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Dokumentenidentifikation DE69630153T2 09.06.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0001006187
Titel Diagnose der Tumorausbreitung
Anmelder Millenium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, Mass., US
Erfinder Shyjan, Andrew W., Nahant, US
Vertreter Dr. Volker Vossius, Corinna Vossius, Tilman Vossius, Dr. Martin Grund, Dr. Georg Schnappauf, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69630153
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 29.03.1996
EP-Aktenzeichen 991258294
EP-Offenlegungsdatum 07.06.2000
EP date of grant 24.09.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.06.2004
IPC-Hauptklasse C07H 21/04
IPC-Nebenklasse C12N 1/16   C12N 1/20   C12N 5/00   C12N 15/63   

Beschreibung[de]
1. Einleitung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur in vitro Diagnose von Tumorprogression in Säugern, z. B. Menschen. Die verschiedenen Tumorarten können humane Melanome, Brust, gastrointestinale Tumoren wie Ösophageal-, Magen-, Zwölffingerdarm-, Kolon-, Kolorektal- und Rektalkrebs, Prostata-, Blasen-, Hoden-, Eierstock-, Uterus-, Cervix-, Hirn-, Lungen-, Bronchial-, Kehlkopf-, Rachen-, Leber-, Pankreas-, Schilddrüsen-, Knochen-, verschiedene Arten von Hautkrebs und neoplastische Zustände wie Leukämien und Lymphome einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.

Insbesondere werden Gene identifiziert, die in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen und/oder im Vergleich zu Tumorzellen in einem anderen Stadium der Tumorprogression differentiell exprimiert werden. Es werden z. B. Gene identifiziert, die in gutartigen (z. B. nichtmalignen) Tumorzellen im Vergleich zu malignen Tumorzellen, die ein hohes metastatisches Potential zeigen, differentiell exprimiert werden. Gene werden auch anhand der Fähigkeit ihrer Genprodukte identifiziert, mit Genprodukten zu interagieren, die an der Progression zu und/oder der Aggressivität neoplastischer Tumorerkrankungsstadien beteiligt sind. Die identifizierten Gene können diagnostisch oder als Zielgene für therapeutische Maßnahmen verwendet werden. Zusätzlich werden Verfahren bereitgestellt zur diagnostischen Auswertung und Prognose von Krankheitszuständen, die Tumorprogression mit einschließen, zur Identifizierung von Patienten, die eine Prädisposition für solche Krankheiten zeigen, zur Überwachung von Patienten, die sich einer klinischen Auswertung unterziehen.

2. Hintergrund der Erfindung

Krebs ist nach Herzkrankheiten die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten (Boring, C. C. et al., 1993, CA Cancer J. Clin. 43: 7) und tritt auf bei einem von drei Amerikanern. Einer von vier Amerikanern stirbt an Krebs. Krebs ist in erster Linie durch eine Zunahme der Anzahl abnormer oder neoplastischer Zellen gekennzeichnet, die von einem gegebenen normalen Gewebe abgeleitet sind, welches proliferiert, um eine Tumormasse zu bilden, durch das Einwachsen dieser neoplastischen Tumorzellen in benachbarte Gewebe und die Bildung maligner Zellen, die über das Blut oder Lymphsystem in regionale Lymphknoten und entfernte Körperregionen einwandern. Die letztgenannte Progression zur Malignität wird als Metastasierung bezeichnet.

Krebs kann als ein Zusammenbruch der Kommunikation zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung, einschließlich ihrer normalen Nachbarzellen gesehen werden. Zwischen Zellen innerhalb eines Gewebes werden routinemäßig Signale, sowohl wachstums-stimulierend als auch wachstums-hemmend, ausgetauscht. Normalerweise teilen sich Zellen in Abwesenheit von stimulierenden Signalen nicht und stellen die Teilung in Anwesenheit von hemmenden Signalen ein. In einem Krebs- oder neoplastischen Zustand erlangt eine Zelle die Fähigkeit, diese Signale zu übergehen und unter Bedingungen zu proliferieren, unter denen normale Zellen nicht wachsen würden.

Tumorzellen müssen, um zu proliferieren, eine Anzahl verschiedener aberranter Eigenschaften annehmen. Die Tatsache, dass die Genome bestimmter gut untersuchter Tumoren einige unterschiedliche, unabhängig veränderte Gene tragen, einschließlich aktivierter Onkogene und inaktivierter Tumor-Suppressorgene, spiegelt dieses Erfordernis wieder. Jede dieser genetischen Veränderungen scheint dafür verantwortlich zu sein, einige dieser Eigenschaften zu verleihen, die zusammen den endgültigen neoplastischen Phänotyp repräsentieren (Land, H. et al., 1983, Science 222: 771; Ruley, H. E., 1983, Nature 304: 602; Hunter, T., 1991, Cell 64: 249).

Zusätzlich zur ungehinderten Zellproliferation müssen die Zellen bestimmte Eigenschaften erlangen, damit Tumorprogression erfolgen kann. So müssen z. B. in einem frühen Stadium der Tumorprogression die Zellen dem Wirtsimmunsystem entkommen. Weiterhin muss mit Zunahme der Tumorgröße der Tumor vaskularisiert werden, um Nährstoffe nachzuliefern und Stoffwechselabbauprodukte zu entfernen. Außerdem müssen die Zellen eine Fähigkeit erlangen, in benachbarte Gewebe einzuwandern. Zellen erlangen schließlich oft die Fähigkeit, in entfernten Regionen zu metastasieren.

Die biochemische Basis der Immunerkennung von Tumorzellen ist unklar. Es ist möglich, dass die Tumorigenität von Zellen ansteigen kann, wenn die Zellen weniger Klasse I-Histokompatibilitäts-Antigene zeigen (Schrier, P. I. et al., 1983, Nature 305: 771), so dass diese Antigene zusammen mit tumorspezifischen Antigenen erforderlich sind, dass Tumorzellen durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) erkannt werden. Tumorzellen, die eines oder mehrere Gene, die für tumorspezifische Antigene kodieren, verloren haben, scheinen der Erkennung durch entsprechende reaktive CTLs zu entkommen (Van der Bruggen, P. et al., 1991, Science 254: 1643).

Sobald ein Tumor mehr als etwa 1 mm Durchmesser an Größe erreicht hat, ist die passive Diffusion zur Ernährung und zur Entfernung von Stoffwechselabbauprodukten nicht länger ausreichend. An diesem Punkt muss die Tumormasse in engen Kontakt mit dem Durchblutungssystem treten. Daher sekretieren Zellen mit fortgeschritteneren Tumoren angiogene Faktoren, die die Neovaskularisation fördern, d. h. das Einwachsen von Blutgefäßen aus umgebendem Gewebe in die Tumormasse (Folkman, J. und Klagsburn, M., 1987, Science 235: 442; Liotta, L. A. et al. 1991, Cell 64: 327). Zu diesen angiogenen Faktoren gehören der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und der endotheliale Wachstumsfaktor (ECGF).

Die Neovaskularisierung kann ein essentieller Vorläufer der Metastasierung sein. Zunächst ist dieser Prozess dafür erforderlich, dass die Anzahl an Tumorzellen stark zunimmt, wodurch umgekehrt das Auftreten von seltenen metastatischen Varianten ermöglicht wird. Außerdem stellt die Neovaskularisierung eine Pforte zum Kreislaufsystem dar, der von den metastatischen Zellen verwendet werden kann.

Eine Vielzahl biochemischer Faktoren wurde mit verschiedenen Phasen der Metastasierung assoziiert. Zelloberflächen-Rezeptoren wie Kollagen, Glykoproteine wie Laminin, oder Proteoglykane erleichtern das Anheften von Tumorzellen, einem wichtigen Schritt bei der Invasion und der Metastasierung. Die Anheftung löst die Freisetzung von abbauenden Enzymen aus, die das Eindringen der Tumorzellen durch Gewebeschranken erleichtert. Sobald die Tumorzelle in das Zielgewebe eingetreten ist, sind für die weitere Proliferation spezifische Wachstumsfaktoren nötig.

Es ist offensichtlich, dass am komplexen Prozess der Tumorprogression multiple Genprodukte beteiligt sind. Es ist deshalb wichtig, die Rolle spezifischer Gene, die an der Tumorprogression beteiligt sind, zu definieren, diese Genprodukte, die am Prozess der Tumorprogression beteiligt sind, zu identifizieren, und diese Genprodukte weiter zu identifizieren, die als therapeutische Zielmoleküle zur Diagnose, Vorbeugung und Behandlung von Metastasen verschiedener Krebsarten dienen können.

Es wurden einige Versuche unternommen, Gene zu untersuchen, von denen man annimmt, dass sie Tumorprogressions-Phänotypen auslösen oder verstärken. Mutationen können eine Welle zellulärer Vermehrung auslösen, die mit schrittweisem Anstieg der Tumorgröße, abnehmender Organisation und Malignität assoziiert sind. Eine Mutation im Tumorsuppressorgen, das ein negativer Regulator der zellulären Proliferation ist, führt z. B. zu einem Verlust der wichtigen Kontrolle über Tumorwachstum und Progression. Die differentielle Expression der folgenden Suppressorgene wurde in humanen Krebsarten gezeigt: das Retinoblastom-Gen, RB; das Wilms-Tumor-Gen, WT1 (11p); das in Kolonkarzinomen deletierte Gen, DCC (18q); das Neurofibromatose Typ 1-Gen, NF1 (17q); und das an familiärer adenomatöser Poliposis coli, APC, beteiligte Gen (5q) (Vogelstein, B. und Kinzler, K. W., 1993, Trends Genet. 9: 138–141).

Ein Einblick in die komplexen Ereignisse, die von normalem Zellwachstum zur Neoplasie, zur Invasion und zur Metastasierung führen, ist zur Entwicklung effektiver diagnostischer und therapeutischer Strategien absolut notwendig. Die vorhergehenden Studien sind darauf gerichtet, die Rolle bestimmter Genprodukte zu definieren, von denen man annimmt, dass sie an der Tumorprogression beteiligt sind. Solche Ansätze können jedoch nicht die komplette Reihe der Genprodukte identifizieren, die bei den Kaskaden von Schritten der Tumorprogression beteiligt sind. Deshalb besteht ein großer Bedarf nach erfolgreicher Identifizierung dieser Gene, die in Zellen differentiell exprimiert werden, die an einem Tumorprogressions-Phänotyp beteiligt oder dafür prädisponiert sind. Solche differentiell exprimierten Gene und/oder Genprodukte können nützliche diagnostische Marker und/oder therapeutische Ziele für Krankheiten darstellen, die mit Tumorprogression assoziiert sind. Im Hinblick auf diagnostische Techniken könnten solche Gene und/oder Genprodukte nützliche Marker zur Diagnose, speziell zur frühen Diagnose, darstellen, wenn die Korrelation zwischen früher Diagnose und erfolgreicher Krebsbehandlung gegeben ist. Im Hinblick auf therapeutische Behandlungen könnten solch differentiell exprimierte Gene und/oder Genprodukte nützliche Ziele zur therapeutischen Behandlung verschiedener Formen von Tumorprogressionserkrankungen darstellen, einschließlich metastatischer und nichtmetastatischer neoplastischer Erkrankungen, und zur Hemmung der Progression von präneoplastischen Läsionen (d. h. hyperplastischen Läsionen oder anderen gutartige Tumoren) zu malignen Tumoren.

Differentiell exprimierte Gene, die an der Tumormetastasierung beteiligt sind, wurden unter Verwendung von murinen Melanom-Zelllinien mit variierenden metastatischen Potentialen, N-Nitroso-methylharnstoff-induzierten Ratten-Mammakarzinomen, Mamma-Karzinomzelllinien, humanen Brusttumoren und spontanen Kolon- und Magentumoren in Mäusen identifiziert (Steeg, P. S. et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 200–204; Qian, F. et al., 1994, Cell 77: 335–347; Leone, A. et al., 1991, 65: 25–35; Zou, Z. et al., 1994, Science 263: 526–529; und Fodde, R., et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8969–8973).

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose von Tumorprogression. Im speziellen werden murine und humane Gene identifiziert und beschrieben, die in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen und/oder Tumorzellen in einem anderen Stadium der Tumorprogression differentiell exprimiert werden. Es werden z. B. Gene identifiziert, die in gutartigen (z. B. nicht-malignen) Tumorzellen verglichen mit malignen, metastatischen Tumorzellen differentiell exprimiert werden.

Weiterhin können die identifizierten Gene und/oder Genprodukte zur Identifizierung von Zellen verwendet werden, die eine Krankheit mit einem Tumorprogressions-Phänotyp zeigen oder dafür prädisponiert sind, wodurch Individuen diagnostiziert werden, die solche Krankheiten oder ein hohes Risiko zur Entstehung solcher Krankheiten tragen. Zusätzlich können die identifizierten Gene und/oder Genprodukte verwendet werden, identifizierte Tumorzellen zu klassifizieren. Außerdem kann der Nachweis der differentiellen Expression identifizierter Gene dazu verwendet werden, Behandlungen (z. B. Chemo-Vorbeugung) in Betracht zu ziehen, bevor die gutartigen Zellen ein malignes Stadium erreichen. Weiterhin kann der Nachweis der differentiellen Expression identifizierter Gene dazu verwendet werden, einen präventiven Eingriff in prä-neoplastische Zellen bei Individuen mit einem hohen Risiko zu planen.

Der hier verwendete Begriff "Tumorprogression" bezieht sich auf ein Ereignis, welches zuerst den Übergang einer normalen, nicht-neoplastischen Zelle zu einer krebsartigen neoplastischen Zelle fördert. Solche Ereignisse schließen Ereignisse ein, die vor dem Auftreten von Neoplasie eintreten und eine Zelle prädisponieren oder als auslösender Schritt wirken, neoplastisch zu werden. Diese Ereignisse können z. B. solche einschließen, die dazu führen, dass eine normale Zelle einen prä-neoplastischen Phänotyp zeigt. Zweitens schließen solche Ereignisse auch Ereignisse ein, die zu einem Übergang von einem präneoplastischen zu einem neoplastischen Stadium führen. Solche Ereignisse können z. B. solche einschließen, die zwei Anzeichen des neoplastischen Stadiums fördern, nämlich ungehinderte Zellproliferation und/oder Invasion von Tumorzellen in benachbartes Gewebe. Drittens kann Tumorprogression Ereignisse einschließen, die den Übergang einer Tumorzelle in ein metastatisches Stadium fördern. Innerhalb jedes Stadiums (d. h. präneoplastisch, neoplastisch und metastatisch) kann sich der hier verwendete Begriff "Tumorprogression" auch auf den Schweregrad der Krankheit oder auf die Aggressivität, die eine Zelle verglichen mit anderen Zellen im gleichen Stadium zeigt, beziehen.

Da multiple Tumorprogressionsereignisse auftreten, wenn eine Zelle von normalen zu neoplastischen und metastatischen Stadien fortschreitet, gehen einige Zellen eine unterschiedliche Reihe solcher Tumorprogressionsereignisse ein. Solche Zellen werden hier als zu verschiedenen "Tumorprogressionsstadien" zugehörig bezeichnet.

Eine "Krankheit, an der Tumorprogression beteiligt ist" oder eine wie hier bezeichnete "Tumorprogressionserkrankung" bezieht sich auf das Stadium einer Zelle oder Zellen, in denen ein wie vorstehend definiertes Tumorprogressionsereignis stattgefunden hat oder in denen das Tumorprogressionsereignis stattfindet.

Der hier verwendete Begriff "differentielle Expression" bezieht sich sowohl auf quantitative als auch qualitative Unterschiede in zeitlichen und/oder zellulären Expressionsmustern von Genen in z. B. normalen und neoplastischen Tumorzellen und/oder bei Tumorzellen, bei denen verschiedene Tumorprogressionsereignisse stattgefunden haben. Differentiell exprimierte Gene können "Fingerprint-Gene" und/oder "Zielgene" darstellen.

Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Gen" bezieht sich auf ein differentiell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster als Teil eines prognostischen oder diagnostischen Markers zur Bewertung einer Krankheit verwendet werden kann, an der Tumorprogression beteiligt ist, oder welches andererseits in Verfahren zur Identifizierung nützlicher Verbindungen zur Behandlung solcher Erkrankungen verwendet werden kann. So kann z. B. die Wirkung der Verbindung auf die normal in Verbindung mit Erkrankungen, an denen Tumorprogression beteiligt ist, gezeigte Expression des Fingerprint-Gens dazu verwendet werden, die Wirksamkeit der Verbindung als Behandlung einer solchen Erkrankung auszuwerten, oder kann zusätzlich dazu verwendet werden, Patienten zu überwachen, die zur Behandlung der Erkrankung klinisch beurteilt werden.

Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Muster" bezieht sich auf das Muster, welches erzeugt wird, wenn das Expressionsmuster einer Reihe (von zwei bis zu allen Fingerprint-Genen, die für ein gegebenes Stadium existieren) von Fingerprint-Genen bestimmt wird. Ein Fingerprint-Muster kann in den gleichen diagnostischen, prognostischen und Verfahren zur Identifikation von Verbindungen verwendet werden, wie die Expression eines einzelnen Fingerprint-Gens.

Der hier verwendete Begriff "Zielgen" bezieht sich auf ein differentiell exprimiertes Gen, welches an der Tumorprogression derart beteiligt ist, dass die Modulierung des Spiegels der Expression des Zielgens oder der Aktivität des Produkts des Zielgens die Symptome der Tumorprogression verhindern und/oder vermindern kann. Verbindungen, die die Expression des Zielgens oder die Aktivität des Genprodukts des Zielgens modulieren, können zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen verwendet werden, einschließlich z. B. Krankheiten mit Progression zu einem metastatischen Stadium. Weiterhin können Verbindungen, die die Expression des Zielgens oder die Aktivität des Genprodukts des Zielgens modulieren, in Behandlungen verwendet werden, um zu verhindern, dass gutartige Zellen ein malignes Stadium erreichen. Weiterhin können Verbindungen, die die Expression des Zielgens oder die Aktivität des Genprodukts des Zielgens modulieren, dazu verwendet werden, einen präventiven Eingriff in prä-neoplastische Zellen bei Individuen mit einem hohen Risiko zu planen.

Weiterhin sind "Pathway-Gene" über die Fähigkeit ihrer Produkte definiert, mit anderen Genprodukten zu interagieren, die an Tumorprogressionserkrankungen beteiligt sind. Pathway-Gene können Zielgen- und/oder Fingerprint-Gen-Charakteristika aufweisen.

Weiterhin werden die Manipulation und die Verwendung Zell-basierender und/oder Tierbasierender Modelle von Tumorprogressionserkrankungen, einschließlich Erkrankungen, an denen Metastasierung beteiligt ist, zu denen solche Genprodukte beitragen können, beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur prognostischen und diagnostischen Auswertung von Tumorprogressions-Krankheitszustände und zur Identifizierung von Patienten, die für solche Krankheitszustände prädisponierte Zellen enthalten. Außerdem stellt die Erfindung auch Verfahren zur Auswertung der Wirksamkeit von Therapien für Krankheiten bereit, an denen Tumorprogression beteiligt ist und zur Überwachung des Fortschritts von Patienten, die an klinischen Studien zur Behandlung solcher Krankheiten teilnehmen.

Die hier beschriebenen Tumorprogressionserkrankungen können Erkrankungen einschließen, die an der Progression solcher humaner Krebserkrankungen beteiligt sind, wie z. B. humane Melanome, Brust, Gastrointestinalkrebs wie Ösophageal-, Magen-, Kolon-, Eingeweide-, Kolorektal- und Rektalkrebs, Prostata-, Blasen-, Hoden-, Eierstock-, Uterus-, Cervix-, Gehirn-, Lungen-, Bronchial-, Kehlkopf-, Rachen-, Leber-, Pankreas-, Schilddrüsen-, Knochen-, verschiedene Arten von Hautkrebs und Leukämie, Lymphome.

Diese Erfindung beruht teilweise auf systematischen Suchstrategien, an denen in vivo- und in vitro-Paradigmen der Tumorprogression beteiligt sind, einschließlich der Progression zur metastatischen Krankheit, gekoppelt mit sensitiven Genexpressions-Tests mit hohem Durchsatz, zur Identifizierung von Genen, die in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen und/oder verglichen mit Tumorzellen in einem verschiedenen Tumorprogressionsstadium differentiell exprimiert werden. Im Gegensatz zu Ansätzen, bei denen lediglich die Expression eines gegebenen Genprodukts ausgewertet wird, von dem man annimmt, dass es in dem einem oder anderen Stadium der Tumorprogression eine Rolle spielt, wie z. B. die Progression zu einem metastatischen Krankheitsprozess, erlauben die hier verwendeten Suchstrategien und Tests die Identifizierung aller bekannten oder neuen Gene, die in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen oder verglichen mit Tumorzellen in einem anderen Stadium der Tumorprogression, differentiell exprimiert werden.

Dieser umfassende Ansatz und die Auswertung ermöglichen die Entdeckung neuer Gene und Genprodukte als auch die Identifizierung einer Reihe von Genen und Genprodukten (bekannt oder unbekannt), die an neuen Pathways beteiligt sind, die eine wichtige Rolle in der Pathologie der Krankheit spielen. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung die Identifizierung und Charakterisierung von Zielgenen, die zur Prognose, Diagnose, Überwachung, Arzneistoffentwicklung und/oder anderen therapeutischen Eingriffen in Tumorprogressionserkrankungen, einschließlich Erkrankungen mit Metastasierung, nützlich sind.

Das nachstehend in Abschnitt 6 gezeigte Beispiel zeigt die erfolgreiche Verwendung von erfindungsgemäßen Tumorprogressions-Suchstrategien zur Identifizierung von Genen, die innerhalb von Tumorzellen, verglichen mit Tumorzellen in einem anderen Stadium der Tumorprogression, differentiell exprimiert werden. Insbesondere identifiziert das Beispiel ein Gen, welches in metastatischen Zellpopulationen, verglichen mit gutartigen, nicht-malignen Tumorzellen differentiell exprimiert ist.

Dieses Gen, welches hier als 030-Gen (fomy030 in der Maus und fohy030 in Menschen) bezeichnet wird, ist ein neues Gen, welches in nicht-metastatischen Tumorzellen in einem vielfach höheren Spiegel exprimiert wird, verglichen mit seiner Expression in metastatischen Tumorzellen. Das Gen kommt bei Mäusen vor und besitzt die in 3A und 3B (SEQ ID NO: 2) gezeigte cDNA-Sequenz. Ein homologes Gen, welches hier als fohy030-Gen bezeichnet, wird, kommt bei Menschen vor und besitzt die in 5 (SEQ ID NO: 6) gezeigte cDNA-Sequenz. Eine alternativ gesplicte Form der humanen cDNA besitzt die in 6 (SEQ ID NO: 8) gezeigte Sequenz. Wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, bezieht sich allgemein jeder Bezug auf das 030-Gen nachfolgend auf das murine (fomy030) und humane (fohy030) Homolog dieses Gens.

Die Identifizierung des 030-Gens und die Charakterisierung seiner Expression in bestimmten Stadien der Metastasierung stellt daher neu identifizierte Ziele zur Diagnose, Vorbeugung und Behandlung von Tumorprogressionserkrankungen, einschließlich metastatischer neoplastischer Erkrankungen, bereit.

Sein Expressionsmuster zeigt, dass das 030-Genprodukt als Inhibitor der Tumorprogression agiert. So korreliert z. B. eine Verminderung der 030-Genexpressionshöhe mit einem Anstieg des metastatischen Potentials einer Zelle, d. h., die Verminderung des 030-Genprodukts in Tumorzellen kann die Zelle dazu induzieren oder prädisponieren, zu einem metastatischen Stadium fortzuschreiten.

Daher kann jedes Verfahren, welches zu einem Anstieg der Menge des 030-Genprodukts führt, die Progression zur Metastasierung hemmen oder verlangsamen. Tatsächlich ist es möglich, dass das 030-Genprodukt allgemeine tumorhemmende Eigenschaften besitzt.

Ein als fomy030 bezeichneter cDNA-Klon des murinen Homologen ist hier in den 3A und 3B (SEQ ID NO: 2) gezeigt (Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz) und wurde von fomy030-mRNA abgeleitet. Der hier verwendete Begriff fomy030-cDNA bezieht sich jedoch auf jede DNA-Sequenz, die für die in den 3A und 3B (SEQ ID NO: 3) gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.

Ein cDNA-Klon des humanen Homologs, als fohy030 bezeichnet, wird in 5 (SEQ ID NO: 6) (Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz) gezeigt. Eine alternativ gespleißte Form von fohy030 ist in 6 (SEQ ID NO: 8) gezeigt. Beide wurden durch Verwendung der gesamten Maus-fomy030-cDNA als Sondenmolekül erhalten. Der hier verwendete Begriff fohy030-cDNA bezieht sich jedoch auf jede DNA-Sequenz, die für die in 5 (SEQ ID NO: 7) und 6 (SEQ ID NO: 9) gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.

3.1 Definitionen

Der hier verwendete Begriff "Tumorprogression" bezieht sich auf ein Ereignis, welches zuerst den Übergang einer normalen, nicht-neoplastischen Zelle zu einer krebsartigen neoplastischen Zelle fördert. Solche Ereignisse schließen Ereignisse ein, die vor dem Auftreten von Neoplasie eintreten und eine Zelle prädisponieren oder als auslösender Schritt wirken, neoplastisch zu werden. Diese Ereignisse können z. B. solche einschließen, die dazu führen, dass eine normale Zelle einen prä-neoplastischen Phänotyp zeigt. Zweitens schließen solche Ereignisse auch Ereignisse ein, die zu einem Übergang von einem präneoplastischen zu einem neoplastischen Stadium führen. Solche Ereignisse können z. B. solche einschließen, die ungehinderte Zellproliferation und/oder Invasion von Tumorzellen in benachbartes Gewebe, was als Kennzeichen des neoplastischen Stadiums betrachtet wird, fördern. Drittens kann Tumorprogression Ereignisse einschließen, die den Übergang einer Tumorzelle in ein metastatisches Stadium fördern. Innerhalb jedes Stadiums (z. B. präneoplastisch, neoplastisch und metastatisch) kann sich der hier verwendete Begriff "Tumorprogression" auch auf den Schweregrad der Krankheit oder auf die Aggressivität, die eine Zelle zeigt, beziehen.

Da multiple Tumorprogressionsereignisse auftreten, wenn eine Zelle von normalen zu neoplastischen und metastatischen Stadien fortschreitet, gehen einige Zellen eine unterschiedliche Reihe solcher Tumorprogressionsereignisse ein. Solche Zellen werden hier als zu verschiedenen "Tumorprogressionsstadien" zugehörig bezeichnet.

Eine "Krankheit, an der Tumorprogression beteiligt ist" oder eine wie hier bezeichnete "Tumorprogressionserkrankung" bezieht sich auf das Stadium einer Zelle oder Zellen, in denen ein wie vorstehend definiertes Tumorprogressionsereignis stattgefunden hat oder in denen das Tumorprogressionsereignis stattfindet.

Der hier verwendete Begriff "differentielle Expression" bezieht sich sowohl auf quantitative als auch qualitative Unterschiede in zeitlichen und/oder zellulären Expressionsmustern von Genen in z. B. normalen und neoplastischen Tumorzellen und/oder bei Tumorzellen, bei denen verschiedene Tumorprogressionsereignisse stattgefunden haben. Differentiell exprimierte Gene können "Fingerprint-Gene" und/oder "Zielgene" darstellen.

Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Gen" bezieht sich auf ein differentiell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster als Teil eines prognostischen oder diagnostischen Markers zur Bewertung von Tumorprogression, oder welches andererseits in Verfahren zur Identifizierung nützlicher Verbindungen zur Behandlung von Tumorprogression verwendet werden kann. So kann z. B. die Wirkung der Verbindung auf die normal in Verbindung mit Tumorprogression gezeigte Expression des Fingerprint-Gens dazu verwendet werden, die Wirksamkeit der Verbindung als Behandlung von Tumorprogression auszuwerten, oder kann zusätzlich dazu verwendet werden, Patienten zu überwachen, die zur Behandlung von Tumorprogression klinisch beurteilt werden.

Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Muster" bezieht sich auf das Muster, welches erzeugt wird, wenn das Expressionsmuster einer Reihe (von zwei bis zu allen Fingerprint-Genen, die für ein gegebenes Stadium existieren) von Fingerprint-Genen bestimmt wird. Ein Fingerprint-Muster kann in den gleichen diagnostischen, prognostischen und Verfahren zur Identifikation von Verbindungen verwendet werden, wie die Expression eines einzelnen Fingerprint-Gens.

Der hier verwendete Begriff "Zielgen" bezieht sich auf ein differentiell exprimiertes Gen, welches an der Tumorprogression derart beteiligt ist, dass die Modulierung des Spiegels der Expression des Zielgens oder der Aktivität des Produkts des Zielgens die Symptome der Tumorprogression verhindern und/oder vermindern kann. Verbindungen, die Zielgen-Expression oder Aktivität des Zielgenprodukts modulieren, können zur Behandlung von Tumorprogression und Tumorprogressionserkrankungen verwendet werden, einschließlich z. B. Krankheiten mit Progression zu einem metastatischen Stadium.

Weiterhin sind "Pathway-Gene" über die Fähigkeit ihrer Produkte definiert, mit anderen Genprodukten zu interagieren, die an Tumorprogression beteiligt sind. Pathway-Gene können auch Zielgen- und/oder Fingerprint-Gen-Charakteristika aufweisen.

4. Beschreibung der Zeichnungen

1 ist ein Northern-Blot, der die differentielle Regulierung des 030-Gens bestätigt. Gesamt-RNA (12 &mgr;g/Spur), erhalten von F1- (Spur 1 und 3) und F10- (Spur 2 und 4) Melanom-Zellkulturen wurde mit einer cDNA-Sonde hybridisiert, die durch zufälliges Markieren einer reamplifizierten romy030-Bande hergestellt wurde (vgl. Materialien und Methoden Abschnitt 6.1, infra). Die romy030-Sonde identifiziert eine RNA-Bande von etwa 3 kb, entsprechend einer fomy030-mRNA.

2 stellt die Nukleotidsequenz der romy030-Bande dar (SEQ ID NO: 1).

3A und 3B zeigen die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Klons fomy030 (SEQ ID NO: 2 [Nukleotidsequenz] und SEQ ID NO: 3 [Aminosäuresequenz]), abgeleitet von fomy030-mRNA.

4 ist eine Northern-Blot-Analyse, die die differentielle Regulierung des fomy030-Gens bestätigt. Spur 1 ist B16 F1, Spur 2 ist B16 F10, und Spuren 3–6 sind B16 H5, B16 H6, B16 H7 und B16 H8.

5 ist eine Darstellung der Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des cDNA-Klons von fohy030 (SEQ ID NO: 6 [Nukleotidsequenz] und SEQ ID NO: 7 [Aminosäuresequenz]).

6 zeigt einen Vergleich der Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen eines anderen cDNA-Klons von fohy030 (SEQ ID NO: 8 [Nukleotidsequenz] und SEQ ID NO: 9 [Aminosäuresequenz]).

In den 3A und B ist die Nukleotidsequenz beginnend am ersten Nukleotid numeriert, wobei die Nukleotidsequenz in den 5 und 6 beginnend mit dem ATG-Startkodon numeriert ist.

5. Detaillierte Beschreibung der Erindung

Verfahren zur Diagnose von Tumorprogression, einschließlich Tumorprogression bei metastatischen Erkrankungen in Zellen, die an humanen Tumoren beteiligt sind. Solche humanen Tumoren können z. B. einschließen: humane Melanome, Brust, gastrointestinale Tumoren wie Ösophageal-, Magen-, Zwölffingerdarm-, Kolon-, kolorektal- und Rektalkrebs, Prostata-, Blasen-, Hoden-, Eierstock-, Uterus-, Cervix-, Gehirn-, Lungen-, Bronchial-, Kehlkopf-, Rachen-, Leber-, Pankreas-, Schilddrüsen-, Knochen-, verschiedene Arten von Hautkrebs und andere neoplastische Zustände wie Leukämien, Lymphome. Die Erfindung beruht teilweise auf der Auswertung und Expression und Funktion aller Gene, die in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen und/oder verglichen mit Tumorzellen in einem anderen Stadium der Tumorprogression, differentiell exprimiert werden. Dies ermöglicht die Definition von Krankheits-Pathways und die Identifizierung von Zielen in solchen Pathways, die zur Diagnose, Vorbeugung und Behandlung von Tumorprogression nützlich sind, einschließlich der Tumorprogressionserkrankungen, an denen metastatische neoplastische Erkrankungen beteiligt sind.

Mit "Zielgene" und/oder "Fingerprint-Gene" bezeichnete Gene werden beschrieben, die in Tumorzellen, verglichen zu ihrer Expression in normalen Zellen oder verglichen mit ihrer Expression in Tumorzellen, die sich in einem anderen Stadium der Tumorprogression befinden, differentiell exprimiert werden. Zusätzlich werden als "Pathway-Gene" bezeichnete Gene beschrieben, deren Genprodukte eine Fähigkeit zeigen, mit Genprodukten zu interagieren, die an der Tumorprogression beteiligt sind, einschließlich Tumorprogressionserkrankungen, an denen metastatische neoplastische Erkrankungen beteiligt sind. Pathway-Gene können zusätzlich Charakteristika von Fingerprint- und/oder Zielgenen besitzen. Verfahren zur Identifizierung solcher Fingerprint-, Ziel- und Pathway-Gene werden ebenfalls beschrieben.

Weiterhin werden beschrieben die Genprodukte solcher Fingerprint-, Ziel- und Pathway-Gene in Abschnitt 5.2.2, Antikörper gegen solche Genprodukte in Abschnitt 5.2.3, ebenso wie Zell- und Tier-basierende Modelle von Tumorprogressionserkrankungen, zu denen solche Genprodukte beitragen können, in Abschnitt 5.2.4.

Ebenfalls nachstehend beschrieben werden Verfahren zur prognostischen und diagnostischen Auswertung von Tumorprogression und Erkrankungen, an denen Tumorprogression beteiligt ist, einschließlich metastatischer Erkrankungen, und weiterhin zur Identifizierung von Patienten, die eine Prädisposition für solche Erkrankungen tragen.

5.1 Identifizierung differentiell exprimierter Gene

Es werden Verfahren zur Identifizierung von differentiell exprimierten Genen beschrieben, die an Tumorprogression beteiligt sind. Es existiert eine Anzahl von Stadien, in denen sich die differentielle Expression solcher Gene zeigen kann. Die differentielle Expression kann in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen, oder in Tumorzellen in anderen Stadien der Tumorprogression auftreten. Es können z. B. Gene identifiziert werden, die in präneoplastischen gegenüber neoplastischen Zellen differentiell exprimiert werden. Solche Gene können z. B. Gene einschließen, die die ungehinderte Zellproliferation oder die Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe fördern, die beide als Anzeichen des neoplastischen Stadiums angesehen werden. Weiterhin kann differentielle Expression in gutartigen (z. B. nicht-malignen) Tumorzellen gegenüber metastatischen malignen Tumorzellen auftreten. Weiterhin kann differentielle Expression auch in Zellen innerhalb eines dieser Stadien auftreten (z. B. prä-neoplastisch, neoplastisch und metastatisch) und kann z. B. einen Unterschied im Schweregrad der Tumorprogression oder der Aggressivität einer Zelle, verglichen mit der Aggressivität einer anderen Zelle im gleichen Stadium, anzeigen.

Verfahren zur Identifizierung solcher differentiell exprimierter Gene werden nachfolgend in Abschnitt 5.1.1 beschrieben. Verfahren zur weiteren Charakterisierung solcher differentiell exprimierter Gene und zu ihrer Einordnung als Ziel- und/oder Fingerprint-Gene werden nachfolgend in Abschnitt 5.3 dargestellt.

Der hier verwendete Begriff "differentielle Expression" bezieht sich sowohl auf quantitative als auch qualitative Unterschiede im zeitlichen und/oder gewebe-abhängigen Expressionsmuster der Gene. Somit kann ein differentiell exprimiertes Gen eine qualitativ aktivierte oder vollständig inaktivierte Expression in z. B. normalen gegenüber Tumorprogressionsstadien, in Zellen innerhalb verschiedener Tumorprogressionsstadien oder innerhalb von Zellen in einem einzigen gegebenen Tumorprogressionsstadium zeigen. Solch ein qualitativ reguliertes Gen wird in einem gegebenen Stadium ein Expressionsmuster zeigen, welches in einem solchen Stadium durch Standardtechniken nachweisbar ist, aber in den beiden miteinander verglichenen Stadien nicht nachweisbar ist.

Der Begriff "nachweisbar" bezieht sich auf eine RNA-Expressionshöhe, die mit den Standardtechniken Differential Display, RT (reverse Transkriptase)-gekoppelter PCR, Northern- und/oder RNase-Schutzanalysen nachweisbar ist.

Alternativ dazu kann ein differentiell exprimiertes Gen eine abweichende Expressionshöhe zeigen, d. h., die in normalen gegenüber Tumorprogressionsstadien, in Zellen in unterschiedlichen Tumorprogressionsstadien oder innerhalb von Zellen innerhalb eines einzigen Tumorprogressionsstadiums quantitativ erhöht oder vermindert ist.

Das Ausmaß, in dem sich die Expression unterscheidet, muss nur groß genug sein, um durch Standard-Charakterisierungsverfahren sichtbar gemacht werden zu können, wie z. B. das nachstehend beschriebene Verfahren des Differential Displays. Andere Standard-Charakterisierungsverfahren, durch die Expressionsunterschiede sichtbar gemacht werden können, umfassen quantitative RT (reverse Transkriptase)-gekoppelte PCR, Northern-Analysen und RNase-Schutz-Techniken, sind aber nicht auf diese beschränkt.

Differentiell exprimierte Gene können weiter als Zielgene und/oder Fingerprint-Gene beschrieben werden. Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Gen" bezieht sich auf ein differentiell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster als Teil eines prognostischen oder diagnostischen Markers zur Auswertung von Tumorprogression verwendet werden kann, oder welches alternativ in Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden kann, die nützlich zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumorprogression und Tumorprogressionserkrankungen sind, einschließlich metastatischer Erkrankungen. Ein Fingerprint-Gen kann auch die Charakteristika eines Zielgens oder eines Pathway-Gens (siehe nachfolgend Abschnitt 5.2) besitzen.

Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Muster" bezieht sich auf das Muster, das erzeugt wird, wenn das Expressionsmuster einer Reihe (von zwei bis zu allen Fingerprint-Genen, die für ein gegebenes Stadium existieren) von Fingerprint-Genen bestimmt wird. Ein Fingerprint-Muster kann in denselben diagnostischen, prognostischen und Verbindungs-Identifizierungsverfahren wie die Expression eines einzelnen Fingerprint-Gens verwendet werden.

Der hier verwendete Begriff "Zielgen" bezieht sich auf ein differentiell exprimiertes Gen, welches so an der Tumorprogression beteiligt ist, dass die Modulierung der Zielgen-Expressionshöhe oder der Aktivität des Genprodukts des Zielgens, die Symptome von Erkrankungen, an denen Tumorprogression beteiligt ist, verhindern und/oder lindern kann. Tumorprogressionserkrankungen schließen z. B. Erkrankungen ein, die an humanen Tumoren beteiligt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf z. B. humane Melanome, Brust, Gastrointestinalkrebs wie Ösophageal-, Magen-, Kolon-, Eingeweide-, Kolorektalund Rektalkrebs, Prostata-, Blasen-, Hoden-, Eierstock-, Uterus-, Cervix-, Gehirn-, Lungen-, Bronchial-, Kehlkopf-, Rachen-, Leber-, Pankreas-, Schilddrüsen-, Knochen-, verschiedene Arten von Hautkrebs und Leukämie, Lymphome. Ein Zielgen kann auch die Charakteristika eines Fingerprint-Gens und/oder eines Pathway-Gens (wie nachstehend in Abschnitt 5.2 beschrieben) besitzen.

5.1.1. Verfahren zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene

Eine Vielzahl von Verfahren kann zur Identifizierung von Genen, die an Tumorprogression beteiligt sind, verwendet werden. In Abschnitt 5.1.1.1 werden experimentelle Paradigmen beschrieben, die zur Erzeugung von Sondenmolekülen zur Identifizierung solcher Gene verwendet werden können. In Paradigma-Kategorien erzeugtes Material kann bezüglich der Anwesenheit differentiell exprimierter Gensequenzen, wie nachfolgend in Abschnitt 5.1.1.2 diskutiert, charakterisiert werden.

5.1.1.1 Paradigmen zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene

Es werden Paradigmen beschrieben, die Modelle von Tumorprogressionsstadien darstellen. Diese Paradigmen können zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die in normalen Zellen gegenüber Zellen in Tumorprogressionsstadien, in Zellen innerhalb verschiedener Tumorprogressionsstadien oder innerhalb von Zellen innerhalb eines einzelnen gegebenen Tumorprogressionsstadiums differentiell exprimiert werden.

Die hier beschriebenen Paradigmen umfassen mindestens zwei Gruppen von Zellen eines gegebenen Zelltyps, bevorzugt genetisch übereinstimmende Zellen (d. h. Zellen, die von Varianten der gleichen Zelllinie, oder Zellen, die von einer individuellen oder biologischen Probe abgeleitet sind), deren Expressionsmuster im Hinblick auf differentielle Expression verglichen und analysiert werden. Verfahren zur Analyse von Paradigmen-Material werden nachfolgend in Abschnitt 5.1.1.2 beschrieben.

Sobald ein bestimmtes Gen durch die Verwendung eines Paradigmas identifiziert wurde, kann sein Expressionsmuster weiter charakterisiert werden, z. B. durch Untersuchung seiner Expression in einem anderen Paradigma. Ein Gen kann z. B. in einer Weise reguliert werden, d. h. es kann in einem gegebenen Paradigma ein differentielles Gen-Expressionsmuster zeigen, kann aber in einem anderen Paradigma unterschiedlich reguliert sein. Daher kann die Verwendung multipler Paradigmen hilfreich sein, die Funktionen und die relative Wichtigkeit bestimmter Gene bei der Tumorprogression zu unterscheiden.

In einer Ausführungsform eines solchen Paradigmas, hier als das "in vitro"-Paradigma bezeichnet, können Zelllinien zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die in Tumorprogressionsstadien differentiell exprimiert werden. Differentiell exprimierte Gene werden, wie hier beschrieben, durch Vergleichen der Muster der Genexpression zwischen experimentellen und Kontrollbedingungen nachgewiesen. In solch einem Paradigma werden genetisch übereinstimmende Tumorzelllinien (z. B. Varianten derselben Zelllinie) allgemein verwendet. Beispielsweise kann das Gen-Expressionsmuster von zwei Varianten von Zelllinien verglichen werden, wobei eine Variante Charakteristika eines Tumorprogressionsstadiums zeigt, während die andere Variante Charakteristika eines anderen Tumorprogressionsstadiums zeigt. Alternativ können zwei variante Zelllinien, die beide Charakteristika des gleichen Tumorprogressionsstadiums, aber abweichende Stufen des Schweregrads der Tumorprogressionserkrankung oder der Aggressivität zeigen, verglichen werden. Weiterhin können genetisch. übereinstimmende Zelllinien verwendet werden, wobei eine davon Charakteristika eines Tumorprogressionsstadiums zeigt, während die andere einen normalen zellulären Phänotyp zeigt.

Die hier verwendeten varianten Zelllinien können Charakteristika der Tumorprogression zeigen, wie z. B. ein hohes oder niedriges Potential zur Metastasierung, das sich auf die Wahrscheinlichkeit bezieht, mit der eine Zelle zur Entstehung von Tumorgewebe in einer entfernten Region des Körpers führen wird. Alternativ dazu können eine oder mehrere solcher varianter Zelllinien prä-neoplastische Charakteristika oder Charakteristika zeigen, die im allgemeinen mit einem oder mehreren neoplastischen Zellphänotypen assoziiert sind, wie z. B. Zellproliferation oder Invasionsphänotypen.

Gemäß dieses Aspektes der Erfindung werden die Zelllinien-Varianten unter geeigneten Bedingungen kultiviert, geerntet. Die RNA wird isoliert und auf differentiell exprimierte Gene analysiert, wie nachfolgend ausführlich in Abschnitt 5.1.1.2 beschrieben.

Beispiele für Zelllinien, die als Teil solcher in vitro-Paradigmen verwendet werden können, schließen Varianten von Melanoma-Zelllinien ein, sind aber nicht darauf beschränkt, wie z. B. die murine Melanom B16 F1-Zelllinie, die ein niedriges metastatisches Potential zeigt, und die Melanom B16 F10-Zelllinie, die ein hohes metastatisches Potential zeigt (Fidler, I. J., 1973, Nature New Biol. 242: 148–149); humane Kolon-Zelllinien wie z. B. KM12c (Tumorzelllinie mit niedrigem metastatischem Potential) und die KM20L4 (Tumorzelllinie mit hohem metastatischem Potential; Morikawa, K. et al., 1988, Cancer Research 48: 1943– 1948); Prostatatumorzelllinien wie z. B. DU145 (nicht-metastatische Tumorzelllinie) und PC-3-M (Tumorzelllinie mit hohem metastatischem Potential; Karmali, R. A. et al., 1987, Anticancer Res. 7: 1173–1180, und Koziowski, J. M. et al., 1984, Cancer Research 44: 3522– 3529); und Brustkarzinom-Tumorzelllinien wie z. B. MCF-7 (nicht-metastatische Tumorzelllinie) und MDA-MB-435 (Tumorzelllinie mit hohem metastatischem Potential; Watts, C. K. et al., 1994, Breast Cancer Res. Treat. 31: 95–105 und Rose, D. P. et al., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85: 1743–1747).

Wie in dem im nachfolgenden Abschnitt 6 gezeigten Beispiel wurde dieses Paradigma erfolgreich verwendet, um ein Gen zu identifizieren, welches hier als 030-Gen bezeichnet wird, welches in Zellen mit einem hohen metastatischen Potential differentiell exprimiert wird, verglichen mit Zellen, die ein niedriges metastatisches Potential zeigen. Insbesondere wird das 030-Gen in Zellen mit einem niedrigen metastatischen Potential vielfach höher exprimiert, verglichen mit Zellen, mit einem hohen metastatischen Potential.

In einem zweiten Paradigma, hier in vivo-Paradigma genannt, können Tiermodelle von Tumorprogressionserkrankungen verwendet werden, differentiell exprimierte Gensequenzen zu entdecken. Der in vivo-Charakter solcher Tumorprogressionsmodelle kann die analogen Reaktionen lebender Patienten vorhersagen.

Eine Vielzahl von Tumorprogressions-Tiermodellen kann als Teil der in vivo-Paradigmen verwendet werden. Tiermodelle der Tumorprogression können hergestellt werden durch Passage von Tumorzellen in Tieren (z. B. in Mäusen), die zum Auftreten von Tumoren in diesen Tieren führt.

Zusätzliche Tiermodelle, von denen einige abweichende Tumorprogressionscharakteristika zeigen können, können von den oben beschriebenen Ausgangstiermodellen hergestellt werden. Tumoren, die in den Ausgangstieren entstehen, können entfernt und in vitro gezüchtet werden. Zellen aus diesen in vitro-Kulturen können dann in Tieren passagiert werden und Tumoren, die aus dieser Passage entstehen, isoliert werden. RNA aus Prä-Passagezellen und Zellen, die nach einer oder mehreren Passage-Runden isoliert wurden, können dann hinsichtlich isolierter und differentieller Expression analysiert werden. Die differentielle Expression kann mit der Expression des Potentials zur Metastasierung solcher Zellen verglichen werden. Diese Zellen können jetzt Zellen aus verschiedenen Tumorprogressionsstadien oder Zellen innerhalb eines gegebenen Tumorprogressionsstadiums, die verschiedene Schweregrade oder Aggressivität zeigen, darstellen. Solche Passagierungstechniken können jede der oben für die in vitro-Paradigmen beschriebenen varianten Zelllinien verwenden.

Zusätzlich schließen Tiermodelle der Tumorprogression, die für ein solches in vivo-Paradigma verwendet werden können, jedes der nachfolgend in Abschnitt 5.7.1 beschriebenen Tiermodelle ein. Andere Modelle schließen ein transgenes Mausmodell für Melanom (Mintz, B. und Silvers, W. K., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8817–8812), transgene Mäuse, die spezifisch adenomatöse Poliposis coli (APC)-Genmutationen tragen (Fodde, R. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8969–8973) und die transgene Maus, in der das Mamm-ary-Tumorvirus LTR/c-myc-Gen aberrant exprimiert wird (Leder, A. et al., 1986, Cells 45: 485–495), ein.

Ein drittes Paradigma, welches hier als "Gewebeproben-Paradigma " bezeichnet wird, verwendet Proben aus chirurgischen Eingriffen und Biopsie-Gewebeproben. Solche Gewebeproben können Normalgewebe sein, primäre, sekundäre oder metastatische Tumoren, von Patienten, die sich einer chirurgischen Behandlung unterzogen haben für Erkrankungen, an denen Tumorprogression beteiligt ist, wie z. B. Melanome, Kolonkarzinome, Lungenkarzinome, Prostatakrebs und Brustkrebs.

Chirurgische Gewebeproben können unter Standardbedingungen durch Einfrieren und Lagern in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden (vgl. Karmali, R. A. et al., 1983, Br. J. Cancer 48: 689–696). RNA aus Zellen aus Gewebeproben wird z. B. durch differentielle Zentrifugation von homogenisiertem Gewebe isoliert und auf differentielle Expression im Vergleich zu anderen Zellen aus Gewebeproben, bevorzugt zu Zellen, die vom gleichen Patienten erhalten worden sind, analysiert.

In Paradigmen, die zur Identifizierung von Genen bestimmt sind, die an der Tumorprogression beteiligt sind, können Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie eine verbessernden Wirkung auf die Symptome der Tumorprogression besitzen, auch in Paradigmen verwendet werden, differentiell exprimierte Gene nachzuweisen. Solche Verbindungen können bekannte Therapeutika, als auch Verbindungen, die aufgrund ihrer schädlichen Nebenwirkungen nicht als Therapeutika nützlich sind, einschließen. So können z. B. Tumorzellen, die wie in diesem Abschnitt beschrieben kultiviert werden, einer dieser Substanzen ausgesetzt werden und verglichen zu unbehandelten Tumorzellen auf differentielle Genexpression analysiert werden, gemäß dem nachfolgend in Abschnitt 5.1.1.2 beschriebenen Verfahren. Grundsätzlich kann jedoch gemäß des Paradigmas jeder Zelltyp, der an der Tumorprogression und Krankheiten daraus beteiligt ist, in jedem Stadium des Tumorprogressions-Prozesses mit diesen Verbindungen behandelt werden.

Zellen, die an der Tumorprogression beteiligt sind, können auch mit unbeteiligten Zellen (z. B. Fibroblasten), die mit der Verbindung behandelt wurden, verglichen werden, so dass generische Effekte auf die Genexpression, die nicht auf die Krankheit oder ihre Behandlung bezogen sind, identifiziert werden können. Solche generischen Effekte können sich z. B. in Veränderungen der Genexpression zeigen, die den Testzellen und den unbeteiligten Zellen nach Behandlung mit der Verbindung gemeinsam sind.

Anhand dieser Verfahren können die Gene und Genprodukte, auf die diese Verbindungen wirken, identifiziert werden, und in den nachfolgend beschriebenen Assays zur Identifizierung neuer therapeutischer Verbindungen zur Hemmung der Tumorprogression und zur Behandlung von Tumorprogressionserkrankungen, metastatische Erkrankungen eingeschlossen, verwendet werden.

5.1.1.2 Analyse von Material aus Paradigmen

Zur Identifizierung differentiell exprimierten Gene kann RNA, entweder Gesamt-RNA oder mRNA aus Zellen isoliert werden, die in Paradigmen, wie vorher in Abschnitt 5.1.1.1 beschrieben, verwendet werden. Jede Technik zur Isolierung von RNA, die nicht gegen die Isolierung von mRNA selektiert, kann verwendet werden, um solche RNA-Proben aufzureinigen; vgl. Ausubel, F. M. et al., Hrsg., 1987–1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York. Zusätzlich können große Zahlen von Gewebeproben verarbeitet werden durch Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. der Ein-Schritt-RNA-Isolierungsprozess von Chomczynski, P. (1989, US-PS 4,843,155).

Transkripte innerhalb der gesammelten RNA-Proben, die RNA differentiell exprimierten Gene darstellt, können durch Verwendung einer Vielzahl von Methoden, die dem Fachmann gut bekannt sind, identifiziert werden. Zum Beispiel Differentielles Screening (Tedder, T. F. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 208–212), subtraktive Hybridisierung (Hedrick, S. M. et al., 1984, Nature 308: 149–153; Lee, S. W. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2825) und, bevorzugt Differential display (Liang,. P. und Pardee, A. B., 1993, US-PS 5,262,311) können verwendet werden zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die von differentiell exprimierten Genen abgeleitet sind.

Differentielles Screening schließt das doppelte Screening einer cDNA-Bibliothek ein, bei dem eine Kopie der Bibliothek mit einer Gesamtzell-cDNA-Sonde gescreent wird, die der mRNA-Population eines Zelltyps entspricht, während eine doppelte Kopie der cDNA-Bibliothek mit einer Gesamt-cDNA-Sonde gescreent wird, die der mRNA-Population eines zweiten Zelltyps entspricht. So kann z. B. eine cDNA-Sonde einer Gesamtzell-cDNA-Sonde eines Zelltyps oder Gewebes, das von einem Kontrollpatienten abgeleitet wurde, entsprechen, während die zweite cDNA-Sonde der Gesamtzell-cDNA-Sonde des gleichen Zelltyps entsprechen kann, der von einem Test-Patienten abgeleitet wurde. Klone, die mit einer aber nicht mit der anderen Sonde hybridisieren, stellen potentiell Klone dar, die im interessierenden Zelltyp in Kontroll- gegenüber Test-Versuchspersonen von differentiell exprimierten Genen abgeleitet sind.

Methoden der subtraktiven Hybridisierung umfassen im allgemeinen die Isolierung von mRNA aus zwei verschiedenen Quellen, z. B. Kontroll- und Test-Gewebe, die Hybridisierung der mRNA oder der einzelsträngigen, von isolierter mRNA revers transkribierten cDNA, und das Entfernen aller hybridisierten und daher doppelsträngigen Sequenzen. Die verbleibenden, nicht-hybridisierten, einzelsträngigen cDNAs stellen möglicherweise Klone dar, die von Genen abgeleitet sind, die in beiden mRNA-Quellen differentiell exprimiert werden. Solche einzelsträngigen cDNAs werden dann als Ausgangsmaterial zur Herstellung einer Bibliothek verwendet, die Klone umfasst, die von differentiell exprimierten Genen abgeleitet sind.

Die Technik des Differential Displays beschreibt ein Verfahren, das die bekannte Polymerase-Kettenreaktion verwendet (PCR; das experimentelle Vorgehen wird beschrieben in Mullis, K. B., 1987, US-PS 4,683,202), welche die Identifizierung von Sequenzen ermöglicht, die von differentiell exprimierten Genen abgeleitet sind. Zunächst wird isolierte RNA revers in einzelsträngige cDNA transkribiert unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind. Primer für die reverse Transkriptase-Reaktion können Oligo dT-enthaltende Primer, bevorzugt vom nachstehend beschriebenen 3'-Primer-Typ-Oligonukleotid einschließen, sind aber darauf nicht beschränkt. Danach verwendet dieses Vertahren, wie nachfolgend beschrieben, PCR-Primerpaare, die die Amplifizierung von Klonen ermöglichen, die eine zufällige Auswahl innerhalb einer gegebenen Zelle anwesenden RNA-Transkripten darstellt. Die Verwendung verschiedener Primer-Paare ermöglicht es, dass jedes der in einer Zelle anwesenden mRNA-Transkripte amplifiziert wird. Unter solchen amplifizierten Transkripten können diejenigen identifiziert werden, die von differentiell exprimierten Genen produziert werden.

Der 3'-Oligonukleotid-Primer der Primer-Paare kann einen Oligo dT-Anteil von 10–13 dT-Nukleotiden an seinem 5'-Ende, bevorzugt 11 Nukleotide enthalten, die an den Poly(A)-Schwanz der mRNA oder der komplementären Sequenz einer cDNA hybridisieren, die von einem mRNA Poly(A)-Schwanz revers transkribiert wurde. Um die Spezifität des 3'-Primers zu erhöhen, kann der Primer ein oder mehrere, bevorzugt 2 zusätzliche Nukleotide an seinem 3'-Ende enthalten. Da statistisch nur ein Anteil der mRNA-abgeleiteten Sequenzen, die in der interessierenden Probe anwesend sind, an solche Primer hybridisiert, ermöglichen die zusätzlichen Nukleotide, dass die Primer nur einen Teil der mRNA-abgeleiteten Sequenzen amplifizieren, die in der interessierenden Probe anwesend sind. Dies wird bevorzugt, da es eine genauere und vollständigere Sichtbarmachung und Charakterisierung jeder Bande, die amplifizierte Sequenzen darstellt, ermöglicht.

Der 5'-Primer kann eine Nukleotidsequenz enthalten, von der statistisch erwartet wird, dass sie an cDNA-Sequenzen, die vom interessierenden Gewebe abgeleitet sind hybridisieren kann. Die Nukleotidsequenz kann willkürlich gewählt werden. Der 5'-Oligonukleotid-Primer kann etwa 9 bis etwa 15 Nukleotide lang sein, wobei 13 Nukleotide bevorzugt werden.

Zusätzlich können willkürlich gewählte Primer-Sequenzen dazu führen, dass die amplifizierten partiellen cDNAs variabel lang sind, wodurch verschiedene Klone durch Verwendung von Standard-denaturierender Sequenzier-Gelelektrophorese aufgetrennt werden können. Es sollten PCR-Reaktionsbedingungen ausgewählt werden, die die Ausbeute und Spezifität des amplifizierten Produkts optimieren und zusätzlich amplifizierte Produkte mit Längen produzieren, die unter Verwendung von Standard-Gelelektrophorese-Techniken aufgetrennt werden können. Solche Reaktionsbedingungen sind dem Fachmann bekannt. Wichtige Reaktionsparameter schließen z. B. die Länge und die Nukleotidsequenz der Oligonukleotid-Primer, wie oben diskutiert, ein und die Temperatur des Anlagerungs- und Verlängerungsschritts und die Reaktionszeiten.

Das Muster der Klone, das durch reverse Transkription und Amplifizierung der mRNA zweier verschiedener Zelltypen entsteht, wird durch Sequenzier-Gelelektrophorese dargestellt und verglichen. Unterschiede in den beiden Bandenmustern zeigen potentiell differentiell exprimierte Gene an.

Sobald potentiell differentiell exprimierte Gensequenzen anhand oben beschriebener Massentechniken identifiziert wurden, sollte die differentielle Expression solcher möglicherweise differentiell exprimierter Gene bestätigt werden. Die Bestätigung kann z. B. durch bekannte Techniken wie Northern-Analyse, quantitative RT-gekoppelte PCR oder RNAse-Schutzassay durchgeführt werden.

Nach Bestätigung können die differentiell exprimierten Gene weiter charakterisiert und als Ziel- und/oder Fingerprint-Gene, wie nachfolgend in Abschnitt 5.1.4 beschrieben, identifiziert werden.

Durch Differential Display erhaltene amplifizierte Sequenzen differentiell exprimierter Gene können auch zur Isolierung vollständiger Klone des entsprechenden Gens verwendet werden. Der vollständige kodierende Teil des Gens kann ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand durch bekannte molekularbiologische Techniken isoliert werden. So kann z. B. das isolierte differentiell exprimierte amplifizierte Fragment markiert und zum Screenen einer cDNA-Bibliothek verwendet werden. Alternativ dazu kann das markierte Fragment zum Screening einer genomischen Bibliothek verwendet werden.

PCR-Technologie kann ebenfalls zur Isolierung vollständiger Gesamt-cDNA-Sequenzen verwendet werden. Wie vorstehend in diesem Abschnitt beschrieben, enden die durch Differential Display erhaltenen isolierten amplifizierten Genfragmente (etwa 10 Nukleotide lang, bevorzugt länger, etwa 15 Nukleotide) an ihrem 5'-Ende an einem zufälligen Punkt innerhalb des Gens und besitzen 3'-Termini an einer Position, die dem 3'-Ende des transkribierten Teils des Gens entspricht. Sobald Nukleotidsequenz-Information eines amplifizierten Fragments erhalten ist, kann der Rest des Gens (d. h. bei Verwendung von Differential Display das 5'-Ende des Gens) unter Verwendung z. B. einer RT-PCR erhalten werden.

In einer Ausführungsform eines solchen Verfahrens zur Identifizierung und Klonierung vollständiger Gensequenzen kann RNA nach Standardvorschriften aus einer geeigneten Gewebe- oder Zellquelle isoliert werden.

Mit der RNA kann dann eine reverse Transkriptionsreaktion ausgeführt werden unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, der komplementär zur mRNA ist, die dem amplifizierten klonierten Fragment entspricht, zum "Priming" der Synthese des ersten Strangs. Da der Primer anti-parallel zur mRNA ist, wird die Verlängerung in Richtung des 5'-Endes der mRNA fortschreiten. An das entstehende RNA/DNA-Hybrid kann dann unter Verwendung einer standardmäßigen Terminale Transferase-Reaktion ein Guaninschwanz angehängt, das Hybrid mit RNAse H verdaut und die Synthese des zweiten Strangs mit einem Poly-C-Primer "geprimt" werden. Unter Verwendung der beiden Primer wird der 5'-Teil des Gens durch PCR amplifiziert. Die erhaltenen Sequenzen können zur Herstellung einer vollständigen cDNA der erfindungsgemäßen differentiell exprimierten Gene isoliert und mit zuvor isolierten Sequenzen rekombiniert werden. Zur Übersicht über Klonierungsstrategien und rekombinanter DNA-Techniken vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates und Wiley Intersciences, N.Y.).

5.2 Verfahren zur Identifizierung von Pathway-Genen

Es werden hier Verfahren zur Identifizierung von Pathway-Genen beschrieben. Der hier verwendete Begriff "Pathway-Gen" bezieht sich auf ein Gen, dessen Genprodukt die Fähigkeit zeigt, mit Genprodukten, die an Tumorprogression beteiligt sind, zu interagieren. Ein Pathway-Gen kann differentiell exprimiert sein, und kann deshalb die Charakteristika eines Ziel- und/oder Fingerprint-Gens haben.

Jedes Verfahren, das zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen geeignet ist, kann zur Identifizierung von Pathway-Genprodukten verwendet werden, durch Identifizierung von Interaktionen zwischen Genprodukten und Genprodukten, von denen bekannt ist, dass sie an Tumorprogression und Tumorprogressionserkrankungen, einschließlich metastatischen Erkrankungen, beteiligt sind. Solche bekannten Genprodukte können zelluläre oder extrazelluläre Proteine sein. Diese Genprodukte, die mit solchen bekannten Genprodukten interagieren, stellen Pathway-Genprodukte und die Gene, die für sie kodieren, stellen Pathway-Gene dar.

Co-Immunpräzipitation, Cross-Linking und Co-Aufreinigung durch Gradienten oder chromatographische Säulen sind die traditionellen Methoden, die verwendet werden können. Die Verwendung solcher Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Pathway-Genprodukten. Einmal identifiziert, kann ein Pathway-Genprodukt zusammen mit Standardtechniken dazu verwendet werden, das zugehörige entsprechende Pathway-Gen zu identifizieren. Es kann z. B. mindestens ein Anteil der Aminosäuresequenz des Pathway-Genprodukts mit dem Fachmann bekannten Techniken wie dem Edman-Abbau (vgl. z. B. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., Seiten 34–49) bestätigt werden. Die erhaltene Aminosäuresequenz kann als Anhaltspunkt zur Herstellung von Oligonukleotid-Gemischen verwendet werden, die zum Screening hinsichtlich Pathway-Gensequenzen verwendet werden können. Das Screening kann z. B. durch Standard-Hybridisierungs- oder PCR-Verfahren durchgeführt werden. Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotid-Gemischen und das Screening sind gut bekannt (vgl. Ausubel, supra, und PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., Hrsg. Academic Press, Inc., New York).

Zusätzlich können Verfahren verwendet werden, die zur gleichzeitigen Identifizierung von Pathway-Genen führen, die für das Protein kodieren, das mit einem Protein interagiert, das an Tumorprogression und Tumorprogressionserkrankungen beteiligt ist, metastatische Erkrankungen eingeschlossen. Diese Verfahren schließen z. B. das Hybridisieren von Expressionsbibliotheken mit markiertem Protein ein, von dem man weiß oder annimmt, dass es an metastatischen Erkrankungen beteiligt ist, wobei dieses Protein ähnlich wie im bekannten Verfahren der Antikörper-Hybridisierung von &lgr;gt11-Bibliotheken verwendet wird.

Ein Verfahren zum Nachweis von Protein-Interaktionen in vivo, das Hefe Two-Hybrid-System, wird detailliert zur Veranschaulichung und nicht beschränkend beschrieben. Eine Variante dieses Systems wurde beschrieben (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578–9582) und ist erhältlich von Clontech (Palo Alto, CA).

Bei Verwendung eines solchen Systems werden Plasmide konstruiert, die für zwei Hybridproteine kodieren: das erste Hybridprotein besteht aus einer DNA-bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors (z. B. das Aktivierungsprotein), fusioniert an ein bekanntes Protein, in diesem Fall ein Protein, von dem bekannt ist, dass es an Tumorprogression beteiligt ist; und das zweite Hybridprotein besteht aus der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors, fusioniert an ein unbekanntes Protein, das von einer cDNA kodiert wird, die als Teil einer cDNA-Bibliothek in dieses Plasmid kloniert wurde. Die Plasmide werden in einen Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert, der ein Reporter-Gen enthält (z. B. IacZ), dessen Expression durch die Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors reguliert wird. Die Hybridproteine allein können die Transkription des Reporter-Gens nicht aktivieren. Das DNA-bindende Hybridprotein kann die Transkription nicht aktivieren, da es die Funktion der Aktivierungsdomäne nicht bereitstellt und das Aktivierungsdomänen-Hybridprotein kann die Transkription nicht aktivieren, da es keine Domäne besitzt, die für die Bindung an seine Zielregion nötig ist (d. h., es kann nicht an die Transkriptionsaktivierungs-Bindestelle des Proteins binden). Die Interaktion zwischen dem DNA-bindenden Hybridprotein und dem von der Bibliothek kodierten Protein rekonstituiert den funktionellen Transkriptionsfaktor und führt zur Expression des Reporter-Gens, die in einem Test für das Reporter-Genprodukt nachgewiesen wird.

Das Two-Hybrid-System oder verwandte Verfahren können verwendet werden, Aktivierungsdomänen-Bibliotheken nach Proteinen zu durchsuchen, die mit einem bekannten Köder-Genprodukt interagieren. Beispielhaft und nicht beschränkend können Genprodukte (z. B. 030-Genprodukte), von denen bekannt ist, dass sie an Tumorprogression und Tumorprogressionserkrankungen, wie metastatischen Erkrankungen beteiligt sind, als Köder-Genprodukte verwendet werden. Gesamt-genomische oder cDNA-Sequenzen werden an die DNA fusioniert, die für eine Aktivierungsdomäne kodiert. Diese Bibliothek und ein Plasmid, welches für ein Hybrid des Köder-Genprodukts, fusioniert an die DNA-bindende Domäne, kodiert, werden in einen Hefe-Reporterstamm co-transformiert und die entstehenden Transformanten nach Transformanten durchsucht, die das Reporter-Gen exprimieren. Beispielsweise und nicht beschränkend kann das Köder-Gen so in einen Vektor kloniert werden, dass es translational an die DNA fusioniert ist, die für die DNA-bindende Domäne des GAL4-Proteins kodiert. Die Kolonien werden aufgereinigt und die (Bibliothek-) Plasmide, die für die Reporter-Genexpression verantwortlich sind, isoliert. Die Inserts in den Plasmiden werden sequenziert, um die von cDNA oder genomischer DNA kodierten Proteine zu identifizieren.

Eine cDNA-Bibliothek aus Gewebe- oder Zellmaterial, das Proteine exprimiert, die möglicherweise mit dem Köder-Genprodukt interagieren, kann mit Routineverfahren hergestellt werden. Gemäß dem spezifisch hier beschriebenen System wird die Bibliothek hergestellt, indem die cDNA-Fragmente so in einen Vektor inseriert werden, dass sie translational an die Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert sind. Diese Bibliothek kann zusammen mit dem Köder-Gen-GAL4-Fusionsplasmid in einen Hefestamm co-transformiert werden, der ein IacZ-Gen enthält, dessen Expression durch einen Promotor, der eine GAL4-Aktivierungssequenz enthält, kontrolliert wird. Ein von cDNA kodiertes Protein, das an die GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, welche mit dem Köder-Genprodukt interagiert, wird einen aktiven GAL4-Transkriptionsfaktor rekonstituieren und somit die Expression des lacZ-Gens antreiben. IacZ-exprimierende Kolonien können durch ihre blaue Farbe in Anwesenheit von X-gal nachgewiesen werden. cDNA-enthaltende Plasmide aus solch einer blauen Kolonie können dann gereinigt und dazu verwendet werden, das Köder-Genproduktinteragierende Protein unter Verwendung von Routineverfahren zu produzieren und zu isolieren.

Sobald ein Pathway-Gen identifiziert und isoliert wurde, kann es z. B. wie nachstehend in Abschnitt 5.3 beschrieben weiter charakterisiert werden.

5.3 Charakterisierung von differentiell exprimierten Pathway-Genen

Differentiell exprimierte Gene, die anhand der vorstehend in Abschnitt 5.1 diskutierten Verfahren identifiziert wurden, und Pathway-Gene, die anhand der vorstehend in Abschnitt 5.2 diskutierten Verfahren identifiziert wurden, als auch Gene, die auf andere Weise identifiziert wurden, können z. B. mit hier diskutierten Verfahren weiter charakterisiert werden. Solche Gene werden hier als "identifizierte Gene" bezeichnet.

Die hier beschriebenen Analysen ergeben Informationen bezüglich der biologischen Funktion der identifizierten Gene. Eine Auswertung der biologischen Funktion der differentiell exprimierten Gene wird zusätzlich deren Kennzeichnung als Ziel- und/oder Fingerprint-Gene ermöglichen.

Insbesondere wird eines der differentiell exprimierten Gene, dessen weitere Charakterisierung anzeigt, dass eine Modulierung der Expression des Gens oder eine Modulierung der Aktivierung des Genprodukts die Tumorprogression inhibieren kann, als Zielgen, wie in Abschnitt 5.1, supra, definiert, bezeichnet werden. Solche Zielgene und Zielgenprodukte werden zusammen mit den nachstehend beschriebenen den Mittelpunkt der nachstehend in Abschnitt 5.8 diskutierten Strategien zur Entdeckung von Verbindungen darstellen. Weiterhin können solche Zielgene, Zielgenprodukte und/oder modulierende Verbindungen als Teil der in Abschnitt 5.9, infra beschriebenen Behandlungsmethoden für Tumorprogressionserkrankungen verwendet werden.

Jedes der differentiell exprimierten Gene, dessen weitere Charakterisierung zeigt, dass solche Modulierungen nicht positiv auf die Tumorprogression einwirken, aber dessen Expressionsmuster zu einem Genexpressions-Fingerprint-Muster beiträgt, das z. B. in Wechselwirkung mit Tumorprogression steht, wird als Fingerprint-Gen bezeichnet werden. Fingerprint-Muster werden nachfolgend in Abschnitt 5.11.1 ausführlicher diskutiert. Es ist zu bemerken, dass jedes der Zielgene, wie auch alle oder ein Teil der Pathway-Gene, ebenfalls als Fingerprint-Gene agieren kann.

Es ist weiter zu bemerken, dass die Pathway-Gene auch anhand der hier beschriebenen Verfahren charakterisiert werden können. Jene Pathway-Gene, die anzeigen, dass sie differentiell exprimiert sind und dass die Modulierung der Expression des Gens oder eine Modulierung der Aktivität des Genprodukts die Tumorprogression hemmen oder Tumorprogression-assoziierte Symptome verbessern kann, werden ebenfalls als Zielgen bezeichnet werden. Solche Zielgene und Zielgenprodukte werden zusammen mit den vorstehend beschriebenen den Mittelpunkt der nachfolgend in Abschnitt 5.8 diskutierten Strategien zur Entdeckung von Verbindungen darstellen und können als Teil der nachfolgend in Abschnitt 5.9 beschriebenen Behandlungsverfahren verwendet werden.

Zusätzlich ist zu bemerken, dass die Charakterisierung eines oder mehrerer Pathway-Gene ein Fehlen von differentieller Expression aufzeigen kann, aber nichtsdestotrotz beweisen kann, dass die Modulierung der Aktivität oder Expression des Gens die Symptome der Tumorprogression verbessern kann. In solchen Fällen würden diese Gene und Genprodukte ebenfalls als Mittelpunkt der nachfolgend in Abschnitt 5.8 beschriebenen Strategien zur Entdeckung von Verbindungen betrachtet werden und können als Teil der nachfolgend in Abschnitt 5.9 beschriebenen Behandlungsverfahren verwendet werden.

In Fällen, in denen die Charakterisierung eines Pathway-Gens anzeigt, dass die Modulierung der Expression des Gens oder der Aktivität des Genprodukts die Tumorprogressionserkrankungen nicht verlangsamen kann, aber das Gen differentiell exprimiert wird und zu einem Genexpressions-Fingerprint-Muster beiträgt, welches in Wechselbeziehungen mit Tumorprogressionsstadien oder Erkrankungen wie metastatischen Erkrankungen steht, können solche Pathway-Gene zusätzlich als Fingerprint-Gene bezeichnet werden.

Eine Vielzahl von Techniken kann zur weiteren Charakterisierung der identifizierten Gene verwendet werden. Zunächst können die Nukleotidsequenzen der identifizierten Gene, die durch Standardtechniken erhalten werden können, zur weiteren Charakterisierung solcher Gene verwendet werden. Die Sequenz der identifizierten Gene kann z. B. Homologien zu einem oder mehreren bekannten Sequenzmotiven aufzeigen, die Informationen bezüglich der biologischen Funktion des identifizierten Genprodukts bereitstellen können.

Zweitens kann mit Standardverfahren eine Analyse der Gewebe- und/oder Zelltyp-Verteilung der von den identifizierten Genen produzierten mRNA durchgeführt werden. Solche Verfahren können z. B. Northern-Analysen, RT-gekoppelte PCR und RNAse-Schutztechniken einschließen. Solche Analysen zeigen, ob die identifizierten Gene in Geweben exprimiert werden, von denen man annimmt, dass sie zur Tumorprogression beitragen. Solche Analysen können ebenfalls quantitative Information bezüglich der Regulation des "steady state" der mRNA bereitstellen. Sie stellen auch Daten bereit, welches der identifizierten Gene bevorzugt in Geweben hoch reguliert wird, von denen man annimmt, dass sie zur Tumorprogression beitragen. Zusätzlich können Standard-in situ-Hybridisierungstechniken dazu verwendet werden, Informationen bereitzustellen, welche Zellen innerhalb eines gegebenen Gewebes das identifizierte Gen exprimieren. Solch eine Analyse kann Informationen bezüglich der biologischen Funktion eines identifizierten Gens verglichen zu gegebener Tumorprogression in Fällen bereitstellen, bei denen angenommen wird, dass nur ein Teil der Zellen innerhalb des Gewebes für die Erkrankung relevant ist.

Drittens können die Sequenzen der identifizierten Gene unter Verwendung von Standardverfahren zur genetischen Kartierung auf genetischen Karten verwendet werden, z. B. Maus (Copeland, N. G. und Jenkins, N. A., 1991, Trens in Genetics 7: 113–118) und menschliche Genkarten (Cohen, D. et al., 1993, Nature 366: 698–701). Solch eine Kartierungsinformation kann Information bezüglich der Wichtigkeit des Gens für humane Erkrankungen bereitstellen, z. B. durch Identifizierung von Genen, die innerhalb genetischer Regionen kartieren, in denen bekannte genetische Tumorprogressionserkrankungen kartieren.

Viertens kann die biologische Funktion der identifizierten Gene durch Verwendung von relevanten in vivo- und in vitro-Systemen genauer ausgewertet werden. in vivo-Systeme können Tiersysteme einschließen, die natürlicherweise Symptome der Tumorprogression wie z. B. metastatische Erkrankung zeigen, oder solche, die dazu entwickelt wurden, solche Symptome zu zeigen, sind aber nicht darauf beschränkt. Tumorprogressions-Tiermodelle können z. B. durch Injektion von Tumorzellen in Tiere wie z. B. Mäuse hergestellt werden, wobei einige der Zellen zur Entstehung von Tumoren in den behandelten Tieren führen werden. Zu den Zellen, die zu diesem Zweck verwendet werden können, gehören die in Abschnitt 5.1.1.1, supra beschriebenen Zellen, wie die B16-Zellvarianten.

Die Funktion identifizierter Genprodukte (z. B. 030-Genprodukte) kann bestimmt werden durch Transfektion von cDNAs, die für diese Genprodukte kodieren, in geeignete Zelllinien wie z. B. die B16 variante Zelllinie, und durch Analyse der Auswirkungen auf die Charakteristika der Tumorprogression. Die Funktion von Genen, die für die Progression humaner kolorektaler Krebsarten wichtig sind, werden unter Verwendung der KM12c (niedriges metastatisches Potential) und KM12L4 (hohes metastatisches Potential)-Zellen ausgewertet, die in Milzen von Nacktmäusen implantiert werden. Die Anzahl entstehender Lebertumoren wird bestimmt. Die Funktion von Genen, die unter Verwendung humaner kolorektaler Tumoren und deren Lebermetastasen isoliert werden, wird durch Expression des Gens in der geeigneten KM12-Variante ausgewertet. Zusätzlich wird die Funktion von Genen, die zur Progression von Prostata- und Brustkrebs wichtig sind, unter Verwendung von in Abschnitt 5.1.1.1, supra beschriebenen geeigneten Zelllinien ausgewertet. Die Funktion von Genen, die zur Progression von Melanomen, Kolon-, Prostata- und Brustkrebs wichtig ist, wird bei Menschen wichtigerweise unter Verwendung von Biopsiematerial aus Patienten, die sich einer chirurgischen Behandlung unterzogen haben ausgewertet, wie in Abschnitt 5.1.1, supra, beschrieben.

Solche Systeme können weiterhin transgene Tiersysteme wie in Abschnitt 5.7.1, infra, beschrieben einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. In vitro-Systeme können Zellbasierte Systeme einschließen, die Zelltypen umfassen, von denen bekannt ist oder von denen vermutet wird, dass sie zur Tumorprogression beitragen, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Zellen können Wildtypzellen oder Nicht-Wildtypzellen sein, die Modifikationen enthalten, von denen bekannt ist oder von denen man annimmt, dass sie zur Tumorprogression beitragen. Solche Systeme werden detailliert nachfolgend in Abschnitt 5.7.2 beschrieben. Das Verfahren zur Identifizierung und Isolierung des humanen Homologs des fomy030-Gens wird nachfolgend in Abschnitt 5.7.3 beschrieben.

Bei der weiteren Charakterisierung der biologischen Funktion der identifizierten Gene kann die Expression dieser Gene innerhalb der in vivo- und/oder der in vitro-Systeme moduliert, d. h. entweder über- oder unterexprimiert werden und der nachfolgende Effekt auf das System untersucht werden. Alternativ kann die Aktivität des Produkts des identifizierten Gens entweder durch Erhöhen oder Vermindern des Aktivitätsspiegels im interessierenden in vivo- und/oder in vitro-System moduliert und sein nachfolgender Effekt untersucht werden.

Mit solchen Charakterisierungen erhaltene Information kann relevante Verfahren zur Behandlung von Tumorprogression und Tumorprogressionserkrankungen vorschlagen, an denen das interessierende Gen beteiligt ist. Weiterhin können aus den durch solche Charakterisierung erhaltenen Informationen Verfahren zur Kontrolle der Ausbreitung von Tumorzellen hervorgehen, an denen das interessierende Gen beteiligt ist. Die Behandlung kann z. B. die Modulierung der Genexpression und/oder der Aktivität des Genprodukts einschließen. Die hier beschriebenen Verfahren zur Charakterisierung können aufzeigen, an welcher Stelle solch eine Modulierung einen Anstieg oder eine Abnahme der Expression oder der Aktivität des Gens oder des interessierenden Genprodukts involvieren sollte. Solche Verfahren zur Behandlung werden nachfolgend in Abschnitt 5.9 beschrieben.

5.4 Differentiell exprimierte und Pathway-Gene

Hier werden differentiell exprimierte Gene, wie in Abschnitt 5.1.1, supra, und Pathway-Gene, wie in Abschnitt 5.2, supra identifiziert, beschrieben.

Die differentiell exprimierten und Pathway-Gene der Erfindung sind nachfolgend in Tabelle 1 aufgelistet. Die Nukleotidsequenz des differentiell exprimierten fomy030-Gens ist in 2 und 3A und 3B gezeigt. Insbesondere stellt 2 die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) der amplifizierten cDNA-Bande dar, die zuerst durch Differential Display-Analyse identifiziert wurde, die hier romy030 genannt wird. 3A und 3B zeigen die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 2) eines fomy030-cDNA-Klons, der unter Verwendung einer romy030-Sonde isoliert wurde. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist ebenfalls in den 3A und 3B (SEQ ID NO: 3) gezeigt. 5 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NO: 6) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7) eines fohy030-cDNA-Klons, der unter Verwendung der gesamten Maus-fomy030-cDNA als Sondenmolekül isoliert wurde. 6 zeigt eine alternative Splicing-Form von fohy030 (SEQ ID NO: 8 und 9).

Tabelle 1 fasst Informationen bezüglich der weiteren Charakterisierung des differentiell exprimierten fomy030-Gens der Erfindung zusammen. Tabelle 2 führt E. coli-Klone auf, hinterlegt bei der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), die Sequenzen enthalten, die innerhalb der Gene von Tabelle 1 gefunden wurden.

In Tabelle 1 wird das Paradigma, das anfänglich zum Nachweis der differentiell exprimierten Gene verwendet wurde, unter der Spalte mit dem Titel "Paradigma des ursprünglichen Nachweises" beschrieben. In dieser Spalte zeigt "⇧", dass die Genexpression im angezeigten Zelltyp höher ist (d. h., es liegt eine größere "steady state"-Menge nachweisbarer mRNA vor, die von einem gegebenen Gen produziert wird), verglichen mit dem anderen Zelltyp, während "⇩" anzeigt, dass die Genexpression im angezeigten Zelltyp niedriger ist (d. h., es liegt eine niedrigere "steady state"-Menge nachweisbarer mRNA, die von einem gegebenen Gen produziert wird, vor), verglichen mit dem anderen Zelltyp. Wie unter dieser Spalte gezeigt, wurde das 030-Gen anfänglich über einen differentiellen Screen zwischen B16 F1 (Zellen mit niedrigem metastatischem Potential) und B16 F10 (Zellen mit hohem metastatischem Potential) identifiziert, in denen die 030-Genexpression in der Zelllinie B16 F10 mit hohem metastatischem Potential niedriger ist als in der B16 F1-Zelllinie mit niedrigem metastatischem Potential.

Die Spalte in Tabelle 1 mit dem Titel "Paradigma-Expressionsmuster" führt den Zelltyp auf, in dem Genexpression anfänglich nachgewiesen wurde. Im Fall des 030-Gens wurde Genexpression zuerst in Melanomzellen (d. h. B16) nachgewiesen. "Nachweisbar" bezieht sich hier auf mRNA-Spiegel, die über Standard-Differential Display, Northern, RT-gekoppelte PCR und/oder RNAse-Schutztechniken, die dem Fachmann bekannt sind, nachweisbar sind.

Zelltypen, in denen differentielle Expression nachgewiesen wurden, sind in Tabelle 1 unter der Spalte mit dem Titel "Zelltyp, in dem Expression nachgewiesen wurde" zusammengefasst. Im Fall des 030-Gens wurde Expression zusätzlich in Melanozyten nachgewiesen.

Zusätzlich werden in Fällen, in denen die Gene Nukleotidsequenzen enthalten, die ähnlich oder homolog zu Sequenzen sind, die in Nukleinsäure-Datenbanken gefunden werden, Referenzen zu solchen Ähnlichkeiten aufgelistet. Da das 030-Gen ein neues Gen ist, d. h., in den publizierten Datenbanken keine homologen Gensequenzen vorhanden sind, werden solche Referenzen nicht aufgelistet.

Schließlich sind Nukleotidsequenzen, die innerhalb der differentiell exprimierten Gene vorhanden sind, in den Abbildungen aufgelistet, die unter dem Titel "Seq." angezeigt sind. Im Fall des fomy030-Gens werden solche Sequenzen in 2 und 3A und 3B und für das fohy030-Gen in 5 und 6 gezeigt.

Die in Tabelle 1 aufgelisteten Gene können mit dem Fachmann bekannten Klonierungsverfahren erhalten werden, einschließlich der Verwendung geeigneter Sondenmoleküle zum Nachweis der Gene innerhalb einer geeigneten cDNA oder gDNA (genomische DNA)-Bibliothek, aber nicht darauf beschränkt; vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories). Sondenmoleküle für die hier beschriebenen neuen Sequenzen können direkt von den bei der NRRL, wie in Tabelle 2 gezeigt, hinterlegten isolierten Klone erhalten werden. Alternativ dazu können Oligonukleotid-Sonden für die neuen Gene unter Verwendung von dem Fachmann bekannter Verfahren, basierend auf den DNA-Sequenzen in 2, 3A, 3B, 5 und 6, synthetisiert werden.

Die Sonden können zum Screening von cDNA-Bibliotheken verwendet werden, die aus einer geeigneten Zelle oder Zelllinie, in der das Gen transkribiert wird, hergestellt wurden. Die hier beschriebenen in Melanozyten nachgewiesenen Gene, können z. B. aus einer cDNA-Bibliothek kloniert werden, die aus Melanozyten wie z. B. melan-c (Hodgkinson, C. A. et al., 1993, Cell 74: 395–404), den cDNA-Bibliotheken aus der humanen Melanom-Zelllinie A2058 (Clontech, Palo Alto, CA) und cDNA-Bibliotheken aus der murinen Melanom-Zelllinie K1735 (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert werden. Genomische DNA-Bibliotheken können aus jedem Material hergestellt werden.

TABELLE 1

Differentiell exprimierte und Pathway-Gene

Die nachfolgende Tabelle 2 führt einen bei der NRRL hinterlegten E. coli-Stamm auf, der einen isolierten Plasmid-fomy030-Klon enthält. Der Klon enthält eine fomy030-cDNA in einem pBlueScript SK- (Stratagen, La Jolla, CA) Vektor, der aus einer Maus-MclanozytencDNA-Bibliothek durch Screening mit einer romy030-Sonde isoliert wurde, wie nachfolgend im Abschnitt 6.2 beschrieben.

TABELLE 2

Der hier verwendete Begriff "differentiell exprimiertes Gen" (d. h. Ziel- und Fingerprint-Gen) oder "Pathway-Gen" bezieht sich (a) auf ein Gen, das mindestens eine der hier gezeigten DNA-Sequenzen (wie in den 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt) oder das in den in Tabelle 2, bei der NRRL hinterlegten Klonen enthaltenen ist; (b) auf jede DNA-Sequenz, die für eine der folgenden Aminosäuresequenzen kodiert, die von den folgenden DNA-Sequenzen kodiert werden: die hier gezeigten DNA-Sequenzen (wie in 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt), die in den Klonen, die bei der NRRL hinterlegt und in Tabelle 2 aufgelisteten sind enthalten sind oder die innerhalb der kodierenden Regionen der Gene, zu denen hier DNA-Sequenzen offenbart sind (wie in 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt), oder die zu den in Tabelle 2 aufgeführten und bei der NRRL hinterlegten Klonen gehören; (c) auf jede DNA-Sequenz, die an den Komplementärstrang von folgenden Sequenzen hybridisiert: hier beschriebene kodierende Sequenzen (wie in 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt), in den in Tabelle 2 aufgelisteten und bei der NRRL hinterlegten Klonen enthaltene Sequenzen, Sequenzen, die innerhalb der kodierenden Regionen der Gene, zu denen hier DNA-Sequenzen offenbart sind (wie in 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt), gehören unter hoch stringenten Bedingungen dazu, z. B. Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel, F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York, Seite 2.10.3). Die Sequenzen kodieren für ein Genprodukt, das funktionell zu einem von dem Gen aus (a) kodiertem Genprodukt äquivalent ist, und/oder zu (d) jeder DNA-Sequenz die an den Komplementärstrang folgender Sequenzen hybridisiert: hier beschriebene kodierende Sequenzen (wie in 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt); in den in Tabelle 2 aufgelisteten und bei der NRRL hinterlegten Klonen enthaltene Sequenzen; Sequenzen, die innerhalb der kodierenden Regionen der Gene, zu denen hier DNA-Sequenzen offenbart sind (wie in 2, 3A, 3B, 5 und 6 gezeigt). gehören unter weniger stringenten Bedingungen, wie mäßig stringenten Bedingungen, z. B. mit Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel, et al., 1989, supra) dazu, die noch für ein Genprodukt kodieren, daß funktionell äquivalent zu einem Genprodukt, dass von einem Gen (a) kodiert wird,

Es werden auch Nukleinsäuremoleküle, bevorzugt DNA-Moleküle, die an die DNA-Sequenzen (a) bis (d) des vorhergehenden Abschnitts hybridisieren und deshalb die Komplementärstränge dazu sind, beschrieben. Solche Hybridisierungsbedingungen können hoch oder weniger hoch stringent sein, wie vorstehend beschrieben. In Fällen, in denen die Nukleinsäuremoleküle Desoxyoligonukleotide sind ("Oligos"), beziehen sich hoch stringente Bedingungen z. B. auf Waschen in 6 × SSC/0,05% Natriumpyrophosphat bei 37°C (für 14-Basen-Oligos), 48°C (für 17-Basen-Oligos), 55°C (für 20-Basen-Oligos) und 60°C (für 23-Basen-Oligos). Diese Nukleinsäuremoleküle können als Zielgen-Antisensemoleküle wirken, die z. B. bei der Regulierung des Zielgens und/oder als Antisense-Primer bei Amplifizierungsreaktionen von Ziel-, Fingerprint- und/oder Pathway-Gen-Nukleinsäuresequenzen nützlich sind. Weiterhin können solche Sequenzen als Teil von Ribozym- und/oder Triple-Helix-Sequenzen verwendet werden, ebenfalls nützlich zur Regulierung des Zielgens. Weiterhin können solche Moleküle als Teile diagnostischer Verfahren verwendet werden, anhand derer Tumorprogressionserkrankungen nachgewiesen werden können.

Weiterhin werden (a) DNA-Vektoren, die eine der vorhergehenden kodierenden Sequenzen und/oder deren Komplemente (d. h. Antisense) enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, die eine der vorhergehenden kodierenden Sequenzen, operativ mit einem regulatorischen Element, das die Expression der kodierenden Sequenzen dirigiert, assoziiert enthalten; und (c) genetisch veränderte Wirtszellen, die eine der vorhergehenden kodierenden Sequenzen enthalten, die operativ mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das die Expression der kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle dirigiert, beschrieben. Die hier genannten regulatorischen Elemente schließen induzierbare und nicht-induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte Elemente ein, die die Expression antreiben und regulieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Erfindung umfasst Fragmente jeder der hier beschriebenen DNA-Sequenzen

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Gen-Sequenzen können Homologe dieser Gen-Sequenzen, die z. B. in anderen Spezies vorkommen können, bevorzugt menschliche Sequenzen in Fällen, in denen die oben beschriebenen Gen-Sequenzen nicht-menschliche Gen-Sequenzen sind, ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand durch gut bekannte molekularbiologische Verfahren identifiziert und isoliert werden.

Außerdem können an anderen genetischen Loci innerhalb des Genoms Gene existieren, die für Proteine kodieren, die übermäßige Homologie zu einer oder mehreren Domänen solcher Genprodukte aufweisen. Diese Gene können ebenfalls über ähnliche Verfahren identifiziert werden.

Die isolierte differentiell exprimierte Gensequenz kann z. B. markiert und zum Screening einer cDNA-Bibliothek verwendet werden, die aus mRNA des interessierenden Organismus hergestellt wurde. Wenn die cDNA-Bibliothek von einem anderen Organismus hergestellt wurde als von dem Organismus, von dem die markierte Sequenz abgeleitet wurde, dann werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen benützt. Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwendet werden, eine vom interessierenden Organismus abgeleitete genomische Bibliothek zu screenen, wiederum unter geeigneten stringenten Bedingungen. Deartige Bedingungen niedriger Stringenz sind dem Fachmann gut bekannt und unterscheiden sich in Abhängigkeit von dem spezifischen Organismus, von dem die Bibliothek und die markierten Sequenzen abgeleitet sind. Zur Anleitung bezüglich solcher Bedingungen vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y.).

Weiterhin kann eine zuvor unbekannte, differentiell exprimierte oder Pathway-Gen artige Sequenz isoliert werden mit PCR mit zwei degenerierten Oligonukleotid-Primerpools, die auf der Basis von Aminosäuresequenzen innerhalb des interessierenden Gens entworfen wurden. Die Matrize für die Reaktion kann cDNA sein, die durch reverse Transkription von mRNA erhalten wurde, die von humanen oder nicht-humanen Zelllinien oder Geweben präpariert wurde, von denen bekannt ist oder man annimmt, dass sie ein differentiell exprimiertes oder Pathway-Gen-Alle) exprimieren. Zur Bestätigung dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenzen eines differentiell exprimierten oder einer Pathway-Gen-artigen Nukleotidsequenz darstellen, können PCR-Produkte subkloniert und sequenziert werden.

Das PCR-Fragment kann dann zur Isolierung eines die gesamte Länge überspannenden Gesamt-cDNA-Klons anhand einer Vielzahl von Verfahren verwendet werden. Das amplifizierte Fragment kann z. B. markiert und zum Screening einer Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek verwendet werden. Alternativ dazu kann das markierte Fragment zum Screening einer genomischen Bibliothek verwendet werden.

Die PCR-Technologie kann auch zur Isolierung von cDNA-Sequenzen verwendet werden, die die Gesamtlänge überspannen. RNA kann mit z. B. Standardverfahren aus einer geeigneten Zell- oder Gewebequelle isoliert werden. Mit der RNA kann eine reverse Transkriptions-Reaktion durchgeführt werden unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, der für den größten Teil des 5'-Endes des amplifizierten Fragments zum "Priming" der Synthese des ersten Strangs spezifisch ist. Das entstehende RNA/DNA-Hybrid kann dann durch Guanine unter Verwendung einer standardmäßigen Terminalen Transferase-Reaktion verlängert, das Hybrid mit RNAse N verdaut, und die Synthese des zweiten Strangs durch einen Poly-C-Primer "geprimt" werden. Somit können cDNA-Sequenzen isoliert werden, die stromaufwärts des amplifizierten Fragments liegen. Zur Übersicht über die zu verwendenden Klonierungsstrategien vgl. z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y.).

In Fällen, in denen das differentiell exprimierte oder Pathway-Gen das normale oder Wildtyp-Gen ist, kann dieses Gen dazu verwendet werden, mutante Allele des Gens zu isolieren. Solch eine Isolierung ist bei Vorgängen oder Erkrankungen bevorzugt, von denen bekannt ist oder man weiß, dass sie eine genetische Basis besitzen. Mutante Allele können von Individuen isoliert werden, von denen bekannt ist oder von denen man annimmt, dass sie einen Genotyp besitzen, der zu Tumorprogressionssymptomen beiträgt. Die mutanten Allele und die Produkte des mutanten Allels können dann in den nachstehend beschriebenen therapeutischen und diagnostischen Testsystemen verwendet werden.

Eine cDNA eines mutierten Gens kann z. B. unter Verwendung von PCR, einem Verfahren, welches dem Fachmann gut bekannt ist, isoliert werden. In diesem Fall kann der erste cDNA-Strang durch Hybridisierung eines Oligo dT-Oligonukleotids an mRNA synthetisiert werden, die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt ist oder man annimmt, dass sie in einem Individuum exprimiert wird, das möglicherweise das mutante Allel trägt, und durch Verlängern des neuen Strangs durch reverse Transkriptase. Der zweite Strang der cDNA kann dann unter Verwendung eines Oligonukleotids synthetisiert werden, das spezifisch an das 5'-Ende des normalen Gens hybridisiert. Mit diesen beiden Primern wird das Produkt dann via PCR amplifiziert, in einen geeigneten Vektor kloniert und bekannten Methoden zur DNA-Sequenzanalyse unterworfen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des mutierten Gens mit der des normalen Gens kann die Mutation bzw. können die Mutationen, die für den Verlust oder die Veränderung der Funktion des mutierten Gens verantwortlich sind, bestätigt werden.

Alternativ dazu kann eine genomische oder cDNA-Bibliothek hergestellt und gescreent werden unter Verwendung von DNA bzw. RNA aus einem Gewebe, von dem bekannt ist oder man annimmt, dass es das interessierende Gen in einem Individuum exprimiert, von dem bekannt ist oder man weiß, das es das mutierte Allel trägt. Das normale Gen oder ein geeignetes Fragment davon kann markiert oder als Sondenmolekül verwendet werden, um das entsprechende mutierte Allel in der Bibliothek zu identifizieren. Der Klon, der dieses Gen enthält, kann dann anhand Routineverfahren gereinigt und wie in diesem Abschnitt beschrieben sequenziert werden.

Zusätzlich kann eine Expressionsbibliothek hergestellt unter Verwendung von DNA, die aus einem Gewebe isoliert oder cDNA, die aus einem Gewebe synthetisiert wurde, von dem bekannt ist oder man annimmt, dass es das interessierende Gen in einem Individuum, von dem bekannt ist oder man annimmt, dass es das mutierte Allel trägt, exprimiert. Auf diese Weise können Genprodukte, die von dem mutmaßlich mutierten Gewebe hergestellt werden, exprimiert und gescreent werden, unter Verwendung von Standard-Antikörper-Screening-Verfahren, mit Antikörpern, die gegen das normale Genprodukt gebildet wurden (vgl. z. B. Harlow, E. und Lane, Hrsg., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). In Fällen, in denen die Mutation zu einem exprimierten Genprodukt mit veränderter Funktion führt (z. B. als Ergebnis einer Missense-Mutation), wird angenommen, dass polyklonale Antikörper mit dem mutierten Genprodukt kreuzreagieren. Bibliotheks-Klone, die anhand ihrer Reaktion mit solchen markierten Antikörpern nachgewiesen werden, können gereinigt und wie vorhergehend in diesem Abschnitt beschrieben sequenziert werden.

Nimmt man das fomy030-Gen als Beispiel, so kann das humane homologe fomy030-Gen durch eine Vielzahl von Verfahren isoliert werden. Zunächst können Sequenzen, die man in fomy030-cDNA von Mäusen findet, als Hybridisierungssonden zum Nachweis humaner fomy030-Sequenzen verwendet werden. Dies kann beispielsweise durch Sondenhybridisierung von Southern Blots, die vollständige humane genomische DNA enthalten, mit einem markierten fomy030-Sondenmolekül durchgeführt werden. Sobald verifiziert ist, dass das verwendete Sondenmolekül das humane 030-Gen nachweist, kann der Fachmann jedes der Routineverfahren zur Isolierung des humanen Gens ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand verwenden.

In einem Verfahren können geeignete humane cDNA-Bibliotheken gescreent werden. Solche cDNA-Bibliotheken können z. B. cDNA-Bibliotheken humaner Melanozyten, humaner Retina und von fötalem humanen Gehirn einschließen. Humane Melanomzellen (wie z. B. SK-MEL-2, ATCC 68-HTB; SK-MEL-5, ATCC 70-HTB; SK-MEL-28, ATCC 72-HTB; G-361, ATCC 1424-CRL; und/oder HT-144 [63-HTB] Zellen) können z. B. durch Northern Blot-Analyse hinsichtlich 030-Expression gescreent werden. Bei Nachweis des 030-Transkripts können unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, cDNA-Bibliotheken aus RNA hergestellt werden, die aus der geeigneten Zelllinie isoliert wurde. Die humane cDNA-Bibliothek kann dann zur Isolierung humaner romy030-cDNA mit einem 030-Sondenmolekül gescreent werden. Dieses Verfahren wurde, wie nachstehend beschrieben, dazu verwendet, die in 5 und 6 gezeigten fohy030-cDNAs zu bestimmen.

Alternativ kann eine humane vollständige genomische DNA-Bibliothek mit 030-Sondenmolekülen gescreent werden. 030-positive Klone können sequenziert und weiterhin die Intron/Exonstruktur des humanen 030-Gens aufgeklärt werden. Sobald die genomische Sequenz erhalten ist, können basierend auf dieser Sequenz Oligonukleotid-Primer zur Isolierung humaner 030-cDNA z. B. über RT-gekoppelte PCR entworfen werden.

Die in diesen Ansätzen beschriebenen Verfahren sind Routineverfahren und wurden detailliert in den Abschnitten 5.1.1.2, 5.3 und 5.7.2 beschrieben.

5.5 Differentiell exprimierte Genprodukte und Pathway-Genprodukte

Differentiell exprimierte und Pathway-Genprodukte umfassen solche Proteine, die von den in Abschnitt 5.2.1 beschriebenen differentiell exprimierten und Pathway-Gensequenzen kodiert werden, wie z. B. das in 3 gezeigte Peptid. Differentiell exprimierte und Pathway-Genprodukte können insbesondere umfassen: differentiell exprimierte und Pathway-Gen-Polypeptide, die von den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen enthaltenen differentiell exprimierten und Pathway-Gensequenzen kodiert werden; die bei der NRRL hinterlegt wurden; oder die in den kodierenden Regionen der Gene enthalten sind, von denen hier DNA-Sequenzen beschrieben wurden (3A, 3B, 5, 6); oder die in den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen, die bei der NRRL hinterlegt wurden, enthalten sind.

Differentiell exprimierte und Pathway-Genprodukte können zusätzlich Proteine einschließen, die funktionell äquivalente Genprodukte darstellen. Solch ein äquivalentes differentiell exprimiertes oder Pathway-Genprodukt kann innerhalb der von den differentiell exprimierten oder Pathway-Gensequenzen, die in Abschnitt 5.2.1, supra, beschrieben werden, kodierten Aminosäuresequenzen, Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, die jedoch zu einer stillen Veränderung führen und somit ein funktionell äquivalentes, differentiell exprimiertes Pathway-Genprodukt herstellen. Aminosäure-Substitutionen können auf der Basis der Ähnlichkeit in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilizität und/oder des amphipathischen Charakters der beteiligten Reste durchgeführt werden. Nicht-polare (hydrophobe) Aminosäuren schließen z. B. Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein; positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Der hier verwendete Begriff "funktionell äquivalent" bezieht sich entweder auf ein Protein, welches eine im wesentlichen ähnliche in vivo-Aktivität wie das endogen differentiell exprimierte oder Pathway-Genprodukt zeigt, das von den differentiell exprimierten oder Pathway-Gensequenzen, wie vorstehend in Abschitt 5.2.1 beschrieben, kodiert wird. Wenn das Protein als Teil eines in Abschnitt 5.3, infra, beschriebenen Assays, verwendet wird, bezieht sich "funktionell äquivalent" alternativ auf Peptide, die mit anderen zellulären oder extrazellulären Molekülen in einer Art interagieren können, die im wesentlichen der Art ähnelt, in der der entsprechende Teil des endogenen differentiell exprimierten oder Pathway-Genprodukts interagieren würde.

Die differentiell exprimierten oder Pathway-Genprodukte können anhand synthetischer Verfahren oder anhand bekannter Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung der differentiell exprimierten oder Pathway-Gen-Polypeptide und Peptide gemäß der Erfindung durch die Expression von Nukleinsäuren, die für differentiell exprimierte oder Pathway-Gensequenzen kodieren, sind hier beschrieben. Dem Fachmann gut bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die differentiell exprimierte oder Pathway-Gen-Protein-kodierende Sequenzen und geeignete Transkriptions-/Translations-Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren schließen z. B. in vitro-rekombinante DNA-Verfahren, synthetische Verfahren und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination ein; vgl. z. B. die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., und Ausubel et al., 1989, supra, beschriebenen Verfahren. RNA, die für differentiell exprimierte oder Pathway-Gen-Proteinsequenzen kodieren kann, kann alternativ unter Verwendung von z. B. Synthesizern chemisch synthetisiert werden; vgl. die in "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M. J., Hrsg., IRL Press, Oxford, beschriebenen Verfahren.

Eine Vielzahl von Wirts-Expressions-Vektorsystemen kann zur Expression der erfindungsgemäßen differentiell exprimierten oder Pathway-Gen kodierenden Sequenzen verwendet werden. Solche Wirts-Expressionssysteme stellen Vehikel dar, anhand derer die interessierenden kodierenden Sequenzen produziert und nachfolgend gereinigt werden können, repräsentieren aber auch Zellen, die, wenn transformiert oder transfiziert mit den geeigneten Nukleotidsequenzen, die differentiell exprimierten oder Pathway-Gen Proteine der Erfindung in situ zeigen können. Diese Zellen schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Mikroorganismen wie Bakterien (z. B. E. coli, B. subtilis), transformiert mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA, Expressionsvektoren, die differentiell exprimierte oder Pathway-Gen Protein-kodierende Sequenzen enthalten; Hefe (z. B. Saccharomyces, Pichia), transformiert mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, die differentiell exprimierte oder Pathway-Gen Proteinkodierende Sequenzen enthalten; Insektenzell-Systeme, infiziert mit rekombinanten viralen Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus), die die differentiell exprimierten oder Pathway-Genprotein-kodierenden Sequenzen enthalten; Pflanzenzell-Systeme, die mit rekombinanten viralen Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabak-Mosaikvirus, TMV) oder die mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die differentiell exprimierte oder Pathway-Gen Proteinkodierende Sequenzen enthalten; oder Säugerzell-Systeme (z. B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressionskonstrukte tragen, die Promotoren enthalten, die vom Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren (z. B. der Adenovirus-late-Promotor; der Vacciniavirus 7.5K-Promotor) abgeleitet sind.

In bakteriellen Systemen können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung des differentiell exprimierten oder Pathway-Genproteins, eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise ausgewählt werden. Wenn z. B. zur Herstellung von Antikörpern oder zum Screening von Peptid-Bibliotheken eine große Menge eines solchen Proteins hergestellt werden soll, können z. B. Vektoren erwünschenswert sein, die die Expression hoher Spiegel der Fusionsproteinprodukte erzielen, die schnell gereinigt werden können. Solche Vektoren schließen den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791) ein, in dem die differentiell exprimierte oder Pathway-Genprotein-kodierende Sequenz einzeln innerhalb des Leserahmens der IacZ-kodierenden Region in den Vektor ligiert werden kann, so dass ein Fusionsprotein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509), und ähnliche ein, sind aber nicht darauf beschränkt. pGEX-Vektoren können auch zur Expression von Fremd-Polypeptiden als Fusionsproteine mit Glutathion S-Transferase (GST) verwendet werden. Solche Fusionsproteine sind im allgemeinen löslich und können aus lysierten Zellen leicht aufgereinigt werden durch Adsorption an Glutathion-Agarosekügelchen, gefolgt durch Elution in Anwesenheit von freiem Glutathion. Die pGEX-Vektoren schließen Thrombin oder Faktor Xa-Protease-Spaltstellen ein, so dass das klonierte Zielgen vom GST-Rest freigesetzt werden kann.

In einem Insektensystem wird das Autographa californica-nukleäre Polyhedrosisvirus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die differentiell exprimierte oder Pathway-Gen kodierende Sequenz kann einzeln in nicht-essentielle Regionen (z. B. das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. dem Polyhedrin-Promotor) gesetzt werden. Erfolgreiche Insertion der differentiell exprimierten oder Pathway-Genkodierenden Sequenz wird zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion von nicht-eingeschlossenem rekombinanten Virus (d. h. Virus, dem die vom Polyhedrin-Gen kodierte proteinartige Hülle fehlt) führen. Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet, in denen das inserierte Gen exprimiert wird (vgl. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-PS 4,215,051).

In Säuger-Wirtszellen kann eine Anzahl viraler Expressionssysteme verwendet werden. Wenn ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, können die differentiell exprimierten oder Pathway-Gen-kodierenden Sequenzen an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. an den late-Promotor und die dreiteilige Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann durch in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Adenovirus-Genom inseriert werden. Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig ist und differentiell exprimierte oder Pathway-Genproteine in infizierten Wirten exprimieren kann (vgl. z. B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659). Zur effizienten Translation von inserierten differentiell exprimierten oder Pathway-Gen-kodierenden Sequenzen können auch spezifische Initiationssignale erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationskodon und benachbarte Sequenzen. Wenn ein vollständiges identifiziertes Gen einschließlich seines eigenen Initiationskodons und der benachbarten Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, kann es sein, dass keine zusätzlichen Translations-Kontrollsignale benötigt werden. Wenn jedoch nur ein Teil der identifizierten kodierenden Sequenz inseriert wird, müssen exogene Translations-Kontrollsignale einschließlich möglicherweise des ATG-Initiationskodons bereitgestellt werden. Das Initiationskodon muss außerdem im gleichen Leserahmen wie der Leserahmen der gewünschten kodierenden Sequenz vorliegen, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initationskodons können vielerlei Ursprung sein, sowohl natürlich als auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente, Transkriptions-Terminatoren, usw. verstärkt werden (vgl. Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544).

Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der spezifisch gewünschten Art modifiziert oder prozessiert. Solche Modifikationen (z. B. Glykosylierung) und Prozessieren (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen zum post-translationellen Prozessieren und Modifizieren von Proteinen. Zur Gewährleistung der korrekten Modifizierung und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen verwendet werden, die die zelluläre Maschinerie zum richtigen Prozessieren des Primärtranskripts, zur Glykosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen. Solche Säuger-Wirtszellen umfassen CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, usw., sind aber nicht darauf beschränkt.

Für die Langzell-Produktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute wird stabile Expression bevorzugt. Es können z. B. Zelllinien, die das differentiell exprimierte oder Pathway-Genprotein stabil exprimieren, hergestellt werden. Anstatt Expressionsvektoren zu verwenden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit DNA transformiert werden, die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen kontrolliert wird (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptions-Terminatoren, Polyadenylierungsstellen, usw.) und einen selektierbaren Marker enthält. Nach der Einführung der Fremd-DNA können die veränderten Zellen für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen und werden dann in ein selektives Medium gegeben. Der selektierbare Marker im rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und unter Bildung von Foci zu wachsen, die wiederum kloniert und in Zellinien expandiert werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhafterweise zur Herstellung von Zelllinien verwendet werden, die das identifizierte Genprotein exprimieren. Solche hergestellten Zelllinien können beim Screening und bei der Auswertung von Substanzen, die die endogene Aktivität des differentiell exprimierten oder Pathway-Genproteins beeinflussen, besonders nützlich sein.

Eine Anzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich des Herpes Simplex Virus-Thymidinkinasegens (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), des Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegens (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und des Adeninphosphoribosyltransferasegens (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) in tk, hgprt oder aprt-Zellen, sind aber nicht darauf beschränkt. Anti-Metabolitresistenz kann auch als Basis der Selektion für dhfr verwendet werden, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, welches Resistenz gegenüber dem Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); und Hygro, welches Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).

Ein anderes Fusionsprotein-System ermöglicht die Aufreinigung nicht-denaturierter Fusionsproteine, die in humanen Zelllinien exprimiert werden (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–8976). In diesem System wird das interessierende Gen in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subkloniert, so dass der offene Leserahmen des Gens translational an einen aminoterminalen "Tag" fusioniert ist, der aus sechs Histidinresten besteht. Extrakte aus Zellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert sind, werden auf Ni2+ Nitriloessigsäure-Agarosesäulen geladen und Histidin-"getaggte" Produkte werden selektiv mit Imidazol-haltigen Puffern eluiert.

Wird das differentiell exprimierte oder Pathway-Genprotein als Komponente in hier beschriebenen Assay-Systemen verwendet, kann es entweder direkt oder indirekt markiert werden, um den Nachweis eines Komplexes zu erleichtern, der sich zwischen dem differentiell exprimierten oder Pathway-Genprotein und einer Testsubstanz gebildet hat. Jedes aus einer Vielzahl von geeigneten Markierungssystemen kann verwendet werden, einschließlich Radioisotopen wie 125I; Enyzm-Markiersystemen, die bei Exposition mit einem Substrat ein nachweisbares kolorimetrisches Signal oder Licht erzeugen; und Fluoreszenz-Labels, sind aber nicht darauf beschränkt.

Wenn das differentiell exprimierte oder Pathway-Genprodukt für solche Assay-Systeme anhand rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wird, kann es vorteilhaft sein, Fusionsproteine herzustellen, die die Markierung, die Löslichkeit, die Immobilisierung und/oder den Nachweis erleichtern.

Indirektes Markieren beinhaltet die Verwendung eines dritten Proteins, wie z. B. eines markierten Antikörpers, der spezifisch entweder an das differentiell exprimierte oder an das Pathway-Genprodukt bindet. Solche Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, chimäre, Einzelketten, Fab-Fragmente und Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek hergestellt sind, sind aber nicht darauf beschränkt.

5.6 Spezifische Antikörper für differentiell exprimierte oder Pathway-Genprodukte

Es werden Verfahren zur Produktion von Antikörpern beschrieben, die spezifisch ein oder mehrere differentiell exprimierte oder Pathway-Gen-Epitope erkennen können. Solche Antikörper können polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, einzelkettige Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek hergestellt werden, anti-idiotypische Antikörper (anti-Id) und Epitop-bindende Fragmente einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Antikörper können z. B. bei Nachweis eines Fingerprint-, Ziel- oder Pathway-Gens in einer biologischen Probe oder alternativ als Verfahren zur Hemmung abnormalen Zielgen-Aktivität verwendet werden. Somit können solche Antikörper als Tumorprogressionsbehandlungsverfahren und/oder als Teil diagnostischer Verfahren verwendet werden, in denen Patienten auf abnormale Spiegel von Fingerprint-, Ziel- oder Pathway-Genproteinen oder auf die Anwesenheit abnormaler Formen der Proteine untersucht werden können.

Zur Produktion von Antikörpern gegen ein differentiell exprimiertes oder Pathway-Gen können verschiedene Wirtstiere durch Injektion eines differentiell exprimierten oder Pathway-Genproteins oder eines Teils davon immunisiert werden. Solche Wirtstiere können Kaninchen, Mäuse und Ratten, um nur wenige zu nennen, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Verschiedene Adjuvanzien können in Abhängigkeit von der Wirtsspezies zur Erhöhung der immunologischen Reaktion verwendet werden, einschließlich Freund's Adjuvans (vollständig und nicht-vollständig), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanione, Peptide, ölige Emulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hemocyanin, Dinitrophenol und potentiell nützliche humane Adjuvanzien wie BCG (Bazillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum, sind aber nicht darauf beschränkt.

Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörper-Molekülen, abgeleitet vom Serum von Tieren, die mit einem Antigen wie Zielgenprodukt (z. B. Protein, das von 030 kodiert wird) oder einem antigenen funktionellen Derivat davon immunisiert wurden. Zur Herstellung polyklonaler Antikörper können die oben beschriebenen Wirtstiere durch Injektion eines differentiell exprimierten oder Pathway-Genprodukts (z. B. 030), das mit den oben beschriebenen Adjuvanzien supplementiert ist, immunisiert werden.

Monoklonale Antikörper, homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen, können durch jedes Verfahren erhalten werden, das die Herstellung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht. Diese schließen ein die Hybridom-Technik von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497; und US-PS 4,376,110), die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030) und die BV-Hybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96), sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Antikörper können jede Immunglobulin-Klasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jede Subklasse davon darstellen. Das Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper der Erfindung produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die in vivo Herstellung hoher Titer monoklonalen Antikörper ist die gegenwärtig bevorzugte Herstellungsmethode.

Zusätzlich können Verfahren verwendet werden, die zur Produktion chimärer Antikörper durch Zusammen-Splicen der Gene eines Maus-Antikörper-Moleküls von geeigneter Antigenspezifität mit Genen eines humanen Antikörper-Moleküls mit geeigneter biologischer Aktivität entwickelt wurden (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454; US-PS 4,816,567). Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem verschiedene Teile von verschiedenen Tierspezies abgeleitet sind, z. B. mit einer variablen Region eines murinen monoklonalen Antikörpers und einer humanen Immunglobulin-konstanten Region.

Zur Herstellung von anti-differentiell exprimierten oder anti-Pathway-Genprodukt-Antikörpern können alternativ Verfahren verwendet werden, die zur Herstellung von einzelkettigen Antikörpern (US-PS 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423–426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883; und Ward et al., 1989, Nature 334: 544–546) und zur Herstellung von humanisierten monoklonalen Antikörpern (US-PS 5,225,539) beschrieben wurden.

Antikörper-Fragmente, die spezifische Epitope erkennen, können anhand bekannter Techniken hergestellt werden. Diese Fragmente schließen z. B. folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: die F(ab')2-Fragmente, die durch Peptidverdau des Antikörper-Moleküls hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente hergestellt werden können. Um die schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der erwünschten Spezifität zu ermöglichen, können alternativ Fab-Expressionsbibliotheken hergestellt werden (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275–1281).

5.7 Zell- und Tier-basierende Modellsysteme

Es werden Zell- und Tier-basierende Systeme beschrieben, die zuverlässige Modelle für Tumorprogressionserkrankungen darstellen. Diese Systeme können in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Die Zell- und Tier-basierenden Modellsysteme können z. B. zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene über die vorstehend in Abschnitt 5.1.1.1 beschriebenen Paradigmen verwendet werden. Solche Systeme können auch dazu verwendet werden, differentiell exprimierte und Pathway-Gene, wie vorstehend in Abschnitt 5.3 beschrieben, weiter zu charakterisieren. Solche eine weitere Charakterisierung kann z. B. zeigen, dass ein differentiell exprimiertes Gen z. B. ein Zielgen ist. Solche Assays können zusätzlich auch als Teil von Screening-Strategien verwendet werden, die dazu gedacht sind, Substanzen zu identifizieren, die zur Vorbeugung und/oder zur Verbesserung von Symptomen von Tumorprogressionserkrankungen fähig sind, einschließlich Erkrankungen, die mit metastatischen Erkrankungen assoziiert sind, wie nachstehend beschrieben. Die Zell- und Tier-basierenden Modelle können somit zur Identifizierung von Arzneistoffen, Pharmazeutika, Therapien und Eingriffen verwendet werden, die für die Behandlung von Tumorprogressionserkrankungen wie z. B. metastatischen Erkrankungen wirksam sein können. Solche Tiermodelle können wie nachstehend detailliert in Abschitt 5.10.1 zusätzlich dazu verwendet werden, den LD50- und den ED50-Wert in Versuchstieren zu bestimmen. Solche Daten können zur Bestimmung der in vivo-Wirksamkeit potentieller Anti-Tumorprogressionserkrankungs-Behandlungen verwendet werden.

5.7.1 Tier-basierende Systeme

Tier-basierende Modellsysteme von Tumorprogressionserkrankungen können sowohl nichtrekombinante Tiere als auch rekombinant hergestellte transgene Tiere sein.

Nicht-rekombinante Tiermodelle für Tumorprogression können z. B. Maus-Modelle für Melanome, Prostatakrebs und Kolonkarzinom einschließen. Solche Modelle können z. B. durch das Einführen von Tumorzellen in syngene Mäuse hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren wie subkutane Injektion, Injektion in die Schwanzvene, Milzimplantation, intraperitoneale Implantation, Implantation unter die Nierenkapsel oder orthotopische Implantation (d. h. Kolonkrebszellen werden in Kolongewebe implantiert oder Prostatakrebszellen werden in die Prostatadrüse implantiert). Nach einem geeigneten Zeitraum können die aufgrund der Injektionen entstehenden Tumoren gezählt und analysiert werden.

Unter den Zellen, die zur Herstellung solcher Tiermodelle für die Tumorprogression verwendet werden können, sind Zellen, die von den im vorstehenden Abschnitt 5.1.1.1 aufgelisteten Zelllinien abgeleitet sind. Es können z. B. B16 Melanomzellen (Fidler, I. J., 1973, Nature New Biol. 242: 148–149) einschließlich Zellvarianten mit hohem (z. B. B16 F10-Zellen) und niedrigem (z. B. B16 F1-Zellen) metastatischem Potential verwendet werden. Nach der Injektion entwickeln sich in diesen Maus-Modellen allgemein Lungentumoren. Somit dienen diese Tiere nicht nur als Modell zur Melanom-Tumorprogression, sondern auch als Modell für Lungenmetastasen.

Zur Herstellung von Tiermodellen für kolorektalen Krebs können Krebszellen wie z. B. KM12c (niedriges metastatisches Potential) und KM12L4 (hoch metastatisch) (Morikawa, K. et al., 1988, Cancer Research 48: 1943–1948) in die Milzen von Nacktmäusen implantiert werden. In diesen Fällen entwickeln die Tiere im allgemeinen Lebertumoren. Somit dienen solche Tiere nicht nur als Modell für kolorektale Tumorprogression, sondern auch als Modelle für Lebermetastasen.

Zur Herstellung von Tiermodellen für die Tumorprogression von Prostatakrebs können Zellen, die z. B. von der hoch-metastatischen Prostata-Zellline PC-3-M oder der nichtmetastatischen Zelllinie DU 145 (Karmali, R. A. et al., 1987, Anticancer Res. 7: 1173–1180; Koziowski, J. M. et al., 1984, Cancer Research 44: 3522–3529) abgeleitet sind, in die Prostata von Tieren implantiert und die entstehenden Tumoren analysiert und z. B. mit Normalgewebe verglichen werden. Auf solche Weise können Gene identifiziert werden, die in neoplastischen gegenüber normalen Zellen als auch gegenüber metastatischen Zellen differentiell exprimiert sind.

Die Funktion identifizierter Genprodukte (z. B. von 030-Genprodukten) kann bestimmt werden, indem cDNAs, die für solche Genprodukte kodieren, in die geeignete Zelllinie transfiziert werden und indem die Auswirkungen auf die Fähigkeit der Zelle, Tumorprogression in solchen Tiermodellen zu induzieren, analysiert werden. Die Funktion der identifizierten Genprodukte kann weiter analysiert werden durch z. B. Kultivieren der Zellen, die von den Tumoren abgeleitet sind, die in den Tiermodellen entstehen, Einbringen dieser kultivierten Zellen in Tiere und nachfolgend Messen des Spiegels des identifizierten Genprodukts, der in den entstehenden Tumorzellen vorliegt. Auf diese Weise entstehen Zelllinien-Varianten, die zur Analyse der Funktion der quantitativen und/oder qualitativen Unterschiede bei der Expression der identifizierten Gene auf die Fähigkeit der Zelle nützlich sind, Tumorprogression zu induzieren. Wie z. B. nachfolgend in dem in Abschnitt 6 dargestellten Beispiel gezeigt, ist die 030-Genexpression umgekehrt abhängig vom Potential zur Metastasierung der Tumorzelllinie, die zur Herstellung solch eines Tumorprogressions-Tiermodells verwendet wurde.

Zusätzlich können rekombinante Tiermodelle, die Tumorprogressionscharakteristika und/oder Symptome von Tumorprogressionserkrankungen zeigen, einschließlich metastatischer Erkrankungen, verwendet werden, z. B. solch gut bekannte Tiermodelle wie das transgene Maus-Modell für das humane Melanom und transgene Mäuse, die spezifische Mutationen tragen, die zu multiplen intestinalen Tumoren führen (Mintz, M. und Silvers, W. K., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8817–8821; und Fodde, R. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8969–8973). Rekombinante Tiermodelle zur Tumorprogression können weiterhin hergestellt werden unter Verwendung von z. B. Zielgen-Sequenzen, wie vorstehend in Abschnitt 5.4 beschrieben, zusammen mit Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, die dem Fachmann bekannt sind. Zielgensequenzen können z. B. in das Genom des interessierenden Tiers inseriert und überexprimiert werden oder wenn endogene Zielgensequenzen vorhanden sind, können diese entweder überexprimiert oder alternativ mutiert sein, um die Zielgen-Expression zu vermindern oder zu inaktivieren.

Zur Überexpression einer Zielgensequenz kann der kodierende Teil der Zielgensequenz an eine regulatorische Sequenz ligiert werden, die die Genexpression im interessierenden Tier und Zelltyp vorantreiben kann. Solche regulatorischen Regionen sind dem Fachmann gut bekannt und können ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand verwendet werden.

Um Unterexpression der endogenen Zielgensequenz zu erreichen, kann solch eine Sequenz in das Genom des interessierenden Tiers derart inseriert werden, so dass die Allele des endogenen Zielgens inaktiviert werden. Bevorzugt wird eine hergestellte Sequenz verwendet, die mindestens einen Teil der Zielgensequenz enthält, und über Gen-"Targeting" so in das Genom des Tiers inseriert, dass die endogene Zielsequenz nach Integration der hergestellten Zielgensequenz in das Genom des Tieres unterbrochen wird. Gen"Targeting" wird nachfolgend in diesem Abschnitt diskutiert.

Tiere jeder Spezies einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schweine, Zwergschweine, Ziegen und nicht-menschliche Primaten, z. B. Paviane, Affen und Schimpansen, aber nicht darauf beschränkt, können zur Herstellung von Tiermodellen für Tumorprogression oder Tumorprogressionserkrankungen wie z. B. metastatische Erkrankungen, verwendet werden.

Jedes aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur Einführung eines Zielgen-Transgens in Tiere zur Herstellung der Gründerlinien transgener Tiere kann verwendet werden. Solche Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf pronukleäre Mikroinjektion (Hoppe, P. C. und Wagner, T. E., 1989, US-PS 4,873,191); Retrovirusvermittelten Gentransfer in Keimzellen (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148–6152); Gen-"Targeting" in embryonale Stammzellen (Thompson et al., 1989, Cell 56: 313–321); Elektroporation von Embryonen (Lo, 1983, Mol. Cell Biol. 3: 1803–1814); und Keimzellen-vermittelter Gentransfer (Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717–723); usw. Bezüglich einer Übersicht über solche Verfahren vgl. Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171–229.

Weiterhin werden transgene Tiere beschrieben, die das Transgen in allen Zellen tragen, als auch Tiere, die das Transgen in einigen, aber nicht in allen Zellen tragen, d. h. Mosaik-Tiere. Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder in Conkatameren, d. h. als Kopfzu-Kopf-Tandem oder Kopf-zu-Schwanz-Tandem integriert sein. Das Transgen kann auch selektiv in einem bestimmten Zelltyp inseriert und aktiviert sein, nach dem Beispiel der Lehre von Lasko et al. (Lasko, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232–6236). Die für eine solche Zelltyp-spezifische Aktivierung erforderlichen regulatorischen Sequenzen werden von dem bestimmten interessierenden Zelltyp abhängen und sind für den Fachmann offensichtlich.

Wenn erwünscht wird, dass das Zielgen-Transgen in die chromosomale Lokalisation des endogenen Zielgens integriert, wird Gen"Targeting" bevorzugt. Wenn solch ein Verfahren verwendet werden soll, werden Vektoren entworfen, die Nukleotidsequenzen enthalten, die homolog zu den endogenen interessierenden Zielgenen sind, mit dem Ziel, über homologe Rekombination mit chromosomalen Sequenzen in die Nukleotidsequenz des endogenen Zielgens zu integrieren und dessen Funktion zu zerstören. Das Transgen kann auch selektiv in einen bestimmten Zelltyp inseriert werden und aktiviert somit das endogene interessierende Gen nur in diesem Zelltyp, z. B. nach der Lehre von Gu et al. (Gu, H. et al., 1994, Science 265: 103–106). Die für eine solche Zelltyp-spezifische Inaktivierung erforderlichen regulatorischen Sequenzen hängen vom jeweiligen interessierenden Zelltyp ab und sind für den Fachmann offensichtlich.

Sobald transgene Tiere hergestellt wurden, kann die Expression des rekombinanten Zielgens und Proteins mit Standardverfahren getestet werden. Das anfängliche Screening kann durch Southern Blot-Analysen oder PCR-Verfahren durchgeführt werden, um tierische Gewebe hinsichtlich der Integration des Transgens zu analysieren. Die Höhe der mRNA-Expression des Transgens in den Geweben der transgenen Tiere kann auch anhand von Techniken nachgewiesen werden, die Northern Blot-Analyse von Gewebeproben des Tieres, in situ-Hybridisierungsanalysen und RT-gekoppelte PCR einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Proben des Zielgen-exprimierenden Gewebes können auch immuncytochemisch mit Antikörpern, die spezifisch für das transgene interessierende Produkt sind, ausgewertet werden.

Die für das Zielgen transgenen Tiere, die Zielgen-mRNA oder Zielgen-Transgen-Peptid in leicht nachweisbaren Mengen exprimieren (immuncytochemisch nachgewiesen, unter Verwendung von Antikörpern gegen Epitope des Zielgenprodukts), sollten weiter getestet werden, zur Identifizierung von Tieren, die Tumorprogressionsstadiumscharakteristika zeigen, einschließlich Symptome von Tumorprogressionserkrankungen. Solche Charakteristika von Tumorprogressionserkrankungen und/oder Symptome können z. B. folgende einschließen, die mit Tumorzellen assoziiert sind, die man bei Menschen findet: Melanom, Brust, gastrointestinal wie Ösophageal-, Magen-, Kolon-, Eingeweide-, kolorektale und rektale Krebsarten, Prostata-, Blase-, Hoden-, Ovar-, Gebärmutter-, Cervix-, Gehirn-, Lunge-, Bronchial-, Kehlkopf-, Rachen-, Leber-, Pankreas-, Schilddrüse-, Knochen-, Leukämien, Lymphome und verschiedene Arten von Hautkrebs.

Zusätzlich können spezifische Zelltypen in den transgenen Tieren hinsichtlich zellulärer Phänotypen analysiert werden, die charakteristisch für Tumorprogression sind. Solche zellulären Phänotypen können z. B. differentielle Genexpressions-Charakteristika von Zellen innerhalb eines gegebenen Stadiums der Tumorprogression einschließen. Weiterhin können solche zellulären Phänotypen als Auswertung eines bestimmten Zelltyps das Fingerprint-Expressionsmuster und dessen Vergleich mit bekannten Fingerprint-Expressionsprofilen des bestimmten Zelltyps in Tieren mit Tumorprogression einschließen. Solche transgenen Tiere dienen als geeignete Modellsysteme für Tumorprogressionserkrankungen.

Sobald Zielgen-transgene Gründertiere hergestellt sind (d. h. Tiere, die Zielgen-Proteine in interessierenden Zellen oder Geweben exprimieren und bevorzugt Charakteristika von Tumorprogression zeigen), können diese gezüchtet, ingezüchtet, ausgezüchtet oder gekreuzt werden, um Kolonien des bestimmten Tiers herzustellen. Beispiele solcher Zuchtstrategien schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Auszucht von Gründertieren mit mehr als einer Integrationsstelle, zur Etablierung getrennter Linien; Inzucht getrennter Linien, zur Herstellung zusammengesetzter Zielgen-Transgene, die das Zielgen-Transgen aufgrund additiver Expression jedes Zielgen-Transgens in höherer Menge exprimieren; Kreuzung heterozygoter transgener Tiere, zur Herstellung von bezüglich einer gegebenen Integrationsstelle homozygoter Tiere, um sowohl die Expression zu erhöhen als auch das Screenen der Tiere durch DNA-Analyse unnötig zu machen; Kreuzen verschiedener homozygoter Linien, um zusammengesetzte heterozygote oder homozygote Linien zu erzeugen; Züchten der Tiere auf verschiedenen genetischen Inzuchtstämmen, zur Untersuchung der Auswirkungen der Modifizierung von Allelen auf die Expression des Zielgen-Transgens und auf die Entstehung von Symptomen von Tumorprogressionserkrankungen. Ein solcher Ansatz besteht darin, Zielgen-transgene Gründertiere mit einem Wildtypstamm zur Erzeugung einer F1-Generation zu kreuzen, die Symptome von Tumorprogressionserkrankungen zeigt. Wenn entdeckt wird, dass homozygote Zielgen-transgene Tiere lebensfähig sind, kann die F1-Generation zur Entwicklung einer homozygoten Linie ingezüchtet werden.

5.7.2 Zell-basierende Assays

Zellen die Zielgensequenzen enthalten, die für Zielgenprotein kodieren und diese exprimieren, und weiterhin zelluläre Phänotypen zeigen, die mit Tumorprogressionserkrankungen assoziiert sind, können dazu verwendet werden, Verbindungen zu identifizieren die eine Fähigkeit zur Verhinderung und/oder Verbesserung von Tumorprogression zeigen. Zelluläre Phänotypen, die eine Fähigkeit zur Verbesserung von Symptomen von Tumorprogressionserkrankungen zeigen, können z. B. Tumorzellen mit niedrigem oder hohem metastatischen Potential zeigen.

Weiterhin kann das Fingerprintmuster der Genexpression interessierender Zellen analysiert und mit dem normalen Fingerprintmuster verglichen werden. Die Verbindungen, die dazu führen, daß Zellen, die zelluläre Phänotypen von Tumorprogressionserkrankungen, einschließlich metastatischen Erkrankungen, ein Fingerprintmuster produzieren, das in der interessierenden Zelle mehr einem normalen Fingerprintmuster ähnelt, können als Kandidaten für weitere Austestung hinsichtlich einer Fähigkeit zur Verbesserung der Symptome solcher Erkrankungen betrachtet werden.

Zellen, die in solchen Assays verwendet werden, können beispielhaft und nicht beschränkend nichtrekombinante Zellinien einschliessen, wie Melanom (z. B. B16 F1 und B16 F10 Zellinien), humane Kolonzelllinien (z. B. KM12c und KM20L4 Zellinien), Prostata (z. B. DU 145 und PC-3-M Zellinien) und Brustkrebszellinien (z. B. MCF-7 und MDA-MB-435 Zellinien). Zusätzlich können aufgereinigte primäre und sekundäre Tumorzellen, die entweder von transgenen oder nicht-transgenen Tumorzellen abgeleitet sind, verwendet werden.

Weiterhin können Zellen, die in solchen Assays verwendet werden können, auch rekombinante, transgene Zellinien einschliessen. Es können z.B, die erfindungsgemäßen Tiermodelle für metastatische Erkrankung die vorstehend in Abschnitt 5.2.4.1 beschrieben werden, zur Herstellung von Zellinien verwendet werden, die einen oder mehrere Zelltypen, die an metastatischer Erkrankung beteiligt sind, enthalten, die als Zellkulturmodelle for diese Erkrankungen verwendet werden können. Während von der Metastase in transgenen Tieren der Erfindung abgeleitete Primärkulturen verwendet werden können, wird die Herstellung kontinuierlicher Zellinien bevorzugt. Bezüglich Beispielen von Verfahren, die verwendet werden können, um eine kontinuierliche Zellinie von den transgenen Tieren abzuleiten, vgl. Small et al., 1985, Mol. Cell Biol. 5: 642–648.

Alternativ können Zellen eines Zelltyps, von dem bekannt ist, dass er an metastatischer Erkrankung beteiligt ist, mit Sequenzen transfiziert werden, die die Höhe der Zielgenexpression innerhalb der Zelle erhöhen oder vermindern können. Es können z. B. Zielgensequenzen in das Genom der interessierenden Zelle eingebracht und überexprimiert werden oder, sie können, wenn endogene Zielgensequenzen anwesend sind, entweder überexprimiert oder alternativ, unterbrochen werden, um die Zielgenexpression zu vermindern oder zu inaktivieren.

Um eine Zielgensequenz überzuexprimieren, kann der kodierende Bereich der Zielgensequenz an eine regulatorische Sequenz ligiert werden, die im interessierenden Zelltyp die Genexpression antreiben kann. Solche regulatorischen Bereiche sind dem Fachmann bekannt und können ohne unzumutbaren eperimentellen Aufwand verwendet werden.

Zur Unterexpression einer endogenen Zielgensequenz kann solche eine Sequenz isoliert und verändert werden, so das bei Wiedereinführung in das Genom der interessierenden Zelle die endogenen Zielgenallele inaktiviert werden. Bevorzugt wird die veränderte Zielgensequenz über Gen-„Targeting" eingebracht, so daß die endogene Zielsequenz durch Integration der veränderten Zielgensequenz in das Genom der Zelle unterbrochen wird. Gen-„Targeting" wird vorstehend in Abschnitt 5.7.1 beschrieben.

Transfektion von Zielgensequenz-Nukleinsäure kann mit Standardverfahren durchgeführt werden. Vgl z. B. Ausubel, 1989, supra. Transfizierte Zellen sollten hinsichtlich der Anwesenheit rekombinanter Zielgensequenzen, auf Expression und Akkumulierung der Zielgen-mRNA und hinsichtlich der Anwesenheit rekombinanter Zielgenprotein-Produktion ausgewertet werden. Falls eine Abnahme der Zielgenexpression erwünscht ist, können Standardverfahren dazu verwendet werden, um aufzuzeigen ob eine Abnahme der endogenen Zielgenexpression und/oder der Zielgenprodukt-Produktion erreicht wurde.

5.8.1 Überwachung von Einflüssen während klinischer Studien

Die Überwachung des Einflusses von Verbindungen auf Tumorprogression kann nicht nur im grundlegenden Arzneistoffscreening, sondern auch in klinischen Studien angewandt werden. In solchen klinischen Studien kann die Expression einer Reihe von Genen, die in einem der in Abschnitt 5.1.1.1 beschriebenen Paradigmen entdeckt wurden, als „read out" des Tumorprogressionssymptome einer bestimmten Zelle verwendet werden.

Beispielhaft und nicht beschränkend ermöglicht das die B16 Melanomzellen beschreibende Paradigma die Identifikation von Fingerprintgenen (z. B. 030), die in metastatischen Tumorzellen herabreguliert sind. In einer klinischen Studie können z. B. aus dem chirurgisch entfernten primären Tumor Tumorzellen isoliert, RNA präpariert und durch „Differential Display" wie in Abschnitt 6.1 beschrieben, analysiert werden. Die Expressionshöhen der Fingerprintgene können wie in Abschnitt 6.1 durch Northern Blotting oder RT-PCR oder alternativ durch Messen der produzierten Proteinmenge nach einem der in Abschnitt 5.7.2 beschriebenen Verfahren quantifiziert werden. Somit können Fingerprint-Profile als mögliche Biomarker dienen, die das Metastasierungspotential der Tumorzelle anzeigen. Somit kann durch Überwachen der romy030-Expressionshöhe ein Protokoll für geeignete chemotherapeutische Arzneistoffe entwickelt werden, basierend auf dem metastatischen Potential der Tumorzellen im Primärtumor. In Fällen inoperabler metastatischen Erkrankung können zur Messung der romy030-Expression Biopsien vom Patienten genommen werden, so daß die Wirksamkeit des Arzneistoffes durch Überwachen des Grades der wiederhergestellten romy030-Expression gemessen werden kann.

5.9 Diagnose von Tumorprogression

Zur Diagnose von Tumorprogression und von Krankheiten mit Tumorprogression, einschließlich metastatischen Erkrankungen kann eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden. Solche Verfahren können z. B. Reagenzien wie die in Abschnitt 5.2.1 beschriebenen Fingerprintgen-Nukleotidsequenzen und gegen differentiell exprimierte und Pathway-Gen-Peptide gerichtetete Antikörper verwenden, wie vorstehend in Abschnitt 5.2.1 (Peptide) und 5.2.3 (Antikörper) beschrieben. Insbesondere können solche Reagenzien z. B. dazu verwendet werden, die Anwesenheit von Mutationen im Zielgen oder die Über- oder Unterexpression des Zielgens auf dem RNA-Level nachzuweisen.

Die hier beschriebenen Verfahren können z. B. unter Verwendung vorgepackter Diagnostik-Kits durchgeführt werden, umfassend mindestens eine der hier beschriebenen spezifische Fingerprintgen-Nukleinsäuresequenz oder ein anti-Fingerprintgen-Antikörperreagenz, die z. B. angenehm in der Klinik verwendet werden können, um Patienten mit Symptomen metastatischer Erkrankungen zu diagnostizieren.

In den nachfolgend beschriebenen diagnostischen Tests kann jeder Zelltyp oder jedes Gewebe, bevorzugt T-Zellen, in denen das Fingerprintgen exprimiert wird, verwendet werden.

5.9.1 Nachweis von Fingerprintgen-Nukleinsäuren

DNA oder RNA aus dem zu analysierenden Zelltyp oder Gewebe kann anhand dem Fachmann bekannter Verfahren leicht isoliert werden. Diagnostische Verfahren können auch „in situ" direkt an Gewebeschnitten (fixiert und/oder gefroren) von Patientengewebe, dass in Biopsien oder Resektionen erhalten wurde, durchgeführt werden, so daß keine Nukleinsäureaufreiningung erforderlich ist. Nukleinsäurereagenzien wie die in Abschnitt 5.1 beschriebenen können als Sonden und/oder Primer für solche in situ-Verfahren verwendet werden (vgl. z. B. Nuovo G. J., 1992, PCR in situ Hybridization: Protocols and Applications, Raven Press, NY).

Fingerprintgen-Nukleotidsequenzen, entweder RNA oder DNA, können z. B. in Hybridisierungs- oder Amplifizierungsassays biologischer Proben zum Nachweis von mit Metastasierung assoziierten Genstrukturen und Expression verwendet werden. Solche Assays können Southern oder Northern-Analysen, einzelsträngige konformationelle Polymorphismen-Analysen, in situ-Hybridisierungs-Assays und Polymerasekettenreaktion-Analysen einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Analysen können sowohl quantitative Aspekte des Expressionsmusters des Fingerprintgens als auch qualitative Aspekte der Expression des Fingerprintgens und/oder der Genzusammensetzung aufzeigen. Dies bedeutet, dass solche Verfahren z. B. Punktmutationen, Insertionen, Deletionen, chromosomale Rearrangements und/oder Aktivierung oder Inaktivierung von Genexpression einschließen können.

Bevorzugte diagnostische Verfahren zum Nachweis von Fingerprintgen-spezifischen Nukleinsäuremolekülen können z. B. das in-Kontakt-bringen und Inkubieren von vom analysierten Zelltyp oder Gewebe abgeleiteten Nukleinsäuren mit einem oder mehreren in Abschnitt 5.1 beschriebenen markierten Nukleinsäure-Reagenzien beinhalten, unter Bedingungen, die das spezifische Anlagern dieser Reagenzien an ihre komplementären Sequenzen innerhalb des interessierenden Nukleinsäuremoleküls begünstigen. Diese Nukleinsäurereagenzien sind bevorzugt mindestens 15–30 Nukleotide lang. Nach der Inkubation werden alle nicht-angelagerten Nukleinsäuremoleküle aus dem Nukleinsäure: Fingerprint-RNA-Hybrid entfernt. Die Anwesenheit von Nukleinsäuren aus dem Zielgewebe, die hybridisiert haben, wird nachgewiesen, wenn solche Moleküle vohanden sind. Unter Verwendung eines solchen Nachweisschemas können die Nukleinsäuren aus dem interessierenden Gewebe oder Zelltyp z. B. an einen festen Träger wie eine Membran oder an eine Plastikoberfläche wie auf einer Mikrotiterplatte oder auf Polystyrenkügelchen immobilisert werden. In diesen Fall werden nach Inkubation nicht-angelagerte, markierte Fingerprint-Nukleinsäurereagenzien des in Abschnitt 5.1 beschriebenen Typs leicht entfernt. Der Nachweis der verbleibenden, angelagerten, markierten Nukleinsäurereagenzien wird anhand dem Fachmann bekannter Standardverfahren durchgeführt.

Alternative diagnostische Verfahren zum Nachweis von Fingerprintgen-spezifischen Nukleinsäuremolekülen können deren Amplifikation, z. B. durch PCR (experimentelle Ausführung siehe in Mullis, K. B., 1987, US-Ps 4,683,202), Ligasekettenreaktion (Barany, F., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193), selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), transkriptionelle Amplifizierungssysteme (Kwoh, D. Y, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173– 1177), Q-beta-Replikase (Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197) beinhalten, oder jedes andere Nukleinsäureamplifizierungs-Verfahren, gefolgt vom Nachweis der amplifizierten Moleküle unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren. Diese Nachweisschemata sind besonders nützlich zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, die in sehr geringer Kopienzahl vorliegen.

In einer Ausführungsform solch eines Nachweisschemas wird ein cDNA-Molekül von einem interessierenden RNA-Molekül erhalten (z. B. durch reverse Transkription des RNA-Moleküls in cDNA). Zelltypen- oder Gewebe, aus denen solch eine RNA isoliert werden kann, umfassen jedes Gewebe, von dem bekannt ist, daß es Wildtyp-Fingerprintgen exprimiert. Eine Sequenz innerhalb der cDNA wird dann als Matrize für eine Nukleinsäureamplifizierungsrekation wie PCR oder ähnliches verwendet. Die als Syntheseinitiations-Reagenzien (z. B. Primer) verwendeten Nukleinsäurereagenzien bei der reversen Transkription und den Nukleinsäureamplifizierungsschritten dieser Methode werden aus den in Abschnitt 5.1 beschriebenen Fingerprintgen-Nukleinsäurereagenzien ausgewählt. Solche Nukleinsäurereagenzien sind bevorzugt mindestens 19–30 Nukleotide lang. Zum Nachweis des amplifizierten Produktes kann die Nukleinsäureamplifikation mit radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierten Nukleotiden durchgeführt werden. In einem anderen Fall kann ausreichend amplifiziertes Produkt durch Standard-Ethidiumbromid-Färbung oder durch jede andere geeignete Nukleinsäurefärbemethode sichtbar gemacht werden.

Zusätzlich zu Verfahren, die primär auf den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz fokussieren, können Fingerprint-Profile, wie in Abschnitt 5.3.4 diskutiert, auch in solchen Nachweisschemata bewertet werden. Fingerprintprofile können z. B. unter Verwendung eines Differential Display-Verfahrens, wie vorstehend in Abschnitt 5.1.1.2 beschrieben, Northern-Analyse und/oder RT-PCR generiert werden. Jede der in Abschnitt 5.2.1, supra, beschriebenen Gensequenzen kann als Sonde und/oder PCR Primer zur Generierung und Bestätigung solcher Fingerprint-Profile verwendet werden.

5.9.2 Nachweis von Zielgen-Peptiden

Gegen Wildtyp- oder mutierte Fingerprintgen-Peptide gerichtete Antikörper, die in Abschnitt 5.2.3, supra, beschrieben werden, können auch in der Tumorprogression-Diagnose und- Prognose wie z. B. hier beschrieben, verwendet werden. Solche Diagnosevertahren können zum Nachweis von Abnormalitäten der Fingerprintgen-Expressionshöhe oder in der Struktur und/oder Gewebelokalisation, zellulärer, oder subzellulärer Lokalisation des Fingerprintgen-Protein verwendet werden. Strukturelle Unterschiede können z. B. Unterschiede in der Größe, der Elektronegativität, der Antigenität des mutierten Fingerprint-genproteins verglichen zum normalen Fingerprint-Genprotein einschließen.

Proteine aus dem zu analysierenden Gewebe oder Zelltyp können anhand der dem Fachmann bekannten Verfahren leicht isoliert werden. Die hier verwendeten Proteinisolierungsverfahren können z. B. die von Harlow und Lane (Harlow, E. und Lane, D., 1988, „Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschriebenen sein.

Bevorzugte diagnostische Verfahren zum Nachweis von Wildtyp- oder mutierten Fingerprintgen-Peptidmolekülen können z. B. Immunassays beeinhalten, bei denen Fingerprintgen-Peptide durch ihre Interaktion mit einem anti-Fingerprintgen-spezifischen Peptidantikörper nachgewiesen werden.

Es können z. B. Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, wie die in Abschnitt 5.2.3, supra beschriebenen verwendet werden, um quantitativ oder qualitativ die Anwesenheit von Wildtyp- oder mutierten Fingerprintgen-Peptiden nachzuweisen. Dies kann z. B. durch Immunfluoreszenztechniken mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper (infra), verbunden mit Lichtmikroskopie, Flußzytometrie oder fluorimetrischem Nachweis ausgeführt werden. Solche Verfahren sind besonders bevorzugt wenn die Fingerprintgen-Peptide auf der Zellobertläche exprimiert werden.

Die Antikörper (oder Fragmente davon) können zusätzlich histologisch, wie in Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie, zum in situ-Nachweis von Zielgenpeptiden verwendet werden. in situ-Nachweis kann durch Entnahme einer histologischen Probe von einem Patienten, auf die ein markierter Antikörper aufgetragen wird, ausgeführt werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird bevorzugt durch Überschichten einer biologischen Probe mit dem markierten Antikörper (oder Fragment) verwendet. Durch die Verwendung eines solchen Verfahrens ist es möglich, nicht nur die Anwesenheit von Fingerprintgen-Peptiden, sondern auch ihre Verteilung im untersuchten Gewebe zu bestimmen. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird der Durchschnittsfachmann erkennen, dass jedes einer Vielzahl von histologischen Verfahren (wie z. B. Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um einen in situ-Nachweis zu erreichen.

Immunassays für Wildtyp- oder mutierte Fingerprintgen-Peptide umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe, wie einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextraktes, frisch geernteter Zellen, oder von Zellen, die in Gewebekultur gehalten wurden, in Gegenwart eines nachweisbar markierten Antikörpers, der zur Identifizierung von Fingerprintgen-Peptiden fähig ist, und Nachweisen des gebundenen Antikörpers durch eines einer Vielzahl bekannter Verfahren.

Die biologische Probe kann mit einem Festphasenträger oder einem Träger wie Nitrozellulose oder einem anderen festen Träger, der Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine immobilisieren kann, in Kontakt gebracht und immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt von einer Behandlung mit dem nachweisbar markierten Fingerprintgen-spezifischen Antikörper. Der Festphasenträger kann dann ein zweites Mal mit einem Puffer gewaschen werden, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem festen Träger kann dann anhand herkömmlicher Verfahren nachgewiesen werden.

Mit den Begriffen „Festphasenträger oder Träger" ist jeder Träger gemeint, der ein Antigen oder einen Antikörper binden kann. Bekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Serpentins und Magnetit. Der Träger kann entweder zu einem gewissen Ausmaß löslich sein oder unlöslich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung. Das Trägermaterial kann jede mögliche strukturelle Konfiguration haben, solange das gekoppelte Molekül an ein Antigen oder einen Antikörper binden kann. Somit kann die Konfiguration des Trägers sphärisch, wie in einem Kügelchen oder cylindrisch, wie in der inneren Oberfläche eines Testgefäßes oder an der äußeren Oberfläche eines Stabes sein. In einem anderen Fall kann die Oberfläche flach wie auf einem Blatt, einem Teststrip, etc. sein. Bevorzugte Träger schließen Polystyrol-Kügelchen ein. Der Fachmann kennt viele weitere geeignete Träger zur Bindung von Antikörper oder Antigen, oder er kann diese durch Verwendung von Routine-Experimenten ermitteln.

Die Bindungsaktivität einer gegebenen Charge von anti-Wildtyp oder mutiertem Fingerprintgen-Peptid-Antikörper kann gemäß bekannter Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann kann operative und optimale Assay-Bedingungen für jede Bestimmung durch Verwendung von Routine-Experimenten bestimmen.

Einer der Wege, auf denen der Fingerprintgen-Peptid-spezifische Antikörper nachweisbar markiert werden kann besteht darin, ihn an ein Enzym zu koppeln und in einem Enzym-Immunassay zu verwenden (EIA) (Voller, A., „The enzyme linked immunosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2: 1–7, 1978) (Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller , A. et al., J. Clin. Pathol. 31: 507–520 (1978); Butler, J. E. Meth. Enzymol. 73: 482–523 (1981), Maggio, E. (Hrsg.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa, E. et al., (Hrsg.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981). Das an den Antikörper gebundene Enzym wird mit einem geeigneten Substrat, bevorzugt einem chromogenen Substrat, so reagieren dass ein chemischer Rest, der z. B. durch spektrophotometrische, fluorimetrische oder visuelle Mittel nachgewiesen werden kann, produziert wird. Enzyme, die zur nachweisbaren Markierung des Antikörpers verwendet werden können schließen ein Malat-Dehydrogenase, Staphylococcen-Nuclease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, Alphaglycerophosphat, Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerettichperoxidase, Alkaline Phosphatase, Asparaginase, Glukose-Oxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Unease, Katalase, Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, Glukoamylase und Acetylcholinesterase. Der Nachweis kann durch kolorimetrische Verfahren, die ein chromogenes Substrat für das Enzym verwenden, ausgeführt werden. Der Nachweis kann auch ausgeführt werden durch visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrates verglichen mit ähnlich hergestellten Standards.

Nachweis kann auch durch eine Vielzahl anderer Immunassays durchgeführt werden. Durch radioaktives Markieren der Antikörper oder der Antikörper-Fragmente ist es z. B. möglich, Fingerprintgen-Wildtyp oder mutierte Peptide durch Verwendung eines Radioimmunassays (RIA) nachzuweisen (vgl. z. B. Weintraub, B. Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, März 1986). Das radioaktive Isotop kann durch Verwendung eines Gamma-Zählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden.

Es ist auch möglich, den Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der Fluoreszenz-markierte Antikörper Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Anwesenheit aufgrund von Fluoreszenz nachgewiesen werden. Zu den meistbenützten Fluoreszenzmarkierungs-Verbindungen gehören Fluoreszein-Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-phtaldehyd und Fluorescamin.

Der Antikörper kann auch durch Fluoreszenz-emittierende Metalle wie 152Eu oder andere Metalle der Lanthanidgruppe nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können durch Metall-Komplexbildende Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA) oder Ethylentetradiamintetraessigsäure (EDTA) an den Antikörper gebunden werden.

Der Antikörper kann auch durch Kopplung an eine chemilumineszente Verbindung nachweisbar markiert werden. Die Anwesenheit des Chemilumineszenz-"getaggten" Antikörpers wird durch die Anwesenheit von Lumineszenz nachgewiesen, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele besonders nützlicher Chemilumineszenz-Markierungs-Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridinsalz und Oxalatester.

Ebenso kann zur Markierung des erfindungsgemäßen Antikörpers eine biolumineszente Verbindung verwendet werden. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die man in biologischen Systemen findet, bei der ein katalytisches Protein die Wirksamkeit der Chemilumineszenz-Reaktion erköht. Die Anwesenheit eines biolumineszenten Proteins wird durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz bestimmt. Wichtige Biolumineszenz-Verbindungen für Zwecke der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.

6. Beispiel: Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Gens das Tumorprogression hemmt

In dem in diesem Abschnitt gezeigten Beispiel wurde das in Abschnitt 5.1.1.1, supra, beschriebene in vitro-Paradigma verwendet, um ein Gen zu identifizieren, welches hier als 030-Gen bezeichnet wird, welches in Zellen mit hohem metastatischen Potential verglichen mit Zellen mit einem niedrigen metastatischen Potential differentiell exprimiert wird. Das 030-Gen wird insbesondere in Zellen mit hohem metastatischen Potential um ein vielfaches geringer als in nicht-metastatischen Zellen exprimiert. Das 030-Gen kann somit wie nachfolgend diskutiert für ein Produkt kodieren, das für eine Vielzahl neoplastischer Prozesse wichtig ist, einschließlich z. B. der Progression einer Zelle zu einem metastatischen Stadium, der Agressivität des metastatischen Zustandes einer Zelle und der Fähigkeit einer primären Tumorzelle, in umgebendes Gewebe einzuwandern. Wenn man das differentielle 030-Genexpressionsmuster, das in diesem Abschnitt aufgedeckt wird, als gegeben ansieht, kann das 030-Genprodukt ein Protein mit Tumorsuppressor oder -inhibitorfunktion darstellen.

6.1 Material und Methoden 6.1.1 Zellkultur

B16 F1 und B16 F10 Melanom-Zellinien wurden in Eagle's Minimal Essential Medium (MEM), ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, kultiviert. Zellen wurden von nichtkonfluenten Einschichtkulturen durch eine 2-minütige Behandlung mit 0,25% Trypsin und 2 mM EDTA geerntet.

Zur weiteren Charakterisierung der in vivo-Aktivität wurde jede Zellinie in Mäuse injiziert. Zellen wurden 2 × in MEM gewaschen und die End-Zellsuspension auf 5 × 105 Zellen pro 1 ml in MEM eingestellt. 200 &mgr;l dieser Zellsuspension (1 × 105 Zellen) wurden i. v. in die laterale Schwanzvene von C57BL/6J-Mäusen injiziert. Nach drei Wochen wurden die Mäuse getötet und ihre Lungen autopsiert. Die Anzahl an Lungentumoren wurde durch Zählen der Oberflächenknötchen unter Verwendung eines Sezier-Mikroskops bestimmt.

Die differentielle Expression des 030-Gens in B16 F1, bezogen auf B16 F10 Zellinien wurde mit dem Ausmaß an Lungenmetastasen, die sich in B16 F1-injizierten Mäusen gebildet hatten, bezogen auf B16 F10-injizierte Mäuse, verglichen.

6.1.2 Differential Display

Differential Display von mRNA wurde wie in Abschnitt 5.1.1.2, supra, beschrieben durchgeführt. Einzelheiten des Differential Displays werden nachfolgend beschrieben.

RNA-Isolierung

RNA wurde mit RNAzol aus nicht-konfluenten Einschichtkulturen von B16 F1 und B16 F10 Zellinien isoliert.

Isolierte RNA wurde in DEPC-H2O resuspendiert und durch spektrophotometrisches Messen bei OD260 quantifiziert. Etwa die Hälfte der RNA-Proben wurden dann zur Entfernung von kontaminierender chromosomaler DNA mit DNAse I behandelt. Jede 50 &mgr;l RNA-Probe (50 &mgr;l), 5,7 &mgr;l 10 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer/Cetus) und 1 &mgr;l RNAse-Inhibitor (40 Einheiten/&mgr;l; Boehringer Mannheim, Deutschland) wurden vermischt. 2 &mgr;l DNAse I (10 Einheiten/&mgr;l; Boehringer Mannheim) wurden zur Reaktion zugegeben, die für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Das Gesamtvolumen wurde mit DEPC-H2O auf 200 &mgr;l gebracht, einmal mit Phenol/Chlorophorm extrahiert und durch Zugabe von 20 &mgr;l 3M NaOAc, pH 4.8 (DEPCbehandelt), 500 &mgr;l EtOH absolut gefällt und für 1 Stunde auf Trockeneis inkubiert. Die gefällte Probe wurde 15 Minuten zentrifugiert und das Pellet mit 70% EtOH gewaschen. Die Probe wurde nochmals zentrifugiert, die verbleibende Flüssigkeit verdampft und das Pellet in 50 &mgr;l H2O resuspendiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Ablesen der OD260 gemessen.

Erst-Strang-cDNA-Synthese

Für jede RNA-Probe wurde ein zweifacher Ansatz von Reverser Transkriptions-Reaktion parallell durchgeführt. 400 ng RNA plus DEPC-H2O in einem Gesamtvolumen von 10 &mgr;l wurden zu 4 &mgr;l T11CC 3'-primer (10 &mgr;M; Operon) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 70°C für 5 Minuten inkubiert, um die RNA zu denaturieren und dann bei Raumtemperatur belassen. 26 &mgr;l des folgenden Reaktions-Mix wurden zu jeder denaturierten RNA/Primer-Probe zugegeben: 8 &mgr;l 5 × Erst-Strang-Puffer (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), 4 &mgr;l 0,1 M DTT (Gibco/BRL), 2 &mgr;l RNAse Inhibitor (40 Einheiten/&mgr;l, Boehringer Mannheim), 4 &mgr;l 200 &mgr;M dNTP-Mix, 6 &mgr;l N2O, 2 &mgr;l Superscript Reverse Transkriptase (200 Einheiten/&mgr;l; Gibco/BRL).

Die Reaktionsgemische wurden sanft gemischt und für 30 Minuten bei 42°C inkubiert. Zu einem Endvolumen von 100 &mgr;l wurden 60 &mgr;l H2O zugegeben und die Proben für 5 Minuten bei 85°C denaturiert und bei –20°C gelagert.

PCR-Reaktionen

Die resultierenden einzelsträngigen cDNA Moleküle wurden mittels PCR amplifiziert. Zu jeder Vertiefung einer 96-Lochplatte wurden auf Eis 13 &mgr;l Reaktions-Mix zugegeben. Der Reaktions-Mix enthielt 6,4 &mgr;l N2O, 2 &mgr;l 10 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer), 2 &mgr;l 20 &mgr;M dNTPs, 0,4 &mgr;l 35S dATP (12,5 &mgr;Ci/ml; 50 &mgr;Ci gesamt; Dupont/NEN), 2 &mgr;l 5'-Primer OPE4 (5' GTGACATGCC-3'; 10 &mgr;M; Operon), und 0,2 &mgr;l AmpIiTagTM Polymerase (5 Einheiten/&mgr;l; Perkin-Elmer). Danach wurden 2 &mgr;l 3'-Primer (T11CC, 10 &mgr;M) an die Seite der Vertiefung gegeben, gefolgt von 5 &mgr;l cDNA, ebenfalls an die Seite der Gefäße, die immer noch auf Eis standen. Die Gefäße wurden verschlossen, gemischt und bei 1000 rpm zentrifugiert und sofort wieder auf Eis gestellt. Ein Perkin-Elmer 9600 Wärmecycler wurde folgendermaßen programmiert: 94°C 2 Minuten *94°C 15 Sekunden *40°C 2 Minuten *ramp 72°C 1 Minuten *72°C 30 Sekunden 72°C 5 Minuten 4°C halten
= × 40

Sobald der Wärmecycler anfänglich 94°C erreicht hatte, wurde die 96-Lochplatte vom Eis genommen und direkt in den Cycler eingesetzt. Nach der Amplifizierungsreaktion wurden 15 &mgr;l Auftragspuffer, enthaltend 80% Formamid, 10 mM EDTA, 1mg/ml Xylencyanol, 1 mg/ml Bromphenolblau, zugegeben. Der Auftragspuffer und die Reaktion wurden gemischt, bei 85°C für 5 Minuten inkubiert, auf Eis abgekühlt, zentrifugiert und auf Eis gestellt. Etwa 4 &mgr;l aus jedem Gefäß wurden auf ein vorgelaufenes (60 V) denaturierendes 6%-Acrylamidgel aufgetragen. Das Gel wurde bei etwa 80 V gefahren bis der Marker etwa 1 inch vom Ende entfernt war. Das Gel wurde auf 3MM-Papier (Whatman Papier, England) transferiert und unter Vakuum getrocknet. Die Banden wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

6.1.3 Andere Verfahren Isolierung amplifizierter cDNA-Banden und Amplifizierung

PCR-Banden, die sich in der Differential Display Analyse als interessant erwiesen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und reamplifiziert.

Differentiell exprimierte Banden wurden aus dem getrockneten Gel mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und mit 100 &mgr;l H2O in ein Mikrofugen-Gefäß gegeben und bei 100°C für 5 Minuten erhitzt, gevortext, wieder auf 100°C für 5 Minuten erhitzt und wieder gevortext. Nach Abkühlung wurden 100 &mgr;l H2O, 20 &mgr;l 3M NaOAc, 1 &mgr;l Glycogen (20 mg/ml) und 50 &mgr;l Ethanol zugegeben und die Probe auf Trockeneis präzipitiert. Nach Zentrifugation wurde das Pellet gewaschen und in 10 &mgr;l H2O resuspendiert.

Aus den ausgeschnittenen differentiell exprimierten Banden isolierte DNA wurde dann durch PCR bei folgenden Reaktionsbedingungen reamplifiziert: 58 &mgr;l H2O 10 &mgr;l 10 × PCR-Puffer (siehe oben) 10 &mgr;l 200 &mgr;M dNTPs 10 &mgr;l 10 &mgr;M 3'-Primer (siehe oben) 10 &mgr;l 10 &mgr;M 5'-Primer (siehe oben) 1,5 &mgr;l amplifizierte Bande 0,5 &mgr;l AMPLITAQ Polymerase (5 Einheiten/&mgr;l; Perkin Elmer)

Die PCR-Bedingungen entsprachen den Bedingungen, mit denen auch die ursprüngliche amplifizierte Bande generiert wurde. Nach der Reamplifizierung wurden Glycerol-Ladepuffer zugegeben, die Proben auf ein 2% präparatives TAE/Biogel (Bio101, La Jolla, CA) – Agarosegel aufgetragen und eluiert. Banden wurden dann mit einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten und 15 Minuten bei Raumtemperatur gevortext und mit dem MERMAIDTM Kit von Bio101 durch Zugabe von 3 Volumina MERMAIDTM Hochsalz-Bindungslösung und 8 &mgr;l resuspendierter Glasmilch in einem Mikrofugen-Gefäß aufgereinigt. Glasmilch wurde dann pelletiert, 3 × mit einer Ethanolwaschlösung gewaschen und die DNA wurde zweimal in 10 &mgr;l bei 50°C eluiert.

Subklonierung und Seguenzierung

Der TA Klonierungskit (Invitrogen, San Diego, CA) wurde zur Subklonierung der amplifizierten Banden verwendet. Die Ligationsreaktion bestand typischerweise aus 4 &mgr;l sterilem H2O, 1 &mgr;l Ligationspuffer, 2 &mgr;l TA Klonierungsvektor, 2 &mgr;l PCR-Produkt und 1 &mgr;l T4 DNA-Ligase. Das Volumen des PCR-Produktes kann variieren, aber das Gesamtvolumen des PCR-Produktes plus H2O betrug immer 6 &mgr;l. Ligationen (einschliesslich des Vektors allein) wurden über Nacht bei 12°C vor der bakteriellen Transformation inkubiert. TA-Klonierungskit kompetente Bakterien (INV&agr;F': enda1, recA1, hsdR17(r – k, m + k), supE44, &lgr;thi-1, gyrA, relA1, M801acZ&agr;)M15) (IacZYA-argf), deoR+, F') wurden auf Eis aufgetaut und zu jeden Gefäß wurden 2 &mgr;l 0,5M &bgr;-Mercaptoethanof zugegeben. 2 &mgr;l jeder Ligation wurden zu jedem Gefäß kompetenter Zellen zugegeben (50 &mgr;l), ohne zu vortexen gemischt und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die Gefäße wurden dann für exakt 30 Sekunden in ein 42°C-Bad gestellt, bevor sie wieder für 2 Minuten auf Eis gestellt wurden. 450 &mgr;l SOC-Medium (Sambrook et al., 1989, supra) wurden zu jedem Gefäß gegeben und bei 37°C für 1 Stunde geschüttelt. Die Bakterien wurden pelletiert, in ca. 200 &mgr;l SOC resuspendiert und auf Luria Broth Agarplatten, die X-Gal und 60 &mgr;g/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Weisse Kolonien wurden gepickt und mit PCR auf Inserts gescreent.

Ein Master-Mix aus 2 &mgr;l 10 × PCR-Puffer, 1,6 &mgr;l 2,5 mM dNTPs, 0,1 &mgr;l 25 mM MgCl2, 0,2 &mgr;l M13 reverser Primer (100 ng/ml), 0,2 &mgr;l M13 "forward" Primer (100 ng/&mgr;l), 0,1 &mgr;l AmpIiTaq® (Perkin-Elmer) und 15,8 &mgr;l H2O wurde hergestellt. 40 &mgr;l des Master-Mixes wurden in Vertiefungen einer 96-Lochplatte allquotiert und ganze Bakterien wurden vor der PCR mit einer Pipettenspitze zugegeben. Der Wärmecycler wurde für das Insert-Screening wie folgt programmiert: 94°C 2 Minuten *94°C 15 Sekunden *47°C 2 Minuten *"ramp" 72°C 30 Sekunden *72°C 30 Sekunden 72°C 10 Minuten 4°C halten
= × 35

Reaktionsprodukte wurden auf einem 2%-Agarosegel eluiert und mit der Vektorkontrolle verglichen. Kolonien mit Vektoren, die Inserts enthielten, wurden durch Ausstreichen auf LB/Amp-Platten aufgereinigt. Vektoren wurden aus solchen Stämmen isoliert und mit einem Applied Biosystems Automated Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Seattle, WA) sequenziert.

Klonierung eines humanen Gens

Eine cDNA-Bibliothek aus humaner Retina von Clontech wurde mit der vollständigen Mausfomy030 cDNA (3A und 3B) als Sondenmolekül gescreent. Während dieses Screens wurden 1 Million Phagen der Bibliothek gescreent. 53 davon hybridisierten mit dem Mausfomy 030-Sondenmolekül. Die cDNA-Inserts von 8 dieser positiven Klone wurden isoliert, sukloniert und sequenziert.

Vergleich der murinen fomy030 und der humanen fohy030-Sequenzen zeigte einen hohen Grad an Sequenzähnlichkeit (86% Identität auf Nukleotidebene und 94,4% Identität auf Aminosäurebene) innerhalb der 5'-gelegenen 1813 Basenpaare ihrer cDNAs. Jenseits dieses Punktes weichen die Sequenzen jedoch voneinander ab und teilen keine signifikante Ähnlichkeit. Die fomy030-Sequenz am Divergenzpunkt ist GTAG, was einer Konsensus-Splice Donorstelle entspricht.

Drei unabhängig aus der Bibliothek isolierte cDNAs als auch eine als 3'- RACE-Produkt isolierte cDNA enthielten die fomy030-Sequenz. Somit ist die Existenz alternativer Splice-Varianten der fomy 030- und der fohy030-Transkripte die wahrscheinlichste Erklärung für die Divergenz der humanen und der murinen Sequenzen. Die fomy030 Splice-Variante führt zu einem Proteinprodukt von 542 Aminosäuren Länge, während für die fohy 030 Splice-Variante vorhergesagt wird, ein 1497 Aminosäuren langes Protein zu kodieren (5).

Eine andere Splice-Variante ist in 6 (SEQ ID NO: 8) gezeigt und kodiert für ein Protein von 1533 Aminosäuren Länge (SEQ ID NO: 9). Der cDNA von 5 (SEQ ID NO: 6) fehlen 34 Nukleotide, beginend nach 2876 in SEQ ID NO: 8, und es fehlen 74 Nukleotide beginnend nach 2926 in SEQ ID NO: 8. Somit sind Nukleotide 2880–2892 in SEQ ID NO: 6 identisch zu Nukleotiden 2914–2926 in SEQ ID NO: 8, und die Sequenzen sind im wesentlichen identisch beginnend bei 2893 in SEQ ID NO: 6 und 3001 in SEQ ID NO: 8. Der Unterschied in den jeweiligen Aminosäuresequenzen besteht darin, daß die Aminosäuren von 1 bis 844 und dann wieder von 850 bis 1497 in SEQ ID NO: 7 und von 886 bis 1533 in SEQ ID NO: 9 identisch sind.

Innerhalb ihrer gemeinsamen 5'-Sequenzen wurde entdeckt, daß fohy030 zusätzlich 3 Basenpaare (GGA) nach Position 1394 in der Maus-cDNA inseriert hat (Positionen 1066– 1068 in 5 und 6). Diese zusätzlichen drei Basenpaare fallen in die offenen Leserahmen sowohl von fohy 030 als auch von fomy 030, und führen zu einem zusätzlichen Glycinrest an Position 356 innerhalb des offenen Leserahmens von fohy 030, bezogen auf fomy 030.

Northern Analyse

Zur Bestätigung der differentiellen Expression der Gene, die den amplifizierten Banden entsprechen, wurde Northern Analyse wie unten beschrieben durchgeführt.

12 &mgr;g von Gesamt-RNA-Probe, 1,5 × RNA-Ladepuffer (60% Formamid, 9% Formaldehyd, 1,5 × MOPS, 0,075% × C/BPB-Färbemittel) in einer 1 × Endkonzentration und H2O zu einem Endvolumen von 40 &mgr;l wurden vermischt. Die Gefäße wurden für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und dann auf Eis gekühlt. Die analysierten RNA-Proben wurden auf ein denaturierendes 1% Agarosegel geladen. Das Gel lief über Nacht bei 32 V in 1 × MOPS-Puffer.

Ein 300 ml denaturierendes 1% Agarosegel wurde wie folgt hergestellt: 3 g Agarose (SeakemTM LE, FMC Bioproducts, Rockland, ME) und 60 ml 5 × MOPS-Puffer (0,1 M MOPS [pH 7,0], 40 mM NaOAc, 5 mM EDTA [pH 8.0]) wurden zu 210 ml sterilem H2O zugegeben. Das Gemisch wurde erhitzt, bis es geschmolzen war, dann auf 50°C abgekühlt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 5 &mgr;l Ethidiumbromid (5 mg/ml) und 30 ml 37% Formaldehyd zum geschmolzenen Gel-Mix zugegeben. Das Gel wurde schnell zum Mischen verquirlt und sofort gegossen.

Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit einem Fluoreszenz-Lineal photographiert, 3 Mal je 20 Minuten in DEPC-H2O bei Raumtemperatur unter Schütteln gewaschen. Die RNA wurde dann aus dem Gel auf Hybond®-N-Membran (Amersham) über Nacht in 20 × SSC transferiert, nach den Verfahren von Sambrook et al., 1989, supra.

Die Sondenmoleküle, die zum Nachweis von mRNA verwendet wurden, wurden typischerweise wie folgt synthetisiert: 2 &mgr;l amplifizierte cDNA-Bande (ca. 30 ng), 7 &mgr;l H2O und 2 &mgr;l 10 × Hexanukleotid-Mix (Boehringer Mannheim) wurden gemischt und 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann auf Eis gekühlt. Das Volumen der Bande kann variieren, aber das Gesamtvolumen der Bande plus H2O betrug immer 9 &mgr;l. 3 &mgr;l dATP/dGTP/dTTP-Mix (1 : 1 : 1, jeweils 0,5 mM), 5 &mgr;l &agr;32P dCTP 3000 Ci/mM (50 &mgr;Ci Gesamt; Amersham, Arlington Heights, IL) und 1 &mgr;l Klenow (2 Einheiten; Boehringer Mannheim) wurden gemischt und bei 37°C inkubiert. Nach 1 Stunde wurden 30 &mgr;l TE zugegeben und die Reaktion auf eine BiospinTM-6-Säule (Biorad, Hercules, CA) geladen und zentrifugiert. Ein 1 &mgr;l-Aliquot des Eluats wurde verwendet um in einem Szintillations-Zähler mit Szintillationsflüssigkeit den Einbau zu messen, um zu gewährleisten, daß ein Einbau von 106 cpm/&mgr;l erreicht wurde.

Zur Prähybridisierung wurde der Blot in eine Rollerflasche gegeben, die 10 ml Rapid-Hyb-Lösung (Amersham) enthielt, und für mindestens eine Stunde in einem 65°C Inkubator gegeben. Zur Hybridisierung wurde 1 × 107 cpm des Sondenmoleküls auf 95°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und zu 10 ml Rapid-Hyb-Lösung gegeben. Die Prähybridisierungslösung wurde dann durch Sondenlösung ersetzt und für 16 Stunden bei 65°C inkubiert. Am folgenden Tag wurde der Blot einmal 20 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC/0,1 %SDS und zweimal für 15 Minuten bei 65°C in 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen, bevor er mit Plastikfolie bedeckt und zur Exposition abgelegt wurde.

In situ-Hybridisierung

10 &mgr;m-Schnitte Formalin-fixierter, Paraffin-eingebetteter gutartiger Naevi (nichtmetastatisches Wachstum von Melanozyten) und maligne Melanome wurden mit 4% PFA/PBS 15 Minuten nachfixiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit 21 &mgr;g/ml Proteinase K bei 37°C 15 Minuten verdaut und wieder mit 4% PFA/PBS für 10 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit PBS gewaschen, 10 Minuten mit 0,2 N HCl inkubiert, mit PBS gewaschen, 10 Minuten mit 0,25% essigsaurem Anhydrid/1M Triethanolamin inkubiert, mit PBS gewaschen und mit 70% und 100% Ethanol dehydriert.

Hybridisierungen wurden mit 35S-radiomarkierten (5 × 107 cpm/ml) cRNA-Sondenmolekülen, die für ein 1,1 kb Segment der kodierenden Region der humanen cDNA (Klon fohy030) und für ein 1 kb Segment der kodierenden Region des humanen H4 Histon-Gens kodieren, in Gegenwart von 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1 × Denhardt's Lösung, 600 mM NaCl, 10 mM DTT, 0,25%SDS und 100 &mgr;g/ml tRNA für 18 Stunden bei 55°C durchgeführt. Das H4 Histon-Gen wurde als Kontrolle verwendet, um ordnungsgemäße RNA-Transkription zu zeigen.

Nach Hybridisierung wurden die Objekträger bei 55°C mit 5 × SSC, 50% Formamid/2 × SSC bei 55°C für 30 Minuten, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6)/500 mM NaCl/1 mM EDTA (TNE) bei 37 °C für 10 Minuten gewaschen, bei 37°C für 10 Minuten in TNE gewaschen, einmal für 30 Minuten bei 50°C in 2 × SSC inkubiert, 2 × in 0,2 × SSC bei 50°C für 30 Minuten inkubiert und mit 70% Ethanol und 100% Ethanol dehydriert. Die Lokalisation von mRNA-Transkripten wurde durch Eintauchen der Objektträger in Kodak NBT-2 Photoemulsion und Exposition für 4 Tage bei 4°C nachgewiesen. Kontrollen für die in situ-Hybridisierungsexperimente umfassten die Verwendung eines "sense"-Sondenmoleküls, die kein Signal über den Hintergrund hinaus zeigte.

6.2 Ergebnisse

Ein wie in Abschnitt 5.1.1.1, supra beschriebenes in vitro Paradigma wurde mit den Melanomzellinien B16 F1 und B16 F10 durchgeführt. Die B16 F1 Zellinie zeigt ein niedriges metastatisches Potential, während die B16 F10 Zellinie ein hohes metastatisches Potential zeigt. Beide Zellinien wurde in vitro wie in Abschnitt 6.1.1, supra beschrieben, kultiviert. RNA wurde aus diesen Zellen isoliert und Diffential Display wie in Abschnitt 6.1 beschrieben durchgeführt.

Anhand Differential Display-Analyse wurde eine Bande, romy 030 genannt, identifiziert, die eine cDNA repräsentiert, die von einer RNA abgeleitet ist, die von einem Gen produziert wurde, das in den B16 F1 Zellen in einem viel höheren Ausmaß exprimiert wurde, d.h in den Zellen mit niedrigem metastatischen Potential, bezogen auf die Expression des Gens in B16 F10 Zellen, d. h. in Zellen mit hohem metastatischen Potential. Das Gen, das der romy030-Bande entspricht, wird hier als fomy030 oder 030-Gen bezeichnet.

Die amplifizierte romy030-Bande wurde isoliert, reamplifiziert, subkloniert und sequenziert wie in Abschnitt 6.1.3, supra, beschrieben. Die romy030 Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) wird in 2 gezeigt.

Eine BLAST (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215; 403–410) Datenbank-Suche mit der romy030 Nukleotidsequenz zeigte innerhalb der Datenbank keine Sequenzen, die zu romy030 ähnlich sind. Somit scheint 030, das zu romy030 entsprechende Gen, ein neues, zuvor unbekanntes Gen darzustellen, das in Zellen mit niedrigem metastatischen Potential bezogen auf Zellen mit einem hohen metastatischen Potential differentiell exprimiert wird.

Um diese mutmaßliche differentielle Regulierung zu bestätigen, wurde amplifizierte romy030 cDNA als Sondenmolekül für die Hybridisierung von Northern RNA-Blots, enthaltend RNA aus B16 F1 und B16 F10 Zellen verwendet. 1 zeigt die Ergebnisse einer dieser Northern Blot-Analysen, in der gezeigt wird, das die "steady-state"-Spiegel von fomy030 mRNA in Zellen mit niedrigem metastatischen Potential (d. h. in den B16 F1 Zellen) bezogen auf Zellen mit einem hohen metastatischen Potential (d. h. B16 F10-Zellen) signifikant höher sind. Die Spuren 1 und 3 zeigen F1-Zellen und die Spuren 2 und 4 zeigen F10 Zellen. Somit bestätigte diese Northern-Analyse die mutmaßliche differentielle Regulierung von fomy030, die von den Differential Display-Ergebnissen nahegelegt worden war.

Zur Verwendung in PCR-Reaktionen wurden basierend auf der romy 030-Sequenz zwei spezifische Oligonukleotide hergestellt, romy 030U 5'-GGGGAAGCACATCAAGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4) und romy 030L 5'-GCAACTACACTCGGAAAAGC-3' (SEQ ID NO: 5). cDNA-Bibliotheken, die aus mRNA aus normalen Maus-Melanozyten und einer Mau-Melanom-Zellinie isoliert wurden, wurden mit den oben genannten romy030-Sondenmolekülen auf die Anwesenheit von fomy030 durch PCR untersucht. fomy030 wurde in der Melanozyten-Bibliothek, aber nicht in der Melanom-Bibliothek entdeckt. Die Melanom-Bibliothek wurde aus einem stark metastatischen Maus-Melanom K-1736 m2 hergestellt. Dieses Ergebnis stimmt mit der Beobachtung überein, daß fomy030 in verminderten Spiegeln in der metastatischen B16 F10 Melanomzellinie vorhanden ist. Von der subklonierten romy030 DNA wurde ein radioaktives DNA-Sondenmolekül hergestellt. Dieses Sondenmolekül wurde zum Screenen der normalen Maus-Melanozyten-cDNA-Bibliothek verwendet. Während dieses Screenings wurden drei unabhängige positive Klone identifiziert und isoliert. Diese Klone wurden mit fomy030a, fomy030b und fomy030c bezeichnet. Diese cDNAs wurden sequenziert und die überlappenden Teile als identisch identifiziert. Die Nukleotidsequenz aller drei fomy030 cDNAs, bezeichnet als fomy030 Sequenz (SEQ ID NO: 2) ist in den 3A und 3B gezeigt und enthält die romy030-Sequenz. Die hier beschriebenen Ergebnisse legen eine neue Funktion für fomy030 in der Tumorsuppression nahe. Eine Herab-Regulierung von 030 kann als diagnostischer Marker für Tumorprogression, speziell für die Progression zur Metastasierung, verwendet werden. Weiterhin können 030 Genprodukte für die Vorbeugung und Behandlung von Tumorprogressionerkrankungen verwendet werden.

Fohy030-Expression in humanen Gewebeproben

Zur Bestimmung, ob das fohy030 Genprodukt in klinisch relevanter humaner Erkrankung differentiell exprimiert wurde, wurde die fohy030-Genexpression in Biopsieschnitten humaner benigner Naevi (nicht-metastatisches Wachstum von Melanozyten) und maligner Melanome durch in situ-Hybridisierung analysiert. fohy030-Expression wurde in kleinen, periodisch aufretenden Zellen in der Basalschicht der Epidermis (wahrscheinlich Melanozyten) und in der Mehrheit von Naevi-Zellen in Patienten mit benignen Naevi nachgewiesen. In der Mehrheit von Melanomzellen von Patienten mit metastatischem Melanom wurde keine fohy030-Expression nachgewiesen, obwohl Expression in normalen Melanozytenzellen in demselben Gewebeschnitt nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse zeigen, daß das fohy030-Gen mit der Unterdrückung von Metastasen assoziiert ist.

6.3 030 Genexpression ist invers mit dem metastatischen Potential korreliert 6.3.1 Experimentelle Protokolle und Ergebnisse

Der Zusammenhang zwischen 030-Genexpression und Tumorprogression wurde wie hier beschrieben bestätigt. Insbesondere wurde das metastatische Potential von sechs Varianten der B16 Zellinie an Tieren getestet und das metastatische Potential wurde mit der 030-Genexpressionshöhe verglichen, die in den Zellvarianten beobachtet wurde.

Eine Einzelsuspension von B16 F1 Zellen (niedriges metastatisches Potential) wurde intravenös in syngene C57BL/6-Mäuse injiziert. Nach drei Wochen wurden Lungentumoren entnommen und in Gewebekultur ausgesäät. Die folgenden sechs Zellinien wurden in Kultur gehalten: B16 G1, B16 G2, B16 G3, B16 G4, B16 G9 und B16 G12.

Um die metastatische Fähigkeit der oben aufgezählten sechs Tumorzellinien zu testen, wurde von jeder Zellinie die gleiche Zellzahl intravenös in verschiedene Gruppen syngener C57BL/6-Mäuse injiziert. Drei Wochen später wurden die Mäuse getötet und die Lungen aseptisch entnommen. Eine signifikant höhere Anzahl von Tumoren wurde in den Mäusen beobachtet, die die folgenden drei Zellinien injiziert bekamen: B16 G4, B16 G9 und B16 G12. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Zellinien B16 G4, B16 G9 und B16 G12 ein hohes metastatisches Potential und die Zellinien B16 G1, B16 G2 und B16 G3 ein niedriges metastatisches Potential haben.

Die aus diesen drei Zellinien (B16 G4, B16 G9 und B16 G12) mit hohem metastatischen Potential hervorgegangenen Lungentumoren wurden herausgeschnitten und in Gewebekultur genommen, um die folgenden vier Zellinien herzustellen: B16 H5, B16 H6, B16 H7 und B16 H8.

Zur Bestimmung der 030-Genexpression in den oben aufgelisteten Zelllinien (d. h. B16 H5, B16 H6, B16 H7 und B16 H8) wurde eine Northern Analyse anhand der in Abschnitt 6.1.3, supra, beschriebenen Verfahren durchgeführt. 4 zeigt die Ergebnisse einer solchen Northern Blot-Analyse, in der gezeigt wird, das die "steady state"-Spiegel von 030 mRNA in Zellen mit hohem metastatischen Potential (d. h. B16 H5, B16 H6, B16 H7 und B16 H8) signifikant niedriger, bezogen auf die B16 F1 Zellen mit niedrigem metastatischen Potential waren,. Spur 1 stellt die B16 F1 Zellen dar, Spur 2 ist die B16 F10 metastatische Zelle und Spuren 3–6 stellen B16 H5, B16 H6, B16 H7 und B16 H8 dar.

Somit bestätigte diese Northern Analyse die anfängliche Entdeckung dieser Erfindung, dass 030-Expression invers mit dem metastatischen Potential von Tumorzellen korreliert und unterstützt die Theorie, dass das 030-Genprodukt eine Rolle bei der Hemmung von Tumorprogression spielt, einschließlich der Progression zu einem Zustand mit einem hohen metastatischen Potential. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu bemerken, dass die Tumorzellzahl und die Homogenität und der syngene Empfänger sich von einer Zellinie zur anderen in den oben genannten Protokollen nicht veränderten. Deshalb können die Unterschiede in der metastatischen Inzidenz nur intrinsischen Eigenschaften der verschiedenen verwendeten Zellinien zugeordnet werden. Die klonale Selektion von Tumoren aus aufeinanderfolgenden Metastasen führt zu Zellen mit einer höheren Überlebensrate, Bildung und Progression von Tumorfoci in der Lunge. Dies zeigt, das der Rückgang der 030-Expression, der in den vier Zellinien mit hohem metastatischen Potential (d. h. B16 H5, B16 H6, B16 H7 und B16 H8) eine intrinsische Eigenschaft dieser Zellinien ist und mit der Entwicklung, der Progression und dem Potential zur Metastasierung der Tumorzellen zusammenhängt.

7. Beispiel: Verwendung von Fingerprint-Genen als Ersatzmarker in klinischen Studien

Das Expressionsmuster der Fingerprintgene der Erfindung kann als Ersatzmarker verwendet werden, um klinische humane Studien zu überwachen, in denen Arzneistoffe auf ihre Wirksamkeit als Tumorprogressionsbehandlung getestet werden oder können zusätzlich dazu verwendet werden, Patienten zu überwachen, die sich einer klinischen Auswertung zur Behandlung von Tumorprogression unterziehen. Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Gen" ist in Abschnitt 3, supra, definiert. Es können individuelle Fingerprint-Genexpressionsmuster oder alternativ, Fingerprintmuster analysiert werden. Der hier verwendete Begriff "Fingerprint-Muster" wird in Abschnitt 3, supra, definiert.

Die Auswirkung der Verbindung auf die Fingerprintgen-Expression, die normalerweise in Verbindung mit einer Krankheit mit Tumorprogression gezeigt wird, kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Verbindung als Behandlung für solch eine Erkrankung auszuwerten. Zusätzlich kann die Fingerprint-Genexpression dazu verwendet werden, Patienten zu überwachen, die sich einer klinischen Auswertung zur Behandlung von Tumorprogression unterziehen.

Erfindungsgemäß können die Fingerprint-Genexpression und das Fingerprint-Muster, das von einem der in Abschnitt 5.1.1.1 beschriebenen Paradigmen abgeleitet ist, dazu verwendet werden, klinische Studien von Arzneistoffen an menschlichen Patienten zu überwachen. Die in Abschnitt 5.1.1.1 beschriebenen Paradigmen, die in dem Beispiel in Abschnitt 6, supra, veranschaulicht sind, z. B., stellen das Fingerprintmuster von B16 Melanomzellen bereit. Dieses Profil liefert ein bestimmendes Verständnis der metastatischen und nicht-metastatischen Zustände von Melanomzellen. Demgemäß kann der Einfluß von Antikrebs-Chemotherapeutika auf die Melanomzellen durch Durchführung von Differential Display-Analyse an Melanomzellen von Patienten, die sich klinischen Tests unterziehen, gemessen werden.

7.2 Probenanalyse

RNA kann mit Differential Display-Analyse analysiert werden wie in Abschnitt 6.6.1, supra, beschrieben. Eine Abnahme im metastatischen Potential von Tumorzellen wird durch einen Anstieg der Intensität der romy030-Bande, wie in Abschnitt 6.2, supra, beschrieben, angezeigt.

8. Hinterlegung von Mikroorganismen

Der folgende Mikroorganismus wurde bei der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois am 3. März 1995 hinterlegt. Es wurde die angezeigte Zugangsnummer zugeordnet: Mikroorganismus NRRL Zugangsnummer E. coli B-21416


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Bestimmen der Menge einer fohy030-mRNA in einer Testprobe im Verhältnis zu einer Kontrollprobe, umfassend:

    a) Messen der Menge der fohy030-mRNA in einer Testprobe und in einer Kontrollprobe, wobei der Schritt des Messens das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das unter hoch-stringenten Bedingungen an die fohy030-mRNA hybridisiert, umfasst, und

    b) Vergleichen der Menge der fohy030-mRNA in der Testprobe mit der Menge der fohy030-mRNA in der Kontrollprobe, wobei die fohy030-mRNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einer mRNA, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst;

    ii) einer mRNA, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 oder das Komplement davon;

    iii) einer mRNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 oder einem Komplement davon besteht, und

    iv) einer mRNA, die für eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testprobe Melanozyten umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kontrollprobe nicht-metastatische Melanozyten umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testprobe Melanomzeilen umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Vorliegen eines fohy030-mRNA-Spiegels in der Testprobe, der geringer ist als der fohy030-mRNA-Spiegel in der Kontrollprobe, anzeigt, dass das Testsubjekt metastatisches Melanom hat oder ein Risiko hat, es zu entwickeln.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist, das an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 besteht, unter Hybridisierungsbedingungen bei 65°C in 0,5 M NaHPO4, 7% SDS und Waschen bei 68°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
  7. Verfahren zum Bestimmen der Menge einer fohy030-mRNA in einer Testprobe im Verhältnis zu einer Kontrollprobe, umfassend:

    a) Messen der Menge der fohy030-mRNA in einer Testprobe und in einer Kontrollprobe, wobei der Schritt des Messens das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das unter hoch-stringenten Bedingungen an die fohy030-mRNA hybridisiert, umfasst, und

    b) Vergleichen der Menge der fohy030-mRNA in der Testprobe mit der Menge der fohy030-mRNA in der Kontrollprobe, wobei die fohy030-mRNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einer mRNA, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 umfasst;

    ii) einer mRNA, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder das Komplement davon;

    iii) einer mRNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder einem Komplement davon besteht, und

    iv) einer mRNA, die für eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Testprobe Melanozyten umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kontrollprobe nicht-metasiatische Melanozyten umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Testprobe Melanomzellen umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Vorliegen eines fohy030-mRNA-Spiegels in der Testprobe, der geringer ist als der fohy030-mRNA-Spiegel in der Kontrollprobe, anzeigt, dass das Testsubjekt metastatisches Melanom hat oder ein Risiko hat, es zu entwickeln.
  12. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist, das an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 besteht, unter Hybridisierungsbedingungen bei 65°C in 0,5 M NaHPO4, 7% SDS und Waschen bei 68°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
  13. Verfahren zum Bestimmen, ob eine fohy030-mRNA in einer Testprobe vorliegt, umfassend:

    a) Aussetzen einer Probe unter hoch-stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das unter hoch-stringenten Bedingungen an eine fohy030-mRNA hybridisiert, und

    b) Bestimmen, dass die fohy030-mRNA in der Testprobe vorliegt, wenn die Probe mRNA enthält, die an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, wobei die fohy030-mRNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einem mRNA-Molekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst,

    ii) einem mRNA-Molekül, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 oder das Komplement davon,

    iii) einem mRNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukieotidsequenz von SEQ ID NO: 6 besteht oder einem Komplement davon, und

    iv) einem mRNA-Molekül, das für eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus SEQ ID NO: 6 besteht.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Testprobe Melanozyten umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Kontrollprobe nicht-metastatische Melanozyten umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Testprobe Melanomzellen umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Vorliegen eines fohy030-mRNA-Spiegels in der Testprobe, der geringer ist als der fohy030-mRNA-Spiegel in der Kontrollprobe, anzeigt, dass das Testsubjekt metastatisches Melanom hat oder ein Risiko hat, es zu entwickeln.
  18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist, das an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 besteht, unter Hybridisierungsbedingungen bei 65°C in 0,5 M NaHPO4, 7% SDS und Waschen bei 68°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
  19. Verfahren zum Bestimmen, ob eine fohy030-mRNA in einer Testprobe vorliegt, umfassend:

    a) Aussetzen einer Probe unter hoch-stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das unter hoch-stringenten Bedingungen an eine fohy030-mRNA hybridisiert, und

    b) Bestimmen, dass die fohy030-mRNA in der Testprobe vorliegt, wenn die Probe mRNA enthält, die an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, wobei die fohy030-mRNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einer mRNA, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 umfasst,

    ii) einer mRNA, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder das Komplement davon,

    iii) einer mRNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 besteht oder einem Komplement davon, und

    iv) einem mRNA-Molekül, das für eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Testprobe Melanozyten umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Kontrollprobe nicht-metastatische Melanozyten umfasst.
  22. Vertahren nach Anspruch 19, wobei die Testprobe Melanomzellen umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Abwesenheit von detektierbarer fohy030 in der Testprobe anzeigt, dass das Testsubjekt metastatisches Melanom hat oder ein Risiko hat, es zu entwickeln.
  24. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist, das an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 besteht, unter Hybridisierungsbedingungen bei 65°C in 0,5 M NaHPO4, 7% SDS und Waschen bei 68°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
  25. Verfahren zum Bestimmen, ob eine für fohy030 kodierende DNA, die in einer Testprobe vorliegt, eine Mutation enthält, umfassend:

    a) Bestimmen der Nukleotidsequenz von mindestens einem Teil einer fohy030-kodierenden DNA, die in einer Probe vorliegt;

    b) Vergleichen der Sequenz, die in Schritt a) bestimmt wurde, mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6, wobei ein Unterschied zwischen der Nukleotidsequenz, die in Schritt a) bestimmt wurde, und der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 anzeigt, dass die Testprobe eine fohy030-DNA enthält, die eine Mutation enthält.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Schritt b) das Sequenzieren der gesamten für fohy030-kodierenden DNA in der Probe umfasst.
  27. Verfahren zum Bestimmen, ob eine für fohy030 kodierende DNA, die in einer Testprobe vorliegt, eine Mutation enthält, umfassend:

    a) Bestimmen der Nukleotidsequenz von mindestens einem Teil einer fohy030-kodierenden DNA, die in einer Probe vorliegt;

    b) Vergleichen der Sequenz, die in Schritt a) bestimmt wurde, mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8, wobei ein Unterschied zwischen der Nukleotidsequenz, die in Schritt a) bestimmt wurde, und der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 anzeigt, dass die Testprobe eine fohy030-DNA enthält, die eine Mutation enthält.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Schritt b) das Sequenzieren der gesamten für fohy030-kodierenden DNA in der Probe umfasst.
  29. Verfahren zum Bestimmen, ob ein fohy030-Polypeptid in einer Testprobe vorliegt, umfassend:

    a) In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einem Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9,

    ii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7,

    iii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 7,

    iv) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 9, und

    b) Bestimmen, dass ein fohy030-Polypeptid in der Testprobe vorliegt, wenn die Probe ein Polypeptid enthält, das durch den Antikörper selektiv gebunden ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Testprobe Melanozyten umfasst.
  31. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Testprobe Protein umfasst, das aus Melanozyten oder Melanomzellen isoliert wurde.
  32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei die Abwesenheit von detektierbarern Polypeptid, das durch die fohy030-mRNA kodiert wird, in der Testprobe anzeigt, dass das Testsubjekt metastatisches Melanom hat oder ein Risiko hat, es zu entwickeln.
  33. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Patient an einem Tumor leidet, der sich zu einem metastatischen Stadium entwickelt hat, umfassend:

    a) In-Kontakt-Bringen einer ersten Testprobe, die zu einem ersten Zeitpunkt erhalten wurde, und einer zweiten Testprobe, die zu einem zweiten Zeitpunkt erhalten wurde, mit einem Antikörper, der selektiv ein fohy030-Polypeptid bindet,

    b) Bestimmen der relativen Menge des Polypeptids in den ersten und zweiten Testproben und

    c) Bestimmen, dass der Patient an einem Tumor leidet, der sich zu einem metastatischen Stadium entwickelt hat, wenn der Spiegel des Polypeptids in der zweiten Probe geringer ist als der Spiegel des Polypeptids in der ersten Testprobe,

    wobei das fohy030-Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9,

    ii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7,

    iii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 7,

    iv) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 9.
  34. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Patient an einem Tumor leidet, der sich zu einem metastatischen Stadium entwickelt hat, umfassend:

    a) In-Kontakt-Bringen einer Probe und einer Kontrollprobe mit einer Sonde, die selektiv ein fohy030-Polypeptid bindet, wobei die Kontrollprobe normale Zellen aus demselben Gewebe wie die Testprobe umfasst,

    b) Bestimmen der relativen Menge des fohy030-Polypeptids in der Testprobe und der Kontrollprobe und

    c) Bestimmen, dass der Patient an einem Tumor leidet, der sich zu einem metastatischen Stadium entwickelt hat, wenn der Spiegel des Polypeptids in der Testprobe geringer ist als der Spiegel des Polypeptids in der Kontrollprobe, wobei das fohy030-Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9,

    ii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7,

    iii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 7,

    iv) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 9.
  35. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Patient an einem Tumor leidet, der sich zu einem metastatischen Stadium entwickelt hat, umfassend:

    a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem Antikörper, der selektiv ein fohy030-Polypeptid bindet,

    b) Bestimmen der Menge des Polypeptids in der Testprobe und

    c) Bestimmen, dass der Patient an einem Tumor leidet, der sich zu einem metastatischen Stadium entwickelt hat, wenn der Spiegel des Polypeptids in der Testprobe geringer ist als der vorbestimmte Spiegel,

    wobei das fohy030-Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

    i) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9,

    ii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7,

    iii) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 7,

    iv) einem Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines Polypeptids, bestehend aus SEQ ID NO: 9.
Es folgen 13 Blatt Zeichnungen






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