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Dokumentenidentifikation DE69909090T2 19.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0001088315
Titel KEIMBILDUNG UND WACHSTUM VON METALLOXID-NANOPARTIKELN UND VERWENDUNG
Anmelder Bar-Ilan University, Ramat Gan, IL
Erfinder MARGEL, Shlomo, 76210 Rehovot, IL;
GURA, Sigalit, 72292 Ramla, IL
Vertreter Henkel, Feiler & Hänzel, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69909090
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 24.05.1999
EP-Aktenzeichen 999252471
WO-Anmeldetag 24.05.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/IL99/00275
WO-Veröffentlichungsnummer 0099062079
WO-Veröffentlichungsdatum 02.12.1999
EP-Offenlegungsdatum 04.04.2001
EP date of grant 25.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.05.2004
IPC-Hauptklasse H01F 1/00
IPC-Nebenklasse B03C 1/01   G01N 33/543   A61K 49/00   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von magnetischen Nanopartikeln durch die Bildung von aus Polymeren, die Metallchelatbildner sind, bestehenden Kernen und das Wachsenlassen eines Überzugs aus einem magnetischen Metalloxid auf diesen, daraus erhaltene hohle magnetische Nanopartikel und verschiedene Verwendungen derselben.

Hintergrund der Erfindung

Magnetische Nanopartikel weisen aufgrund ihrer relativ großen Oberfläche und ihrer magnetischen Eigenschaften einen breiten Bereich möglicher Anwendungen auf. Typische Beispiele für derartige Anwendungen sind Magnetspeicherung, Magnetversiegelung, Röntgenverstärkung, die Herstellung von Umformern, Induktoren, Audio- und Videoköpfen und eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen (Kontrastmittel für MRI, Zellmarkierung, Zelltrennung, Diagnostika, Arzneimittelabgabe, Hyperthermie, Oligonucleotid- und Peptidsynthese, Enttoxifizierung von unerwünschten Molekülen, immobilisierte Enzyme, Chromatographie und dgl.)

In den vergangenen Jahren wurden intensive Anstrengungen unternommen, Nanopartikel mit magnetischen Eigenschaften zu synthetisieren. Die Herstellung dieser Partikel ist sehr komplex, da es wichtig ist, eine im wesentlichen homogene Population von Teilchen einer engen Größenverteilung zu erhalten und Bedingungen, die Agglomerationsprozesse in der Lösung auf ein minimales Maß verringern, sicherzustellen, um nur zwei der bei der Herstellung von magnetischen Nanopartikeln beteiligte Faktoren zu nennen. Im allgemeinen lassen sich die einschlägig offenbarten Verfahren in drei Hauptkategorien einteilen.

Das erste Verfahren beruht auf der Mikroverkapselung des magnetischen Materials in einer geeigneten Matrix. Beispielsweise beschreiben Margel et al., J. Immunol. Methods 28, 341 (1979) die heterogene Polymerisation geeigneter Monomere in Gegenwart von Ferrofluidteilchen und geeigneten Netzmitteln. Dieses Verfahren führt üblicherweise zur Bildung von magnetischen Teilchen, die aus Ferrofluidteilchen, die in die Polymernanoteilchen eingebettet und zur Verhinderung einer Agglomeration mit dem Netzmittel überzogen sind, bestehen.

Das zweite Verfahren beruht auf der direkten Abscheidung der magnetischen Oxide, beispielsweise Magnetit (Fe3O4) und/oder Maghemit (&ggr;-Fe2O3), durch Inkontaktbringen von Eisen(II)- und Eisen(III)-salzen und anschließenden verschiedenen Oberflächenbehandlungen, was beispielsweise in WO 88/06632 offenbart ist. Diese Verfahren führen typischerweise zu niedrigen Ausbeuten stabiler Teilchen einer engen Größenverteilung.

Das dritte Verfahren beruht auf der Bildung eines magnetischen Überzugs, d.h. es umfasst die Bildung eines Überzugs aus Eisenoxiden oder Ferrit auf der Oberfläche vorgeformter Teilchen. M. Abe, Proceedings of The Sixth International Conference on Ferrites (ICF-6), Tokyo und Kyoto, Japan 1992, S. 472–477, S. Nagahata et al., Proceedings of the Sixth International Conference on Ferrits (ICF-6), Tokyo und Kyoto, Japan 1992, S. 279–282, und M. Abe und T. Itoh, Thin Solid Films 216, 155 (1992), offenbaren Verfahren zur Herstellung magnetischer Nanopartikel von Größen im Bereich von etwa 0,3 &mgr;m bis zu einigen &mgr;m über magnetische dünne Beschichtungen von Fe3O4 oder (Fe,M)3O4 [M = Fe, Co, Ni und dgl.] auf vorgeformten Polyacrylatnanopartikeln, die Hydroxyloberflächengruppen enthalten, d. h. Nanopartikel, deren Größen etwa 0,3 &mgr;m oder mehr betragen, werden getrennt hergestellt und dann einem Beschichtungsverfahren unterzogen.

Ein weiteres einschlägig bekanntes Verfahren, das auf der Bildung einer magnetischen Beschichtung auf einem vorgeformten Partikel beruht, wurde von Margel et al. in WO 96/11054 offenbart. Gemäß dieser Veröffentlichung werden monodisperse magnetische Nanopartikel von Größen im Bereich von etwa 0,3 &mgr;m bis zu einigen &mgr;m über magnetische dünne Überzüge bzw. Beschichtungen von Ferrit oder Eisenoxiden auf vorgeformten monodispersen Polystyrolteilchen (oder ähnlichen hydrophoben Teilchen, beispielsweise Polychlormethylstyrol) von Mikrometergröße hergestellt. Gemäß diesem Verfahren werden magnetische Nanopartikel durch Polymerisation von Eisen(II)- und Eisen(III)-salzen auf vorgeformten Polystyrolteilchen von Mikrometergröße, die mit hydrophilen Netzmitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, überzogen sind, gebildet. Dieses Verfahren, das eine Beschichtung aus Eisenoxidinseln auf den Netzmittel-Polystyrolteilchen erzeugt, ist auf Polystyrolteilchen, die mit hydrophilen Netzmitteln überzogen sind und eine Größe im Bereich von etwa 0,3 &mgr;m bis zu einigen &mgr;m aufweisen, beschränkt.

Die US 5 062 991 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Ferritnanopartikeln in Gegenwart einer wässrigen Lösung von Gelatine (Typ B), einem Metallsalz bzw. Metallsalzen wie FeCl2, NaNO3 als Oxidationsmittel und Natriumhydroxid als alkalisches Mittel. Gemäß US 5 062 991 wird Gelatine sowohl zur Kernbildung als auch zum Schutz der gebildeten Partikel gegen eine Agglomeration verwendet, d. h. Gelatine soll einen Teil des Überzugs bilden. Wegen dieser zweifachen Funktion von Gelatine, als Trägervehikel für die Kernbildung und als Stabilisierungsnetzmittel, wird eine relativ hohe Konzentration desselben verwendet. Ferner gilt die US 5 062 991 speziell für Gelatine Typ B (Stärke 60) oder alkaligehärtete Gelatine. Gemäß US 5 062 991 wurde keine andere Art von Gelatine, beispielsweise Typ A, oder eines Polymers, beispielsweise Dextran und Polyvinylpyrrolidon, erfolgreich zur Herstellung der magnetischen Teilchen verwendet. Das Verfahren gemäß US 5 062 991 ergibt angeblich Teilchen von Größen im Bereich von 0,1 &mgr;m bis zu 1 &mgr;m, doch gibt dieses Patent kein Beispiel für die Herstellung von Partikeln von Durchmessern von weniger als 0,2 &mgr;m in zufriedenstellender Ausbeute und in einer zufriedenstellenden Größenverteilung an.

Es ist daher klar, dass durch den Stand der Technik kein vollständig zufriedenstellendes Verfahren zur Herstellung magnetischer Nanopartikel einer engen Größenverteilung, insbesondere magnetischer Nanopartikel mit einer Größe von niedriger als 0,3 &mgr;m und insbesondere niedriger als 0,1 &mgr;m in guten Ausbeuten bereitgestellt wird. Ferner ermöglichen die Verfahren gemäß dem derzeitigen Stand der Technik nicht die Nutzung einer Vielzahl von Substratmaterialien, auf denen der magnetische Überzug gebildet werden kann, und ferner ist die gemäß dem Stand der Technik verwendete Konzentration der Substratmaterialien relativ hoch. Diese entscheidenden Merkmale, nämlich die Größenverteilungen, die gemäß dem derzeitigen Stand der Technik erhältlich sind, und die Materialien und der Konzentrationsbereich derselben, die zur Herstellung der zu beschichtenden Partikel verwendet werden können, beschränken den Umfang von Anwendungsmöglichkeiten der magnetischen Partikel signifikant. Die Bedeutung einer homogenen Größenverteilung der gebildeten magnetischen Nanopartikel leitet sich von der Tatsache ab, dass heterogene kolloidale Partikel schwierig zu definieren und zu kennzeichnen sind. Heterogene kolloidale Partikel können auch die Erfassung kleiner atypischer Populationen, die entweder zum Zeitpunkt der Herstellung vorhanden sind oder sich bei der Aufbewahrung entwickeln, verhindern. Atypische Subpopulationen kolloidaler Partikel werden als potentielle Quellen von Toxizität bei einer Injektion im Menschen betrachtet. Daher verbessert die Möglichkeit, das Nichtvorhandensein derartiger Subpopulationen sicherzustellen, die Qualität eines Kolloids, die erhalten werden kann [siehe S. Palmacci, L. Josephson und E. Groman, WO 95/05669 (1995)]. Die Möglichkeit, magnetische Nanopartikel zu erhalten, deren Größe geringer als 0,1 &mgr;m ist, ist ebenfalls entscheidend, da es mehrere Anwendungsmöglichkeiten gibt, bei denen diese Partikel besonders geeignet sind. Beispielsweise sind für MRI-Anwendungen magnetische Partikel von Größen unter etwa 0,1 &mgr;m bevorzugt [siehe S. Pamacci et al., WO 95/05669]. Ein weiteres Beispiel, das den Vorteil von magnetischen Partikeln von kleiner als etwa 0,1 &mgr;m belegt, liegt auf dem Gebiet der spezifischen Zelltrennung [siehe S. Miltenyi et al., Cytometry 11, 231 (1990); S. Miltenyi, WO 90/07380 (1990)]. Bezüglich der Verwendung relativ hoher Konzentrationen von Substratmaterialien, auf denen das Wachsen des magnetischen Metalloxids bewirkt werden soll, ist, da gemäß dem derzeitigen Stand der Technik diese Materialien auch als Netzmittelstabilisatoren für die Nanopartikel fungieren sollen, einem Fachmann klar, dass dies zu verschiedenen Schwierigkeiten bei dem Versuch des Auswaschens des Überschusses polymerer Substrate, der nach der Bildung der fertigen magnetischen Nanopartikel vorhanden ist, führen kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, alle im vorhergehenden genannten Nachteile zu überwinden. Insbesondere ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung magnetischer Nanopartikel von Größen von weniger als 0,3 &mgr;m in einer hervorragenden Ausbeute, deren Größenverteilung im wesentlichen gleichförmig ist.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das wirtschaftlich vorteilhaft und technisch hervorragend ist, da es die Verwendung einer breiten Vielzahl polymerer Substrate zur Bildung der Kerne, auf denen der magnetische Überzug wachsen gelassen werden soll, ermöglicht, die Konzentrationen der verwendeten Substrate relativ niedrig sein können, wodurch aufgrund des Vorhandenseins eines Überschusses von polymeren Materialien in der Lösung auftretende Schwierigkeiten beseitigt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun durch die Erfinder der vorliegende Erfindung ermittelt, dass magnetische Nanopartikel direkt durch Erzeugen geeigneter Kerne zum Wachsenlassen des magnetischen Metalloxids auf denselben und anschließendes Bewirken des Wachstums des magnetischen Metalloxids auf eine einfache Weise direkt hergestellt werden können.

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung der mit einem magnetischen Metalloxid überzogenen Nanopartikel die folgenden Stufen:

  • a) Kontaktieren einer wässrigen Lösung, die einen löslichen polymeren Metallchelatbildner enthält, mit einem oder mehreren, Metallionen liefernden löslichen Metallsalzen, wobei mindestens eines der Metallionen zur Bildung eines Oxids, das magnetisch ist, fähig ist, wobei die Metallionen in Mengen vorhanden sind, die das Bindungsvermögen des Chelatbildners nicht wesentlich übersteigen;
  • b) Bewirken, dass die Metallionen in den für die Bildung des Oxids, das magnetisch ist, erforderlichen Oxidationsstufen vorhanden sind;
  • c) Halten des pH-Werts der Lösung in einem Bereich von mindestens 7;
  • d) Einführen von weiteren Mengen der Metallsalze in die Lösung;
  • e) Bewirken, dass die weiteren Metallionen in den für die Bildung des Oxids, das magnetisch ist, erforderlichen Oxidationsstufen vorhanden sind;
  • f) Halten des pH-Werts der Lösung in einem Bereich von mindestens 7;
  • g) aufeinanderfolgendes Wiederholen der Vorgänge von Stufe d) bis Stufe f) so oft dies erforderlich ist, um mit einem magnetischen Metalloxid überzogene monodisperse Nanopartikel zu erhalten.

Der Ausdruck "Nanopartikel" soll ein Teilchen, dessen Größe weniger als 0,3 &mgr;m beträgt, bedeuten.

Mit dem Ausdruck "polymerer Metallchelatbildner" ist die Chelatbildung mit Metallionen gemeint. Die polymeren Metallchelatbildner, die zur Bildung der Kerne, auf denen das Wachstum eines magnetischen Metalloxids bewirkt werden soll, verwendet werden, sind Polymere mit funktionellen Gruppen, die Metallionen binden können, wie Amino-, Hydroxyl-, Carboxylat-, -SH-, Ether-, Imin-, Phosphat- und Sulfidgruppen.

Die bevorzugten magnetischen Metalloxide gemäß der vorliegenden Erfindung sind aus der aus Eisenoxiden (insbesondere Magnetit, Maghemit oder ein Gemisch derselben) und Ferrit bestehenden Gruppe ausgewählt. Um die Eisenoxide oder das Ferrit zu bilden, ist es günstig, wenn Eisen in der Lösung, die den löslichen Metallchelatbildner enthält, in zwei verschiedenen Oxidationsstufen, Fe+2 und Fe+3, vorhanden ist. Das Vorhandensein beider Oxidationsstufen in der Lösung wird dadurch bewirkt, dass entweder ein Gemisch von Eisen(II)- und Eisen(III)-salzen gemäß den Stufen a) und d) eingeführt wird, oder Eisen(II)-salze oder Eisen(III)-salze eingeführt werden und, falls erforderlich, ein Teil des Fe+2 oder Fe+3 in die andere Oxidationsstufe vorzugsweise durch Oxidation bzw. optional durch Reduktion umgewandelt wird. Vorzugsweise wird bewirkt, dass das auf einem der beiden Wege bereitgestellte Molverhältnis zwischen Fe+2- und Fe+3Ionen nicht höher als das Verhältnis zwischen Fe+2- und F++3-Ionen in der Zusammensetzung des gewünschten Magnetoxids ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in den Stufen a) und d) Eisen(II)-salze in die Lösung eingeführt und die Oxidation eines Teils derselben zur Bildung von Fe+3-Ionen durch Einführen eines Oxidationsmittels in die Lösung durchgeführt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden andere Metallsalze, die zusammen mit den Eisenionen magnetische Metalloxide bilden können, in den Stufen a) und d) bereitgestellt. Diese optionalen Metalle werden typischerweise aus Übergangsmetallen ausgewählt.

Die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Metallionen zur Bildung des magnetischen Metalloxids erfordert, dass der pH-Wert der Lösung mindestens 7 beträgt. Der pH-Wert wird in dem gewünschten Bereich entweder durch die Verwendung einer geeigneten Pufferlösung als die wässrige Lösung gemäß Stufe a) oder durch Einführen einer Base in die Lösung in den Stufen c) und f) gehalten. Es ist günstig, dass, sobald ein spezieller pH-Wert innerhalb des Bereichs von 7 oder darüber gewählt ist, dieser während der gesamten Herstellung der magnetischen Nanopartikel beibehalten wird, um eine im wesentlichen gleichförmige Größenverteilung der Endprodukte sicherzustellen.

Es ist klar, dass das Einführen der verschiedenen Komponenten in die Lösung gemäß den Stufen d) bis g) in zwei unterschiedlichen Arbeitsweisen durchgeführt werden kann:

Eine Arbeitsweise in Inkrementen, die im folgenden als portionsweise Arbeitsweise bezeichnet wird, bei der jede Komponente (Metallsalze, Oxidationsmittel und Base) in mehreren, vorzugsweise gleichen Dosismengen bereitgestellt wird, die nacheinander gemäß der in den Stufen d) bis g) festgelegten Reihenfolge zur Lösung gegeben werden, wobei diese Stufen so oft, wie erforderlich, wiederholt werden, bis die mit dem magnetischen Metalloxid überzogenen gewünschten Nanopartikel erhalten werden, wobei die Menge jeder Dosis derart ist, dass eine Polymerisation der Metallionen in der Lösung, d. h. nicht auf der Partikeloberfläche, im wesentlichen vermieden wird; und

eine kontinuierliche Arbeitsweise, bei der jede Komponente (Metallsalze, Oxidationsmittel und Base) kontinuierlich zu der Lösung gemäß der in den Stufen d) bis g) festgelegten Reihenfolge mit einer im wesentlichen gleichförmigen Fließrate, die für jede Komponente charakteristisch ist, zugegeben wird, um eine Polymerisation der Metallionen außerhalb der Partikeloberfläche zu vermeiden.

Die Menge jeder Dosis gemäß der ersten Ausführungsweise und die Fließrate gemäß der zweiten Ausführungsweise werden experimentell bestimmt und eingestellt, da die unerwünschte Polymerisation der Metallionen in den Lösungen, die bedeutet, dass die Stufen d) bis g) unter Verwendung kleinerer Dosismengen oder geringerer Fließraten durchgeführt werden müssen, manchmal für das Auge sichtbar ist oder unter Verwendung herkömmlicher Verfahren identifiziert werden kann. Beispielsweise kann ein optisches Verfahren auf der Grundlage eines Kolterzählers, das einen Hinweis ergibt, dass die Lösung polydispers wurde, verwendet werden. Alternativ können analytische Verfahren, wie Atomabsorption, verwendet werden, um den Aufbau einer signifikanten Konzentration freier Metallionen in der Lösung zu bestimmen.

Bei diesen Arbeitsweisen wird angenommen, dass die verschiedenen Komponenten der Lösung mit einer Rate zugeführt werden, die niedriger als die Rate oder ähnlich der Rate ist, mit der das magnetische Metalloxid auf der Oberfläche der Kerne gebildet wird, wodurch der Aufbau signifikanter Konzentrationen der Komponenten in der Lösung, die zu unerwünschten Nebenreaktionen (Polymerisation von Metallsalzen außerhalb der Korngrenzen der wachsenden Partikel und Agglomerationsprozesse) führen können, vermieden wird. Ungeachtet der genauen Erklärung ist es jedoch Fakt, dass ein Arbeiten auf die im vorhergehenden beschriebenen Weisen stabile monodisperse mit magnetischem Metalloxid überzogene Nanopartikel einer engen Größenverteilung ergibt.

Die Zahl der Wiederholungen der Stufen d) bis g) variiert entsprechend der gewählten Arbeitsweise und der gewünschten Größe der fertigen Nanopartikel, die durch die im vorhergehenden beschriebenen optischen Verfahren verfolgt wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Für die Zeichnungen gilt:

1 ist ein Schema, das die Kernbildung und das Wachstum eines magnetischen Eisenoxidfilms auf einem einzigen Kern zeigt.

2. Titrationskurven von Gelatine mit Fe+2-Ionen: (A) ohne Gegenwart eines Oxidationsmittels; (B) in Gegenwart von NaNO3 als Oxidationsmittel; (C) in Gegenwart von NaNO2 als Oxidationsmittel.

3. Histogramme der Teilchengröße von magnetischen Partikeln, die durch eine stufenweise Zugabe (A) und eine Zugabe in einer einzigen Dosis (B) von FeCl2·4H2O (0,21 mmol), NaNO2 (0,04 mmol) und NaOH (pH-Wert 9,5) in eine 0,1%-ige (Gew/V) wässrige Gelatinelösung gebildet wurden.

4. REM-Photomikrographie der magnetischen Nanopartikel, die durch portionsweise Zugabe der Polymerisationreagentien in die Gelatinelösung (0,1%) gebildet wurden.

5. Histogramme der Teilchengröße von magnetischen Partikeln, die durch eine stufenweise Zugabe (A) und eine Zugabe in einer einzigen Dosis (B) von FeCl2·4H2O (0,21 mmol), NaNO2 (0,04 mmol) und NaOH (pH-Wert 9,5) in eine 0,3%-ige (Gew/V) wässrige Gelatinelösung gebildet wurden.

6. REM-Photomikrographie der magnetischen Nanopartikel, die durch die Zugabe der Polymerisationsreagentien FeCl2·4H2O (0,21 mmol), NaNO2 (0,004 mmol) und NaOH (pH-Wert 9,5) in eine 0,3%-ige (Gew/V) wässrige Gelatinelösung in einer einzigen Dosis gebildet wurden.

7. REM-Photomikrographie, die das Wachstum der magnetischen Nanopartikel durch portionsweise Zugaben der Polymerisationsreagentien FeCl2·4H2O (0,21 mmol), NaNO3 (0,004 mmol) und NaOH (pH-Wert 9,5) in eine 0,3%-ige (Gew/V) wässrige Gelatinelösung belegt.

8. MRI-Bildgebung einer Rattenleber ohne magnetische Nanopartikel (A) und mit magnetischen Nanopartikeln (B).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORM

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung der mit magnetischem Metalloxid überzogenen Nanopartikel die folgenden Stufen:

  • a) Kontaktieren einer wässrigen Lösung, die einen löslichen polymeren Metallchelatbildner enthält, mit einem oder mehreren, Metallionen liefernden löslichen Metallsalzen, wobei mindestens eines der Metallionen zur Bildung eines Oxids, das magnetisch ist, fähig ist, wobei die Metallionen in Mengen vorhanden sind, die das Bindungsvermögen des Chelatbildners nicht wesentlich übersteigen;
  • b) Bewirken, dass die Metallionen in den für die Bildung des Oxids, das magnetisch ist, erforderlichen Oxidationsstufen vorhanden sind;
  • c) Halten des pH-Werts der Lösung in einem Bereich von mindestens 7;
  • d) Einführen von weiteren Mengen der Metallsalze in die Lösung;
  • e) Bewirken, dass die weiteren Metallionen in den für die Bildung des Oxids, das magnetisch ist, erforderlichen Oxidationsstufen vorhanden sind;
  • f) Halten des pH-Werts der Lösung in einem Bereich von mindestens 7;
  • g) aufeinanderfolgendes Wiederholen der Vorgänge von Stufe d) bis Stufe f) so oft dies erforderlich ist, um mit einem magnetischen Metalloxid überzogene monodisperse Nanopartikel zu erhalten.

Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass über die Stufen a) bis c) Kerne gebildet werden, auf denen das Wachsen des magnetischen Metalloxids anschließend über die Stufen d) bis g) bewirkt werden kann. Dieser Mechanismus ist schematisch in 1 angegeben, wo der Einfachheit halber nur eine einzige polymere Metallchelatbildungskette angegeben ist.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von mit magnetischem Metalloxid überzogenen Nanopartikeln, deren Größe weniger als 0,3 &mgr;m, vorzugsweise weniger als 0,1 &mgr;m beträgt. Die magnetischen Nanopartikel bestehen aus polymere Metallchelatbildner umfassenden Kernen, auf denen ein magnetisches Metalloxid wachsen gelassen wird. Einem Fachmann ist klar, dass das Gewichtsprozent-Verhältnis zwischen den Kernen und dem magnetischen Überzug gesteuert werden kann: je kleiner die Partikel sind, desto höher ist der Prozentanteil der Kerne. Beispielsweise bestehen Partikel von über etewa 0,2 &mgr;m hauptsächlich aus dem Überzug des magnetischen Metalloxids, und der Gewichtsprozent-Anteil der Kerne ist relativ vernachlässigbar. Andererseits kann bei Teilchen von etwa 60– 70 nm der Gewichtsprozent-Anteil der Kerne im Bereich zwischen 5 und 20% liegen.

Die polymeren Metallchelatbildner, die zur Bildung der Kerne, auf denen das Wachstum des magnetischen Metalloxids bewirkt werden soll, verwendet werden, sind Polymere mit funktionellen Gruppen, die Metallionen binden können, wobei die bevorzugten Gruppen Amino-, Hydroxyl-, Carboxylat-, -SH-, Ether-, Imin-, Phosphat- und Sulfidgruppen sind. Die polymeren Chelatbildner sind äußerst bevorzugt aus der aus Gelatine, Polymethylenimin, Dextran, Chitosan, Polylysin und Polyvinylpyrrolidon bestehenden Gruppe ausgewählt. Die Konzentration des polymeren Metallchelatbildners in der wässrigen Lösung kann zwischen 0,01 und 10, vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 (Gew/V) variieren.

Die bevorzugten magnetischen Metalloxide gemäß der vorliegenden Erfindung sind aus der aus Eisenoxiden (insbesondere Magnetit, Maghemit oder einem Gemisch derselben) und Ferrit, (Fe,M)3O4, wobei M im folgenden definiert ist, bestehenden Gruppe ausgewählt. Um die Eisenoxide oder Ferrit zu bilden, ist es günstig, dass Eisen in der Lösung, die den löslichen Metallchelatbildner enthält, in zwei unterschiedlichen Oxidationsstufen, Fe+2 und Fe+3, vorhanden ist. Das Vorhandensein beider Oxidationszustände in der Lösung wird dadurch bewirkt, dass entweder ein Gemisch von Eisen(II)- und Eisen(III)-salzen gemäß den Stufen a) und d) in einem Molverhältnis, das vorzugsweise nicht höher als das Verhältnis zwischen Fe+2 und Fe+3 in der Zusammensetzung des gewünschten Magnetoxids ist, eingeführt wird, oder Eisen(II)-salze oder Eisen(III)-salze eingeführt werden und, falls erforderlich, ein Teil des Fe+2 oder Fe+3 in die andere Oxidationsstufe vorzugsweise durch Oxidation bzw. optional Reduktion umgewandelt wird, wobei die Größe des Teils, der oxidiert oder reduziert wird, derart ist, dass das gebildete Molverhältnis zwischen Fe+2 und Fe+3 nicht höher als deren Verhältnis in der Zusammensetzung des gewünschten magnetischen Oxids ist.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst der Überzug aus einem magnetischen Metalloxid Magnetit oder Maghemit oder ein Gemisch derselben.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das magnetische Metalloxid, aus dem der magnetische Überzug besteht, Ferrit.

Die in den Stufen a) und d) bereitgestellten Metallsalze können zusätzlich zu Eisen(II)- oder/und Eisen(III)-salzen optional andere Metallsalze enthalten, die zusammen mit den Eisenionen die magnetischen Metalloxide bilden können, wenn ein Ferritüberzug beabsichtigt ist. Diese optionalen Metalle, die durch M bezeichnet werden, werden typischerweise aus Übergangsmetallen ausgewählt, wobei die bevorzugten Salze von Zn+2, Co+2, Mn+2 oder Ni+2 sind, wobei das Molverhältnis Fe+2/M+n, wobei M+n das Kation des Metalls M bezeichnet, gemäß der stöchiometrischen Zusammensetzung des gewählten Ferrits bestimmt wird. Die Metallsalze können in einer festen Form oder in der Form flüssiger Lösungen bereitgestellt werden, wobei Chloride, Bromide oder Sulfatsalze bevorzugt sind.

Die Menge des Metallions oder der Metallionen, die in den wässrige Lösung gemäß Stufe a) der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, wird durch das Bindungsvermögen des polymeren Metallchelatbildners, der in der Lösung vorhanden ist, in Bezug auf diese Ionen bestimmt. Der Ausdruck "Bindungsvermögen des polymeren Chelatbildners" soll die maximale Menge eines bestimmten Ions, die an eine gegebene Menge des polymeren Metallchelatbildners binden kann, bedeuten. Dieser Parameter ist von signifikanter Bedeutung, da durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung ermittelt wurde, dass die Konzentration des Metallsalzes/der Metallsalze, die in Stufe a) verwendet wurde, ähnlich dem oder nicht viel größer als das Bindungsvermögen des Chelatbildners gegenüber den Metallionen sein sollte, wobei sichergestellt wird, dass im wesentlichen alle Kerne gebildet wurden, bevor ein signifikantes Wachstum des magnetischen Überzugs beginnt, um eine hohe Ausbeute (nahezu 100%) einer einzigen Population von gleichförmigen monodispersen magnetischen Nanopartikeln zu erhalten. Das Bindungsvermögen eines gegebenen polymeren Metallchelatbildners kann durch einschlägig bekannte Verfahren im voraus bestimmt werden. Ein derartiges Verfahren ist in Beispiel 1 beschrieben und in 2 erläutert.

Zur Bildung des bevorzugten Überzugs aus einem magnetischen Metalloxid gemäß der vorliegenden Erfindung ist es im allgemeinen günstig, wenn das Eisen in der Lösung, die den löslichen Metallchelatbildner enthält, in zwei unterschiedlichen Oxidationsstufen, Fe+2 und Fe+3, vorhanden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die in Stufe a) bereitgestellten Metallsalze Eisen(II)-salze. Zur Umwandlung eines Teils der Fe+2-Ionen in Fe+3 gemäß Stufe b) wird eine Oxidationsreaktion durchgeführt, vorzugsweise durch Einführen eines Oxidationsmittels in die Lösung, wodurch ein Teil von Fe+2 zu Fe+3 oxidiert wird, wobei dieser Teil derart ist, dass das gebildete Verhältnis zwischen Fe+2 und Fe+3 nicht höher als deren Verhältnis in der Zusammensetzung des gewünschten magnetischen Oxids ist. In einer bevorzugt Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sollte das gewünschte Verhältnis zwischen Fe+2 und Fe+3 in der Lösung nicht höher als 1 : 2 sein, und daher sollten nicht mehr als 2/3 der Menge des Fe+2, das in die Lösung in den Stufen a) oder d) eingeführt wurde, und vorzugsweise weniger der Oxidationsreaktion unterzogen werden. Das Oxidationsmittel wird vorzugsweise aus der aus Sauerstoff, H2O2, Nitritsalzen oder Nitratsalzen bestehenden Gruppe ausgewählt. Die bevorzugten Oxidationsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung sind Nitrit- und Nitratsalze, insbesondere Alkalimetallnitrit- oder -nitratsalze. Es wurde durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschenderweise ermittelt, dass das gewünschte Molverhältnis von Nitrit (oder Nitrat)/Fe+2 vorzugsweise nicht höher als 2/3 ist und vorzugsweise geringer als 1/2 ist, wobei das bevorzugte Verhältnis etwa 1/5 beträgt, um die gewünschte enge Größenverteilung der magnetischen Nanopartikel sicherzustellen. Die Oxidationsmittel können in einer festen Form oder in Form einer flüssigen Lösung, optional in der Form einer basischen Pufferlösung bereitgestellt werden.

Wenn keine Pufferlösung als die wässrige Lösung, die den polymeren Metallchelatbildner enthält, gemäß Stufe a) oder optional als die Oxidationsmittellösung gemäß Stufe b) verwendet wird, sollten Basen zu der Lösung gemäß den Stufen c) und f) gegeben werden, um in der Lösung einen pH-Wert von mindestens 7 aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise liegt der pH-Wert der Lösung im Bereich zwischen 7 und 11, wobei ein pH-Wert zwischen 8 und 10 äußerst bevorzugt ist. Vorzugsweise wird, sobald ein pH-Wert in dem Bereich von 7 oder darüber gewählt ist, dieser während der gesamten Herstellung der magnetischen Nanopartikel beibehalten, um eine im wesentlichen gleichförmige Größenverteilung der Endprodukte sicherzustellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein erster pH-Wert während Stufe c) beibehalten und ein zweiter pH-Wert während Stufe f) beibehalten, wobei diese Werte innerhalb des Bereichs von mindestens 7 sind, wobei der zweite pH-Wert vorzugsweise höher ist. Basen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können aus der aus Alkalihydroxiden, Ammoniak oder organischen Basen, vorzugsweise Aminen, bestehenden Gruppen ausgewählt werden.

Wie im vorhergehenden erklärt, werden die Stufen d) bis f) gemäß der vorliegenden Erfindung in einer gesteuerten Weise, um sicherzustellen, dass Teilchen einer engen Größenverteilung gebildet werden und Nebenreaktionen (beispielsweise eine Polymerisation von Metallsalzen in der wässrigen Lösung und Agglomerationsprozesse) vermieden werden, indem eine Arbeitsweise in Inkrementen oder eine kontinuierliche Arbeitsweise, wie im vorhergehenden erklärt, gewählt wird, durchgeführt.

Es ist anzumerken, dass, wenn die Stufen d) bis f) nicht in einer gesteuerten Weise wie im vorhergehenden erklärt durchgeführt werden, dies zu einem wesentlichen Anteil von agglomerierten Partikeln und/oder der Bildung einer Population von Partikeln einer breiten Größenverteilung führen kann.

Das Verfahren zur Herstellung von mit einem magnetischen Metalloxid überzogenen Nanopartikeln gemäß der vorliegenden Erfindung wird in einem Temperaturbereich von unter 100°C durchgeführt, wobei Temperaturen zwischen 50°C und 90°C im allgemeinen bevorzugt sind. Eine Temperatur um 60°C wird typischerweise verwendet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung hohler magnetischer Nanopartikel. Gemäß diesem Aspekt werden diese hohlen magnetischen Nanopartikel durch Entfernen der aus dem polymeren Metallchelatbildner bestehenden Innenkerne aus diesen durch Wegbrennen derselben in einer inerten Atmosphäre erhalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Wegbrennen durchgeführt, indem die magnetischen Nanopartikel Temperaturen im Bereich von 400 bis 1000°C, vorzugsweise zwischen 500 und 900°C ausgesetzt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nanopartikel, deren Größe weniger als 0,3 &mgr;m, vorzugsweise weniger als 0,1 &mgr;m beträgt, die aus einem Polymer, das ein Metallchelatbildner ist, das mit einem magnetischen Metalloxid überzogen ist, bestehen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft hohle Nanopartikel, die aus einer Hülle aus einem magnetischen Metalloxid bestehen, deren Größe weniger als 0,3 &mgr;m, vorzugsweise weniger als 0,1 &mgr;m beträgt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der magnetischen Nanopartikel gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl biologischer und medizinischer Anwendungen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die biologischen und medizinischen Anwendungen aus der aus Zellmarkierung, Zelltrennung, gesteuerte Freisetzung, Diagnostika, Enzymimmobilisierung, Proteinreinigung, Kontrastmittel für MRI und Ultraschallbildgebung, Arzneimittelabgabe und Chelatbildung von Schwermetallionen bestehenden Gruppe ausgewählt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind funktionelle Gruppen enthaltende Moleküle an die magnetische Oberfläche der magnetischen Nanopartikel der vorliegenden Erfindung gebunden, um einen gewünschten funktionellen Überzug zu bilden. Vorzugsweise umfassen diese Moleküle Polymere, die aus Polysacchariden, Proteinen, Peptiden, Polyaminen und dem &ohgr;-Silan Si(OR)3(CH2)nX, wobei R ein Alkylsubstituent ist, n eine ganze Zahl zwischen 1 bis 18 einschließlich ist und X eine funktionelle Gruppe, die aus NH2, CH3, CN und SH ausgewählt ist, bedeutet, ausgewählt sind. Von den durch diese Moleküle bereitgestellten funktionellen Gruppen sind die Amingruppe oder andere funktionelle Gruppen, die in eine Amingruppe umgewandelt werden können, von besonderer Bedeutung, da eine kovalente Bindung von Polyaldehydliganden an diese Gruppen im weiteren durchgeführt werden kann. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Aktivierungsliganden, die vorzugsweise aus der aus Acryloylchlorid, Divinylsulfon, Dicarbonylimidazol, Ethylenglykolbis(sulfosuccinimidylsuccinat) und m-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysulfosuccinimidester bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei die Aktivierungsliganden die Oberfläche der Nanopartikel für die weitere Kopplung von biologisch aktiven Verbindungen geeignet machen, an die auf der Oberfläche der magnetischen Nanopartikel bereitgestellten funktionellen Gruppen gebunden. Vorzugsweise werden die biologisch aktiven Materialien aus Proteinen, Enzymen, Antikörpern und Arzneimitteln gemäß der gewünschten biologischen oder biomedizinischen Anwendung gewählt.

Wie im vorhergehenden erklärt, ist es für einige Anwendungsmöglichkeiten, beispielsweise spezifische Zelltrennung, Arzneimittelabgabe, Reaktionen in organischen Lösemitteln und dgl., wesentlich, die Oberfläche der magnetischen Nanopartikel zu modifizieren, um die Partikel gegenüber dem Agglomerationsprozess zu stabilisieren oder gewünschte funktionelle Gruppen der Oberfläche einzuführen. Die Modifikation der Oberfläche wird durch einschlägig bekannte Verfahren, die vorzugsweise in wässrigen Lösungen durchgeführt werden, erreicht. Eine Modifikation der magnetischen Partikel mit &ohgr;-Alkylsilanverbindungen, wie Si(OR)3(CH2)nX, X = CH3, NH2, SH und dgl ., wurde in wässrigen Lösungen gemäß einem dem bei P. Wikstrom et al., J. of Chromatography 455, 105 (1988) und S. Brandriss et al., Langmuir 9, 1232 (1993) beschriebenen ähnlichen Verfahren durchgeführt. Beispielsweise werden Partikel, an die &ohgr;-Alkylsilanverbindungen, die terminale Aminogruppen enthalten, gebunden sind, leicht in polaren Lösemitteln suspendiert, während Partikel, an die &ohgr;-Alkylsilanverbindungen, die terminale Methylgruppen enthalten, gebunden sind, leicht in unpolaren Lösemitteln suspendiert werden. Die Beschichtung der Oberfläche der magnetischen Nanopartikel mit Polysacchariden, wie Dextran und Dextranderivaten, beispielsweise Dextran-Biotin, wurde üblicherweise durch Mischen der Ferritsuspension in einer wässrigen Lösung der Polysaccharide bei hoher Temperatur (beispielsweise 80°C) während eines entsprechenden Zeitraums und anschließendes Abkühlen derselben auf Raumtemperatur durchgeführt. Cellulosebeschichtete Nanopartikel wurden durch Einmischen der Ferritsuspension bei Raumtemperatur in eine wässrige Cellulosexanthatlösung und anschließendes Hydrolysieren des Cellulosexanthats zu Cellulose durch Erhöhen der Temperatur der Suspension auf etwa 90°C gebildet. Chitosanbeschichtete Nanopartikel wurden durch Abscheiden einer sauren wässrigen Chitosanlösung auf ferritbeschichtete Nanopartikel bei einem pH-Wert von > 7, d. h. einem pH-Wert von 9,5, hergestellt. Die polysaccharidbeschichteten Ferritnanopartikel wurden dann durch Waschen von einem Überschuss von nichtgebundenen Polysacchariden durch Verfahren wie Dialyse, Gelfiltrationssäulen, Magnetfeld oder durch einen hohen Magnetfeldgradienten (HMFG) befreit. Im folgenden bedeutet eine Magnetfeldtrennung die Verwendung eines Permanentmagneten oder eines hohen Magnetfeldgradienten zur Trennung der Nanopartikel von der Lösung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Beschichtung der Oberfläche der magnetischen Nanopartikel mit Proteinen, vorzugsweise Proteinen wie Albumin, Polylysin und einem Copolymer von Polylysin und Glutaminsäure durch Einmischen der Metalloxidsuspension in einer wässrigen Lösung des Proteins bei einem basischen pH-Wert, beispielsweise pH-Wert von 9,5, während eines geeigneten Zeitraums durchgeführt werden. Die albuminbeschichteten magnetischen Nanopartikel wurden dann durch Waschen von nicht-gebundenem Albumin wie im vorhergehenden beschrieben befreit. Gelatinebeschichtete Nanopartikel wurden durch Einmischen der Ferritsuspension bei hoher Temperatur (beispielsweise 60°C) in eine wässrige Lösung der Gelatine während eines geeigneten Zeitraums hergestellt. Danach wurde die Temperatur auf Raumtemperatur verringert und die gelatinebeschichteten Partikel wurden wie im vorhergehenden beschrieben gewaschen.

Für biomedizinische Anwendungen, wie Arzneimittelabgabe und gesteuerte Freisetzung, MRI und Ultraschallbildgebung, werden die polymeren Metallchelatbildner und die zur Bildung des funktionellen Überzugs auf den magnetischen Nanopartikeln, wie im vorhergehenden beschrieben, verwendeten Polymere aus Materialien, die biologisch kompatibel, nichttoxisch und biologisch abbaubar sind, beispielsweise chelatbildenden Polymeren, wie Gelatine oder Chitosan, ausgewählt.

Aktivierte magnetische Nanopartikel zur Herstellung biologisch aktiver konjugierter Partikel wurden durch Wechselwirken der funktionell beschichteten Partikel mit spezifischen Aktivierungsliganden, wie Carbonyldiimidazol, Acryloylchlorid, Divinylsulfon [DVS], Ethylenglykolbis(sulfosuccinimidylsuccinat) [sulfo-EGS)] und m-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysulfosuccinimidester [sulfo-MBS], hergestellt. Verbliebene funktionelle Gruppen der funktionellen Beschichtung der Nanopartikel wurden dann blockiert. Biologisch aktive Reagentien, beispielsweise Proteine, Enzyme, Antikörper, Arzneimittel und dgl., wurden dann an die Aktivierungsliganden, die an die funktionelle Beschichtung bzw. den funktionellen Überzug der magnetischen Nanopartikel gebunden waren, kovalent gebunden. Verbliebene Aktivierungsgruppen der Aktivierungsliganden wurden dann blockiert oder hydrolysiert. Die biologisch aktiven magnetischen konjugierten Nanopartikel wurden dann für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Mikroverkapselung aktiver Materialien in den magnetischen Nanopartikeln durch Einführen eines aktiven Materials, beispielsweise eines Arzneimittels oder eines fluoreszierenden Farbstoffs, in die wässrige Lösung gemäß Stufe a) entweder als solches oder an einen geeigneten Liganden gekoppelt unter Bildung von magnetischen Mikroverkapselungsnanopartikeln, wobei der Überzug aus einem magnetischen Metalloxid eine Umhüllung für das aktive Material bereitstellt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die hohlen magnetischen Nanopartikel gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit einem Gas, wie Luft, gefüllt sind, in Anwendungen, wie Ultraschallbildgebung, die bereits für hohle Nanopartikel, die aus Albumin oder Span 60 und Tween 80 hergestellt wurden, beschrieben wurden [siehe M. A. Wheatley und S. Singhal, Reactive polymers 25, 157 (1995)] und für ferritbeschichtete porenhaltige Siliciumdioxidnanopartikel beschrieben wurden [siehe M. Zhang, Y. Kitamoto und M. Abe, J. Phys. IV France 7, C1-669 (1997)], verwendet werden.

Die vorhergehende Beschreibung und die Beispiele wurden alle zum Zwecke der Erläuterung bereitgestellt und sollen die Erfindung in keinster Weise beschränken. Viele Modifikationen können im Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführt werden. Beispielsweise können unterschiedliche chelatbildende Polymere verwendet und unterschiedliche Ferritzusammensetzungen und unterschiedliche Beschichtungen hergestellt werden, ohne jeweils über den Schutzumfang der Erfindung hinauszugehen.

BEISPIELE Beispiel 1 Chelatbildungsvermögen von Gelatine gegenüber Eisenionen

Das Chelatbildungsvermögen von Gelatine (Typ A aus Schweinehaut, Stärke 300 – Sigma) gegenüber Eisenionen wurde durch Titration der Gelatine in wässriger Lösung mit Eisenionen in Abwesenheit und in Gegenwart von Oxidationsmitteln, wie NaNO2 und NaNO3, bestimmt. Das Chelatbildungsvermögen wurde ermittelt, indem die pH-Änderungen während der Zugabe von Eisenionen in die Gelatinelösung verfolgt wurden. Der pH-Wert ändert sich nicht signifikant, solange die Eisenionen durch Gelatine als Chelat gebunden werden. Das Chelatbildungsvermögen von Gelatine gegenüber Eisenionen wird durch eine scharfe Abnahme des pH-Werts der wässrigen Lösung infolge des Vorhandenseins von signifikanten freien Eisenionen in der wässrigen Lösung angezeigt.

Beispiel 1-A. In einem typischen Experiment wurde eine luftfrei gemachte wässrige Lösung (10 ml bei 60°C geschüttelt), die 0,3% (Gew/V) Gelatine enthielt, mit Fe(II)ionen durch stufenweise Zugabe von 10 &mgr;l-Portionen einer Referenzeisenlösung (7 mmol FeCl2·4H2O in 5 ml destilliertem Wasser) zu der Gelatinelösung titriert. Jede zugegebene Dosis der Eisenreferenzlösung enthielt 0,014 mmol Fe(II)ionen und der Zeitabstand zwischen jeder Zugabe betrug etwa 3 min.

Beispiel 1-B. Das Experiment 1-A wurde wiederholt, wobei es jedoch ferner die Zugabe des Oxidationsmittels NaNO3 (0,0028 mmol) vor jeder Zugabe der Eisenlösung umfasste.

Beispiel 1-C. Das Experiment 1-B wurde wiederholt, wobei NaNO3 durch NaNO2 ersetzt wurde.

2: A-C zeigen, dass unter den experimentellen Bedingungen das Chelatbildungsvermögen von 30 mg Gelatine (0,3% in 10 ml Lösung) gegenüber Eisenionen zwischen 0,05 und 0,07 mmol Eisenionen beträgt. Unter den experimentellen Bedingungen sollte die Zugabe von Fe(II)-salzen für die Kernbildungsstufe das Bindungsvermögen der Gelatine gegenüber den Eisensalzen nicht signifikant übersteigen, um gleichförmige Magnetitnanopartikel zu bilden; ansonsten können Nebenreaktionen, wie die Bildung von polydispersen Magnetitnanopartikeln sowie agglutinierten Partikeln auftreten.

BEISPIEL 2 Herstellung von magnetischen Nanopartikeln mit Gelatine: portionsweise Zugabe gegenüber Zugabe in einer einzigen Dosis Beispiel 2-A. Portionsweise Zugabe

In einem typischen Experiment wurden 10 ml einer luftfrei gemachten wässrigen Lösung, die 0,1% (Gew/V) Gelatine enthielt, bei 60°C geschüttelt. Feste Proben, die FeCl2.4H2O (0,07 mmol) und NaNO2 (0,014 mmol) enthielten, wurden dann nacheinander in die Gelatinelösung gegeben (das NaNO2 wurde unmittelbar nach dem Aufösen des Eisensalzes zugegeben). Der pH-Wert der Lösung wurde dann durch die Zugabe von NaOH-Lösung (0,3 M) zu der Gelatinelösung auf 9,5 erhöht. Die Reaktion der Bildung des magnetischen Oxids wurde etwa 5 min fortgesetzt. Danach wurde das vorherige Verfahren (aufeinanderfolgende Zugaben von FeCl2·4H2O, NaNO2 und NAOH bis zu einem pH-Wert von 9,5) zweimal wiederholt.

Beispiel 2-B. Zugabe in einer einzigen Dosis Das Beispiel 2-A wurde wiederholt, wobei die drei aufeinanderfolgenden Zugaben von FeCl2.4H2O, NaNO2 und NAOH durch eine Zugabe dieser Reagentien in einer einzigen Dosis ersetzt wurden (0,21 mmol FeCl2.4H2O, 0,04 mmol NaNO2 und dann 0,03 M NAOH zum Erreichen eines pH-Werts von 9,5, Reaktionsdauer –15 min gegenüber Experiment 2-A).

Tabelle 1 und 3 und 4 geben eine Zusammenfassung und zeigen die Hauptunterschiede zwischen den Experimenten 2-A und 2-B.

Tabelle 1. Vergleich zwischen dem Magnetoxid, das durch die Zugabe von FeCl2.4H2O und NaNO2 in einer einzigen Dosis und mit stufenweiser Dosierung zu der Gelatinelösung gebildet wurde.

Beispiel 2 zeigt die Hauptunterschiede des Magnetoxids, das durch die portionsweise Zugabe und die Zugabe in einer einzigen Dosis einer ähnlichen Konzentration der Polymerisationsreagentien in die Gelatinelösung gebildet wurde. Die durch die portionsweisen Zugaben gebildeten Partikel aus einem magnetischen Oxid waren monodispers mit einer engen Größenverteilung. Im feuchten Zustand beträgt ihr durchschnittlicher Durchmesser 92 nm, was durch Koltermessungen angezeigt wurde (3A), und im trocknen Zustand beträgt ihr durchschnittlicher Durchmesser etwa 15 nm, was durch REM-Messungen gezeigt wurde (4). Nahezu 100% der zugegebenen Eisensalze wurden für den magnetischen Überzug verwendet (nur eine insignifikante Menge der Eisensalze wurde in der wässrigen Lösung außerhalb der Partikel gefunden). Die magnetischen Nanopartikel waren außerdem sehr gut verteilt und setzten sich auch während mehrerer Monate nicht ab. Andererseits wiesen die durch die einzige Zugabe gebildeten magnetischen Teilchen eine breite Größenverteilung auf und sie enthielten einen hohen Prozentsatz agglomerierter Partikel. Außerdem war die Suspension instabil und während einer relativ kurzen Zeitspanne schieden sich die meisten Teilchen aus, und selbst nach einer starken Ultraschallbehandlung waren die Teilchen nicht gut suspendiert und sie agglomerierten sehr bald und fielen aus.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei das Oxidationsmittel NaNO2 durch NaNO3 ersetzt wurde und die 0,1%-ige (Gew/V) Gelatine durch 0,3%-ige (Gew/V) ersetzt wurde, wie in Tabelle 2 angegeben ist.

Tabelle 2. Vergleich zwischen dem Magnetoxid, das durch die Zugabe von FeCl2·4H2O und NaNO3 in einer einzigen Dosis und mit stufenweiser Dosierung zu der Gelatinelösung gebildet wurde.

Dieses Experiment (siehe Tabelle 2 und 5) zeigte ein ähnliches Verhalten zu dem in Beispiel 2 beschriebenen, d. h. eine signifikante Überlegenheit der magnetischen Nanopartikel, die durch portionsweise Zugaben der Polymerisationsreagentien zu der Gelatinelösung gebildet wurden, im Vergleich zu einer einzigen Zugabe einer ähnlichen Konzentration der Polymerisationsreagentien.

Die durch die portionsweise Zugabe hergestellten magnetischen Nanopartikel waren monodispers, mit einer engen Größenverteilung mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 65 nm (kleiner als die in Gegenwart von 0,1%-iger Gelatine gebildeten (92 nm, wie in Tabelle 1 angegeben)). Fast 100 der zugegebenen Eisensalze wurden für den magnetischen Überzug verwendet. Die magnetischen Nanopartikel waren ebenfalls sehr gut verteilt und fielen selbst nach mehreren Monaten nicht aus. Andererseits war die Suspension der magnetischen Teilchen, die durch die einzige Zugabe gebildet wurden, instabil und sie enthielt einen hohen Prozentsatz agglomerierter Teilchen mit einer sehr breiten Größenverteilung.

Beispiel 4 Substitution der Gelatine durch Polyethylenimin

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei die Gelatine durch Polyethylenimin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 50000 ersetzt wurde. Ein dem im vorhergehenden beschriebenen ähnlicher Unterschied zwischen den portionsweisen Zugaben und der Zugabe in einer einzigen Dosis wurde beobachtet, wobei jedoch der durchschnittliche Durchmesser der Nanopartikel unterschiedlich war, d. h. 190 ± 40 nm für die durch die portionsweise Zugabe gebildeten Partikel und 380 ± 300 nm für die Zugabe in einer einzigen Dosis.

Beispiel 5

Ein dem in Beispiel 3 beschriebenen ähnliches Experiment wurde durchgeführt, wobei die festen Proben von FeCl2·4H2O und NaNO3 durch flüssige Proben ersetzt wurden. Für dieses Experiment wurden wässrige Referenzlösungen, die FeCl2·4H2O (2,1 g/5 ml 0,1 N HCl) und NaNO3 (0,5 g/5 ml H2O) enthielten, hergestellt und gemäß der folgenden Beschreibung verwendet:

10 ml einer luftfrei gemachten wässrigen Lösung, die 0,3 (Gew/V) Gelatine enthielt, wurde bei 60°C geschüttelt. Proben, die FeCl2·4H2O und NaNO3 enthielten, wurden dann nacheinander in die Gelatinelösung gegeben (das NaNO3 wurde 1 min nach der Zugabe des Eisensalzes zugegeben). Der pH-Wert der Lösung wurde dann durch Zugabe von NaOH (1,0 N) auf 9,5 erhöht. Die Reaktion wurde portionsweise (gleiche Portionen) oder in einer einzigen Dosis gemäß Tabelle 3 durchgeführt. Die Gesamtreaktionszeit für sowohl die portionsweise Zugabe als auch die Zugabe in einer einzigen Dosis betrug 15 min.

Tabelle 3. Vergleich zwischen dem Magnetoxid, das durch die Zugabe von wässrigen Lösungen von FeCl2·4H2O und NaNO3 in einer einzigen Dosis und mit stufenweiser Dosierung zu der Gelatinelösung gebildet wurde.

Ein zu dem in Beispiel 3 ähnlicher Unterschied zwischen den portionsweisen Zugaben (Tabelle 3-A) und der Zugabe in einer einzigen Dosis (Tabelle 3-B & C) wurde beobachtet. 6 ist beispielsweise ein typisches REM-Bild, das die agglomerierten Partikel, die durch die Zugabe in einer einzigen Dosis gemäß den Einzelheiten von Tabelle 3-B gebildet wurden, zeigt.

Beispiel 6 Wirkung des pH-Werts

Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei der pH-Wert 9,5 durch den pH-Wert 7,0 und den pH-Wert 11,0 ersetzt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet.

Beispiel 7 Wirkung der Temperatur

Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei 60°C durch 50°C und 90 °C ersetzt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Beispiel 8 Herstellung von Metallferriten

Das Experiment 5 wurde wiederholt, wobei jedoch das Fe(II)salz durch ein Gemisch aus einem Fe(II)-salz und einem weiteren Metallion, das aus Mn(II), Co(II), Ni(II) und Zn(II) ausgewählt wurde, ersetzt wurde. Das Molverhältnis Fe(II)/M(II) wurde bei 2/1 gehalten, und die meisten Metallsalze des M(II)-Typs waren in der Nitratform. Kolter-Messungen zeigten, dass die durch die portionsweisen Zugaben gebildeten Partikel eine enge Größenverteilung aufwiesen und Größen im Bereich zwischen etwa 50 nm und 150 nm in Abhängigkeit von der Art des Metallions aufwiesen. Andererseits wiesen die durch die Zugabe in einer einzigen Dosis gebildeten Ferritpartikel eine breite Größenverteilung auf und sie enthielten eine signifikante Menge agglomerierter Partikel.

Beispiel 9 Ändern des Molverhältnisses NO3 /Fe+2

Das Beispiel 5-A (portionsweise Zugaben) wurde mit den folgenden Molverhältnissen NO3 /Fe+2 1/20, 1/5, 1/2 und 1/1 wiederholt. Die magnetischen Partikel, die bei Verwendung des Molverhältnisses 1/1 gebildet wurden, wiesen eine breite Größenverteilung auf und enthielten einen signifikanten Teil agglomerierter Partikel. Andererseits wiesen die magnetischen Nanopartikel, die mit den anderen Molverhältnissen hergestellt wurden, einen ähnlichen Durchmesser (etwa 65 nm) mit einer engen Größenverteilung auf und sie verhielten sich ähnlich den gemäß Beispiel 5-A hergestellten magnetischen Nanopartikeln.

Beispiel 10 Herstellung fluoreszierender magnetischer Nanopartikel

Das Beispiel 5-A wurde wiederholt, wobei die Gelatinelösung durch eine ähnliche Lösung, die 2 mg Rhodamin-B-Isothiocyanat enthielt, ersetzt wurde. Überschüssiges fluoreszierendes Reagens wurde dann durch Dialyse entfernt. Fluoreszierende magnetische Nanopartikel ähnlicher Eigenschaften wurden gebildet. Fluoreszierende Nanopartikel werden auch durch Bindung der gewünschten fluoreszierenden Moleküle an die Oberfläche der Partikel gemäß Beispiel 23 hergestellt.

Beispiel 11 Ersetzen von NaOH durch Na4OH und (CH3)3NOH

Das Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei NaOH durch NH4OH und (CH3)3NOH ersetzt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Beispiel 12 Mikroverkapselung eines Arzneimittels, beispielsweise Adriamycin, in den magnetischen Nanopartikeln

Das Beispiel 5-A wurde wiederholt, wobei die Gelatinelösung durch eine ähnliche Lösung, die 10 mg Adriamycin enthielt, ersetzt wurde. Überschüssiges Adriamycin wurde dann durch ein Magnetfeld oder durch Dialyse entfernt. Magnetische Nanopartikel, die Adriamycin enthielten, wurden dadurch gebildet. Es ist auch möglich, das Arzneimittel an ein geeignetes Polymer, beispielsweise Polyethylenglykol, das am Ende eine Acylchloridgruppe enthält, kovalent zu binden und dann das im vorhergehenden angegebene Mikroverkapselungsverfahren zu wiederholen.

Beispiel 13 Ersetzen der Eisensalzlösung und der Oxidationsmittellösung durch eine beide Reagentien enthaltende einzige Lösung

Das Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei die Eisensalzlösung und die Oxidationsmittellösung durch eine beide Reagentien enthaltende einzige Lösung (unter Beibehalten von deren Konzentration) ersetzt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Beispiel 14 Ersetzen von Fe+2 und der Oxidationsmittellösung durch eine ein Gemisch von Fe+2- und Fe+3-Salzen enthaltende einzige Lösung

Das Beispiel 13 wurde wiederholt, wobei die das Fe+2-Salz und das Oxidationsmittel enthaltende Lösung durch eine Fe+2und Fe+3-Salze enthaltende Lösung, wobei deren Mengen betragen: [Fe+3] = [NaNO3], [Fe+2] = [Fe+2] – [NaNO3], wobei die Mengen auf der rechten Seite wie in Beispiel 5 definiert sind, ersetzt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Beispiel 15 Kontinuierliche Zugabe der Polymerisationsreagentien

Das Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei die portionsweisen Zugaben der Polymerisationsreagentien durch eine kontinuierliche Zugabe gemäß den folgenden Bedingungen ersetzt wurde: 100 &mgr;l der Eisensalzlösung mit einer Fließrate von 2,1 &mgr;l/min, 36 &mgr;l der Oxidationsmittellösung mit einer Fließrate von 0,8 &mgr;l/min und 365 &mgr;l der NaOH-Lösung mit einer Fließrate von 7,5 &mgr;l/min. Die Oxidationsmittellösung und die Baselösung wurden etwa 30 s bzw. 60 s nach der Zugabe der Eisensalzlösung zugegeben. Die Gesamtreaktionsdauer betrug etwa 50 min. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Zugabe der Polymerisationsreagentien mit einer etwa dreifach schnelleren Rate erhalten, und dadurch wurde das Beschichtungsverfahren nach etwa 16 min beendet.

Beispiel 16 Kernbildung und Wachstum der magnetischen Nanopartikel

In diesem Experiment wurde die Kernbildung und das Wachstum der magnetischen Partikel ähnlich den in Beispiel 5 beschriebenen gemäß Tabelle 4 durchgeführt.

Tabelle 4. Kernbildung und Wachstum magnetischer Nanopartikel.

Die Experimente A-C zeigen, dass die Kernbildungsgröße durch das chelatbildende Polymer bestimmt wird. Die durchschnittliche Größe der Partikel betrug in all diesen Versuchen 65 nm, jedoch war die Konzentration der Partikel von Versuch C signifikant höher als die von A und B. Auch war in den Experimenten A und B die Eisen(II)-Konzentration nicht ausreichend, um alle Kerne zu bilden, und die Farbe der Suspension war aufgrund von etwas wasserlöslichem Eisen(II)-Gelatine (das die Kernbildungsstufe noch nicht erreichte) gelblich-braun. In Experiment C ist die Konzentration des Eisen(II) höher und ausreichend, um die Bildung von dem größten Teil der Kerne, falls nicht von allen Kernen, zu erreichen. Die Experimente C und D zeigen das Wachstum der magnetischen Nanopartikel, d. h. in der feuchten Stufe von etwa 65 nm auf etwa 90 nm (Tabelle 4) und in der trocknen Stufe von etwa 10 nm auf etwa 25 nm (7).

Beispiel 17 Herstellung hohler magnetischer Nanopartikel

Hohle magnetische Nanopartikel wurden durch Wegbrennen des organischen Kerns der magnetischen Partikel, die ähnlich der Beschreibung in Beispiel 5 hergestellt wurden, gemäß Tabelle 5 hergestellt. Dieses Experiment wurde mit einer TGA (Thermogravimetric Analyzer von Mettler TC11 TA-Prozessor)-Vorrichtung in inerter Atmosphäre durchgeführt. In jedem Experiment wurden 10 mg Nanopartikel 15 min bei 110 °C zum Entfernen des Wassers gehalten, danach die Temperatur etwa 30 min auf 900°C erhöht (10°/min), um den Gelatinekern wegzubrennen.

Tabelle 5. Wegbrennen des organischen Kerns der magnetischen Nanopartikel.

Tabelle 5 zeigt, dass die Prozentmenge des organischen Kerns abnahm, wenn die Dicke des magnetischen Überzugs zunahm. Magnetische Messungen zeigten, dass die Partikel vor und nach dem Brennprozess eine ähnliche magnetische Suszeptibilität aufweisen.

Beispiel 18 Herstellung magnetischer Nanopartikel durch Verwendung von PVP als chelatbildendes Polymer

Das Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei Gelatine durch Polyvinylpyrrolidon (PVP) eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 160000 gemäß Tabelle 6 ersetzt wurde. Ähnliche Folgen wurden beobachtet. Es wurde auch ermittelt, dass es möglich ist, das Wachsen der Teilchen von etwa 160 nm bis auf etwa 300 nm fortzusetzen, und dass es über etwa 300 nm schwierig ist, Agglomerationsprozesse zu verhindern.

Tabelle 6. Vergleich zwischen den magnetischen Nanopartikeln, die durch die Zugabe von wässrigen Lösungen von FeCl2·4H2O und NaNO3 in einer einzigen Dosis und mit stufenweiser Dosierung zu der PVP-Lösung gebildet wurden.
Beispiel 19 Herstellung magnetischer Nanopartikel unter Verwendung von Dextran eines unterschiedlichen Molekulargewichts als chelatbildende Polymere

Das Beispiel 18 wurde wiederholt, wobei PVP durch Dextran eines unterschiedlichen Molekulargewichts gemäß Tabelle 7 ersetzt wurde.

Tabelle 7. Wirkung des Molekulargewichts von Dextran auf die magnetischen Nanopartikel.

Dieses Experiment zeigt, dass die Konzentration der zugegebenen Polymerisationsreagentien zur Bildung stabiler monodisperser Partikel stark vom Molekulargewicht des chelatbildenden Polymers abhängt. Beispielsweise waren bei ähnlichen Konzentrationen (Experimente A & B) die in Gegenwart von Dextran des niedrigeren Molekulargewichts (41 K) gebildeten Partikel instabil und sie enthielten einen wesentlichen Teil von agglomeriertem Material, während die in Gegenwart eines Dextrans des höheren Molekulargewichts (580 K) gebildeten Partikel stabil und monodispers mit einer relativ engen Größenverteilung waren.

Beispiel 20 Magnetische Messungen der magnetischen Nanopartikel

Das Beispiel 5 wurde gemäß Tabelle 8 wiederholt. Werte der magnetischen Suszeptibilität wurden mit einem Magnetometer (VSM Oxford Instrument Vibrating Sample Magnetometer) ermittelt. Die Magnetisierungskurven, die das magnetische Moment/Magnetfeld der in diesen Versuchen hergestellten Partikel beschreiben, die bei 250°K aufgezeichnet wurden, zeigen ein superparamagnetisches Verhalten aufgrund von Partikeln mit einzelnen Domänen an.

Tabelle 8. Magnetische Suszeptibilität der magnetischen Nanopartikel.
Beispiel 21 Lyophilisierung der magnetischen Nanopartikel

Die mit Wasser gewaschenen Nanopartikel, die 10% (Gew/V) Mannit oder 1% (Gew/V) Dextran oder 0,25% (Gew/V) Albumin enthielten, die in den Beispielen 5-A, 8 (portionsweise Zugaben) und 17-A hergestellt wurden, wurden lyophilisiert. Die lyophilisierten Pulver konnten durch Verwirbeln der mit Wasser (oder einem anderen physiologischen Lösemittel) befeuchteten Pulver ohne weiteres zur ursprünglichen Suspension dispergiert werden.

Beispiel 22 Oberflächenmodifizierung der magnetischen Nanopartikel

Eine Oberflächenmodifizierung der magnetischen Nanopartikel wurde mit Reagentien, wie &ohgr;-funktionellen Alkylsilanverbindungen, Proteinen und Polysacchariden, durchgeführt. Beispielsweise werden die folgenden typischen Oberflächenmodifizierungsverfahren beschrieben:

1. Beschichten der magnetischen Nanopartikel mit &ohgr;-Alkylsilanverbindungen, d. h. Si(OEt)3(CH2)3NH2.

1-A. In einem typischen Experiment wurden 0,1 ml des Amphiphils Si(OEt)3(CH2)3NH2 in 5 ml der magnetischen Nanopartikel, die gemäß den Beispielen 5-A, 8, 17 und 22 hergestellt wurden (die Partikel waren bei einem pH-Wert von 9,5 bei 60 °C) eingeführt. Die Suspension wurde dann etwa 12 h geschüttelt. Danach wurden die mit primärem Amin derivatisierten Partikel intensiv mit Wasser mittels eines Magnetfelds oder Dialyse gewaschen. Die gewaschenen beschichteten magnetischen Nanopartikel wurden dann lyophilisiert oder in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4°C aufbewahrt.

Ähnliche Verfahren wurden mit anderen &ohgr;-Silanverbindungen, beispielsweise Si(OEt)3(CH2)3X, worin X = CH3, SH und Epoxid, durchgeführt. Magnetische Nanopartikel, die mit hydrophilen &ohgr;-Gruppen, beispielsweise einem primären Amin, überzogen waren, verteilten sich ohne weiteres in polaren Lösemitteln (beispielsweise Wasser), ergaben jedoch in unpolaren Lösemitteln (beispielsweise Toluol) Aggregate. Andererseits verteilten sich Nanopartikel, die mit hydrophoben &ohgr;-Gruppen, beispielsweise CH3, überzogen waren, ohne weiteres in unpolaren Lösemitteln, ergaben jedoch in polaren Lösemitteln Aggregate.

Magnetische Nanopartikel, die &ohgr;-Aldehydgruppen enthielten, wurden durch Umsetzen der mit einem primären Amin &ohgr;-derivatisierten Partikel, die gemäß der vorhergehenden Beschreibung hergestellt wurden, mit 1% (Gew/V) Glutaraldehyd bei Raumtemperatur (oder höher) während etwa 3 h hergestellt. Die &ohgr;-aldehydderivatisierten Partikel wurden dann intensiv mit Wasser mittels eines Magnetfelds oder Dialyse gewaschen und wie im vorhergehenden beschrieben aufbewahrt.

1-B. In einem typischen Experiment wurden 5 ml der in 1-A beschriebenen magnetischen Nanopartikel gegen einen Acetatpuffer, 0,1 M mit einem pH-Wert von 5,5 dialysiert. Die Suspension wurde dann etwa 12 h bei 60°C mit den &ohgr;-Alkylsilanverbindungen, d. h. Si(OEt)3(CH2)3NH2, geschüttelt. Das Waschen der derivatisierten Partikel und die Derivatisierung mit Glutaraldehyd wurden gemäß der vorhergehenden Beschreibung (1-A) durchgeführt.

1-C. In einem typischen Experiment wurden 5 ml der magnetischen Nanopartikel mit 5 ml Glycerin verdünnt. 0,1 ml des Amphiphils Si(OEt)3(CH2)3NH2 wurden dann in die Glycerin/Wasser-Suspension eingeführt. Die Suspension wurde dann etwa 3 h bei 60°C gerührt. Danach wurde die Temperatur auf etwa 150°C erhöht. Bis das gesamte Wasser und das nichtgebundene Amphiphil von der Glycerin-Suspension abdestilliert waren. Das Waschen der derivatisierten Partikel und die Derivatisierung mit Glutaraldehyd wurden gemäß der vorhergehenden Beschreibung (1-A) durchgeführt.

2. Beschichtung der magnetischen Nanopartikel mit Proteinen

Beschichtung mit BSA. In einem typischen Experiment wurden 5 ml der magnetischen Nanopartikel, die gemäß den Beispielen 5-A, 8, 17 und 22 hergestellt wurden (pH-Wert 9,5 bei 60°C), in 5 ml einer 1–4%-igen (Gew/V) wässrigen Rinderserumalbumin(BSA)-Lösung bei 60°C (oder bei Raumtemperatur) eingeführt. Die Suspension wurde dann 4 h bei 60°C (oder bei Raumtemperatur) und anschließend 12 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die BSA-beschichteten Partikel wurden dann intensiv mit Wasser mittels eines Magnetfelds oder Dialyse gewaschen. Die gewaschenen beschichteten magnetischen Nanopartikel wurden dann lyophilisiert oder in einer wässrigen Lösung bei 4°C aufbewahrt.

Ähnliche Verfahren wurden mit anderen Proteinen, Peptiden und Polyaminen, beispielsweise humanem Serumalbumin, Gelatine, Casein, Polylysin, Copolymeren von Lysin und Glutaminsäure und Polyethylenimin, durchgeführt.

3. Beschichtung der magnetischen Nanopartikel mit Polysacchariden 3-A. Beschichtung der magnetischen Nanopartikel mit Dextran.

In einem typischen Experiment wurden 5 ml der magnetischen Nanopartikel, die gemäß den Beispielen 5-A, 8, 17 und 22 hergestellt wurden (pH-Wert 9,5 bei 60°C), in 5 ml einer wässrigen 1%-igen (Gew/V) Dextran(MG 41 K)-Lösung bei 80°C eingeführt. Die Suspension wurde dann 4 h bei 80°C und anschließend 12 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die dextranüberzogenen Partikel wurden dann intensiv mit Wasser mittels eines Magnetfelds oder Dialyse gewaschen. Die gewaschenen überzogenen magnetischen Nanopartikel wurden dann lyophilisiert oder in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4°C aufbewahrt. Ein ähnliches Verfahren wurde unter Substitution der Dextranbeschichtung bei 80°C durch Raumtemperatur durchgeführt. Es wurde ein ähnlicher Dextran-Beschichtungsgehalt erhalten.

Ein ähnliches Verfahren wurde zur Beschichtung der magnetischen Nanopartikel mit unterschiedlichen Derivaten von Polysacchariden, wie Dextran-Biotin, Carboxymethylcellulose und Stärke, durchgeführt.

3-B. Beschichtung der magnetischen Nanopartikel mit Cellulose.

3-B-I. In einem typischen Experiment wurde 1 ml einer wässrigen 1%-igen (Gew/V) Cellulosexanthatlösung in 5 ml der magnetischen Nanopartikel, die gemäß den Beispielen 5-A, 8 und 22 hergestellt wurden (die Partikel waren bei einem pH-Wert von 9,5 und auf Raumtemperatur gekühlt), eingeführt. Die Suspension wurde dann 4 h geschüttelt und anschließend auf etwa 80°C erhitzt und dann weitere 4 h geschüttelt, um die Xanthatgruppen zu hydrolysieren. Die celluloseüberzogenen Partikel wurden dann durch Waschen von der freien Cellulose mit Wasser mittels eines Magnetfelds befreit. Die gewaschenen überzogenen magnetischen Nanopartikel wurden dann lyophilisiert oder in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4°C aufbewahrt.

3-B-II. In einem typischen Experiment wurde 1 ml einer wässrigen 1%-igen (Gew/V) Cellulosexanthatlösung in 5 ml der magnetischen Nanopartikel, die gemäß den Beispielen 5-A, 8 und 22 hergestellt wurden (die Partikel waren bei einem pH-Wert von 9,5 und auf Raumtemperatur gekühlt), eingeführt. Die cellulosexanthatbeschichteten magnetischen Partikel wurden dann bei Raumtemperatur mit einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 9,5 mittels eines Magnetfelds gewaschen. Die Suspension wurde dann auf etwa 80°C erhitzt und wie bei 3-B-I beschrieben behandelt.

3-C. Beschichten der magnetischen Nanopartikel mit Chitosan.

In einem typischen Experiment wurde 1 ml einer wässrigen 0,1-1%-igen (Gew/V) Chitosanlösung mit einem pH-Wert von 3,0 tropfenweise in 5 ml der magnetischen Nanopartikel, die gemäß den Beispielen 5-A, 8, 17 und 22 hergestellt wurden (die Partikel waren bei einem pH-Wert von 9,5 und auf Raumtemperatur gekühlt), eingeführt. Das Chitosan schied sich vorzugsweise auf den Nanopartikeln ab. Die chitosanbeschichteten Partikel wurden dann durch Waschen mit Wasser mittels eines Magnetfelds von freiem Chitosan befreit. Die gewaschenen beschichteten magnetischen Nanopartikel wurden dann lyophilisiert oder in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4°C aufbewahrt.

4. Derivatisierung der magnetischen Nanopartikel mit Thiolreagentien.

Das Beispiel 3-A wurde wiederholt, wobei Dextran durch Dimercaptobernsteinsäure substituiert wurde.

Beispiel 23 Kopplung von Aminoliganden (d. h. Proteinen und Arzneimitteln) an die modifizierten magnetischen Nannopartikel 1. Kopplung an die aminbeschichteten Nanopartikel.

Im allgemeinen wurden die aminbeschichteten magnetischen Nanopartikel in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur oder (einer anderen gewünschten Temperatur) unter einem optimalen pH-Wert während einigen Stunden mit einem geeigneten Aktivierungsreagens, d. h. sulfo-EGS bei einem pH-Wert von 7–8,0, Acryloylchlorid bei einem pH-Wert von 8,5 und DVS bei einem pH-Wert von 9–9,5, geschüttelt. Nichtgebundenes Aktivierungsreagens wurde dann durch einige magnetische Abtrennungszyklen mit der vorliegenden wässrigen Lösung und anschließend mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,01 M mit einem pH-Wert von 7,4) oder einer anderen gewünschten physiologischen Lösung entfernt. Verbliebene Amingruppen wurden dann manchmal mit Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester durch Wiederholen des vorhergehenden Verfahrens unter Substituieren des Aktivierungsreagens durch 0,2% Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester in PBS-Lösung blockiert [siehe Y. Dolitzky, S. Sturchak, B. Nizan, Sela Ben-Ami und S. Margel, Analytical Biochemistry 220, 257 (1994)]. Die aktivierten magnetischen Nanopartikel wurden dann mit Aminoliganden (d. h. Proteinen) durch Schütteln derselben bei Raumtemperatur (oder einer anderen gewünschten Temperatur) während einigen Stunden mit einem gewünschten Protein und anschließend weiteren Stunden mit einem Blockierungsreagens (beispielsweise Glycin, Ethanolamin bei einem pH-Wert von 7 und dgl.) in PBS (oder einer anderen physiologischen Lösung) gebunden. Nicht-gebundenes Protein wurde dann durch einige magnetische Abtrennungszyklen in PBS (oder einer anderen physiologischen Lösung) entfernt. Die konjugierten Nanopartikel wurden dann in PBS (oder Wasser oder einer anderen physiologischen Lösung) bei 4°C gehalten.

Magnetische Kation- und Anionaustauschharze wurden in ähnlicher Weise erhalten, indem die Proteine durch Liganden, wie Polyethylenimin, (Diethylamino)ethylamin [DEAE] und Aminopropionsäure, ersetzt wurden.

In einem typischen Experiment wurde 1 mg der aminbeschichteten magnetischen Nanopartikel von etwa 65 nm Durchmesser in PBS (pH-Wert 7,5) bei Raumtemperatur 4 h mit 0,1 mg des Aktivierungsreagens sulfo-EGS geschüttelt. Nicht-gebundenes Aktivierungsreagens wurde dann durch magnetische Abtrennung in PBS entfernt. Verbliebene Amingruppen wurden dann mit Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester durch Wiederholen des im vorhergehenden genannten Verfahrens, wobei das Aktivierungsreagens durch 0,2% Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester in PBS-Lösung ersetzt wurde, blockiert. Die aktivierten derivatisierten magnetischen Nanopartikel wurden dann 4 h bei Raumtemperatur mit 1 mg Trypsin in 5 ml PBS geschüttelt. Verbliebene Aktivierungsgruppen auf den Teilchen wurden dann durch Zugabe von 5 mg Glycin zu den geschüttelten konjugierten Nanopartikeln blockiert. Nach weiteren 2 h wurden nicht-gebundenes Trypsin und Glycin dann durch magnetische Abtrennung in PBS entfernt. Die mit Trypsin konjugierten Partikel wurden dann in PBS (oder Wasser oder einer anderen physiologischen Lösung) bei 4°C gehalten.

Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wurden die im folgenden angegebenen weiteren Proteine kovalent an die verschiedenen aminderivatisierten magnetischen Nanopartikel gebunden: Adriamycin, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (G RIgG), Ziegen-Anti-Maus-Ig (G MIg), Ziegen-IgG, Protein A, BSA und Lysozym.

2. Kopplung an die thiolbeschichteten Nanopartikel.

Das im vorhergehenden angegebene Verfahren (1) wurde wiederholt, wobei die Aktivierungsgruppen (beispielsweise sulfo-EGS) durch andere Aktivierungsreagentien (beispielsweise sulfo-MBS) ersetzt wurden, und der pH-Wert der Aktivierung von 7–8 auf 6,5–8,0 geändert wurde.

3. Kopplung an die aldehydbeschichteten Nanopartikel.

Im allgemeinen wurden die aldehydbeschichteten magnetischen Nanopartikel bei Raumtemperatur (oder einer anderen gewünschten Temperatur) einige Stunden mit dem gewünschten Protein in PBS (oder einer anderen physiologischen Lösung) geschüttelt. Nicht-gebundenes Protein wurde dann durch einige wenige magnetische Trennzyklen in PBS entfernt. Verbliebene Aldehydgruppen wurden dann mit Aminoliganden, wie BSA, Hydroxylamin oder Ethanolamin, bei einem physiologischen pH-Wert blockiert. Die mit Protein konjugierten Partikel wurden dann lyophilisiert oder in PBS (oder Wasser oder einer anderen physiologischen Lösung) bei 4°C gehalten.

Magnetische Kation- und Anionaustauschharze wurden in ähnlicher Weise gebildet, wobei die Proteine durch Liganden, wie Polyethylenimin, (Diethylamino)ethylamin [DEAE] und Aminopropionsäure, ersetzt wurden. Für Liganden, die eine einzelne primäre Amingruppe enthalten, wurden die Schiff-Base-Bindungen weiter zu Einfachbindungen mit NaBH4 oder NaCNBH4 reduziert. Dieses Verfahren wurde üblicherweise in einer Ethanolsuspension oder in einer wässrigen Suspension bei 4°C oder einem basischen pH-Wert (zwischen 9 und 11) durchgeführt, siehe A. Lazar, L. Silverstein, S. Margel und A. Mizrahi, Develop. Biol. Standard, 60, 457 (1985).

In einem typischen Experiment wurde 1 mg der aldehydbeschichteten magnetischen Nanopartikel von etwa 65 nm Durchmesser bei Raumtemperatur 4 h mit 1 mg Trypsin in 5 ml PPS geschüttelt. Nicht-gebundenes Trypsin wurde dann durch 3 magnetische Abtrennzyklen in PBS abgetrennt. Verbliebene Aldehydgruppen auf den Teilchen wurden dann durch Schütteln der konjugierten Nanopartikel bei Raumtemperatur während 4 h mit BSA (1%) in PBS blockiert. Nicht-gebundenes BSA wurde dann durch 3 magnetische Abtrennzyklen in PBS entfernt. Die mit Trypsin konjugierten Partikel wurden dann in PBS (oder Wasser oder einer anderen physiologischen Lösung) bei 4°C gehalten.

Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wurden die folgenden weiteren Proteine kovalent an die verschiedenen Aldehyd-derivatisierten magnetischen Nanopartikel gebunden: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (G RIgG), Ziegen-Anti-Maus-Ig (G MIg), Ziegen-IgG, Protein A, BSA und Lysozym.

4. Kopplung an die hydroxylbeschichteten Nanopartikel.

10 mg der lyophilisierten dextranbeschichteten Nanopartikel (65 nm) wurden in 10 ml Aceton dispergiert. 1 mg Carbonyldiimidazol wurde dann zu den dispergierten Partikeln gegeben. Die Suspension wurde dann 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die aktivierten Partikel wurden dann durch Waschen von nicht-gebundenem Aktivierungsreagens mittels eines Magnetfelds befreit. Die getrockneten aktivierten Partikel wurden dann bei Raumtemperatur in 1 mg Trypsin enthaltende 5 ml PBS eingeführt. Die Suspension wurde etwa 12 h geschüttelt und dann wurde verbliebenes Aktivierungsreagens durch eine Hydrolyse bei einem pH-Wert von 8,5 (0,1 M Bicarbonatlösung) bei Raumtemperatur während 4 h blockiert.

Beispiel 24 Biologische Anwendungen der mit Protein konjugierten magnetischen Nanopartikel 1. Biokatalyse: proteolytische Aktivität gegenüber Gelatinegel.

Eine Gelatinesuspension (5% (Gew/V)) in PBS wurde 20 min auf 60°C erhitzt. Die gebildete klare Gelatinelösung wurde in Kunststoffschalen (5 mm Durchmesser, 1 ml/Schale) gegossen und dann bei Raumtemperatur gelieren gelassen. Das Gewicht des Gels in jeder Schale wurde dann genau bestimmt.

1 ml PBS-Suspension, die 20 mg von mit Trypsin konjugierten magnetischen Nanopartikeln von etwa 65 nm Durchmesser enthielt, wurde auf die Geloberfläche appliziert. Um die Stabilität der Gelatinegele gegenüber den experimentellen Bedingungen aufzuzeigen, wurde 1 ml PBS, das 20 mg mit Ethanolamin konjugierte Nanopartikel enthielt (Kontrolle), ebenfalls auf eine ähnliche Geloberfläche gegeben und während der Versuchszeitspanne inkubiert.

Die Proben wurden etwa 48 h bei 25°C inkubiert. Nach der Inkubation war das mit den mit Trypsin konjugierten Partikeln behandelte Gelatinegel vollständig solubilisiert. Diese Wirkung beruht wahrscheinlich auf dem enzymatischen Abbau der Gelatine durch das immobilisierte Trypsin [siehe S. Margel und I. Burdygin, WO 98/02189]. Auf der anderen Seite blieb das mit den Kontrollnanopartikeln inkubierte Gelatinegel das gleiche. Die mit Trypsin konjugierten Partikel wurden dann von der solubilisierten Gelatinelösung entfernt und mit PBS mittels eines Magnetfelds gewaschen. Dieses Verfahren wurde dann weitere zwei Male auf neue Gelatinegele angewandt. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

2. Gesteuerte Freisetzung.

Eine Gelatinesuspension (5% (Gew/V)), die 5% eines Arzneimittels, wie Adriamycin, enthielt, in PBS wurde 20 min auf 60°C erhitzt. Die gebildete klare Gelatinelösung wurde in Kunststoffschalen (5 mm Durchmesser, 1 ml/Schale) gegossen und dann bei Raumtemperatur gelieren gelassen. Das Gewicht des Gels in jeder Schale wurde dann genau bestimmt. Mit Trypsin konjugierte magnetische Nanopartikel wurden, wie in Beispiel 24–1 beschrieben, auf das Gelatinegel appliziert. Während des Auflösens des Gels wurde Adriamycin gesteuert freigesetzt.

3. Proteinreinigung.

1 ml PBS-Suspension, die 10 mg Ziegen-IgG-konjugierte magnetische Nanopartikel von etwa 65 nm Durchmesser enthielt, wurde in 5 ml eines Kaninchen-Antiserums eingeführt. Nach etwa 10-minütigem Schütteln bei Raumtemperatur wurden die Partikel 3-mal mit PBS mittels eines Magneten gewaschen. Absorbierte Antikörper (Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG) wurden dann von den Partikeln mit einer 0,2 M Glycin-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 2,4 eluiert, mit NaOH neutralisiert und gegen PBS dialysiert. Die hohe Reinheit der eluierten Antikörper wurde dann durch Polyacrylamidgelelektrophorese demonstriert. Die magnetischen konjugierten Nanopartikel wurden nach einer Behandlung mit Glycin-HCl-Puffer mit PBS mittels eines Magnetfelds gewaschen und dann bei 4°C in Gegenwart von Natriumazid (0,05%) bis zur erneuten Verwendung aufbewahrt.

4. Diagnostika: Bestimmung von 1-Antitrypsin in humanem Serum

Die Aktivität der mit Trypsin konjugierten Nanopartikel, die wie in Beispiel 25–1 beschrieben hergestellt wurden, wurde mit dem Substrat -N-benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) überprüft. Das konjugierte Trypsin setzte in einer Reaktion mit BAPNA in Tris-Puffer (pH-Wert 8) p-Nitroanilin frei, dessen Extinktionswert bei 400 nm ermittelt wurde.

Die Bestimmung von 1-Antitrypsin in humanem Serum beruhte auf der Hemmwirkung von Antitrypsin von Serum auf die Hydrolyse von BAPNA durch das konjugierte Trypsin in Tris-Puffer. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Essigsäure gestoppt, und die Extinktion wird dann bei 400 nm abgelesen. Bei dieser Wellenlänge besitzt das freigesetzte p-Nitroanilin ein molares Absorptionsvermögen von 10500. Kurz gesagt, wurde jedes geprüfte Serum vor dem Test 1000-fach mit Tris-Puffer verdünnt. 2 ml des verdünnten Serums wurden dann bei 37°C 30 min mit 1 ml einer Suspension, die 10 mg von mit Trypsin konjugierten Nanopartikeln in Tris-Puffer enthielt, inkubiert. 5 ml BAPNA-Lösung (die durch Auflösen von 100 mg BAPNA in 2,3 ml Dimethylsulfoxid hergestellt wurde, und wobei dann 1 ml dieser Stammlösung mit 100 ml Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 verdünnt wurde) bei 37°C wurden dann während 30 min zu der Suspension von Serum-Trypsin-konjugierten Nanopartikeln gegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 ml Eisessig gestoppt. Der Grad der Wechselwirkung zwischen den konjugierten Trypsin und BAPNA wurde dann durch den Extinktionswert bei 400 nm bestimmt. Kontrollexperimente wurden mit 4% humanem Serumalbumin (HSA) unter Verwendung des gleichen Verfahrens durchgeführt. Die genaue Menge von 1-Antitrypsin wurde durch Vergleich einer Standardkurve, die mit einer bekannten Menge von 1-Antitrypsin erhalten wurde, bestimmt. Die durch dieses Verfahren erhaltenen Ergebnisse waren in guter Übereinstimmung mit den durch das Radialimmunodiffusionsverfahren [siehe J. Travis und D. Johnson, Methods Enzymol. 80, 754 (1981)], dem am häufigsten zur Bestimmung von 1-Antitrypsin in Humanserum verwendeten klinischen Verfahren, erhaltenen Ergebnissen.

5. (A) Zellmarkierung: Spezifische Zellmarkierung von humanen roten Blutzellen.

Frische humane rote Blutzellen (HRBC) wurden 50 min bei 4 °C mit Kaninchen-Anti-HRBC (106 HRBC mit 0,8 g Kaninchen-Anti-HRBC)-Antikörpern geschüttelt. Die sensibilisierten Zellen wurden abgetrennt und 4-mal durch Zentrifugation mit PBS gewaschen. Die gewaschenen sensibilisierten Zellen wurden dann 1 h bei 4°C mit mit G RIgG konjugierten magnetischen Nanopartikeln (5 mg, 65 nm), die wie in Beispiel 24 beschrieben hergestellt wurden, geschüttelt. Die markierten Zellen wurden dann durch Waschen mit PBS von überschüssigen Nanopartikeln mittels eines Magnetfelds befreit. Kontrollexperimente wurden in ähnlicher Weise unter Ersetzen der sensibilisierten Kaninchen-Anti-HRBC durch nichtsensibilisierte HRBC durchgeführt. Die Prüfung mit REM demonstrierte die spezifische Markierung der RBC durch die mit G RIgG konjugierten Nanopartikel. Die Kontrollzellen wurden andererseits überhaupt nicht markiert.

(B) Spezifische Markierung von Oberflächenimmunglobuline tragenden Maus-Splenocyten (B-Zellen).

Mit G MIg konjugierte fluoreszierende Nanopartikel (5 mg, 65 nm), die wie in Beispiel 24 beschrieben hergestellt wurden, wurden 1 h bei 4°C mit gereinigten Maus-Splenocyten (106) geschüttelt. Die markierten Zellen wurden dann durch Waschen mit PBS mittels eines Magnetfelds von überschüssigen Nanopartikeln befreit. Kontrollexperimente wurden in ähnlicher Weise unter Ersetzen der Maus-Splenocyten durch Maus-Thymocyten durchgeführt. Die Überprüfung mittels eines Fluoreszenzmikroskops zeigte die spezifische Markierung der Maus-Splenocyten mit den mit G MIg konjugierten Nanopartikeln. Die Kontrollzellen waren auf der anderen Seite überhaupt nicht markiert.

6. Zelltrennung: Abtrennung von Truthahn-RBC von humanen RBC.

Ein Gemisch, das 106 humane RBC und 106 Truthahn-RBC enthielt, wurde mit magnetischen Nanopartikeln unter Verwendung des in 5-A beschriebenen Markierungsverfahrens behandelt. Ein Magnet wurde dann an der Außenwand einer Phiole, die 5 ml einer PBS-Suspension des Gemischs der Zellen enthielt, angebracht. Zellen, die nicht zur Wand gezogen wurden, wurden dann isoliert. Die angezogenen Zellen wurden in PBS resuspendiert und die magnetische Trennung wurde zweimal wiederholt. Eine Überprüfung durch Lichtmikroskopie demonstrierte eine Trennwirksamkeit von 99–100% der humanen RBC von den Truthahn-RBC.

7. Chelatisierung von Schwermetallionen.

15 mg der mit Chitosan oder Polyethylenimin überzogenen magnetischen Nanopartikel (65 nm), die wie in Beispiel 23 hergestellt wurden, wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 100 ml wässriger Lösungen, die 15 mg CdCl2 oder CuCl2 enthielten, geschüttelt. Die Partikel wurden dann aus der wässrigen Lösung mittels eines Magnetfelds entfernt. Atomabsorptionsmessungen an der verbliebenen wässrigen Lösung zeigten die Entfernung von 90–100% der Metallionen aus dem Wasser.

Beispiel 25 Kontrastmittel für MRI

Relaxationszeiten (T1 & T2) wurden mit einem 2T (Tesla) Whole Body MRI System (2T prestige, Elscint Ltd.) bei Raumtemperatur gemessen. T1 wurde aus 10 Datenpunkten, die durch die Inversion-Recovery(IR)-Pulssequenz erzeugt wurden, ermittelt. T2 wurde durch die Spin Echo-Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Sequenz ermittelt. 8 Echozeiten (TE) wurden verwendet: 24, 48, 72, 104, 124, 148, 172, 204 ms (Millisekunden). Die Wiederholungszeit (TR) betrug 5000 ms.

In-vitro-Untersuchungen:

Messungen der Relaxivität (R1 & R2) von magnetischen Nanopartikeln in einer wässrigen 5%-igen Dextrosesuspension (0,05 mM Fe), die gemäß Beispiel 5-A hergestellt wurden, zeigten Werte von 17,4 und 240 mM–1 s–1 für R1 bzw. R2. Ähnliche Messungen für magnetische Nanopartikel, die gemäß Beispiel 5-A hergestellt und dann mit Dextran gemäß Beispiel 23 überzogen wurden, zeigten Werte von 16,2 und 202 mM–1 s–1 für R1 bzw. R2.

In-vivo-Messungen:

MRI wurde an der Leber einer Ratte mit 2T unter Verwendung einer SE-Sequenz mit TR/TE = 500/96 ms durchgeführt. Die intravenös injizierte Dosis betrug 10–15 &mgr;mol Fe/kg der gebildeten wässrigen magnetischen Dextrosesuspension. 8A zeigt die Intensität der Leber vor der Injektion der Partikel und 8B zeigt die Intensität der Leber 25 min nach der Injektion der Partikel. Das Intensitätsverhältnis zwischen der Leber nach der Injektion (Ipost) und vor der Injektion (Ipre) des Magnetits (Ipost/Ipre) wurde als 0,47 ermittelt, was die hohe Effizienz dieser Nanopartikel als Kontrastmittel für MRI-Zwecke zeigt.

Beispiel 25 Arzneimittelabgabe und gesteuerte Freisetzung

Der In-vivo-Teil von Beispiel 25 wurde wiederholt, wobei die magnetischen Nanopartikel von Beispiel 5-A durch die magnetischen Nanopartikel von Beispiel 12 (Nanopartikel, die eingekapseltes Arzneimittel, beispielsweise Adriamycin, enthalten) ersetzt wurden. Die gesteuerte Freisetzung des Arzneimittels in der Leber beruht auf der biologischen Abbaubarkeit der magnetischen Nanopartikel.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung von mit einem magnetischen Metalloxid überzogenen Nanopartikeln, das die folgenden Stufen umfasst:

    a) Kontaktieren einer wässrigen Lösung, die einen löslichen polymeren Metallchelatbildner enthält, mit einem oder mehreren, Metallionen liefernden löslichen Metallsalzen, wobei mindestens eines der Metallionen zur Bildung eines Oxids, das magnetisch ist, fähig ist, wobei die Metallionen in Mengen vorhanden sind, die das Bindungsvermögen des Chelatbildners nicht wesentlich übersteigen;

    b) Bewirken, dass die Metallionen in den für die Bildung des Oxids, das magnetisch ist, erforderlichen Oxidationsstufen vorhanden sind;

    c) Halten des pH-Werts der Lösung in einem Bereich von mindestens 7;

    d) Einführen von weiteren Mengen der Metallsalze in die Lösung;

    e) Bewirken, dass die weiteren Metallionen in den für die Bildung des Oxids, das magnetisch ist, erforderlichen Oxidationsstufen vorhanden sind;

    f) Halten des pH-Werts der Lösung in einem Bereich von mindestens 7;

    g) aufeinanderfolgendes Wiederholen der Vorgänge von Stufe d) bis Stufe f) so oft dies erforderlich ist, um mit einem magnetischen Metalloxid überzogene monodisperse Nanopartikel zu erhalten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die polymeren Metallchelatbildner funktionelle Gruppen besitzen, die Metallionen, die aus der aus Amino-, Hydroxyl-, Carboxylat-, -SH-, Ether-, Imin-, Phosphat- und Sulfidgruppen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, binden können.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der polymere Metallchelatbildner aus der aus Chelatine, Polymethylenimin, Dextran, Chitosan, Polylysin und Polyvinylpyrrolidon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des polymeren Metallchelatbildners in der wässrigen Lösung zwischen 0,01 und 10% (Gew./V.) variiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration des polymeren Metallchelatbildners in der wässrigen Lösung zwischen 0,1 und 1% (Gew./V.) variiert.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Metalloxid, das magnetisch ist, aus der aus Eisenoxiden oder Ferrit bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das magnetische Eisenoxid Magnetit oder Maghemit oder ein Gemisch derselben ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung mit Fe+2-Ionen liefernden Eisen(II)-Salzen kontaktiert wird, und durch Oxidieren eines Teils dieser Fe+2-Ionen bewirkt wird, dass Fe+3-Ionen in der Lösung vorhanden sind.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung mit einem Gemisch von Eisen(II)- und Eisen(III)-Salzen kontaktiert wird, was bewirkt, dass Fe+2- und Fe+3-Ionen in der Lösung vorhanden sind.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Oxidieren eines Teils der Fe+2-Ionen durch Einführen eines Oxidationsmittels in die Lösung durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 10, wobei das magnetische Metalloxid Eisenoxid ist und der Teil von Fe+2, der oxidiert wird, nicht größer als 2/3 ist, wodurch das in der Lösung erhaltene Molverhältnis von Fe+2 zu Fe+3 nicht größer als 1 : 2 ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Teil von Fe+2, der oxidiert wird, nicht größer als 1/2 ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Oxidationsmittel aus Sauerstoff, H2O2, Nitrit- oder Nitratsalzen ausgewählt ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Oxidationsmittel NO2 oder NO3 ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Molverhältnis (NO2 oder NO3 )/Fe+2 nicht größer als 1/2 ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das magnetische Metalloxid Ferrit ist, wobei das Verfahren ferner die Zugabe von Übergangsmetallsalzen in den Stufen a) und d) umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert durch die Zugabe einer Base in einem Bereich von mindestens 7 gehalten wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert auf einem konstanten Wert im Bereich zwischen 8 und 10 gehalten wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufen d) bis f) in einem, wie im vorhergehenden angegebenen, portionsweisen Arbeitsverfahren durchgeführt werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufen d) bis f) in einen, wie im vorhergehenden angegebenen, kontinuierlichen Arbeitsverfahren durchgeführt werden.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Größe der Nanopartikel weniger als 0,1 &mgr;m beträgt.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Temperatur zwischen 50°C und 90°C beträgt.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Entfernen des inneren polymeren Metallchelatbildnermaterials unter Bildung magnetischer Nanopartikel, die hohl sind, durch Wegbrennen des polymeren Materials in einer inerten Atmosphäre umfasst.
  24. Verfahren nach Anspruch 1 oder 23, das ferner das Befestigen von funktionelle Gruppen enthaltenden Molekülen an der magnetischen Oberfläche der magnetischen Nanopartikel zur Bildung eines gewünschten funktionellen Überzugs auf den Partikeln umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die funktionelle Gruppen enthaltenden Moleküle Polymere umfassen, die aus der aus Polysacchariden, Proteinen, Peptiden, Polyaminen und &ohgr;-Silan Si(OR)3(CH2)nX, worin R ein Alkylsubstituent ist, n eine ganze Zahl zwischen 1 und einschließlich 18 ist und X eine aus der aus NH2, CH3, CN und SH bestehenden Gruppe ausgewählte funktionelle Gruppe ist, bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, das ferner das Binden von Polyaldehydliganden an die Amingruppen des funktionellen Überzugs umfasst.
  27. Verfahren nach den Ansprüchen 25 und 26, das ferner das Befestigen von Aktivierungsliganden, die zur Bindung von biologisch aktiven Mitteln fähig sind, an den funktionellen Gruppen umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Aktivierungsliganden aus der aus Acryloylchlorid, Divinylsulfon, Dicarbonylimidazol, Ethylenglykolbis(sulfosuccinimidylsuccinat) und m-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysulfosuccinimidester bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, das ferner die Kopplung von biologisch wirksamen Mitteln an die Aktivierungsliganden umfasst.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die biologisch aktiven Mittel aus der aus Proteinen, Enzymen, Antikörpern und Arzneimitteln bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindungen sind.
  31. Verfahren nach Anspruch 1 zur Mikroverkapselung von aktiven Materialien in den magnetischen Nanopartikeln, gekennzeichnet, dass ein aktives Material in die wässrige Lösung gemäß Stufe a) eingeführt wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das aktive Material ein Arzneimittel oder ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
  33. Nanopartikel einer Größe von weniger als 0,3 &mgr;m, das aus einem mit einem magnetischen Metalloxid überzogenen Polymer, das ein Metallchelatbildner ist, besteht.
  34. Nanopartikel nach Anspruch 33, wobei dessen Größe geringer als 0,1 &mgr;m ist.
  35. Nanopartikel nach Anspruch 34, wobei dessen Größe geringer als 92 nm ist.
  36. Hohles Nanopartikel, das aus einer Hülle aus einem magnetischen Metalloxid besteht, wobei die Größe des Nanopartikels geringer als 0,3 &mgr;m ist.
  37. Hohles Nanopartikel nach Anspruch 36, wobei dessen Größe geringer als 0,1 &mgr;m ist.
  38. Magnetisches Nanopartikel nach einem der Ansprüche 34 bis 37, das ferner auf dem magnetischen Überzug einen Überzug aus einem funktionellen Polymer umfasst.
  39. Magnetisches Nanopartikel nach Anspruch 38, wobei der funktionelle Polymerüberzug Polymere umfasst, die aus der aus Polysacchariden, Proteinen, Peptiden, Polyaminen und &ohgr;-Silanverbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  40. Magnetisches Nanopartikel nach Anspruch 39, an das Aktivierungsliganden gebunden sind.
  41. Magnetisches Nanopartikel nach Anspruch 40, wobei die Aktivierungsliganden durch aus der aus Acryloylchlorid, Divinylsulfon, Dicarbonylimidazol, Ethylenglykolbis(sulfosuccinimidylsuccinat) und m-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysulfosuccinimidester bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindungen bereitgestellt werden.
  42. Magnetisches Nanopartikel nach Anspruch 41, das an biologisch aktive Mittel gekoppelt ist.
  43. Magnetisches Nanopartikel nach Anspruch 42, wobei das biologisch aktive Mittel eine aus der aus Proteinen, Enzymen, Antikörpern und Arzneimitteln bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindung ist.
  44. Mikrokapsel, die ein magnetisches Nanopartikel nach Anspruch 33, 34 oder 35 umfasst, wobei ein aktives Material in dem Überzug aus einem magnetischen Metalloxid eingeschlossen ist.
  45. Verwendung der magnetischen Nanopartikel nach einem der Ansprüche 33 bis 43 zur Herstellung einer diagnostischen oder medizinischen Zusammensetzung für biologische oder medizinische Anwendungen.
  46. Verwendung eines magnetischen Nanopartikels nach Anspruch 45, wobei die biologischen und medizinischen Anwendungen ausgewählt sind aus der aus Zellmarkierung, Zelltrennung, gesteuerte Freisetzung, Diagnostika, Enzymimmobilisierung, Proteinreinigung, Arzneimittelabgabe, Kontrastmittel für MRI und Ultraschallbildgebungsanwendungen und Chelatbildung von Schwermetallionen bestehenden Gruppe.
Es folgen 9 Blatt Zeichnungen






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