischen 20°C und 40°C.

Auch die Dauer der Verseifung ist an sich nicht kritisch. In Frage kommen erfindungsgemäß Zeiten für die Verseifung zwischen 1 min und 1 d, bevorzugt zwischen 10 min und 10 h und besonders bevorzugt zwischen 30 min und 3 h.

Der pH des Gemisches während der Verseifung ist maßgeblich von der Wahl des Katalysators abhängig.

Saure Katalyse findet bei einem pH zwischen 0 und 7 statt, bevorzugt zwischen 2 und 6 und besonders bevorzugt zwischen 3 und 5. Zur Einstellung des pH-Wertes können dem Gemisch Säuren beigefügt werden. Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Säuren zählen Zitronensäure, Weinsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, saure Ionenaustauscher, Salzsäure und Schwefelsäure, wobei hiervon Salzsäure und Schwefelsäure besonders bevorzugt sind.

Alkalische Katalyse findet bei einem pH zwischen 7 und 14 statt, bevorzugt zwischen 8 und 12 und besonders bevorzugt zwischen 9 und 11. Zur Einstellung des pH-Wertes können dem Gemisch Laugen beigefügt werden. Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Laugen zählen Natronlauge (NaOH) und Kalilauge (KOH).

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verseifung unter alkalischer Katalyse in einem alkoholischen Lösungsmittel durchgeführt. Als Alkohol dienen vorzugsweise aliphatische Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Hierzu gehören unter anderem Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Butanol, Pentanol und Hexanol. Hiervon sind Methanol, Ethanol und/oder Isopropanol bevorzugt. Diese Alkohole können einzeln oder als Mischung eingesetzt werden. Bezogen auf das zur Verseifung eingesetzte Lösungsmittel inklusive des Verseifungskatalysators beträgt der Alkoholgehalt vorzugsweise mindestens 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-%.

Der pH Wert des Reaktionsgemisches bei Katalyse mittels Lipasen ist vom gewählten Enzym abhängig. Bevorzugt sind pH Werte zwischen 3,5 und 10,5, besonders bevorzugt zwischen 4 und 10 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4,5 und 9,5. Zur Einstellung des pH Wertes sind dem Fachmann gut bekannte Säuren bzw. Laugen geeignet, die zuvor genannt wurden.

Unter einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Verseifung in einer enzymatisch katalysierten Reaktion, insbesondere durch die Einwirkung von Lipasen. Die entsprechenden Enzyme können zu diesem Zweck in Lösung vorliegen oder immobilisiert. Erfindungsgemäß besonders geeignete Lipasen sind Lipozyme IM RM (N), Lipozyme IM TL (N), R.delemar, carrier EP100 (L), C.antarctica B, carrier 2 (R), M.racemosus (L), R.cohnii (L), C.lipolytica 1 (L), C.lipolytica 2 (L), M.circinelloides (L), C.lipolytica 16 (L), C.antarctica (L), C.rugosa (S), C.antarctica B, carrier 1 (R), C.antarctica B, carrier 3 (R), C.antarctica A, carrier 1 (R), AYS (A) , AS (A), Porcine Pancrease lipase (S), Lipase F (A), Lipase M (A), Lipase G (A), Lipase AP6 (A), Lipase PS (A), M.miehei, carrier 2 (R), Lipase A (A), Lipase PS-C (A), Lipase ACS (A), Lipase AK (A), Lipase PS-D (A), Lipase AY (A). Die in Klammern dargestellten Abkürzungen stellen die Anbieter dar, wobei A= Amno, S= Sigma, R =Roche bedeutet). Die Reaktionsbedingungen für die Verseifung sind im Falle der Verwendung kommerziell erhältlicher Lipasen den Herstellerangaben entsprechend zu wählen.

Die Isolierung der organischen Phase, enthaltend die gereinigten Fettsäuren, kann erfindungsgemäß beispielsweise durch Zentrifugation oder Sedimentation erfolgen.

Gemäß eines bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Ölphase durch einfaches Dekantieren abgetrennt. Es kann zur Isolierung der organischen Phase aber auch eine Zentrifuge oder ein Dekanter verwendet werden. Die Temperatur, bei der die Ölphase abgetrennt wird, ist an sich nicht kritisch. Nach unten hin ist der Temperaturbereich durch den entsprechenden Aggregatzustand bzw. die entsprechende Viskosität des Gemisches begrenzt, nach oben hin durch die Temperaturempfindlichkeit der zu reinigenden Verbindungen. Im Allgemeinen erfolgt die Abtrennung daher bei einer Temperatur zwischen 20°C und 100°C. Bevorzugt wird sie bei einer Temperatur zwischen 30°C und 60°C durchgeführt und ganz besonders bevorzugt bei 40°C.

Erfindungsgemäß beträgt der Silicium-Gehalt des Produktes nach Abtrennung des Silikonöls ≤ 1000 ppm, bevorzugt ≤ 100 ppm und ganz besonders bevorzugt ≤ 10 ppm.

Die Abtrennung der organischen Phase erfolgt von einer wässrigen Phase, die neben Wasser auch wasserlösliche organische Lösungsmittel, beispielsweise Alkohole, wie Ethanol oder Methanol umfassen kann. Das Wasser, von dem die organische Phase abgetrennt wird, kann in dem Gemisch vor der Verseifung enthalten sein. Des weiteren kann das Wasser auch nach der Verseifung zugegeben werden. Beispielsweise kann nach einer alkalischen Verseifung der pH-Wert durch Zugabe einer wässrigen Säurelösung verringert werden.

Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird nach der Verseifung des Öls zur Fettsäure nur geringe Mengen eines organischen Extraktionslösungsmittels zur wässrigen Phase zugegeben. Vorzugsweise werden dem Gemisch nach der Verseifung weniger als 10 Gew.-% organische Extraktionslösungsmittel, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-% organische Extraktionslösungsmittel zugesetzt. Diese Extraktionslösungsmittel sind nicht mit Wasser mischbar. Zu diesen organischen Extraktionslösungsmitteln gehören insbesondere Alkane; wie n-Hexan, Heptan, und Ketone, wie Cyclohexanon. Insbesondere erfolgt die Isolierung der organischen Phase in diesem Schritt des Verfahrens nicht durch Lösungsmittelextraktion aus der wässrigen Phase.

Besonders bevorzugt umfasst das gesamte erfindungsgemäße Verfahren von der Fermentation bis nach der Abtrennung des Antischaummittels keinen Extraktionsschritt mit organischen Lösungsmitteln.

Die vom Silikonöl abgetrennten Fettsäuren können anschließend mit weiteren technischen Verfahren aufgereinigt werden. Bei diesen Verfahren kann es sich um Raffinationen, Extraktionen, chromatographische Verfahren, wie HPLC oder SFC, Destillationen, Winterisierungen oder andere dem Fachmann gut bekannte Methoden handeln.

Das vorliegende Verfahren eignet sich insbesondere zur Aufreinigung von Fettsäuren, die in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden können. Unter anderen können die Fettsäuren als Wirkstoff oder Bestandteil in pharmazeutischen Zubereitungen, als Lebensmittelzusatzstoff und als Bestandteil funktioneller Nahrungsmittel verwendet werden. Hierbei zeichnen sich die Fettsäuren durch einen besonders geringen Silikonölanteil aus.

DHA: Docosahexaensäure

DHAEE: Docosahexaensäureethylester

HPLC: High Pressure Liquid Chromatography

PUFA: Polyunsaturated Fatty Acid

SFC: Supercritical Fluid Chromatography

SFE: Supercritical Fluid Extraction

Nachfolgend wird die Erfindung durch ein Beispiel eingehender erläutert, ohne dass die Erfindung auf dieses Beispiel beschränkt werden soll.