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Dokumentenidentifikation DE69722900T2 19.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000844484
Titel Verfahren zur Herstellung von einer stabilen Troponin-Zubereitung und ihre Verwendung als Kalibrator/Kontrolle in Immunoassays
Anmelder Bayer Corp., Pittsburgh, Pa., US
Erfinder Doth, Dr., Margit, 47800 Krefeld, DE;
Petry, Dr., Christoph, Elmsford, US
Vertreter Köhler, F., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 40723 Hilden
DE-Aktenzeichen 69722900
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.11.1997
EP-Aktenzeichen 971196175
EP-Offenlegungsdatum 27.05.1998
EP date of grant 18.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.05.2004
IPC-Hauptklasse G01N 33/96
IPC-Nebenklasse G01N 33/68   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Immunoassayverfahren werden oft zum Nachweis von Proteinen in Serum- oder Urinproben für medizinische/diagnostische Zwecke wegen ihrer besonders hohen Spezifität und Empfindlichkeit angewandt. Für derartige Immunoassayverfahren sind nicht nur 1 oder 2 spezifische Antikörper erforderlich, sondern es werden auch Eichmittel benötigt, welche als Bezugsstandard zur Quantifizierung der Patientenproben dienen. Die Lagerung und Aufbewahrung der Eichmittel über mehrere Monate bis zu 2 Jahren bei 4°C ist manchmal bei automatisierten Assayverfahren in großen analytischen Laboratorien notwendig. Abhängig vom betreffenden Analyt, können sie Bedingungen und Erfordernisse bezüglich der Stabilität der Eichmittel-Formulierung Probleme ergeben, wenn beispielsweise deren Löslichkeit unter physiologischen Salz- und pH-Bedingungen nicht garantiert ist. Entsprechende Beispiele, die diesbezüglich genannt werden können, sind Troponin I und Troponin T, die nur in denaturierenden Lösungen (6 M Harnstoff, 0,01 M Dithiothreitol) hinreichend stabil und löslich sind. Allerdings ist es nicht möglich, einen Immunoassay in dieser Denaturierformulierung durchzuführen, da Denaturierbedingungen die Antikörper durch Modifizierung von deren Sekundärstruktur beeinflussen würden, so dass diese den Troponin-Analyt nicht binden könnten. Weitere Faktoren im Fall von Troponin könnten seine Tendenz zum Kleben an Oberflächen wie Glas sowie eine mögliche chemische Instabilität darstellen, wodurch die Zubereitung stabiler Eichmittel erschwert wird.

Es ist bekannt, dass Proteine relativ instabil in Lösung sind und Reagenzien, die diese enthalten, häufig in lyophilisierter Form zusammen mit einem Lösungsmittel einer geeigneten Zusammensetzung verkauft werden, worin diese dann vor ihrer Anwendung vom Anwender aufgelöst werden. Werden die auf diese Weise erhaltenen Lösungen bei 4°C aufbewahrt, sind sie einige Tage lang verwendbar, sogar wenn eine bestimmte Veränderung bei der Konzentration des Reagens im täglichen Nachweisverfahren beobachtet wird. Werden somit die Referenz-Lösungen, die aus dem lyophilisierten Material erhalten werden, über längere Zeiträume gelagert und aufbewahrt, werden sie im Allgemeinen in einer Standard-Dosierungsform eingefroren, wie dies im Fall von Troponin I und Troponin T empfohlen wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Eichmittel mit sehr hoher Stabilität bei 4°C und höher zur Anwendung in Immunoassayverfahren. Das Eichmaterial umfasst eine sorgfältig erzeugte Zubereitung von einem Herzmuskel, worin Troponin in seiner nativen Form gehalten bleibt.

Die Herzmuskel-Zubereitung kann auch als ein Vergleichsmittel verwendet werden, das in ein Labor-Qualitätskontrollschema integrierbar ist. Vergleichsmittel unterscheiden sich in der Art und Weise ihrer Herstellung nicht von Eichmitteln, ausser dass ihre Stabilitätserfordernisse weniger streng sind. Es gibt allerdings einen Unterschied bei der Anwendung, da Eichmittel bei der Erstellung eines Assay angewandt werden, wogegen Vergleiche bzw. Vergleichsmittel auf einer täglichen Basis durchgeführt und angewandt werden um sicherzustellen, dass der Assay weiterhin angemessen gut abläuft. Die folgende Beschreibung stellt die Verwendung des Herzmuskel-Homogenats als Eichmittel heraus, es sollte aber klar sein, dass der vorliegende Beschreibungsgegenstand zur Zubereitung von Herzmuskel-Homogenaten, die als Vergleichsmittel herangezogen und eingesetzt werden, ebenfalls anwendbar ist.

Beschreibung der Erfindung

Standardverfahren zur Isolierung und Reinigung von Troponin verwenden organische Lösungsmittel und/oder hohe Salzkonzentrationen (siehe z. B. US-A-5 560 937, DE-A-19 548 029). Während die hier angegebenen Beispiele Troponin I betreffen, sind die offenbarten Verfahrensweise desgleichen auf Troponin C und T sowie auf mehrere weitere Moleküle anwendbar, die in Herzgewebe vorhanden und Indikatoren eines Herzmuskelschadens sind.

Das neue Verfahren beruht auf einer homogenen Zerkleinerung von frischem Säugetier-Herzmuskel, der im gefrorenen Zustand mit einer physiologischen Puffer-Lösung aufbewahrt werden kann. Herzgewebe vom Mensch oder vom Rind ist bevorzugt. Weitere Säugetier-Herzgewebe können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten Aminosäure-Sequenzen, die denjenigen ähneln, die im Material von Mensch und Rind vorhanden sind. Geeignete Homogenisiermedien sind Puffer-Lösungen mit pH-Werten im neutralen, schwach sauren oder schwach alkalischen Bereich (vorzugsweise von ca. pH = 5,5 bis 8,5), wie z. B. PBS (Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumdihydrogenphosphat), TRIS (Tris[hydroxymethyl]aminomethan), Imidazol, MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure] und HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]), welche ein Salz enthalten, um die Ionenstärke im physiologischen Bereich zu halten, um die Moleküle in ihrer natürlichen Konfiguration aufrecht zu erhalten. Die Salzkonzentrationen liegen im physiologischen Konzentrationsbereich, wie z. B. von 10 bis 880 mM NaCl, MgCl2, KCl oder CaCl2. Detergenzien wie Triton X 100 oder Tween 20, Protease-Inhibitoren wie Trypsin-Inhibitor, Phenylmethylsulfonylfluorid (PBSF), Leupeptin und/oder Pepstatin und Antioxidanzien wie DTI oder &bgr;-Mercaptoethanol werden vorzugsweise als Additive verwendet. Die Detergenzien verhindern ganz allgemein, dass die Eichmaterialien an Glas- und Plastikoberflächen kleben, wogegen die Antioxidanzien dazu beitragen, den Analyt im monomeren Zustand durch Inhibierung der Disulfid-Brückenbildung zu erhalten. Die Protease-Inhibitoren verhindern den Abbau des Troponin-Moleküls durch nicht- spezifische Proteasen, die im Gewebeextrakt vorhanden sind.

Das Homogenat wird abzentrifugiert und vorzugsweise bei einer Temperatur von –20 bis –80°C aufbewahrt, da niedrige Temperaturen Protein-Lösungen bei der Lagerung bzw. Aufbewahrung stabilisieren. Verdünnungen dieser Zubereitung ergeben eine Reaktivität mit den im Immunoassay verwendeten Antikörpern, die spezifisch für Herz-Troponin (kardisches Troponin) und insbesondere für Troponin I sind. Zur Zubereitung der Eichmittel wird das Herz-Homogenat, das in typischer Weise Rinder-Herzgewebe ist, in einer Verdünnungsmatrix verdünnt. Die Troponin I-Aktivität in der oben genannten Herzmuskel-Zubereitung erwies sich nicht als vorhanden bzw. vorliegend in einer ähnlich verabeiteten Skelettmuskel-Zubereitung. Auch wurde herausgefunden, dass es nur in der Herzmuskel-Zubereitung vorkommt und gelingt, dass die vorgenannten Antikörper ein Protein erkennen, das die gleichen Durchlaufeigenschaften bei der denaturierenden Gel-Elektrophorese wie isoliertes Herz-Troponin I zeigt und ergibt.

Die oben genannte Zubereitung ist auch über mehrere Tage in verschiedenen physiologischen Puffern bei 20 und bei 4°C stabil. Geeignete Verdünnungsmatrices sind verarbeitete und unverarbeitete menschliche und tierische Seren oder Plasmen oder die als Isolierungsmedien genannten Puffer. Außerdem werden Konservierungsstoffe wie Natriumazid und Proclin 150 und stabilisierte Proteine wie Rinderserumalbumin (BSA) oder &ggr;-Globuline verwendet. Die Verdünnung des Herz-Homogenats zu einer 6%-igen wässrigen BSA-Lösung mit den verschiedenen genannten Additiven ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung und Zubereitung der Eichmatrix. In typischer Weise werden Eichmittel für Immunoassayverfahren durch Auflösung des zu messenden Analyts in normalem Menschenserum zubereitet. Dies deshalb, um sicherzustellen, dass die Eichmittel der klinischen Serumprobe so nahe wie möglich kommen. Allerdings ist das Herz-Homogenat der vorliegenden Erfindung nicht sehr stabil, wenn es in normales Menschenserum eingebracht wird. Deshalb wird eine künstliche Matrix aus normalem Menschenserum unter Verwendung von BSA oder weiterem Protein wie von menschlichem Serumabumin, fötalem Kälberserum, Rinder-&ggr;-Globulin oder von Eieralbumin in hinrichender Menge zubereitet, um der Durchschnittsproteinkonzentration von menschlichem Serum (6% im Fall von BSA) in Kombination mit Stabilisiermitteln zusammen mit Puffer und Salzen nahezukommen, um sich der Ionenstärke von Serum anzugleichen. Zur verbesserten Reproduzierbarkeit kann die oben genannte Zubereitung auch die folgenden Stufen einschließen: Fraktionierung durch Routine-Verfahren wie z. B. Gelfiltration, Hochgeschwindigkeitsentfernung durch Zentrifugation von unlöslichen Bestandteilen und/oder Filtration durch sterile Filter. Auf diese Weise ist es möglich, stabile oder flüssige Eichmittel für den oben genannten Immunoassay zur Diagnose eines Herzinfarkts in sehr einfacher und preiswerter Weise herzustellen und zuzubereiten. Ferner enthält die Troponin-Zubereitung das nachzuweisende Molekül in einer Form, in welcher es hauptsächlich und vorrangig auch in Patientenproben aufgefunden wird. Das Troponin im gesunden Herzmuskel liegt als ein Komplex von Troponin I, T und C vor, und es wird angenommen, dass im Herz-Homogenat der vorliegenden Erfindung Troponin in der natürlichen ITC-Komplexform vorliegt und vorhanden ist. Demzufolge kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Eichmitteln für die T- und C-Formen von Troponin wie auch für die I-Form angewandt werden. Es stellt daher einen authentischeren Vergleich für einen diagnostischen Test als eine Formulierung dar, die isoliertes Troponin I, T oder C enthält. Da Troponin in der Form eines Komplexes in seiner nativen Form vorliegt und dieser Komplex die stabilere Form darstellt, kann das oben genannte Rinder-Herzmuskel-Homogenat mit Vernetzungsmitteln behandet werden, um eine kovalente Bindung zwischen den 3 Komponenten des Komplexes zu erhalten. Diese Bindung ist stabiler als die natürlich vorkommenden molekularen Wechselwirkungen innerhalb des Troponin-Komplexes, da die kovalente Bindung zwischen den Teilen des Komplexes, die durch die Vernetzungsmittel eingeführt wird, das Aufbrechen des Komplexes verhindert. Geeignete Vernetzer sind homobifunktionelle Moleküle wie z. B. 1-Ethyl-3,3-[dimethylaminopropyl]carbodiimid-Hydrochlorid (EDC), (Bis[sulfocuccinimidyl]suberat (BS3) und Sulfodisccinimidyltartrat (Sulfo-DST). Die Bildung des Troponin-Vernetzungskomplexes ist erwünscht, wenn eine erhöhte Stabilität des Eichmittels angestrebt wird. Während das unvernetzte Material eine sehr gute Stabilität zeigt und ergibt, erfordern einige kommerzielle Assayverfahren eine Stabilität über ein Jahr oder mehr, in welchem Fall die Vernetzung von Vorteil sein würde. Die vorliegende Erfindung wird nun noch weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Schock-gefrorener Rinder-Herzmuskel, 31 g, wurde mit 30 mL eines gekühlten Homogenisierungspuffers (1,39 g L K2HPO4, pH = 7,3, 8,77 g/L NaCl, 0,312 g/L Na(HPO3)2 × 2 H2O, 0,1 Tween 20, 0,1 mM Dithiothreitol homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 1000 g 20 min lang abzentrifugiert, in Anteilsmengen aufgeteilt und eingefroren. In typischer Weise werden die Eichmittel für Immunoasssayverfahren durch Auflösen des zu messenden Analyts in normalem Menschenserum zubereitet. Dies deshalb, um sicherzustellen, dass die Eichmittel der klinischen Serumprobe so nahe wie möglich kommen. Allerdings ist das Herz-Homogenat der vorliegenden Erfindung nicht sehr stabil, wenn es in normales Menschenserum eingebracht wird. In verschiedenen Matrices ergaben Verdünnungen dieses Homogenats die folgenden Stabilitätswerte (Tabelle 1). Die Stabilität wurde durch Vergleich des verdünnten Homogenats mit ähnlich zubereiteten Verdünnungsen von reinem Troponin ITC-Komplexermittelt, der aus einer handelsüblichen Quelle erhalten wurde, deren effektiver Troponin-Gehalt mit einem Standardverfahren gemessen worden war. Der reine ITC-Komplex wurde herangezogen, um gravimetrisch ein Versuchs- bzw. Erforschungslos von Eichmitteln zuzubereiten. Dieses Bezugslos von Eichmitteln (gelagert bei –80°C) wurde mit experimentellen Troponin I- (aus dem Rinderherz-Homogenat)-Assay-Reagenzien verwendet, um eine Standardkurve zur Messung von Troponin I-Konzentrationen zu erstellen. Die Rinderherz-Homogenat-basierten Eichmittel wurden unter verschiedenen Bedingungen belastet und als unbekannte Proben gegen die Referenzlos-Eichmittel gemessen, um jeglichen Abfall bei der Aktivität nachzuweisen. Die Zubereitung wurde in einem Bayer Immuno 1TM-Analysegerät (Bayer Diagnostics) analysiert. Die Assayform war ein Sandwich unter Verwendung der folgenden Antikörper: 1) eines polyclonalen Ziege-Antikörpers, der mit einem Peptid aus der Sequenz menschlichen Herz-Troponins I Affinitäts gereinigt worden war, 2) eines monoclonalen Antikörpers gegen Menschenherz-Troponin I. Der erste Antikörper des Sandwich wird mit FITC markiert und an Magnetpartikeln mittels anti-FITC immobilisiert. Der zweite Antikörper des Sandwich enthält alkalische Phosphatase und katalysiert eine Farbbildungsreaktion, mit der die Antigen-Menge bestimmt wird. Das Analysegerät gibt die Versuchsergebnisse als AE, d. h. als (optische) Absorptionseinheiten/min an, bevor die Ergebnisse in klinische Einheiten überführt werden. Die Aminosäure-Sequenzen des kardischen Troponins I von Mensch und Rind sind sehr ähnlich, was die Antikörper-Kreuzreaktion erklärt. Rinder-Herzmuskel kann daher für die Eichmittel-Zubereitung verwendet werden. Grundsätzlich kann menschliches und weiteres Säugetiergewebe ebenfalls für die Zubereitung verwendet werden. Bezüglich der Tabelle 1 betrifft der Begriff "Eich-Puffer" eine Zubereitung des Rinder-Herzmuskels in: 6,81 g/L Imidazol, 5,84 g/L Natriumchlorid, 0,9 g/L Natriumazid, 2,0 g/L Triton X100, 1 mL/L Proclin 150 und in 60 g/L BSA,
und unverarbeitetes Serum betrifft Serum, das nicht lipidisiert oder mit organischen Lösungsmitteln behandelt worden ist.

Bezüglich der in Tabelle 1 angegebenen Daten, gibt es keine signifikante Differenz zwischen den Stabilitätsdaten des Homogenats in Puffer oder in Serum.

Tatsächlich erwies sich in länger andauernden Studien der Puffer als insgesamt überlegen gegenüber Serum-Matrices. In der Tabelle angegebene Daten weisen eine bestimmte Streuung auf, die aber in Studien zu erwarten ist, die über mehrere Wochen laufen.

Beispiel 2

Ein Herzmuskel-Homogenat wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde auf 2 mg/mL eingestellt, und es wurden Mengen im Bereich des 2,5- bis 250-fachen molaren Überschusses zur auftretenden Troponin I-Konzentration der folgenden Vernetzungsmittel zugegeben: 1-Ethyl-3,3-[dimethylaminopropyl]carbodiimid-Hydrochlorid (EDC), (Bis[sulfosuccinimidyl))suberat (BS3) oder Sulfodisuccinimidyltartrat (Sulfo-DST). Die Reaktionszeit bei Raumtemperatur betrug 3 h. Dann wurden die Zubereitungen wie in Beispiel 1 weiter verdünnt und analysiert.


Anspruch[de]
  1. Eich/Vergleichsformulierung mit der Eignung für Immunoassayverfahren zum Nachweis von Indikatoren eines Herzmuskelschadens, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Homogenat eines Säugetier-Herzmuskels umfasst, das den Tropomyosin-Komplex in natürlicher Konfiguration umfasst.
  2. Eich/Vergleichsformulierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rinder-Herzmuskel für die Zubereitung verwendet worden ist.
  3. Eich/Vergleichsformulierung gemäß Anspruch 1, die sich zum Nachweis von kardischem Troponin eignet.
  4. Eich/Vergleichsformulierung gemäß Anspruch 1, die sich zum Nachweis von kardischem Troponin I eignet.
  5. Eich/Vergleichsformulierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Herzmuskel-Homogenat mit Vernetzern vernetzt worden ist.
  6. Verfahren zur Zubereitung einer Formulierung zur Verwendung als Eichmittel oder Vergleich in Immunoassayverfahren zum Nachweis von Troponin in Menschenserum, welches die Stufen umfasst, in denen:

    i. frisches Säugetier-Herzmuskelgewebe mit einer physiologischen Salz/Puffer-Lösung homogen zerkleinert wird, um ein Homogenat des Muskelgewebes zu erhalten, und

    ii. das Homogenat verdünnt wird, um eine Verdünnungsmatrix als die Eichmittelformulierung zu ergeben.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Säugetier-Herzmuskelgewebe Gewebe vom Rind oder des Menschen ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die physiologische Lösung einen pH-Wert von ca. 5,5 bis 8,5 aufweist und die Salzkonzentration im physiologischen Bereich liegt.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei in die physiologische Lösung ein Detergens, ein Protease-Inhibitor und ein Antioxidans eingeschlossen sind.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die Verdünnungsmatrix ein Protein in einer Menge, die hinreicht, sich der Protein-Konzentration von Menschenserum anzugleichen, zusammen mit Puffern und Salzen enthält, um sich der Ionenstärke von Serum anzugleichen.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Troponin Troponin I ist.
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