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CHEMISCHE KONSTRUKTIONEN - Dokument DE69911444T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69911444T2 01.07.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0001119529
Titel CHEMISCHE KONSTRUKTIONEN
Anmelder Glaxo Group Ltd., Greenford, Middlesex, GB
Erfinder CARR, Arthur, Robin, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY, GB;
GEHANNE, Sylvie, I-37100 Verona, IT;
KAY, Corinne, Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, GB;
McKEOWN, Carl, Stephen, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY, GB;
MURRAY, John, Peter, Aston Science Park, Birmingham B7 4EJ, GB;
PAIO, Alfredo, I-37100 Verona, IT;
SCICINSKI, Jan, Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, GB;
WATSON, Paul, Stephen, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY, GB;
WILLIAMS, G., Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, GB;
ZARAMELLA, Alessio, I-37100 Verona, IT
Vertreter HOFFMANN · EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69911444
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.10.1999
EP-Aktenzeichen 999477508
WO-Anmeldetag 05.10.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/GB99/03286
WO-Veröffentlichungsnummer 0000020357
WO-Veröffentlichungsdatum 13.04.2000
EP-Offenlegungsdatum 01.08.2001
EP date of grant 17.09.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.07.2004
IPC-Hauptklasse C07B 61/00
IPC-Nebenklasse

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft chemische Konstrukte zur Verwendung in der Festphasensynthese und Verfahren zum Nachweisen und/oder Charakterisieren der Produkte der Festphasensynthese unter Verwendung der Konstrukte.

Hintergrund der Erfindung

Die Festphasensynthese ist seit vielen Jahren auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt und wird seit kurzem auch zunehmend zur Synthese von Nicht-Peptiden verwendet.

Die Festphasensynthese hat besondere Anwendung auf dem Gebiet der kombinatorischen Chemie und in der Herstellung von chemischen Bibliotheken als potentielle Quellen für neue Hinweise zur Arzneistoffentdeckung gefunden, siehe z. B. Anthony W. Czarnik, Analytical Chemistry News and Features, 1. Juni 1998, S. 378A–386A, und The Combinatorial Index, Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998. Ein Merkmal von Verfahren der kombinatorischen Chemie besteht darin, daß sie die Herstellung einer sehr großen Anzahl unterschiedlicher Verbindungen aus einer relativ beschränkten Anzahl von molekularen Bausteinen in einer relativ kleinen Anzahl von Reaktionen ermöglichen. Die kombinatorische Chemie macht Gebrauch vom Ansatz des "Split and Pool"-Ansatzes, in dem eine Suspension aus chemischem Ausgangsstoff, der an einen festen Träger gebunden ist, in N Teile aufgespalten wird, von denen jeder mit einem unterschiedlichen Reagens umgesetzt wird. Die Produkte der N Reaktionen werden dann vereinigt und sorgfältig vermischt, das resultierende Reservoir wird in N' Teile aufgespalten, und jeder Teil wird erneut mit einem unterschiedlichen Reagens umgesetzt. Dieses Verfahren kann so viele Male wiederholt werden, wie es Schritte in der Reaktionssequenz gibt. So wird für eine dreistufige Reaktionssequenz, falls die Reaktionsmischung in 10 Teile in jedem Schritt unterteilt wird, wobei jedes der Reservoirs mit einem unterschiedlichen Reagens vor dem Rekombinieren mit den anderen Teilen umgesetzt wird, die Gesamtanzahl von durch das Verfahren gebildeten Verbindungen 103 = 1000 sein. Somit ist ersichtlich, daß unter Verwendung der "Split and Pool"-Technik eine große Anzahl unterschiedlicher Moleküle unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Reaktionen (30 im oben genannten Fall) synthetisiert werden kann.

Jeder der festen Träger (z. B. eine Harzperle) wird ein einzelnes daran gebundenes Produktmolekül aufweisen, und daher kann im Prinzip jedes der Reaktionsprodukte getrennt und analysiert oder einen biologischen Untersuchung unterworfen werden, indem jeder einzelne feste Träger einfach isoliert und das Produkt vom Träger abgespalten wird. Jedoch bedeutet die hohe Anzahl von durch kombinatorische Verfahren erzeugten Verbindungen, daß es undurchführbar sein kann, jede Verbindung zu identifizieren und zu charakterisieren. Entsprechend werden die Verbindungen gewöhnlich zuerst untersucht, entweder am festen Träger oder nach Abspalten vom Träger, und nur diejenigen Verbindungen, die eine gewisse biologische Aktivität zeigen, werden anschließend identifiziert. Zur Minimierung der Anzahl durchgeführter biologischer Untersuchungen können Verbindungen in Reservoirs untersucht werden, die eine vorher festgelegte Anzahl von Verbindungen enthalten, wobei die inaktiven Reservoirs verworfen und die aktiven Reservoirs einer weiteren Untersuchung unterworfen werden. Die biologischen Aktivitäten der Verbindungen können unter Verwendung von automatisierten Untersuchungstechniken mit hohem Durchsatz analysiert werden, die die Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen in einem kurzen Zeitraum erlauben.

Die typischerweise in der Synthese von kombinatorischen Bibliotheken verwendeten Harzperlen stammen aus vernetztem Polystyrolharz und haben gewöhnlich einen Durchmesser in der Größenordnung von 90 bis 250 &mgr;m (d. h. gerade mit bloßem Auge sichtbar). Die Anzahl von Perlen in einer vorgegebenen Masse oder einem vorgegebenen Volumen von Harz wird von der durchschnittlichen Perlengröße abhängen, aber z. B. wird es bei einer Perlengröße von 150 &mgr;m Durchmesser ca. 500 Perlen pro mg Harzmasse geben. Typische Verbindungsbeladungen auf den Perlen sind in der Größenordnung von 0,1 bis 0,4 mmol/g, und daher werden Perlen der oben angegebenen Abmessungen dazu neigen, individuelle Verbindungsbeladungen von ca. 1 nmol Verbindung pro Perle aufzuweisen. Man wird daher einsehen, daß eines der Probleme, denen sich der mit Festphasenkonstrukten arbeitende Chemiker gegenübergestellt sieht, die Frage nach der Identifizierung und Charakterisierung der verschiedenen Verbindungen in einer kombinatorischen Bibliothek ist, da jede Verbindung in der Bibliothek in sehr kleinen Mengen vorhanden sein kann, und gewöhnlich wird unzureichend Verbindung auf einem gegebenen festen Träger vorhanden sein, um sowohl eine biologische Untersuchung als auch Identifizierung der Verbindung zu erlauben.

Ein bekannter Ansatz für das Problem der Identifizierung der Verbindungen in einer kombinatorischen Bibliothek liegt darin, jeden festen Träger mit einer Kodierungsmarke zu versehen, aus der die Identität der Verbindung bestimmt werden kann. So kann z. B. eine Kodierungsmarke in aufeinanderfolgenden Schritten auf dem festen Träger parallel zur Konstruktion der gewünschten Zielverbindung aufgebaut werden, wobei die Kodierungsmarke die Synthesehistorie der Produktverbindung widerspiegelt und eindeutig für jede Produktverbindung ist. Die Kodierungsmarke wird gewöhnlich auf dem Träger unter Verwendung chemischer Reaktionen eines Typs aufgebaut, der orthogonal zur Chemie ist, die zum Aufbau der Produktverbindung verwendet wird, wodurch sichergestellt wird, daß die Kodierungseinheiten und Produktverbindungen nicht verwechselt werden. Sobald die Produktverbindung untersucht wurde und ihre biologische Aktivität bestätigt ist, kann die Kodierungsmarke dann dekodiert werden, um die Identifizierung der Verbindung zu erlauben.

In einem alternativen Ansatz, beschrieben in Geysen et al., Chemistry & Biology, 1996, Bd. 3, Nr. 8, S. 679–688 und in WO 97/37953, können Kodierungsmarken wie Isotopenmarkierungen u. a. in eine Linker-Gruppe zwischen dem festen Träger und dem Substrat eingeführt werden. Dieser Ansatz hat den Vorteil, daß er nicht die Bildung einer separaten Kodierungsmarke unter Verwendung orthogonaler Chemie erfordert und daher die Gesamtanzahl von eingesetzten Syntheseschritten reduziert.

Ein weiteres Problem, dem sich der Festphasenchemiker gegenübergestellt sieht, ist die Schwierigkeit der Quantifizierung der Produkte einer gegeben Reaktionssequenz. In jedem Festphasensyntheseverfahren, ob es Teil eines kombinatorischen Verfahrens ist oder nicht, ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für einen gegebenen Reaktionsschritt in einer Reihe von Schritten bestimmen zu können. Es ist ebenfalls wichtig, das Fortschreiten einer Reaktion überwachen zu können, so daß bestimmt werden kann, ob eine besondere Reaktion vollständig abgelaufen ist. Dies ist besonders wichtig in einer mehrstufigen Festphasensynthese, wo das Versagen einer gegebenen Stufe zum Fortschreiten bis zur Vollendung zur Bildung von Nebenprodukten führen kann, wodurch kompliziert wird, was ansonsten ein relativ geradliniges Trennverfahren ist. Wenn multiple Produkte in einem gegebenen Reaktionsschritt oder einer Sequenz von Schritten gebildet werden, oder wenn ein gegebener Reaktionsschritt nicht vollständig abgelaufen ist, kann es äußerst nützlich sein, Mittel zur Quantifizierung der Reaktionsprodukte zu besitzen, entweder in absoluten Zahlen oder als relative Konzentrationen in bezug auf andere Reaktionsprodukte. Wenn die Produkte in Milligrammengen erzeugt werden, kann die Quantifizierung unter Verwendung einer Vielzahl instrumenteller Techniken durchgeführt werden, z. B. durch Kernspin-(NMR)-Spektroskopie. Jedoch ist die Quantifizierung viel schwieriger, wenn die zur Analyse verfügbare Produktmenge nur 1 nmol beträgt.

Obwohl sowohl zerstörende als auch nicht-zerstörende Analyseverfahren zur Bestimmung der Produkte der Festphasensynthese bekannt sind (siehe The Combinatorial Index, loc. cit.), liegt eines der bekannten Probleme der Festphasensynthese darin, daß es allgemein schwieriger ist, an festen Trägern durchgeführte Reaktionen zu überwachen, als herkömmliche Reaktionen in der Lösungsphase zu überwachen; siehe z. B. die oben bezeichnete Czarnik-Veröffentlichung. Dies stimmt insbesondere bei den Produkten aus Verfahren der kombinatorischen Chemie, wo es erforderlich ist, schnelle Techniken mit hohem Durchsatz zu verwenden, um die große Anzahl von Verbindungen, die durch solche Verfahren erzeugt werden, zu analysieren. Techniken wie die Massenspektrometrie sind potentiell ideal als Mittel zur Bereitstellung von Analysen mit hohem Durchsatz geeignet, aber ein substantielles Problem besteht darin, daß nicht alle Verbindungen eine garantierte Reaktion unter massenspektrometrischen Bedingungen erzeugen. Tatsächlich sind viele Verbindungen "unsichtbar" für die sogenannten "weichen" Methoden der Massenspektrometrie wie die Matrix-gestützte Laserdesorptionsionisation (MALDI) und Elektrospray-Massenspektrometrie, die Molekülionen ohne Hervorrufung einer signifikanten Fragmentierung des Moleküls nachweisen sollen. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "weich" massenspektrometrische Methoden, die Molekülionen und nicht bloß Fragmente ergeben. Einer der Gründe dafür liegt darin, daß unter MALDI- und Elektrospray-Bedingungen viele Verbindungen, insbesondere Peptide, nicht ausreichend gut ionisieren, um eine nachweisbare massenspektroskopische Reaktion zu ergeben.

Geysen et al. (loc. cit.) begegnen diesem Problem, indem sie die Einführung eines leicht ionisierbaren basischen Zentrums wie Lysin in den Linker vorschlagen und weiter vorschlagen, daß das basische Zentrum durch Alkylierung während der Aufarbeitung quaternisiert werden könnte, um eine geladene Gruppe zu ergeben, die das Konstrukt für die massenspektrometrische Analyse sensibilisieren würde. Jedoch ist ein Nachteil dieses Ansatzes die Notwendigkeit, die Amin-Gruppe während der verschiedenen Syntheseschritte zu schützen, und die anschließende Notwendigkeit, die Amin-Gruppe vor der Analyse zu entschützen.

Eine Entwicklung des Geysen-Ansatzes wird in Carrasco et al., Tetrahedron Letters, 1997, 38, Nr. 36, S. 6331–6334 offenbart. Carrascos Verfahren beinhaltet die Bildung eines Konstruktes, das eine Harzperle umfaßt, die über eine erste Linker-Gruppe an eine Gruppe gebunden ist, die die Autoren als eine "Ionisierungsmarke" bezeichnen. Die "Ionisierungsmarke" ist wiederum über eine zweite Linker-Gruppe an ein Substrat gebunden. Die ersten und zweiten Linker-Gruppen sind orthogonal spaltbar, d. h. sie können selektiv unter Verwendung einer unterschiedlichen Chemie gespalten werden.

Im spezifischen Beispiel, das in Carrasco et al. offenbart wird, ist die erste Linker-Gruppe photochemisch spaltbar, während die zweite Linker-Gruppe chemisch spaltbar ist. Die von Carrasco verwendete "Ionisierungsmarke" ist eine Tetrapeptid-Kette mit der Sequenz (ausgehend vom C-Terminus) Gly-Phe-Lys-Ala und mit einer an das Lysin gebundenen N-(2-Trimethylammonium)-acetyl-Gruppe. Der Zweck der Ionisierungsmarke ist zweifach. Zuerst stellt sie eine schon ionisierte "Sensibilisatorgruppe" bereit, die den Nachweis des Konstruktes durch Matrix-gestützte Laserdesorptionsionisations-(MALDI)-Massenspektrometrie erlaubt, und zweitens fügt sie dem Konstrukt Masse hinzu, wodurch die Substratmoleküle nachgewiesen werden können, ohne durch Peaks mit geringem Molekulargewicht im Massenspektrum überschwemmt oder maskiert zu werden.

Jedoch gibt es verschiedene signifikante mögliche Probleme bei den Carrasco-Konstrukten und insbesondere bei der im Konstrukt verwendeten "Ionisierungsmarke". Insbesondere wird vorausgesehen, daß die quaternäre Ammonium-Sensibilisatorgruppe unverträglich mit vielen der Typen von Chemie ist, die der Chemiker an den Konstrukten möglicherweise durchführen möchte. So ist die Trimethylammonium-Gruppe z. B. potentiell chemisch reaktiv, und außerdem kann die kationische Gruppe als Ionenaustauschzentrum fungieren und mit Anionen komplexieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Überwachung von chemischen Reaktionen an festen Trägern bereitzustellen, welches die den bekannten Verfahren innewohnenden Probleme vermeidet, und welches ein Mittel zum Nachweis und zu Identifizierung der Produkte von Festphasensynthesetechniken unter Verwendung von Massenspektroskopie bereitstellt.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese bereit, umfassend einen festen Träger Q mit einem daran über eine Verbindungsgruppe Y gebundenen Substrat R; wobei die Verbindungsgruppe Y erste und zweite Spaltungsstellen aufweist, die orthogonal und selektiv abspaltbar sind; wobei die zweite Spaltungsstelle selektiv unter Freisetzung des Substrats abspaltbar ist; und wobei sich die erste Spaltungsstelle an einer Position zwischen der zweiten Spaltungsstelle und dem festen Träger befindet und selektiv unter Freisetzung eines Fragments Fr abspaltbar ist, das das Substrat und wenigstens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung des Gerüsts des Konstrukts an der ersten Spaltungsstelle eine Einheit am chemischen Fragment Fr an der ersten Spaltungsstelle bildet oder einführt, die eine sensibilisierende Gruppe G umfaßt, die das chemische Fragment Fr für die instrumentelle, z. B. massenspektroskopische, Analyse sensibilisiert.

In den Konstrukten der Erfindung wird die sensibilisierende Gruppe G durch Spaltung des "Gerüsts" des Konstrukts gebildet oder eingeführt. Dies ist im Gegensatz zu bekannten Konstrukten (siehe z. B. Carrasco et al., loc. cit.), wo die sensibilisierende Gruppe durchgehend in der Synthese des Substrats vorhanden ist, oder wo die sensibilisierende Gruppe durch Spaltung einer Seitenkette oder Entfernung einer Schutzgruppe aus einer abstehenden sensibilisierenden Gruppe offengelegt wird.

Die sensibilisierende Gruppe G macht das Fragment Fr und damit indirekt das Substrat R für die Analyse durch eine gegebene Analysentechnik und insbesondere eine massenspektrometrische Technik empfindlicher. So kann die sensibilisierende Gruppe eine Gruppe sein, die unter den in einem Massenspektrometer und insbesondere in der Elektrospray-Massenspektrometrie angetroffenen Bedingungen leicht ionisierbar ist, um ein starkes Signal zu liefern.

Die während der selektiven Abspaltung des chemischen Fragments Fr vom festen Träger gebildete ionisierbare sensibilisierende Gruppe dient zur Sicherstellung, daß das Fragment ausreichend im Massenspektrometer ionisiert wird, um eine starke Reaktion zu ergeben. Dies räumt ein vielen Molekülen innewohnendes Problem aus, die durch Festphasenverfahren synthetisiert werden, wo eine geeignete ionisierende Gruppe nicht vorhanden ist und die Analyse durch massenspektrometrische Techniken mit hohem Durchsatz problematisch ist.

Die ionisierbaren Gruppe kann z. B. eine basische Amino-Gruppe oder eine Carboxylat-Gruppe sein, aber sie ist bevorzugt eine basische Amino-Gruppe. Man wird einsehen, daß der Begriff "basische Amino-Gruppe" wie hier verwendet insbesondere eine Amino-Gruppe bezeichnet, die leicht protoniert wird.

Die basische Amino-Gruppe kann eine primäre Amino-Gruppe, eine sekundäre Amino-Gruppe oder eine tertiäre Amino-Gruppe sein. Wenn die basische Amino-Gruppe eine tertiäre Amino-Gruppe ist, kann sie z. B. eine cyclische Amino-Gruppe wie Piperidino, Piperazino, Pyrrolidino oder Morpholino sein, wobei Piperidino oder Piperazino (z. B. N-Methylpiperazino) derzeit bevorzugt sind.

Erfindungsgemäß wird eine Einheit, die die sensibilisierende Gruppe G umfaßt, wie eine basische Amino-Gruppe, an der ersten Spaltungsstelle gebildet oder eingeführt, wenn das chemische Fragment Fr (hier nachfolgend als das analytische Fragment bezeichnet) vom festen Träger abgespalten wird. Der Vorteil der Bildung der sensibilisierenden Gruppe auf diese Weise liegt darin, daß sie das potentielle Problem einer vorher existierenden oder vorher gebildeten sensibilisierenden Gruppe vermeidet, die mit der Chemie des Konstrukts wechselwirkt. Außerdem vermeidet sie die Notwendigkeit, die sensibilisierende Gruppe unabhängig schützen zu müssen, wodurch das zusätzliche Problem des Entschützens umgangen wird, ein Erfordernis, das die Typen von Chemie einschränken könnte, die für den Chemiker zur Spaltung an den ersten und zweiten Spaltungsstellen verfügbar sind. Falls somit z. B. eine geschützte abstehende sensibilisierende Gruppe vorhanden wäre und z. B. die für das Entschützen erforderlichen Bedingungen die Verwendung einer Säure wie Trifluoressigsäure beinhalten würden, dann würde dies effektiv die Verwendung einer säurelabilen Spaltungsstelle als zweite Spaltungsstelle verhindern, die das Substrat an den Rest des Konstruktes bindet. Die Konstrukte der Erfindung vermeiden solche Probleme.

Die Atome oder die funktionelle Gruppe, die die sensibilisierende Gruppe G bilden, können in einer maskierten Form im Konstrukt vor der Abspaltung des Fragments Fr vom Harz sein, wobei die Spaltungsbedingungen bloß zum Entmaskieren der sensibilisierenden Gruppe G dienen. Alternativ können die Atome oder funktionelle Gruppe, die die sensibilisierende Gruppe G bilden oder enthalten, an der Spaltungsstelle während der Spaltungsreaktion eingeführt werden. Wenn z. B. die sensibilisierende Gruppe eine basische Amino-Gruppe ist, kann das Stickstoffatom der Amino-Gruppe im Konstrukt vor der Abspaltung vorhanden sein, oder es kann während der Spaltungsreaktion eingeführt werden.

Wenn die sensibilisierende Gruppe G aus einer externen Quelle während der Spaltungsreaktion eingeführt wird, kann sie einen Teil einer größeren chemischen Einheit bilden. Z. B. kann die Gruppe G als Teil einer Gruppe X-G eingeführt werden, worin X der Rest eines Nukleophils oder Elektrophils ist, z. B. eine nukleophile Gruppe auf Stickstoff- oder Schwefelbasis, z. B. eine Gruppe der Formel G-Alk-Nuc, worin Alk eine Alkylen-Gruppe ist (z. B. eine C2-20- und bevorzugt C2-6-Alkylen-Gruppe), gegebenenfalls unterbrochen von einem oder mehreren Heteroatomen, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und worin Nuc ein Nukleophil ist, wie eine Amin- (z. B. NH oder NR', worin R' eine C1-6-Alkyl-Gruppe ist) oder eine Thiolat-Gruppe.

Es ist bevorzugt, daß das chemische Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen. Die Signatur kann vorteilhaft durch Einfügen einer "Peak-spaltenden" Isotopenmarkierung in das Fragment bereitgestellt werden. Die Peak-spaltende Isotopenmarkierung umfaßt wenigstens ein Atom, das in einer Anzahl von stabilen Isotopenformen existiert. Durch die Isotopenmarkierung eines oder mehrerer besonderer Atome im Fragment Fr, so daß ein gegebenes Atom mit einer Mischung von Isotopen markiert ist, werden die Massenspektren der Molekülionen als charakteristisches Muster erscheinen, wobei das präzise Muster von den relativen Mengen der individuellen Isotope abhängt. Falls so z. B. ein gegebenes Atom im Fragment Fr so markiert wird, daß 50% der Atome eine Isotopenform haben und 50% eine andere Isotopenform haben, dann wird das Massenspektrum das Molekülion als ein charakteristisches Dublett zeigen, in dem die Peaks eine etwa gleiche Höhe haben.

Der Zweck des (der) Peak-spaltenden Atoms (Atome) liegt in der Bereitstellung eines charakteristischen Musters, das jeden Peak im Massenspektrum kennzeichnen wird, der aus dem analytischen Fragment Fr stammt, wodurch solche Peaks von denjenigen aufgrund von fremden Stoffen unterschieden werden.

Beispiele für Atome, die als Peak-spaltende Isotopenmarkierungen verwendet werden können, schließen 1H/2H(D), 79Br/81Br, 12C/13C, 14N/15N und 16O/18O ein.

Das Fragment Fr kann eine einzelne Peak-spaltende Isotopenmarkierung oder mehr als eine solche Markierung enthalten. Z. B. kann die Isotopenmarkierung ein einzelnes Bromatom sein, wobei in diesem Fall der Peak für das Molekülion des analytischen Fragments Fr, das im Anschluß an die Abspaltung vom festen Träger freigesetzt wird, als ein Dublett erscheinen wird. Durch Einführung einer zweiten oder nachfolgenden Peak-spaltenden Markierung (Markierungen) wird ein komplexeres Peak-Muster für das Molekülion erzeugt werden.

Die Peak-spaltende(n) Isotopenmarkierung(en) befindet (befinden) sich bevorzugt zwischen den ersten und zweiten Spaltungsstellen.

Die ersten und zweiten Spaltungsstellen können durch erste und zweite Linker-Gruppen L1 und L2 definiert werden. Eine "Spacer-Gruppe" A kann zwischen den zwei Linker-Gruppen L1 und L2 zwischengeschaltet werden, wobei die Spacer-Gruppe A typischerweise eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung enthält. Entsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein chemisches Konstrukt wie zuvor definiert bereitgestellt, worin die Verbindungsgruppe Y die Formel L1-A-L2 hat; worin L1 eine erste Linker-Gruppe ist, die die erste Spaltungsstelle definiert; A eine chemische Gruppe (die Spacer-Gruppe) ist, die eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung enthält; und L2 eine zweite Linker-Gruppe ist, die die zweite Spaltungsstelle definiert.

Die ersten und zweiten Spaltungsstellen sind orthogonal und selektiv spaltbar; d. h. die zur Bewirkung der Spaltung an einer der Spaltungsstellen verwendeten Bedingungen werden nicht die andere spalten. Eine große Vielzahl unterschiedlicher Typen von Spaltungsreaktionen kann verwendet werden, wobei Beispiele dafür Reaktionen sind, die aus säurekatalysierter Spaltung, basenkatalysierter Spaltung, metallkatalysierter Spaltung, oxidativer Spaltung, reduktiver Spaltung, nukleophiler Verdrängung, Spaltung durch 1,2-bis-Nukleophile, elektrophiler Verdrängung und thermischer, photochemischer und enzymatischer Spaltung ausgewählt sind.

Beispiele für Linker-Gruppen, die selektiv unter photochemischen Bedingungen zur Offenlegung oder Einführung einer sensibilisierenden Gruppe G (z. B. eine Amin-Gruppe) gespalten werden können, schließen Carbamat-Gruppen ein, wie o-Nitrobenzylcarbamat-Gruppen, in denen die Anfangsspaltung zwischen der benzylischen Methylen-Gruppe und dem benachbarten Sauerstoffatom stattfindet, gefolgt vom Verlust von Kohlendioxid, um eine basische Amino-Gruppe zu ergeben.

Beispiele für Linker-Gruppen, die durch nukleophile Verdrängung gespalten werden können (z. B. zur Offenlegung oder Einführung einer sensibilisierenden Gruppe G), schließen Sulfonamid-Linker-Gruppen ein, in denen der Aryl- (z. B. Phenyl) -Ring des Sulfonamids eine elektronenziehende Gruppe wie eine Nitro-Gruppe enthält, bevorzugt in der ortho-Position des Aryl-Rings (siehe z. B. Kay et al., Tetrahedron Letters – 1997, 38(39)). Die Spaltung der Linker-Gruppe zwischen den Amino- und Sulfonyl-Einheiten kann durch ein Nukleophil wie ein Thiol- oder Thiolat-Nukleophil in Gegenwart einer Base wie 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU), Morpholin oder Natriumcarbonat bewirkt werden. Weitere Beispiele für Gruppen, die durch nukleophile Verdrängung gespalten werden können, schließen "Fanghaken-Linker" auf Mercaptopyrimidin-Basis ein, wie 5-Carboxy-2-mercaptopyrimidin, worin die Spaltung durch Umsetzen unter oxidierenden Bedingungen zur Erzeugung einer Sulfoxid- oder Sulfonbindung bewirkt werden kann, gefolgt von Reaktion mit einer nukleophilen Amino-Gruppe zur Bildung eines 2-Aminopyrimidins. Solche Linker-Gruppen können z. B. durch Reaktion mit einem cyclischen Amin wie Piperidin oder einem N-substituierten Piperazin (z. B. N-Methylpiperazin) oder mit einem eine Amino-Gruppe enthaltenden Thiolat-Nukleophil (z. B. Dimethylaminoethylthiolat) nach zunächst Oxidieren mit einem Oxidationsmittel gespalten werden, bevorzugt mit einem relativ milden Oxidationsmittel wie einer Persäure oder einem anorganischen Persalz wie Kaliumperoxymonosulfat (z. B. "Oxon").

Entweder die erste oder zweite Spaltungsstelle/Linker-Gruppe oder beide, aber bevorzugt die erste, kann vom "Fanghaken"-Typ sein; d. h. die Spaltungsstelle oder Linker-Gruppe muß chemisch in einem ersten Schritt modifiziert werden, bevor sie der Spaltung in einem zweiten Schritt unterworfen werden kann (z. B. zur Offenlegung oder Einführung der sensibilisierenden Gruppe G). Ein Vorteil einer solchen Anordnung ist, daß sie die Möglichkeit verhindert oder signifikant reduziert, daß die Spaltung unbeabsichtigt stattfindet. Ein Beispiel für einen "Fanghaken"-Mechanismus beinhaltet die Oxidation einer funktionellen Gruppe (z. B. der oben beschriebenen "Fanghaken"-Linker-Gruppe auf Mercaptopyrimidin-Basis) in einem ersten Schritt, wobei die Oxidation dazu dient, die funktionelle Gruppe zugänglicher für die Verdrängung durch ein Nukleophil in einem anschließenden Spaltungsschritt zu machen. Das Nukleophil kann beträchtlich in der Struktur variieren. Z. B. kann das Nukleophil in einer Auführungsform ein eine Amino-Gruppe enthaltendes Nukleophil sein, wobei die Amino-Gruppe bei der Nukleophil-Verdrängung so teilnimmt, daß die Amino-Gruppe (sensibilisierende Gruppe G) direkt an die Spaltungsstelle gebunden ist. Alternativ kann die Amino-Gruppe (oder andere sensibilisierende Gruppe) in einer anderen Ausführungsform in einer Gruppe vorhanden sein (z. B. einem Dialkylaminoalkyl-thiolat-Anion), die ein anderes Nukleophil wie ein Schwefel-Nukleophil enthält, das an die Spaltungsstelle gebunden wird.

Eine andere Klasse von Linker-Gruppen, die zur Verwendung in den Konstrukten der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ist die Klasse von Linker-Gruppen, die durch 1,2-Bis-nukleophile wie Hydrazine und Hydroxylamine spaltbar sind. Solche Bis-nukleophile können verwendet werden, um die Bindung zwischen dem Stickstoffatom und dem benachbarten Kohlenstoffatom in bestimmten Enaminsystemen zu spalten, z. B. Enamin-systemen, in denen das Enamin mit einer Carbonyl-Gruppe konjugiert ist. Beispiele für solche Gruppen sind Gruppen auf Basis von Oxo-substituierten Cycloalkyliden-Ringen, wie die an ein Amino-Stickstoffatom gekoppelte 1-[4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidenj-ethyl-(dde)-Gruppe. Die Konstrukte werden bevorzugt so eingestellt, daß das Enaminsystem die erste Spaltungsstelle definiert, wobei das Brechen der Bindung zwischen dem Stickstoffatom und dem benachbarten Kohlenstoffatom, wie oben beschrieben, eine Amin-Gruppe offenlegt, die als massenspektrometrischer Sensibilisator fungiert.

Entweder die erste oder zweite, aber bevorzugt die erste Spaltungsstelle kann durch Linker-Gruppen definiert werden, die unter des Wirkung von Übergangsmetallen, bevorzugt Palladium(0), spaltbar sind. Beispiele für solche Linker-Gruppen schließen Allyloxycarbonylamino-Gruppen ein, die bei Spaltung eine Amin-Gruppe freisetzen, die als massenspektrometrischer Sensibilisator wirken kann.

Beispiele für Linker-Gruppen, die selektiv unter sauren Bedingungen gespalten werden können, schließen geeignet substituierte Benzyloxycarbonyl-Gruppen und geeignet substituierte Diphenylmethylamino-Gruppen ein, die beide durch die Wirkung von Trifluoressigsäure gespalten werden können.

Besondere Beispiele für durch Säure spaltbare Linker-Gruppen werden aufgeführt in "The Combinatorial Index", Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998, dessen Offenbarung hier durch Verweis eingeführt wird. Linker-Gruppen des "Rink"- oder "Knorr"-Typs umfassen typischerweise eine N-geschützte 1-Amino-1,1-diphenylmethan-Einheit, wobei die Amino-Gruppe beim Entschützen die Bindung an ein Substrat erlaubt, einer der Phenyl-Ringe z. B. mit Dimethoxy-Gruppen substituiert ist und der andere einen Carboxyalkyloxy-Substituenten aufweist, der einen zweiten Bindungspunkt bereitstellt. Die Spaltung mit TFA führt zu einer Substratverbindung mit einer terminalen Carboxamido-Gruppe. Linker-Gruppen des "Wang"-Typs enthalten typischerweise eine substituierte Phenoxyacetyl-Gruppe, wobei die Acetyl-Gruppe einen Bindungspunkt bereitstellt, und eine benzylische Hydroxyl-Gruppe am Phenyl-Ring, die einen zweiten Bindungspunkt bildet. Ester können zwischen einer Carboxyl-Gruppe eines Substrats und der benzylischen Hydroxyl-Gruppe gebildet werden, wobei die Ester-Gruppen anschließend mit TFA spaltbar sind, um eine Substratverbindung mit einer terminalen Carboxylat-Gruppe freizusetzen.

Beispiele für Linker-Gruppen, die selektiv unter basischen Bedingungen gespalten werden können, schleißen Gruppen ein, die Esterbindungen enthalten.

In einer Ausführungsform wird ein chemisches Konstrukt wie hier zuvor definiert bereitgestellt, worin die erste Spaltungsstelle selektiv spaltbar zur Bildung oder Einführung einer sensibilisierenden Gruppe G (insbesondere eine Amino-Gruppe) ist und die Spaltung durch einen Typ von Chemie bewirkt wird, der aus einer Chemiegruppe ausgewählt ist, die aus Spaltung unter sauren Bedingungen, basenkatalysierter Spaltung, Palladium(0)-katalysierter Spaltung, oxidativer Spaltung, Oxidation gefolgt von nukleophiler Verdrängung, reduktiver Spaltung, nukleophiler Verdrängung, Spaltung durch 1,2-Bis-nukleophile, elektrophiler Verdrängung und thermischer, photochemischer und enzymatischer Spaltung besteht, und worin die zweite Spaltungsstelle durch einen unterschiedlichen Typ von Chemie selektiv spaltbar ist, ausgewählt aus dieser Gruppe.

Obwohl Gruppen, die unter sauren Bedingungen spaltbar sind, zur Bildung der ersten Spaltungsstelle verwendet werden können, ist es derzeit bevorzugt, daß die erste Spaltungsstelle gegenüber sauren Bedingungen stabil ist. Jedoch kann die zweite Spaltungsstelle vorteilhaft unter sauren Bedingungen spaltbar sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Spaltungsstelle zur Bildung oder Einführung der sensibilisierenden Gruppe G spaltbar, wobei die Spaltung durch einen Typ von Chemie bewirkt wird, ausgewählt aus:

  • (i) photochemischer Spaltung, z. B. photochemische Spaltung einer Carbamat-Gruppe, wie eine Nitrobenzylcarbamat-Gruppe;
  • (ii) Oxidation gefolgt von Spaltung durch nukleophile Verdrängung, z. B. Oxidation eines Thiopyrimidins gefolgt von nukleophiler Verdrängung mit einem Amin (z. B. ein sekundäres Amin wie N-Methylpiperazin);
  • (iii) Spaltung eines Sulfonamids durch nukleophile Verdrängung, z. B. mit einem Thiolatnukleophil (z. B. Mercaptoethanol in Gegenwart einer starken Base wie DBU);
  • (iv) Spaltung von Enamingruppen (insbesondere diejenigen, die eine mit einer Carbonyl-Gruppe konjugierte Enamineinheit enthalten; z. B. wie 1-[4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden]ethylamino) mit einem 1,2-Bisnukleophil wie Hydrazin oder Hydroxylamin oder Derivaten davon; und
  • (v) übergangsmetallkatalysierter Spaltung von Allyloxycarbonylamino-Gruppen, z. B. Palladium(0)-katalysierte Spaltung von Allyloxycarbonylamino-Gruppen.

In der zuvor genannten bevorzugten Ausführungsform kann die zweite Spaltungsstelle z. B. unter sauren Bedingungen oder durch Photolyse gespalten werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Spaltungsstelle durch eine Sulfonamid-Linker-Gruppe definiert, und die zweite Spaltungsstelle wird gegebenenfalls durch eine Gruppe definiert, wie eine Rink-Linker-Gruppe, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die erste Spaltungsstelle durch eine Thiopyrimidin-Linker-Gruppe definiert, die für Spaltung durch Oxidation gefolgt von nukleophiler Verdrängung empfindlich ist, und die zweite Spaltungsstelle wird gegebenenfalls durch eine Gruppe wie eine Rink-Linker-Gruppe definiert, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erste Spaltungsstelle durch eine dde-Gruppe wie zuvor hier beschrieben definiert, und die zweite Spaltungsstelle wird gegebenenfalls durch eine Gruppe wie eine Rink-Linker-Gruppe definiert, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erste Spaltungsstelle durch eine photochemisch spaltbare Carbamat-Gruppe wie hier zuvor beschrieben definiert, und die zweite Spaltungsstelle wird gegebenenfalls durch eine Gruppe wie eine Rink-Linker-Gruppe definiert, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.

In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die erste Spaltungsstelle durch eine Gruppe wie Allyloxycarbonylamino definiert, die durch ein Übergangsmetall wie Palladium(0) gespalten werden kann, und die zweite Spaltungsstelle wird gegebenenfalls durch eine Gruppe wie eine Rink-Linker-Gruppe definiert, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.

Indem die ersten und zweiten Spaltungsstellen, z. B. wie durch die ersten und zweiten Linker-Gruppen L1 und L2 definiert, orthogonal spaltbar gemacht werden, ist es möglich, selektiv vom Konstrukt entweder das chemische Fragment Fr oder das Substrat R zu trennen, einfach unter Verwendung unterschiedlicher Spaltungsbedingungen. Dies bedeutet, daß der Chemiker während Experimenten, die zur Optimierung der Bedingungen für einen besonderen Reaktionsschritt entwickelt sind, das Konstrukt Bedingungen unterwerfen kann, die zur Abspaltung des analytischen Fragments Fr geeignet sind, wodurch die Durchführung der Analyse zur Bestimmung des Ergebnisses jeder Testreaktion erlaubt wird. In ähnlicher Weise kann während einer präparativen Reaktion (z. B. Herstellung einer kombinatorischen Bibliothek oder während anschließender präparativer Reaktionen, wie in einer vergrößerten Reaktion oder der gewerblichen Herstellung) eine Qualitätskontrolle (QC) durchgeführt werden, indem ein oder mehrere feste Träger aus dem Reaktionsgefäß entfernt, die Konstrukte an der ersten Spaltungsstelle gespalten und das resultierende Fragment Fr analysiert werden, um nachzusehen, ob ein besonderer Reaktionsschritt funktioniert hat. Andererseits wird das Reaktionsprodukt R durch Spalten an der zweiten Spaltungsstelle, z. B. an der zweiten Linker-Gruppe, anstelle an der ersten aus dem festen Träger freigesetzt. Somit liegt ein Vorteil der Konstrukte der vorliegenden Erfindung darin, daß sie sowohl auf einem experimentellen Niveau zur Optimierung eines besonderen Verfahrensschrittes als auch auf einem präparativen Niveau ohne Modifizieren der Linker-Gruppen verwendet werden können.

In einer Ausführungsform der Erfindung enthält das Fragment Fr und besonders bevorzugt die Spacer-Gruppe A eine Alkylendiamin-Gruppe oder Aminoalkoxy-Gruppe. Die genaue Größe der Alkylen-Gruppe und ihr Substitutionsgrad wird derzeit nicht als wichtig erachtet, aber die Kette könnte beispielsweise eine Länge von 2 bis 30 Kohlenstoffatomen haben, z. B. bis zu 20 Kohlenstoffatome, besonders typisch weniger als 10 Kohlenstoffatome, wobei besondere Beispiele Ethylen- oder Propylendiamin- oder Aminoalkohol-Gruppen sind, die substituiert oder unsubstituiert sein können. Die Alkylendiamin-Gruppe oder der Aminoalkohol enthält typischerweise eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung wie hier zuvor definiert. Die zwei Amino-Gruppen können jeweils an die ersten und zweiten Linker-Gruppen gebunden werden. Zur Erhöhung der Masse der Spacer-Gruppe A kann die Alkylendiamin-Gruppe mit einer Aryl-Gruppe substituiert sein, z. B. mit einer N-Aryl-Gruppe wie einer N-Benzyl-Gruppe. Die N-Aryl-Gruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein.

Wenn die Spacer-Gruppe, wie es bevorzugt ist, eine oder mehrere massenspektroskopische Peak-spaltende Isotopenmarkierungen enthält, so können sich diese entweder in der Alkylen-Kette oder in einer an die Alkylen-Kette gebundenen Substituentengruppe befinden. So kann z. B. eine an eine der zwei Amino-Gruppen in einem Alkylendiamin gebundene N-Benzyl-Gruppe eine Methylen-Gruppe aufweisen, die mit dem Peak-spaltenden Atom Deuterium substituiert ist. Alternativ kann ein in einem Substituenten am Alkylendiamin vorhandener Aryl-Ring (z. B. eine N-Benzyl-Gruppe) mit einem Peak-spaltenden Bromatom substituiert sein, wobei ein besonderes Beispiel für eine Aryl-Gruppe eine N-o-Brombenzyl-Gruppe ist.

Obwohl Alkylendiamin- und Aminoalkohol-Gruppen als spezifische Beispiele für Spacer-Gruppen angegeben werden, können alternative Spacer-Gruppen verwendet werden. Z. B. können die Spacer-Gruppen aus Kohlenwasserstoffketten gebildet werden, die bis zu 30 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kette enthalten, und die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Heteroatomen wie Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel unterbrochen sein können. Als eine weitere Alternative kann der Spacer z. B. eine Peptidkette sein, die eine oder mehrere Aminosäuren enthält. Die genaue Natur und Länge des Spacers wird derzeit nicht als wichtig erachtet, vorausgesetzt der Spacer wechselwirkt nicht mit der Chemie des Konstruktes.

Das chemische Fragment Fr und insbesondere die Spacer-Gruppe A können, ebenso wie sie ein Mittel zur Identifizierung unter Verwendung von Massenspektrometrie bereitstellen, auch mit einem oder mehreren zusätzlichen Sensibilisatoren versehen werden, um eine Charakterisierung durch andere Analysentechniken zu erlauben. Z. B. kann die Spacer-Gruppe einen Chromophor enthalten, um die Charakterisierung durch Ultraviolett- (UV)- oder Fluoreszenzspektroskopie zu erlauben.

Insbesondere können die Verbindungsgruppe Y und das Fragment Fr einen Chromophor Cu enthalten, der die Analyse des Fragments Fr durch Ultraviolett-, sichtbare oder Fluoreszenzspektrophotometrie und bevorzugt durch Ultraviolett-Spektrophotometrie erlaubt, um die Durchführung einer quantitativen Analyse zur Bestimmung entweder der relativen Mengen (z. B. relativ zu einem anderen Substrat R) oder absoluten Menge von in einer Reaktionsmischung vorhandenem Substrat zu erlauben.

Entsprechend stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Analyse des Fragments Fr der vorliegenden Erfindung bereit, welches das Unterwerfen des Fragments Fr der Ultraviolett-, sichtbaren oder fluoreszenzspektrophotometrischen Analyse zur Quantifizierung des Substrats R umfaßt.

Gemäß dem vorhergehenden Verfahrensaspekt der Erfindung kann die spektrophotometrische Analyse verwendet werden, um entweder die absolute Menge von in einer gegebenen Probe vorhandenem Substrat R zu bestimmen, oder sie kann verwendet werden, um die relative Menge (z. B. als Molverhältnis) von vorhandenem Substrat R relativ zu einer anderen Komponente (z. B. wenn mehr als ein Substrat R vorhanden ist) in der Probe zu bestimmen. Verweise auf Verfahren zur Quantifizierung des Substrats R in dieser Anmeldung schießen sowohl die absolute Bestimmung als auch die relative Bestimmung ein, wenn der Zusammenhang nichts anderes angibt.

Zur Sicherstellung, daß etwaige im Substrat R vorhandene Chromophore nicht mit der Analyse wechselwirken, wird der Chromophor typischerweise so ausgesucht, daß er eine substantielle Absorptionsbande hat, die ihn vom Substrat unterscheidet. So kann z. B. die Absorptionsbande entfernt von etwaigen signifikanten Absorptionsbanden im Substrat sein. Alternativ kann die Absorptionsbande im Chromophor eine solche Intensität haben, daß sie effektiv jede überlappende Bande im Substrat überschwemmt. Es ist bevorzugt, daß der Chromophor Cu einen log Emax-Hauptwert von wenigstens 2,5 hat. Es ist weiter bevorzugt, daß der log Emax-Hauptwert wenigstens 1,5-mal größer als der log Emax-Hauptwert des Substrats R ist.

Die Beziehung zwischen der Absorption von sichtbarer oder UV-Strahlung durch eine Verbindung in Lösung und der Konzentration der Verbindung wird durch das Beer-Lambert-Gesetz definiert, das durch die Formel E = A/cl ausgedrückt werden kann, worin A die Extinktion oder optische Dichte einer Probenlösung ist, c die molare Konzentration ist, 1 der Lichtweg der Probe ist und E die molare Absorptivität ist. Die molare Absorptivität E ist konstant für eine gegebene Verbindung bei einer gegebenen Wellenlänge und wird gewöhnlich als Emax ausgedrückt – die molare Absorptivität bei einem Absorptionsbandenmaximum. Die Werte für E oder Emax werden typischerweise in Einheiten von 10–2 m2 mol–1 ausgedrückt, und Verweise auf E- oder Emax-Werte werden hier auf solche Einheiten verweisen, wenn nichts anderes angegeben wird. Da E- oder Emax-Werte sehr groß sein können, wird häufig das logarithmische Äquivalent verwendet, und solche logarithmischen Äquivalente werden hier als log Emax-Werte bezeichnet.

Eine gegebene Verbindung wird häufig signifikante Absorptionspeaks oder -Banden bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen haben und kann daher häufig unter Bezugnahme auf mehrere Emax-Werte definiert werden. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Emax-Hauptwert" verwendet, um das Emax bei der Wellenlänge zu bezeichnen, bei der die größte Extinktion erfolgt. Somit hat der Chromophor Cu in den Konstrukten der vorliegenden Erfindung bevorzugt einen log Emax-Hauptwert von wenigstens 2,5 und hat typischerweise einen log Emax-Hauptwert, der wenigstens 1,5-mal größer als der Emax-Hauptwert des Substrats R ist. Besonders typisch hat jedoch der Chromophor Cu einen log Emax-Hauptwert, der wenigstens 2-, besonders gewöhnlich 2,5- und bevorzugt 3-mal größer als der log Emax-Hauptwert des Substrats R ist.

Obwohl die Analyse der Verbindungen durch Messung der Extinktion bei einem Hauptmaximum bewirkt werden kann, kann statt dessen eine Messung von Nebenbanden oder geringeren Maxima verwendet werden, um die vorhandene Menge der Verbindung zu bestimmen. Allgemein wird die Wellenlänge, bei der die Messung vorgenommen wird, von den genauen Absorptionseigenschaften der Substrate R und des Chromophors Cu abhängen und kann von Fall zu Fall bestimmt werden.

Der Chromophor Cu kann von beliebigen Chromophoren im Substrat R unterschieden werden, indem er eine Absorptionsbande besitzen kann, die entfernt von etwaigen signifikanten Absorptionsbanden ist. Damit ist gemeint, daß die Absorptionsbande des Chromophors entfernt ist von und nicht in einem signifikanten Ausmaß überlappt (z. B. weniger als 5% Überlappung in bezug auf die Fläche unter der Kurve ("aerea under the curve", a. u. c.) des jeweiligen Absorptionspeaks) mit etwaigen signifikanten Absorptionen aufgrund des Substrats R. Eine signifikante Absorption im vorliegenden Zusammenhang bedeutet eine Absorption mit einem log E-Wert von 1 oder mehr.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese bereitgestellt, das einen festen Träger Q mit einem über eine Verbindungsgruppe Y daran gebundenen Substrat R umfaßt, worin Q, Y und R wie hier zuvor definiert sind; und worin die Verbindungsgruppe Y orthogonal und selektiv wie hier zuvor definiert spaltbar ist; worin das Fragment Fr das Substrat und wenigstens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfaßt und der Teil einen Chromophor Cu enthält, der die Analyse des Fragments Fru durch Ultraviolett-, sichtbare oder Fluoreszenz-Spektroskopie erleichtert, wobei der Chromophor Cu einen log Emax-Hauptwert von wenigstens 2,5 hat und worin (i) der log Emax-Hauptwert wenigstens 1,5-mal größer als der log Emax-Hauptwert des Substrats R ist; oder (ii) der Chromophor Cu einen Absorptionspeak bei einer von Absorptionen aufgrund des Substrats R entfernten Wellenlänge hat.

Die Gegenwart eines UV-Chromophors im Konstrukt ermöglich die Quantifizierung der Produkte einer durchzuführenden Synthese. Eine solche Quantifizierung kann (i) eine absolute Quantifizierung oder (ii) eine relative Quantifizierung oder beide sein. Mit absoluter Quantifizierung ist gemeint, daß die absoluten Mengen eines Substratmoleküls oder Fragments oder Konstrukts, das das Substratmolekül enthält, bestimmt werden können, wohingegen der Begriff "relative Quantifizierung" hier verwendet wird, um die Bestimmung der Menge eines Substrats (oder Fragments oder Konstrukts, das das Substrat enthält) relativ zu einer anderen Komponente (wie ein Nebenprodukt oder Ausgangsmaterial oder ein anderes Substrat) in einer Reaktionsmischung zu bezeichnen.

Der UV-Chromophor wird typischerweise so ausgewählt, daß er eine sehr starke Absorption bei einer einzigartigen oder charakteristischen Wellenlänge hat, die gewöhnlich unterschiedlich von den Wellenlängen ist, bei denen die maximalen Extinktionen eines typischen Substratmoleküls gefunden werden könnten. Jedoch kann in Fällen, in denen die Absorption des Chromophors sehr groß relativ zum Substrat oder Substrat R ist, die Überlappung von Absorptionen aufgrund des Substrats und des Chromophors einen minimalen Einfluß auf die Genauigkeit der Messung der Menge von Substrat haben. Allgemein sollten überlappende Absorptionsbanden nicht die Durchführung von aussagekräftigen Analysen verhindern, vorausgesetzt, daß ein etwaiger eingeführter Fehler nicht größer als 10% und bevorzugt nicht größer als ca. 5% ist. Entsprechend können als eine Alternative zur Definition des Chromophors in bezug auf relative Extinktionen und absolute molare Absorptionswerte der Chromophor C und seine Beziehung zur Absorption aufgrund des Substrats in bezug auf den Fehlergrad definiert werden, der aus einer etwaigen Überlappung zwischen den Absorptionsbanden des Substrats R und des Chromophors stammt.

Daher stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese bereit, das einen festen Träger Q mit einem daran über eine Verbindungsgruppe Y gebundenen Substrat R umfaßt, worin Q, Y und R wie hier zuvor definiert sind; und worin die Verbindungsgruppe Y orthogonal und selektiv spaltbar wie hier zuvor definiert ist; worin das Fragment Fr das Substrat und wenigstens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfaßt und der Teil einen Chromophor Cu enthält, der die Analyse des Fragments Fru durch Ultraviolett-, sichtbare oder Fluoreszenzspektroskopie erleichtert, worin die Absorptionseigenschaften des Chromophors Cu und des Substrats R so sind, daß bei einer gegebenen Meßwellenlänge etwaige Fehler in der Messung der Menge von Substrat R (oder eines Fragments oder Konstrukts, das das Fragment enthält), die aus einer etwaigen Überlappung zwischen Absorptionsbanden aufgrund des Chromophors und Absorptionsbanden aufgrund des Substrats R stammen, weniger als 10%, bevorzugt weniger als 5% sind.

Beispiele für Chromophore sind Gruppen, die eine Aryl-Gruppe enthalten, bevorzugt eine kondensierte polycyclische Aryl-Gruppe, z. B. eine polycyclische C6-30-Aryl-Gruppe, in der ein oder mehrere (z. B. 1, 2 oder 3) Ringkohlenstoffatome gegebenenfalls durch ein Heteroatom wie Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff ersetzt sind. Beispiele für polycyclische Aryl-Gruppen sind polycyclische Kohlenwasserstoffe wie Naphthyl-, Phenanthrenyl- und Anthracenyl-Gruppen und polycyclische Heteroaryl-Gruppen wie Acridin oder Phenanthrolin. Solche Aryl-Gruppen oder polycyclischen Gruppen können gegebenenfalls substituiert sein, bevorzugt mit einem Substituent oder mit Substituenten, der/die inert ist/sind und/oder nicht in bezug auf die in einem gegebenen Reaktionsschema eingesetzten Reaktionsbedingungen wechselwirkt/wechselwirken.

Beispiele für solche Substituentengruppen schließen Alkyl und Alkoxy (z. B. Alkyl und Alkoxy mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffen), die jeweils gegebenenfalls eine oder mehrere ungesättigte Bindungen enthalten und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen sind, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel; Amino (bevorzugt geschütztes Amino oder mono- oder disubstituiertes Amino, z. B. Dimethylamino); Halogen wie Fluor, Chlor, Brom und Iod; Alkylthio (z. B. C1-20-Alkylthio, bevorzugt C1-6), Hydroxy, geschütztes (z. B. acyliertes) Hydroxy, Thio, geschütztes (z. B. acyliertes) Thio, Trifluormethyl, Nitro, Alkylsulfonyl, Aryl (z. B. gegebenenfalls substituiertes Phenyl, Thienyl und Furanyl) und Arylalkyl (z. B. Benzyl und Phenethyl) ein.

Andere Beispiele für Chromophore schließen hochkonjugierte Aryl- oder Nicht-Aryl-Systeme ein, vorausgesetzt daß solche Verbindungen unter den in der Festphasenchemie eingesetzten Synthesebedingungen inert sind, und sogenannte "Push-Pull"-Systeme des Typs G-J-M, worin G eine elektronenspendende Gruppe ist (z. B. Amino oder Alkoxy), J ein konjugiertes Feld von Mehrfach-, z. B. Doppelbindungen ist und M eine elektronenziehende Gruppe ist (z. B. Nitro oder Sulfonyl), wobei die Gruppen G und M elektronisch durch das konjugierte Feld von Mehrfachbindungen verbunden sind. Ein Beispiel für einen solchen Chromophor ist die Dansyl-Gruppe (1-Dimethylamino-5-napthylsulfonyl).

Die genaue Natur des Chromophors, seine chemischen Eigenschaften und seine Extinktionseigenschaften können von Fall zu Fall bestimmt werden, abhängig vom Typ der in einer gegebenen Synthese zu verwendenden Chemie. Es ist jedoch am meisten bevorzugt, daß der Chromophor inert gegenüber den in der Synthese eingesetzten Reaktanden und Reaktionsbedingungen ist.

Derzeit bevorzugte Chromophore schließen Anthracenyl- und Dansyl-Gruppen (5-Dimethylamino-1-naphthylsulfonyl) ein, wobei Anthracenyl besonders bevorzugt ist.

Die Quantifizierung des Substrats R kann entweder eine absolute Quantifizierung oder relative Quantifizierung sein, worin die relativen Mengen des Substrats R und einer anderen Komponente in der Synthesemischung (z. B. ein anderes Substrat oder ein anderes Ausgangsmaterial oder z. B. ein Nebenprodukt) bestimmt werden. Relative Quantifizierung macht Gebrauch von der Tatsache, daß der Chromophor Cu jedem Substrat einen gemeinsamen Satz von charakteristischen Extinktionen verleiht, die als Basis für die spektrophotometrische Analyse verwendet werden können.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Charakterisierung und/oder Analyse der Konstrukte der Erfindung an einer einzelnen Perle oder einer kleinen Anzahl von Perlen durchgeführt, z. B. 1 bis 20 Perlen, gewöhnlicher weniger als 10 Perlen. Solche Perlen haben typischerweise einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 90 bis 250 &mgr;m und eine Verbindungsbeladung zwischen 0,1 und 0,4 mmol/g. Die durchschnittliche Beladung einer individuellen Perle beträgt weniger als 10 nmol, häufig weniger als 5 nmol, z. B. ca. 1 nmol.

Ein signifikanter Vorteil der Verwendung der einen UV-Chromophor enthaltenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie verwendet werden können, um quantitative Information über sehr geringe Mengen von Substratverbindungen bereitzustellen, z. B. Mengen in der Größenordnung von 1 nmol, die typischerweise aus einzelnen Harzperlen der in kombinatorischen Spalt- und Mischverfahren verwendeten Größe erhältlich sind. In durch das Spalt- und Mischverfahren gebildeten kombinatorischen Bibliotheken wird jede Perle typischerweise nur eine einzelne Substratverbindung enthalten, aber eine Bibliothek wird eine Mehrzahl von Perlen enthalten, die unterschiedliche Substrate tragen. Die Analyse von Mischungen aus Perlen, die unterschiedliche Substrate tragen, ist problematisch, und daher ist es allgemein notwendig, Analysen an einzelnen Perlen durchzuführen. Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung ermöglichen die wirksame und genaue Durchführung der Analyse auf dem Niveau einer einzelnen Perle und insbesondere mit Perlen einer Größe der Größenordnung von 90 bis 250 &mgr;m Durchmesser mit Beladungen der Größenordnung 0,1–0,4 mmol/g.

In Konstrukten, in denen die ersten und zweiten Spaltungsstellen durch erste und zweite Linker-Gruppen L1 und L2 definiert sind und eine "Spacer-Gruppe" A zwischen den zwei Linker-Gruppen L1 und L2 zwischengeschaltet ist, kann die Spacer-Gruppe A den UV-Chromophor Cu enthalten oder daran gebunden aufweisen. Somit wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein chemisches Konstrukt wie hier zuvor definiert bereitgestellt, worin die Verbindungsgruppe Y die Formel L1-A-L2 hat; worin L1 eine erste Linker-Gruppe ist, die die erste Spaltungsstelle definiert; A eine chemische Gruppe (die Spacer-Gruppe ist), die den UV-Chromophor Cu enthält oder daran gebunden aufweist und gegebenenfalls eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung enthält; und L2 eine zweite Linker-Gruppe ist, die die zweite Spaltungsstelle definiert.

Der Chromophor Cu kann als integraler Teil der Hauptkomponente oder des Gerüsts des Fragments Fru gebildet sein (z. B. als Teil der Spacer-Gruppe A), oder er kann eine abstehende Gruppe sein. Wenn er eine abstehende Gruppe ist, kann er somit z. B. an A entweder direkt oder über eine Alkylen-Kette (z.B, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), gegebenenfalls unterbrochen mit einem oder mehreren Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatomen, oder mittels einer Ether-, Thioether-, Amid-, Sulfonamid- oder Ester-Bindung gebunden sein. Wenn die Spacer-Gruppe A eine Alkylendiamin-Gruppe oder Aminoalkoxy-Gruppe enthält, kann der Chromophor Cu z. B. an das Stickstoffatom der oder einer der Amino-Gruppen gebunden sein (direkt oder über eine gegebenenfalls unterbrochene Alkylen-Kette wie hier zuvor definiert). Z. B. kann der Chromophor Cu an das Stickstoffatom mittels einer Ethylen- oder Propylen-Kette oder durch eine Sulfonyl-Gruppe gebunden sein.

In Verbindungen, in denen ein Substituent wie eine Benzyl-Gruppe an eine der Amino-Gruppen einer Alkylendiamin-Spacer-Gruppe A gebunden ist, kann der Chromophor Cu direkt oder indirekt an die andere der Amino-Gruppen gebunden sein. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist der Chromophor Cu eine polycyclische Aryl-Gruppe wie eine Anthracenyl- oder Phenanthrenyl-Gruppe, die über eine Propylen-Kette an ein Stickstoffatom an einem Ende der Diamin-Spacer-Gruppe gebunden ist.

Der feste Träger Q kann jeder Typ von festem Träger sein, der zur Verwendung in der Festphasensynthese und insbesondere in der kombinatorischen Chemie geeignet ist. So kann der feste Träger allein als Beispiel die Form von Perlen, einer festen Oberfläche, von festen Substraten, Teilchen, Pellets, Scheiben, Kapillaren, Hohlfasern, Nadeln, festen Fasern oder organischen oder anorganischen Gelen wie Kieselgelen und unlöslichen organischen Teilchen wie aus Fullerenen gebildeten Teilchen annehmen.

Beispiele für Perlen sind polymere Perlen wie Cellulose-Perlen oder Harzperlen, wobei besondere Beispiele für Materialien, aus denen Harzperlen hergestellt werden können, funktionalisierte Polymerharze wie Polystyrolharze, Polyacrylamidharze und Dimethylacrylamidharze einschließen. Beispiele für geeignete Träger sind in "The Combinatorial Index" von Barry A. Benin, oben bezeichnet, aufgeführt. Beispiele für funktionalisierte Harze schließen vernetzte Polystyrolharze ein, die zur Bereitstellung von Amino-Gruppen oder Hydroxyl-Gruppen an ihren Oberflächen modifiziert sind; siehe z. B. "Combinatorial Chemistry" von Nicholas K. Terrett, Oxford University Press, 1998.

Um die Bestimmung der Synthesehistorie eines festen Trägers vereinfachen und ein Mittel zur Steuerung des Vermischens von festen Trägern in kombinatorischen "Split-and-Pool"-Synthesen bereitstellen zu können, können die festen Träger (z. B. Gruppen von Perlen) innerhalb durchlässiger markierter Behälter durch eine Reaktionssequenz hindurch begrenzt werden, wodurch die Synthese als ein Ergebnis dessen stattfindet, daß die Reaktanden und Lösungsmittel durch die Durchdringungen im Behälter fließen. Eine gegebene Reaktionsmischung kann eine Anzahl von Behältern enthalten, und am Ende jedes Reaktionsschrittes können die Behälter durch die Markierung, die z. B. eine Radiofrequenzmarkierung sein kann, entfernt und identifiziert werden. Beispiele für solche Behälter sind die "Kan"TM-Behälter aus Polypropylennetz, erhältlich von Irori aus La Jolla, Kalifornien, USA, die miniaturisierte Radiofrequenzmarkierungen enthalten.

In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse der wie hier zuvor definierten Konstrukte bereit; wobei das Verfahren das Spalten des Konstrukts an der ersten Spaltungsstelle zur Freisetzung des chemischen Fragments Fr, wobei die Spaltungsreaktion am chemischen Fragment Fr eine massenspektrometrische sensibilisierende Gruppe (z. B. eine Gruppe, die unter massenspektroskopischen Bedingungen ionisierbar ist) erzeugt, und anschließend das Unterwerfen des chemischen Fragments der Massenspektrometrie, z. B. Elektrospray-Massenspektrometrie, umfaßt.

Die Analyse des Fragments Fr liefert Informationen über die Reaktionshistorie des Konstrukts. Somit kann durch massenspektrometrische Analyse leicht bestimmt werden, ob das gewünschte Substrat in einer gegebenen Reaktionssequenz gebildet worden ist oder nicht. Die Analyse des Fragments Fr kann daher nicht nur zur Charakterisierung des Substrats oder Produkts der Festphasenreaktionssequenz verwendet werden, sondern ebenfalls zum Verfolgen des Fortschreitens der Reaktionen.

Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Analyse der Konstrukte wie hier zuvor definiert bereit; wobei das Verfahren das Spalten des Konstrukts an der ersten Spaltungsstelle zur Freisetzung des chemischen Fragments Fu und das Unterwerfen des Fragments der UV-, sichtbaren oder fluoreszenzspektrometrischen Analyse, z. B. quantitativen UV-Analyse, umfaßt.

Die Spaltungsprodukte können der Chromatographie, bevorzugt einer Flüssigchromatographietechnik wie HPLC, unter Verwendung eines UV-Detektors unterworfen werden, der eingestellt werden kann, um ein Mittel zur Bestimmung von Konzentrationen der verschiedenen Verbindungen bereitzustellen, wenn sie aus der Chromatographiesäule eluieren. Die Chromatographiesäule kann wiederum mit einem anderen instrumentellen Mittel zur Analyse zu dem Zweck der Identifizierung des Substrats verbunden werden. Ein bevorzugtes Mittel der instrumentellen Analyse ist die massenspektroskopische Analyse, und daher liefern das Verfahren und die Konstrukte der Erfindung ein Mittel zum Erreichen von sowohl Identifizierung als auch Quantifizierung des Substrats in einer einzelnen verbundenen Reihe von Analyseverfahren.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein intermediäres chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Herstellung eines chemischen Konstrukts wie hier zuvor definiert bereit, wobei das intermediäre Konstrukt die Formel Q-Y' hat, worin Y' eine reaktive oder geschützte Form der Gruppe Y ist und Q und Y wie hier zuvor definiert sind.

In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein intermediäres Konstrukt der Formel Q-L1-Ap bereit, worin Q und L1 wie hier zuvor definiert sind und Ap eine reaktive oder geschützte Form der Spacer-Gruppe A ist, die eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung und gegebenenfalls einen Chromophor Cu enthält. In einer besonderen Ausführungsform hat das intermediäre Konstrukt die allgemeine Formel Q-L1-N(Alk-Cu)-Alk-NH-X1, worin Alk eine Alkylen-Gruppe ist und X1 Wasserstoff oder eine Aralkyl-Gruppe ist. Das intermediäre Konstrukt wird bevorzugt mit einer Peak-spaltenden Kombination von Atomen wie 1H/2H(D), 79Br/81Br, 12C/13C, 14N/15N und 16O/18O isotopenmarkiert.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Identifizieren eines pharmazeutisch nützlichen Substrats bereit, umfassend das Herstellen einer Bibliothek, die eine Anzahl chemischer Konstrukte wie hier zuvor definiert enthält, und das Unterwerfen der Bibliothek der biologischen Untersuchung zur Identifizierung biologisch aktiver Substrate. Das Verfahren kann ferner den weiteren Schritt der Formulierung eines so identifizierten biologisch aktiven Substrats mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einschließen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt das Massenspektrum des Photolyseprodukts des in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukts;

2 zeigt das Massenspektrum eines Fragments, hergestellt durch Spaltung der Thiopyrimidin-Linker-Gruppe im in Beispiel 2 beschriebenen Konstrukt;

3 bis 8 zeigen die Massenspektren der Photolyseprodukte der in Beispiel 4 beschriebenen Konstrukte;

9 und 10 zeigen die Massenspektren von analytischen Fragmenten, hergestellt durch Palladium(0)-Spaltung der einen "Alloc"-Linker enthaltenden Konstrukte aus Beispiel 7; und

11 bis 18 zeigen die vergleichenden Massenspektren entweder eines Substrats oder eines analytischen Fragments, das das Substrat enthält, im Anschluß an Spaltung an entweder der ersten oder zweiten Spaltungsstelle für vier der Mitglieder der in Beispiel 6 beschriebenen kombinatorischen Bibliothek.

Beschreibung der erläuternden Ausführungsformen

Die Erfindung wird nun unter Verweis auf die folgenden Beispiele erläutert, aber nicht beschränkt.

In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Abkürzungen AcOH Essigsäure DMF Dimethylformamid DCM Dichlormethan DMAP 4-Dimethylaminopyridin DIC Diisopropylcarbodiimid TFA Trifluoressigsäure DIPA Diisopropylethylamin HATU 2-(1H-9-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat DMSO Dimethylsulfoxid PyBOP® Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat HOBT N-Hydroxybenzotriazol AA Aminosäure

Beispiel 1 Herstellung eines Konstrukts, das eine photolytisch spaltbare erste Spaltungsstelle enthält

Ein photospaltbares Konstrukt wurde unter Befolgen des in Schema 1 gezeigten Reaktionsschemas hergestellt. In diesem Beispiel setzt die photolytische Spaltung einer an eine Amino-Gruppe einer Ethylendiamin-Kette gebundenen substituierten Nitrobenzyloxycarbonyl-Linker-Gruppe die freie Amino-Gruppe frei, so daß sie eine Ionisation in einem Massenspektrometer erfahren kann, wodurch die Bildung eines charakteristischen Molekülions ermöglicht wird. In diesem Beispiel weist die Ethylendiamin-Verbindungsgruppe eine an die andere Amino-Gruppe gebundene isotopenmarkierte Benzyl-Gruppe auf, deren Effekt die Bereitstellung eines charakteristischen Spalt-Peaks im Massenspektrum des Spaltprodukts zur Unterstützung der Identifizierung ist.

Die in den Versuchen für Beispiel verwendeten Verbindungsnummern bezeichnen die Verbindungsnummern in Schema 1.

Schema 1
Experimentelle Beschreibung für Schema 1

TentaGel-NH2 (Rapp Polymere) (Harz 1) (30 g, 12,0 mmol) mit einem Perlendurchmesser im Bereich von 130 bis 160 &mgr;m und einer Beladung von 0,4 mmol/g wurde mit DMF gequollen, und hierzu wurde eine Lösung aus HOBT (9,3 g, 69,0 mmol), DIC (6,48 ml, 41,4 mmol) und 4-[4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (11,8 g, 39,4 mmol) in DMF (420 ml) gegeben und die Mischung für 16 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF gefolgt von MeOH und dann DCM und schließlich MeOH gewaschen. Dies wurde dann im Vakuum zum Erhalt von Harz 2 getrocknet.

Harz 2 (3 g, 11,9 mmol) wurde mit einer Lösung aus Carbonyldimidazol (19,3 g, 119 mmol) in DCM (400 ml) behandelt und das ganze unter langsamem Rühren für 5 h auf 50°C erwärmt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DCM gefolgt von Et2O, DCM und Et2O gewaschen und im Vakuum zum Erhalt von Harz 3 getrocknet.

Harz 3 (15 g, 4,35 mmol) wurde in DMF (200 ml) gequollen, und hierzu wurde eine Lösung aus 1-Benzyl-1-tert-butoxycarbonyl-1,2-diaminoethan (17) (2,71 g, 10,9 mmol) und 1-(Dideuterobenzyl)-1-tert-butoxycarbonyl-1,2-diaminoethan (16) (2,71 g, 10,9 mmol) in DMF (20 ml) gegeben und das ganze unter langsamen Rühren für 16 h auf 50°C erwärmt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF gefolgt von Et2O, DCM und Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet. Das Harz wurde dann mit einer 1 : 4-Lösung aus wäßrigem TFA (95%) und DCM behandelt und für 30 min geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DCM, gefolgt von Et2O, DCM und Et2O gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Harz wurde dann mit einer 10%igen Lösung von DIPEA in DMF für 1 h geschüttelt und dann abgelassen, und das Waschen wurde dann wie oben wiederholt, um Harz 4 zu ergeben.

Eine Lösung aus HATU (0,96 g, 2,52 mmol), DIPEA (0,89 ml, 5,04 mmol) und p-[(R,S)-&agr;-[1-(9H-Fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxy-butansäure (1,42 g, 2,52 mmol) in DMF (30 ml) wurde zu Harz 4 (3 g, 0,84 mmol) gegeben und das ganze für 16 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF und DCM gewaschen. Eine Lösung aus 20% Piperidin in DMF (30 ml) wurde zum Harz hinzugegeben und das ganze für 1 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF und DCM gefolgt von Et2O, DCM und Et2O gewaschen, und das Harz wurde im Vakuum getrocknet.

Harz 5 (20 mg, 0,004 mmol) wurde mit einer Lösung aus HATU (15 mg, 0,04 mmol), DIPEA (14 &mgr;l, 0,08 mmol) und Benzoesäure (5 mg, 0,04 mmol) in DMF (1 ml) behandelt und das ganze für 6 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und Et2O gewaschen und im Vakuum zum Erhalt von Harz 6 getrocknet. Die Konstruktanalyse dieses Harzes durch Photospaltung gefolgt von MS-Analysee ist in 1 gezeigt (siehe allgemeine Spaltungsbedingungen).

Wie aus 1 ersichtlich ist, führten die Gegenwart der sensibilisierenden Amin-Gruppe und der Peak-spaltenden Gruppe im analytischen Fragment, abgespalten vom Harz, zu einem starken Molekülion mit einem charakteristischen Doppelmuster.

Allgemeines Verfahren der Konstruktanalyse von Harzen über den photospaltbaren Linker

Eine kleine Probe des Harzes (ca. 0,5 mg) wird in DMSO (50 &mgr;l) suspendiert und für 30 min UV-Licht ausgesetzt. Die Lösung wird dann durch Massenspektrometrie analysiert. (Alternativ kann DMSO, das 0,2% Hydrazinhydrat enthält, als Lösungsmittel verwendet werden).

Die Massenspektren wurden auf einem im positiven Elektrospray-Modus betriebenen Finnegan MAT LCQ Ion Trap Massenspektrometer erhalten. Abtastbereich 100–1500 a. m. u. Abtastzyklusdauer 1,4 Sekunden; Ionenzeit 200 Mikrosekunden.

Beispiel 2 Herstellung eines Konstrukts, das eine "Fanghaken"-Thiopyrimidin-Linker-Gruppe an der ersten Spaltungsstelle enthält

Ein Konstrukt, das einen Thiopyrimidin-"Fanghaken"-Linker an der ersten Spaltungsstelle enthält, wurde gemäß dem im nachfolgenden Schema 2 gezeigten Reaktionsschema hergestellt. Die in der folgenden experimentellen Beschreibung verwendeten Konstruktzahlen bezeichnen die Zahlen in Schema 2.

Schema 2
Experimentelle Beschreibung für Schema 2

Eine Lösung aus 4-(Chlormethyl)benzoesäure (0,27 g, 1,6 mmol), PyBOP® (0,83 g, 1,6 mmol) und DIPEA (0,56 ml, 3,2 mmol) in DMF (8 ml) wurde für 20 min geschüttelt, und dann wurde diese Lösung zu TentaGel-NH2 (Rapp Polymere) Harz 1 (1 g, 0,32 mmol) mit einem Perlendurchmesser im Bereich von 130 bis 160 &mgr;m und einer Beladung von 0,32 mmol/g gegeben und das ganze für 5 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (8) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Aufschlämmung aus Thioharnstoff (0,58 g, 7,7 mmol) in Dioxan (4 ml) und Ethanol (1 ml) wurde zur Harz 8 (1 g, 0,32 mmol) gegeben und das ganze für 16 h auf 80°C erwärmt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF (× 5), DCM (× 5), Et2O, DCM und schließlich Et2O zum Erhalt von Harz 9 gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Lösung aus Methyl-2-(dimethylaminomethylen)-3-oxobutanoat (0,017 g, 0,96 mmol) und Triethylamin (65 &mgr;l, 0,48 mmol) in DMF (10 ml) wurde zu Harz 9 (1 g, 0,31 mmol) gegeben und das ganze für 16 h auf 80°C erwärmt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (10) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Harz 10 (0,5 g, 0,15 mmol) wurde dann mit einer 1 : 1-Mischung auf THF und 2N wäßrigem NaOH (4 ml) behandelt und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit THF/H2O, 10% AcOH/THF, THF/H2O, THF, DMF, DCM, Et2O, DCM und Et2O gewaschen und dann im Vakuum zum Erhalt von Harz 11 getrocknet.

Eine Lösung aus PyBOP® (24 mg, 0,045 mmol) und DIPEA (16 &mgr;l, 0,09 mmol) in DMF (1 ml) wurde zu Harz 11 (50 mg, 0,015 mmol) gegeben, gefolgt von einer Lösung aus 1-tert-Butoxycarbonyl-1-(o-brombenzyl)-diaminoethan (18) (15 mg, 0,045 mmol) in DMF (1 ml), und das ganze für 3 Tage geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Eine Lösung aus 95%igem wäßrigem TFA in DCM (20%, 1 ml) wurde dann zum Harz gegeben und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O und DCM gewaschen und dann mit 10% DIPEA in DMF für 10 min geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (12) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Lösung aus 4-[4-(1-(Fmoc-Amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-butansäure (23 mg, 0,045 mmol), DIPEA (16 &mgr;l, 0,09 mmol) und HATU (17 mg, 0,045 mmol) in DMF (2 ml) wurde zu Harz 12 (50 mg, 0,015 mmol) gegeben und das ganze für 3 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin in DMF (3 ml) behandelt und das ganze für 1 h geschüttelt. Das Harz (13) wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Eine Lösung aus Benzoesäure (11 mg, 0,09 mmol), DIPEA (16 &mgr;l, 0,09 mmol) und HATU (17 mg, 0,045 mmol) in DMF (2 ml) wurde zu Harz 13 gegeben und das ganze für 2 h geschüttelt. Das Harz (14) wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Die Konstruktanalyse dieses Harzes durch Pyrimidin-Spaltungsbedingungen (nachfolgend beschrieben) gefolgt von MS-Analyse ist in 2 gezeigt.

Allgemeines Verfahren der Konstruktanalyse von Harzen über den Pyrimidin-Linker

Eine kleine Probe Harz (ca. 0,5 mg) wird mit 0,01 M m-Chlorperbenzoesäure (0,5 ml) für 2 h behandelt. Das Harz wird dann abgelassen und mit DCM, Et2O und DCM gewaschen. Das Harz wird dann mit 0,02 M N-Methylpiperazin in DMF (50 &mgr;l) behandelt und für 12 h geschüttelt. Die Lösung wird dann entfernt und durch Massenspektrometrie analysiert.

Beispiel 3 Herstellung von Konstrukten, die unterschiedliche Peak-spaltende Gruppen enthalten

Eine Anzahl unterschiedlicher massenspektrometrischer Peak-spaltender Gruppen wurde hergestellt, und diese sind nachfolgend in Tabelle 1 erläutert.

Tabelle 1

In Beispiel 1 wurde die Peak-spaltende Gruppe mittels der Mischung aus Deuterium-markierten und unmarkierten Verbindungen 16/17 in Tabelle 1 (siehe Verweis auf Harz 4) eingeführt, wohingegen die Peak-spaltende Gruppe in Beispiel 2 mittels der Brombenzyl-Verbindung 18 (siehe Verweis auf Harz 12) eingeführt wurde.

Harze, die alternative Peak-spaltende Gruppen enthalten, wurden unter Verwendung der Verbindungen 19/20 und 21/22 wie nachfolgend beschrieben hergestellt.

Verwendung der Amine 19/20

Eine Lösung aus 1-tert-Butoxycarbonyl-1,2-diaminoethan (20) (110 mg, 0,68 mmol) und doppelt 15N-markiertem 1-tert-Butoxycarbonyl-1,2-di(15N)-aminoethan (19) (112 mg, 0,68 mmol) in DMF wurde zu Harz 3 (0,6 g, 0,18 mmol) gegeben und das ganze für 3 h auf 50°C erwärmt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Verwendung der Amine 21/22

Eine Lösung aus 1-tert-Butoxycarbonyl-1,5-diaminopentan (21) (295 mg, 1,45 mmol) und doppelt 15N-markiertem 1-tert-Butoxycarbonyl-1,2-di(15N)-aminopentan (22) (295 mg, 1,45 mmol) in DMF wurde zu Harz 3 (1,66 g, 0,58 mmol) gegeben und das ganze für 4 h auf 50°C erwärmt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Eine Lösung aus 95%igem wäßrigem TFA in DCM (20%, 1 ml) wurde dann zum Harz hinzugegeben und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O und DCM gewaschen und dann mit 10% DIPEA in DMF für 10 min geschüttelt. Das Harz (23) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Beispiel 4 Herstellung von Konstrukten, die Dipeptid-Substrate enthalten

In den Beispielen 1 und 2 ist das Substrat oder die Zielverbindung in jedem Fall die Modellverbindung Benzamid. In den folgenden Beispielen wurden Konstrukte hergestellt, die Dipeptide enthalten, die als Substrat entweder an einen Rink-Linker oder einen Wang-Linker als zweite Linker-Gruppe gebunden sind. In jedem Fall wurde eine photospaltbare erste Linker-Gruppe verwendet. Die zur Herstellung der Konstrukte verwendeten Reaktionsschemata sind nachfolgend in den Schemata 3 und 4 gezeigt.

Schema 3
Schema 4
Experimentelle Beschreibung für Aminosäure-Beispiele Herstellung von Rink-Harz 24

Eine Lösung aus p-[(R,S)-&agr;-[1-(9H-Fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxybutansäure (240 mg, 0,42 mmol), DIC (65 &mgr;l, 0,42 mmol)und HOBT (57 mg, 0,42 mmol) in DMF (1 ml) wurde zur Harz 23 (100 mg, 0,042 mmol) gegeben und das ganze für 4 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin in DMF (2 ml) behandelt und für 30 min geschüttelt. Das Harz (24) wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Herstellung von Wang-Harz 27

Eine Lösung aus 4-Formylphenoxyessigsäure (23 mg, 0,13 mmol), DIC (20 &mgr;l, 0,13 mmol) und HOBT (17 mg, 0,13 mmol) in DMF (1 ml) wurde zu Harz 23 (100 mg, 0,042 mmol) gegeben und das ganze für 4 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet. Das Harz wurde dann mit einer Lösung aus Tetrabutylammoniumborhydrid (50 mg, 0,2 mmol) in DCM behandelt und für 16 h geschüttelt. Das Harz (27) wurde dann abgelassen und mit DCM, DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Herstellung von acylierter Dipeptidsequenz auf Harz Tabelle 2: AA1 und AA2 auf Rink- und Wang-Linkern

Die Harze 25 und 28 wurden durch Umsetzen der Harze 24 bzw. 27 mit den gewünschten Fmoc-geschützten Aminosäuren gefolgt von Entschützen und anschließendem wiederholten Kuppeln an die zweite Aminosäure und Entschützen hergestellt (siehe allgemeines Verfahren). Die terminalen Amino-Gruppen wurden dann unter Verwendung von Essigsäureanhydrid acyliert (siehe nachfolgendes Verfahren).

Die Konstruktanalyse dieser Harze durch Photospaltung gefolgt von MS-Analyse ergab die in den Figuren gemäß Tabelle 3 gezeigten Massenspektren.

Tabelle 3: Massenspektren nach Konstruktanalyse
Allgemeines/typisches Verfahren zur Kupplung der Aminosäuren an die Linker

Eine Lösung der Fmoc-geschützten Aminosäure (0,14 mmol, 10 Äq.), DIC (22 &mgr;l, 0,14 mmol, 10 Äq.) und HOBT (19 mg, 0,14 mmol, 10 Äq.) in DMF (1 ml) wurde zu den erforderlichen Harzen 24 und 27 (30 mg, ca. 0,014 mmol) gegeben. Das ganze wurde dann für 5 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DCM, DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppen wurden dann durch Behandlung der Harze mit 20%iger Piperidin-Lösung in DMF (2 ml) und Schütteln für 30 min entfernt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DCM, DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Acetylierung der Dipeptide

Eine Lösung aus Essigsäureanhydrid (15 ml, 0,14 mmol) in DCM (1 ml) wurde zu den Harzen (30 mg, ca. 0,014 mmol) gefolgt von DMAP (1 mg, 0,008 mmol) gegeben und das ganze für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DCM, DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Wie aus den obigen Beispielen ersichtlich ist, ermöglichen die Konstrukte der Erfindung die einfache und leichte Analyse der durch Festphasenverfahren gebildeten kleinen Moleküle durch Massenspektrometrie. Durch Bereitstellen einer ionisierbaren Gruppe als massenspektraler Sensibilisator und eines Peak-spaltenden Isotops war das Ergebnis in jedem Fall ein leicht interpretiertes Massenspektrum, in dem das Molekülion als charakteristisches Dublett erscheint und in dem Peaks aufgrund von Fragmenten oder fremden Stoffen vernachlässigbar sind.

Beispiel 5 Herstellung eines Konstrukts, das einen Sulfonamid-Linker an der ersten Spaltungsstelle enthält

Ein Benzoesäure enthaltendes Konstrukt als Modellsubstrat, gebunden über einen säurelabilen Linker vom "Rink"-Typ an eine massenspektrale Peak-spaltende Ethylendiamin-Gruppe und wiederum über einen Sulfonamido-Linker an ein Harz, wurde wie im nachfolgenden Schema 5 gezeigt hergestellt. In diesem Beispiel setzt die Spaltung des Sulfonamids mit Mercaptoethanol in Gegenwart von starker Base ein analytisches Fragment mit einer massenspektrometrischen sensibilisierenden Amino-Gruppe frei.

Schema 5
Herstellung von Verbindung 3a

Zu einer gerührten Lösung aus 2-Nitro-4-methylbenzoatsulfonylchlorid 1 (1,10 g, 3,90 mmol) und Triethylamin (0,39 g, 3,90 mmol) in trockenem Dichlormethan (40 ml) wurde bei 0°C das Amin 2a (1,00 g, 3,9 mmol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) über 30 min gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um ein gelbes Öl zu ergeben. Reinigung durch Chromatographie mit [MTBE : Hexan (1 : 1)] als Elutionsmittel gefolgt von Umkristallisation aus MTBE (5 ml) und Hexan (2 ml) lieferte das Sulfonamid 3a (1,53 g, 79%) als weiße Flocken; Smp. 129–130°C;

Rf 0,31 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

(gefunden: C, 53,2; H, 5,6; N, 8,5; S, 6,4; C22H25D2N3O8S erfordert: C, 53,3; H, 5,5; N, 8,5; S, 6,5%);

&dgr;H (DMSO-d6) 1,40 (9H, s, H-18), 3,05 (2H, m, H-9), 3,20 (2H, dt, J3 und 13, H-10), 3,9 (3H, s, O-Me), 7,10–7,35 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,35 (1H, d, J8, H-5), 8,40 (1H, m, H-8), 8,45 (1H, s, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 27,8 (C-18), 40,9 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 53,0 (O-Me), 79,1 (C-17), 124,8 (C-13), 127,0 (C-14 und 15), 128,3 (C-6), 130,0 (C-13), 132,9 (C-5), 134,2 (C-12), 136,4 (C-1), 147,5 (C-4), 154,7 (C-2), 163,5 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray + ve) m/z 496 (MH)+;

HPLC, Rt 6,07 min.

Herstellung von Verbindung 4a

Der Ester 3a (0,40 g, 0,80 mmol) in Methanol (2 ml) wurde mit wäßrigem 1M Natriumhydroxid (1,60 ml, 1,60 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde dann im Vakuum auf konzentriert und der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst und dann mit 1 M Salzsäure (1,80 ml, 1,80 mmol) bei 0°C angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde mit Dichlormethan (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck zur Säure 4a (0,34 g, 88%) als weißer Feststoff eingedampft; Smp. 143–145°C;

Rf 0,58 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

&dgr;H (DMSO-d6) 1,29 (9H, s, H-18), 3,02 (2H, m, H-9), 3,20 (2H, dt, J3 und 13, H-10), 7,10–7,40 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,06 (1H, d, J8, H-6), 8,28 (1H, s, H-3), 8,30 (1H, d, J8, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 27,9 (C-18), 40,9 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 79,1 (C-17), 124,5 (C-13), 127,1 (C-14 und 15), 128,4 (C-6), 129,5 (C-13), 132,5 (C-5), 139,2 (C-12), 147,3 (C-1), 155,1 (C-4), 164,8 (C-16 und C=O);

(gefunden: MH+, 482,156364 C21H23D2N3O8S erfordert: MH+, 482,156615);

HPLC, Rt 5,65 min.

Herstellung von Verbindung 3b

Zu einer gerührten Lösung aus 2-Nitro-4-methylbenzoatsulfonylchlorid 1 (1,10 g, 3,90 mmol) und Triethylamin (0,39 g, 3,90 mmol) in trockenem Dichlormethan (40 ml) wurde bei 0°C das Amin 2b (0,95 g, 3,9 mmol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) über 30 min gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum auf konzentriert, um ein gelbes Öl zu ergeben. Reinigung durch Chromatographie mit [MTBE : Hexan (1 : 1)] als Elutionsmittel gefolgt von Umkristallisation aus MTBE (5 ml) und Hexan (2 ml) lieferte das Sulfonamid 3b (1,51 g, 79%) als weiße Flocken; Smp. 131–132°C;

Rf 0,28 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

(gefunden: C, 53,7; H, 5,4; N, 8,4; S, 6,5; C22H27D2N3O8S erfordert: C, 53,5; H, 5,5; N, 8,5; S, 6,5%);

&dgr;H (DMSO-d6) 1,38 (9H, s, H-18), 3,10 (2H, t, J8, H-9), 3,24 (2H, t, J8, H-10), 3,95 (3H, s, O-Me), 4,32 (2H, s, H11), 7,13–7,32 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,09 (1H, s, H-3), 8,32 (1H, d, J8, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 28,3 (C-18), 40,2 (C-9 und 10), 46,2 (C-11), 53,2 (O-Me), 79,3 (C-17), 125,1 (C-13), 127,2 (C-14 und 15), 128,6 (C-6), 130,3 (C-13), 133,1 (C-5), 134,4 (C-12), 136,6 (C-1), 147,6 (C-4), 163,7 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray –ve) m/z 492 (M – H);

HPLC, Rt 5,99 min.

Herstellung von Verbindung 4b

Der Ester 3b (0,40 g, 0,80 mmol) in Methanol (2 ml) wurde mit wäßrigem 1M Natriumhydroxid (1,60 ml, 1,60 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde dann im Vakuum aufkonzentriert und der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst und dann mit 1 M Salzsäure (1,80 ml, 1,80 mmol) bei 0°C angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde mit Dichlormethan (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck zur Säure 4b (0,36 g, 93%) als weißer Feststoff eingedampft; Smp. 123,7–124,8°C;

Rf 0,59 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

&dgr;H (DMSO-d6) 1,42 (9H, s, H-18), 3,12 (2H, m, H-9), 3,22 (2H, m, H-10), 4,38 (2H, s, H11), 7,18–7,42 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,11 (1H, d, J8, H-6), 8,39 (1H, d, J8, H-3), 8,45 (1H, s, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6); 27,8 (C-18), 40,1 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 79,1 (C-17), 124,8 (C-13), 126,9 (C-14 und 15), 128,4 (C-6), 129,9 (C-13), 132,9 (C-5), 135,8 (C-12), 137,9 (C-1), 147,5 (C-4), 153,9 (C-2), 163,7 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray –ve) m/z 478 (M – H);

HPLC, Rt 5,56 min.

Herstellung von Verbindung 5

Zu einer Suspension aus Aminharz (Argogel-NH2) (0,37 g, 0,15 mmol) mit einem durchschnittlichen Perlendurchmesser von 150 &mgr;m und einer Beladung von 0,4 mmol/g in DMF (4 ml) und Dichlormethan (2 ml) wurde die Benzoesäure (4a) (0,22 g, 0,45 mmol) und die Benzoesäure (4b) (0,22 g, 0,45 mmol) gegeben, gefolgt von PyBOP (0,47 g, 0,9 mmol) und HOBT (0,12 g, 0,90 mmol), gefolgt 4 min später von Hünigscher Base (0,21 g, 1,80 mmol). Die Reaktion wurde mit Stickstoff für 18 h gerührt und das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 10 ml), DMF (6 × 10 ml), Dichlormethan (6 × 10 ml) und Ether (2 × 10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das Sulfonamidharz 5 (0,43 g, 97%) als gelben Feststoff zu ergeben; der Kaiser-Test war negativ; der Bromphenolblau-Test war negativ.

Herstellung von Verbindung 6

Das geschützte Harz (0,39 g, 0,13 mmol) wurde in Dichlormethan (2 ml) suspendiert und mit Trifluoressigsäure (2 × 4 ml) für 5 min behandelt. Die Lösungsmittel wurden durch Filtration entfernt und das Harz mit 10%iger DIPEA-Lösung in DMF (3 × 5 ml), Dichlormethan (6 × 5 ml), DMF (6 × 5 ml), Dichlormethan (6 × 5 ml) und Ether (2 × 5 ml) gewaschen. Das Aminharz wurde dann in DMF (4 ml) und Dichlormethan (2 ml) suspendiert, die Rink-Säure (0,51 g, 0,90 mmol) wurde hinzugegeben, gefolgt von PyBOP (0,47 g, 0,9 mmol) und HOBT (0,12 g, 0,90 mmol). Nach 4 min wurde Hünigsche Base (0,21 g, 1,80 mmol) hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Stickstoff für 18 h gerührt und das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 10 ml), DMF (6 × 10 ml), Dichlormethan (6 × 10 ml) und Ether (2 × 10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das Sulfonamidharz 6 (0,43 g, 100%) als gelben Feststoff zu ergeben; der Kaiser-Test war negativ; der Bromphenolblau-Test war negativ; die Harzbeladung betrug 98%, abgeschätzt durch quantitative Spaltung der Fmoc-Gruppe.

Herstellung von Verbindung 7

Harz (6) (0,20 g, 0,06 mmol) wurden mit 20% Piperidin in DMF-Lösung (2 × 3 ml) für 10 min behandelt. Die Lösungsmittel wurden durch Filtration entfernt und das Harz mit DMF (6 × 3 ml), Dichlormethan (6 × 3 ml) und Ether (2 × 3 ml) gewaschen. Das Harz wurde in DMF (1 ml) und Dichlormethan (1 ml) suspendiert, und Benzoesäure (12 mg, 0,01 mmol) wurde hinzugegeben, gefolgt von PyBOP (52 mg, 0,1 mmol) und hofbt (13 mg, 0,1 mmol). Nach 4 min wurde Hünigsche Base (26 mg, 0,2 mmol) hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Stickstoff für 3 h gerührt und das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 1 ml), DMF (6 × 1 ml), Dichlormethan (6 × 1 ml) und Ether (2 × 1 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das Sulfonamidharz 7 (51 mg, 100%) als gelben Feststoff zu ergeben; der Kaiser-Test war negativ; der Bromphenolblau-Test war negativ.

Herstellung von Verbindung 8

Eine kleine Probe von Harz (7) (ca. 0,5 mg) wurde mit der Entschützungslösung A (0,5 ml) für 1 h behandelt. Das Harz wurde filtriert und die resultierende Lösung dann durch Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert;

MS (Elektrospray –ve) m/z 582/584 (M – H), HPLC Rt 4,49 min.

Lösung A: Mercaptoethanol (0,23 ml, 3,0 mmol) und DBU (0,67 ml, 4,5 mmol) in MeCN (3 ml).

Beispiel 5 Herstellung eines Konstrukts, das einen dde-Linker an der ersten Spaltungsstelle enthält

Ein Konstrukt, das ein Benzoesäure-Modellsubstrat enthielt, gebunden über einen Linker vom "Rink"-Typ an einen massenspektralen Ethylendiamin-Peak-Spalter und weiterhin über einen "dde"-Linker an ein Harz, wurde gemäß dem im nachfolgenden Schema 6 dargestellten Reaktionsschema hergestellt. Spaltung des Konstrukts an der ersten Spaltungsstelle, definiert durch die dde-Gruppe, unter Verwendung von Hydrazin erzeugt ein analytisches Fragment mit einer freien Amino-Gruppe als massenspektrometrische sensibilisierende Gruppe.

Schema 6
Allgemein

HPLC wurde an einem Instrument Hewlett Packard 1050 unter Verwendung einer C18-Umkehrphasensäule (Supelco, Supelcosil ABZ+, 3,3 mm, 4,6 mm ϕ) durchgeführt. Verfahren A: 10 bis 95% Lösungsmittel B Gradient (1 ml/min) als mobile Phase. [Lösungsmittel A: 1% TFA in Wasser; Lösungsmittel B: 0,5% TFA in McCN : Wasser (10 : 1), 8 min Gradientenzeit] oder Verfahren B: C18-Umkehrphasensäule (Dynamax 60A, 25 mm, 6 mm ϕ) mit 10 bis 95% Lösungsmittel B Gradient (1 ml/min) als mobile Phase. [Lösungsmittel A: 1% TFA in Wasser; Lösungsmittel B: 0,5% TFA in McCN : Wasser (10 : 1), 10 min Gradientenzeit]. Schmelzpunkte wurden an einer automatischen Schmelzpunktvorrichtung Mettler FP5 in offenen Röhrchen unter Erwärmen von 50°C mit 2°C/min bestimmt und sind unkorrigiert.

Herstellung von Verbindung 10

4-Dimethylaminopyridin (4,03 g, 33 mmol) wurde zu einer Lösung aus Adipinsäuremonoethylester (5,33 ml, 30 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) gefolgt von Düsopropylcarbodiimid (5,17 ml, 33 mmol) gegeben. Nach 25 min wurde eine Lösung aus Dimedon (4,63 g, 33 mmol) in Dimethylformamid (25 ml) hinzugegeben und das Rühren für 48 h fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt und mit 0,5 M KHSO4 (2 × 100 ml), Wasser (100 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO4), filtriert und eingedampft. Die resultierende Aufschlämmung wurde mit Ethylacetat (250 ml) verrieben, filtriert und der Rückstand mit Ethylacetat gewaschen. Eindampfen der vereinigten Filtrate ergab ein gelbes Gummi, das durch Festphasenextraktion (Säule 1,5'' × 4'', Elutionsmittel: Dichlormethan) gereinigt wurde, um Verbindung 10 als gelbes Öl (7,43 g, 84%) zu ergeben.

&dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 4,04 (q, 2H, H2, 7Hz), 2,97 (t, 2H, H4, 7,5Hz), 2,46 (s, 2H, H13), 2,28 (s, 2H, H14), 2,26 (d, 2H, H7, 7,5Hz), 1,60 (m, 4H, H5,6), 1,00 (s, 6H, H16).

&dgr;C (CDCl3, 400 MHz): 205,15 (C-12), 197,58 (C-11), 195,08 (C-3), 173,47 (C-8), 112,02 (C-10), 60,27 (C-2), 52,67 (C-4), 46,80 (C-13), 40,04 (C-14), 34,15 (C-7), 30,72 (C-15), 28,23 (C-16), 24,64 (C-5), 24,01 (C-6), 14,31 (C-1).

&ngr;max (cm–1): 2960 (OH), 1734 (C=O Ester), 1665 (C=O Keton), 1564, 1445, 1143.

MS (Elektrospray +ve) m/z 297 (MH)+ (Elektrospray –ve), 295 (M – H);

HPLC-Verfahren A: 5,31 min, 97%, 254 nm.

Herstellung von Verbindung 11

2 M Natriumhydroxid-Lösung (2 ml, 4 mmol) wurde zu einer Lösung aus Verbindung 10 in Tetrahydrofuran (5 ml) gegeben. Nach 3 h wurde die Reaktionsmischung auf 10%ige wäßrige Salzsäure (50 ml) gegossen und mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und eingedampft, um Verbindung 11 als cremefarbenen weißen Feststoff (498,5 mg, 95%) zu ergeben.

&dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 2,99 (dd, 2H, H2, 5Hz), 2,47 (s, 2H, H10), 2,34 (2H, H5, 5Hz), 2,29 (s, 2H, H11), 1,63 (m, 4H, H3,4), 1,00 (s, 6H, H13,14).

&dgr;C (CDCl3, 400 MHz): 205,15 (C-9), 197,58 (C-8), 195,08 (C-1), 173,47 (C-6), 112,02 (C-7), 52,96 (C-2), 47,11 (C-10), 40,40 (C-11), 33,92 (C-5), 30,72 (C-12), 28,23 (C-13, 14), 24,64 (C-3), 24,01 (C-4).

&ngr;max (cm–1): 3030 (Säure-OH), 1702 (Säure-C=O), 1646 (Keton-C=O).

Schmelzpunkt: 58,2°C.

MS (Elektrospray +ve) m/z 296 (MH)+ (Elektrospray –ve), 267 (M – H);

HPLC-Verfahren A: 4,15 min, 97%, 254 nm.

Herstellung Von Verbindung 12

Eine Lösung aus N-(tert-Butoxycarbonyl)-N-benzyldiaminoethan (187,3 mg, 0,75 mmol) und N-(tert-Butoxycarbonyl)-N-(&agr;-dideutero)-benzyldiaminoethan (189,3 mg, 0,75 mmol) in Dichlormethan (3 ml) gefolgt von Diisopropylethylamin (348,4 &mgr;l, 2 mmol) wurde zu einer Lösung aus Verbindung 11 (268,4 mg, 1 mmol) in Dichlormethan (2 ml) gegeben. Nach Rühren für 20 h wurde die Reaktionsmischung eingedampft, erneut in Ethylacetat (25 ml) gelöst und mit 10%iger Zitronensäure-Lösung (3 × 10 ml), Wasser (10 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und eingedampft und dann durch Flash-Chromatographie (1 bis 3% Methanol in Chloroform) gereinigt, um Verbindung 12 als gelbes Gummi (474,5 mg, 95%) zu ergeben.

&dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 13,50 (bs, 1H, H20), 7,30 (m, 5H, H17), 4,45 (bd, 1H, H18), 3,47 (bd, 4H, H15,16), 2,90 (m, 2H, H2), 2,40 (t, 2H, H5, 7,4Hz), 2,30 (s, 4H, H10,11), 1,75 (m, 2H, H4), 1,45 (m, 11H, H3,19).

&ngr;max (cm–1): 3030 (Säure-OH), 1730 (C=O, Boc, Säure), 1690 (Keton-C=O), 1570 (konjugiertes Enamin).

MS (Elektrospray +ve) m/z 503, 501 (MH)+ (Elektrospray –ve), 502, 499 (M – H).

HPLC-Verfahren A: 5,35 min, > 97%, 230, 254 nm.

Herstellung von Verbindung 13

Zu einer Lösung aus Verbindung 12 (310 mg, 0,62 mmol) in Dichlormethan (6 ml) wurden 1-Hydroxybenzotriazol (110,8 mg, 0,82 mmol) und PyBOP (426,6 mg, 0,82 mmol) gegeben. Nach 5 min wurde die Lösung zu einer Suspension aus Aminomethyl-Argogel® (500 mg, 0,205 mmol, 0,41 mmol/g Beladung) mit einer durchschnittlichen Perlengröße von 150 &mgr;m in Dichlormethan (1 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 5 min gerührt, dann wurde Diisopropylethylamin (285,7 &mgr;l, 1,64 mmol) hinzugegeben und das Rühren für 16 h fortgesetzt. Das Harz wurde mit DMF (5 ×) und DCM (5 ×) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um Harz 13 (573,5 mg) zu ergeben. Das Harz ergab einen negativen Bromphenolblau-Test.

Herstellung von Verbindung 14

Harz 13 (475,5 mg) wurde mit Dichlormethan gequollen und dann mit einer Lösung aus Phenol (60 mg) in Dichlormethan (1 ml) gefolgt von Trifluoressigsäure (3 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde für 10 min gerührt, dann abgelassen und mit Dichlormethan (2 ×) gewaschen. Die Reaktion wurde wiederholt und dann das Harz mit Dichlormethan (1 ×), 20% Diisopropylethylamin in Dimethylformamid (3 ×), Dimethylformamid (5 ×) und Dichlormethan (5 ×) gewaschen, um die Aminoharz-Zwischenstufe zu ergeben, die einen positiven Bromphenolblau-Test ergab. Das Harz wurde in Dichlormethan (2 ml) suspendiert und mit einer vorgebildeten Lösung aus der C-4-Rink-Säure (351,5 mg, 0,62 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (110,8 mg, 0,82 mmol) und PyBOP (426,6 mg, 0,82 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) behandelt. Nach 5 min wurde Diisopropylethylamin (285,47 &mgr;l, 1,64 mmol) hinzugegeben und die Reaktionsmischung für 3 h gerührt, worauf das Harz einen negativen Bromphenolblau-Test ergab. Das Harz wurde mit DMF (5 ×) und DCM (5 ×) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um Harz 14 (500,9 mg) zu ergeben.

Eine kleine Probe von Harz 14 (ca. 0,5 mg) wurde mit 2% Hydrazin in Dimethylformamid für 30 Minuten behandelt. Die Lösung wurde dann durch Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert, um ein Ion 700/702 zu ergeben.

Herstellung von Verbindung 15

Das Harz 14 (65 mg) wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (2 × 3 ml × 10 min) behandelt und dann mit Dimethylformamid (5 ×) und Dichlormethan (5 ×) gewaschen. Das Harz ergab einen positiven Kaiser-Test und wurde in Dichlormethan (1 ml) suspendiert und dann mit einer vorgebildeten Lösung aus Benzoesäure (127 mg, 1,04 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (140 mg, 1,04 mmol) und PyBOP (541 mg, 1,04 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) behandelt. Nach 5 min wurde Diisopropylethylamin (541 mg, 2,08 mmol) hinzugegeben und die Reaktionsmischung für 72 h gerührt, worauf das Harz einen negativen Kaiser-Test ergab. Das Harz wurde mit DMF (5 ×) und DCM (5 ×) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um Harz 15 (60 mg) zu ergeben.

Eine kleine Probe des Harzes (ca. 0,5 mg) wurde mit 2% Hydrazin in Dimethylformamid für 30 Minuten behandelt. Die Lösung wurde dann durch Elektrospray-Massenspektrometrie zu einem Ion 582/584 analysiert.

Beispiel 6 Herstellung einer 64-gliedrigen Bibliothek durch eine 4 × 4 × 4-kombinatorische Synthese

Die Nützlichkeit der Konstrukte der Erfindung in der Schaffung kombinatorischer Bibliotheken wurde durch Herstellen einer 64-gliedrigen Bibliothek von Konstrukten, die unterschiedliche Diamid-Substrate enthielten, unter Verwendung eines 4 × 4 × 4-kombinatorischen Syntheseverfahrens gezeigt. Zur Bereitstellung eines Mittels zur Bestimmung der Synthesehistorie der Perlen und zur Ermöglichung der positiven Steuerung des Sortierens und Mischens der Perlen (anstelle der bloßen Bestimmung durch eine einfache statistische Verteilung), so daß alle 64 Mitglieder der Bibliothek gebildet wurden, wurden Mengen der Harzperlen in 64 radiofrequenzmarkierte Irori MicroKanTM-Behälter geladen. Die MicroKanTM-Behälter, erhältlich von Irori aus La Jolla, Kalifornien, USA, sind Polypropylen-Behälter mit einer Polypropylennetz-Seitenwand, einer Harzkapazität von bis zu 30 mg und einem Innenvolumen von 330 &mgr;l. Die Verwendung der MicroKanTM-Behälter stellt hinsichtlich der Anzahl synthetisierter Verbindungen die Vorzüge einer kombinatorischen "Split and Pool"-Synthese bereit, aber vermeidet die Notwendigkeit, Kodierungskonstrukte auf den Harzperlen aufzubauen, da die MicroKanTM-Behälter mit Radiofrequenzmarkierungen versehen sind, die die Identifizierung und damit Überwachung jedes Behälters durch die Reaktionssequenz hindurch ermöglichen. Da jeder Behälter ein einzigartiges Substrat am Ende der Reaktionssequenz enthält und die Synthesehistorie des Behälters verfolgt wurde, kann entsprechend die Identität des Substrats in jedem Behälter bestimmt werden, natürlich unter der Annahme, daß jeder Reaktionsschritt nach Plan abgelaufen ist.

Die Diamid-Substrate wurden auf einem Gerüst aufgebaut, das einen Thiopyrimidin-Fanghaken-Linker an der ersten Spaltungsstelle, eine Diaminoethan-Verbindungsgruppe, die eine Peak-spaltende N-Benzyl-Gruppe trägt, und einen photolabilen Linker an der zweiten Spaltungsstelle enthält, die das Substrat mit der Diaminoethan-Verbindungsgruppe vereinigt.

Ein intermediäres Konstrukt, das die N-Benzyldiaminoethan-Peak-Spaltergruppe und eine photolabile Pyrimidin-Linker-Gruppe enthält, wurde durch die im nachfolgenden Schema 7 gezeigte Reaktionssequenz hergestellt, wobei die anschließenden Syntheseschritte und die Herstellung der kombinatorischen Bibliothek in Schema 8 gezeigt sind. Die experimentellen Einzelheiten für jedes Schema sind nachfolgend aufgeführt, und die in den experimentellen Beschreibungen verwendeten Verbindungs- und Konstruktnummern bezeichnen die Konstrukt/Verbindungsnummern in den zwei Schemata.

Schema 7
Experimentelle Beschreibung für Pyrimidin-Konstrukt

Eine Lösung aus 4-(Chlormethyl)benzoesäure (3,91 g, 23 mmol), HATU (8,74 g, 23 mmol) und DIPEA (7,95 ml, 46 mmol) in DMF (40 ml) wurde für 20 min geschüttelt, dann wurde diese Lösung zu Argogel-Harz 1 (1 g, 0,46 mmol) mit einem durchschnittlichen Perlendurchmesser von 150 &mgr;m und einer Beladung von 0,46 mmol/g gegeben, und das ganze wurde für 5 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (2) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Aufschlämmung aus Thioharnstoff (8,4 g, 110 mmol) in Dioxan (80 ml) und Ethanol (20 ml) wurde zu Harz 2 gegeben und das ganze für 16 h auf 80°C erwärmt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF (× 5), DCM (× 5), Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen, um Harz 3 zu ergeben. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Lösung aus Methyl-2-(dimethylaminomethylen)-3-oxobutanoat (2,4 g, 13,8 mmol) und Triethylamin (0,96 ml, 6,9 mmol) in DMF (100 ml) wurde zu Harz 3 gegeben und das ganze für 16 h auf 80°C erwärmt. Das Harz wurde heiß abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (4) wurde dann im Vakuum getrocknet. Das Harz 4 wurde dann mit einer 1 : 1-Mischung aus THF und wäßrigem 2N NaOH (100 ml) behandelt und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und mit THF/H2O, 10% AcOH/THF, THF/H2O, THF, DMF, DCM, Et2O, DCM und Et2O gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um Harz 5 zu ergeben.

Eine Lösung aus PyBOP® (3,6 g, 6,9 mmol) und DIPEA (2,4 ml, 25 mmol) in DMF (30 ml) wurde zu Harz 5 (5 g, 2,3 mmol) gegeben, gefolgt von einer Lösung aus 1-Benzyl-1-tert-butoxycarbonyl-1,2-diaminoethan (0,86 g, 3,5 mmol) und 1-(Dideuterobenzyl)-1-tert-butoxycarbonyl-1,2-diaminoethan (0,86 g, 3,5 mmol) in DMF (1 ml) und das ganze für 4 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Eine Lösung aus 20%igem wäßrigem TFA in DCM (20%, 30 ml) wurde dann zum Harz hinzugegeben und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O und DCM gewaschen und dann mit 10% DIPEA in DMF für 10 min geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (6) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Schema 8
Experimentelle Beschreibung für Schema 8

Die Photolinker-Säure 11 (0,416 g, 1,47 mmol), DIPEA (0,51 ml, 2,94 mmol) und PyBOP (0,765 g, 1,47 mmol) wurden in DMF (10 ml) gelöst und für 10 min stehengelassen. Dies wurde dann zu Harz 6 (0,7 g, 0,294 mmol) gegeben und für 4 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O und DCM gewaschen und dann mit 10% DIPEA in DMF für 10 min geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen und mit DMF, DCM, Et2O, DCM und schließlich Et2O gewaschen. Das Harz (7) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Allgemeines Verfahren für den reduktiven Aminierungsschritt

In ein Gefäß, das 16 Irori MicroKanTM-Behälter (jeweils enthaltend 10 mg, 0,004 mmol Harz 7) in DCM (30 ml) enthielt, wurde eine vorgemischte Lösung aus dem Amin (für die Mengen siehe die nachfolgende Tabelle) und Essigsäure (46 &mgr;l, 0,768 mmol) in DCM (2 ml) gegeben und für 20 min geschüttelt. Zum Gefäß wurde dann eine Mischung aus Tetramethylammoniumborhydrid (0,404 mg, 1,54 mmol) und Essigsäure (46 &mgr;l, 0,768 mmol) in DCM (5 ml) gegeben und das Gefäß für 16 h geschüttelt. Die Gefäße wurden dann abgelassen und die MicroKanTM-Behälter mit DCM, DMF, DCM und Et2O (jeweils 3-mal) gewaschen.

Allgemeines Verfahren für den Acylierungsschritt mit Aminosäuren

In jedes von 4 Gefäßen, die 16 Irori MicroKanTM-Behälter (jeweils enthaltend 10 mg, 0,004 mmol Harz 8) in DMF (30 ml) enthielten, wurde eine Lösung aus PyBOP (333 mg, 0,64 mmol), DIPEA (224 &mgr;l, 1,28 mmol) und einer der Aminosäuren (für Mengen siehe nachfolgende Tabelle) in DMF (5 ml) gegeben und die Mischung für 16 h geschüttelt. Die Gefäße wurden dann abgelassen und die MicroKanTM-Behälter mit DMF, DCM, DMF, DCM und Et2O (jeweils 3-mal) gewaschen. In ein Gefäß, das alle 64 MicroKanTM-Behälter enthielt, wurde dann eine Lösung aus Piperidin (20%) in DMF gegeben und für 3 h geschüttelt. Die Gefäße wurden dann abgelassen und die MicroKanTM-Behälter mit DMF, DCM, DMF, DCM und Et2O (jeweils 3-mal) gewaschen.

Allgemeines Verfahren für den Acylierungsschritt mit Säuren

In jedes von 4 Gefäßen, die 16 Irori MicroKanTM-Behälter (jeder Behälter enthaltend 10 mg, 0,004 mmol Harz 9) in DMF (30 ml) enthielten, wurde eine Lösung aus PyBOP (333 mg, 0,64 mmol), DIPEA (224 &mgr;l, 1,28 mmol) und einer der Säuren (für Mengen siehe Tabelle 3) in DMF (5 ml) gegeben und die Mischung für 16 h geschüttelt. Die Gefäße wurden dann abgelassen und die MicroKanTM-Behälter mit DMF, DCM, DMF, DCM und Et2O (jeweils 3-mal) gewaschen.

Allgemeines Verfahren zur analytischen Spaltung von Harz 10

Das Harz 10 wird mit einer 10%igen Lösung aus meta-Chlorperbenzoesäure (mcpba) in DCM für 4 h behandelt. Die Lösung wird dann durch Filtration entfernt und die Perlen mit DCM gewaschen. Eine einzelne Perle aus jedem der 64 MicroKanTM-Behälter wird dann mit einer 10%igen Lösung aus 1-Methylpiperazin in DMSO behandelt und für 16 h stehengelassen. Die resultierende gespaltene Lösung wird dann der Analyse durch Elektrospray-Massenspektrometrie unterworfen. Die Massenspektren für die gespaltenen analytischen Konstrukte sind in den Spektren gezeigt, die in der nachfolgenden Tabelle in der mit "Konstruktspaltung" übertitelten Spalte identifiziert sind. Die Massenspektren für die ersten vier Monomerkombinationen sind in den 11 bis 14 gezeigt.

Allgemeines Verfahren zur Photospaltung von Harz 10

Eine einzelne Perle aus jedem der 64 MicroKanTM-Behälter wird in DMSO (enthaltend 0,2% H2NNH2) gequollen und dann für 4 h der Photolyse unterworfen und die Lösung der Analyse durch Elektrospray-Massenspektrometrie unterworfen. Die Massenspektren der Photolyse-Spaltungsprodukte der Bibliothek sind in den Spektren gezeigt, die in der mit "UV-Spaltung" übertitelten Spalte in der nachfolgenden Tabelle identifiziert sind. Die Massenspektren für die ersten vier Monomerkombinationen sind in den 15 bis 18 gezeigt.

Ergebnisse

Wie aus den in den Figuren gezeigten Massenspektren ersichtlich ist, bedeutet die Abwesenheit einer leicht ionisierbaren Gruppe am Substrat, wenn die Konstrukte photolytisch an der zweiten Spaltungsstelle zur Freisetzung von Substrat gespalten werden, daß das Massenspektrum kein starkes Molekülion zeigt und daher die Identifizierung des Substrats schwierig ist. Wenn jedoch die Konstrukte an der Perle an der ersten Spaltungsstelle gespalten werden, um ein analytisches Fragment freizusetzen, das das Substrat und sensibilisierende und Peak-spaltende Gruppen enthält, dann wird ein starkes charakteristisches und leicht identifizierbares gespaltenes Molekülion erzeugt, wodurch die Identifizierung des Substrats ermöglicht wird. In den meisten Fällen korrelierte die Identität des Substrats aus dem Molekülion im Massenspektrum mit der aus der bekannten Synthesehistorie der Harzperlen in jedem MicroKanTM vorhergesagten Identität. Bei gewissen Reaktionen bildeten die Substrate jedoch Oxidationsprodukte unter den verwendeten Spaltungsbedingungen, um den Fanghaken-Linker aufzuschließen, aber solche Oxidationsprodukte konnten leicht als M + 16-Ionen im Massenspektrum identifiziert werden. Daher besteht ein weiterer Vorteil der Konstrukte der Erfindung darin, daß sie ein Mittel zur Bestimmung bereitstellt, wenn eine besondere Reaktion nicht gemäß Plan fortgeschritten ist.

Die doppelten Linker-Konstrukte der Erfindung erlauben es, daß die Spaltung entweder zur Freisetzung eines analytischen Konstrukts, das eine massenspektrometrische sensibilisierende Gruppe enthält, oder zur Freisetzung von Substrat stattfindet. Somit ermöglichen die Konstrukte die Durchführung von QC-Verfahren auf dem Niveau der einzelnen Perle in einer Weise, die nicht möglich gewesen wäre, falls die Konstrukte nur einen einzelnen Linker und keine massenspektrometrische sensibilisierende Gruppe enthalten hätten.

Beispiel 7 Herstellung eines Konstrukts, das einen Alloc-Linker an der ersten Spaltungsstelle enthält

Ein Beispiel für ein Konstrukt, das einen Allyloxycarbonyl-("Alloc")-Linker an der ersten Spaltungsstelle und einen säurelabilen Rink-Linker an der zweiten Spaltungsstelle enthält, wurde gemäß dem in Schema 9 gezeigten Reaktionsschema hergestellt. In diesem Beispiel wird Palladium(0) zur Spaltung der Allyloxycarbonyl-Gruppe von der Amino-Gruppe der Diaminoethan-Gruppe verwendet, um eine freie Amino-Gruppe freizusetzen, die dann als massenspektrometrische sensibilisierende Gruppe fungieren kann.

Schema 9
Experimentelle Beschreibung für Schema 9 Allgemein

In diesem Abschnitt bezeichnen die Verbindungsnummern die Verbindungsnummern in Schema 9.

Alle Waschvorgänge wurden 5-fach mit den angegebenen Lösungsmitteln durchgeführt. Standard-Waschverfahren A: DMF, DCM, DMF, DCM, Et2O, DCM und Et2O, alle jeweils 5-fach.

Kommerziell erhältliche Säure 2 (65 mg, 0,115 mmol) (Neosystems) wurde in DMF (0,5 ml) gelöst und diese mit DIPEA (40 &mgr;l, 0,23 mmol) gefolgt von HATU (44 mg, 0,115 mmol) versetzt. Diese Mischung wurde für 5 min stehengelassen und dann zu kommerziell erhältlichem Argogel-NH2 (Harz 1) (50 mg, 0,023 mmol) mit einem durchschnittlichen Perlendurchmesser für 150 &mgr;m und einer Beladung von 0,46 mmol/g gegeben und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und gemäß Standard-Waschverfahren A gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Das Harz wurde dann mit einer Lösung aus DCM, TFA und TES (1 ml, 95 : 2 : 5) für 2 h behandelt und dann wie oben gewaschen und abgelassen, und dann wurde diese Behandlung mit DCM, TFA und TES für 1 h wiederholt. Das Harz wurde gemäß Standard-Waschverfahren A unter Erhalt von Harz 3 gewaschen und abgelassen.

Harz 3 (50 mg, 0,023 mmol) wurde dann mit einer Lösung aus 4-Nitrophenylchlorformiat (23 mg, 0,115 mmol) in DCM (1 ml) behandelt und für 16 h geschüttelt. Das Harz wurde dann schnell abgelassen und mit DCM und Et2O unter Erhalt von Harz 4 gewaschen. Zu diesem wurde direkt eine Lösung aus den Aminen 7 (50 mg, 0,2 mmol) und 8 (50 mg, 0,2 mmol) und DIPEA (70 &mgr;l, 0,4 mmol) in DCM (1 ml) gegeben und für 16 h geschüttelt. Das Harz wurde dann abgelassen und gemäß Standard-Waschverfahren A gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Dieses Harz wurde dann mit einer Lösung aus 20% TFA in DCM (1 ml) behandelt und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde abgelassen, mit einer Lösung aus 10 B DIPEA in DMF (2 ml) gewaschen und dann abgelassen und gemäß Standard-Waschverfahren A gewaschen und dann im Vakuum unter Erhalt von Harz 5 getrocknet.

Rink-Säure 9 (65 mg, 0,115 mmol) wurde in DMF (0,5 ml) gelöst und mit DIPEA (40 &mgr;l, 0,23 mmol) und HATU (44 mg, 0,115 mmol) versetzt und diese Mischung für 5 min stehengelassen. Diese Lösung wurde dann zu Harz 5 (25 mg, 0,012 mmol) gegeben und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde gemäß Standard-Waschverfahren A gewaschen und abgelassen und im Vakuum getrocknet. Dieses Harz wurde dann mit einer 20%igen Lösung aus Piperidin in DMF (1 ml) für 1 h behandelt. Das Harz wurde gemäß Standard-Waschverfahren A gewaschen und abgelassen und im Vakuum getrocknet. Benzoesäure (14 mg, 0,115 mmol) wurde in DMF (0,5 ml) gelöst und mit DIPEA (40 &mgr;l, 0,23 mmol) und HATU (44 mg, 0,115 mmol) versetzt und diese Mischung für 5 min stehengelassen. Diese Lösung wurde dann zum Harz gegeben und für 2 h geschüttelt. Das Harz wurde gemäß Standard-Waschverfahren A gewaschen und abgelassen und im Vakuum unter Erhalt von Harz 6 getrocknet.

Spaltung von Harz 6: Verfahren 1

Harz 6 (0,5 mg) wurde in DCM gequollen und dann mit (Ph3P)4Pd(0) (2,7 mg, 2,3 × 10–3 mmol) gefolgt von Morpholin (10 ml, 0,11 mmol) versetzt und die Mischung für 1 h geschüttelt. Eine Probe der Flüssigkeit wurde entfernt und durch Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert, um eine Analyse wie in 17 gezeigt zu ergeben. Wie mit den vorhergehenden Beispielen ermöglicht die Gegenwart einer massenspektrometrischen sensibilisierenden Gruppe und einer Peak-spaltenden Gruppe die Bildung und leichte Identifizierung eines starken Molekülions.

Spaltung von Harz 6: Verfahren 2

Harz 6 (0,5 mg) wurde in einer Mischung aus DMSO, THF und 0,5 M HCl (0,5 ml, 2 : 2 : 1) gequollen und dann mit (Ph3P)4Pd(0) (2,7 mg, 2,3 × 10–3 mmol) gefolgt von Morpholin (10 ml, 0,11 mmol) versetzt und die Mischung für 1 h geschüttelt. Eine Probe der Flüssigkeit wurde entfernt und durch Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert, um eine Analyse wie in 18 gezeigt zu ergeben.

Beispiel 8 Herstellung eines Konstrukts, das einen Anthracenyl-UV-Chromophor enthält

Um zu zeigen, daß UV-Spektrometrie verwendet werden kann, um genaue quantitative Informationen über die Produkte der Festphasenreaktionen bereitzustellen, wurde ein Konstrukt, das einen Anthracenyl-UV-Chromophor enthält, gemäß dem in den nachfolgenden Schemata 10, 11 und 12 gezeigten Syntheseweg hergestellt. Das Konstrukt wurde mit einem Sulfonamid-Linker an der ersten Spaltungsstelle und einem Rink-Linker an der zweiten Spaltungsstelle versehen, wobei eine Ethylendiamin-Kette die zwei Linker verbindet und die zwei Stickstoffatome der Diamin-Kette als Anbindungspunkte des UV-Chromophors und entweder einer Peak-spaltenden deuteriummarkierten Benzyl-Gruppe oder einer unmarkierten Benzyl-Gruppe dienen.

Das nachfolgende Schema 10 erläutert die Synthese eines nicht-harzgebundenen intermediären Konstrukts, Schema 11 erläutert die Anbindung des Konstrukts aus Schema 10 an einen Harzträger und anschließende Reaktionen am Harz, und Schema 12 erläutert die Anbindung von unterschiedlichen Substratgruppen an die Konstrukte und anschließende Spaltungsexperimente. Im nachfolgenden experimentellen Abschnitt bezeichnen die verwendeten Verbindungsnummern die in den Schemata 10, 11 und 12 identifizierten Verbindungen.

Schema 10
Experimentelle Beschreibung für Schema 10
Herstellung von Verbindung 12 (X = 1H, 1H)

Trockenes Triethylamin (25 &mgr;l, 0,2 mmol) wurde zu einer Lösung aus dem Amin (X = H, H) (11) (0,05 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) gegeben. Eine Lösung aus 2-Nitro-4-methylbenzoatsulfonylchlorid (10) (25 mg, 0,1 mmol) in trockenem Dichlormethan (0,5 ml) wurde dann hinzugetropft und die Mischung für 15 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 2 : 1 Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um das Sulfonamid (12) (23,3 mg, 95%) als farbloses Öl zu liefern,

Rf 17/50 [Hexan-Ethylacetat (2 : 1)];

(gefunden: C, 53,7; H, 5,4; N, 8,4; S, 6,5; C22H27N3O8S erfordert: C, 53,5; H, 5,5; N, 8,5; S, 6,5%);

&dgr;H (DMSO-d6) 1,38 (9H, s, H-18), 3,10 (2H, t, J8, H-9), 3,24 (2H, t, J8, H-10), 3,95 (3H, s, O-Me), 4,32 (2H, s, H11), 7,13–7,32 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,29 (1H, s, H-3), 8,32 (1H, d, J8, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 28,3 (C-18), 40,2 (C-9 und 10), 46,2 (C-11), 53,2 (O-Me), 79,3 (C-17), 125,1 (C-13), 127,2 (C-14 und 15), 128,6 (C-6), 130,3 (C-13), 133,1 (C-5), 134,4 (C-12), 136,6 (C-1), 147,6 (C-4), 163,7 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray –ve) m/z 494 (MH);

HPLC, Rt 6,8 min.

Herstellung von Verbindung 12 (X = 2H, 2H)

Trockenes Triethylamin (25 &mgr;l, 0,2 mmol) wurde zu einer Lösung aus dem Amin (X = 2H, 2H) (11) (0,05 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) gegeben. Eine Lösung aus 2-Nitro-4-methylbenzoatsulfonylchlorid (10) (25 mg, 0,1 mmol) in trockenem Dichlormethan (0,5 ml) wurde dann hinzugetropft und die Mischung für 15 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 2 : 1 Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um das Sulfonamid (12) (23,5 mg, 94%) als farbloses Öl zu liefern,

Rf 17/50 [Hexan-Ethylacetat (2 : 1)];

(gefunden: C, 53,2; H, 5,6; N, 8,5; S, 6,4; C22H25D2N3O8S erfordert: C, 53,3; H, 5,5; N, 8,5; S, 6,5%);

&dgr;H (DMSO-d6) 1,40 (9H, s, H-18), 3,05 (2H, m, H-9), 3,20 (2H, dt, J3 und 13, H-10), 3,9 (3H, s, O-Me), 7,10–7,35 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,35 (1H, d, J8, H-5), 8,40 (1H, m, H-8), 8,45 (1H, s, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 27,8 (C-18), 40,9 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 53,0 (O-Me), 79,1 (C-17), 124,8 (C-13), 127,0 (C-14 und 15), 128,3 (C-6), 130,0 (C-13), 132,9 (C-5), 134,2 (C-12), 136,4 (C-1), 147,5 (C-4), 154,7 (C-2), 163,5 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray +ve) m/z 496 (MH)+;

HPLC, Rt 6,8 min.

Herstellung von Verbindungen 13 und 1
Verbindung 13

Di-tert-butylazodicarboxylat (32,6 mg, 142 &mgr;mol) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (0,5 ml) unter Stickstoff gelöst und zu einer gerührten Lösung aus Triphenylphosphin (37,1 mg, 142 &mgr;mol), 3-(9-Anthracen)propanol (17,6 mg, 74 &mgr;mol) und Sulfonamid 12 (X = H, H und 2H, 2H) (35 mg, 71 &mgr;mol), gelöst in trockenem Tetrahydrofuran (1 ml) unter Stickstoff, getropft. Nach einer Stunde wurde die Reaktion gemäß DC als vollständig erachtet, und die Lösung wurde fast zur Trockene eingedampft.

Verbindung 1

Der Rest wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 2 : 1 Hexan/Ethylacetat, das 10% Triethylamin enthielt, gereinigt, um das Sulfonamid 13 (45 mg, 90%) als farbloses Öl zu liefern, Rf 15/38 (Hexan-Ethylacetat (2 : 1)); MS (Elektrospray +ve) m/z 612, 614 (MH-Boc)+, MS (Elektrospray –ve) m/z 756, 758 (M-H + Formiat); HPLC Rt 6,9 min. 2 M wäßriges Natriumhydroxid (0,35 ml, 0,7 mmol) wurde zu einer Lösung aus dem Ester 13 (0,25 g, 0,35 mmol) in Methanol-1,4-Dioxan (4 : 1) (2 ml) getropft. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde (weiteres Methanol-Dioxan (ca. 1 ml) wurde nach Bedarf hinzugegeben, um eine einzelne Phase sicherzustellen) wurde ausreichend 2 M HCl hinzugegeben, um die Lösung schwach sauer zu machen. Die Lösung wurde in einen Trenntrichter überführt, der Ethylacetat (50 ml) und Wasser (10 ml) enthielt, und wurde nach Trennung der wäßrigen Schicht erneut mit Ethylacetat (25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO4) und unter reduziertem Druck eingedampft, um die Säure 1 (0,23 g, 94%) als farbloses Öl zu liefern;

Rf 2/40 [Hexan-Ethylacetat (2 : 1)];

&dgr;H (CDCl3): 1,40 (9H, br d, tBu), 1,90 (2H, br m, CH2), 3,3–3,7 (8H, br m, 4 × CH2), 7,10–8,30 (17H, br m, arom. H);

MS (Elektrospray +ve) m/z 697, 699 HPLC, Rt 7,2 min.

Schema 11
Schema 12
Experimentelle Beschreibung für Schemata 11 und 12

Trockenes Aminomethyl-Agrogel® (0,87 g, 0,35 mmol) mit einem durchschnittlichen Perlendurchmesser von 150 &mgr;m und einer Beladung von 0,4 mmol/g in einem mit trockenem Stickstoff gespülten Reaktionsgefäß wurde mit trockenem Dichlormethan (5 ml) gequollen. In einem separaten, mit Stickstoff gespülten Kolben wurden die Benzoesäure (1) (0,67 g, 0,93 mmol), PyBOP (0,728 g, 1,4 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (0,19 g, 1,4 mmol) in trockenem Dimethylformamid (2 ml) gelöst und die resultierende Lösung für 2 min gerührt, bevor sie in die Harzsuspension über eine Kanüle überführt wurde. Ein langsamer Stickstoffstrom wurde durch die Lösung für 5 min geblasen, um Vermischen sicherzustellen, und dann wurde Diisopropylethylamin (0,49 ml, 2,8 mmol) hinzugegeben. Das Rühren wurde für 18 h fortgesetzt, worauf das Harz (2) abgelassen, gewaschen (Dichlormethan (3 × 7 ml), Dimethylformamid (3 × 7 ml) und Dichlormethan (3 × 7 ml)) und vakuumgetrocknet wurde. Eine Analysenprobe von 2 ergab einen negativen Kaiser-Test.

Harz 2 (0,35 mmol) wurde in Dichlormethan (3 ml) gequollen und mit Phenol (66 mg, 0,7 mmol) gefolgt von Trifluoressigsäure (4,5 ml) versetzt. Das Harz wurde vorsichtig für 5 min unter Verwendung eines Stickstoffstroms gerührt und dann abgelassen und mit Dichlormethan (2 × 5 ml) gewaschen. Das Verfahren wurde wiederholt und das Harz nach dem Ablassen gewaschen (Dichlormethan (3 × 8 ml), 10% Diisopropylamin in Dichlormethan (2 × 6 ml) und Dichlormethan (4 × 8 ml)) und im Vakuum getrocknet. Eine Analysenprobe ergab einen positiven Kaiser-Test.

Das Harz in einem mit Stickstoff gespülten Reaktionsgefäß wurde mit trockenem Dichlormethan (5 ml) gequollen. In einem separaten, mit Stickstoff gespülten Kolben wurden C-4-Rink-Säure (0,795 g, 1,4 mmol), PyBOP (1,46 g, 2,8 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (0,378 g, 2,8 mmol) in trockenem Dimethylformamid (3 ml) gelöst und die resultierende Lösung in die Harzsuspension über eine Kanüle überführt. Diese Mischung wurde vorsichtig durch Blasen eines Stickstoffstroms durch die Lösung gerührt, und nach 5 Minuten wurde trockenes Diisopropylethylamin (0,98 ml, 5,6 mmol) hinzugegeben. Das Rühren wurde auf einem mechanischen Rütteltisch für 18 h fortgesetzt, worauf das Harz (3) abgelassen und gewaschen (Dichlormethan (3 × 8 ml), Dimethylformamid (3 × 5 ml) und Dichlormethan (3 × 5 ml)) und im Vakuum getrocknet wurde. Eine Analysenprobe ergab einen negativen Kaiser-Test.

Eine Probe von Harz 3 (50 mg, 14 &mgr;mol) wurde mit 20% V/V Piperidin in 1 : 1 Dichlormethan/Dimethylformamid (2 ml) für 15 Minuten behandelt. Das Harz wurde abgelassen und gewaschen (Dichlormethan (3 × 2 ml), Dimethylformamid (3 × 2 ml) und Dichlormethan (3 × 2 ml)) und dann im Vakuum getrocknet, wobei eine Analysenprobe einen positiven Bromphenolblau-Test ergab. Das Reaktionsgefäß, das das Harz enthielt, wurde mit Stickstoff gespült und mit trockenem 1 : 1 Dichlormethan/Dimethylformamid (0,5 ml) versetzt. In einem separaten, mit Stickstoff gespülten Kolben wurden PyBOP (57 mg, 110 &mgr;mol), 1-Hydroxybenzotriazol (15 mg, 110 &mgr;mol) und die entsprechende Säure (4a–d) (55 &mgr;mol) in trockenem 1 : 1 Dichlormethan-Dimethylformamid (0,5 ml) gelöst und diese Lösung in einer Portion zur Harzsuspension gegeben, durch die ein Stickstoffstrom geblasen wurde, um gleichförmiges Vermischen sicherzustellen. Nach Rühren für 18 h wurde das Harz abgelassen, gewaschen (Dichlormethan (3 × 2 ml), Dimethylformamid (4 × 2 ml) und Dichlormethan (3 × 2 ml)) und im Vakuum getrocknet, um die Harze 5a–d zu ergeben. Eine Analysenprobe von jedem ergab einen negativen Kaiser-Test.

Eine kleine Probe von jedem der vier Harze wurde mit DBU/Mercaptoethanol in Acetonitril zur Freisetzung von 6a–d behandelt, die durch HPLC und schwach-auflösende Massenspektrometrie analysiert wurden:

  • 6a (R = 3-Dimethylaminobenzoyl) HPLC Rt 4,51 min, MS (Elektrospray +ve) m/z 843,7 und 845,7;
  • 6b (R = 2-Naphthylacetoyl) HPLC Rt 5,41 min, MS (Elektrospray +ve) m/z 863,4 und 865,4;
  • 6c (R = 4-Pentenoyl) HPLC Rt 4,98 min, MS (Elektrospray +ve) m/z 778,7 und 780,7;
  • 6d (R = tert-Butylacetoyl) HPLC Rt 5,18 min, MS (Elektrospray +ve) m/z 795,0 und 797,0.

Relative Quantifizierung

Etwa gleiche Mengen (ca. 50 mg) der Harze 5a und 5b wurden vereinigt und mit 4-Mercaptobenzoesäure (43 mg, 20 &mgr;mol) und Morpholin (49 &mgr;mol) in Dichlormethan (2 ml) behandelt. Nach einer Stunde wurde die Lösung abgelassen und das Harz mit Dichlormethan (2 × 1 ml) gewaschen. Diese vereinigten Waschlösungen wurden mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt und zuerst mit 50% gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat (3 ml), Wasser (3 ml) und Kochsalzlösung (2 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die filtrierte Lösung wurde eingedampft, um ca. 5 mg einer Mischung aus 6a und 6b zu liefern. Das Verhältnis der Komponenten dieser Mischung wurde zuerst durch HPLC bewertet, wobei die Peak-Flächen bei 254 und 386 nm gemessen wurden, was mit dem Verhältnis korreliert wurde, das aus der Größe der Integrationen der charakteristischen Resonanzen im 1H-NMR-Spektrum bestimmt wurde.

In der gleichen Weise lieferte eine Mischung der Harze 5c und 5d eine Mischung aus 6c und 6d, deren Verhältnis wiederum durch HPLC bewertet und mit den unter Verwendung von 1H-NMR-Spektroskopie gemessen Verhältnissen korreliert wurde.

Schließlich wurden 6a, 6b, 6c und 6d in einer Lösung vereinigt, die unter Verwendung von HPLC und 1H-NMR wie zuvor analysiert wurde:

Harz 3 (214 mg, 59 &mgr;mol) wurde mit 20% V/V Piperidin in 1 : 1 Dichlormethan/Dimethylformamid (3 ml) für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde abgelassen, gewaschen (Dichlormethan (3 × 3 ml), Dimethylformamid (3 × 3 ml) und Dichlormethan (3 × 3 ml)) und im Vakuum getrocknet, wobei eine Analysenprobe einen positiven Bromphenolblau-Test ergab. Das Reaktionsgefäß wurde dann mit Stickstoff gespült und das Harz mit trockenem 1 : 1 Dichlormethan/Dimethylformamid (2 ml) gequollen.

In einem separaten, mit Stickstoff gespülten Kolben wurden PyBOP (245 mg, 470 &mgr;mol), 1-Hydroxybenzotriazol (64 mg, 470 &mgr;mol) und eine Mischung aus 4-Pentansäure (6,0 &mgr;l, 59 &mgr;mol), 3-Dimethylaminobenzoesäure (19,5 mg, 120 &mgr;mol) und tert-Butylessigsäure (23 &mgr;l, 180 &mgr;mol) in trockenem 1 : 1 Dichlormethan/Dimethylformamid (1 ml) gelöst und die Lösung in einer Portion zur Harzsuspension gegeben. Ein vorsichtiger Stickstoffstrom wurde durch die Mischung geleitet, und nach 5 Minuten wurde Diisopropylethylamin (165 &mgr;l, 940 &mgr;mol) hinzugegeben. Nach Rühren für 18 h wurde das Harz (7) abgelassen, gewaschen (Dichlormethan (3 × 4 ml), Dimethylformamid (4 × 4 ml) und Dichlormethan (3 × 4 ml)) und im Vakuum getrocknet. Eine Analysenprobe von 7 ergab einen negativen Kaiser-Test.

Eine kleine Probe des Harzes 7 wurde mit DBU/Mercaptoethanol in Acetonitril zur Freisetzung einer Mischung aus 6a, 6c und 6d behandelt, wobei die relativen Mengen dieser Komponenten durch HPLC unter Messung der Peak-Flächen bei 254 und 386 nm bewertet wurden (siehe Tabelle).

Eine einzelne Perle aus 7 wurde dann ausgewählt und in der gleichen Weise gespalten. Das Verhältnis der Komponenten wurde erneut unter Verwendung von HPLC gemessen.

Ca. 200 mg Harz 7 (0,056 &mgr;mol) wurden mit Dichlormethan gequollen und das überschüssige Lösungsmittel abgelassen. Phenol (10,5 mg, 0,112 &mgr;mol) wurde hinzugegeben, gefolgt von 80% Trifluoressigsäure in Dichlormethan, so daß dieses hinzugegebene Volumen ein Drittel des Gesamtvolumens darstellte. Nach Rühren für 2 Stunden wurde das blaßrote Lösungsmittel in einen Rundkolben abgelassen und das Harz mit destilliertem Dichlormethan (3 × 3 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Anteile wurden zur Trockene verdampft, um eine Mischung der primären Amide 8a, 8c und 8d zu liefern. Das Verhältnis dieser Komponenten wurde durch Messung der Größe der Integration von charakteristischen Resonanzen im 1H-NMR-Spektrum bewertet.

Die in den obigen Tabellen angegebenen Ergebnisse illustrieren, daß es eine bemerkenswert gute Korrelation zwischen den durch das UV-Verfahren erhaltenen Verhältnissen und den durch das gut etablierte und bewährte Verfahren der NMR-Analyse erhaltenen Verhältnissen gibt. Somit zeigen die Daten, daß die UV-Detektion und -Analyse verwendet kann, um ein sehr genaues Mittel zum Erhalt quantitativer Information über die Reaktionsprodukte der Festphasensynthesen bereitzustellen. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß gezeigt wurde, daß die UV-Analyse ein genaues Mittel zur Bereitstellung quantitativer Daten liefert, selbst auf dem Niveau einer einzelnen Perle, wenn die zur Analyse erhältlichen Mengen von Verbindung in der Größenordnung von nur 1 nmol sind.

Beispiel 9 Herstellung eines Konstrukts, das eine Dansyl-Gruppe als UV-Chromophor enthält

Ein zweites, einen UV-Chromophor enthaltendes Konstrukt wurde hergestellt, aber dieses Mal mit einer Dansyl-Gruppe als Chromophor anstelle der Anthracenyl-Gruppe. Die Sequenz von Schritten, die zum Konstrukt führen, ist nachfolgend in Schema 13 gezeigt. Wie aus Schema 13 ersichtlich ist, ist das Konstrukt analog zum Konstrukt aus Beispiel 8, in dem eine Sulfonamid-Linker-Gruppe eine erste Spaltungsstelle bereitstellt, um die Freisetzung von analytischen Fragmenten zu ermöglichen, und ein Rink-Linker eine zweite Spaltungsstelle bereitstellt, um die Freisetzung von Substrat zu ermöglichen. Jedoch ist in diesem Beispiel der Chromophor anstelle an den Sulfonamid-Stickstoff an eine Lysin-Gruppe gebunden, die sich zwischen der Ethylendiamin-Kette und dem Rink-Linker befindet.

Schema 13
Experimentelle Beschreibung für Schema 13

In den folgenden experimentellen Einzelheiten bezeichnen die Verbindungs- oder Konstruktnummern die in Schema 13 identifizierten Verbindungen und Konstrukte.

Herstellung von Verbindung 3a

Zu einer gerührten Lösung aus 2-Nitro-4-methylbenzoatsulfonylchlorid 1 (1,10 g, 3,90 mmol) und Triethylamin (0,39 g, 3,90 mmol) in trockenem Dichlormethan (40 ml) wurde bei 0°C das Amin 2a (1,00 g, 3,9 mmol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) während 30 min gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum unter Erhalt eines gelben Öls aufkonzentriert. Reinigung durch Chromatographie mit [MTBE : Hexan (1 : 1)] als Elutionsmittel gefolgt von Umkristallisation aus MTBE (5 ml) und Hexan (2 ml) lieferte das Sulfonamid 3a (1,53 g, 79%) als weiße Flocken; Smp. 129–130°C;

Rf 0,31 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

(gefunden: C, 53,2; H, 5,6; N, 8,5; S, 6,4; C22H25D2N3O8S erfordert: C, 53,3; H, 5,5; N, 8,5; S, 6,5%);

&dgr;H (DMSO-d6) 1,40 (9H, s, H-18), 3,05 (2H, m, H-9), 3,20 (2H, dt, J3 und 13, H-10), 3,9 (3H, s, O-Me), 7,10–7,35 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,35 (1H, d, J8, H-5), 8,40 (1H, m, H-8), 8,45 (1H, s, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 27,8 (C-18), 40,9 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 53,0 (O-Me), 79,1 (C-17), 124,8 (C-13), 127,0 (C-14 und 15), 128,3 (C-6), 130,0 (C-13), 132,9 (C-5), 134,2 (C-12), 136,4 (C-1), 147,5 (C-4), 154,7 (C-2), 163,5 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray +ve) m/z 496 (MH)+;

HPLC (Verfahren A), Rt 6,07 min.

Herstellung von Verbindung 4a

Der Ester 3a (0,40 g, 0,80 mmol) in Methanol (2 ml) wurde mit 1 M wäßrigem Natriumhydroxid (1,60 ml, 1,60 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde dann im Vakuum aufkonzentriert und der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst und dann mit 1M Salzsäure (1,80 ml, 1,80 mmol) bei 0°C angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde mit Dichlormethan (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck zur Säure 4a (0,34 g, 88%) als weißer Feststoff eingedampft; Smp. 143–145°C.

Rf 0,58 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

&dgr;H (DMSO-d6) 1,29 (9H, s, H-18), 3,02 (2H, m, H-9), 3,20 (2H, dt, J3 und 13, H-10), 7,10–7,40 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,06 (1H, d, J8, H-6), 8,28 (1H, s, H-3), 8,30 (1H, d, J8, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 27,9 (C-18), 40,9 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 79,1 (C-17), 124,5 (C-13), 127,1 (C-14 und 15), 128,4 (C-6), 129,5 (C-13), 132,5 (C-5), 139,2 (C-12), 147,3 (C-1), 155,1 (C-4), 164,8 (C-16 und C=O);

(gefundene MH+, 482,156364 C21H23D2N3O8S erforderte MH+, 482,156615);

HPLC (Verfahren A), Rt 5,65 min.

Herstellung von Verbindung 3b

Zu einer gerührten Lösung aus 2-Nitro-4-methylbenzoatsulfonylchlorid 1 (1,10 g, 3,90 mmol) und Triethylamin (0,39 g, 3,90 mmol) in trockenem Dichlormethan (40 ml) wurde bei 0°C das Amin 2b (0,95 g, 3,9 mmol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) während 30 min gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 3 h bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum unter Erhalt eines gelben Öls aufkonzentriert. Reinigung durch Chromatographie mit [MTBE : Hexan (1 : 1)] als Elutionsmittel gefolgt von Umkristallisation aus MTBE (5 ml) und Hexan (2 ml) lieferte das Sulfonamid 3b (1,51 g, 79%) als weiße Flocken; Smp. 131–132°C;

Rf 0,28 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

(gefunden: C, 53,7; H, 5,4; N, 8,4; S, 6,5; C22H27N3O8S erfordert: C, 53,5; H, 5,5; N, 8,5; S, 6,5%);

&dgr;H (DMSO-d6) 1,38 (9H, s, H-18), 3,10 (2H, t, J8, H-9), 3,24 (2H, t, J8, H-10), 3,95 (3H, s, O-Me), 4,32 (2H, s, H11), 7,13–7,32 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,29 (1H, s, H-3), 8,32 (1H, d, J8, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 28,3 (C-18), 40,2 (C-9 und 10), 46,2 (C-11), 53,2 (O-Me), 79,3 (C-17), 125,1 (C-13), 127,2 (C-14 und 15), 128,6 (C-6), 130,3 (C-13), 133,1 (C-5), 134,4 (C-12), 136,6 (C-1), 147,6 (C-4), 163,7 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray –ve) m/z 492 (M – H);

HPLC (Verfahren A), Rt 5,99 min.

Herstellung von Verbindung 4b

Der Ester 3b (0,40 g, 0,80 mmol) in Methanol (2 ml) wurde mit 1M wäßrigem Natriumhydroxid (1,60 ml, 1,60 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde dann im Vakuum aufkonzentriert und der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst und dann mit 1M Salzsäure (1,80 ml, 1,80 mmol) bei 0°C angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde mit Dichlormethan (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck zur Säure 4b (0,36 g, 93%) als weißer Feststoff eingedampft; Smp. 123,7–124,8°C.

Rf 0,59 [MTBE : Hexan (1 : 1)];

&dgr;H (DMSO-d6) 1,42 (9H, s, H-18), 3,12 (2H, m, H-9), 3,22 (2H, m, H-10), 4,38 (2H, s, H11), 7,18–7,42 (5H, m, H-13, 14 und 15), 8,11 (1H, d, J8, H-6), 8,39 (1H, d, J8, H-3), 8,45 (1H, s, H-3);

&dgr;C (DMSO-d6) 27,8 (C-18), 40,1 (C-9 und 10), 45,9 (C-11), 79,1 (C-17), 124,8 (C-13), 126,9 (C14 und 15), 128,4 (C-6), 129,9 (C-13), 132,9 (C-5), 135,8 (C-12), 137,9 (C-1), 147,5 (C-4), 153,9 (C-2), 163,7 (C-16 und C=O);

MS (Elektrospray –ve) m/z 478 (M – H);

HPLC (Verfahren A), Rt 5,65 min.

Herstellung von Verbindung 5

Zu einer Suspension aus Aminharz (Argogel-NH2) (0,80 g, 0,32 mmol) mit einem durchschnittlichen Perlendurchmesser von 150 &mgr;m und einer Beladung von 0,4 mmol/g in DMF (4 ml) und Dichlormethan (4 ml) wurden die Benzoesäure (4a) (0,46 g, 0,96 mmol) und die Benzoesäure (4b) (0,46 g, 0,96 mmol) gegeben, gefolgt von PyBOP (0,99 g, 1,92 mmol) und HOBT (0,26 g, 1,92 mmol), gefolgt 4 min später von Hünigscher Base (0,49 g, 3,84 mmol). Die Reaktion wurde mit Stickstoff für 18 h gerührt und das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 10 ml), DMF (6 × 10 ml), Dichlormethan (6 × 10 ml) und Ether (2 × 10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das Sulfonamidharz 5 (0,94 g, 97%) als gelben Feststoff zu ergeben; der Kaiser-Test war negativ; der Bromphenolblau-Test war negativ.

Herstellung von Verbindung 6

Das geschützte Harz 5 (0,85 g, 0,34 mmol) wurde in Dichlormethan (2 ml) suspendiert und mit Trifluoressigsäure (2 × 4 ml) für 5 min behandelt. Die Lösungsmittel wurden durch Filtration entfernt und das Harz mit 10%iger DIPEA-Lösung in DMF (3 × 5 ml), Dichlormethan (6 × 5 ml), DMF (6 × 5 ml), Dichlormethan (6 × 5 ml) und Ether (2 × 5 ml) gewaschen. Das Aminharz wurde dann in DMF (4 ml) und Dichlormethan (2 ml) suspendiert, FMoc-Lys(Dde)-OH (0,86 g, 1,62 mmol) wurde hinzugegeben, gefolgt von PyBOP (0,84 g, 1,62 mmol) und HOBT (0,22 g, 0,62 mmol). Nach 4 min wurde Hünigsche Base (0,42 g, 3,24 mmol) hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Stickstoff für 18 h gerührt und das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 10 ml), DMF (6 × 10 ml), Dichlormethan (6 × 10 ml) und Ether (2 × 10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das Sulfonamidharz 6 (0,96 g, 100%) als gelben Feststoff zu ergeben; der Kaiser-Test war negativ; der Bromphenolblau-Test war negativ; die Harzbeladung betrug 98%, abgeschätzt durch quantitative Spaltung der Fmoc-Gruppe.

Herstellung von Verbindung 7

Harz (6) (0,93 g, 0,28 mmol) wurde mit 20% Piperidin in DMF-Lösung (2 × 5 ml) für 10 min behandelt. Die Lösungsmittel wurden durch Filtration entfernt und das Harz mit DMF (6 × 5 ml), Dichlormethan (6 × 5 ml) und Ether (2 × 4 ml) gewaschen. Das Harz wurde in DMF (5 ml) und Dichlormethan (5 ml) suspendiert, und der Rink-Säure-Linker (0,92 g, 1,62 mmol) wurde hinzugegeben, gefolgt von PyBOP (0,84 g, 1,62 mmol) und HOBT (0,22 g, 1,62 mmol). Nach 4 min wurde Hünigsche Base (0,42 g, 3,24 mmol) hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Stickstoff für 3 h gerührt das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 5 ml), DMF (6 × 5 ml), Dichlormethan (6 × 5 ml) und Ether (2 × 3 ml) gewaschen und im Vakuum unter Erhalt des Sulfonamidharzes 7 (1,02 g, 98%) als gelber Feststoff getrocknet; der Kaiser-Test war negativ; der Brophenolblau-Test war negativ; die Harzbeladung betrug 94% nach Abschätzung durch quantitative Fmoc-Gruppenabspaltung.

Herstellung von Verbindungen 9a–d und 10a–d

Harz (7) (70 mg, 0,02 mmol) wurde mit 20% Piperidin in DMF-Lösung (2 × 1 ml) für 10 min behandelt. Die Lösungsmittel wurden durch Filtration entfernt und das Harz mit DMF (6 × 1 ml), Dichlormethan (6 × 1 ml) und Ether (2 × 1 ml) gewaschen. Das Harz wurde in DMF (0,5 ml) und Dichlormethan (0,5 ml) suspendiert, und die entsprechende Säure (8a–d) (0,15 mmol) wurde hinzugegeben, gefolgt von PyBOP (0,08 g, 0,15 mmol) und HOBT (0,02 g, 0,15 mmol). Nach 4 min wurde Hünigsche Base (0,04 g, 0,30 mmol) hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Stickstoff für 3 h gerührt das Harz dann mit Dichlormethan (6 × 1 ml), DMF (6 × 1 ml), Dichlormethan (6 × 1 ml) und Ether (2 × 1 ml) gewaschen und im Vakuum unter Erhalt der Sulfonamidharze 9a–d als gelber Feststoff getrocknet; der Kaiser-Test und Brophenolblau-Test waren negativ in allen vier Fällen.

Eine kleine Probe von jedem der vier Harze wurde mit DBU/Mercaptoethanol in Acetonitril zur Freisetzung von 10a–d behandelt, die durch niedrigauflösende Massenspektrometrie und RP-HPLC (Verfahren A) analysiert wurden:

  • 10a (R' = Z-Gly-) MS (Elektrospray +ve) m/z 961 und 963 (MH)+; HPLC, Rt 4,01 min.
  • 10b (R' = Boc-Abu-) MS (Elektrospray +ve) m/z 955 und 957 (MH)+; HPLC, Rt 4,09 min.
  • 10c (R' = 1-Naphthylacetoyl-) MS (Elektrospray +ve) m/z 938 und 939 (MH)+; HPLC, Rt 4,28 min.
  • 10d (R' = Boc-Phe-) MS (Elektrospray +ve) m/z 1017 und 1019 (MH)+; HPLC, Rt 4,42 min.

Herstellung von Verbindungen 11a–d und 12a–d

Harz (9a–d) (ca. 70 mg, 0,02 mmol) wurde mit 10% Hydrazin in DMF-Lösung (3 × 1 ml) für 30 min behandelt. Die Lösungsmittel wurden durch Filtration entfernt und jedes Harz mit DMF (6 × 1 ml), Dichlormethan (6 × 10 ml) und Ether (2 × 1 ml) gewaschen. Zu jeder Harzportion wurden dann Dansylchlorid (40 mg, 0,15 mmol) und Triethylamin (15 mg, 0,15 mmol) in Dichlormethan (1 ml) gegeben. Nach 4 h Reaktionsdauer wurden die Harze mit Dichlormethan (6 × 1 ml), DMF (6 × 1 ml), Dichlormethan (6 × 1 ml) und Ether (2 × 1 ml) gewaschen und im Vakuum unter Erhalt der Sulfonamidharze 11a–d als gelber Feststoff getrocknet; der Kaiser-Test und Bromphenolblau-Test waren positiv in allen vier Fällen.

Eine kleine Probe jedes der vier Harze wurde mit DBU/Mercaptoethanol in Acetonitril zur Freisetzung von 12a–d behandelt, die durch niedrigauflösende Massenspektrometrie und RP-HPLC (Verfahren B) analysiert wurden:

  • 12a (R' = Z-Gly-) MS (Elektrospray +ve) m/z 1030 und 1032 (MH)+; HPLC, Rt 4,77 min.
  • 12b (R' = Boc-Abu-) MS (Elektrospray +ve) m/z 1024 und 1026 (MH)+; HPLC, Rt 4,94 min.
  • 12c (R' = 1-Naphthylacetoyl-) MS (Elektrospray +ve) m/z 1007 und 1009 (MH)+; HPLC, Rt 5,47 min.
  • 12d (R' = Boc-Phe-) MS (Elektrospray +ve) m/z 1086 und 1089 (MH)+; HPLC, Rt 5,82 min.

Es ist aus den vorhergehenden Beispielen ersichtlich, daß der Einschluß eines UV-Chromophors und einer massenspektrometrischen sensibilisierenden Gruppe in die Konstrukte die schnelle und einfache, qualitative und quantitative Analyse der Produkte aus einer Festphasensynthese durch die einfachen und gut etablierten Verfahren von HPLC in Kombination mit UV-Detektion und Massenspektrometrie ermöglicht.


Anspruch[de]
  1. Chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese, umfassend einen festen Träger Q mit einem daran über eine Verbindungsgruppe Y gebundenen Substrat R; wobei die Verbindungsgruppe Y erste und zweite Spaltungsstellen aufweist, die orthogonal und selektiv abspaltbar sind; wobei die zweite Spaltungsstelle selektiv unter Freisetzung des Substrats abspaltbar ist; und wobei sich die erste Spaltungsstelle an einer Position zwischen der zweiten Spaltungsstelle und dem festen Träger befindet und selektiv unter Freisetzung eines Fragments Fr abspaltbar ist, das das Substrat und wenigstens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst; dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung des Gerüsts des Konstrukts an der ersten Spaltungsstelle eine Einheit am chemischen Fragment Fr an der ersten Spaltungsstelle bildet oder einführt, die eine sensibilisierende Gruppe G umfasst, die das chemische Fragment Fr für die instrumentelle, z. B, massenspektroskopische, Analyse sensibilisiert.
  2. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 1, worin das chemische Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.
  3. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 2, worin die charakteristische Signatur bereitgestellt wird, indem eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung in das Fragment Fr eingeführt wird.
  4. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 3, worin die Peak-spaltende Isotopenmarkierung durch ein oder mehrere Isotopenpaare definiert ist, die aus 1H/2H (D), 79Br/81Br, 12C/13C, 14N/15N und 16O/18O ausgewählt sind.
  5. Chemisches Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, worin sich das Mittel, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen, zwischen der ersten und zweiten Spaltungsstelle befindet.
  6. Chemisches Konstrukt gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die ersten und zweiten Spaltungsstellen durch erste und zweite Linker-Gruppen L1 und L2 definiert sind.
  7. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 6, worin eine Spacer-Gruppe A zwischen den zwei Linker-Gruppen L1 und L2 zwischengeschaltet ist, wobei die Spacer-Gruppe A Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments Fr eine charakteristische Signatur zu verleihen, wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert.
  8. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 7, worin die Verbindungsgruppe Y die Formel L1-A-L2 hat.
  9. Chemisches intermediäres Konstrukt gemäss Anspruch 8, worin die Gruppe A die allgemeine Formel NH-Alk-NH-X1 hat, worin X1 Wasserstoff oder eine Aralkylgruppe ist und Alk eine Alkylengruppe ist.
  10. Chemisches Konstrukt gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die sensibilisierende Gruppe G eine ionisierbare Gruppe ist, die unter massenspektrometrischen Bedingungen ionisierbar ist.
  11. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 10, worin die Gruppe G zur Bildung eines positiven Ions unter massenspektrometrischen Bedingungen ionisierbar ist, z. B. unter Elektrospray-massenspektrometrischen Bedingungen.
  12. Chemisches Konstrukt gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Gruppe G eine basische Aminogruppe ist.
  13. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 12, worin die basische Aminogruppe eine primäre Aminogruppe ist.
  14. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 12, worin die basische Aminogruppe eine tertiäre Aminogruppe ist.
  15. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 14, worin die tertiäre Aminogruppe eine cyclische Aminogruppe ist.
  16. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 15, worin die cyclische Aminogruppe N-Methylpiperazino ist.
  17. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 12 oder 13, worin die basische Aminogruppe aus der photochemischen Spaltung einer Carbamatgruppe stammt.
  18. Chemisches Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 3 bis 17, worin die Peak-spaltende Isotopenmarkierung innerhalb einer substituierten oder unsubstituierten Alkylendiamingruppe enthalten ist.
  19. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 18, worin die Alkylendiamingruppe mit einer N-Benzylgruppe substituiert ist.
  20. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 19, worin die N-Benzylgruppe eine Methylengruppe hat, die mit dem Peak-spaltenden Atom-Deuterium substituiert ist.
  21. Chemisches Konstrukt gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die erste Spaltungsstelle selektiv spaltbar durch einen Typ von Chemie ist, der aus einer Chemiegruppe ausgewählt ist, die aus Spaltung unter sauren Bedingungen, basenkatalysierter Spaltung, oxidativer Spaltung, reduktiver Spaltung, nukleophiler Verdrängung, Spaltung durch 1,2-Bisnukleophile, elektrophiler Verdrängung und thermischer, photochemischer und enzymatischer Spaltung besteht, und worin die zweite Spaltungsstelle durch einen unterschiedlichen Typ von Chemie selektiv spaltbar ist, ausgewählt aus dieser Gruppe.
  22. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21, worin die erste Spaltungsstelle durch einen Typ von Chemie spaltbar ist, ausgewählt aus:

    (i) photochemischer Spaltung, z. B. photochemischer Spaltung einer Nitrobenzylcarbamatgruppe;

    (ii) Oxidation, gefolgt von Spaltung durch nukleophile Verdrängung, z. B. Oxidation eines Thiopyrimidins, gefolgt von nukleophiler Verdrängung mit einem Amin (z. B. mit einem sekundären Amin wie N-Methylpiperazin);

    (iii) Spaltung eines Sulfonamids durch nukleophile Verdrängung, z. B. durch ein Thiolat-nukleophil (z. B. Mercaptoethanol in Gegenwart einer starken Base wie DBU);

    (vi) Spaltung von Enamingruppen (insbesondere denjenigen, die eine Enamineinheit enthalten, die mit einer Carbonylgruppe konjugiert ist; wie z. B. 1-[4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden]ethylamino) mit einem 1,2-Bis-nukleophil wie Hydrazin oder Hydroxylamin oder Derivaten davon; und

    (vii) Übergangsmetall-katalysierte Spaltung von Allyloxycarbonylaminogruppen, z. B. Palladium(0)-katalysierte Spaltung von Allyloxycarbonylaminogruppen.
  23. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 22, worin die zweite Spaltungsstelle unter sauren Bedingungen oder durch Photolyse gespaltet wird.
  24. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste Spaltungsstelle durch eine Sulfonamid-Linker-Gruppe definiert ist und die zweite Spaltungsstelle gegebenenfalls durch eine Gruppe wie einen Rink-Linker definiert ist, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.
  25. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste Spaltungsstelle durch einen Thiopyrimidin-Linker definiert ist, der für Spaltung durch Oxidation, gefolgt von nukleophiler Verdrängung empfindlich ist, und worin die zweite Spaltungsstelle gegebenenfalls durch eine Gruppe wie einen Rink-Linker definiert ist, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.
  26. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste Spaltungsstelle durch eine dde-Gruppe definiert ist und die zweite Spaltungsstelle gegebenenfalls durch eine Gruppe wie einen Rink-Linker definiert ist, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.
  27. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste Spaltungsstelle unter photochemischen Bedingungen spaltbar ist und die zweite Spaltungsstelle durch eine Gruppe wie einen Rink-Linker definiert ist, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.
  28. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste Spaltungsstelle durch eine Gruppe, wie Allyloxycarbonylamino, definiert ist, die durch ein Übergangsmetall wie Palladium(0) gespalten werden kann, und worin die zweite Spaltungsstelle gegebenenfalls durch eine Gruppe wie einen Rink-Linker definiert ist, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.
  29. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste Spaltungsstelle durch Oxidation, gefolgt von nukleophiler Verdrängung gespalten wird.
  30. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 29, worin das Nukleophil ein Amin ist.
  31. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 30, worin das Amin ein cyclisches Amin wie Piperidin ist.
  32. Chemisches Konstrukt gemäss. einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Fragment Fr einen Chromophor Cu enthält, der die Analyse des Fragments Fr durch Ultraviolett-, sichtbare oder Fluoreszenz-Spektrophotometrie erleichtert.
  33. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 32, worin der Chromophor Cu einen log Emax-Hauptwert von wenigstens 2,5 hat.
  34. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 33, worin der log Emax-Hauptwert wenigstens 1,5 mal grösser als der log Emax-Hauptwert des Substrats R ist.
  35. Chemisches Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei das Konstrukt einen festen Träger Q mit dem daran über die Verbindungsgruppe Y gebundenen Substrat R umfasst, worin das Fragment Fr das Substrat und wenigstens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst, und worin der Teil einen Chromophor Cu enthält, der die Analyse des Fragments Fr durch Ultraviolett-, sichtbare oder Fluoreszenz-Spektroskopie erleichtert, wobei der Chromophor Cu einen log Emax-Hauptwert von wenigstens 2,5 hat und worin (i) der log Emax-Hauptwert wenigstens 1,5 mal grösser als der log Emax-Hauptwert des Substrats R ist; oder (ii) der Chromophor Cu einen Absorptionspeak bei einer von Absorptionen aufgrund des Substrats R entfernten Wellenlänge hat.
  36. Chemisches Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 1 bis 35, das einen festen Träger Q mit dem daran über die Verbindungsgruppe Y gebundenen Substrat R umfasst, worin das Fragment Fr das Substrat und wenigstens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst, und wobei der Teil einen Chromophor Cu enthält, der die Analyse des Fragments Fr durch Ultraviolett-, sichtbare oder Fluoreszenz-Spektroskopie erleichtert, worin die Absorptionscharakteristiken des Chromophors Cu und des Substrats R derart sind, dass bei einer gegebenen Messwellenlänge etwaige Fehler in der Messung der Menge des Substrats R (oder jedes Fragments oder Konstrukts, das das Fragment enthält), die aus einer Überlappung zwischen Absorptionsbanden aufgrund des Chromophors und Absorptionsbanden aufgrund des Substrats R entstehen, geringer als 10% sind, bevorzugt geringer als 5%.
  37. Chemisches Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 32 bis 36, worin der Chromophor eine Gruppe ist, die eine Arylgruppe enthält.
  38. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 37, worin die Arylgruppe eine anellierte polycyclische Arylgruppe ist, in der ein oder mehrere Ringkohlenstoffatome gegebenenfalls durch Heteroatome ersetzt sind.
  39. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 38, worin die anellierte polycyclische Arylgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Naphthyl-, Phenanthrenyl- und Anthracenylgruppen besteht.
  40. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 39, worin die anellierte polycyclische Arylgruppe eine Anthracenylgruppe ist.
  41. Chemisches Konstrukt gemäss Anspruch 39, worin die anellierte polycyclische Arylgruppe eine Dansylgruppe (1-Dimethylamino-5-naphthylsulfonyl) ist.
  42. Verfahren zur Analyse der Konstrukte gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren das Spalten des Konstrukts an der ersten Spaltungsstelle zur Freisetzung des chemischen Fragments Fr, wobei die Spaltungsreaktion am chemischen Fragment Fr an der Spaltungsstelle eine Gruppe erzeugt, die eine massenspektrometrisch sensibilisierende Gruppe G umfasst (z. B. eine Gruppe, die unter massenspektroskopischen Bedingungen ionisierbar ist), und anschliessend das Unterwerfen des chemischen Fragments der Massenspektrometrie, z. B. Elektrospray-Massenspektrometrie, umfasst.
  43. Intermediäres chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Herstellung eines chemischen Konstrukts wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, worin das intermediäre Konstrukt die Formel Q-Y' hat, worin Y' eine reaktive oder geschützte Form der Gruppe Y ist und Q und Y wie hier zuvor definiert sind.
  44. Intermediäres Konstrukt der Formel Q-L1-Ap, worin Q und L1 wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert sind und Ap eine reaktive oder geschützte Form der Spacer-Gruppe A ist, die eine Peak-spaltende Isotopenmarkierung enthält.
  45. Intermediäres Konstrukt gemäss Anspruch 44 mit der allgemeinen Formel Q-L1-NH-Alk-NH-X1, worin X1 Wasserstoff oder eine Aralkylgruppe ist und Alk eine Alkylengruppe ist.
  46. Verfahren zum Analysieren des Fragments Fr, das aus einem chemischen Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 32 bis 41 stammt, welches das Unterwerfen des Fragments Fr der Ultraviolett-, sichtbaren und Fluoreszenz-spektrophotometrischen Analyse zur Quantifizierung des Substrats R umfasst.
  47. Verfahren zur Identifizierung eines pharmazeutisch nützlichen Substrats, welches das Herstellen einer Bibliothek, die eine Mehrzahl von chemischen Konstrukten wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert enthält, und das Unterwerfen der Bibliothek einer biologischen Untersuchung zur Identifizierung biologisch aktiver Substrate umfasst.
  48. Verfahren gemäss Anspruch 47, welches den weiteren Schritt der Formulierung eines so identifizierten, biologisch aktiven Substrats mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einschliesst.
  49. Verfahren gemäss Anspruch 48, das den weiteren Schritt der Formulierung eines so identifizierten, biologisch aktiven Substrats mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einschliesst.
Es folgen 18 Blatt Zeichnungen






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