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Dokumentenidentifikation DE69628878T2 27.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000738890
Titel Methode zur Bestimmung von Cholinesterase und Methode zur Unterscheidung zwischen Leberzirrhose und Hepatitis
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Kondo, Masahide, Zama-shi, Kanagawa 228, JP;
Yasukawa, Kiyoshi, Sagamihara-shi, Kanagawa, JP;
Hada, Toshikazu, Ikoma-shi, Nara 630-01, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69628878
Vertragsstaaten BE, DE, FR, GB, IT, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 17.04.1996
EP-Aktenzeichen 961060290
EP-Offenlegungsdatum 23.10.1996
EP date of grant 02.07.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.05.2004
IPC-Hauptklasse G01N 33/573
IPC-Nebenklasse G01N 33/577   G01N 33/541   G01N 33/566   G01N 33/576   G01N 33/563   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Gesamt-Cholinesterase, beispielsweise in Serum, ein Verfahren zur Messung der Lectin-reaktiven Cholinesterase von Aleuria aurantia, beispielsweise in Serum, und ein in vitro-Diagnoseverfahren zur Unterscheidung von Leberzirrhose, Leberkrebs und Hepatitis, das diese Verfahren verwendet.

Im Körper existieren zwei Arten Cholinesterase, die sich hinsichtlich ihrer enzymologischen Eigenschaften, ihrer physiologischen Funktion und ihrer Verteilung im Körper unterscheiden. Die erste Art ist Acetylcholinesterase (E.C.3.1.1.7), die spezifisch Acetylcholin spaltet, und in großen Mengen in Erythrocyten, Nervengewebe, Muskeln usw. vorkommt, und im Verhältnis zu diesen physiologischen Funktionen verteilt ist. Die andere Art ist Cholinesterase (auch als Pseudocholinesterase oder Butylcholinesterase bezeichnet) (E.C.3.1.1.8.), die auf Choline wie Benzoylcholin und Butylcholin wirkt, in großer Menge im Serum und in der Leber vorkommt, von der Leber hergestellt wird, und deren physiologische Wirkung höchstwahrscheinlich mit dem neuromuskulären System zusammenhängt.

Derzeit handelt es sich bei der Cholinesterase, die im Rahmen von klinischen Laboruntersuchungen häufig gemessen wird, um Cholinesterase im Serum (Pseudocholinesterase oder Butylcholinesterase). Dieses Enzym ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 340.000, das aus vier identischen Untereinheiten zusammengesetzt ist. Jede Untereinheit ist ihrerseits aus 574 Aminosäuren zusammengesetzt und hat neun Asparagin-gekoppelte Kohlenwasserstoffketten. Von klinischer Bedeutung ist eine Abnahme ihrer Aktivität, wie sie durch Messung dieses Enzyms bestimmt wird, bei der Bestimmung des Grades der funktionellen Schädigung von Leberparenchym bei Leberkrankheiten, besonders bei chronischen Leberparenchymkrankheiten wie Leberzirrhose und chronischer Hepatitis. Da die Serum-Cholinesterase in den Leberparenchymzellen hergestellt wird, weist ihre Abnahme auf ein chronisches Nachlassen der Funktion von Leberzellen hin. Weiterhin beobachtet man ein akutes Nachlassen der Cholinesterase-Aktivität bei Vergiftung mit organischen landwirtschaftlichen Chemikalien auf Phosphorbasis, und die Messung der Aktivität dieses Enzyms ist in diesen Fällen unerläßlich. Schließlich beobachtet man Aktivitätszunahmen dieses Enzyms in erster Linie bei nephrotischen Syndromen.

Früher geschah die Messung der Cholinesterase mit verschiedenen Verfahren, darunter einem Thiocholin-Verfahren, bei dem das von Cholinesterase freigesetzte Thiocholin gemessen wird, indem es mit einem SH-Gruppen-Testreagens unter Verwendung der synthetischen Substrate Acetylthiocholin, Propionylthiocholin und Butylthiocholin verfärbt wird; einem UV-Verfahren, bei dem eine direkte Abnahme des Substrats in Form einer Abnahme der UV-Absorption mit Benzoylcholin als Substrat gemessen wird; ein pH-colorimetrisches Verfahren, bei dem eine von Cholinesterase hergestellte organische Säure mit einem pH-Indikator gemessen wird; und ein Enzymverfahren (Cholinoxidaseverfahren), bei dem das Wasserstoffperoxid, das bei der spezifischen Aufspaltung von Cholin durch Cholinesterase erzeugt wird, mit einem Färbungssystem gemessen wird, das Benzoylcholin als Substrat und Cholinoxidase und Peroxidase als kooperierende Enzyme benützt.

Darüber hinaus wurden seit der Entwicklung der Technik zur Herstellung monoclonaler Antikörper durch G. Köhler und C. Milstein im Jahr 1975 (Nature, Bd. 256, S. 495, 1975), zahlreiche monoclonale Antikörper für verschiedene Antigene hergestellt. Die Anwendung monoclonaler Antikörper hat auf den Gebieten der In-vitro-Diagnostika, In-vivo-Diagnostika, therapeutischen Arzneimittel und Affinitätsreinigungsreagentien Fortschritte gemacht. Einige davon haben bereits die Stufe der praktischen Anwendung erreicht, während an anderen aktiv geforscht und entwickelt wird, damit sie die Stufe der praktischen Anwendung erreichen.

Es wurden auch monoclonale Antikörper gegen Cholinesterase hergestellt. Beispiele von Verfahren, von denen schon berichtet wurde, sind unter anderen eines, bei dem Cholinesterase durch ein Enzym-Immuntestverfahren unter Verwendung von immobilisierten polyclonalen Antikörpern gegen Cholinesterase und monoclonalen Antikörpern gegen Cholinesterase gemessen wird (A. Broth et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Bd. 28, S. 222, 1990); und ein Verfahren, bei dem Cholinesterase durch ein Enzym-Immuntestverfahren mit immobilisierten monoclonalen Antikörpern gegen Cholinesterase und polyclonalen Antikörpern gegen Cholinesterase gemessen wird (M. Whittaker et al., Hum. Hered., Bd. 40, S. 153, 1990).

Aleuria aurantia-Lectin ist ein kohlenhyratkettenfreies Protein, das aus Aleuria aurantia hergestellt wird. Es enthält große Mengen Serin und Glycin, hat ein Molekulargewicht von 72.000 und hat Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 31.000. Es hat eine Kohlenhydratbindungsstelle pro Untereinheit. Es weist eine Affinität zu L-Fucose als Monosaccharid auf und bindet an die L-Fucose &agr;1 → 2- und L-Fucose &agr;1 → 3-Reste, und es bindet stark an die Kohlenhydratkette mit dem L-Fucose &agr;1 → 6-Rest.

Neuerdings wurde bei der chromatographischen Behandlung eines Serums eine Affinitätssäule verwendet, an der Aleuria aurantia immobilisiert war (T. Ohkura und T. Hada et al.). Die Verwendung dieser Säule zur Messung der Enzymaktivität der an der Säule verbliebenen Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase und zur Bestimmung des Verhältnisses dieser Cholinesterase zur Gesamtenzymaktivität der ursprünglich im Serum vorhandenen Cholinesterase ergab bei Patienten mit Leberzellenkrebs und Leberzirrhose ein signifikant höheres Verhältnis als bei Patienten mit chronischer Hepatitis und normalen Kontrollen (Cancer Research, Bd. 54, S. 55, 1994). Darüber hinaus gibt es zur Zeit kein anderes Verfahren zum Diagnostizieren von Leberzirrhose und chronischer Hepatitis als die Durchführung histologischer Untersuchungen von Lebergewebeproben, die durch Biopsie oder Operationen gewonnen wurden, was mit beträchtlicher Belastung der Patienten verbunden ist.

Die Verfahren zur Messung der Cholinesterase nach dem bisherigen Stand der Technik, darunter das Thiocholinverfahren, das UV-Verfahren, das pH-Wert-colorimetrische Verfahren und das Enzymverfahren (Cholinoxidaseverfahren) messen alle die Enzymaktivität der Cholinesterase, nicht aber die Menge der Cholinesterase als Protein.

Darüber hinaus besteht bei Verfahren, die die Enzymaktivität messen, je nach dem gewählten Substrat die Möglichkeit, daß die Aktivität von Substanzen (Enzymen) mitgemessen wird, die keine Cholinesterasen sind, jedoch Esteraseaktivität aufweisen. Da das, was als Ergebnis einer Schädigung der Leberparenchymzellen erscheint, in Wirklichkeit die Synthese von Cholinesterase selbst ist, ist es nötig, die Menge der Cholinesterase als Protein zu messen. Darüber hinaus erlaubt eine Messung der Cholinesterasemenge als Protein zusammen mit der Enzymaktivität selbst im Fall eines Nachlassens der Cholinesteraseaktivität, etwa durch Vergiftung mit organischen landwirtschaftlichen Chemikalien auf Phosphorbasis, eine genauere Beurteilung.

Darüber hinaus ist es, da polyclonale Antikörper entweder als immobilisierter Antikörper oder als enzymmarkierter Antikörper verwendet werden, bei den genannten Enzym-Immuntestverfahren schwierig, einen gleichförmigen Antikörper semipermanent zur Verfügung zu stellen.

Deshalb haben die Autoren der vorliegenden Erfindung als ersten Gegenstand dieser Erfindung versucht, die Menge der Cholinesterase als Protein zu messen, ohne daß diese durch andere Substanzen (Enzyme) mit Esteraseaktivität beeinflußt würde, als Cholinesterase selbst, und ohne daß sie durch Cholinesteraseinhibitoren beeinflußt würden, indem sie ein Immuntestverfahren mit monoclonalen Antikörpern verwendeten, die in gleichförmiger Qualität semipermanent zur Verfügung gestellt werden können, und auf polyclonale Antikörper verzichteten.

Weiterhin wäre, da eine Diagnose von Leberzirrhose und chronischer Hepatitis durch histologische Untersuchungen von Lebergewebeproben, die durch Biopsie oder Operationen gewonnen wurden, wie sie bisher durchgeführt wird, eine beträchtliche Belastung der Patienten verursacht, ein Serodiagnoseverfahren von großer Bedeutung. Jedoch ergibt sich im Fall des in der Literatur beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung des Verhältnisses der Lectinreaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase zur Gesamtenzymaktivität der ursprünglich im Serum vorhandenen Cholinesterase durch säulenchromatographische Behandlung des Serums mit einer Affinitätssäule, an der Aleuria aurantia-Lectin immobilisiert ist, und Messung der Enzymaktivität der an der Säule immobilisierten Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase, wie in der Literatur beschrieben, die Notwendigkeit, eine komplexe Prozedur aus Adsorption, Elution, Volumen- und Aktivitätsmessung durchzuführen, was die Messung einer großen Probenzahl in kurzer Zeit unmöglich macht.

Deshalb haben die Autoren der vorliegenden Erfindung als zweiten Gegenstand dieser Erfindung versucht, ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung einer großen Zahl von Proben von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase mittels einer einfachen Prozedur und ohne Verwendung von Säulenchromatographie zu entwickeln.

Die vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren zur Messung der Cholinesterase, das folgende Schritte umfaßt:

  • – Reagierenlassen eines ersten, immobilisierten monoclonalen Antikörpers, der Cholinesterase erkennt, eines zweiten, markierten monoclonalen Antikörpers, der ein Epitop von Cholinesterase erkennt, das von dem vom ersten Antikörper erkannten Epitop verschieden ist, und einer Probe, und
  • – Feststellung der Markierung des zweiten Antikörpers, der an der Reaktion teilgenommen hat oder dessen, der nicht daran teilgenommen hat.

Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung der Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase, das folgenden Schritt umfaßt:

  • – Reagierenlassen eines immobilisierten monoclonalen Antikörpers, der Cholinesterase erkennt, eines markierten Aleuria aurantia-Lectins und einer Probe, und Feststellung der Markierung des Aleuria aurantia-Lectins, das an der Reaktion teilgenommen hat oder dessen, das nicht daran teilgenommen hat.

Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Leberzirrhose, Leberkrebs und Hepatitis, das folgenden Schritt umfaßt:

  • – Messen der Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase nach dem vorstehenden Verfahren.

Die vorliegenden Erfindung liefert weiterhin einen Kit zur Messung von Cholinesterase, der einen ersten monoclonalen Antikörper, der an ein Epitop von Cholinesterase bindet, und einen zweiten Antikörper umfaßt, der an ein Epitop von Cholinesterase bindet, das von dem vom ersten Antikörper erkanten verschieden ist.

Die vorliegenden Erfindung liefert auch einen Kit zur Messung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase, der einen ersten monoclonalen Antikörper und Aleuria aurantia-Lectin umfaßt.

1 ist ein Schaubild der Werte von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase für verschiedene Krankheiten, wie in Schritt (1) von Beispiel 3 gemessen.

2 ist ein Schaubild der Werte von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase für verschiedene Krankheiten, wie in Schritt (2) von Beispiel 3 gemessen.

Im folgenden wird eine detaillierte Erklärung der vorliegenden Erfindung geliefert.

Zuerst wird eine Erklärung der ersten Erfindung geliefert. Die Erfinder haben mehrere Cholinesterase-spezifische monoclonale Antikörper hergestellt und mit diesen immunologische Meßverfahren geprüft.

Es zeigte sich, daß der monoclonale Antikörper dieser Erfindung äußerst nützlich als Reagens für die Cholinesterasemessung ist.

Der monclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann erzeugt werden durch (1) Schaffung eines Hybridoms, das monoclonale Antikörper erzeugt, die Cholinesterase erkennen, und zwar durch Fusionieren von Myelomzellen mit mäuseantikörper-produzierenden Lymphocyten, die mit aus menschlichem Serum hergestellter Cholinesterase immunisiert wurden, (2) Kultivierung dieses Hybridoms oder einer davon abstammenden Zellinie, und (3) Gewinnung des monoclonalen Antikörpers aus dieser Kultur. Hybridome, die einen monoclonalen Antikörper erzeugen, der Cholinesterase erkennt, können durch Zellfusionsverfahren erzeugt werden, die als solche bekannt sind.

In der vorliegenden Erfindung werden mehrere monoclonale Antikörper, die verschiedene Epitope der Cholinesterase erkennen, mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten. Da die Cholinesterase ein aus vier identischen Untereinheiten zusammengesetztes Tetramer ist, wäre es zwar möglich, sie mit einem Festphasen-Immuntest nach dem Sandwichverfahren unter Verwendung eines einzigen monoclonalen Antikörpers zu messen, da jedoch die Möglichkeit der Kompetition zwischen einem ersten Antikörper und einem zweiten Antikörper besteht, wird in der vorliegenden Erfindung die Messung mit einem Festphasen-Immuntest nach dem Sandwichverfahren unter Verwendung von zwei monoclonalen Antikörpern, die verschiedene Epitope erkennen, ausgeführt.

In der vorliegenden Erfindung wird ein monoclonaler Antikörper, der Cholinesterase erkennt, zur Verwendung als erster Antikörper immobilisiert. Diese Immobilisierung kann mit bekannten Verfahren erfolgen.

Beispiele von Substanzen, die bevorzugt zur Immobilisierung des Antikörpers verwendet werden, sind unter anderen Kügelchen und Mikroplättchen, zum Beispiel aus Glas, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Latex, Agarose, Cellulose und Polymethacrylat.

Darüber hinaus gibt es keinerlei Beschränkungen hinsichtlich des Markierungsverfahrens und -mittels zur Markierung des zweiten Antikörpers, ebenso wie hinsichtlich der Feststellungsverfahren und -mittel; diese können mit den bekannten Verfahren und Mitteln durchgeführt werden. In Verfahren, bei denen ein Enzym wie Alkaliphosphatase, Peroxidase oder &bgr;-D-Galactosidase zur Markierung verwendet werden, wird normalerweise eine radioaktive Substanz, 125I, 3H usw. als Markierungsagens verwendet, wogegen in Verfahren, bei denen ein Fluoreszenzmittel verwendet wird, normalerweise Fluorescein, Isocyanat usw. als Markierungsagens dienen. Es können jedoch auch andere Substanzen verwendet werden.

Im Fall, daß das Markierungsagens ein Enzym ist, wird ein Substrat zur Messung seiner Aktivität verwendet. Beispiele für Substrate von Alkaliphosphatase sind unter anderem p-Nitrophenylphosphat und 4-Methylumbelliferylphosphat, Beispiele für Substrate von Meerrettichperoxidase sind unter anderen 2,2'-Azinodi-[3-Ethylbenzothiazolinsulfonat]-2-Ammoniumsalz- (abgekürzt ABTS) -H2O2, 5-Aminosalicylat-H2O2 und o-Phenyldiamin-H2O2, und ein Beispiel für Substrate von &bgr;-D-Galactosidase ist o-Nitrophenol-&bgr;-D-Galactopyranosid. Bekannte Reagentien, wie Verdünner, Spülungen, Reaktionsstopper und so weiter werden zusätzlich zu diesen Substraten zu Meßzwecken verwendet.

In der vorliegenden Erfindung gibt es keine besonderen Beschränkungen hinsichtlich der Reihenfolge der Reaktion des ersten monoclonalen Antikörpers, des zweiten monoclonalen Antikörpers und der Probe. Die Reaktion kann gleichzeitig oder hintereinander in willkürlicher Reihenfolge erfolgen.

Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Cholinesterase in einer Probe bevorzugt in einem Bereich von 6,25 bis 600 ng/ml gemessen.

Im folgenden wird eine Erklärung der zweiten Erfindung gegeben. Bei dieser zweiten Erfindung kann, obwohl ein monoclonaler Antikörper, der Cholinesterase erkennt, immobilisiert ist, ein monoclonaler Antikörper, der mit dem monoclonalen Antikörper der vorstehend erwähnten ersten Erfindung identisch oder ihm ähnlich ist, verwendet werden. Falls man einen monoclonalen Antikörper aus einem Hybridom oder aus einer Kultur tierischer Zellen, die von diesem Hybridom herrühren, erhält, ist es, da der monoclonale Antikörper eine Lectinreaktiven Aleuria aurantia-Kohlenhydratkette an der Fc-Region des Antikörpers aufweist, im allgemeinen nötig, diese Region zu eliminieren. Die Fc-Region kann beispielsweise durch eingeschränkte Hydrolyse mit einer Protease wie Pepsin oder Papain entfernt werden. Dadurch kann ein F(ab')2-Fragment erhalten werden. Alternativ kann in einem Medium ein kohlenhydratkettenfreier monoclonaler Antikörper erhalten werden, indem Hybridomzellen oder tierische Zellen, die von diesem Hybridom herrühren, gezüchtet werden, und denen ein Kohlenhydratketten-Syntheseinhibitor hinzugefügt wird. Alternativ kann ein monoclonaler Antikörper mit kohlenhydratkettenzersetzendem Enzym behandelt werden. Die Immobilisierung des monoclonalen Antikörpers, dessen Kohlenhydratkette entfernt wurde, sollte in der gleichen Weise geschehen, wie die Immobilisierung des ersten monoclonalen Antikörpers der vorstehend erwähnten ersten Erfindung.

Darüber hinaus gibt es keinerlei Beschränkungen hinsichtlich des Markierungsverfahrens und -mittels zur Markierung des Aleuria aurantia-Lectins, oder hinsichtlich der Feststellungsverfahren und -mittel. Obwohl diese mit den bekannten Verfahren und Mitteln in der gleichen Weise wie die Markierung des zweiten monoclonalen Antikörpers der vorstehend erwähnten ersten Erfindung durchgeführt werden können, ist es, wenn das Markierungsagens ein Enzym ist und wenn das Enzym selbst eine Kohlenhydraktkette hat, die an Aleuria aurantia-Lectin bindet, nötig, die Affinität des Enzyms zum Aleuria aurantia-Lectin durch Entfernung der Kohlenhydratkette zu eliminieren.

Es bestehen in der vorliegenden Erfindung keine besondere Beschränkungen hinsichtlich der Aufeinanderfolge der Reaktionen des monoclonalen Antikörpers, des Aleuria aurantia-Lectins und der Probe. Die Reaktion kann gleichzeitig oder in beliebiger, willkürlicher Reihenfolge erfolgen. Jedoch ist es vorzuziehen, den monoclonalen Antikörper und die Probe zuerst und das Aleuria aurantia-Lectin anschließend, nach Entfernung des Probenmaterials, das nicht reagiert hat, reagieren zu lassen, da so die Wirkung von anderen Stoffen als Cholinesterase, die Aleuria aurantia-Lectin binden, aus der Probe ausgeschlossen werden kann.

Im Meßverfahren nach der vorliegenden Erfindung wird die Lectin-reaktive Aleuria aurantia-Cholinesterase gemessen, indem die L-Fucose &agr;1 → 2-, &agr;1 → 3- und &agr;1 → 6-Reste in der Kohlenhydratkette der Cholinesterase anstelle der Menge der Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase als Protein gemessen werden.

Für die Reaktion im Verfahren zur Feststellung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine unverdünnte Probe oder eine Probe in geeigneter Verdünnung verwendet. Weiterhin ist es vorzuziehen, die Messung nach Verdünnung der Probe vorzunehmen, so daß die Gesamtcholinesterasekonzentration in der Probe einen spezifischen Wert erreicht, da die erhaltenen Werte die Menge der L-Fucose &agr;1 → 2-, &agr;1 → 2- und &agr;1 → 6-Reste in der Kohlenhydratkette der Cholinesterase im Verhältnis zur Gesamtcholinesterase widerspiegeln, wenn mehrere Proben verglichen werden.

Im Verfahren der vorliegenden Erfindung sollte, da die Messung der absoluten Menge Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase schwierig ist, diese Menge als relativer Wert ausgedrückt werden, wobei als Referenz Standardproben mit bekanntem Gehalt Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase benützt werden.

Im folgenden wird nun eine dritte Erfindung erklärt. Die dritte Erfindung erlaubt die Unterscheidung von Leberzirrhose und chronischer Hepatitis auf der Grundlage der Ergebnisse der zweiten Erfindung der vorliegenden Anmeldung. Wie bei der zweiten Erfindung beschrieben, ist, obwohl die Probe zur Messung entweder unverdünnt oder in geeigneter Verdünnung verwendet werden kann, eine Verdünnung im Bereich von 1/20 vorzuziehen, falls die Probe ein Serum ist. Die Messung erfolgt dann gemäß dem in der zweiten Erfindung angegebenen Verfahren.

Im Vergleich mit dem Wert der Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase im Serum normaler Kontrollen, ist der Wert bei Hepatitispatienten ungefähr gleich, während er bei Leberzirrhosepatienten signifikant höher liegt und somit eine Unterscheidung zwischen Hepatitis und Leberzirrhose ermöglicht. Darüber hinaus wurden hohe Werte auch bei Patienten mit Leberkrebs beobachtet.

Weiterhin ist es möglich, zwischen Hepatitis und Leberzirrhose zu unterscheiden, indem die Messung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase im Serum eines Individuums, die mit dem Verfahren aus der zweiten Erfindung erhalten wurde, mit der Gesamtcholinesterasekonzentration im Serum des gleichen Individuums verglichen wird. In diesem Fall wird die Gesamtcholinesterasekonzentration separat nach dem Verfahren der ersten Erfindung der vorliegenden Anmeldung oder nach einem anderen bekannten Verfahren gemessen und dann rechnerisch bestimmt. Alternativ kann nach der Im-Voraus-Messung der Gesamtcholinesterasekonzentration der Probe und anschließender Verdünnung der Probe, so daß die Gesamtcholinesterasekonzentration darin einen bestimmten Wert, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 &mgr;g/ml, erreicht, die Messung gemäß der zweiten Erfindung der vorliegenden Anmeldung ausgeführt werden. Bei diesem Verfahren können chronische Hepatitis und Leberzirrhose anhand der Menge der L-Fucose &agr;1 → 2-, &agr;1 → 3- und &agr;1 → 6-Reste in der Kohlenhydratkette der Cholinesterase im Verhältnis zur Gesamtcholinesterase gemessen werden.

Die vorliegende erste Erfindung ist ein spezifisches Meßverfahren für Cholinesterase und wird in keiner Weise von der Anwesenheit von Enzymreaktionsinhibitoren usw. der Cholinesterase beeinflußt. Weiterhin hat die Reaktion, da der in der vorliegenden Erfindung verwendete monoclonale Antikörper in großer Menge und in gleichbleibender Qualität hergestellt werden kann, einen hohen Grad von Gleichförmigkeit. Der Antikörper kann auch industriell hergestellt werden.

Auch ist das Verfahren zur Feststellung von Lectin-reaktiven Aleuria aurantia-Cholinesterase nach der vorliegenden Erfindung ein einfaches Verfahren, das einem sogenannten Festphasen-Immuntest ähnelt und keine komplizierte Prozedur, wie eine Affinitätschromatographie erfordert. Dieses Verfahren ist wirkungsvoll zur Messung einer großen Probenzahl.

Darüber hinaus ist das Unterscheidungsverfahren zwischen Hepatitis und Leberzirrhose der vorliegenden Erfindung sehr bedeutsam, da es eine Serodiagnose liefert ohne den Patienten übermäßig zu belasten, da es nicht auf dem in der Vergangenheit üblichen Weg der histopathologischen Untersuchung von Lebergewebeproben, die durch Biopsie oder Operation erhalten wurden, ausgeführt wird.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Kit zur Ausführung der vorstehend erwähnten Verfahren. Der Kit umfaßt die in den Patentansprüchen umrissenen Ausführungsformen.

Im einzelnen umfaßt der Kit einen ersten monoclonalen Antikörper, der an ein Epitop der Cholinesterase bindet, und einen einen zweiten monoclonalen Antikörper, der an ein Epitop der Cholinesterase bindet, das von dem vom ersten monoclonalen Antikörper erkannten Epitop verschieden ist. Dabei kann der erste Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert sein. Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung einen Kit zur Messung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase, der einen ersten monoclonalen Antikörper, der an Cholinesterase und an Aleuria aurantia-Lectin bindet, umfaßt, wobei dieser monoclonale Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert sein kann. Der monoclonale Antikörper kann ein monoclonales Antikörperderivat sein, bei dem die Fc-Domäne deletiert ist, oder das F(ab')2-Fragment.

Beispiele

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht nur auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1: Herstellung monoclonaler Anti-Cholinesterase-Mäuseantikörper

Es wurden monoclonale Antikörper gegen Cholinesterase gemäß dem Verfahren von G. Köhler und C. Milstein hergestellt. Eine Emulsion aus einem Gemisch gleicher Volumina PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) mit 500 &mgr;g/ml aus menschlichem Serum abgeleiteter Cholinesterase und Vollständigem Freund'schem Adjuvans wurde BALB/c-Mäusen zweimal in jeweils 200 &mgr;l-Aliquoten im Abstand von 4 Wochen intraperitoneal verabreicht. Nachdem der Anstieg des Antikörperliters im Blut durch einen Festphasen-Immuntest mit Feststellung mittels Meerrettichperoxidase-markiertem anti-Maus-Immununglobulin-Antikörper von Kaninchen bestätigt worden war, wozu eine Schale mit 96 Vertiefungen verwendet wurde, auf der Cholinesterase in 100 &mgr;l PBS mit 200 &mgr;g/ml darin aufgelöster Cholinesterase immobilisiert war, wurde die Cholinesterase der Maus intraperitoneal injiziert.

Drei Tage später wurde die Milz der Maus entnommen und die Zellfusion mit 8-azaguaninresistenten Myelomzellen SP2/O-Ag-14 unter Verwendung von Polyethylenglykol vorgenommen. Die Zellen wurden in Schalen mit 96 Vertiefungen gezüchtet, und es wurde die bekannte HAT-Selektion ausgeführt. Das Absuchen der Hybridome geschah mittels Festphasen-Enzym-Immuntest in Schalen mit 96 Vertiefungen, und die Hybridome, die Antikörper gegen Cholinesterase erzeugten, wurden mit einem limitierenden Verdünnungsverfahren cloniert.

Auf die vorstehend beschriebene Weise erhielt man mehrere Hybridome, die Cholinesterase erkennen. Nach Kultivierung im Kolben wurden die so erhaltenen Hybridome intraperitoneal in BALB/c-Mäuse transplantiert, um Ascites-haltige monoclonale Antikörper zu erhalten. Der Antikörper wurde dann mittels Ammoniumsulfatfällung und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit TSKgeI Phenyl-SPW (TOSOH CORPORATION) gereinigt, und erhielt so einen gereinigten monoclonalen Antikörper gegen Cholinesterase.

Weiterhin wurde nach einer eingeschränkten Hydrolyse mittels Pepsin der monoclonale Antikörper (B-3), der im folgenden Beispiel zur Immobilisierung verwendet wurde, mittels Ammoniumsulfatfällung und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit TSKgeI Phenyl-SPW (TOSOH CORPORATION) gereinigt und als das F(ab')2-Fragment verwendet.

Beispiel 2: Messung der Gesamtcholinesterase durch Enzym-Immuntest (1) Herstellung des immobilisierten Antikörpers

100 &mgr;l des F(ab')2-Fragments des in Beispiel 1 hergestellten monoclonalen Antikörpers, der Cholinesterase erkennt (B-3), auf 5 &mgr;g/ml in PBS verdünnt, wurde in jede Vertiefung einer unbehandelten Schale mit 96 Vertiefungen (Maxisorp, NUNC) gegeben und 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Lösung aus jeder Vertiefung entfernt, jede Vertiefung zweimal mit PBS gespült und 300 &mgr;l PBS mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) hinzugefügt, um die Blockierung 16 Stunden lang bei 4°C durchzuführen (eine Behandlung, bei der BSA an nichtspezifischen Bindungsstellen mit dem Antigen oder dem Antikörper am Träger adsorbiert wird). Die Schale wurde dann bei 4°C gelagert.

(2) Herstellung enzymmarkierter Antikörper

0,1 ml einer 1%-igen Ethanollösung von 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzol wurden zu 1 ml Meerrettichperoxidase- (HRPO-)lösung, gelöst in 0,3 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8.1; 0,5 mg/ml) hinzugefügt und eine Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Dann wurde 1,0 ml 0,06 M Natriumperjodat hinzugefügt und 30 Minuten reagieren gelassen. Nach Entfernen des nicht verbrauchten Natriumperjodats durch Hinzufügen von 1,0 ml 0,16 M Ethylenglykol, wurde die Lösung gegen 0,01 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 9.5) dialysiert.

Dann wurden 5 mg monoclonaler Antikörper (A-2) hinzugefügt, der ein Epitop des Antigens erkennt, das von dem von B-3 erkannten verschieden ist, und die Reaktion wurde 5 Stunden lang laufen gelassen. Es wurden 5 mg Natriumborhydrid hinzugefügt und die Lösung 16 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen.

Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, wobei TSKgeI G3000SW (TOSOH CORPORATION) verwendet wurde, wodurch man HRPO-markierten monoclonalen Antikörper erhielt.

(3) Messung der Gesamtcholinesterase durch Enzym-Immuntest

Nachdem die Mikrotiterschale mit dem darauf in Schritt (1) immobilisierten Antikörper wieder zurück auf Zimmertemperatur gebracht und zweimal mit PBS gewaschen wurde, wurden 100 &mgr;l-Aliquote von PBS mit 1% BSA mit 6,25 bis 600 ng/ml gereinigter Cholinesterase als Standard in jede Vertiefung gegeben (die Konzentration einer gereinigten Cholinesteraselösung, die eine Absorption von 1 bei 280 nm aufweist, wurde als 1 mg/ml angenommen).

Nach zweistündiger Inkubation bei 25°C und Entfernen der Lösung wurde die Schale 5 mal mit PBS mit 0,05% Tween-20 (PBS-T) gewaschen. Anschließend wurden 100 &mgr;l-Aliquote von PBS-T-Lösung mit 0,1% BSA, in denen der in Schritt (2) hergestellte, HRPO-markierte Antikörper bis zu einer Konzentration von 4,5 &mgr;g/ml verdünnt war, in jede Vertiefung gegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde die Lösung entfernt und die Schale 3 mal mit PBS-T gewaschen. Darüber hinaus wurden 100 &mgr;l-Aliquote Substratlösung aus 0,1 M Citratpuffer (pH 4.1) mit 0,6 mg/ml ABTS und 0,01% H2O2 in jede Vertiefung gegeben. Nach 15minütiger Reaktion bei Zimmertemperatur wurden in jede Vertiefung 100 &mgr;l-Aliquote von 0,2 M Oxalsäure gegeben, um die Reaktion zu stoppen.

Nachdem die Reaktion gestoppt war, wurde die Absorption einer jeden Vertiefung mittels eines automatischen Mikrotiterschalenmeßgerätes bei einer Meßwellenlänge von 415 nm und einer Referenzwellenlänge von 600 nm gemessen. Das in Tabelle 1 gezeigte Resultat erhielt man aus der Konzentration und Absorption des Standards. Tabelle 1 Cholinesterasekonzentration (ng/ml) Absorption bei 415 nm 0 0,077 6,25 0,089 12,5 0,100 25,0 0,131 50,0 0,175 100,0 0,273 200,0 0,480 400,0 1,020 600,0 1,59–2

Zusätzlich wurde der gleiche Vorgang mit einer 1 : 100-Verdünnung von mit PBS mit 1% BSA verdünntem menschlichem Serum im Fall der Probe statt im Fall des Standards ausgeführt. Die Gesamtcholinesterasemenge im Serum wurde durch Umwandeln der Konzentration unter Verwendung der aus dem Standard erhaltenen Eichkurve bestimmt. Das Ergebnis wird in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Probennummer Cholinesterasekonzentration (&mgr;g/ml ) 1 21,4 2 28,0 3 19,0 4 16,7 5 8,9 6 13,1 7 13,7 8 18,5 9 18,7 10 22,9

Beispiel 3: Feststellung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase in Serum (1) Feststellung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase in Proben mit gleicher Cholinesterasekonzentration

Die Gesamtcholinesterasekonzentration in Serum wurde im Voraus mit dem Verfahren von Schritt (3) aus Beispiel 2 gemessen; die Proben wurden durch Verdünnung mit PBS mit 10% BSA hergestellt, so daß jede Serumprobe eine Cholinesterasekonzentration von 0,5 &mgr;g/ml aufwies. Eine in gleicher Weise wie in Schritt (1) aus Beispiel 2 präparierte Mikrotiterplatte wurde auf Zimmertemperatur zurückgebracht und zweimal mit PBS gewaschen; danach wurden 100 &mgr;l Probe mit gleicher Cholinesterasekonzentration hinzugefügt und zwei Stunden lang bei 25°C inkubiert. Nach dem Entfernen der Lösung wurde die Mikrotiterplatte 5 Mal mit PBS mit 0,05% Tween-20 (PBS-T) und 3 Mal mit PBS gewaschen.

Anschließend wurden in jede Vertiefung 100 &mgr;l-Aliquote von PBS mit 4 &mgr;g/ml biotinmarkiertem Aleuria aurantia-Lectin (Honen Co., Ltd.) und 4 &mgr;g/ml streptoavidinmarkierter Alkaliphosphatase (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) gegeben und 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Nach dem Entfernen der Lösung und 4maligem Waschen mit PBS wurden 100 &mgr;l-Aliquote von 10 mM p-Nitrophenylphosphat, 2 mM MgCl2 und 0,3 M 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol in jede Vertiefung gegeben und dann 10 Minuten bei 25°C inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen von 100 &mgr;l 1 N NaOH wurde die Absorption einer jeden Vertiefung mittels eines automatischen Mikrotiterschalenmeßgerätes bei einer Meßwellenlänge von 405 nm und einer Referenzwellenlänge von 492 nm gemessen. Das in 1 gezeigte Resultat erhielt man nach Klassifizierung in Patienten mit Leberzellenkrebs, Patienten mit Leberzirrhose, Patienten mit chronischer Hepatitis und normalen Kontrollen.

(2) Feststellung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase unter Verwendung von mit dem gleichen Verdünnungsfaktor verdünnten Serumproben

Außer der Verwendung von 1 : 10 mit PBS mit 10% BSA verdünntem Serum für die Proben und der Verwendung des F(ab')2-Fragments von monoclonalem Antikörper (B-3), der in allen Vertiefungen der Mikrotiterplatte in einer Konzentration von 3 &mgr;g/ml immobilisiert war, geschah die Feststellung Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase mit dem gleichen Verfahren wie in Schritt (1) von Beispiel 3. Das in 2 gezeigte Resultat erhielt man nach Klassifizierung in Patienten mit Leberzellenkrebs, Patienten mit Cirrhose, Patienten mit chronischer Hepatitis und normalen Kontrollen.

Sowohl beim Resultat der Feststellung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase, wenn für die Proben Serum mit gleicher Cholinesterasekonzentration verwendet wurde (1), als auch beim Resultat der Feststellung von Lectin-reaktiver Aleuria aurantia-Cholinesterase, wenn für die Proben Serum verwendet wurde, das mit dem gleichen Verdünnungsfaktor verdünnt war (1), waren die Werte bei Patienten mit chronischer Hepatitis und bei normalen Kontrollen niedrig und bei Leberzirrhosepatienten hoch. Somit kann jedes der beiden Verfahren zur Unterscheidung von chronischer Hepatitis (Hepatitis) und Leberzirrhose durch Serodiagnose angewandt werden.


Anspruch[de]
  1. Verfahren für die Unterscheidung zwischen Leberzirrhose und chronischer Hepatitis, umfassend den Schritt der Messung von Aleuria aurantia-Lectinreaktiven Kohlenhydratketten der Cholinesterase in einer Blutprobe, die von einer zu testenden Person erhalten wurde, durch Umsetzen eines immobilisierten monoclonalen Antikörpers, der Cholinesterase erkennt, eines markierten Aleuria aurantia-Lectins und einer Probe, und Nachweis des Markers des gebundenen Aleuria aurantia-Lectins.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die quantitative Messung von Aleuria aurantia-Lectin-reaktiven Kohlenhydratketten der Cholinesterase einer zu testenden Person mit der einer gesunden Kontrollperson verglichen wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Messung von Aleuria aurantia-Lectinreaktiven Kohlenhydratketten der Cholinesterase im Serum einer Person mit der Gesamtkonzentration an Cholinesterase im Serum derselben Person verglichen wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der monoclonale Antikörper ein von Kohlenhydratketten freies Antikörperderivat ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das monoclonale von Kohlenhydratketten freie Antikörperderivat ein Antikörper ist, aus dem die Fc-Region deletiert wurde.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das monoclonale von Kohlenhydratketten freie Antikörperderivat das F(ab')2-Fragment ist.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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