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Dokumentenidentifikation DE69433057T2 03.06.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000693938
Titel PEPTIDE ZUR VERWENDUNG BEI DER IMPFUNG UND INDUKTION NEUTRALISIERENDER ANTIKÖRPER GEGEN DAS MENSCHLICHE IMMUNSCHWÄCHE-VIRUS
Anmelder Tripep AB, Huddinge, SE
Erfinder VAHLNE, Anders, S-430 80 Hovas, SE;
SVENNERHOLM, Bo, S-412 68 Göteborg, SE;
RYMO, Lars, S-430 80 Hovas, SE;
JEANSSON, Stig, S-411 27 Göteborg, SE;
HORAL, Peter, S-412 66 Göteborg, SE
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69433057
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 15.04.1994
EP-Aktenzeichen 949127278
WO-Anmeldetag 15.04.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/SE94/00340
WO-Veröffentlichungsnummer 0094023746
WO-Veröffentlichungsdatum 27.10.1994
EP-Offenlegungsdatum 31.01.1996
EP date of grant 20.08.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.06.2004
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse C07K 7/08   C07K 14/15   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche zur Verwendung bei der Impfung gegen AIDS geeignet sind.

Das menschliche Immunschwächevirus (HIV) ist für die Erkrankung verantwortlich, welche als erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) bekannt geworden ist. Obwohl erstmals 1981 erkannt, ist noch kein Heilverfahren für diese unvermeidlich tödliche Krankheit gefunden worden. HIV wird über eine Vielzahl von Wegen verbreitet, wie durch sexuellen Kontakt, infiziertes Blut oder infizierte Blutprodukte und perinatal. Wegen der Komplexität einer HIV-Infektion und der geringen Zahl von wirksamen Therapien wird die Ausrottung von AIDS höchstwahrscheinlich durch die Verhinderung neuer Infektionen als durch die Heilung der bereits infizierten Personen erfolgen. Zu diesem Zweck sind große Anstrengungen unternommen worden, um Verfahren zum Nachweis und zur Verhinderung einer Infektion zu entwickeln. Diagnostische Verfahren sind entwickelt worden, um Personen, Blut und andere biologische Produkte zu identifizieren, welche infiziert sind.

Wie die meisten Viren ruft das HIV häufig die Produktion von neutralisierenden Antikörpern hervor. Im Gegensatz zu vielen anderen Viren und anderen infektiösen Agenzien, bei denen eine Infektion eine schutzgewährende Immunität zur Folge hat, sind HIV-spezifische Antikörper jedoch nicht in der Lage, den Verlauf der Erkrankung aufzuhalten. Daher könnte sich im Fall von HIV ein Impfstoff, der die Immunität einer natürlichen Infektion hervorruft, als unwirksam erweisen. Tatsächlich scheinen Impfstoffe, die aus dem HIV-Protein gp160 hergestellt wurden, eine geringe Immunität gegen eine HIV-Infektion bereitzustellen, obwohl sie neutralisierende Antikörper induzieren. Das Mißlingen des Versuchs, einen wirksamen anti-HIV-Impfstoff herzustellen, hat zu der Vorhersage geführt, daß ein wirksamer Impfstoff nicht bis Ende der 1990er Jahre verfügbar sein wird.

Das HIV-Genom ist hinreichend charakterisiert worden. Dessen etwa 10 kb codieren Sequenzen, die regulatorische Segmente für die HIV-Replikation als auch die gag-, pol- und env-Gene, die Kernproteine, die reverse Transkriptase-Protease-Endonuclease und die internen bzw. externen Hüllglycoproteine codieren.

Das HIV-env-Gen codiert das intrazelluläre Glycoprotein gp160, das normalerweise durch proteolytische Spaltung prozessiert wird, um gp120, das externe virale Glycoprotein, und gp41, das virale Transmembranglycoprotein, zu bilden. Das gp120 bleibt mit den HIV-Virionen auf Grund nichtkovalenter Wechselwirkungen mit gp41 assoziiert. Diese nicht-kovalenten Wechselwirkungen sind schwach, folglich wird der größte Teil des gp120 aus den Zellen und Virionen in löslicher Form freigesetzt.

Frühere Studien haben gezeigt, daß die Proteine, welche durch die gag- und insbesondere die env-Regionen des HIV-1-Genoms codiert werden, immunogen sind, da Antikörper gegen die Produkte der gag- und env-Gene in den Seren von HIV-infizierten, AIDS- und ARC ("AIDS Related Condition")-Patienten nachgewiesen wurden.

Es ist bereits gezeigt worden, daß einige Antikörper, die aus Seren von AIDS- und ARC-Patienten sowie symptomlosen Individuen erhalten wurden, die mit dem Virus infiziert sind, für gp120 und gp160 spezifisch sind. Vereinzelt sind diese Antikörper neutralisierend. Die Hüllglycoproteine stellen das HIV-1-Antigen dar, das am beständigsten durch Antikörper in AIDS- und ARC-Patientenseren erkannt wird. Allan et al., "Major Glycoprotein Antigens that Induce Antibodies in AIDS Patients are Encoded by HTLV-III", Science 228 (1985), 1091–1094; und Barin et al., "Virus Envelope Protein of HTLV-III Represents Major Target Antigen for Antibodies in AIDS Patients", Science 228 (1985), 1094–1096. Außerdem erkennen Antikörper in Patientenseren auch Epitope der Viruskernproteine, die durch das gag-Gen codiert werden.

Immunologisch wichtige HIV-1-Antigene zur Verwendung bei der Diagnose und als potentielle Impfstoffzusammensetzungen sind durch Clonierung von Teilen des HIV-1-Genoms in verschiedene Expressionssysteme wie Bakterien, Hefe oder Vaccinia hergestellt worden. Cabradilla et al., "Serodiagnosis of Antibodies to the Human AIDS Retrovirus With a Bacterially Synthesized env Polypeptide", Biotechnology 4 (1986), 128–133; und Chang et al., "Detection of Antibodies to Human T-Cell Lymphotropic Virus-III (HTLV-III) With an Immunoassay Employing a Recombinant Escherichia coli – Derived Viral Antigenic Peptide", Biotechnology 3 (1985), 905–909. Durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellte HIV-1-Antigene müssen jedoch noch gründlich gereinigt werden, um schädigende Nebenwirkungen bei der Impfung und falsch positive Reaktionen in ELISA-Tests infolge einer Antikörperreaktivität gegen Antigene des Expressionssystems, welche die HIV-1-Antigenzubereitung verunreinigen können, zu vermeiden. Auch kann eine Denaturierung von HIV-1-Antigenen während der Reinigung wichtige Antigenaktivitäten aufheben. Die Präparation von Proteinen aus intakten Viren kann auch eine Verunreinigung durch das intakte Virus zur Folge haben.

Mehrere Veröffentlichungen haben Daten vorgestellt, welche die immunologische Reaktivität ausgewählter synthetischer Peptide zeigen, welche den antigenen Proteinen von HIV-1 entsprechen. In einer Studie wurde ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-Ile-Glu-Glu-Gly-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Gly-Cys synthetisiert, das den Aminosäureresten 735–752 von HIV-1 entspricht. Kennedy et al., "Antiserum to a Synthetic Peptide Recognizes the HTLV-III Envelope Glycoprotein", Science 231 (1986), 1556–1559. Dieses aus einem Teil von gp41 abgeleitete Peptid wurde verwendet, um Kaninchen bei dem Versuch zu immunisieren, eine neutralisierende Antikörperantwort gegen HIV-1 zu induzieren. Ferner waren mehrere Seren von AIDS-Patienten, die bekanntermaßen anti-gp41-Antikörper enthielten, mit diesem Peptid schwach reaktiv; auf diese Weise wurde gezeigt, daß dieses Peptid mindestens ein Epitop enthält, das in einem gewissen Umfang durch Antikörper gegen das native gp160/gp41 erkannt wird. Jedoch ist für dieses Peptid nicht gezeigt worden, daß es neutralisierende Antikörper in von Kaninchen verschiedenen Säugern induziert, noch ist es zur Verwendung als menschlicher Impfstoff vorgeschlagen worden.

In WO 92/05800 sind Peptide, welche Epitopen des HIV-1-gp120-Proteins mit den Aminosäurekoordinaten 151–176, 192–218 und 205–230 entsprechen, zur Verwendung bei der Impfung und Induktion neutralisierender Antikörper gegen HIV beschrieben. Weitere Peptide, welche Regionen des HIV-Proteins gp120 entsprechen, zur Verwendung bei der Induktion einer T-Zell-Aktivierung gegen HIV-1 sind in WO 92/21377 beschrieben. Synthetische Peptide mit Sequenzen, abgeleitet aus diesem HIV-1-gp120-Protein, welche die Produktion neutralisierender Antikörper in unter dem Menschen stehenden Primaten induzieren können, sind beschrieben worden bei Vahlne et al., "Immunizations of Monkeys With Synthetic Peptides Disclose Conserved Areas on gp120 of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Associated With Cross-Neutralizing Antibodies and T-Cell Recognition", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10744–10748 (1981).

In antigenen Proteinen von HIV-1 gibt es antigene Epitope, die durch Antikörper, cytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen und auch bei der Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizität (ADCC) erkannt werden. Traditionell werden neutralisierende Antikörper als wesentlich bei der Verhinderung einer Virusinfektion angesehen. Ein neutralisierender Antikörper bindet an ein infektiöses Viruspartikel, und bei diesem Prozeß wird die Infektiosität des Viruspartikels aufgehoben.

Zelluläre Mechanismen zur Eliminierung virusinfizierter Zellen schließen cytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen und ADCC ein. Die an der Neutralisierung und an den verschiedenen zellulären Immunmechanismen beteiligten Epitope müssen nicht notwendigerweise die gleichen sein.

Es ist bereits festgestellt worden, daß die ADCC ein immunologischer Abwehrmechanismus ist, der bei Virusinfektionen wirksam ist. Bei dieser Reaktion binden antigenspezifische Antikörper an Oberflächenstrukturen auf der Zielzelle und induzieren auf diese Weise deren Abtötung, welche durch Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-uneingeschränkte CD16+-Effektorzellen, die den Fc-Rezeptor tragen, vermittelt wird. Eine HIV-spezifische Cytotoxizität im peripheren Blut der meisten seropositiven Individuen wird auch durch MHC-uneingeschränkte ADCC-Effektorzellen vermittelt, die mit env-spezifischen IgG-Antikörpern bewaffnet sind. Tyler et al., J. Immunol. 142 (1989), 1177; Tanneau et al., J. Infect. Dis. 162 (1990), 837; Riviere et al., J. Virol. 63 (1989), 2270. Eine HIV-spezifische ADCC-Aktivität ist in der Mehrzahl von Seren aus HIV-1-infizierten Individuen nachgewiesen worden. Ljunggren et al., J. Immunol. 139 (1987), 2263; Lyerly et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 3 (1987), 409. Es ist sowohl eine Typ- als auch eine Stamm-spezifische ADCC beobachtet worden, und die Antikörper in einigen Seren vermittelten eine ADCC gegen alle Stämme, während andere Seren überhaupt keine ADCC-Aktivität zeigten. Ljunggren et al., 63 (1989), 3376. Bei einer pädiatrischen HIV-1-Infektion korreliert das Vorhandensein von ADCC-vermittelnden Antikörpern signifikant mit einem besseren klinischen Stadium. Ljunggren et al., 161 (1990), 198. Die ADCC-Reaktion tritt früh nach einer HIV-Infektion auf, und eine weitreichende ADCC-Reaktion gegen HIV-1HTLVIIB-infizierte Zielzellen tritt zwischen 2 und 12 Monaten nach einer Serokonversion auf.

Aktivierte Zellen, die HIV-Antigene auf ihrer Oberfläche exprimieren, sind mögliche Ziele einer ADCC. Für HIV-infizierte, autologe CD4+-T-Zell-Blasten ist vor kurzem gezeigt worden, daß sie als Zielzellen für eine Lyse durch ADCC dienen. Tanneau et al., J. Infect. Dis. 162 (1990), 837. Die Hüllglykoproteine von HIV sind in einer Reihe von Studien als Ziel-Epitope vorgeschlagen worden. Evans et al., AIDS 3 (1989), 273, verwendeten affinitätsgereinigtes menschliches Ig oder polyclonale Kaninchenseren gegen env-Proteine von HIV-1 und wiesen Antikörper nach, die eine ADCC gegen gp120 und gp41 vermittelten. Koup et al., J. Virol. 63 (1989), 584, haben Vacciniavirus-Vektoren verwendet, die Hüllglycoproteine (gp160, gp120 und gp41) oder gag-Proteine (p55, p40, p24 und p17) in lymphoblastoiden Zelllinien exprimieren. Es wurde festgestellt, daß nur der Hüllglycoprotein-Komplex gp 120/gp41 das Zielantigen für eine HIV-spezifische ADCC ist, was auch in einer anderen Studie unter Verwendung eines ähnlichen Systems bestätigt wurde. Tanneau et al., J. Infect. Dis. 162 (1990), 837.

In einer Reihe von Studien sind auch stärker abgegrenzte Regionen nachgewiesen worden. Ein muriner monoclonaler Antikörper, der gegen die V3-Region von gp120 gerichtet ist (As, 309–318), vermittelte sowohl eine Neutralisierung, Titer 1: 500, als auch eine ADCC, Titer 1: 800, gegen HTLVIIIB. Broliden et al., J. Virol. 64 (1990), 936. Auch ein chimärer Maus-Mensch-Antikörper, der gegen die V3-Region gerichtet ist (As, 308–322), induzierte eine ADCC sowie eine Neutralisierung und Fusionsinhibierung. Liou et al., J. Immunol. 143 (1989), 3967. Lyerly et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 3 (1987), 409, haben ein ADCC-Epitop im C-terminalen Teil von gp120 lokalisiert (As, 467–511).

Eine Zusammenfassung bekannter Epitope aus HIV-1 und -2 sowie SIV für Antikörper, ADCC, cytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen ist angegeben bei Nixon et al., "Cellular and Humoral Antigenic Epitopes in HIV and SIV", Immunology 76 (1992), 515– 534.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Peptide offenbart und beschrieben, die Epitopen des HIV-1-gp120-Proteins entsprechen. Jedes Peptid umfaßt eine epitopische Aminosäuresequenz aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt jedes Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen aus SEQ ID Nr.: 41 besteht.

In Übereinstimmung mit einem anderen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt werden die neuen Peptide zur Formulierung einer Impfstoffzusammensetzung verwendet. Die Impfstoffzusammensetzung umfaßt eine epitopische Aminosäuresequenz aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben, in einer wirksamen Menge, um eine Immunantwort in einem Säuger zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Impfstoffzusammensetzung ferner ein Adjuvans wie komplettes Freundsches Adjuvans, inkomplettes Freundsches Adjuvans, Muramyldipeptid, Levamisol, Isoprinosin oder Tuftsin.

In Übereinstimmung mit einem weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt werden mindestens zwei Peptide in der Impfstoffzusammensetzung verwendet, wobei jedes Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein umfaßt, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.: 6, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID Nr.: 12, SEQ ID Nr.: 14, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 36 oder SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörperabhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben. Die Peptide liegen in einer wirksamen Menge vor, um eine Immunantwort in einem Säuger zu induzieren und sind mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt diese Impfstoffzusammensetzung ferner ein Adjuvans wie komplettes Freundsches Adjuvans, inkomplettes Freundsches Adjuvans, Muramyldipeptid, Levamisol, Isoprinosin oder Tuftsin.

Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um ein Verfahren zum Schutz eines Säugers vor einer Infektion mit dem menschlichen Immunschwächevirus durchzuführen, welches die Verabreichung einer der hierin beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen an den Säuger umfaßt. Die Verabreichung kann durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Injektion erfolgen.

Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich, um ein Verfahren zur Induktion neutralisierender anti-HIV-Antikörper in einem Säuger durchzuführen, umfassend den Schritt des Verabreichens einer wirksamen, Antikörper induzierenden Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine epitopische Aminosäuresequenz aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben, in einer wirksamen Menge, um eine Immunantwort in einem Säuger zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Impfstoffzusammensetzung mindestens zwei Peptide, wobei jedes Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz aus dem menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein umfaßt, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.: 6, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID Nr.: 12, SEQ ID Nr.: 14, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 36 oder SEQ ID Nr.: 41 angeordnet ist und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen Antikörper abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben. Die Peptide liegen in einer wirksamen Menge vor, um eine Immunantwort in einem Säuger zu induzieren, und sind mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Peptide bereit, für die gezeigt worden ist, daß sie die Produktion von HIV-neutralisierenden Antikörpern durch Primaten induzieren. Die Peptide entsprechen Regionen des gp120-Proteins mit Koordinaten, wie durch Kennedy et al. definiert. Die erfindungsgemäßen Peptide werden als gp120-12 (Aminosäurekoordinaten 159– 183), gp120-15 (Aminosäurekoordinaten 200–225), gp120-16 (Aminosäurekoordinaten 213– 237) und gp120-19 (Aminosäurekoordinaten 255–276) bezeichnet. Obwohl das Peptid gp120-19 einem Peptid ähnlich ist, das beschrieben worden ist (Ho et al., Science 239 (1988), 1021– 1023), ist nun gezeigt worden, daß gp120-19 neutralisierende Antikörper in Primaten induziert. Die erfindungsgemäßen Peptide können als Immunogene in Impfstoffzusammensetzungen und zur Induktion der Produktion von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern verwendet werden; besonders wichtig sind HIV neutralisierende Antikörper.

Proteine enthalten eine Reihe von antigenen Determinanten oder Epitopen, welche die Regionen der Proteine sind, die die Erkennungs- und Bindungsstellen für spezifische Antikörper umfassen. Im allgemeinen enthalten Proteine zwischen 5 bis 10 Epitope, wobei jedes davon eine Sequenz von 6 bis 8 Aminosäuren enthält. Epitope können entweder zusammenhängend sein, wobei die 6 bis 8 Aminosäuren in einer linearen Abfolge vorliegen, oder unzusammenhängend, wobei die das Epitop bildenden Aminosäuren durch die dreidimensionale Faltung des Proteins zusammengebracht werden. Selbst wenn ein Epitop nur aus relativ wenigen Aminosäuren besteht, kann dessen Reaktivität mit einem Antikörper durch die Aminosäuren in dem Protein beeinflußt werden, welche das Epitop umgeben.

Studien mit dem Ziel, antigene Stellen oder Epitope von Proteinen zu kartieren, sind durch die Verwendung von synthetischen Peptiden, welche verschiedenen Regionen der Proteine von Interesse entsprechen, unterstützt worden. Lerner et al., in The Biology of Immunological Disease: A Hospital Practice Book (Dixon und Fisher, Hrsg.), S. 331–338 (1983); und Lerner, Adv. Immunol. 36 (1984), 1. Zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit in Epitop-Katierungsstudien sind synthetische Peptide als Impfstoffe und diagnostische Reagenzien geeignet, falls sie wichtige antigene Determinanten eines Proteins umfassen. Van Regenmortel, Ann. Inst. Pasteur/Virol. 137E (1986), 497–528; und Van Regenmortel, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Buroden und Van Knippenburg, Hrsg., Bd. 19, Synthetic Peptides as Antigens, Elsevier ISBN 0-444-80974-0 (1988).

Synthetische Peptide weisen im Hinblick auf eine spezifische Antikörperproduktion und Reaktivität mehrere Vorteile auf. Die genaue Sequenz des synthetisierten Peptids kann aus der Aminosäuresequenz des Proteins, wie durch Aminosäuresequenzierung des Proteins bestimmt, oder aus der vorhergesagten Aminosäuresequenz, bestimmt anhand der das Protein codierenden DNA-Sequenz, ausgewählt sein. Die Verwendung von spezifischen synthetischen Peptiden erübrigt die Notwendigkeit für ein Protein vollständiger Länge bei der Impfung und die Erzeugung von Antikörpern oder einen Test dafür. Außerdem ermöglichen die Festphasen-Peptidsynthesetechniken von Merrifield und Mitarbeitern die chemische Herstellung von im Wesentlichen unbegrenzten Mengen des synthetisierten Peptids von Interesse. Erickson und Merrifield, in The Proteins, 3. Auflage, Bd. 2, Academic Press, New York, Kapitel 3 (1976). Die Verfügbarkeit automatischer Peptidsynthesegeräte hat solche Techniken weiter verbessert.

Obwohl eine Vielzahl von Kriterien verwendet werden kann, um antigene Regionen von Proteinen vorherzusagen, können Peptide, die solchen Regionen entsprechen, nicht immer als Impfstoffe nützlich sein. Zum Beispiel kann die Antigenität verloren gehen, da das Peptid nicht in der richtigen räumlichen Orientierung vorliegt, um durch Antikörper erkannt zu werden, die mit dem Protein reagieren. Es ist auch gezeigt worden, daß bestimmte Peptide, die aus Typ-C-Retroviren und HIV abgeleitet wurden, als immunsuppressive Agenzien wirksam sind, so wie HIV selbst. Cianciolo et al., J. Immunol. 124 (1980), 2900–2905; und Cianciolo et al., Science 230 (1985), 453–455. Peptide wie diese, die eine nachteilige Wirkung auf den Patienten haben, wären zur Verwendung als Impfstoffe nicht geeignet.

Außerdem, wie es bei HIV-1 und HIV-2 besonders offensichtlich ist, gibt es eine erhebliche genetische Variabilität innerhalb jeder dieser zwei Virusgruppen, was viele Serotypen oder Isolate der Viren zur Folge hat. Daher mußte zwingend eine Region eines Proteins ausgewählt werden, aus der ein Peptid zur Verwendung bei der Formulierung von Immunogenen abgeleitet werden konnte. Jedoch ist für bestimmte immundominante Teile von HIV-1- und HIV-2-Proteinen gezeigt worden, daß sie relativ invariant sind. Synthetische Peptide können auch der Schlüssel zu viralen Impfstoffen sein, insofern als sie eine Immunantwort gegen Sequenzen gleichen Typs induzieren, die normalerweise in dem nativen Molekül nicht immunogen sind. Die sonst stummen Epitope können eine weitreichende schutzgewährende Spezifität besitzen. Steward et al., Immunol. Today 8 (1987), 51–58. Mehrere experimentelle Impfstoffe sind mit dem Ziel formuliert worden, eine Infektion in solchen Menschen zu verhindern, die wahrscheinlich dem Virus ausgesetzt sind. Berman et al., "Protection of Chimpanzees from Infection by HIV-2 After Vaccination With Recombinant Glycoprotein gp120 But Not gp160", Nature 345 (1990), 622–625. Synthetische Peptide, die Regionen von immunologisch wichtigen HIV-Proteinen entsprechen, haben nun direkt Anwendung in diagnostischen Verfahren zum Nachweis von HIV, als potentielle Impfstoffe gegen HIV und bei der Herstellung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gefunden.

Eine Reihe von Neutralisierungs-Epitopen auf gp120 ist durch mehrere Forscher identifiziert und definiert worden; für einen Überblick vgl. Bolognesi, AIDS 3 (1989) (Suppl. 1), 5111–5118. In diesem Überblick erwähnt Bolognesi vier verschiedene virale Neutralisierungs-Epitope mit den folgenden Aminosäurekoordinaten: 254–274, 303–337, 458–484 und 491–523. Das Peptid mit den Aminosäurekoordinaten 254–274 wurde zur Immunisierung von Kaninchen verwendet, und für das erhaltene Antiserum wurde gezeigt, daß es HIV-1 neutralisiert, wie vorstehend beschrieben. Ho et al.

Die erfindungsgemäß eingeschlossenen Peptide umfassen Aminosäuresequenzen, die jeweils mindestens ein zusammenhängendes (lineares) Epitop enthalten, welches die Produktion von HIV-spezifischen Antikörpern in dem immunisierten Wirt induziert.

Die Erfindung umfaßt folglich immunogene Peptide, die den Regionen des HIV- gp120-Proteins entsprechen, welche durch das "Hüll"-Gen von HIV-1-HTLVIIIB codiert werden; beschrieben durch Muesing et al., "Nucleic Acid Structure and Expression of the Human AIDS/Lymphadenopathy Retrovirus", Nature 313 (1985), 450–458. Die Nucleotidsequenz ist in Genbank Release 63 unter der Bezeichnung HIVPV22 angegeben. Die Erfindung umfaßt ferner funktionell äquivalente Varianten der Peptide, welche die immunogenen Eigenschaften der Peptide nicht wesentlich beeinflussen. Zum Beispiel ist die konservative Substitution von Aminosäureresten von einem oder einigen wenigen Aminosäureresten durch Aminosäureanaloge im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.

Homologe sind Peptide, die konservativ substituierte Aminosäurereste aufweisen. Aminosäuren, die für eine andere konservativ substituiert werden können, umfassen, aber sind nicht begrenzt auf: Glycin/Alanin; Valin/Isoleucin/Leucin; Asparagin/Glutamin; Asparaginsäure/Glutaminsäure; Serin/Threonin; Lysin/Arginin; und Phenylalanin/Tyrosin. Homologe Peptide sind im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen, falls sie durch Antikörper erkannt werden, welche die als gp120-12, gp120-15, gp120-16 und gp120-19 bezeichneten Peptide erkennen, deren Sequenzen nachstehend gezeigt sind. Ferner sind alle homologen Peptide, die den erfindungsgemäßen Peptiden entsprechen, aber aus verschiedenen HIV-Isolaten abgeleitet sind, auch im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen.

Analoge sind definiert als Peptide, die funktionell äquivalent sind zu den erfindungsgemäßen Peptiden, aber die bestimmte nicht natürlich vorkommende oder modifizierte Aminosäurereste enthalten. Zusätzlich sind Polymere von einem oder mehreren der Peptide und Peptidanaloge oder -homologe im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen. Im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen sind auch Peptide mit weniger Aminosäureresten als gp120-12, gp120-15, gp120-16 bzw. gp120-19, welche aber ein oder mehrere immunogene Epitope umfassen, die in irgendeinem der Peptide vorhanden sind und folglich die immunogenen Eigenschaften des Ausgangspeptids beibehalten. Analysenverfahren zur Bestimmung des Ausmaßes, in dem die fraglichen Peptide an jedem Ende verkürzt werden können, während sie noch das immunogene Epitop der längeren Sequenz beibehalten, werden nachstehend beschrieben.

Die Addition von Aminosäuren an jedes Ende der hierin spezifisch offenbarten Peptide ist auch im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen, solange eine solche Addition die immunologischen Eigenschaften dieses Peptids nicht wesentlich nachteilig beeinflußt. Mittels üblichem Testen kann bestimmt werden, ob die gewünschten immunologischen Eigenschaften durch solche ergänzten oder verkürzten Peptide beibehalten werden. Falls Aminosäuren angehängt werden, wird bevorzugt, daß die erhaltenen Peptide noch relativ kurz sind, z. B. nicht mehr als etwa 50 Aminosäuren lang, vorzugsweise nicht mehr als etwa 40 oder 45 Aminosäuren lang und am meisten bevorzugt nicht mehr als etwa 25, 30 oder 35 Aminosäuren lang.

Die erfindungsgemäßen Peptide wurden durch bekannte Festphasen-Peptidsynthesetechniken synthetisiert. Barany und Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 1, Gross und Meinenhofer, Hrsg., Academic Press, New York, Kap. 1 (1980). Die Synthese ermöglicht auch, daß eine oder mehrere Aminosäuren, die nicht der ursprünglichen Proteinsequenz entsprechen, an den Amino- oder Carboxylterminus des Peptids angehängt werden können. Solche zusätzlichen Aminosäuren sind nützlich, um die Peptide an ein anderes Peptid, an ein großes Trägerprotein oder an einen festen Träger zu koppeln. Die für diese Zwecke nützlichen Aminosäuren schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf, Tyrosin, Lysin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Cystein und Derivate davon. Zusätzliche Proteinmodifikationstechniken können angewendet werden, z. B. die NH2-Acetylierung oder die COOH-terminale Amidierung, um ein zusätzliche Hilfsmittel für die Kopplung der Peptide an ein anderes Protein- oder Peptidmolekül oder an einen Träger bereitzustellen. Verfahren zur Kopplung von Peptiden aneinander, an Trägerproteine und an feste Träger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Peptide mit den vorstehend erwähnten zusätzlichen Aminosäureresten, entweder am Carboxy- oder Aminoterminus, nicht gekoppelt oder gekoppelt an einen Träger oder ein festes Trägermaterial, sind folglich im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen. Die Bezugnahme auf die erfindungsgemäßen Peptide schließt alle der hierin besprochenen Ausführungsformen ein.

Ein anderes Verfahren zur Impfstoffherstellung ist die Anwendung von molekularbiologischen Techniken, um ein Fusionsprotein herzustellen, das eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide und ein stark immunogenes Protein enthält. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß Fusionsproteine, enthaltend das Antigen von Interesse und die B-Untereinheit des Choleratoxins, eine Immunantwort auf das Antigen von Interesse induzieren. Vgl. Sanchez et al., "Recombinant System for Overexpression of Cholera Toxin B Subunit in Vibrio cholerae as a Basis for Vaccine Development", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 481–485. Solche chimären Peptide können oral verabreicht werden.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Peptidsequenzen sind nachstehend angegeben. Die Aminosäurereste sind aus der Nucleotidsequenz abgeleitet, die bereits durch Muesing et al., "Nucleic Acid Structure and Expression of the Human AIDS/Lymphadenopathy Retrovirus", Nature 313 (1985), 450–458, beschrieben wurde. Es wird bevorzugt, daß die Peptide eine Amidogruppe an ihren Carboxytermini anstatt einer Carboxylgruppe besitzen. Der Carboxyterminus kann auch eine Carboxylgruppe sowie eine nachstehend beschriebene Einheit sein.

worin X entweder ein Wasserstoffatom der aminoterminalen NH2-Gruppe des Peptids ist oder eine zusätzliche Aminosäure, welche so gewählt ist, daß die Kopplung des Peptids an einen Träger ermöglicht wird; Y nicht vorkommt oder Cys ist; und Z die Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure oder eine Amidogruppe ist. Die verwendeten Aminosäureabkürzungen sind in Tabelle 2 definiert.

Die Peptide sind als Impfstoffe nützlich, um vor einer künftigen Infektion mit HIV zu schützen oder die Immunantwort gegen HIV in Individuen zu verstärken, die bereits mit HIV infiziert sind. Obwohl jeder Primat oder vorzugsweise ein Mensch mit den Peptiden geimpft werden kann, sind die geeignetsten Individuen Menschen, für die ein Risiko einer HIV-Infektion besteht. Solche Individuen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Homosexuelle, Prostituierte, intravenös spritzende Drogenabhängige und in medizinischen Berufen Beschäftige, die mit Patienten oder biologischen Proben Kontakt haben, ein. Die Erfindung stellt auch monoclonale und polyclonale Antikörper bereit, welche die Peptide spezifisch erkennen. Die Erfindung stellt ferner Antikörper bereit, die HIV neutralisieren.

In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Peptide in Zusammensetzungen zur Verwendung als Immunogene formuliert. Diese Immunogene können als Impfstoffe in Säugern, einschließlich Primaten und Menschen, oder zur Induktion der Produktion polyclonaler und monoclonaler Antikörper in Tieren verwendet werden. Zur Formulierung solcher Zusammensetzungen wird eine immunogen wirksame Menge von mindestens einem der Peptide mit einem physiologisch verträglichen Träger vermischt, der zur Verabreichung an Säugern, einschließlich Menschen, geeignet ist. Die Peptide können kovalent aneinander, an andere Peptide, an einen Proteinträger oder an andere Träger gebunden, in Liposomen oder andere solche Vesikel eingeschlossen und/oder mit einem Adjuvans oder einem Absorbens, so wie auf dem Impfstoff-Fachgebiet bekannt, vermischt werden. Zum Beispiel kann das Peptid oder können die Peptide mit immunstimulierenden Komplexen vermischt werden, wie beschrieben durch Takahashi et al., "Induction of CD8+ Cytotoxic T-Cells by Immunization With Purified HIV-1 Envelope Protein and ISCOMS", Nature 344 (1990), 873–875. In einer anderen Ausführungsform sind die Peptide nicht gekoppelt und lediglich mit einem physiologisch verträglichen Träger wie normale Salzlösung oder einer Pufferungsverbindung, die zur Verabreichung an Säuger, einschließlich Menschen, geeignet ist, gemischt.

Die Immunantwort auf die erfindungsgemäßen Peptide kann durch eine große Vielzahl von Agenzien verstärkt werden. Die Liste der verfügbaren Adjuvanzien ist lang und wächst schnell. In einer bevorzugten Ausführungsform wird komplettes Freundsches Adjuvans verwendet, um die Immunantwort des Säugers zu verstärken, welcher das Peptid als Impfstoff erhält.

Wie bei allen immunogenen Zusammensetzungen zur Induktion von Antikörpern müssen die immunogen wirksamen Mengen der erfindungsgemäßen Peptide empirisch bestimmt werden. Die zu berücksichtigen Faktoren schließen die Immunogenität des nativen Peptids, ob das Peptid komplexiert wird mit einem oder kovalent gebunden wird an ein Adjuvans oder ein Trägerprotein oder einen anderen Träger oder nicht, die Verabreichungsweise für die Zusammensetzung, d. h. intravenös, intramuskulär, subkutan etc., und die Anzahl der zu verabreichenden Immunisierungsdosen ein. Solche Faktoren sind auf dem Impfstoff-Fachgebiet bekannt, und erfahrene Immunologen sind hinreichend darin geübt, solche Bestimmungen ohne übermäßiges Experimentieren durchzuführen.

Die Erfindung wird durch die folgenden spezifischen Beispiele weiter veranschaulicht, die den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise begrenzen sollen.

Beispiel 1 Peptidsynthese

Ein Peptidsynthesegerät von Applied Biosystems, Modell 430 A, wurde für die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide verwendet. Jede Synthese verwendete ein p-Methylbenzylhydrylamin-Festphasen-Trägerharz (Peptides International, Louisville, KY). Die Peptide wurden gemäß dem Benutzerhandbuch für Peptidsynthesegerät Model 430 A, Applied Biosystems, 1986, synthetisiert.

Alle Aminosäuren zur Verwendung bei der Synthese enthielten t-Butylcarbonylgruppen (t-Boc) zum Schutz der &agr;-NH2-Gruppe und wurden von der Novabiochem AG, Schweiz, bezogen. Aminosäuren mit reaktiven Seitenkettengruppen enthielten zusätzliche Schutzgruppen, um unerwünschte und ungünstige Seitenkettenreaktionen zu verhindern. Die einzelnen geschützten Aminosäuren, die bei der Synthese aller Peptide verwendet wurden, sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1 Bei der Peptidsynthese verwendete Aminosäuren
  • Boc-Ala-OH
  • Boc-Arg (Tos)-OH
  • Boc-Asn-OH
  • Boc-Asp (Obzl)-OH
  • Boc-Cys (Pmeobzl)-Oh
  • Boc-Glu (Obzl)-OH
  • Boc-Gln-OH
  • Boc-Gly-OH
  • Boc-His-(Tos)-OH
  • Boc-Ile-OH^1/2 H2O
  • Box-Leu-OH^H2O
  • Box-Lys (2-CI-Z)-OH ( kristal.)
  • Box-Met-OH
  • Boc-Phe-OH
  • Boc-Pro-OH
  • Boc-Ser (Bzl)-OH^DCHA
  • Boc-Thr (bzl)-OH
  • Boc-Trp (Formyl)-OH
  • Boc-Tyr (2-Br-Z)-OH
  • Boc-Val-OH
  • Tos: Tosyl oder p-Toluolsulfonsäure
  • Obzl = Benzyloxy
  • Pmeobzl = p-Methylbenzyloxy
  • 2-CL-Z = Carbobenzoxychlorid
  • 2-Br-Z = Carbobenzoxybromid

Nach Beendigung einer bestimmten Synthese wurden die Schutzgruppen aus dem synthetisierten Peptid entfernt, und das Peptid wurde von dem festen Trägerharz durch Behandlung mit Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) gemäß dem Verfahren abgespalten, das durch Bergot et al., "Utility of Trifluoromethane Sulfonic Acid as a Cleavage Reagent in Solid Phase Peptide Synthesis", Applied Biosystems User Bulletin, Peptide Synthesizer, Ausgabe Nr. 16, 2. September 1986, beschrieben wurde. Nachstehend wird das verwendete ausführliche Protokoll angegeben.

  • 1. Für 1 Gramm Peptidharz wurden 3 ml Thioanisol-1,2-Ethandithiol (2 : 1) als Fänger zugegeben, und das Gemisch wurde unter fortgesetztem Rühren für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert.
  • 2. Trifluoressigsäure (TFA), 10 ml, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 min bei Raumtemperatur fortgesetzt gerührt.
  • 3. TFMSA, 1 ml, wurde unter starkem Rühren zugetropft und für 25 min bei Raumtemperatur umgesetzt.
  • 4. Nach der Abspaltung wurden die Peptide mit wasserfreiem Ether ausgefällt und gewaschen.
  • 5. Die gefällten und gewaschenen Peptide wurden in einem kleinen Volumenteil von TFA (etwa 5 ml) gelöst.
  • 6. Die gelösten Peptide wurden abermals ausgefällt und gewaschen, wie vorstehend in Schritt 4, und der Niederschlag wurde unter einem N2-Strom getrocknet.

Vor der Verwendung in spezifischen Tests können die Peptide gegebenenfalls durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) weiter gereinigt werden. Eine besonders geeignete Säule für eine solche Reinigung ist die Umkehrphasen-VydakTM C-18-Säule unter Verwendung eines Wasser (TFA)-Acetonitril (TFA)-Gradienten zum Eluieren der Peptide. 40 Peptide mit den in Tabelle 2 gezeigten Aminosäuresequenzen, welche die gesamte Sequenz von HIV-1-gp120 abdecken, wurden synthetisiert. Ein verkürztes Peptid, gp120-16B, mit den Aminosäurekoordinaten 213–224 wurde auch synthetisiert.

Beispiel 2 Zellen und Virusstammlösungen

Alle Neutralisierungstests wurden unter Verwendung von H-9-Zellen und dem HTLV-111B-Virus (zurückgehend auf R. C. Gallo und bereitgestellt durch Dr. William Hall, North Shore Hospital, Manhasset, New York) durchgeführt. Die H-9-Zellen (bezeichnet als H9-NY) wurden in RPMI-Medium (Gibco), supplementiert mit 20% fötalem Kälberserum (FSC), Penicillin/Streptomycin (PEN/STREP, jeweils 50 &mgr;g/ml, und ohne irgendwelche Fungizide), aufrechterhalten. Die Zellen wurden bei einer Verdünnung von 1 : 3 an jeden 4. Tag subkultiviert.

Die Zellen wurden von den Platten abgeschabt und durch Zentrifugation bei 325 × g pelletiert. Die pelletierten Zellen wurden in 1 ml Virusstammlösung, vorher 1/10 verdünnt, resuspendiert, und man ließ sie für 60 min bei 37°C unter häufigem Rühren adsorbieren. Nach der Adsorption des Virus wurden die Zellen erneut zentrifugiert und in 10 ml RPMI mit 20% FCS und Polybrene (2 &mgr;g/ml) resuspendiert (wobei eine Endkonzentration von 5 × 105 Zellen/ml erhalten wurde) und bei 37°C in 5% CO2 inkubiert.

Für infizierte Zellen wurde gezeigt, daß sie 4–5 Tage nach der Infektion (p. i.) durch Überwachung der Syncytienbildung, der positiven Zellen mittels Immunfluoreszenz und der p24-Produktion (getestet durch den p24-Antigentest von Abbott) nachweisbar sind. Der Peak einer HIV-Produktion wurde 10–15 Tage p. i. beobachtet; zu diesem Zeitpunkt wurde das Virus gewonnen. Nach Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit, um Zelltrümmer zu entfernen, wurden virushaltige Überstände, die aus infizierten Zellen gewonnen worden waren, in Stammlösungen bei –90°C eingefroren. Eine Virusstammlösung mit einem Endpunkttiter von 40.000 Gewebekultur-Infektionsdosen von 50% (TCID50) wurde in den ganzen Studien verwendet (bezeichnet als NT3-NT19).

Beispiel 3 Herstellung von Peptiden zur Immunisierung

Erfindungsgemäße Peptide wurden kovalent an Ovalbumin, Grad V (Sigma, St. Louis, MO, USA) in einem Molverhältnis von etwa 10 : 1 (Peptid : Ovalbumin) unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) (Pharmacia, Uppsala, Schweden) als bifunktionelle Verbindungsgruppe gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia) gekoppelt, d. h. kurz zusammengefaßt wie folgt: Ovalbumin wurde in Kupplungspuffer (0,2 M NaHP2O4, pH 8,5) gelöst. Das gelöste Ovalbumin wurde dann unter Verwendung des gleichen Puffers über eine Sephadex G-25M-Säule (Pharmacia, Schweden) geleitet. Die Proteinkonzentration wurde bei 280 nm gemessen, und die Rückgewinnung wurde bestimmt. SPDP wurde in 99,5% Ethanol in einer Endkonzentration von 40 mM gelöst. SPDP wurde dann zu der Ovalbuminlösung unter Rühren zugetropft. Das SPDP-Ovalbumin-Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten stehengelassen. Das Ovalbumin-SPDP-Konjugat wurde von dem unkonjugierten SPDP getrennt, indem das Gemisch unter Verwendung von Wasser als Eluent über eine Sephadex G-25M-Säule geleitet wurde. Der Substitutionsgrad für das Ovalbumin-SPDP-Konjugat wurde bestimmt nach Verdünnen von 50 &mgr;l Konjugat in 2 ml Wasser durch Messen des verdünnten Konjugats bei 280 nm und des verdünnten Konjugats plus 100 &mgr;l Dithiothreit (DDT) (Sigma) bei 343 nm, um die Menge zu bestimmen, die zu der Peptidlösung zugegeben werden kann.

Schließlich wurde das synthetische Peptid, welches an das Ovalbumin-SPDP-Konjugat gekoppelt werden soll, in 10% Essigsäure in einer Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst, und eine geeignete Menge des Ovalbumin-SPDP-Konjugats (wie durch den vorstehenden Substitutionsgrad bestimmt) wurde zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.

Beispiel 4 Immunisierungsprotokolle

Maccaca fascicularis-Spezies wurden verwendet, um Antikörper zu erzeugen. Vor der ersten Peptidinjektion wurden den Affen eine Blutprobe entnommen. Diese erste Blutprobe wird als "Präimmun" bezeichnet (Tabellen 3–6) und wird als interne Kontrolle verwendet und gleichzeitig mit dem jeweiligen Immunserum analysiert.

Den Affen wurden 100 &mgr;g Peptid-SPDP-Ovalbumin, suspendiert in 0,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), injiziert. Die Affen wurden dreimal intramuskulär in Abständen von drei Wochen immunisiert. Als Adjuvans wurden 0,5 ml komplettes Freundsches Adjuvans für alle Immunisierungen verwendet. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde den Affen Blut entnommen, und Präimmun- und Hyperimmunseren wurden Neutralisierungstests unterzogen, wie in Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 5 HIV-1-Neutralisierungstest

Seren, enthaltend Antikörper, die eine HTLV-11B-Infektiosität neutralisieren, wurden durch ihre Fähigkeit zur Verhinderung einer HIV-1-Syncytiumbildung, einer p24-Antigenproduktion und eine verringerte Anzahl von infizierten Zellen, wie durch Immunfluoreszenzmarker bestimmt, im Vergleich zu Kontrollinfektionen ohne Peptid-spezifische Antiseren nachgewiesen. Die in Beispiel 2 beschriebene Virusstammlösung wurde auf 100 TCID50 verdünnt und mit Vierfach-Verdünnungsreihen (1/5, 1/20 und 1/80) von Komplement-inaktivierten Immunseren gemischt, welche, aus den Affen erhalten wurden, die immunisiert worden waren, wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Als positive Kontrolle wurde ein Meerschweinchen-Hyperimmunserum (bezeichnet als MSV) mit einem bekannten HIV-Neutralisierungstiter von 1/40–1/160 in allen Experimenten eingeschlossen (freundlicherweise bereitgestellt durch Prof. B. Morein, Dept. Veterinary Virology, BMC, Uppsala, Schweden). Nach Inkubation für 60 min bei 37°C oder 16 Stunden bei 4°C wurde das Serum-Virus-Gemisch zu 1 × 106 H-9-Zellen zugegeben und weitere 60 min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen einmal gewaschen und in Platten mit 24 Vertiefungen zusammen mit 2 ml Wachstumsmedium (RPMI, 10% FCS, 2 &mgr;g Polybrene/ml) pro Vertiefung eingebracht.

Die Zellen wurden unter dem Mikroskop (Vergrößerung × 200) auf das Vorhandensein von Syncytien an den Tagen 5–12 p. i. untersucht. Überstände von infizierten Zellen wurden auf die Anwesenheit des p24-Antigens gemäß den Anweisungen des Herstellers (ag-Test HIVAG-1® von Abbott, Enzyme Immunoassay for the Detection of Human Immunodeficiency Virus Type I (HIV-1) Antigen(s) in Human Serum or Plasma) in Zehnfach-Verdünnungsreihen (1/10–1/1000) am Tag 10 p. i. getestet. Die Ergebnisse sind als Extinktionswerte bei 454 nm dargestellt, wobei höhere Extinktionswerte eine höhere Proteinkonzentration und daher eine HIV-Infektion anzeigen. Verdünnungsreihen der Überstände wurden hergestellt, um die p24-Konzentrationen im genauesten Bereich nachzuweisen (< 2,0 Extinktionseinheiten).

Die Anzahl der infizierten Zellen wurde am Ende des Experiments (üblicherweise am Tag 15 p. i.) mittels Acetonfixierung der Zellen auf Objektträgern bestimmt, die für die Immunfluoreszenz (IF) angepaßt sind. Ein indirekter IF-Test wurde gemäß den bei Jeansson et al., "Elimination of Mycoplasmas from Cell Cultures Utilizing Hyperimmune Sera", Ex. Cell Res. 161 (1985), 181–188, beschriebenen Standardverfahren mit Hyperimmunseren in einer 1/400-Verdünnung aus HIV infizierten Individiuen und einem Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markierten anti-Mensch-IgG-Antikörper (Bio-Merieux, Frankreich), 1/100 verdünnt, verwendet. Die Tabellen 3–6 zeigen die Ergebnisse, welche aus der Durchmusterung von Hyperimmunseren aus Affen, die mit den Peptiden 1–40 immunisiert worden waren, erhalten wurden.

In den Tabellen 3(A-D)-6 wurde der p24-Antigengehalt der Überstände durch einen ELISA analysiert, wie vorstehend beschrieben. Die relative Menge der Antigen-positiven Zellen ist als AG-pos. Zellen angegeben, wobei die Prozentsätze wiedergegeben werden durch: – = 0%; + = >0–2%; ++ = 3–10%; und +++ = 11–20%, wobei das Prozentsatzintervall die Anzahl der Antigen-positiven Zellen angibt.

Tabelle 3A (HIVNT3P1.XLS) veranschaulicht die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die mit den Peptiden gp120-1-gp120-10 immunisiert worden waren. Die verwendeten Zellen waren H9-NY-Zellen, und das verwendete Virus war HTLV-IIIB, Charge 18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.

Tabelle 3B (HIVNT4P1.XLS) veranschaulicht die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die mit den Peptiden gp120-11-gp120-20 immunisiert worden waren. Die verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en, und das verwendete Virus war HTLV-IIIB, Charge 18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.

Tabelle 3C (HIVNT5P1.XLS) veranschaulicht die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die mit den Peptiden gp120-21-gp120-30 immunisiert worden waren. Die verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en, und das verwendete Virus war HTLV-IIIB, Charge 18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.

Tabelle 3D (HIVNT6P1.XLS) veranschaulicht die Ergebnisse, welche mit Seren von Affen erhalten wurden, die mit den Peptiden gp120-31-gp120-40 immunisiert worden waren. Die verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en, und das verwendete Virus war HTLV-IIIB, Charge 18, beschrieben in Beispiel 2. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation (Virus plus Serum) bei 37°C für eine Stunde.

Tabelle 4 (HIVTAB4.XLS) veranschaulicht die Ergebnisse der ersten Wiederholungsprüfung auf mutmaßliche neutralisierende Antikörper, wie durch den ersten Test bestimmt wurde (Tabellen 3A–D). In jedem Test war das verwendete Virus HTLV-IIIB, Charge 18, und die verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en. Die Ergebnisse der Ersten Wiederholungsprüfung in den Reihen 1–19 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 5. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Die Ergebnisse der Ersten Wiederholungsprüfung in den Reihen 20–32 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstests Nr. 7. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde.

Tabelle 5 (HIVTAB5.XLS) zeigt die Ergebnisse der zweiten, dritten und vierten Wiederholungsprüfung auf die positiven Peptide. In jedem Test war das verwendete Virus HTLV-IIIB, Charge 18, und die verwendeten Zellen waren H9-NY-Ze11en. Die Ergebnisse der Zweiten Wiederholungsprüfung in den Reihen 1–4 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 7. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Die Ergebnisse der Zweiten Wiederholungsprüfung in den Reihen 5–13 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 12. Die Ergebnisse der Dritten Wiederholungsprüfung in den Reihen 14–16 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 12. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Die Ergebnisse der Vierten Wiederholungsprüfung in den Reihen 17–39 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 16. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation bei 4°C für 16 Stunden. Die Ergebnisse der Zweiten Wiederholungsprüfung in den Reihen 40–53 sind die Ergebnisse von Neutralisierungstest Nr. 19. Das Inkubationsprotokoll umfaßte eine Inkubation (Zellen plus Virus) bei 4°C für 16 Stunden.

Tabelle 6 (HIVKOMBP.XLS) zeigt die Ergebnisse des Neutralisierungstests mit kombinierten Hyperimmunseren. Anmerkung: die Inkubation von Virus und Zellen erfolgte bei 4°C für 16 Stunden.

Die in den Tabellen 3(A-D)-6 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Peptide die Produktion von HIV neutralisierenden Antikörpern in Primaten induzieren. Die Verwendung der Peptide bei der Impfung von Menschen ist daher geeignet, um eine Infektion mit HIV zu verhindern oder um eine verstärkte Immunantwort in Individuen hervorzurufen, die bereits mit HIV infiziert sind.

Beispiel 6 ADCC-Test

Das zur Bestimmung einer HIV-spezifischen ADCC angewendete Verfahren ist beschrieben worden durch Ljunggren et al., J. Immunol. Meth. 104 (1987), 7; und J. Immunol. 139 (1987), 2263. Kurz zusammengefaßt wurde die Zelllinie U937, Clon 2, fortgesetzt infiziert mit HIV-1HTLVIIIB, als Zielzelle verwendet. Einkernige Zellen aus peripherem Blut (PBMC), erhalten aus HIV-Antikörper-negativen Blutspendern, wurden als Effektorzellen verwendet. Die PBMCs wurden mittels Dichtezentrifugation auf Lymphoprep (Nykomed Pharma AS, Oslo, Norwegen) gewonnen, und anhaftende Zellen wurden durch die Nylonwolle-Scheuertechnik entfernt. Merril et al., Eur. J. Immunol. 11 (1981), 536. 51Cr-markierte Zielzellen, 1 × 104, und Lymphocyten als Effektorzellen, 2 × 105, wurden mit Serumverdünnungen, sechs Verdünnungsschritte in Dreifach-Verdünnungsreihen, beginnend bei 1 : 30, gemischt. Die Überstände wurden nach drei Stunden geerntet, und die freigesetzte Radioaktivität wurde berechnet. Die spontane Freisetzung überschritt nie 10%.

Die HIV-spezifische ADCC wurde wie folgt bestimmt: spezifische 51Cr-Freisetzung mit HIV-positiven Seren minus der spezifischen 51Cr-Freisetzung mit HIV-negativen Seren. Seren mit einem Spezifischen ADDC-Index (SAI)-Wert von > 0,5 bei 1 : 30 wurden als positiv für eine HIV-spezifische ADCC angesehen. Ljunggren et al., J. Immunol. 139 (1987), 2263. Dieser Wert liegt mehr als 3 SD oberhalb der spezifischen 51Cr-Freisetzung, die durch HIV-Antikörper-negative Seren erhalten wird. HIV-Antikörper-positive Seren mit einem bekannten ADCC-Titer waren in jedem Test eingeschlossen. Der reziproke Wert des letzten Verdünnungschritts mit einem SAI-Wert von > 0,5 wurde als ADCC-Titer angenommen. Keine ADCC-Aktivität konnte in Seren gegen nicht infizierte Zielzellen oder in HIV-Antikörpernegativen Seren nachgewiesen werden.

Die gemäß dem vorstehenden Beispiel 5 bestimmten Hyperimmunseren wurden in einem ADCC-Test getestet, wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse für ADCC-positive Seren allein sind nachstehend in Tabelle 7 dargestellt. Alle anderen Seren in der Gruppe waren ADCC-negativ. Alle Präimmunseren von den Affen 1–40 waren negativ gegen infizierte Zielzellen, ausgenommen Serum Nr. 36, das einen Titer von 1 : 30 aufwies. Alle Präimmun- und Hyperimmunseren waren ADCC-negativ gegen nicht infizierte Zielzellen.

Die in Tabelle 7 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Peptide lineare ADCC-Epitope einschließen, die für HIV-1HTLVIIB-gP120 spezifisch sind. Folglich können die erfindungsgemäßen Peptide zur Induktion einer Antikörper abhängigen zellulären Cytotoxizität verwendet werden, um die Verhinderung einer Infektion mit HIV zu unterstützen oder um eine verstärkte Immunantwort in Individuen hervorzurufen, die bereits mit HIV infiziert sind.

Zur Bestimmung der richtigen Aminosäuren, die für das aktive Epitop eines jeden der neuen erfindungsgemäßen Peptide notwendig sind, kann eine Deletionsanalyse durchgeführt werden, wie im folgenden Beispiel beschrieben ist.

Beispiel 7 Deletionsanalyse der Peptide

Die erfindungsgemäßen Peptide können genau in der hierin beschriebenen Form verwendet werden oder können in einer ergänzten oder verkürzten aktiven Form verwendet werden. Um zu bestimmen, ob die Entfernung oder Addition von Aminosäuren aus oder an die Sequenz die vorteilhaften Eigenschaften der Sequenz beeinflußt, wie vorstehend beschrieben, können Routineexperimente durchgeführt werden, um den Teil der Sequenz zu identifizieren, der das aktive Epitop enthält. Zum Beispiel wird eine Deletionsanalyse bei gp120-1 durchgeführt, indem Peptide synthetisiert werden, denen eine, zwei, drei oder mehr Aminosäuren aus dem Carboxyterminus, aus dem Aminoterminus oder beiden fehlen, und diese Peptide systematisch gemäß den Beispielen 4–6 getestet werden. Falls das erhaltene verkürzte Peptid immunologisch äquivalent ist zu der nicht verkürzten Form bezüglich der Erzeugung von protektiven oder neutralisierenden Antikörpern, dann kann man daraus schließen, daß das Epitop, welches für die fraglichen Eigenschaften verantwortlich ist, innerhalb der verkürzten Sequenz vorhanden ist. In ähnlicher Weise können die Sequenzen nach der Addition von einer, zwei, drei oder mehren Aminosäuren (gewählt aus einer beliebigen gewünschten Aminosäure) an jedes Ende des Peptids getestet werden. Falls das erhaltene Peptid im Wesentlichen die Eigenschaften beibehält, die in den Beispielen 4–6 für das unmodifizierte Peptid identifiziert wurden, wird das modifizierte Peptid für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als immunologisch äquivalent angesehen.

Zusätzlich zur Synthese der zu testenden Peptide de novo können Aminosäuren aus den Peptiden mit irgendeiner der hierin offenbarten SEQ ID Nrn. chemisch entfernt werden. Zum Beispiel können Aminosäuren unter Anwendung des Verfahrens entfernt werden, das bei Morrison und Boyd, Organic Chemistry, 3. Auflage (1976), S. 1145–1146, offenbart ist. Kurz zusammengefaßt wird Phenylisothiocyanat verwendet, um einen substituierten Thioharnstoff an dem N-terminalen Rest des Peptids zu bilden. Ein milde Hydrolyse mit Salzsäure entfernt selektiv den N-terminalen Rest als das Phenylthiohydantoin. Die restliche Peptidkette bleibt in einem intakten Zustand zurück und wird auf eine immunologische Aktivität gemäß den Verfahren getestet, die in den vorstehend beschriebenen Beispielen 4–6 offenbart sind. Das Verfahren wird dann wiederholt, wobei aufeinanderfolgend der N-terminale Rest aus der restlichen Peptidkette entfernt wird und das erhaltene Peptid auf seine Fähigkeit getestet wird, eine HIV-spezifische ADCC zu induzieren, bis diese Fähigkeit verlorengeht. Auf diese Weise wird die Aminosäuresequenz des aktiven Epitops bestimmt.

Alternativ wird die C-terminale Aminosäure unter Verwendung des Enzyms Carboxypeptidase selektiv entfernt, um nur die Peptidbindungen direkt neben der freien alpha-Carboxylgruppe zu spalten. Zusätzlich können Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Peptide in kleinere Fragmente zu zerkleinern, die dann gemäß den Verfahren analysiert werden, welche vorstehend in den Beispielen 4–6 beschrieben sind.

Obwohl besondere Ausführungsformen der Erfindung ausführlich beschrieben worden sind, ist für die Fachleute ersichtlich, daß diese Ausführungsformen beispielhaft anstatt begrenzend sind, und der wirkliche Schutzumfang der Endung ist derjenige, welcher durch die folgenden Patentansprüche definiert wird.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Peptid zur Stimulierung einer menschlichen Immunschwächevirusspezifischen, Antikörper-abhängigen, zellulären Cytotoxizitätsantwort in einem Säuger, umfassend eine epitopische Aminosäuresequenz vom menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID NO: 41 gelegen ist, und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen, Antikörperabhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben.
  2. Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein Peptid, wobei das Peptid eine epitopische Aminosäuresequenz vom menschlichen Immunschwächevirusgp120-Protein umfasst, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID NO: 41 gelegen ist, und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen, Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben, wobei das Peptid in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um eine HIV-spezifische, Antikörper-abhängige, zelluläre Cytotoxizitätsimmunantwort in einem Säuger zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  3. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 2, weiter umfassend ein Adjuvans.
  4. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus komplettem Freundschem Adjuvans, inkomplettem Freundschem Adjuvans, Muramyldipeptid, Levamisol, Isoprinosin und Tuftsin.
  5. Verwendung eines Peptids, umfassend eine epitopische Aminosäuresequenz vom menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID NO: 41 gelegen ist, und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen HIV-spezifischen, Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines mit menschlichem Immunschwächevirus infizierten Säugers.
  6. Verwendung eines Peptids, umfassend eine epitopische Aminosäuresequenz vom menschlichen Immunschwächevirus-gp120-Protein, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 36 oder SEQ ID NO: 41 gelegen ist, und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen, Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung einer HIV-spezifischen, Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsimmunantwort in einem Säuger.
  7. Verwendung von mindestens zwei Peptiden, wobei jedes der Peptide eine epitopische Aminosäuresequenz vom menschlichen Immunschwächevirusgp120-Protein umfasst, wobei das Epitop innerhalb von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 36 oder SEQ ID NO: 41 gelegen ist, und wobei in Affen erzeugte Antiseren gegen die epitopische Sequenz einen spezifischen, Antikörperabhängigen zellulären Cytotoxizitätsindex-Wert von größer als 0,5 bei einer Verdünnung von größer als 1 : 30 haben, für die Herstellung eines Impfstoffs und/oder eines Arzneimittels zur Induzierung einer HIV-spezifischen, Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitätsimmunantwort in einem Säuger und/oder zur Behandlung eines mit menschlichem Immunschwächevirus infizierten Säugers.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei Schutz durch Verabreichung des Arzneimittels durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Injektion erreicht wird.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Arzneimittel weiterhin ein Adjuvans umfasst.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus komplettem Freundschem Adjuvans, inkomplettem Freundschem Adjuvans, Muramyldipeptid, Levamisol, Isoprinosin und Tuftsin.
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