Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin, das in einer Probe einer Körperflüssigkeit enthalten ist, und ein Reagens, das bei diesem Verfahren verwendet werden kann.

Bilirubin ist ein Stoffwechselprodukt von Hämoglobin, das von gealterten Erythrocyten abstammt und die Hauptkomponente des Pigmentes der Gallenflüssigkeit bildet. Blutbilirubin enthält als vorherrschende Komponenten direktes Bilirubin (Konjugatform) und indirektes Bilirubin (freie Form). Direktes Bilirubin mit Gruppen von Propionsäure an der Seitenkette, die enzymatisch eine Esterbindung hauptsächlich mit Glucuronsäure in der Leber eingehen, sind sehr wasserlöslich und reagieren leicht mit einem Diazoreagens, um eine Azofarbsubstanz zu bilden. Indirektes Bilirubin, bei dem die Gruppen der Propionsäure in freier Form vorliegen, weist eine geringe Wasserlöslichkeit auf und reagiert mit einem Diazoreagens nur in der Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers wie Alkohol usw. Indirektes Bilirubin kann bestimmt werden durch das Abziehen des direkten Bilirubins vom Gesamtbilirubin, ein Messwert der konjugierten Form und freien Form, das durch eine Diazoreaktion mit einem Diazoreagens in der Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers erhältlich ist.

Einzelne Bilirubinkonzentrationen der Konjugat- (direkten) Form und der freien (indirekten) Form können daher getrennt bestimmt werden, um verschiedene Leberkrankheiten und Gelbsucht zu diagnostizieren. Die Bilirubinmessung ist daher eine der wichtigen klinischen Untersuchungen.

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von direktem Bilirubin sind vorgeschlagen worden, wie unten beschrieben, wie z. B. ein Verfahren unter Verwendung eines Diazoreagens, ein Verfahren unter Verwendung von Bilirubinoxidase, ein Verfahren unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie, ein Verfahren unter Verwendung einer chemischen oxidierenden Substanz und dergleichen.

Bei dem Diazoverfahren reagiert Bilirubin mit einem Diazoreagens unter Bildung von Azobilirubin. Das Azobilirubin hat ein Absorptionsmaximum, das größer als das sichtbare Absorptionsmaximum von Bilirubin selbst ist und ist leicht durch optische Änderungen nachweisbar. Das Verfahren unter Verwendung eines Diazoreagens kann sehr variabel sein wegen der Art des Reaktionsbeschleunigers für indirektes Bilirubin, den Bedingungen zur Reaktionsbeendigung und den Bedingungen zum Bestimmen von Azobilirubin (Malloy, H. T., Evelyn, K. A.: J. Biol. Chem., 119, 481 (1937); The determination of bilirubin with the photoelectric colorimeter; Jendrassik, L., Grof, P., Biochem. Z., 297, 81 (1938): Vereinfachte Photometrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins; Micha ėlsson, M., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 12 (Supp. 56), 1–80 (1937): Bilirubin determination in serum and urine).

Bei dem Verfahren unter Verwendung einer Bilirubinoxidase wird das Enzym einer Probe ausgesetzt, von der angenommen wird, dass sie Bilirubin enthält, um Bilirubin zu Biliverdin zu oxidieren, wodurch die Absorption von Bilirubin in dem maximalen Absorptionswellenlängenbereich verschwindet. Direktes Bilirubin kann folglich bestimmt werden durch diese Abnahme der Absorption. Verschiedene Modifikationen wurden vorgenommen, um eine Reaktion von indirektem Bilirubin zu hemmen. Die folgenden Verfahren wurden für solche Modifikationen vorgeschlagen.

• B1) Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin, wobei eine Bilirubinoxidase in einem pH-Bereich von 3,5 bis 4,5 umgesetzt wird (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 59-125899);
• B2) Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin, das das Reagieren einer Bilirubinoxidase mit Bilirubin in einer sauren Pufferlösung von pH 5 bis 6, die ein anionisches oberflächenaktives Mittel enthält, umfasst (Shogo Otsuji: Clin. Biochem., 21, 33–38 (1988) und japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 60-152955);
• B3) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von konjugiertem Bilirubin, das das Umsetzen einer Bilirubinoxidase in einer Pufferlösung von pH 9 bis 10 und das Messen einer Absorptionsänderung umfasst (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 62-58999);
• B4) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von direktem Bilirubin, das das Umsetzen einer Bilirubinoxidase in einer Pufferlösung von pH 2,0 bis 3,3, die Kaliumferrocyanid und/oder Kaliumferricyanat und Messung einer Absorptionsänderung, umfasst (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 64-5499);
• B5) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von direktem Bilirubin, das das Umsetzen einer Bilirubinoxidase in der Gegenwart einer Fluorverbindung oder eines reduzierenden Mittels umfasst (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 5-276992); und
• B6) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von direktem Bilirubin, umfassend die Möglichkeit der Umsetzung des Bilirubins, wobei es ermöglicht wird, dass eine Bilirubinoxidase in der Gegenwart einer Tetrapyrrolverbindung wirken kann (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 7-231795).
• B7) EP-A-0 678 580 beschreibt ein Verfahren zur Messung von direktem Bilirubin durch Reaktion von Bilirubinoxidase mit direktem Bilirubin in der Gegenwart einer Tetrapyrrolverbindung und eines zusätzlichen Reaktionsverlangsamers für indirekter Bilirubin, z. B. Hydrazine, Hydroxylamine, Oxime, aliphatische mehrwertige Amine, Phenole, usw. Die Beispiele zeigen jedoch, dass der Reaktionsverlangsamer nicht wirksam das Oxidieren von indirektem Bilirum hemmt.

Das Verfahren, bei dem HPLC eingesetzt wird, umfasst die Elution von Bilirubin durch einen organischen Lösungsmittelgradienten auf einer umgekehrten Säule und das Fraktionieren der Bilirubinfraktionen aufgrund des Unterschiedes in der hydrophilen/hydrophoben Eigenschaft. Gemäß HPLC wird Serumbilirubin in vier Fraktionen von &agr;, &bgr;, &ggr; und &dgr; fraktioniert. Die &agr;-, &bgr;-, &ggr;- und &dgr;-Fraktionen werden jeweils fraktioniert, Bilirubin in freier Form, Bilrubin bei dem nur ein oder zwei Propionsäuregruppen an der Seitenkette in einem Molekül eine Esterbindung mit Glucuronsäure (Bilirubinmonoglucuronid) bilden, Bilirubin, bei dem zwei Propionsäuregruppen Esterbindungen mit Glucuronsäure (Bilirubindiglucuronid) bilden und Bilirubin, das eine kovalente Bindung mit Albumin bildet. Es wird angenommen, dass die &dgr;-Fraktion durch eine nicht-enzymatische Reaktion der &ggr;-Fraktion mit Albumin gebildet wird (Toshio Yamamoto, Nippon Naibunpi Gakkai Zasshi, 78 (11), 36–41 (1989)). Es ist bekannt, dass die &agr;-Fraktion, die durch HPLC erhältlich ist, indirektem Bilirubin entspricht und die &bgr;- und &ggr;-Fraktionen direktem Bilirubin entsprechen, wenn durch das Verfahren unter Verwendung eines Diazoreagens bestimmt (John J. Lauff, Clin. Chem., 28 (4) 629–637 (1982)). Das Verfahren unter Verwendung von HPLC wurde kontinuierlich modifiziert, um die komplizierte Vorbehandlung einer Probe zu verbessern, und über solche Modifikationen wurde berichtet von Nakamura, H.: Bunseki Kagaku, 36, 352–355 (1987); Yukihiko Adachi: Gastroenterologia Japonica, 23 (3), 268–272 (1988); Yuko Kato: Kinkidaigaku Igaku Zasshi, 14 (1), 97–112 (1989).

Das Verfahren unter Verwendung eines chemischen oxidierenden Mittels umfasst das Umsetzen eines niedrig-molekularen Oxidierungsmittels in Lieu einer Bilirubinoxidase, um Bilirubin zu Biliverdin zu oxidieren. Wenn oxidiert, verringert sich die Absorbanz von Bilirubin. Demzufolge kann direktes Bilirubin auf Basis der verringerten Absorbanz bestimmt werden. Verschiedene Modifikationen wurden bei diesem Verfahren außerdem durchgeführt, um eine Reaktion von indirektem Bilirubin zu hemmen. Bei den folgenden Verfahren werden solche Modifikationen vorgeschlagen.

• D1) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von direktem Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, dass Kupferionen und Thioharnstoff oder ein Derivat davon mit einer Probenlösung umgesetzt wird (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 63-118662).
• D2) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, dass Vanadinsäureionen oder dreiwertige Manganionen als oxidiertes Agens eingesetzt werden, um optische Änderungen einer Probenlösung zu messen (japanisches offengelegtes Patent KOKAI Nr. 5-18978). Zur direkten Bilirubinbestimmung durch dieses Verfahren wird/werden eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydrazinen, Hydroxylaminen, Oximen, aliphatischen mehrwertigen Aminen, Phenolen, wasserlöslichen Substanzen mit hohem Molekulargewicht und nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln, mit einem HLB von wenigstens 15 als Reaktionshemmstoffe für indirektes Bilirubin eingesetzt.
• D3) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, dass salpetrige Säure als oxidierendes Agens eingesetzt wird, um optische Änderungen einer Probenlösung zu messen (WO 96-17251). Um die Messung von direktem Bilirubin durch dieses Verfahren zu bewirken, wird ein Reaktionshemmer für indirektes Bilirubin, wie Polyoxyethylen (n-Alkyl- oder Isoalkyl-)ether mit einem HLB von 12 bis 15, Thioharnstoff, Hydrazin, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen, eingesetzt.

Jedes dieser Verfahren A) bis D) hat sowohl Vor- als auch Nachteile und keines ist wirklich zufriedenstellend für den erforderlichen Bilirubintest. Die Nachteile, die diese Verfahren aufweisen, werden nachfolgend beschrieben.

Bei dem Verfahren A) unter Verwendung eines Diazoreagens wird eine Reaktion in der Abwesenheit eines Reaktionsbeschleunigers eine direkte Diazoreaktion genannt, von der der Ausdruck direktes Bilirubin stammt. Es ist jedoch in vielen Zeitschriften berichtet worden, dass ein Teil des indirekten Bilirubins auch diese direkte Diazoreaktion bewirken könnte (z. B. Killenberg, P. G., Gastroenterology, 78, 1011–1015 (1980); Blankaert, N., J. Lab. Clin. Med., 96, 198– 212 (1980); Yukio Manabe, Bunseki Kaaku, 30, 736–740 (1981), Chan, K. M., Clin. chem., 31, 1560–1563 (1985); Akira Kosaka, Kensa-to-Gijutsu, 14, 971–975 (1986); Yukihiko Adachi, Seibutsu-Shiryou Bunseki, 9, 33–42 (1986)). Selbst wenn Bilirubin durch das oben genannte direkte Diazoverfahren bestimmt werden kann, stellt der so erhaltene Bilirubinwert daher nicht unbedingt "direktes Bilirubin" dar.

Das Verfahren B) unter Verwendung einer Bilirubinoxidase ist entwickelt worden, um Bilirubinwerte zu erhalten, die so nahe wie möglich an den Messwerten, die durch die direkte Diazoreaktion definiert werden, liegen. Eine natürliche Konsequenz ist, dass die Oxidation ebenfalls zum Teil mit indirektem Bilirubin bewirkt wird und daher das Verfahren B) keine genaue Messung von "direktem Bilirubin" ergibt. Dies hat Modifikationen des Verfahrens B) erforderlich gemacht, um eine ungewünschte Reaktion mit indirektem Bilirubin zu vermeiden. Bei einem verbesserten Verfahren wird es einer Bilirubinoxidase ermöglicht, in der Gegenwart einer Fluorverbindung zu reagieren (japanisches offengelegtes Patent Kokai Nr. 5-276992), und bei einem weiteren Verfahren wird es einer Bilirubinoxidase ermöglicht, in der Gegenwart einer Tetrapyrrolverbindung zu reagieren (japanisches offengelegtes Patent Kokai Nr. 7-231795). Diese Verfahren beinhalten jedoch Probleme, dadurch dass die Verwendung der Fluorverbindung bei dem ersten Verfahren zu einer Umweltverschmutzung führt und die Notwendigkeit, dass eine Tetrapyrrolverbindung in einer Reaktionslösung vorhanden ist, die Lösung unstabil macht, wodurch es nicht möglich ist, das Assaysystem in einem Lösungszustand über einen Zeitraum zu verwenden, der für das Assay erforderlich ist.

Das Verfahren C) unter Verwendung von HPLC liefert eine hohe Effizienz der Analyse, aber auf der anderen Seite erfordert es einen beträchtlichen Zeitraum von ungefähr 1 Stunde, um eine Probe zu behandeln. Daher ist das Verfahren C) nicht adäquat zur Behandlung einer großen Zahl von Proben. Darüber hinaus ist das Verfahren C), das teure und spezielle Vorrichtungen erfordert, nicht für alle Zwecke verfügbar.

Das Verfahren D) unter Verwendung eines chemischen oxidierenden Mittels beinhaltet ähnliche Probleme wie die, die bei dem Verfahren B) unter Verwendung einer Bilirubinoxidase beobachtet werden, da das Verfahren D) ebenfalls entwickelt wurde, um Bilirubinmesswerte zu erhalten, die so nahe wie möglich, an denen liegen, die durch die direkte Diazoreaktion definiert werden, und folglich wird ein Teil des indirekten Bilirubins oxidiert. In dieser Hinsicht ist es schwierig zu sagen, dass das Verfahren D) genau "direktes Bilirubin" misst.

Wie oben angeführt, kann keines der vorgenannten Verfahren perfekt die Beeinträchtigung von indirektem Bilirubin vermeiden oder kann eine stabile und sichere Messung von direktem Bilirubin liefern. Daher ist es sehr erwünscht, ein Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin zu entwickeln, das diese Mängel des Standes der Technik behebt und alle Erfordernisse erfüllt.

Die Erfindung wurde aus Sicht der derzeitigen Situation vervollständigt. Erfindungsgemäß wird ein sicheres und stabiles Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin bereitgestellt, bei dem die Beeinträchtigung von indirektem Bilirubin vollständig vermieden werden kann und keine Gefahr für die Umweltverschmutzung wie Wasserabfallbehandlung, usw. besteht.

Die Erfinder haben ausführlich die Reaktivität von indirekten und direkten Bilirubinen in einem optimalen pH-Wert einer Bilirubinoxidase untersucht. Als Folge wurde festgestellt, dass, wenn es ermöglicht wird, dass eine Bilirubinoxidase auf Bilirubin in der Gegenwart von Thiocyanation, einem Hydrazid, reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (hiernach häufig mit NADH abgekürzt), reduziertem Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (hiernach häufig mit NRDPH abgekürzt), oder einem Kaliumion von 100 mM bis 800 mM zu wirken, die Beeinträchtigung von indirektem Bilirubin durch seine Oxidation vollständig gehemmt werden kann und gleichzeitig die Oxidation von direktem Bilirubin selektiv quantitativ fortgesetzt werden kann. Anschließend kann direktes Bilirubin genau bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung wurde folglich gemacht.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin, das umfasst: Kontaktieren einer Bilirubinoxidase mit einer Probe einer Körperflüssigkeit und Messen des direkten Bilirubins in der Probe mittels der optischen Veränderung der Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilirubinoxidase in der Gegenwart von mindestens einem Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Thiocyanation, einem Hydrazid, NADH, NADPH und einem Kaliumion von 100 mM bis 800 mM wirkt.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Reagenskit zur Messung von direktem Bilirubin, umfassend als wesentliche Bestandteile:

• i) eine Bilirubinoxidase; und
• ii) mindestens einen Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin, ausgewählt aus einem Thiocyanation, einem Hydrazid, NADH, NADPH und einem Kaliumion von 100 mM bis 800 mM.

1 zeigt den Reaktionszeitverlauf des Beispiels 1 und Vergleichsbeispiels 1, wobei Messpunkte (ca. 20 Sek/Punkt) auf der Abszisse angegeben sind und die Absorbanz × 10.000 auf der Ordinate angegeben ist.

2 zeigt den Reaktionszeitverlauf in Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 1, wobei die Messpunkte (ca. 20 Sek/Punkt) auf der Abszisse angegeben sind und die Absorbanz × 10.000 auf der Ordinate angegeben ist.

3 zeigt den Reaktionszeitverlauf in Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1, wobei die Messpunkte (ca. 20 Sek/Punkt) auf der Abszisse angegeben sind und die Absorbanz × 10.000 auf der Ordinate angegeben ist.

4 zeigt den Reaktionszeitverlauf in Beispiel 4 und Vergleichsbeispiel 1, wobei die Messpunkte (ca. 20 Sek/Punkt) auf der Abszisse angegeben sind und die Absorbanz × 10.000 auf der Ordinate angegeben ist.

5 zeigt den Reaktionszeitverlauf von indirektem Bilirubin unter Verwendung einer Bilirubinoxidase in Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel 1, wobei die Messpunkte (ca. 20 Sek/Punkt) auf der Abszisse angegeben sind und die Absorbanz × 10.000 auf der Ordinate angegeben ist.

6 zeigt den Reaktionszeitverlauf von indirektem Bilirubin unter Verwendung einer Bilirubinoxidase in Beispiel 6 und Vergleichsbeispiel 1, wobei die Messpunkte (ca.

20 s/Punkt) auf der Abszisse angegeben sind und die Absorbanz × 10.000 auf der Ordinate angegeben ist.

7 zeigt die in Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben ist und die Abnahme der Absorbanz auf der Ordinate angegeben ist.

8 zeigt die in Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben ist und die Abnahme der Absorbanz auf der Ordinate angegeben ist.

9 zeigt die in Beispiel 9 und Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben ist und die Abnahme der Absorbanz auf der Ordinate angegeben ist.

10 zeigt die in Beispiel 10 und Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben ist und die Abnahme der Absorbanz auf der Ordinate angegeben ist.

11 zeigt die in Beispiel 11 und Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben ist und die Abnahme der Absorbanz auf der Ordinate angegeben ist.

12 zeigt die in Beispiel 12 und Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben ist und die Abnahme der Absorbanz auf der Ordinate angegeben ist.

In der vorliegenden Erfindung sind die zu untersuchenden Proben nicht besonders eingeschränkt, solange von diesen Proben vermutet wird, dass sie direktes Bilirubin oder indirektes Bilirubin enthalten. Im allgemeinen umfassen die Proben solche von lebenden Körperflüssigkeiten wie Plasma, Serum, Urin, usw. und Modellproben davon.

Erfindungsgemäß umfasst das Thiocyanation, das als Reaktioninhibitor für indirektes Bilirubin verwendet wird, ein Alkalimetallthiocyanat, ein alkalisches Erdmetallthiocyanat, Ammoniumthiocyanat, usw., ist aber nicht darauf beschränkt, wobei Natriumthiocyanat und Kaliumthiocyanat bevorzugt sind.

Das erfindungsgemäß verwendete Hydrazid umfasst, ist aber nicht besonders darauf beschränkt, Acetylhydrazid, Phthalsäurehydrazid, Isophthaloyldihydrazid, Terephthalsäuredihydrazid, Benzolsulfonylhydrazid, usw.

Reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) oder reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NRDPH) können als Reaktionsreagenzien eingeführt werden. Alternativ kann außerdem NADH oder NADPH von oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid durch eine Enzymreaktion unter Verwendung einer Alkoholdehydrogenase, einer Glucose-6-phosphatdehydrogenase, usw. abstammen, solange die Wirkung, die erfindungsgemäß erforderlich ist, erreicht werden kann.

Das erfindungsgemäß verwendete Kaliumion umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, Kaliumchlorid, Kaliumbromid, Kaliumacetat, Kaliumcitrat, Kaliumtartrat, Kaliumlactat, Kaliumphthalat, Kaliumsulfat, usw.

Erfindungsgemäß sollte der Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin in einer optimalen Konzentration in der Reaktionslösung vorhanden sein, bei der die Oxidation verläuft. Bei einer zu niedrigen Konzentration kann die Reaktion von indirektem Bilirubin nicht ausreichend gehemmt werden, wobei bei einer zu hohen Konzentration die Wirkung einer Bilirubinoxidase übermäßig sein kann, und die Oxidation von direktem Bilirubin beeinträchtigt. Wenn das Thiocyanation oder das Hydrazid als Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin verwendet wird, wird die Konzentration daher bevorzugt in einem Bereich von 0,1 mM bis 100 mM, mehr bevorzugt 0,2 mM bis 50 mM, in der Enzymreaktionslösung gehalten.

Wenn NADH oder NADPH als Reaktionsinhibitor verwendet wird, liegt die Konzentration im allgemeinen im Bereich von 0,1 mM bis 10 mM, bevorzugt 0,2 mM bis 5 mM.

Im Fall der Verwendung des Kaliumions als Inhibitor ist die Konzentration bevorzugt im Bereich von 100 mM bis 800 mM, bevorzugter von 110 mM bis 600 mM, am meisten bevorzugt von 120 mM bis 400 mM, in der ultimativen Reaktionslösung. Wenn die Kaliumionenkonzentration weniger als 100 mM beträgt, kann die hemmende Wirkung auf die Reaktion von indirektem Bilirubin nicht ausreichend sein. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration mehr als 800 mM beträgt, steigert sich die inhibierende Wirkung einer Bilirubinoxidase, so dass die Oxidation von direktem Bilirubin beeinträchtigt sein kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die indirekten Bilirubinreaktionsinhibitoren wirksam, wenn sie allein verwendet werden, aber die Wirkung wird häufig verbessert durch Verwendung einer Kombination von zwei oder mehreren. Zum Beispiel können mindestens zwei Inhibitoren, ausgewählt aus dem Thiocyanation, Hydrazid, NADH und NADPH, in Kombination verwendet werden. Alternativ kann ein oder können mehrere Inhibitoren, ausgewählt aus dem Thiocyanation, Hydrazid, NADH und NADPH, in Kombination mit dem Kaliumion verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die erfindungsgemäße Bilirubinoxidase, ist aber nicht darauf beschränkt, Bilirubinoxidase, abstammend aus Myrothecium verrucaria (im Handel von Amano Pharmaceutical Co., Ltd. erhältlich), Bilirubinoxidase aus Trachyderma tsunodae (im Handel erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd.), Bilirubinoxidase, abstammend von der Gattung Pleurotus (im Handel von K. K. Seishin erhältlich), und dergleichen. Es ist wünschenswert, das Enzym in einer Konzentration von 0,001 bis 10 E/ml, bevorzugt 0,01 bis 1 E/ml, am meisten bevorzugt 0,02 bis 0,5 E/ml, in der ultimativen Reaktionslösung zu verwenden.

Wenn eine Bilirubinoxidase mit einer Probe einer Körperflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, ist der pH-Bereich nicht besonders beschränkt, solange die Enzymaktivität unter Optimumbedingungen für eine Bilirubinoxidase entfaltet werden kann. Der pH-Bereich beträgt bevorzugt von 4,5 bis 6,5, am meisten bevorzugt 5,0 bis 6,0. Jede Pufferlösung kann erfindungsgemäß ohne irgendwelche Einschränkungen verwendet werden, wenn die Lösung eine puffernde Wirkung in dem oben identifizierten pH-Bereich aufweist. Spezifische Beispiele einer solchen Pufferlösung sind eine Kaliumhydrogenphthalat/Natriumhydroxidpufferlösung, eine Natriumcitrat/Natriumhydroxidpufferlösung, eine Äpfelsäure/Natriumhydroxidpufferlösung, usw. Vor allem ist eine Pufferlösung, enthaltend ein Kaliumsalz, wie Kaliumhydrogenphthalat oder dergleichen, bevorzugt, da das Kaliumion die Reaktion von indirektem Bilirubin inhibiert.

Erfindungsgemäß kann in einer Probe enthaltendes direktes Bilirubin selektiv unter Verwendung des Reagenskits zur Messung von direktem Bilirubin, umfassend z. B. eine Bilirubinoxidase und mindestens indirekte Bilirubinreaktionsinhibitoren, untersucht werden.

Ein bevorzugtes Reaktionskit zur Messung von direktem Bilirubin umfasst zwei Reagenzien, eine erste Reaktionslösung, umfassend z. B. Thiocyanationen oder das Hydrazid, und eine zweite Reaktionslösung, umfassend eine Bilirubinoxidase. Besonders bevorzugt enthält die erste Reaktionslösung außerdem Kaliumionen.

Bei einer weiteren Ausführungsform des Reagenskits wird das Kit derart entworfen, um die notwendigen Reagenskomponenten in zwei Lösungen wegen der Stabilität von NADH, NADPH oder einer Bilirubinoxidase zu trennen. Folglich enthält eine erste Reaktionslösung z. B. eine Pufferlösung mit einem pH von 4,5 bis 6,5, bevorzugt einen pH von 5,0 bis 6,0, und eine zweite Reaktionslösung enthält eine Bilirubinoxidase und NADH, NADPH oder Kaliumionen. Wenn NADH oder NADPH verwendet wird, hat die zweite Reaktionslösung bevorzugt einen pH von 9 oder mehr, bevorzugter 9 bis 11,0, aus Sicht der Stabilität von NADH oder NADPH in seinem Lösungszustand. Es ist bevorzugt, dass die zweite Reaktionslösung außerdem Kaliumionen enthält.

Wenn Kaliumionen allein als Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin verwendet werden, wird der pH-Bereich der zweiten Reagenslösung, die Bilirubinoxidase enthält, angesichts der Stabilität von Bilirubinoxidase, bevorzugt von auf 7 bis 11 gehalten.

Illustrative Beispiele der Pufferlösung sind Kaliumhydrogenphthalat/Natriumhydroxidpufferlösung, eine Natriumcitrat/Natriumhydroxidpufferlösung, eine Äpfelsäure/Natriumhydroxidpufferlösung usw.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erste Reagenslösung außerdem Kaliumionen.

Erfindungsgemäß kann direktes Bilirubin unter Verwendung des oben beschriebenen Kits wie folgt bestimmt werden. Eine Probe wird mit einer ersten Reagenslösung gemischt. Die Absorbanz bei einer bestimmten Wellenlänge, bevorzugt bei 450 nm in einem Wellenlängenbereich (430–460 nm) auf Basis des Bilirubins in der Lösung, wird bestimmt, um den Messwert als "Absorbanz 1" zu erhalten. Anschließend wird eine zweite Reagenslösung, die Bilirubinoxidase enthält, zu der Lösung gegeben, um die Oxidation bei 25 bis 40°C 3 bis 15 Minuten durchzuführen. Daraufhin wird wieder die Absorbanz bei einer bestimmten Wellenlänge auf Basis des Bilirubins in der Lösung gemessen, um den Messwert "Absorbanz 2" zu erhalten. Nachdem die Absorbanz 1 und Absorbanz 2 auf das Lösungsvolumen korrigiert wurden, wird die Absorbanzänderung vor und nach der Oxidation bestimmt. Die direkte Bilirubinkonzentration in der Probe kann bestimmt werden durch die Änderung der Absorbanz und einer Kalibrierungskurve, die zuvor auf Basis von Änderungen der Absorbanz hergestellt wurden, die durch das gleiche Verfahren erhalten wurden, wobei Standardlösungen bekannter Bilirubinkonzentrationen eingesetzt wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von direktem Bilirubin ist bei vielseitigen automatischen Analysatoren, die im Handel für klinische Untersuchungen erhältlich sind, wie dem Hitachi-Modell 7070 automatischen Analysator, usw., anwendbar. Die Probenlösung wird bevorzugt in einem Volumen von 0,005 bis 1 ml verwendet.

Die Thiocyanationen, Hydrazide und Kaliumionen, die in den Reagenzien zur Bestimmung von direktem Bilirubin verwendet werden, sind in einer wässrigen Lösung nicht besonders stabil. Wenn der pH bei 9 oder mehr gehalten wird, sind jedoch NADH oder NADPH und eine Bilirubinoxidase in einer wässrigen Lösung stabil. Das erfindungsgemäße Reagens kann daher als flüssiges Reagens in der Form einer wässrigen Lösung bereitgestellt werden.

Das Reagens zur Bestimmung von direktem Bilirubin kann außerdem andere bekannte Reagenzien enthalten, wie ein antiseptisches Mittel, einen Chelatbildner, ein oberflächenaktives Mittel usw., solange sie in herkömmlichen Reagenzien oder Reagenskits verwendet werden können. Diese bekannten Reagenzien können in dem erfindungsgemäßen Reagens verwendet werden, wobei gemäß bekannter Verfahren genau ausgewählt wird.

Die folgenden Beispiele wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die Oxidation von indirektem Bilirubin in der Gegenwart von 100 mM bis 800 mM Kaliumionen (Beispiel 1), Thiocyanationen (Beispiel 2), Hydraziden (Beispiel 3 und 4), NADH (Beispiel 5) oder NADPH (Beispiel 6) inhibiert werden kann, wenn es mit Bilirubinoxidase oxidiert wird. In Vergleichsbeispiel 1 werden die gleichen Verfahren in der Abwesenheit dieser Inhibitoren durchgeführt. Details über diese Reagenzien, Proben und Verfahren sind unten aufgeführt, und die erhaltenen Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen und den Figuren ebenfalls gezeigt. (1) Erste und zweite Reagenslösungen

Erste Reagenslösung, die in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird Phthalsäure 150 mM Triton X-100 5,50% pH 0,05 (mit NaOH eingestellt) Erste Reagenslösung, die in Beispiel 1 verwendet wird Phthalsäure 150 mM Kaliumchlorid 200 mM Triton X-100 0,05% pH 5,50 (mit NaOH eingestellt) Erste Reagenslösung, die in Beispiel 2 verwendet wird Kaliumhydrogenphthalat 150 mM Natriumthiocyanat 10 mM Triton X-100 0,05% pH 5,50 (mit NaOH eingestellt) Erste Reagenslösung, die in Beispiel 3 verwendet wird Kaliumhydrogenphthalat 150 mM Benzolsulfonylhydrazid 10 mM Triton X-100 0,05% pH 5,50 (mit NaOH eingestellt) Erste Reagenslösung, die in Beispiel 4 verwendet wird Kaliumhydrogenphthalat 150 mM Isophthaloyldihydrazid 10 mM Triton X-100 0,05% pH 5,50 (mit NaOH eingestellt) Erste Reagenslösung, die in den Beispielen 5 und 6 verwendet wird Kaliumhydrogenphthalat 150 mM Triton X-100 0,05% pH 5,50 Zweite Reagenslösung, die in Vergleichsbeispiel 1 und Beispielen 1 bis 4 verwendet wird Tris(hydroxymethyl)aminomethan 10 mM Bilirubinoxidase (abstammend von der Gattung Pleurotus) 0,24 E/ml pH 10,2 Zweite Reagenslösung, die in Beispiel 5 verwendet wird Tris(hydroxymethyl)aminomethan 10 mM NADH 5 mM Bilirubinoxidase 0,24 E/min pH 10,2 Zweite Reagenslösung, die in Beispiel 6 verwendet wird Tris(hydroxymethyl)aminomethan 10 mM NADPH 5 mM Bilirubinoxidase 0,24 E/ml pH 10,2

Eine Lösung, enthaltend 50 mg/dl indirektes Bilirubin und 6,0 g/l humanes Serumalbumin wird als Probenlösung verwendet. Die Probenlösung wird wie folgt hergestellt.

Nachdem 5 mg indirektes Bilirubin ausgewogen wurden, wurde es in 0,4 ml Dimethylsulfoxid dispergiert, und 0,4 ml 100 mM Natriumcarbonatlösung wurden zu der Dispersion gegeben, um indirektes Bilirubin aufzulösen. Sofort danach wurde die Lösung mit 9,2 ml 100 mM Trispuffer (pH 7,00), enthaltend humanes Serumalbumin, verdünnt, um die Probenlösung zu ergeben.

Unter Verwendung eines automatischen Analysators, Hitachi Modell 7070, wurde die Messung durchgeführt. Nach der Mischung von 10 &mgr;l Probenlösung 300 &mgr;l der ersten Reagenslösung und 75 &mgr;l der zweiten Reagenslösung wurde alle Vorgänge automatisch durchgeführt und die Änderung der Absorbanz bei der Hauptwellenlänge von 450 nm und der Nebenwellenlänge von 546 nm wurde durch das 2-Punkteverfahren gemessen.

Genauer gesagt wird die Probenlösung mit der Erstreagenzlösung in dem automatischen Analysator gemischt. Nach fünfminütiger Inkubierung bei 37°C wird die Absorbanz auf Basis des in der Mischung enthaltenen Bilirubins bei einer Hauptwellenlänge von 450 nm und einer Nebenwellenlänge von 546 nm gemessen.

Anschließend wurde die zweite Reagenslösung, die Bilirubinoxidase enthält, zu der Lösungsmischung gegeben, gefolgt von der 5-minütigen Oxidation von Bilirubin bei 37°C. Wieder wurde die Absorbanz auf Basis von Bilirubin in der Lösung bei der oben angegebenen Wellenlängen gemessen (Absorbanz 2). Die Messwerte der Absorbanz 1 und Absorbanz 2 wurden auf das Lösungsvolumen korrigiert. Anschließend wurde eine Abnahme der Absorbanz vor und nach der Oxidation erhalten. Diese Messungen und die Berechnung werden automatisch von dem automatischen Analysator durchgeführt.

Die Ergebnisse der Abnahme der Absorbanz von indirektem Bilirubin in Vergleichsbeispiel 1 und Vergleichsbeispielen 1 bis 6 sind in Tabelle 1 gezeigt. Zusätzlich ist der Reaktionszeitverlauf in dem automatischen Analysator für Vergleichsbeispiel 1 und Beispiele 1 bis 6 jeweils in den 1 bis 6 gezeigt.

Aus den Ergebnissen der Tabelle 1 und den 1 bis 6 ist klar ersichtlich, dass in den Beispielen 1 bis 6, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, eine Abnahme der Absorbanz aufgrund der Oxidation von indirektem Bilirubin geringfügig ist und fast innerhalb der Messfehler, die bei dem automatischen Analysator erlaubt sind. Keine Abnahme der Absorbanz ist außerdem im Reaktionszeitverlauf zu bemerken. Auf der anderen Seite wurde eine signifikante Abnahme der Absorbanz, begleitet von der Oxidation von indirektem Bilirubin, in Vergleichsbeispiel 1 bemerkt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass in allen erfindungsgemäßen Untersuchungen die Reaktion von indirektem Bilirubin mit der Bilirubinoxidase in der Gegenwart von Thiocyanationen, Hydraziden, 100 mM bis 800 mM Kaliumionen, NADH oder NADPH gehemmt wird.

Eine Lösung, enthaltend 5 mg/dl Ditaurobilirubin (wenn als Bilirubin berechnet), das ein synthetisches konjugiertes Bilirubin ist, und 6,0 g/l humanes Serumalbumin in 100 mM Trispufferlösung (pH 7,00) wurde hergestellt. Die Lösung wurde als direkte Bilirubinlösung verwendet. Davon getrennt wurde eine Lösung, enthaltend 5 mg/dl nicht-konjugiertes Bilirubin und 6,0 g/l humanes Serumalbumin in 100 mM Trispufferlösung (pH 7,00) hergestellt. Die Lösung wurde als indirekte Bilirubinlösung verwendet. Die direkte Bilirubinlösung wurde mit der indirekten Bilirubinlösung verdünnt, um verschiedene Probenlösungen mit der gleichen Gesamtkonzentration von Bilirubin (5 mg/dl), aber unterschiedlichen Konzentrationen von direktem Bilirubin, herzustellen. Sechs (6) Probenlösungen wurden hergestellt, bei denen die Verhältnisse von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin jeweils 0,0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 bzw. 1,0 h betragen.

Eine Abnahme der Absorbanz wird unter Verwendung der gleichen Reagenzien und der gleichen Bedingungen wie bei der Messung, die für die Beispiele 1 bis 6 beschrieben ist, gemessen, außer dass Probenlösungen verwendet wurden, die in (1) oben hergestellt wurden. Die Untersuchungen wurden jeweils Beispiel 7 (wobei Kaliumionen verwendet wurden), Beispiel 8 (wobei Thiocyanationen verwendet wurden), Beispiel 9 (Hydrazid), Beispiel 10 (Hydrazid), Beispiel 11 (NADH) bzw. Beispiel 12 (NADPH) genannt.

Die Ergebnisse sind in 7 bis 12 gezeigt. In den Figuren wird das Verhältnis von direktem Bilirubin zu Gesamtbilirubin auf der Abszisse angegeben und eine Abnahme der Absorbanz wird auf der Ordinate angegeben. In den Beispielen 7 bis 12, die das erfindungsgemäße Verfahren einsetzen, erhöht sich die Absorbanz im Verhältnis zu der Menge von direktem Bilirubin und die Arbeitskurven zeigen eine gute Linearität der Verdünnung, die durch den Ursprung führt, was anzeigt, dass in den Beispielen 7 bis 12 direktes Bilirubin selektiv ohne Beeinträchtigung von indirektem Bilirubin gemessen wird.

Bestimmung von direktem Bilirubin in einer Probe, die direktes Bilirubin und indirektes Bilirubin enthält, durch ein herkömmliches Verfahren Zu Vergleichszwecken wird direktes Bilirubin in der Probe, die in den Beispielen 7 bis 12 verwendet wird, gemäß einem herkömmlichen Verfahren bestimmt. Ein Verfahren zur Bilirubinmessung unter Verwendung einer Bilirubinoxidase bei einem pH von 3,5 bis 4,5 wurde in dem herkömmlichen Verfahren verwendet (japanisches offengelegtes Patent Kokai Nr. 59-125891, Shogo Otsuji, Clin. Biochem., 21, 33–38 (1988)). Das heißt, die verwendeten Reagenzien haben die folgenden Zusammensetzungen: (1) Erste und zweite Reagenslösungen

Erste Reagenslösung bei dem herkömmlichen Verfahren Trinatriumcitrattrihydrat 17,65 g/l Lactinsäure 30,0 g/l Triton X-100 1,0 g/l EDTA·2Na·2H₂O 18,6 mg/l pH 3,70 Zweite Reagenslösung bei dem herkömmlichen Verfahren Trinatriumcitrattrihydrat 3,0 g/l Lactinsäure 160 mg/l Triton X-100 1,0 g/l CuSO₄·5H₂O 1,25 g/l Bilirubinoxidase 0,2 E/ml pH 6,50

Die gleichen Bedingungen wie diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, werden verwendet, außer dass die obigen Reagenslösungen eingesetzt werden.

Die Ergebnisse sind in 7 bis 12 gezeigt. Die Ergebnisse des herkömmlichen Verfahrens (Vergleichsbeispiel 2) zeigen, dass keine Linearität zwischen der Konzentration von direktem Bilirubin in der Probe und der gemessenen Absorbanz erhalten wird, was darauf hindeutet, dass bei dem herkömmlichen Verfahren direktes Bilirubin in der Probe nicht genau gemessen wird aufgrund schwerwiegender Beeinträchtigung durch indirektes Bilirubin in der Probe.

Ein Pool von Sera, die von einer Patientin mit einem hohen Bilirubingehalt gesammelt wurden, wurden als Probe verwendet. Die Probe wurde in ihrer intakten Form für die Analyse bereitgestellt, ohne dass mit Natriumsulfat ausgesalzt wurde. Die intakte Probe würde zur Absorption von Globulinen in der Probe auf einer Säule führen, wodurch die Verschlechterung der Säule gefördert wird, aber um die Denaturierung von Bilirubinfraktionen zu verhindern, wurde die Probe nicht einer Aussalzbehandlung unterworfen.

Die gleichen Reagenzien, die in den Beispielen 1 bis 6 verwendet wurden, werden jeweils verwendet in Beispiel 13 (Kaliumionen werden als Inhibitor verwendet), Beispiel 13 (Thiocyanationen), Beispiel 15 (Hydrazid), Beispiel 16 (Hydrazid), Beispiel 17 (NADH) und Beispiel 18 (NADPH). In Vergleichsbeispiel 3 wird das gleiche Reagens, das in Vergleichsbeispiel 2 verwendet wurde, eingesetzt.

Zu 16 &mgr;l Probe werden 480 &mgr;l der ersten Reagenslösung gegeben. Die Mischung wird bei 37°C 5 min erwärmt. Anschließend werden 120 &mgr;l der zweiten Reaktionslösung zu der Mischung gegeben. Nach 5-minütiger Erwärmung bei 37°C werden 120 &mgr;l 2%iger wässriger Ascorbinsäurelösung zugegeben, um die Reaktion von Bilirubinoxidase zu beenden.

Die Analyse durch HPLC wird gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von John J. Lauff in Clin. Chem., 28 (4), 629–637 (1982) beschrieben wird, und Änderungen des Peakbereichs aufgrund von indirektem Bilirubin wird vor und nach der Reaktion untersucht. Für die Daten vor der Reaktion werden die gleichen Verfahren wie für die Oxidation beschrieben durchgeführt, außer dass physiologische Kochsalzlösung anstatt der zweiten Reagenslösung verwendet wird. Folglich wird der Peakbereich auf Basis von indirektem Bilirubin bestimmt.

Das Hitachi-HPLC-System (Säulenofen L-7300, UV-Detektor L-7400, Pumpe L-7100, Integrator D-7500), das mit einer Umkehrphasensäule Lichrspher 100 RP-18 (10 &mgr;m, von Kanto Kagaku K. K. hergestellt) ausgestattet ist, wird für die HPLC verwendet.

Das heißt, die Lösung, die durch die oben beschriebene Oxidation erhalten wird, wird durch ein Membranfilter von 0,45 &mgr;m filtriert und 150 &mgr;l des Filtrats wird über die HPLC-Säule geleitet, wobei der Peakbereich auf Basis von indirektem Bilirubin nach der Reaktion gemessen wird. Die Elution wird durch den linearen Gradienten von Isopropanol zwischen zwei Lösungen, Lösung A (950 Volumen gereinigtes Wasser/50 Volumen 2-Methoxyethanol, pH 2,1, eingestellt mit Phosphorsäure) und Lösung B (950 Volumen Isopropanol/50 Volumen 2-Methoxyethanol/2,5 Volumen Phosphorsäure) bewirkt. Die Bilirubinfraktionen werden bei einer Wellenlänge von 450 nm nachgewiesen.

Die Daten des Peakbereichs vor der Reaktion werden auf 100 eingestellt. Diese Daten werden verglichen mit den Daten des Peakbereichs auf Basis von indirektem Bilirubin nach der Reaktion, um ein Restverhältnis von indirektem Bilirubin zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Erfindungsgemäß wird keine signifikante Änderung vor und nach der Reaktion in dem Peakbereich auf Basis von indirektem Bilirubin beobachtet. Es ist daher bestätigt, dass indirektes Bilirubin nicht unter den erfindungsgemäßen Messbedingungen umgesetzt wird. Bei Vergleichsbeispiel 3 (herkömmliches Verfahren) wird eine 16,5%ige Abnahme mit indirektem Bilirubin notiert, was darauf hinweist, dass ein Teil des indirekten Bilirubins unter den Messbedingungen des herkömmlichen Verfahrens umgesetzt wird.

Erfindungsgemäß kann direktes Bilirubin in einer Probe selektiv ohne jegliche Beeinträchtigung von indirektem Bilirubin bestimmt werden. Daher trägt die Erfindung zum Gebiet der klinischen Untersuchungen bei.