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Dokumentenidentifikation DE69628564T2 13.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000848752
Titel VERFAHREN ZUR REINIGUNG VON VIREN MIT CHROMATOGRAPHIE
Anmelder Aventis Pasteur, Lyon, FR
Erfinder FANGET, Bernard, F-69210 Saint-Germain-sur-l'Arbresle, FR;
FRANCON, Alain, F-69690 Bessenay, FR
Vertreter Zumstein & Klingseisen, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69628564
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 08.07.1996
EP-Aktenzeichen 969249549
WO-Anmeldetag 08.07.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/FR96/01064
WO-Veröffentlichungsnummer 0097006243
WO-Veröffentlichungsdatum 20.02.1997
EP-Offenlegungsdatum 24.06.1998
EP date of grant 04.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.05.2004
IPC-Hauptklasse C12N 7/02
IPC-Nebenklasse A61K 39/12   A61K 39/145   A61K 39/205   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Reinigung von Viren und spezieller die Reinigung von Viren, die durch Kulturen auf Zelllinien erhalten werden.

Die Ernten von Viren, die aus Kulturen auf Zelllinien, wie die Vero-Zellen, erhalten werden, enthalten nicht nur die gewünschten Viren, sondern auch Proteine und DNA, die aus den Kulturzellen stammen. Nun ist es, wenn die Viren für bestimmte Verwendungen bestimmt sind, wie die Herstellung von Impfstoffen, unerlässlich, dass sie so rein wie nur möglich sind. Es gibt nämlich Normen, die die maximale zulässige Menge an Zell-DNA in den Impfstoffen, die Produkte enthalten, die aus permanenten und heteroploiden Zelllinien erhalten werden, auf 100·10–12 g/Impfdosis beschränkt.

Der Stand der Technik kennt Verfahren zur Reinigung von Viren. So verbreitet das Patent US 4 664 912 insbesondere ein Verfahren zur Reinigung von Tollwutviren durch Zonen-Zentrifugation in einem Sucrosegradienten. Ein solches Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, schwer automatisierbar zu sein; außerdem erfordert es einen vorherigen Schritt zur Inaktivierung, der zwischen dem Virus und der Zell-DNA Wechselwirkungen zur Folge haben kann, die dann den Schritt zum Entfernen dieser DNA schwieriger machen.

Diese Referenz verbreitet auch ein Reinigungsverfahren, das einen Schritt zur Gelfiltration und einen Schritt zur Ionenaustausch-Chromatographie kombiniert. Ein solches Reinigungsverfahren ermöglicht es jedoch nicht, ein maximales Entfernen der Zell-DNA zu erzielen.

Ein Ziel der Erfindung ist es folglich, ein neues Verfahren zur Reinigung von Viren vorzuschlagen, das eine sehr hohe Ausbeute hat und leicht automatisierbar ist.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Reinigungsverfahren vorzuschlagen, das es ermöglicht, vollständige, nicht beschädigte Viren zu erhalten.

Um diese Ziele zu erreichen hat die Erfindung ein Verfahren zu Reinigung von Viren, erhalten aus einer Zellkultur auf einer Zelllinie, zum Gegenstand, das darin besteht, die Viren von den Proteinen und Zell-DNA, die aus der Kultur stammen, durch Ionenaustausch-Chromatographie abzutrennen, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens einen Schritt zur Anionenaustausch-Chromatographie und einen Schritt zur Kationenaustausch-Chromatographie umfasst.

Gemäß einem speziellen Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Schritt zur Kationenaustausch-Chromatographie nach dem Schritt zur Anionenaustausch-Chromatographie ausgeführt. Man erhält so Reinigungsausbeuten, die im Vergleich zur umgekehrten Reihenfolge der Schritte optimiert sind.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren außerdem einen Schrift zur Affinitätschromatographie durch Metallchelation. So werden die Mengen an Rest-DNA wirklich aufs Maximale reduziert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Verfahren außerdem darin, alle Chromatographieschritte beim gleichen pH-Wert auszuführen. So ist es möglich, das Verfahren leicht zu automatisieren und seine Kosten beträchtlich zu vermindern, wobei seine Leistungsfähigkeit gleichzeitig beibehalten wird.

Die Erfindung wird beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung besser verständlich.

Die gemäß dem Verfahren der Erfindung zu reinigenden Viren sind Viren, die durch Zelllinien, insbesondere permanente und heteroploide Zelllinien, erhalten werden und die folglich mit Zell-DNA vereinigt sein können. Es kann sich insbesondere um Tollwutviren, Viren der japanischen Enzephalitis oder auch um Grippeviren handeln. Diese zu reinigenden Viren können durch Kultur auf Vero-Zellen auf Mikroträgern erhalten worden sein. Es handelt sich beispielsweise um das Tollwutvirus, erhalten durch Kultur, wie es in dem Patent US 4 664 912 beschrieben ist.

Die Virenernte wird filtriert, dann erfindungsgemäß durch Anionenaustausch-Chromatographie und durch Kationenaustausch-Chromatographie behandelt.

Die Anionenaustausch-Chromatographie kann eine Austauschchromatograpie mit schwachen Anionen sein, durchgeführt beispielsweise mit Gel, das den Diethylaminoethylrest umfasst: Gel DEAE Spherodex, verkauft von SEPRACOR, Gel DEAE Sepharose, verkauft von PHARMACIA, Gel EMD DEAE, verkauft von E. MERCK. Man bevorzugt, obwohl dies für das Entfernen von Nukleinsäuren nicht üblich ist, die Verwendung eines starken Anionenaustauschers, wie eines der folgenden Gele: Gel High Q, verkauft von BIO-RAD, Gel Q Sepharose, verkauft von PHARMACIA, Gel EMD TMAE, verkauft von E. Merck.

Alle diese Gele können in TRIS-Puffer oder in Phosphatpuffer verwendet werden. Vorteilhafterweise verwendet man ein Gel, das eine große Verfügbarkeit der Kationengruppe ermöglicht, wie dies bei EMD TMAE von E. MERCK der Fall ist, das Ketten mit 15 bis 25 Einheiten des folgenden Monomers besitzt: CH2=CHCONH(CH2)2N+(CH3)3 .

Desgleichen wird gemäß dem Verfahren der Erfindung der Schritt zur Kationenaustausch-Chromatographie vorzugsweise mit einem Gel durchgeführt, das eine große Zugänglichkeit der Anionengruppe ermöglicht, wie dies bei EMD SO3, verkauft von E. MERCK, der Fall ist, das Ketten mit 15 bis 25 Einheiten des folgenden Monomers besitzt: CH2=CHCONH-C(CH3)2CH2SO3 .

Dieses Gel kann auch mit TRIS-Puffer oder Phosphatpuffer äquilibriert werden.

Gemäß einer bevorzugten Form der Erfindung nimmt man die Anionenaustausch-Chromatographie vor der Kationenaustausch-Chromatographie vor, wobei das Eluat der ersten Chromatographie nach etwaiger Verdünnung direkt in die zweite Chromatographiesäule eingeführt wird. Diese Reihenfolge der Arbeitsgänge ermöglicht es, eine Optimierung des Entfernens der Zell-DNA zu erzielen.

Die durch Elution der Kationenaustausch-Chromatographiesäule erhaltene Virensuspension weist einen Reinheitsgrad auf, der die für die Verwendung von Viren bei der Herstellung der Impfstoffe aufgestellten Normen bereits erfüllt.

Jedoch fügt man gemäß einer bevorzugten Form der Erfindung dem oben beschriebenen Reinigungsverfahren einen zusätzlichen Schritt zur Affinitätschromatographie durch Metallchelation hinzu, indem man beispielsweise das Ca2+-Ion als Metallion verwendet. Diese Chromatographie kann durchgeführt werden, indem man als Chelatträger ein Agarosegel verwendet, wie das Gel chelating Sepharose® FF, verkauft von PHARMACIA, das die folgende Struktur besitzt

Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird dieser Chelationsschritt online mit den 2 vorhergehenden Schritten zur Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt, wobei das Eluat des Kationenaustauschers direkt in die Chromatographiesäule zur Chelation eingeführt wird.

Bei diesem Schritt bleibt die Zell-DNA gebunden, während das Virus das Gel durchläuft, ohne zurückgehalten zu werden.

Dieser zusätzliche Schritt ermöglicht es, noch wenigstens die Hälfte der Rest-DNA zu binden, die zwar bereits in sehr geringer Menge vorhanden ist, die aber dafür in diesem Stadium sehr schwierig zu entfernen ist.

Die so gereinigte Virensuspension wird durch einen Stabilisator verdünnt, dann gemäß jedem, im Stand der Technik bekannten Verfahren inaktiviert, beispielsweise mit &bgr;-Propiolacton, bevor sie konzentriert und lyophilisiert wird, um dann mit den anderen Ernten, die aus der gleichen VERO-Zellkultur hervorgegangen sind und die eine gemeinsame Herstellungscharge bilden werden, gemischt zu werden.

Die aus solchen Viren hergestellten Impfstoffe wurden dem Menschen injiziert und wurden sehr gut vertragen. Man hat außerdem ihre Schutzwirkung beim Tier mit einem an der Maus ausgeführten Test untersucht, dessen Ergebnisse positiv waren.

Überraschenderweise und sehr vorteilhaft ist es gemäß der Erfindung möglich, die gesamte Reinigung bei Raumtemperatur online und immer beim gleichen pH durchzuführen, was das Verfahren einfach, leicht automatisierbar und sicher macht; es ist insbesondere möglich, das gesamte Verfahren unter guten Sterilitätsbedingungen durchzuführen.

Mit diesem Reinigungsverfahren erhält man vollständige, nicht beschädigte Viren, deren Spitzen elektronenmikroskopisch sichtbar sind, mit einem sehr hohen Reinheitsgrad.

Beispiel 1

Man stellt eine Anionenaustausch-Chromatographiesäule her, indem man in eine Säule Gel EMD TMAE, verkauft von E. MERCK einbringt, durch die man zum Zweck der Desinfektion zuerst Natronlauge 1 M NaOH laufen lässt. Die Säule wird dann mit 20 mM TRIS-Puffer mit pH 7,5 äqulibriert.

Man stellt eine Kationenaustausch-Chromatographiesäule her, indem man in eine Säule Gel EMS SO3, verkauft von E. MERCK einbringt, durch die man ebenfalls 1M Natronlauge, dann 20 mM TRIS-Puffer mit pH 7,5 laufen lässt.

Man stellt eine Säule zur Affinitätschromatographie durch Metallchelation her, indem man in eine Säule Gel chelating Sepharose® FF, verkauft von PHARMACIA einbringt, durch die man 1 M Natronlauge, dann Wasser laufen lässt, bevor man sie mit CaCl2 mit 3 g/l belädt; man spült dann mit Wasser, dann lässt man 20 mM TRIS 0,5 M NaCl-Puffer mit pH 7,5 durchlaufen.

Beispiel 2

Man filtriert eine Tollwutvirenernte, kultiviert auf VERO-Zellen, mit einer Membran, deren Trenngrenze 0,65 um beträgt, dann einer Membran, deren Trenngrenze 0,45 um beträgt.

Diese Ernte besteht aus einer Suspension von Viren in Kulturmedium, die auch Zell-DNA sowie Proteine umfasst, die sowohl aus den VERO-Zellen als auch aus dem Kulturmedium stammen. Die filtrierte Rohernte wird durch die Anionenaustausch-Chromatographiesäule, die gemäß dem im Beispiel 1 Beschriebenen hergestellt ist, geleitet. Der nicht gebundene Teil, der Proteine und DNA enthält, wird am Auslass der Säule für Analysezwecke aufgefangen. Man spült die Säule mit 20 mM TRIS 0,1 M NaCl-Puffer mit pH 7,5, dann eluiert man die Viren, die gebunden sind, indem man durch die Säule 20 mM TRIS 0,4 M NaCl-Puffer mit pH 7,5 laufen lässt, bis der charakteristische Peak der Viren durch ist. Das Eluat der ersten Säule wird online mit 20 mM TRIS-Puffer mit pH 7,5 auf 1/4 verdünnt, bevor es in die gemäß Beispiel 1 hergestellte Kationenaustausch-Chromatographiesäule eingeführt wird.

Der nicht gebundene Teil dieser zweiten Säule wird für Analysezwecke aufgefangen. Wenn das gesamte Eluat der ersten Säule, das Virus enthält, durch die zweite Säule gelaufen ist, spült man mit 20 mM TRIS 0,1 M NaCl-Puffer mit pH 7,5, dann eluiert man die gebundenen Viren, indem man 20 mM TRIS 0,5 M NaCl-Puffer mit pH 7,5 durchlaufen lässt, bis der charakteristische Peak der Viren durch ist.

Das Eluat dieser zweiten Säule wird direkt ohne Verdünnung in die Säule zur Affinitätschromatographie durch Metallchelation, die gemäß dem Beispiel 1 hergestellt ist, eingeführt. Jetzt komplexieren die DNA und die Ca++-Ionen, die in der Säule vorhanden sind, während das Virus die Säule durchläuft und am Auslass aufgefangen wird, um mit einem Stabilisator kombiniert und inaktiviert zu werden. Die mit den Ca++-Ionen komplexierte DNA wird eluiert, indem man durch die Säule eine 50 mM EDTA-Lösung laufen lässt.

Die Ionenaustausch-Chromatographiesäulen werden durch Durchlaufen von 20 mM TRIS 1 M NaCl-Puffer mit pH 7,5 regeneriert und mit 1M Natronlauge desinfiziert, bevor sie für die Reinigung der weiteren Ernten, die aus der gleichen Kultur stammen und die zur Bildung einer einzigen Herstellungscharge alle vereinigt werden, verwendet werden.

Beispiel 3

Man bestimmt für jede Ernte nach jedem Chromatographieschritt die Mengen an Proteinen und Zell-DNA, die gereinigt wurden.

Die Gesamtproteine werden mit dem Verfahren von Lowry bestimmt und die Gesamt-DNA mit der Apparatur THRESHOLD von MOLECULAR DEVICE.

Die Ergebnisse, die erhalten werden, indem man einen Mittelwert der Ausbeuten pro Schritt für jede Ernte der Kultur bildet, ausgedrückt in Restprozent für jeden der Schritte des Reinigungsverfahrens, sind die folgenden:

Insgesamt verbleiben durch das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren nur 0,004% der Zell-DNA und 1,4% der Proteine, die in den Rohernten vorliegen.

Die durchgeführte Reinigung ist folglich vollkommen zufriedenstellend.

Man untersucht außerdem die Infektiosität der bei jedem Schritt erhaltenen Viren mit einer Messung ihres Infektionstiters in DICC 50 und mit einer Betrachtung im Elektronenmikroskop. Man stellt fest, dass die Unversehrtheit des Virus während des gesamten Verfahrens gut erhalten bleibt.

Wenn die so hergestellten Viren bei der Herstellung von Impfstoffen gegen die Tollwut verwendet werden, ist es möglich, Dosen herzustellen, die nicht mehr als 30 bis 40·10–12 g Zell-DNA pro Dosis enthalten, also eine Menge, die deutlich unter der Norm von 100·10–12 g liegt.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Reinigung von Viren, erhalten aus einer Zellkultur, das darin besteht, die Viren von den Proteinen und Zell-DNA, die aus der Kultur stammen, durch Ionenaustausch-Chromatographie abzutrennen, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens einen Schritt zur Anionenaustausch-Chromatographie sowie einen Schritt zur Kationenaustausch-Chromatographie umfasst.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionen starke Anionen sind.
  3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kationen starke Kationen sind.
  4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kationenaustausch nach dem Anionenaustausch durchgeführt wird.
  5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem einen Schritt zur Affinitätschromatographie durch Metallchelation umfasst.
  6. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallchelation mit Calciumionen durchgeführt wird.
  7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu reinigenden Viren durch Kulturen auf permanenten und heteroploiden Zelllinien erhalten werden.
  8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu reinigenden Viren durch Kulturen auf VERO-Zellen erhalten werden.
  9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu reinigenden Viren Tollwutviren sind.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zu reinigenden Viren Viren der japanischen Enzephalitis sind.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zu reinigenden Viren Grippeviren sind.
  12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, alle Chromatographieschritte beim gleichen pH-Wert auszuführen.
  13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Online-Verfahren handelt.
  14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
  15. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird.
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