Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verwendungsmöglichkeiten von oligo- und polymeren galloylierten Proanthocyanidinen.

Die Haut ist flächenmäßig das größte Organ des Menschen. Wichtigste Aufgabe der humanen Haut ist neben der Aufrechterhaltung einer konstanten Körpertemperatur und dem Schutz vor Austrocknung, vor allem die Barrierefunktion gegenüber der Außenwelt (d.h. gegenüber physikalischen, chemischen und mikrobiellen Reiznoxen), ohne die ein reibungsloser Ablauf der Vitalfunktionen gar nicht möglich wäre. Diese Barrierefunktion wird von der Epidermis bewirkt. Durch Verhornung und der Ausbildung von Lipidlagen reift die Epidermis zur Hornschicht heran, die als äußerste Schicht an der Grenzfläche die eigentliche Schutzschicht gegenüber der Außenwelt darstellt. Auch die Schleimhaut als eine epitheliale Sonderform erfüllt ähnliche Aufgaben, wobei aber durch die im Vergleich zur Haut gering ausgeprägte und kaum stratifizierte Epidermis bei der Schleimhaut zusätzlich zu der Schutz- und Austrocknungsfunktion der selektive Stoffaustausch zwischen serosaler und luminaler Seite im Vordergrund steht.

Die zelluläre Organisation im Rahmen der Hautreifung stellt ein äußerst komplexes Geschehen dar, wobei auf der einen Seite zelluläre Bestandteile (überwiegend Keratinozyten) in eine extrazelluläre Matrix aus Lipiden eingebettet sind. Die Lipid-Vorläufermoleküle (precursors) werden ebenfalls von den Keratinozyten gebildet. Zusätzlich verändern sich aber die Keratinozyten während ihres Lebenszykluses sehr stark. Diese Hautzellen werden initial in einem undifferenzierten Zustand aus der Basalzellschicht heraus gebildet und stellen hierbei eine proliferierende Zellmasse dar. Da durch das Stratum basale kontinuierlich Keratinozyten gebildet werden, rücken die Zellen im Laufe der Zeit von unten her Richtung Grenzfläche. Hierbei kommt es zu charkteristischen Änderungen im zellulären Erscheinungsbild: Die Zellen flachen sich deutlich ab, elongieren und vergrössern sich, während gleichzeitig die Mitochondrienzahl zunimmt. In weiteren Entwicklunszyklen reduziert sich die Golgi-Entwicklung und die Kerngrösse, aber gleichzeitig nimmt das Tonofilament-Netzwerk zu und wird dichter. Desweiteren unterliegen auch die biochemischen Prozesse in den Keratinozyten im Laufe ihrer Entwicklung einem entscheidenden Wandel. Insbesondere die Produktion niedermolekularer Keratine nimmt im Laufe der Entwicklung ab, während hochmolekulare, differenzierungsspezifische Keratine (K1 und K10) deutlich zunehmen. Diese Differenzierung hin zu stark keratinisierten Zellen geht auch mit einer vermehrten Bildung von Lipid-Vorläufermolekülen (u.a. Phospho- und Sphingolipide) für die Lipiddoppelschichten der Hornschicht einher. Diese Lipide werden später ausgeschleusst und enzymatisch in neutrale Lipide umgebaut. Die sich so ständig differenzierenden Zellen sind ab einer bestimmten Keratinisierungsdichte nicht mehr lebensfähig und sterben apoptotisch ab, wobei aber die verhornten, toten Zellen (Korneozyten) neben der Lipidmatrix, in die sie eingebettet sind, entscheidend für die eigentliche (physikalische) Barrierefunktion der Haut sind.

Somit ergeben sich zwei unterschiedliche Regulationsprozesse: Zum einen die Proliferation der Keratinozyten zur ständigen Erneuerung der zellulären Hautbestandteile und nachfolgend die Differenzierung der Keratinozyten hin zu den verhornten, abgestorbenen Zellen und damit einhergehend zum Aufbau der epidermalen Barriere. Eine Schädigung (endogener oder exogener Genese) der Epidermis und der Hornschicht führt nicht nur zu drastischen Einschränkungen der Barriereeigenschaften, sondern auch zu einem stumpfen, rauhen und müden Erscheinungsbild der Haut.

Der Zweck der pflegenden Kosmetik besteht in erster Linie darin, die natürliche Funktion der Haut als Barriere gegen äußeren Einflüssen zu stärken und den Verlust von körpereigenen Stoffen (z.B. Wasser, Fette, Elektrolyte) zu mindern bzw. das normale Maß dieses Verlustes wiederherzustellen. Dies bewirkt auf der einen Seite eine erhöhte Resistenz oder Abwehrfähigkeit gegen äußere Einflüsse (z.B. gegen Chemikalien, mechanischen Stress, erhöhte UV-Belastung oder mikrobiellen Befall) zum anderen werden aber auch von außen auf die Haut treffende Stoffe in geringerem Ausmaß absorbiert. Nicht zu vernachlässigen ist auch der Aspekt, dass eine Haut, die täglich durch Waschen einen gewissen Verlust an Lipiden und Feuchtigkeit erfährt, Ausdünnungen innerhalb der extrazellulären Matrix erfäht. Eine veränderte Regeneration der Keratinyozyten kann die Folge sein. Hautpflegeprodukte sollen demgemäß dabei helfen, entweder den durch häufiges Waschen bedingten Feuchtigkeits- und Fettverlust auszugleichen und/oder die Hautalterung zu vermindern, was z.B. durch eine Steigerung der Keratinozytenproliferation und somit der Regeneration der Haut erreicht werden kann. Hautpflegeprodukte und deren Wirkstoffe dienen des weiteren dazu, die Pflege der Haut und deren Versorgung mit Feuchtigkeit und Nährstoffen sicherzustellen, vor allem aber die Förderung einer schnelleren und besseren Regeneration der epidermalen Barriere nach eingetretener Schädigung einzuleiten und zu erhalten.

Proanthocyanidine stellen polyphenolische Biopolymere dar, die relativ häufig in Pflanzen vorkommen, d.h. diese sind Naturstoffe. Handelt es sich bei den Grundbausteinen um Catechin oder Epicatechin, so werden die entsprechenden Oligo- und Polymere auch als Procyanidine bezeichnet.

Die Verwendung von Proanthocyanidinen aus Pflanzenextrakten unterschiedlicher Zusammensetzung, häufig jedoch in einer Mischung mit anderen Gerbstoffen, wurde bereits im Stand der Technik beschrieben. Die beschriebenen Verwendungen beziehen sich häufig auf medizinisch/pharmakologische Anwendungsgebiete, wie z.B. Virustherapie, Wundheilung oder anti-mutagene Wirkungen. Dabei können diese Extrakte neben Proanthocyanidinen eine große Anzahl weiterer und teilweise noch nicht ausreichend charakterisierter Gerb- und Wirkstoffe enthalten.

So beschreiben Dauer et al. (Dauer et al., Planta Medica 64 (1998), S. 324-327) die Verwendung von Extrakten aus Hamamelis virginiana als anti-mutagenes Agens (Messung mittels Ames-Test). Die maximal anti-mutagene Wirkung des Extraktes wird hier bei einer Fraktion beobachtet, die Catechin- und Gallocatechin-Oligomere enthält, die einen durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 9,2 aufwiesen.

Die EP 0 812 592 A1 beschreibt die Verwendung von Pflanzenextrakten, die u.a. Proanthocyanidin-Oligomere enthalten, zur Behandlung von Katarakten, d.h. oxidativen Schädigungen des Auges. Die verwendeten Wirkstoffe werden dabei als wässrige Extrakte aus Trauben, Traubenschalen oder -kernen gewonnen und anschließend mittels Flüssigchromatographie aufgetrennt.

Des weiteren beschreibt die WO 96/30033 an Proanthocyanidinen angereicherte Pflanzenextrakte, die zur Inhibition von mikrobieller Adhäsion an Zelloberflächen und damit als anti-mikrobielles Agens verwendet werden.

In ähnlicher Weise offenbart die WO 92/06695 die Verwendung von Proanthocyanidin-Zusammensetzungen als anti-virales agens zur Behandlung von durch Influenza- und Herpesviren verursachten Infektionen.

Schließlich beschreibt die WO 87/00051 die Verwendung von Extrakten aus Hamamelis zur Behandlung von Gingivitis (einer Zahnfleischerkrankung).

Die JP 100 59 846 A beschreibt ein Arzneimittel gegen Katarakt, welches Proanthocyanidine enthält. Des weiteren beschreibt die JP 200 106 4172 A ein Mittel zur Behandlung von Defekten, welche durch Mutationen des APC-Genes hervorgerufen werden, welche Polyphenole, insbesondere Proanthocyanidine enthält. Ein weiteres Anwendungsgebiet eines verschiedene Formen von Proanthocyanidinen enthaltendes Medikament wird von der JP 200 004 4472 A beschrieben. Das dort beschriebene Medikament soll zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden, um den Blutzuckerspiegel zu kontrollieren. Letztendlich beschreibt die JP 200 1131 027 A ein Haarwasser und -shampoo, welches Proanthocyanidin Di-Pentamere, als oligomer Formen, enthält.

Die JP 631 626 85 A stellt ein Extraktionsverfahren von Proanthocyanidinen aus pflanzlichen Rohstoffen dar. In der JP 630 203 21 A wird ein Epoxyharz beschrieben, welches aus einer polyfunktionalen Epoxykomponente besteht sowie einem Proanthocyanidin,.

Trotz der im Stand der Technik offenbarten zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten für unfraktionierte bzw. fraktionierte Extrakte, die z.B. aus Hamamelis, Chrysanthemum oder auch aus Trauben bzw. deren Schalen, gewonnen werden können, enthalten diese Extrakte häufig eine große Anzahl anderer Substanzen bzw. pflanzlicher Sekundärstoffe. Dies macht es häufig schwierig, einen definierten Wirkstoff zu bestimmen und diesen gezielt einzusetzen. Des weiteren wird durch die Anwesenheit von Zusatzstoffen im Extrakt bzw. der Präparation der Anteil an pharmakologisch wirksamer Substanz verringert und somit die pharmakologische Effizienz herabgesetzt.

Folglich besteht im Stand der Technik ein Bedürfnis, strukturell definierte Proanthocyanidine in hoher Reinheit bereitzustellen, so dassdass eine hohe Konzentration der gewünschten Proanthocyanidine vorliegt bzw. der Gehalt an Verunreinigungen und/oder Nebenprodukten möglichst gering ist.

Ausgehend von diesem Stand der Technik besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Nutzbarmachung von substituierten Proanthocyanidinen.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von oligo- und polymeren Proanthocyanidinen zur Behandlung von Haut- und Schleimhautdefekten sowie Entzündungen, zur regenerativen Haut- und Schleimhautpflege, sowie zur Beschleunigung der Haut- und Schleimhautregeneration, wobei die Proanthocyanidine aus der Grundeinheit Flavan-3-ol aufgebaut ist, welche an der C3-Position mindestens zum Teil mit Gallussäure verestert ist, und wobei die Grundeinheiten über (C4, C6)- oder (C4, C8)-Bindungen verknüpft sind.dass Die Erfindung geht daher von oligo- und polymeren Proanthocyanidinen aus, die

• a) aus der Grundeinheit Flavan-3-ol aufgebaut sind, welche
• b) an der C3-Position mindestens zum Teil mit Gallussäure verestert sind, und wobei
• c) die Grundeinheiten über (C4, C6)- oder (C4, C8)-Bindungen verknüpft sind, und
• d) im wesentlichen frei von anderen Zusatzstoffen ist.

Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung derartiger substituierter Proanthocyanidine als Bestandteil von kosmetischen Produkten, zur Beschleunigung der Proliferation von Keratinozyten, zur Beschleunigung der Proliferation von Zellen in Zellkultur und zur Beschleunigung der in vivo Proliferation von Zellen vorgesehen.

In der unten gezeigten Strukturformel (1) werden beispielhaft vier Grundeinheiten (Flavan-3-ol) gezeigt, die über eine (4, 8)-Bindung verknüpft sind und, mit Ausnahme der (unteren) terminalen Grundeinheit, an der C3 OH-Gruppe mit Gallussäure verestert sind. Die Veresterung der C3 OH-Gruppe der erfindungsgemäßen Proanthocyanidine mit Gallussäure liegt mindestens zum Teil vor, d.h. in einer vorteilhaften Ausführungsform sind mindestens 50% der vorhandenen C3 OH-Gruppen der Grundeinheit mit Gallussäure verestert (galloyliert), in einer bevorzugten Auführungsform sind mindestens 80% der C3 OH-Gruppen der Grundeinheiten galloyliert, wobei besonders bevorzugt ein Galloylierungsgrad von mindestens 90% der vorhandenen C3 OH-Gruppen ist (die Prozentsätze sind jeweils bezogen auf 100% der vorhandenen C3 OH-Gruppen). Die ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbarte mögliche (4, 6)-Verknüpfung der Grundeinheiten ist in der Formeldarstellung nicht gezeigt, stellt aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine weitere bevorzugte Ausführungsform dar. Die für n vorteilhaften bzw. bevorzugten Zahlenwerte sind für die (4, 6)-verknüpften und die (4, 8)-verknüpften Proanthocyanidine identisch, wobei vorteilhafte Werte für n zwischen 1 und 80 liegen. Bevorzugt sind Werte zwischen 2 und 40, besonders bevorzugt sind Werte zwischen 3 und 27. Die erfindungsgemäßen Proanthocynidine können ausschließlich als mindestens zum Teil galloylierte Verbindungen in (4, 6)-Verknüpfung auftreten, als mindestens zum Teil galloylierte Verbindungen in (4, 8)-Verknüpfung, sowie als Mischung dieser beiden letztgenannten Möglichkeiten in jedem möglichen Mischungsverhältnis, wobei der Galloylierungsgrad (d.h. der Prozentsatz der mit Gallussäure veresterten C3 OH-Gruppen bei den (4, 6)- bzw. (4, 8)-verknüpften Molekülspezies unterschiedlich sein kann. Die erfindungsgemäßen oligo- und polymeren Proanthocyanidine sind des weiteren im wesentlichen frei von anderen Zusatzstoffen. Diese Zusatzstoffe stellen insbesondere Gerbstoffe dar, die nicht zu den erfindungsgemäß beanspruchten Proanthocyanidinen zählen, wie z.B. hydrolysierbare Tannine, aber auch andere sekundäre Pflanzenstoffe, die als Verunreinigungen in Extrakten aus Pflanzen bzw. Teilen von Pflanzen auftreten können. Der Begriff "im wesentlichen frei von" ist dahingehend zu verstehen, dass der Reinheitsgrad der erfindungsgemäßen Proanthocyanidine, d.h. der mindestens zum Teil galloylierten oligo- und polymeren Proanthocyanidine, bei über 85% liegt (d.h. es liegen 15% Verunreinigungen bezogen auf die Gesamtmenge an erfindungsgemäßen Proanthocyanidinen vor). Bevorzugt ist ein Reinheitsgrad von mehr als 90%, besonders bevorzugt ist ein Reinheitsgrad von mehr als 95%.

Die verwendeten oligo- und polymeren Proanthocyanidine haben ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 250 bis 40000 Da. Das mittlere Molekulargewicht des Proanthocyanidins bezieht sich auf das Massenmittel aller umfassten Molekülspezies, d.h. sämtlicher zumindest teilweise an der C3 OH-Gruppe galloylierter, über (4, 6)- oder (4, 8)-Bindungen verknüpfter Grundeinheiten oder Mischungen derselben.

Die Erfindung verwendet ein oligo- und polymeres Proanthocyanidin, bei dem mindestens 50% der C3-Positionen der Grundeinheiten mit Gallussäure verestert sind. Der Prozentsatz bezieht sich hier wiederum auf die Gesamtzahl der vorhandenen C3 OH-Gruppen des Proanthocyanidins.

Die Erfindung verwendet ferner ein oligo- und polymeres Proanthocyanidin, bei dem, mit Ausnahme der C3-Position einer oder beider terminaler Grundeinheiten, sämtliche C3-Positionen mit Gallussäure verestert sind. Als terminale Grundeinheiten sind hier die das Polymer "abschließenden" Grundeinheiten zu verstehen. Somit ist bei dem in 1 gezeigten schematischen Molekül z.B. die untere (also abschließende) terminale Grundeinheit nicht mit Gallussäure verestert, während im Gegensatz dazu die obere terminale Grundeinheit galloyliert ist.

Es wird ferner ein oligo- und polymeres Proanthocyanidin verwendet, bei dem sämtliche C3-Positionen der Grundeinheiten mit Gallussäure verestert sind.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines oligo- und polymeren Proanthocyanidins zur Behandlung von Haut- und Schleimhautdefekten sowie Entzündungen, zur regenerativen Haut- und Schleimhautpflege, sowie zur Beschleunigung der Haut- und Schleimhautregeneration. Das Proanthocyanidin kann dabei systemisch (z.B. oral) oder topisch (lokal) verabreicht werden. Als medizinische Indikationen bezüglich der Verwendung sind hier die posttraumatische Versorgung von Schürf-, Schnitt- und Verbrennungswunden zu nennen. Das Proanthocyanidin eignen sich dabei sowohl zur topischen / lokalen Anwendung auf den betroffenen Hautarealen, als insbesondere auch zur protektiven oder regenerativen Behandlung von Schleimhäuten.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform auch die Verwendung eines oligo- und polymeren Proanthocyanidins als Bestandteil von kosmetischen Produkten. Proanthocyanidine sind in der Literatur (s.o.) als Bestandteile von sogenannten Gerbstoffpflanzen bekannt. Bisher in der Kosmetik verwendete Extrakte stellen meist rohe Gemische aus Procyanidinen und anderen Gerbstofftypen (z.B. hydrolysierbaren Tanninen) dar. Der Vorteil des zumindest teilweise galloylierten Procyanidins im Sinne dieser Erfindung ist die Möglichkeit der gezielten kosmetischen Anwendung der hier offenbarten Substanzen, die in konzentrierter und chemisch definierter Form dermal (topisch) appliziert werden können. Die hier offenbarte Galloylierung an der C3 OH-Gruppe der Grundeinheit verbessert darüber hinaus die Löslichkeit der Verbindungen und deren Einarbeitung in topisch anwendbare Grundlagen und stabilisiert die Oligomere hinsichtlich oxidativen Degradationserscheinungen. Es wurde durch in vitro und in vivo Versuche gezeigt, dass die Substanzen aus dieser Erfindung die Regeneration und Proliferation von Haut anregen können und somit als kosmetische Wirkstoffe, sowie auch als die Proliferation fördernde Agenzien einsetzbar sind (s.u., Beispiele). Dementsprechend konnte experimentell nachgewiesen werden, dass die Proliferationsrate der mit den erfindungsgemäßen Proanthocyanidinen behandelten Zellen (humane Keratinozyten) um das 2- bis 3.5-fache gesteigert wurde (s. Beispiel 1), sowie, dass auf zellulärer Ebene die Energiebereitstellung durch die Mitochondrien stimuliert wurde.

Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch die Verwendung eines oligo- und polymeren Proanthocyanidins zur Stimulation der Proliferation von Keratinozyten, wobei die Stimulation von humanen primären Keratinozyten bevorzugt ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen oligo- und polymeren Proanthocyanidins zur Beschleunigung der Proliferation von Zellen in Zellkultur, sowie die Verwendung des oligo- und polymeren Proanthocyanidins zur Beschleunigung der in vivo Proliferation von Zellen. Wie aus den Ausführungsbeispielen 1 und 2 (s.u.) ersichtlich, steigert das Proanthocyanidin die Proliferation von humanen Keratinozyten signifikant.

Primäre Keratinozytenkulturen werden immer häufiger im Rahmen von Hauttransplantationen eingesetzt. Bei großflächigen Verletzungen oder Verbrennungen, bei denen nicht genug intaktes Hautmaterial des Patienten zur Transplantation auf die verletzten Stellen zur Verfügung steht, werden häufig Hautstücke entnommen, anschließend aus diesen in vitro und ex vivo Keratinozytenkulturen angelegt, die dann auf inerten Trägermaterialien bis zur massiven Konfluenz kultiviert werden und schließlich auf die verletzten Hautareale des Patienten transplantiert werden (siehe in diesem Zusammenhang auch: Horch R, Bannasch H, Stark GB, "Transplantation of cultured autologous keratinocytes in fibrin sealant biomatrix to resurface chronic wounds", Transplant. Proc., 33 (2001), 642; Lee KH, "Tissue-engineered human living skin substitutes: development and clinical application." Yonsei Med. J. 41(6) (2000), 774, Übersichtsartikel; Tanczos E, Horch RE, Bannasch H, Andree C, Walgenbach KJ, Voigt M, Stark GB, "Keratinocyte transplantation and tissue engineering. New approaches in treatment of chronic wounds." Zentralbl. Chir. 1999;124 (1999), Suppl 1:81-6, Übersichtsartikel).

Da im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Zusatz des oligo- und polymeren Procyanidins zu den Kulturmedien die Proliferation der Hautzellen beschleunigt werden kann, bedeutet dies, dass die Transplantation zu einem früheren Zeitpunkt erfolgen kann. Letztgenanntes ist mit erheblichen Vorteilen für den Patienten verbunden, da dessen Wunden früher versorgt werden können, was das Infektionsrisiko (z.B. Sepsis) vermindert und die Gesamtprognose verbessert.

In einer weiteren Ausführungsform können die oligo- und polymeren Proanthocyanidins als Medikament oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Haut- und Schleimhautdefekten, sowie zur Stimulation der Proliferation von Zellen verwendet werden. Die möglichen Darreichungsformen umfassen hier orale Darreichungsformen wie z.B. Kapseln und Tabletten, als auch parenterale Darreichungsformen, sowie insbesondere topische bzw. lokale Anwendungsformen in Form von Lutschtabletten, Spülungen, Suppositorien, Stili, Salben und Cremes.

Die verwendeten oligo- und polymeren Proanthocyanidine können auf folgendem Weg hergestellt und isoliert werden:

• i) Extraktion von Pflanzenmaterial enthaltend Proanthocyanidine mit einem Gemisch umfassend Aceton,
• ii) weitere Behandlung des Extraktes aus Schritt i) mit wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Verwerfen der organischen Phase,
• iii) Auftragen der verbliebenen wässrigen Phase aus Schritt ii) auf wenigstens eine Säule,
• iv) Waschen der beladenen Säule aus Schritt iii) mit einem geeigneten Lösungsmittel,
• v) Elution der Säule aus Schritt iv) mit einem Aceton/Wasser Gemisch oder Methanol oder zunächst mit Methanol und anschließend mit einem Aceton/Wasser Gemisch oder zuerst mit einem Aceton/Wasser Gemisch und anschließend mit Methanol.

Dabei findet die Extraktion von Pflanzenmaterial, das die galloylierten oligo- und polymeren Proanthocyanidine enthält, in Schritt i) statt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird zerkleinerte Rinde von Hamamelis virginiana verwendet und bei Raumtemperatur unter Verwendung eines geeigneten und dem Fachmann bekannten Lichtschutzes mittels eines Gemisches umfassend Aceton extrahiert, wobei ein Aceton/Wasser-Gemisch (bevorzugtes Verhältnis Aceton/Wasser = 7:3 (v/v)) bevorzugt ist. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Extraktion der galloylierten Proanthocyanidine ist in 8 gezeigt. Eine bevorzugte erschöpfende Extraktionsmethode zur Gewinnung des galloylierten Proanthocyanidins der vorliegenden Erfindung, die zu guten Ausbeuten führt stellt, die Perkolation dar. Es sind jedoch auch andere dem Fachmann bekannte Extraktionsverfahren des Standes der Technik im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbar.

Die Verwendung von Methanol als Extraktionsmittel sollte im Rahmen der vorliegenden Erfindung in den ersten Extraktionsschritten vermieden oder die Methanol-Exposition der Lösung sollte möglichst kurz gehalten werden, da es hierdurch zur Methanolyse der zu isolierenden Gallussäureester des Proanthocyanidins kommen kann (Bruneton, J, "Pharmocognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants.", (1995) Lavoisier, London, New York, 313-334.

Nach Entfernung des Acetons bei maximal 40°C wird in Schritt ii) die wässrige Phase mit wenigstens einem organischen Lösungsmittel extrahiert, in einer bevorzugten Ausführungsform wird Petrolether verwendet, anschliessend wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden verworfen. Das Proanthocyanidin befindet sich nun in der wässrigen Phase, wobei die Ausbeute der wässrigen Phase nach Trocknung in der Regel bei bis zu 8%, bezogen auf das eingesetzte getrocknete Gesamt-Pflanzenmaterial, liegt.

Nachfolgend wird das Rohgemisch auf eine Säule aufgetragen (Schritt iii), wobei als bevorzugtes Material Sephadex LH20 von Pharmacia oder ein gleichwertiges Material verwendet wird. Alternativ kann auch ein entsprechendes Batch-Verfahren zur Anwendung kommen. Es wird dabei immer zunächst bis zur Farblosigkeit des Durchflusses mit 96%-igem Ethanol gewaschen (Schritt iv), wobei der Durchfluss anschließend verworfen wird. Nachfolgend wird ausschließlich mit einem Aceton-Wasser-Gemisch eluiert (Schritt v), gegebenenfalls ausschließlich mit Methanol. Alternativ erfolgt eine Elutionssequenz, wobei zuerst eine Elution mit Methanol und anschließend mit einem Aceton/Wasser-Gemisch erfolgt oder umgekehrt. Typische Ausbeuten eines Methanol-Eluates (ausschl. Methanol) sind > 30% bezogen auf die Menge an eingesetztem Rohprodukt, die eines Aceton/Wasser-Eluates (ausschl. Aceton/Wasser) liegt bei > 10%. Allgemein gilt, dass durch Methanol-Elution Proanthocyanidin-Fraktionen mit kleinerem Molekulargewicht erhalten werden und durch Aceton-Wasser-Elution höhermolekulare Proanthocyanidine eluiert werden. Durch Kombinationen der beiden Elutionsmethoden (erst Methanol, danach Aceton oder umgekehrt) können unterschiedliche galloylierte oligo- oder poylmere Proanthocyanidine erhalten werden, die sich in der mittleren Molekülgrösse (DP) unterscheiden.

Um Fraktionen mit enger begrenzten Molekulargewichtsbereichen zu erhalten, kann gegebenenfalls eine weitere säulenchromatographische Fraktionierung an Sephadex LH20-Säulen oder gleichwertigen Materialien, vorzugsweise unter Verwendung eines Ethanol-Wasser-Aceton-Gemisches, erfolgen.

Die vorliegende Erfindung soll weiterhin anhand der folgenden Beispiele und Abbildungen erläutert werden, wobei besonders deren vorteilhafte Anwendbarkeit sowohl im Bereich der Hautregeneration und Zellkultur, als auch auf dem Gebiet der Kosmetik, aufgezeigt werden.

1 zeigt Strukturmerkmale der galloylierten oligo- und polymeren Proanthocyanidine, wobei hier eine (4, 8)-Verknüpfung der Grundeinheiten vorliegt.

2 zeigt den Einfluss von oligomeren, galloylierten Proanthocyanidinen unterschiedlicher Molekulargewichte in Dosierungen von 1 und 10 &mgr;g/ml auf die Zellproliferation von humanen Keratinozyten nach neuntägiger Inkubationsdauer. Die Ergebnisse wurden mittels BrdU-Einbau in die zelluläre DNA und anschließender ELISA-Auswertung bestimmt. Die angegebenen Werte stellen die Mittelwerte +/– die Standardabweichung aus n = 10 dar mit *p < 0.1 und **p < 0.05 gegenüber der unbehandelten Kontrolle.

3 zeigt den Einfluss der galloylierten Proanthoycyanidine auf die Zellproliferation von NHK über eine 10tägige Fütterungsperiode. Die Ergebnisse wurden mittels BrdU-Einbau in die zelluläre DNA und anschliessender ELISA-Auswerung bestimmt. Die angegebenen Werte stellen die Mittelwerte +/– die Standardabweichung aus n = 10 dar mit *p > 0.1 und **p > 0.05 gegenüber der unbehandelten Kontrolle.

4 beschreibt den Einfluss eines galloylierten Proanthocyanidins auf die mitochondriale Aktivität humaner Keratinozyten in Dosen von 1 und 10 &mgr;g/ml nach neuntägiger Inkubationsdauer. Auswertung mittels MTT-Test; die angegebenen Werte stellen die Mittelwerte aus n = 10 dar mit *p < 0.1 gegenüber der unbehandelten Kontrolle.

5 zeigt den Einfluss verschiedener hochmolekularer galloylierter Proanthocyanidine (Substanzen B und C) auf die Zelldifferenzierung humaner Keratinozyten in Dosierungen von 0,1 bis 50 &mgr;g/ml nach neuntägiger Inkubation.

4A: Absorptionsmesswerte, ermittelt mittels Keratin-ELISA;

4B: Quantifizierung der Menge differenzierungsspezifischer Keratine aus 5A.

6 zeigt delta TEWL nach 3-tägiger kumulativer Irritation von Hautarealen; GPC = galloylierte Proanthocyanidine.

7 zeigt den klinischen Score nach 3 Tagen kumulativer Irritation GPC: galloylierte Proanthocyanidine.

8 zeigt eine Colorimetrie nach 3-tägiger kumulativer Irritation von Hautarealen.

9 zeigt schematisch ein bevorzugtes Aufreinigungsverfahren zum Erhalt der galloylierten Proanthocyanidine.

Als Testsubstanzen wurden galloylierte Proanthocyanidine mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 1000 Da (Substanz B) und 5000 Da (Substanz C) verwendet.

Es wurde eine Untersuchung des Einflusses der beiden Proanthocyanidinfraktionen auf humane Keratinozyten (natural human keratinozytes, NHK) durchgeführt. Hierzu wurden Primärkulturen aus Keratinozyten von Spendern angelegt und diese Kulturen in-vitro mit den o.g. zu untersuchenden Substanzen B und C, gelöst in physiologischem Medium, versetzt. Als Negativkontrollen dienten gleichartig behandelte Kulturen, denen nur reines Medium zugesetzt wurde.

Für alle in vitro Untersuchungen wurde das System der „submerged" Keratinozytenkultur gewählt. Keratinozyten wurden entweder von kommerziellen Anbietern bezogen (Cell Systems, St. Katharinen, Deutschland) oder aus Humanhaut aus operativen Resektionen gewonnen.In letzterem Falle wurden die Hautstücke direkt nach Entnahme mit einer Lösung, die 0,2% Fungizone, 5,9 &mgr;g/ml Gentamycin und 7,5% Natriumhydrogenphosphat in DMEM-Medium (Gibco, Karlsruhe, Deutschland) dekontaminiert. Das Gewebe wurde mechanisch aufgeschlossen und Dermis und Epidermis durch Dispasebehandlung getrennt. Die Epidermis wurde trypsinisiert (15 min, 34°C Trypsin 0,05%, NaEDTA 0,53mM). Die Reaktion wurde durch Zugabe von TNS (Cell Systems, St. Katharinen, Deutschland) gestoppt. Die Kerationzyten wurden abzentrifugiert (463 × g, 5 min), in PBS resuspendiert, erneut zentrifugiert und in KGM2-Medium ausgesät. Die Kultur erfolgte bei 37° unter einer 5% CO₂ Atmosphäre.

Bei etwa 60 bis 70% Konfluenzraten wurden nach Trypsinisierung Sekundärkulturen angelegt. Alle Kulturen waren im wesentlichen frei von Kontminationen, insbesondere die Abwesenheit von Fibroblasten und Melanocyten wurde routinemässig geprüft. Die Sekundärkulturdauer betrug 9 bis 14 Tage.

Die Zugabe der Proanthocyanidine zu den Keratinozyten erfolgte nach Lösen in KGM-2/DMSO. Als Positivkontrollen zur Detektion von Differenzierungsvorgängen diente hoch konzentriertes Calcium-Medium mit 1,5 mM Ca²⁺. Als Kontrollen dienten die unbehandelten Kulturen.

Die Charakterisierung der Keratinozytenphysiologie erfolgte über die Ermittlung der Wachstumsraten der Zellen nach Trypsinisierung. Die mitochondrialen Aktivitäten wurden mittels der MTT-Methode nach Mosmann ermittelt (Mosmann, M, "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: applications to proliferation and cytotoxicity assays.", J. Imm. Methods 65 (1983), 55-163). Die Lactat dehydrogenase-Titer wurden mittels eines LDH-Assay-Kits (Sigma, Steinheim, Deutschland) bestimmt (Amador E, Dorfman LE, Wacker WEC, "Serum lactic dehydrogenase. An analytical assessment of current assays.", Clin. Chem. 9 (1963), 391-395). Die Zellproliferationsbestimmung erfolgte unter Verwendung eines BrdU-Kits (Boehringer, Mannheim, Deutschland) nach den Angaben von Porstmann T., Ternyck T., Avrameas S, "Quantitation of 5-bromo-2-deoxyuridine into DNA an enzyme immunoassay for the assesment of the lymphoid cell proliferative response.", J. Immunol. Methods 82 (1985), 169-179. Die differenzierungsspezifischen Keratine K1 und K10 wurden folgendermaßen bestimmt: die Zellen wurden gewaschen und die Keratine mittels Harnstoff 8 M, &bgr;-Mercaptoethanol 0.2 M und Tris 1.5 mM solubilisiert. 50 &mgr;L des Solubilisates wurden in 96-well Mikrotiterplatten transferiert und über 18 h bei 4°C inkubiert. Danach wurde 1 Stunde mit Blockmedium (Milchpulver 7% in PBS mit 0,05%Tween 20) behandelt, anschliessend erfolgte Zugabe von 100 &mgr;L eines monoklonalen Maus-anti-human-Keratin-Antikörpers (Dako, Hamburg, 1:400 in Blockmedium). Danach erfolgt 3-maliges Waschen mit 150 &mgr;L PBS enthaltend 0,05% Detergens. Anschliessend erfolgte der Zusatz von POD-gebundenem Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (Sigma, Steinheim, Deutschland). Nach 3-maligem Waschen erfolgte die Zugabe von 100 &mgr;L Substratlösung (Phenylendiamin, Wasserstoffperoxid), die Reaktionsdauer betrug 10 min bei Raumtemperatur, die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von 100 &mgr;l Schwefelsäure beendet. Die Auswertung erfolgte durch Bestimmung der UV-Absorption bei 492 nm, die Kalibration wurde mit Standardkeratinen durchgeführt.

Alle Kulturen, die mit den Proanthocyanidin-Fraktionen behandelt worden waren zeigten deutliche und rasche Bildung von konfluenten Monolayern nach 9 Tagen Inkubationsdauer. Die unbehandelten Kontrollgruppen zeigten innerhalb dieser neuntägigen Versuchdauer lediglich etwa 40% Konfluenz. Erwartungsgemäß spiegelte sich dieses Ergebnis auch in der Zellproliferationsrate wieder, die mittels BrdU-Einbau (Brom-desoxy-Uridin) quantifiziert wurde (siehe 1).

Aus den in 1 gezeigten Daten wird deutlich, dass die verwendeten Proanthocyanidine, hier die Substanzen B und C, die Zellproliferationsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle um das Zwei- bis Dreieinhalbfache erhöhen und somit vorteilhaft im Rahmen einer Zellkultur zur Erhöhung der Proliferationsrate und damit einem schnelleren Erreichen der Konfluenz verwendet werden können. Folglich wurden die Proliferationsquoten bei Zusatz der galloylierten Proanthocyanidine gegenüber der unbehandelten Kontrolle um über das dreifache gesteigert. Das heißt aber auch, dass diese Substanzen, werden sie zu den Nährmedien bzw. direkt zu den Kulturen, zugesetzt, generell als Wachstumsenhancer für Zellen, Zellkulturen und Gewebe verwendet werden können. Dies hat zur Folge, dass die Zellkulturen bzw. Gewebe schneller wachsen und somit deren Herstellung effizienter und preiswerter wird. Ein weiterer Vorteil der Verwendung der Proanthocyanidine besteht auch in der schnelleren und effizienteren Möglichkeit, transplantierende Zellen bzw. Gewebe für z.B. Hauttransplantationspatienten bereitzustellen.

Untersucht man die Zellproliferation humaner Keratinozyten über die Zeit hinweg in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit der zumindest teilweise galloylierten Proanthocyanidine, so zeigt sich, dass schon nach sechstägiger Inkubation signifikante Unterschiede zwischen behandelter und unbehandelter Gruppe auftreten und die behandelten Zellen weiterhin ein signifikant stärkeres Wachstum zeigen ( 2). Dies bedeutet aber auch, dass die Proanthoycyanidine nicht als punktueller Stimulus nach Einmalgabe die Zellproliferation anregen, sondern den Zellen ständig zugeführt werden müssen.

Die mittels der hochmolekularen, galloylierten Procyanidinen erzielten Proliferationsquoten gehen auf subzellulärerer Ebene mit einer deutlich gesteigerten mitochondrialen Aktivität, also mit vermehrter Energieproduktion, einher. Dies konnte durch Bestimmung der mitochondrialen Aktivität behandelter und unbehandelter Zellen nach neuntägiger Inkubation mittels des MTT-Test belegt werden ( 3).

Zur Untersuchung, inwieweit die hochmolekularen, galloylierten Procyanidine auch Differenzierungsprozesse beeinflussen, wurden vergleichende Untersuchungen zu differenzierungsspezifischen Keratinen K1 und K10 mittels ELISA-Technik durchgeführt (Muzarelli et al. (1999) EXS 87, 251-264).

Hierbei wurden NHK wiederum entweder mit verschiedenen Procyanidinen oder reinem Medium behandelt, die Zellen nach neuntägiger Inkubation aufgeschlossen, die Keratine solubilisiert und mit spezifischen Antikörpern quantifiziert ( 4). Hierbei zeigt sich deutlich, dass eine Beeinflussung der Keratinbildung und damit auch der Differenzierung nicht durch die Proanthocyanidine ausgelöst wird. Somit kann die Wirkung der galloylierten Proanthyocyanidine auf eine Steigerung der Proliferation und des Energiestoffwechsels zurückgeführt werden, während unerwünschte Differenzierungsvorgänge nicht induziert werden.

Als Ergebnis ist festzuhalten, dass die Unterschiede, die über die Menge an differenzierungsspezifischen Keratinen (ELISA) ermittelt wurden, zwischen den einzelnen Gruppen nicht signifikant sind und somit keine Beeinflussung der zellulären Differenzierungsvorgänge durch die Proanthocyanidine stattfindet.

Ein wichtiger Anforderungspunkt für pflegende Kosmetika ist immer auch die Verträglichkeit. Zur Untersuchung der Frage, inwieweit zelluläre Toxizitäten zu beobachten sind, wurden Keratinozyten mit hochmolekularen, galloylierten Proanthocyanidinen in einem Dosisbereich von 1 bis 100 &mgr;g/ml inkubiert und nekrotische Prozesse über die Messung der extrazellulären Lactatdehydrogenase bestimmt. Das verwendete Konzentrationsintervall geht im oberen Dosisbereich weit über die Dosen hinaus, die bei einer topischen Anwendung tatsächlich in Kontakt mit den Zellen kommen. Nekrotische Prozesse konnten in keinem Dosisintervall festgestellt werden. Sämtliche Gruppen erweisen sich als nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppen. Auch mikroskopisch konnten keine Zelldeformationen oder andere Hinweise auf Zellschädigungen beobachtet werden.

In vitro kultivierte Keratinozyten werden allgemein als international akzeptiertes Testsystem zur Evaluation cytotoxischer und hautschädigender Wirkungen verwendet (Sandt S, Roguet R, Cohen C, Esdaile D, Ponec M, Corsins E, Barker C, Fusenig, N, Liebsch M, Benford D, Fartasch M, "The use of keratinozytes and human skin models for predicting skin irritation.", European Centre for the validation of alternative methods ECVAM, ATLA 27 (1999), 723-743).

Die bei weitem häufigste Ursache für eine Schädigung der Hautbarriere ist der wiederholte Kontakt mit in relativ geringem Maße irritativ wirkenden Substanzen, wie zum Beispiel Detergenzien in Wasser.

In der Literatur existiert bereits eine Vielzahl von in vivo Modellen für den Wirksamkeitsnachweis von Hautschutzpräparaten. Sogenannte kumulative Modelle vollziehen die eigentliche Expositionssituation mit Detergenzien am Besten nach.

Die Bewertung der Hautsituation erfolgt vorwiegend durch eine klinische Bewertung der Irritation (clinical scoring), eine Quantifizierung des Erythems (Colorimetrie) und durch Messungen der Barrierestörungen über den transepidermalen Wasserverlust (TEWL). In einem validierten kumulativ-irritativem Modell (Schnetz E, Diepgen TL, Elsner P, Frosch PJ, Klotz AJ, Kresken J, Kuss 0, Merk H, Schwanitz HJ, Wigger-Alberti W, Fartsch M, Contact Dermatitis 42 (2000), 336-343; Fartasch M, Schnetz E, Ennen J, Lanzendörfer G, Diepgen TL, Zeitschr. f. Hautkrankheiten, H + G, 74 (1999), 1-6; Fartasch M, Schnetz E, Diepgen TL, J. Invest. Dermatol., Symposium Proceedings, Vol. 3, No. 2 (1998), 121-127) wurden die Untersuchungen am volaren Unterarm über 3 Tage durchgeführt. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, die Effektivität von Hautpflegeprodukten sowie von deren Wirkstoffen in kurzer Zeit reproduzierbar zu erkennen.

Dieser kumulativ-irritative Test wurde verwendet, um die Effektivität der galloylierten Proanthocyanidine als Wirkstoffe in kosmetischen Zubereitungen zu testen. Die Testung erfolget bei einer Konzentration der galloylierten Proanthycyanidine von 1 % in einer kosmetischen Grundlage (Eucerin cum aqua, gemäss den Anforderungen des Europäischen Arzneibuches) an geschädigter Haut (0,5% Sodiumlaurylsulfat, SDS, SLS). Vergleichswerte waren eine Negativkontrolle durch Behandlung der Haut mit aqua purificata, sowie eine Positivkontrolle durch Irritation der Haut mit 0,5 % SLS. Als Kontrolle für die Anwendbarkeit des Testverfahrens wurden die Messwerte der unbehandelten Haut erfasst.

1.Tag: Zweimalige Applikation von 50&mgr;l einer 0.5% wäßrigen Natriumlaurylsulfatlösung (Sodiumlaurylsulphate, SLS) am volaren rechten und linken Unterarm in 11 mm Finnchambers^® auf Filterpapierscheiben mit jeweils 30min Okklusion und 3h± 30 min Pause zwischen den Applikationen. Jeweils 10 min vorher wurde an den Testorten das Testprodukt aufgetragen (0,05g/ 2cm²). Am 2.Tag und 3.Tag wurde dieses Schema wiederholt. Die Testareale wurden zwischen den Probanden im Uhrzeigersinn permutiert.

Die Bewertung des Hautzustandes (TEWL, Colorimetrie und clinical Score) wurde vor dem ersten Ausbringen der Testsubstanzen am 1. Tag und ca. 3 bis 4 Stunden nach der letzten Irritation am Tag 3 durchgeführt.

Klinisches Scoring 0,5 = sehr schwaches Erythem – etwas glänzende Oberfläche – keine Schuppung - kein Ödem – keine Fissuren; 1 = Erythem schwach, diffus oder follikulär – leicht rauhe Oberflache – minimale Schuppung – leichtes Ödem- feine Fissuren; 2 = mittleres Erythem – mittelstarke Rauhigkeit, Schuppung und Ödem, mit breiten Fissuren; 3 = deutliches Erythem, grobe Schuppung, ausgeprägtes Ödem, ausgeprägte Fissuren mit Hämorrhagie und Exsudation.

Die Messung des TEWL erfolgte durch ein durch Tewameter vom Typ TM 210 (Courage und Khazaka, Köln) unter standardisierten Bedingungen im klimatisierten Raum. Doppelbestimmung. Zuvor lag eine 20-minütige Ruhepause der Probanden.

Die Colorimetrie wurde mit einem Colorimeter der Fa. Minolta, entsprechend den europäischen Guidelines (siehe Fullerton A, Fischer T, Lauti A, Wilhelm KP, Takiwaki H, Serup J, Contact Dermatitis 35 (1996), 1-10) durchgeführt.

Als Probanden standen 7 freiwillige, hautgesunde Individuen (2 männlich, 5 weiblich, Alter 22 bis 38 Jahre, Durchschnitt 29,8 Jahre) zur Verfügung. Bei keinem der Probanden lag eine bekannte Typ-IV Allergie vor. Es bestand keine atopische Hautdiathese und keine Ekzemvorerkrankungen.

Die Ergebnisse der TEWL- Messungen und der Colorimetrie werden in 5 als Boxplots dargestellt. Die Boxplots zeigen den Median, das 25% Percentil, das 75% Percentil und Werte, die außerhalb der Percentile liegen. Die untere Begrenzung der Box ist der 25% Percentil, die obere Begrenzung der 75% Percentil, die Linie im Inneren der Box ist der Median. Von den Begrenzungen der Box werden Linien zu dem höchsten und dem niedrigsten beobachteten Werten gezogen, die noch keine "Ausreißer" oder Extremwerte darstellen. Werte die zwischen dem 1.5 bis 3 fachen der Boxlänge über oder unter der Begrenzung der Box liegen werden als "Ausreißer" bezeichnet (o) und nicht berücksichtigt. Liegen Werte mehr als das 3-fache außerhalb der Box, so gelten sie als Extremwerte und bleiben ebenfalls unberücksichtigt.

Die Ergebnisse des Clinical Score werden in einem Balkendiagramm dargestellt (s. 6). Die Balken zeigen den Mittelwert. Die Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwertes

TEWL:

Die Ergebnisse aus den TEWL- Messungen stimmten gut mit den Ergebnissen des Klinischen Scores und der Colorimetrie überein. In allen Fällen führte eine Irritation mit SLS – mit oder ohne Pflegeprodukte – zu einer Erhöhung der TEWL Werte gegenüber der unbehandelten Kontrolle und Wasser. Das untersuchte kosmetische Präparat, enthaltend 1 % an erfindungsgemäßen galloylierten Proanthocyanidinen, führte jedoch zu unterschiedlich starken delta TEWL-Erhöhungen.

Die delta TEWL-Werte für die reine Grundlage enthaltend die Proanthocyanidinzubereitung waren signifikant niedriger als die Werte nach reiner Irritation mit SLS. Bei Verwendung von reiner Grundlage (ohne Proanthocyanidine) konnte keine signifikante Erniedrigung im Vergleich zu reiner Irritation nachgewiesen werden.

Die prozentuale Verminderung des delta TEWL (Mittelwert) bei Applikation von Hautschutz (delta TEWL bei reiner Irritation = 100%) war wie folgt:

Die Ergebnisse der TEWL-Messungen sind in 5 wiedergegeben.

Eine Irritation der Haut mit 0,5%igem SLS bewirkt eine Erhöhung der Werte der klinischen Scorings. Dies kann auch durch die untersuchten Zuammensetzungen mit Proanthocyanidinen nicht vollständig verhindert werden. Die verschiedenen Produkte zeigen jedoch eine unterschiedlich starke Wirkung gegenüber einer Irritation mit SLS. Bei der Applikation von reiner Grundlage mit den erfindungsgemäßen galloylierten Proanthocyanidinen war das induzierte Erythem deutlich geringer ausgeprägt als bei der Applikation von reiner Grundlage. Der Unterschied zwischen den Produkten war signifikant. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist in 6 wiedergegeben.

Auch die Quantifizierung des Erythems zeigt die gleichen Ergebnisse wie die klinische Bewertung der Haut. Eine Irritation mit SLS führt zu einem Anstieg der Werte, der durch das kosmetische Testprodukt, enthaltend die erfindungsgemäßen galloylierten Proanthocyanidine gelöst in Grundlage, nicht vollständig verhindert werden kann.

Bei der Verwendung des Testproduktes (mit galloylierten Proanthoyanidinen) zeigte sich jedoch, dass der Großteil der Werte deutlich niedriger liegen als bei reiner Irritation oder auch der Verwendung von reiner Grundlage. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist in 7 wiedergegeben.

Es wurden reine Grundlage (Eucerin cum aqua) und Grundlage mit Zusatz von 1 % an erfindungsgemäßen galloylierten Proanthocyanidinen als Wirkstoff in einem dreitägigen kumulativen Test auf eine regenerative Wirkung an hautgesunden Versuchspersonen (Personenzahl n = 7) nach Irritaion mit 0,5% SLS geprüft.

Somit ist offenbar, dass der Zusatz von 1% der galloylierten Proanthocyanidine zur Grundlage vorteilhaft ist, und zwar nicht nur bezüglich der Verminderung von potentiell auftretenden Irritationen, sondern auch bezüglich der durch die so induzierte schnellere und effizientere Regeneration der epidermalen Barriere (bestimmt durch den TEWL) nach eingetretenen Schädigungen bewirkte schnellere Verbesserung des (Haut-)Zustandes.

Die Extraktion von Pflanzenmaterial, das die galloylierten oligo- und polymeren Proanthocyanidinen enthält, wurde bei Raumtemperatur unter Lichtschutz mittels einer Aceton/Wasser-Mischung (im Verhältnis von 7:3). Eine erschöpfende Extraktionsmethode, die zu guten Ausbeuten führt stellt die Perkolation dar, jedoch sind hier auch andere technische Verfahren denkbar.

Die Verwendung von Methanol als Extraktionsmittel wird zunächst vermieden, da es hierdurch zur Methanolyse der Gallussäureestern kommen kann (Bruneton, 1995).

Nach Entfernung des Acetons bei einer Temperatur von maximal 40°C wird die wässrige Phase mit mindestens einem organischen Lösungsmittel extrahiert hier wird Petrolether verwendet, anschliessend wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phase werden verworfen. Die Proanthocyanidine befinden sich nun in der wässrigen Phase (die Ausbeute der wässrigen Phase nach Trocknung liegt bei ca. 8%, bezogen auf das getrocknete Ausgangs-Pflanzenmaterial.

Nachfolgend wird das Rohgemisch auf eine mit Sephadex LH20 (Pharmacia) befüllte Säule aufgetragen. Anschließend wird die Säule mit 96%-igem Ethanol gewaschen, bis der Durchfluß klar erscheint (mindestens Waschen mit drei Säulenvolumina). Der Durchfluß (Wschlösung) wird anschließend verworfen. Nachfolgend wird entweder mit Methanol oder mit einem Aceton-Wasser-Gemisch ( Verhältnis 7:3) eluiert. Die typische Produktausbeuten eines Methanol-Eluates liegen bei ca. 30%, bezogen auf die Menge an eingesetztem Rohprodukt, und die eines Aceton/Wasser-Eluates liegen bei etwa 10%. Durch Methanol-Elution werden Procyanidin-Fraktionen mit kleinerem Molekulargewicht erhalten, durch Aceton-Wasser-Elution werden hochmolekulare Procyanidine eluiert. Durch Kombinationen der beiden Eluitionsmethoden (erst Methanol, danach Aceton 70%) können unterschiedliche Produkte erhalten werden, die galloylierte oligo- oder poylmere Proanthocyanidine darstellen, sich aber in der mittleren Molekülgrösse (DP) unterscheiden.

Um enger definierte Fraktionen mit engeren Molekulargewichtsbereichen zu erhalten, erfolgt nun eine weitere säulenchromatographische Fraktionierung an Sephadex LH20 unter Verwendung eines Ethanol-Wasser-Aceton (7:7:6)-Gemisches.

sDie Saure Hydrolyse des Produktes mit ethanolischer Salzsäure resultiert im Auftreten der Anthocyane Cyanidin und Delphinidin zu gleichen Teilen. Somit bestehen die verwendeten Proanthocyanidinen aus Einheiten, die im Ring B sowohl di- als auch trihydroxyliert sind. Die Identifizierung von Gallusäure durch Hydrolyse der oligo- und polymeren Proanthyocyanidinen mit 2N ethanolischer Salzsäure für 60 min am Rückfluss und anschließender dünnschichtchromatographischer Identifizierung freier Gallusäure erfolgte im Vergleich mit authentischer Referenzsubstanz. In allen untersuchten Proben wurden deutliche Mengen an freier Gallussäure detektiert. Die Identifizierung der Kettenendeinheiten und Kettenverlängerungseinheiten erfolgte nach säurekatalysierter, thiolytischer Spaltung mit Benzylmercaptan als Nucleophil (2 g Probe in 15 ml Ethanol 96%, 1350 &mgr;l Benzylmercaptan, 660 &mgr;l Eisessig, Stickstoffbegasung, 95°C, 5 Tage in verschlossener Ampulle) und anschliessender HPLC-Auftrennung und Quantifizierung der Spaltprodukte. Nach zweitägiger Reaktionsdauer waren lediglich 3-O-Galloylepigallocatechin-4-benzylthioether sowie 3-O-Galloyl-epicatechin-4-benzylthioether zu detektieren. Die Mengen an Epigallocatechin-4-benzylthioether und Epicatechin-4-benzylthioether waren < 1 %. Es ergab sich die folgende prozentuale Verteilung der bei vollständiger Thiolyse gebildeten Thioether zweier ausgewählter Fraktionen nach fünftägiger Reaktionsdauer (Berechnung aus Flächenintegralen HPLC; Angaben in %):

Einzelbausteine des Polymers (Thiolyse, HPLC):

3-O-Galloyl-epigallocatechin, 3-O-Galloyl-epicatechin als Hauptkomponenten der Kettenglieder, geringe Mengen freies Catechin und Epicatechin als terminale Endgruppen

Interflavanverknüpfung (partielle Thyolyse, HPLC): 4⟹6 und 4⟹8-Verknüfung

Durchschnittlicher Polymerisationsgrad (GPC): 12^

Produkt-Gehalt (UV) > 90%, hohe Reinheit

Das durch Anthocyanspaltung ermittelte Vorkommen von Di- und Trihydroxylierung in den B-Ringen im Verhältnis von etwa 1 : 1 konnte somit bestätigt werden. Die Zusammensetzung der einzelnen Fraktionen war mit Schwankungsbreiten von etwa 10% sehr ähnlich.

Epicatechin-4-benzylthioether und Epigallocatechin-4-benzylthioether entstanden nur in untergeordnetem Maße. Aufgrund der langen Reaktionszeit (5 Tage, 95°C) ist davon auszugehen, dass diese aus den entsprechenden, an Position 3 galloylierten Verbindungen, entstehen. Nachdem diese beiden Verbindungen in den ersten beiden Tagen der Reaktion nicht detektierbar waren und auch freie Gallussäure im Thiolyseansatz detektiert wurde, kann mit ziemlicher Sicherheit davon ausgegangen werden, dass die polymeren Proanthocyanidine an den Kettenverlängerungseinheiten an Position 3 vollständig galloyliert sind.

Die Kettenenden setzten sich zum größten Teil aus Catechin (95%) zusammen, Gallocatechin kommt nur zu etwa 5% vor.

Die Bestimmung der durchschnittlichen Molekulargewichte erfolgte mittels zweier unterschiedlicher Methoden:

• a) Durch Gelpermeationschromatographie der peracetylierten Verbindungen an Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren
• b) Durch vollständige Thiolyse (3 mg Probe in 300 &mgr;l Ethanol, 30 &mgr;l Benzylmercaptan, 15 &mgr; Eisessig, Stickstoffbegasung, 95°C) und Molekulargewichtsbestimmung über das Verhältnis der Endgruppen zu den Kettenglieder

Ergebnisse:

Fraktion C2 (Elution an LH20-Säule mit 70% Aceton, Erhalt von Subfraktion 2): Durchschnittlicher Polymerisationsgrad 20,0

Fraktion M2 (Elution an LH20 mit Methanol, Subfraktion 2): Durchschnittlicher Polymerisationsgrad 12,9

Die o.g. Ergebnisse wurden zusätzlich durch MALDI-TOF Massenspektroskopie bestätigt. Die Bestimmung der Interflavan-Verknüfung erfolgte durch partiellen thiolytischen Abbau der Oligo- und Polymere unter schonenden Bedingungen (6 g Probe in 45 Ethanol 96%, 4050 &mgr;l Benzylmercaptan, 1980 &mgr;l Eisessig, Stickstoffbegasung, 95°C, 48 Stunden in verschlossener Ampulle) und HPLC-Analytik des resultierenden Spaltgemisches. Identifizierung der Spaltprodukte durch Vergleich und Co-Chromatographie mit authentischen Referenzsubstanzen.

Folgende Spaltprodukte wurden hierbei aufgefunden:

Catechin

Gallocatechin

Epicatechin-4&bgr;-benzylthioether

3-O-Galloyl-epicatechin-4&bgr;-benzylthioether

3-O-Galloyl-epigallocatechin-4ß-benzylthioether

Procyanidin B1

Procyanidin B3

Durch das Auftreten der dimeren Procyanidinen B2 (4,8-verknüfte Catechine) und B3 (4,6-verknüfte Catechine) ergibt sich eine Interflavan-Verknüfung über die Positionen 4⟹8 als auch 4⟹6. Diese Verknüfungstypen wurden auch über die 1H-NMR-Spektren der polymeren Proanthocyanidinen detektiert (Dubletts bei 6,49, 6,51, 6,85 ppm, entsprechend dem H-6 und H-8 der „oberen" Moleküleinheit, sowie Signale bei 5,35 und 5,42 ppm, entsprechend der Resonanz H-2 der „unteren" Einheit).

Ein Vorteil der galloylierten oligo- und polymeren Proanthocyanidine der vorliegenden Erfindung besteht in ihrer ausgeprägten Stabilität, die im Vergleich zu den unveresterten (nicht-galloylierten) Verbindungen deutlich erhöht ist. Gravierende Instabilitäten der unveresterten Verbindungen wurden von Rohr (Rohr G, 1999, Dissertation ETH Zürich, Diss. ETH No. 13020) beschrieben. Castillo et al. zeigen, dass die freie 3-OH-Gruppen des Flavan-3-ol-Polymerskeletts wichtige Funktionen im Rahmen der Radikalfängereigenschaft der unveresterten Procyanidine übernehmen (Castillo, J. et al., J. Agric. Food Chem. 48 (2000), 1738-45). Dies bedeutet, dass Oxidations-, Radikal- oder Strahlungsstress durch diese Procyanidine abgemildert werden kann, dies aber auf Grund der spezifischen Substanzeigenschaften zur Oxidation bzw. zur radikalischen Zerstörung des Procyanidins führen muss.

Diese schnellen Substanzdegradationen werden bei den galloylierten oligo- und polymeren Procyanidinen nicht beobachtet. Als stabilitätsrelevante analytische Parameter können insbesondere die Farbintensität, das mittlere Molekulargewicht sowie die UV-Adsorption der Verbindung herangezogen werden. Typische Degradationserscheinungen gehen mit einer Oxidation zu den entsprechenden o-Chinonen (also zu oxidierten Flavanolen) einher. Dies kann anhand der entsprechenden UV-Adsorptionen detektiert werden. Als Folgereaktion entstehen hochmolekulare, amorphe Pigmente von roter bis braunschwarzer Farbe, die sogenannten Phlobaphene. Entsprechende Reaktionen sind durch Veränderung der VIS-Adsorptionsspektren deutlich erkennbar (deutlicher Adsorptionsshift und Adsorptionszunahme zu 500 bis 610 nm).

Zum Nachweis der hohen Stabilität der zumindest teilweise galloylierten Proanthocyanidine wurde eine frisch gewonnen Probe gegenüber einem 2 Jahre bei Raumtemperatur (20-25°C) gelagertem Muster untersucht. Es ergaben sich UV-spektroskopisch keine relevanten Unterschiede.

Zur Untersuchung der Kurzzeitstabilität der Probe unter Stressbedingungen wurden UV-Spektren einer 1% Lösung bei pH 7, sowie im saueren Bereich (HCl 0,05 N), im alkklischen Milieu (NaOH 0,05 N) sowie unter oxidativen Bedingungen (3% H₂O₂) über 16 Stunden aufgenommen. Keine Veränderungen zeigten sich im neutralen und sauren Milieu sowie unter oxidativen Einflüssen. Deutliche Zersetzung wurde im alkalischen Bereich detektiert.

Somit zeigt sich eine ausgeprägte Stabilität der galloylierten oligo- und polymeren Proanthocyanidine, sowohl im sauren als auch im neutralen pH-Bereich.