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Dokumentenidentifikation DE69724943T2 15.07.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000890094
Titel MIKROHERGESTELLTER CHEMISCHER SENSOR AUF DIFFUSIONSBASIS
Anmelder University of Washington, Seattle, Wash., US
Erfinder WEIGL, H., Bernhard, Seattle, US;
YAGER, Paul, Seattle, US;
BRODY, P., James, Seattle, US;
HOLL, R., Mark, Seattle, US;
KENNY, Margaret, Edmonds, US;
SCHUTTE, David, Auburn, US;
HIXSON, Gregory, Seattle, US;
ZEBERT, Diane, M., Seattle, US;
KAMHOLZ, Andrew, Seattle, US;
WU, Caicai, Seattle, US;
ALTENDORF, Eric, Seattle, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69724943
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 31.03.1997
EP-Aktenzeichen 979360088
WO-Anmeldetag 31.03.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/05245
WO-Veröffentlichungsnummer 0097039338
WO-Veröffentlichungsdatum 23.10.1997
EP-Offenlegungsdatum 13.01.1999
EP date of grant 17.09.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.07.2004
IPC-Hauptklasse G01N 21/64
IPC-Nebenklasse G01N 35/08   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung im Rahmen des von der U.S. Army vergebenen militärischen Forschungsvertrages DAMD17-94-J-4460 gemacht. Die Regierung besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung.

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Mikrosensoren und Methoden für die Analyse der Anwesenheit und der Konzentration von kleinen Teilchen in Strömen, die die kleinen Teilchen und größere Teilchen enthalten, nach dem Diffusionsprinzip. Die Erfindung dient beispielsweise der Blutanalyse zum Detektieren des Vorliegens von kleinen Teilchen, wie zum Beispiel Wasserstoff-, Natrium- oder Calciumionen, in einem Zellen enthaltenden Strom.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In Maxwells berühmten Gedankenversuch betätigt ein Dämon eine Tür zwischen zwei Gaskästen gleicher Temperatur. Der Dämon sortiert die Moleküle und sammelt die schnelleren Moleküle in dem einen Kasten und die langsameren Moleküle in dem anderen Kasten, wobei er gegen die Grundgesetze der Thermodynamik verstößt. Dieses Paradoxon ist seither auf zahlreiche verschiedene Arten gelöst worden. Leff, H. S. und Rex, A. F. (1990) "Resource letter md-1: Maxwell's demon", Am. J. Physics 58: 201–209.

Eine ähnliche Anordnung kann verwendet werden, um Teilchen zu trennen. Man stelle sich ein Gemisch aus Teilchen zweier verschiedener Größen vor, die in einem Kasten in Wasser und in dem anderen Kasten in reinem Wasser suspendiert sind. Wenn der Dämon die Tür zwischen den Kästen schnell genug öffnet und schließt, so dass keines der größeren Teilchen Zeit hat, durch die Tür hindurch zu diffundieren, wenn er sie jedoch lange genug öffnet und schließt, so dass einige der kleineren Teilchen genug Zeit haben, in den anderen Kasten zu diffundieren, wird eine gewisse Trennung erreicht werden.

Vor kurzem wurden zwei Versuche durchgeführt, wobei ein räumlich asymmetrisches Potential bei Anwesenheit einer Anzahl Brownscher Teilchen angelegt wurde. Faucheux, L. S. et al. (1995) „Optical thermal ratchet", Physical Rev. Letters 74: 1504–1507; Rousselet, J. et al. (1994) "Directional motion of Brownian particles induced by a periodic asymmetric potential", Nature 370: 446–448.

Es wurde nachgewiesen, dass dies zu einer gerichteten Bewegung der Teilchen führt, wobei die Geschwindigkeit von dem Diffusionskoeffizienten abhängig ist. Ein Versuch (Rousselet, J. et al. (1994) "Directional motion of brownian particles induced by a periodic asymmetric potential", Nature 370: 446–448) verwendete mikrohergestellte Elektroden auf einem Objektträger zum Anlegen eines elektrischen Feldes für das Potential. Dieser Gedanke ist auch das Thema der Europäischen Patentschrift 645169 vom 29. März 1995 für "Separation of particles in a fluid using a saw-tooth electrode and an intermittent excitation field", Adjari A. et al. Der andere Versuch (Faucheux L. S. et al. (1995) "Optical thermal ratchet", Physical Rev. Letters 74: 1504–1507) verwendete eine modulierte optische Pinzetten-Versuchsanordnung.

Diffusion ist ein Prozess, der auf großtechnischer Ebene ohne weiteres vernachlässigt werden kann, der jedoch im Mikromaßstab durchaus zu einem wichtigen Faktor wird. Die durchschnittliche Zeit t, in der ein Molekül über eine Entfernung d diffundiert, beträgt t = d2/D, wobei D der Diffusionskoeffizient des Moleküls ist. Für ein Protein oder ein anderes großes Molekül ist die Diffusion im Makromaßstab relativ langsam (z. B. Hämoglobin bei D gleich 7 x 10–7 cm2/s in Wasser bei Raumtemperatur benötigt etwa 106 Sekunden (zehn Tage), um durch ein Ein-Zentimeter-Rohr zu diffundieren, jedoch etwa eine Sekunde, um durch einen Kanal von zehn Mikrometer zu diffundieren).

Unter Verwendung von von der Halbleiterindustrie zur Miniaturisierung der Elektronik entwickelten Werkzeugen ist es möglich, komplizierte Fluidsysteme mit Kanalgrößen von lediglich einem Mikrometer herzustellen. Diese Vorrichtungen können kostengünstig massengefertigt werden und sollen schon bald für einfache Analyseversuche verbreiteten Einsatz finden.

Ein als Feldflussfraktionierung (FFF) bezeichneter Prozess wurde verwendet, um Komponenten eines einzelnen Eingangsstromes in ein nicht auf Mikromaßstabsebene hergestelltes System, das jedoch Kanäle hat, die klein genug sind, um eine Laminarströmung zu erzeugen, zu trennen und zu analysieren. Verschiedene Felder, einschließlich von Konzentrationsgefällen, werden verwendet, um eine Kraft senkrecht zu der Strömungsrichtung zu erzeugen, um eine Trennung von Teilchen in dem Eingangsstrom zu bewirken. Siehe zum Beispiel Giddings, J. C., US-Patent 3,449,938, 17. Juni 1969 "Method for Separating and Detecting Fluid Materials"; Giddings, J. C., US-Patent 4,147,621, 3. April 1979, "Method and Apparatus for Flow Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 4,214,981, 29. Juli 1980 "Steric Field-Flow Fractionaton"; Giddings, J. C. et al., US-Patent 4,250,026, 10. Februar 1981 "Continuous Steric FFF Device for The Size Separation of Particles"; Giddings, J. C. et al. (1983) "Outlet Stream Splitting for Sample Concentration in Field-Flow Fractionation", Separation Science and Technology 18: 293–306; Giddings, J. C., (1985) "Optimized Field-Flow Fractionation System Based on Dual Stream Splitters", Anal. Chem. 57: 945–947; Giddings, J. C., US-Patent 4,830,756, 16. Mai 1989, "High Speed Separation of Ultra-High Molecular Weight Polymers by Hyperlayer Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 4,141,651, 25. August 1992, "Pinched Channel Inlet System for Reduced Relaxation Effects and Stopless Flow Injection in Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 5,156,039, 20. Oktober 1992, "Procedure for Determining the Size and Size Distribution of Particles Using Sedimentation Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 5,193,688, 16. März 1993, "Method and Apparatus for Hydrodynamic Relaxation and Sample Concentration in Field-Flow Fractionation Using Permeable Wall Elements"; Caldwell, K. D. et al., US-Patent 5,240,618, 31. August 1993, "Electrical Field-Flow Fractionation Using Redox Couple Added to Carrier Fluid"; Giddings, J. C., (1993), "Field-Flow Fractionation: Analysis of Macromolecular, Colloidal and Particulate Materials", Science 260: 1456–1465; Wada, Y. et al., US-Patent 5,465,849, 14. November 1995, "Column and Method for Separating Particles in Accordance with their Magnetic Susceptibility". Keine der genannten Literaturstellen beschreibt die Verwendung eines separaten Eingangsstromes, um von einem Teilchen enthaltenden Eingangsstrom diffundierte Teilchen zu erhalten.

Eine verwandte Methode der Teilchenfraktionierung ist der "Split Flow Thin Cell" (SPLITT) genannte Prozess. Siehe z. B. Williams, P. S. et al. (1992), "Continuous SPLITT Fractionation Based on a Diffusion Mechanism", Ind. Eng. Chem. Res. 31: 2172–2181; und J. C. Giddings, US-Patent 5,039,426. Diese Veröffentlichungen beschreiben Kanalzellen mit Kanälen, die ausreichend klein sind, um eine Laminarströmung zu erzeugen, haben jedoch auch wieder nur einen Eingangsstrom. Ein weiteres J. C. Giddings erteiltes Patent, das US-Patent Nr. 4,737,268, beschreibt eine SPLITT-Strömungszelle mit zwei Eingangsströmen (3); der zweite Eingangsstrom ist jedoch kein Indikatorstrom, sondern vielmehr ein teilchenfreier Strom. Das US-Patent 4,894,146 von Giddings beschreibt weiterhin eine SPLITT-Strömungszelle mit zwei Eingangsströmen, jedoch ohne Indikatorstrom. Alle genannten SPLITT-Strömungsmethoden erfordern die Anwesenheit von mehr als einem Ausgangsstrom zum Trennen der verschiedenen Teilchenfraktionen.

Die deutsche Patentanmeldung DE-A-4411266 beschreibt ein Analysenverfahren und ein Analysengerät zur Umsetzung des Verfahrens, wobei mehrere Proben nacheinander durch einen Reaktionskanal zu einem Detektor durchgeleitet werden. Wenigstens ein Reagens wird zwecks Reaktion mit den Proben in den Reaktionskanal eingeleitet. Jede Probe und die zugehörigen Reagenzien werden kontrolliert in den Reaktionskanal eingeleitet, so dass sie einen Block bilden. Entlang der Länge dieses Blockes ist das örtliche Mengenverhältnis zwischen Probe und Reagens, über ein Segment einer vorbestimmten Länge Bemittelt, im Wesentlichen konstant. Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass die Diffusion zwischen den beiden oder mehr Strömen von Proben und Reagenzien maximiert wird, während die Diffusion zwischen den Probenblöcken minimiert wird. Detektion erfolgt, wenn das Gleichgewicht zwischen Probe und Reagens erreicht wird, und im Ergebnis dessen wird der Detektor in einem Bereich über dem Kanal platziert, wo das Mischen abgeschlossen ist. Messstörung von größeren Teilchen wird eliminiert, indem ein Membransystem verwendet wird, das nur die zu analysierenden Teilchen einer zu analysierenden Substanz in den Analysenkanal eintreten lässt.

Keine der vorgenannten Veröffentlichungen beschreibt ein Kanalsystem, das in der Lage ist, kleine Teilchen in sehr geringen Probenmengen, die größere Teilchen enthalten, insbesondere größere Teilchen, die den für die Analyse verwendeten Indikator stören können, zu analysieren. Es werden keine Vorrichtungen oder Verfahren unter Verwendung von Indikatorströmen innerhalb des Zellensystems beschrieben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Mikrofluid-Vorrichtungen ermöglichen die Nutzung der Vorteile von Diffusion als raschem Trennmechanismus. Das Strömungsverhalten in Mikrostrukturen unterscheidet sich wesentlich von dem in der makroskopischen Welt. Aufgrund äußerst geringer Trägheitskräfte in solchen Strukturen ist praktisch die gesamte Strömung in Mikrostrukturen laminar. Dies ermöglicht die Bewegung von unterschiedlichen Schichten von Fluid und Teilchen nebeneinander in einem Kanal ohne Vermischung mit Ausnahme von Diffusion. Aufgrund des geringen seitlichen Abstandes in solchen Kanälen ist die Diffusion andererseits ein wirksames Mittel zur Trennung von Molekülen und kleinen Teilchen entsprechend ihrem Diffusionskoeffizienten, der seinerseits wiederum von ihrer Größe abhängig ist.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Kanalzellensystem zum Detektieren der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in einem Probenstrom bereit, der wie in Anspruch 1 definiert auch größere Teilchen beinhaltet.

In dem einfachsten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden ein einzelner Indikatorstrom und ein einzelner Probenstrom verwendet. Die Verfahren und die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können jedoch ebenso mehrfache Proben- und/oder Indikatorströme verwenden, ebenso wie Bezugs- oder Eichströme, die jeweils in einer Laminarströmung miteinander stehen.

Die bevorzugten Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung verwenden Flüssigkeitsströme, wenngleich die Verfahren und Vorrichtungen ebenso zur Anwendung mit gasförmigen Strömen geeignet sind. Der Ausdruck "Fluidverbindung" bedeutet, dass Fluid zwischen den zwei oder mehr Elementen strömt, die in einer Fluidverbindung miteinander stehen.

Der Ausdruck "Detektion" bei Verwendung in dieser Schrift bedeutet die Bestimmung, dass eine bestimmte Substanz anwesend ist. Üblicherweise wird die Konzentration einer bestimmten Substanz bestimmt. Die Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können genutzt werden, um die Konzentration einer Substanz in einem Probenstrom zu bestimmen.

Das Kanalzellensystem der vorliegenden Erfindung kann ein externes Detektionsmittel zum Detektieren von Änderungen in einer Indikatorsubstanz beinhalten, die in einem Indikatorstrom als Ergebnis von Kontakt mit Teilchen einer zu analysierenden Substanz geführt wird. Detektion und Analyse erfolgen mittels beliebiger nach dem Stand der Technik bekannter Mittel, einschließlich optischer Mittel, wie zum Beispiel optischer Spektroskopie, und anderer Mittel, wie zum Beispiel Absorptionsspektroskopie oder Fluoreszenz, mittels chemischer Indikatoren, die die Farbe oder andere Eigenschaften verändern, wenn sie der zu analysierenden Substanz ausgesetzt werden, mittels immunologischer Mittel, elektrischer Mittel, wie zum Beispiel in die Vorrichtung eingesetzter Elektroden, elektrochemischer Mittel, radioaktiver Mittel bzw. mittels praktisch beliebiger nach dem Stand der Technik bekannter mikroanalytischer Verfahren, einschließlich von magnetischen Resonanzverfahren oder anderen nach dem Stand der Technik bekannter Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit einer zu analysierenden Substanz, wie zum Beispiel Ionen, Moleküle, Polymere, Viren, DNA-Sequenz, Antigene, Mikroorganismen oder sonstige Faktoren. Vorzugsweise werden optische oder fluoreszierende Mittel und Antikörper, DNA-Sequenzen und ähnliches, angebracht an fluoreszierenden Markierern, eingesetzt.

Der Ausdruck "Teilchen" bezieht sich auf beliebige suspendierte Partikel, einschließlich von Molekülen, Zellen, suspendierten und aufgelösten Teilchen, Ionen und Atomen.

Der Eingangsstrom kann ein beliebiger Strom sein, der Teilchen der gleichen oder unterschiedlicher Größe enthält, wie zum Beispiel Blut und andere Körperflüssigkeiten, verunreinigtes Trinkwasser, verunreinigte organische Lösungsmittel, Urin, biotechnologische Prozessproben, wie zum Beispiel Fermentationsbrühe und ähnliches. Die zu analysierende Substanz kann ein beliebiges kleineres Teilchen in dem Eingangsstrom sein, das in der Lage ist, in den Indikatorstrom der Vorrichtung hinein zu diffundieren, wie zum Beispiel Wasserstoff-, Calcium- oder Natriumionen, Proteine, wie zum Beispiel Albumin, organische Moleküle, Arzneimittel, Pestizide und andere Teilchen. Wenn der Probenstrom in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel Vollblut ist, diffundieren kleine Ionen, wie zum Beispiel Wasserstoff oder Natrium, rasch durch den Kanal, während größere Teilchen, wie zum Beispiel die großer Proteine, Blutzellen etc., langsam diffundieren. Vorzugsweise sind die Teilchen einer zu analysierenden Substanz nicht größer als etwa drei Mikrometer, insbesondere vorzugsweise nicht größer als etwa 0,5 Mikrometer, bzw. sie sind nicht größer als etwa 1.000.000 MW, insbesondere vorzugsweise nicht größer als etwa 50.000 MW.

Das System kann ebenso einen Indikatorstrom beinhalten, der in eines der Eingangsmittel eingeleitet wird, die einen Flüssigkeitsträger umfassen, der Teilchen einer zu analysierenden Substanz enthält, wie zum Beispiel Polymere oder Kügelchen mit einer darauf immobilisierten Indikatorsubstanz. Das System kann weiterhin einen Strom einer zu analysierenden Substanz enthalten, der aus Substratteilchen besteht, wie zum Beispiel Polymerkügelchen, Antikörper und ähnliches, auf dem eine Indikatorsubstanz immobilisiert ist. Der Flüssigkeitsträger kann ein beliebiges Fluid sein, das in der Lage ist, Teilchen anzunehmen, die von dem Speisestrom diffundieren und eine Indikatorsubstanz enthalten. Bevorzugte Indikatorströme sind unter anderem Wasser und isotonische Lösungen, wie zum Beispiel Salzwasser mit einer Salzkonzentration von etwa 10 mM NaCl, KCl oder MgCl, oder organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Aceton, Isopropylalkohol, Ethylalkohol oder beliebige andere Flüssigkeiten, die nicht die Wirkung der zu analysierenden Substanz an der Indikatorsubstanz oder dem Detektionsmittel stören.

Die Kanalzelle kann durch nach dem Stand der Technik bekannte Mikrofertigungsverfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch ein hierin beispielhaft genanntes Verfahren der Ausbildung von Kanälen in einem Silizium-Mikrochip, wie beispielsweise durch das Ätzen von Rillen in die Oberfläche des Silizium-Mikrochips und das Platzieren einer Glasabdeckung auf der Oberfläche. Präzisionsspritzgießen kann ebenfalls für die Fertigung eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll so ausgeführt werden, dass die gesamte Strömung laminar ist. Normalerweise wird dies in einer Vorrichtung erreicht, die Mikrokanäle einer solchen Größe umfasst, dass die Reynoldssche Zahl für Strömung in dem Kanal unter etwa 1 liegt, vorzugsweise unter etwa 0,1. Die Reynoldssche Zahl ist das Verhältnis von Trägheit zu Viskosität. Eine niedrige Reynoldssche Zahl bedeutet, dass Trägheit im Wesentlichen vernachlässigbar ist und dass die Strömung der beiden benachbarten Ströme laminar ist, d. h. die Ströme vermischen sich nicht zur Diffusion von Teilchen wie oben beschrieben. Strömung kann mit einer Reynoldsschen Zahl von größer 1 laminar sein. Jedoch entwickeln solche Systeme rasch Turbulenz, wenn das Strömungsbild gestört wird, zum Beispiel wenn sich die Strömungsgeschwindigkeit eines Stromes ändert oder wenn sich die Viskosität eines Stromes ändert.

Der Laminarströmungskanal ist lang genug, um kleinen Teilchen einer zu analysierenden Substanz zu ermöglichen, von dem Probenstrom zu diffundieren und eine detektierbare Wirkung auf eine Indikatorsubstanz oder ein Detektionsmittel zu haben, vorzugsweise wenigstens etwa 2 mm lang. Die Länge des Strömungskanals ist von seiner Geometrie abhängig. Der Strömungskanal kann gerade oder beliebig gekrümmt sein. In einem Ausführungsbeispiel kann der Strömungskanal eine oder mehrere "Haarnadelkurven" beinhalten, wodurch sich eine enge Treppenstufengeometrie ergibt. In einem anderen Ausführungsbeispiel kann der Strömungskanal die Form einer Spule aufweisen, wie bei einem sauber aufgewickelten Gartenschlauch. Nichtgerade Kanalgeometrien ermöglichen eine Erhöhung der Länge des Strömungskanals, ohne die Größe/den Durchmesser der Substratplatte, in der der Kanal ausgebildet ist, wie z. B. ein Silizium-Mikrochip, zu erhöhen. Der Diffusionskoeffizient der zu analysierenden Substanz, der üblicherweise umgekehrt proportional zu der Größe der zu analysierenden Substanz ist, beeinflusst die gewünschte Länge des Strömungskanals. Für eine gegebene Strömungsgeschwindigkeit benötigen Teilchen mit kleineren Diffusionskoeffizienten einen längeren Strömungskanal, um entsprechend Zeit zu haben, um in den Indikatorstrom zu diffundieren.

Alternativ dazu, um mehr Zeit für Diffusion bereitzustellen, kann die Strömungsgeschwindigkeit herabgesetzt werden. Mehrere Faktoren begrenzen jedoch die kleinste Strömungsgeschwindigkeit und machen daher einen längeren Strömungskanal in einigen Fällen wünschenswert. Erstens wird die Strömungsgeschwindigkeit durch Pumpmittel oder eine Druckquelle erzielt, von denen einige keinen so niedrigen Druck und keine so niedrige Strömungsgeschwindigkeit erzeugen können, wie dies wünschenswert sein kann, um ausreichend Zeit für Diffusion von Teilchen mit niedrigem Diffusionskoeffizienten zur Verfügung zu stellen. Zweitens, wenn die Strömungsgeschwindigkeit hinreichend gering ist und einige Teilchen von signifikant unterschiedlicher Dichte im Vergleich zu den umgebenden Fluidströmen sind, können Teilchen mit einer höheren Dichte als die umgebenden Fluidströme auf den Boden des Strömungskanals absinken, und Teilchen mit einer geringeren Dichte als die umgebenden Fluidströme können zu dem Oberteil des Strömungskanals aufschwimmen. Vorzugsweise soll die Strömungsgeschwindigkeit ausreichend groß sein, damit hydrodynamische Kräfte im Wesentlichen Teilchen daran hindern, an dem Boden, dem Oberteil oder den Wänden des Strömungskanals haften zu bleiben. Drittens führt eine geringe Änderung des Druckes zu größeren Fehlern in der Messgenauigkeit bei kleineren Strömungsgeschwindigkeiten. Viertens können bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten andere Faktoren, wie zum Beispiel Änderungen der Viskosität bei Fluiden, zu größeren Fehlern in der Messgenauigkeit führen.

Der Strömungskanal kann gerade oder nichtgerade sein, zum Beispiel gewunden. Ein gewundener Strömungskanal, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Strömungskanal, der nicht gerade ist. Ein gewundener Kanal kann beispielsweise in einer Spiralform gewunden sein oder eine Vielzahl von "Haarnadelkurven" umfassen, wodurch sich eine Rechteckwellenform ergibt. Gewundene Kanäle bieten längere Entfernungen für das Auftreten von Diffusion, wodurch zu analysierende Substanzen mit größeren Diffusionskoeffizienten, z. B. üblicherweise größere zu analysierende Substanzen, gemessen werden können. Bei den erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsbeispielen, bei denen ein Silizium-Mikrochip die Substratplatte ist, in der der Strömungskanal ausgebildet wird, beträgt die Kanallänge eines geraden Strömungskanals zwischen etwa 5 mm und etwa 50 mm. Bei den erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsbeispielen, bei denen der Strömungskanal gewunden ist, d. h. nichtgerade ist, wird die Länge des Strömungskanals lediglich durch die Größe des Mikrochips bzw. einer anderen Substratplatte, in die der Kanal geätzt oder auf andere Weise ausgebildet wird, definiert bzw. begrenzt. Die Kanalbreite (Diffusionsrichtung) beträgt vorzugsweise zwischen etwa 20 Mikrometern und etwa 1 mm. Der Kanal wird vorzugsweise breiter gebildet, zum Beispiel wenigstens etwa 200 Mikrometer, wodurch die Messung der Indikatorfluoreszenz mit einfachen optischen Systemen erleichtert wird und wodurch das Verstopfen des Kanals durch Teilchen reduziert wird. Jedoch kann der Kanal so eng wie möglich ausgebildet werden, solange ein Verstopfen mit den verwendeten Teilchen vermieden wird. Wenn die Breite des Kanals verringert wird, tritt Diffusion rascher auf, und damit kann Detektion rascher erfolgen. Die Kanalhöhe ist ausreichend gering, um darin Laminarströmung zweier Ströme zu ermöglichen, vorzugsweise nicht größer als etwa 1000 Mikrometer und insbesondere vorzugsweise zwischen etwa 50 Mikrometer und etwa 400 Mikrometer.

Bei einigen Ausführungsbeispielen kann der Laminarströmungskanal ausreichend lang sein, so dass der Indikatorstrom und der Probenstrom ein Gleichgewicht in Bezug auf die Teilchen einer zu analysierenden Substanz in dem Kanal erreichen. Gleichgewicht stellt sich ein, wenn der größte Betrag kleinerer Teilchen in den Indikatorstrom diffundiert ist.

Das System kann auch einen Probenkanal und Auslassmittel, wie zum Beispiel kleinere Kanäle für Durchleiten von Probenströmen von dem Indikatorstrom in aufeinanderfolgenden Intervallen über die Länge des Laminarströmungskanals, und Mittel, einschließlich von Ansichtsfenstern und Fluoreszenzdetektoren zum Messen von Änderungen in der Indikatorsubstanz in einem jeden Probenstrom umfassen, wobei die Konzentration der zu analysierenden Substanz in dem Probenstrom bestimmt werden kann.

Doppeldetektions-Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die die Detektion sowohl ungelöster als auch gelöster zu analysierender Substanzen ermöglichen, werden ebenfalls bereitgestellt. Detektion sowohl ungelöster als auch gelöster zu analysierender Substanzen kann in einer Doppeldetektions-Vorrichtung erzielt werden: gelöste Teilchen können in dem Strömungskanal des T-Sensors detektiert werden, und ungelöste Teilchen können in einem V-Rillenkanal oder Hüllenflussmodul detektiert werden, von denen eines oder beide in Fluidverbindung mit einem T-Sensor-Strömungskanal stehen kann oder können. Verzweigte Strömungskanäle können Fluidverbindung zwischen einem T-Sensor-Strömungskanal und einem V-Rillen-Kanal und/oder Hüllenflussmodul bereitstellen.

Die erfindungsgemäßen Kanalzellensysteme können in Fluidverbindung mit einem V-Rillen-Strömungskanal stehen, der vorzugsweise an dem Oberteil eine Breite hat, die klein genug ist, um die Teilchen in eine einzelne Reihe zu zwingen, die jedoch groß genug ist, damit die größten Teilchen durchgeleitet werden, ohne den Kanal zu verstopfen. V-Rillenkanäle werden durch Ätzen von Einkristall-Silizium-Mikrochips mit anisotropem Ethylendiamin-Brenzcatechin-Wasser (EPW) ausgebildet, so dass Zugang zu Spiegelebenen mit präzise geätzten Winkeln in Bezug auf die Oberfläche des Mikrochips gegeben ist (Petersen, Proc. IEEE 70 (5): 420–457, 1982). (US-Patent Nr. 5,726,751 "Silicon Microchannel Optical Flow Cytometer", eingereicht am 27. September 1995 beschreibt ein Durchfluss-Zytometer mit einem V-Rillen-Strömungskanal, der durch Mikrobearbeitung eines Silizium-Mikrochips ausgebildet wird.) Der Querschnitt eines solchen Kanals ist wie ein Buchstabe V beschaffen und der Kanal wird demzufolge als V-Rillenkanal bezeichnet. Ein optischer Kopf mit einem Laser sowie mit klein- und großwinkeligen Photodetektoren, die für den Einsatz mit einem V-Rillenkanal angepasst sind, können ebenfalls verwendet werden. Wie in dem US-Patent Nr. 5,726,751 beschrieben, können Detektoren, die in kleinen und großen Winkeln in Bezug auf den Teil des Sondenstrahls, der von der V-Rillenwand reflektiert wird, angeordnet sind, verwendet werden, um Teilchen, wie zum Beispiel Zellen, zu zählen und diese nach Größe (über Kleinwinkeldetektor) und Gefüge/Morphologie (über Großwinkeldetektor) zu unterscheiden. Unter Verwendung einer geeigneten Laser- oder LED-Quelle, wie zum Beispiel Blaulaser, die vom Durchschnittsfachmann standardmäßig bestimmt werden kann, kann Fluoreszenzdetektion durchgeführt werden, indem ein geeignetes Filter vor den Großwinkeldetektor gesetzt wird.

Der Strömungskanal des T-Sensors kann in Fluidverbindung mit einem V-Rillenkanal stehen und somit Doppeldetektion von gelösten und ungelösten einreihigen Teilchen mit einer Vorrichtung ermöglichen. Die Fluidströme können zuerst durch einen T-Sensor-Strömungskanal und danach über verzweigte Strömungskanäle durch einen V-Rillenkanal strömen. Alternativ dazu kann der Fluidstrom zuerst durch einen V-Rillenkanal und danach durch einen T-Sensor-Strömungskanal strömen.

Ein alternatives Mittel zum Erreichen eines einreihigen Teilchenstroms durch einen Strömungskanal ist das Hüllenflussmodul, das in dem am 26. März 1997 eingereichten US-Patent Nr. 6,159,739 "Device and Method for 3-Dimensional Alignment of Particles in Microfabricated Flow Channels" offengelegt wird. Das Hüllenflussmodul umfasst eine erste Platte aus Material, in dem ein Laminarströmungskanal ausgebildet ist; wenigstens zwei Einlässe, wobei jeder Einlass an einer Verzweigungsstelle mit dem Laminarströmungskanal verbunden ist; und einen Auslass von dem Strömungskanal. Eine zweite Platte, wie zum Beispiel eine transparente Abdeckplatte, dichtet das Modul ab und ermöglicht optische Messungen mittels Reflexion in Fällen, in denen die erste Platte aus einem reflektierenden Material besteht, wie zum Beispiel aus Silizium. Ein erster Einlass ermöglicht das Einleiten eines ersten Fluids in den Strömungskanal. Das erste Fluid ist das Hüllenfluid. Ein zweiter Einlass ermöglicht das Einleiten eines zweiten Fluids in das Hüllenfluid, wenn dieses durch den Strömungskanal strömt. Das zweite Fluid ist das Mittelfluid. Da die zweite Einlassverbindung enger ist als die erste Einlassverbindung, wird das Mittelfluid auf beiden Seiten von dem Hüllenfluid umgeben. Nachdem alle Fluide eingeleitet worden sind und Hüllenströmung erreicht worden ist, kann die Höhe des Strömungskanals verringert werden, was zu vertikaler hydrodynamischer Scharfeinstellung führt. Wahlweise kann die Breite des Strömungskanals verringert werden. Die Verringerung der Höhe bzw. der Breite kann schrittweise oder sprunghaft erfolgen. Die hydrodynamische Scharfeinstellung in dem Hüllenflussmodul führt zu einreihiger Teilchenströmung.

Das Hüllenflussmodul kann in Fluidverbindung mit dem Kanalzellensystem der vorliegenden Erfindung stehen. Die Fluidströme können zuerst durch einen T-Sensor-Strömungskanal und danach durch ein Hüllenflussmodul strömen. Alternativ dazu kann der Fluidstrom zuerst durch ein Hüllenflussmodul und danach durch einen T-Sensor-Strömungskanal strömen.

Das Kanalzellensystem eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung umfasst Kanalrillen in Form eines "T" oder eines "Y" mit einer Mittelrinne und zwei Verzweigungen, die in die Oberfläche eines Silizium-Mikrochips eingeätzt sind, wobei die Oberfläche danach mit einer Glasscheibe abgedeckt wird. Die Mittelrille wird aus der Rinne des "T" bzw. "Y" ausgebildet, und die Verzweigungen sind Einlassmittel in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal zum Durchleiten des Probenstromes und Indikatorstromes in den Laminarströmungskanal.

Erfindungsgemäße Kanalzellen können ebenso Mehrfacheinlassverzweigungen in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal zum Leiten einer Vielzahl von Einlassströmen in den Kanal umfassen. Diese können in einer "kronleuchterartigen" Anordnung oder aufeinanderfolgend entlang einer "Traverse" für das "T" bzw. die Verzweigungen der "Y"-Konfiguration angeordnet sein, wobei einzig die Einschränkung gilt, dass Laminarströmung aller Ströme aufrecht erhalten werden muss.

Einlassmittel umfassen die Einlasskanäle oder "Verzweigungen" und können weiterhin andere Mittel umfassen, wie beispielsweise Rohre, Spritzen und ähnliches, die Mittel zum Einspritzen von Speisefluid in die Vorrichtung bereitstellen. Auslassmittel umfassen Sammelanschlüsse und/oder Mittel zum Entfernen von Fluid aus dem Auslass, einschließlich von Auffangbehältern, Strömung durch Kapillarwirkung induzierende Mittel, Druck, Schwerkraft und andere bekannte Mittel. Die Auffangbehälter können Bestandteil einer Analysen- oder Detektionsvorrichtung sein.

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung, die optische Messungen in Transmission ermöglichen, werden bereitgestellt. Bei solchen Ausführungsbeispielen bildet das Kanalzellensystem bzw. wenigstens der Detektionsbereich der zu analysierenden Substanz die Breite der Substratplatte, in der das Kanalzellensystem ausgebildet ist. Die erfindungsgemäße Substratplatte betrifft den Teil von Material, in dem das erfindungsgemäße Kanalzellensystem ausgebildet ist, wie zum Beispiel eine Siliziumscheibe und eine Kunststofffolie. Der Detektionsbereich für zu analysierende Substanz und wahlweise andere Teile des Kanalzellensystems liegen zwischen optisch transparenten Platten in einem Raum, der sich durch die gesamte Breite der Substratplatte zieht. Der erfindungsgemäße Detektionsbereich für zu analysierende Substanz betrifft den Teil des Indikatorstroms, in dem Teilchen der zu analysierenden Substanz eine detektierbare Änderung in dem Indikatorstrom erzeugen.

Optische Messungen unter Nutzung von Reflexlicht werden hierin als Detektion durch Reflexion bezeichnet, wohingegen optische Messungen unter Nutzung von Durchlicht hierin als Detektion durch Transmission bezeichnet werden.

Ein Verfahren wird weiterhin wie im Anspruch 10 definiert für Detektion der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in einem Probenstrom bereitgestellt.

Die Strömungsgeschwindigkeit der Eingangsströme liegt vorzugsweise zwischen etwa 5 Mikrometern/Sekunde und etwa 5000 Mikrometern/Sekunde, insbesondere vorzugsweise bei etwa 25 Mikrometern/Sekunde. Vorzugsweise ist die Strömungsgeschwindigkeit für beide Ströme gleich.

Das erfindungsgemäße Verfahren und System umfassen die Bestimmung der Konzentration der Teilchen einer zu analysierenden Substanz in dem Probenstrom durch Detektieren der Position von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in dem Laminarströmungskanal, die in den Indikatorstrom diffundieren und dabei eine detektierbare Änderung in dem Indikatorstrom bzw. in einer Indikatorsubstanz in dem Indikatorstrom verursachen. Der Probenstrom und der Indikatorstrom können auch in dem Laminarströmungskanal ein Gleichgewicht erreichen lassen. Der Ort der Grenze des Detektionsbereiches (d. h. der Teil des Indikatorstroms, der diffundierte Teilchen in einer detektierbaren Konzentration enthält) mit dem nicht beeinflussten Indikatorstrom kann verwendet werden, um Informationen zu Strömungsgeschwindigkeit und/oder Probenkonzentration bereitzustellen. Der physische Ort dieser Grenze in dem Kanal für eine gegebene zu analysierende Substanz bleibt über die Zeit gleich, solange die Strömungsgeschwindigkeit konstant ist und die Probe unverändert ist. Der Ort und die Größe des Detektionsbereiches können nur durch Verändern der Strömungsgeschwindigkeit und/oder der Konzentration einer Indikatorsubstanz verändert werden, um das Signal für Detektion zu optimieren.

Für die Bestimmung der Konzentration der Teilchen einer zu analysierenden Substanz zweckdienliche Informationen können erhalten werden, indem Mittel zum Leiten von Probenströmen von dem Indikatorstrom in aufeinanderfolgenden Intervallen entlang der Länge des Laminarströmungskanals bereitgestellt werden, wie zum Beispiel kleinere Kanäle, die mit Ansichtsfenstern wie hierin beschrieben ausgerüstet sind. Detektionsmittel wie die oben genannten werden verwendet, um Signale von dem Indikatorstrom zu messen. Änderungen in der Intensität der Signale von Probenkanal zu Probenkanal können verwendet werden, um die Konzentration der Teilchen einer zu analysierenden Substanz in der Originalprobe zu berechnen.

Das Verfahren eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung einer Indikatorsubstanz, die auf einem Teilchensubstrat immobilisiert ist, die in dem Indikatorstrom getragen wird. Die Indikatorsubstanz ist vorzugsweise eine Substanz, die sich bei Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz, wie zum Beispiel einem Farbstoff, Enzymen oder anderen organischen Molekülen, die ihre Eigenschaften in Abhängigkeit von der Konzentration der zu analysierenden Substanz ändern, in der Fluoreszenz bzw. in der Farbe verändern. Der Ausdruck "Indikatorsubstanz" wird auch verwendet, um polymere Kügelchen, Antikörper oder ähnliches zu bezeichnen, auf denen Farbstoffe oder andere Indikatoren immobilisiert sind. Es ist nicht notwendig, dass der Indikatorstrom eine Indikatorsubstanz umfasst, wenn Detektionsmittel, wie zum Beispiel solche, die direkt elektrische, chemische oder andere Änderungen in dem Indikatorstrom, die durch die Teilchen der zu analysierenden Substanz detektieren, verwendet werden.

Vorteile dieses Systems sind unter anderem der Umstand, dass zu analysierende Substanzen optisch in trüben und stark gefärbten Lösungen, wie zum Beispiel Blut, ohne die Notwendigkeit der vorhergehenden Filterung oder des vorhergehenden Schleuderns bestimmt werden können; Querempfindlichkeiten von Indikatorfarbstoffen gegenüber größeren Probenkomponenten (ein häufiges Problem) können vermieden werden; und der Indikator kann in einer Lösung gehalten werden, in der er seine optischen Merkmale darstellt (z. B. Querempfindlichkeiten gegenüber pH-Wert oder Ionenstärke können unterdrückt werden, indem stark gepufferte Lösungen verwendet werden). Messungen des Indikatorstroms an verschiedenen Orten entlang des Kanals können einige verbleibende Querempfindlichkeiten kompensieren. Zusätzlich kann der Strömungskanal breit sein, wodurch es leicht ist, die Indikatorfluoreszenz mit einfachen optischen Systemen zu messen. Es wird keine Membran benötigt; das System ist weniger anfällig gegenüber biologischem Bewuchs und Verstopfung als Membransysteme. Das System kann auch dahingehend eingestellt werden, dass die Konzentration des Proben- bzw. Indikatorstroms und/oder die Strömungsgeschwindigkeiten variiert werden können, um das zu detektierende Signal zu optimieren. Wenn eine Reaktion zum Beispiel etwa fünf Sekunden benötigt, kann das System so eingestellt werden, dass die Reaktion in dem Mittelteil der Vorrichtung zu sehen ist.

Das Verfahren kann durch kontinuierlichen Durchfluss des Probenstroms und des Indikatorstroms durchgeführt werde. Der stabile Zustand dieses Verfahrens ermöglicht längere Signalintegrationszeiten.

Der Probenstrom kann größere Teilchen als die Teilchen einer zu analysierenden Substanz enthalten, die auch empfindlich gegenüber der Indikatorsubstanz sind. Diese diffundieren nicht in den Indikatorstrom und stören somit die Detektion der zu analysierenden Substanz nicht.

Zusätzlich wird ein Verfahren zum Bestimmen kinetischer Geschwindigkeitskonstanten wie in Anspruch 12 definiert bereitgestellt. Normalerweise werden kinetische Messungen durchgeführt, indem eine physikalische Eigenschaft in Bezug auf Konzentration über Zeit, d. h. Reaktionszeit, aufgezeichnet werden. Das hierin bereitgestellte Verfahren zur Durchführung kinetischer Messungen in Abhängigkeit von der von dem Probenstrom und dem Indikatorstrom zurückgelegten Entfernung anstelle von Abhängigkeit von Zeit ist aus den folgenden Gründen vorteilhaft. Die Bestandteile der Ströme, d. h. die Teilchen, und ihre Konzentration an einer gegebenen Position des Strömungskanals bleiben konstant, solange die Strömungsgeschwindigkeit konstant ist. Dieses Verfahren ermöglicht die Integration der Daten von der Detektion, z. B. optische Messungen, über Zeit, wobei sich die Genauigkeit der gesammelten Daten und somit der berechneten/bestimmten Geschwindigkeitskonstanten erhöht. Wenn weiterhin ein Versuchsfehler zu einer gegebenen Zeit während der Detektion auftritt, wie z. B. bei der Datenerfassung, kann man einfach die Detektionsmessung an der Position/der Entfernung in dem Strömungskanal, an der der Fehler aufgetreten ist, erneut durchführen. Wenn bei bekannten Verfahren kinetischer Messungen Daten an einem gegebenen Zeitpunkt aufgrund eines Versuchsfehlers verloren gehen, können diese Daten während des gleichen Versuches nicht erneut erfasst werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine Schemazeichnung von Strömung und Diffusion in dem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung mit T-Sensor-Kanalzellen.

2 ist eine Fluoreszenzmikrofotografie eines T-Sensors der vorliegenden Erfindung, wobei eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9 (rechter Einlass) in Richtung der Vorrichtung strömt und eine schwach gepufferte Indikatorfarbstofflösung (pH-Wert 5) von links eintritt. Die klar erkennbare Umwandlung des Farbstoffes von einer Form in die andere mit fortschreitender Diffusion ist deutlich sichtbar.

3 zeigt die Auslegung des Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung mit dem Ansichtsfenster-T-Sensor. Bei diesem Ausführungsbeispiel kommt der Indikatorstrom von dem rechten T-Schenkel und es handelt sich dabei um eine Lösung eines Indikatorfarbstoffes in einem Puffer mit pH-Wert 9 und geringer Ionenstärke. Der hier von links eingeleitete Probenstrom ist eine Pufferlösung 0,15 M mit einem pH-Wert von 5. Mehrere Teile des Indikatorstroms, der einen Indikatorfarbstoft enthält, werden kontinuierlich an verschiedenen Orten als Probenstrom aus dem Kanal entnommen.

4 zeigt einen an einen optischen Kopf und Durchfluss-Zytometer gekoppelten V-Rillenkanal.

5 zeigt einen gewundenen Strömungskanal in Rechteckwellenform.

6 zeigt einen gewundenen Strömungskanal in gewendelter Form.

7A zeigt einen T-Sensor mit einem gerundeten T-Stoß.

7B zeigt einen Ansichtsfenster-T-Sensor mit einem gerundeten T-Stoß.

8 zeigt einen gewundenen Strömungskanal mit einer Vielzahl von Detektionsbereichen zur Durchführung kinetischer Messungen in Abhängigkeit von der Entfernung.

9, umfassend die 9A bis 9C, zeigt Ausführungsbeispiele mit verzweigten Strömungskanälen für Doppeldetektion von gelösten und ungelösten zu analysierenden Substanzen.

10, umfassend die 10A bis 10C, zeigt ein Hüllenflussmodul.

11 zeigt einen T-Sensor, bei dem der Detektionsbereich für zu analysierende Substanz über die gesamte Breite der Substratplatte geätzt ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Mikromaßstabs-Kanalzellen der vorliegenden Erfindung dienen der Trennung kleinerer Teilchen von größeren Teilchen in einem Probenstrom ausgehend von der Tatsache, dass der Diffusionskoeffizient eines Teilchens im Wesentlichen umgekehrt proportional zu der Größe des Teilchens ist, so dass größere Teilchen langsamer diffundieren als kleinere Teilchen; von der Tatsache, dass Diffusion in dem Mikromaßstab der vorliegenden Erfindung rascher eintritt als in bekannten Trennvorrichtungen größeren Maßstabs; und von der Tatsache, dass laminare, turbulenzfreie Strömung in dem Mikromaßstab in angrenzenden Strömen induziert werden kann.

Wie in 1 gezeigt, wird eine Kanalzelle in der Form eines "T" bereitgestellt, die als T-Sensor 10 bezeichnet wird. Die Vorrichtung kann durch Ätzen auf einem Silizium-Mikrochip mikrohergestellt werden. Die Geometrie muss nicht unbedingt ein "T" sein, sondern kann ebenso ein "Y" sein. Ein beliebiger Winkel, der hergestellt werden kann, genügt ebenso. Wie oben diskutiert, kann es eine Vielzahl von Eingangskanälen geben. Es ist lediglich notwendig, dass sich alle Eingangskanäle zu einem einzigen Strömungskanal vereinigen und dass alle Kanäle hinreichend klein sind, damit Laminarströmung unter allen Betriebsbedingungen aufrecht erhalten wird. Normalerweise ist die Reynoldssche Zahl des Systems kleiner als 1. Die Probe, die kleine zu untersuchende Moleküle, den Probenstrom 80, enthält, wird durch den Probenstrom-Einlassstutzen 30 in die Vorrichtung eingeleitet, von wo sie in den Probenstromeinlasskanal 50 strömt, wo sie als Probeneinlassstrom 55 bezeichnet wird. Ein Indikatorstrom 70 wird in den Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 gebracht, von wo er in den Indikatorstrom-Einlasskanal 40 strömt, wo er als Indikatoreinlassstrom 45 bezeichnet wird.

Der Probeneinlassstrom 55 trifft an dem T-Stoß 58 an dem Beginn des Strömungskanals 100 auf den Indikatoreinlassstrom 45, und die beiden Ströme strömen in paralleler Laminarströmung als Indikatorstrom 70 und Probenstrom 80 zu dem Ausgangsstutzen 60. Der Indikatorstrom 70 enthält eine Indikatorsubstanz, wie zum Beispiel einen Farbstoff, der mit den Teilchen einer zu analysierenden Substanz in dem Probenstrom 80 durch eine detektierbare Änderung der physikalischen Eigenschaften reagiert. Der Indikatorstrom 70 ist in 1 in weiß dargestellt. Aufgrund der niedrigen Reynoldsschen Zahl in dem kleinen Strömungskanal 100 tritt keine durch Turbulenz verursachte Vermischung auf und die beiden Ströme strömen parallel zueinander, ohne sich zu vermischen. Aufgrund der beteiligten kurzen Entfernungen wirkt Diffusion jedoch rechtwinklig zu der Strömungsrichtung, und die Probenkomponenten (Teilchen einer zu analysierenden Substanz) diffundieren nach links in den Indikatorstrom 70 und werden schließlich gleichmäßig über die Breite des Strömungskanals 100 in gleichen Diffusionsbereichen von Teilchen zu analysierender Substanz 120 verteilt.

Der Indikatorstrom 70 strömt in den Strömungskanal 100, um einen anfänglichen Bezugsbereich 85 auszubilden, in den noch keine Teilchen einer zu analysierenden Substanz diffundiert sind. Teilchen einer zu analysierenden Substanz von dem Probenstrom 80, die noch nicht in den Indikatorstrom 70 diffundiert sind, bilden einen Detektionsbereich 90 für zu analysierende Substanz, wo Teilchen einer zu analysierenden Substanz eine detektierbare Änderung in dem Indikatorstrom 70 erzeugen, vorzugsweise durch Bewirken einer detektierbaren Änderung der Eigenschaft einer Indikatorsubstanz in dem Indikatorstrom 70. Teilchen einer Indikatorsubstanz, zum Beispiel Farbstoffteilchen, können ebenfalls in den Probenstrom 80 diffundieren, um einen diffundierten Indikatorbereich 110 auszubilden. Wenn diese Änderung der lokalen Konzentration der Indikatorsubstanz bei einigen Anwendungen ein Problem darstellt, kann ihre Diffusionsgeschwindigkeit durch Immobilisierung auf Polymeren oder Kügelchen, wie zum Beispiel Indikatorkügelchen 130, willkürlich klein gemacht werden.

In dem T-Sensor 10 aus 1 werden ein Probenstrom 80, wie zum Beispiel Blut, und ein Indikatorstrom 70, der einen Indikatorfarbstoff enthält, an dem Schnittpunkt des Probenstrom-Einlasskanals 50 und des Indikatorstrom-Einlasskanals 40 mit dem Strömungskanal 100 (d. h. der T-Stoß 58) zusammengeführt und strömen laminar nebeneinander in dem Strömungskanal 100, bis sie die Konstruktion an dem Auslaufstutzen 60 verlassen. Kleine Ionen, wie zum Beispiel H+ und Na+, diffundieren rasch über den Durchmesser des Strömungskanals 100, wohingegen größere Ionen, wie zum Beispiel das Farbstoffanion, nur langsam diffundieren. Größere Teilchen, wie zum Beispiel Zuckerarten, Proteine und ähnliches und Blutzellen, weisen eine signifikante Diffusion auf, solange der Indikatorstrom 70 und der Probenstrom 80 miteinander in Kontakt stehen. Die kleineren Probenkomponenten diffundieren rascher und stellen weiter oben in dem Strömungskanal 100 ein Gleichgewicht her. Da der Indikator weiterhin eine besondere Halbsättigungskonzentration hat (pKa in dem Fall eines pH-Farbstoffes), liegt bei fortschreitender Diffusion eine vordere oder Detektionsbereichsgrenze 95 aus Indikatorfarbstoff-Farbänderung oder Fluoreszenzänderung den Kanal stromaufwärts vor, um einen Detektionsbereich 90 auszubilden. Praktisch können die Detektionsbereichsgrenze 95 und der Bezugsbereich 85 eine gekrümmte Linie bilden, die in 2 am besten zu sehen ist. Die Lage und die Krümmung des vorderen Bereiches können eine "Ruhelage" haben, die eingestellt werden kann, indem die Strömungsgeschwindigkeit und die Kanalbreite entsprechend verändert werden, um die Signalgröße und Signalstärke zu optimieren.

Wenngleich es sich hierbei um ein Strömungssystem handelt, bleibt die physische Lage der Detektionsbereichsgrenze 95 in dem Strömungskanal 100 für eine gegebene zu analysierende Substanz gleich, solange die Strömungen konstant sind und die Probe unverändert ist. Die Konzentration der zu analysierenden Substanz wird entweder durch Überwachung des Indikatorsignals bei gleichmäßigem Diffusionsbereich 120 der Teilchen der zu analysierenden Substanz nach wesentlicher Einstellung eines Gleichgewichtes oder durch Aufzeichnen der Lage der Vorderflanke der steilsten Indikatorfarbänderung, zum Beispiel mit einem Mehrfachdetektor (siehe 3), bestimmt. Der Detektionsbereich 90 der zu analysierenden Substanz kann so groß wie notwendig sein, um ein detektierbares Bezugssignal bereitzustellen. Einstellungen dieser Bereiche können wie unten beschrieben auf der Grundlage der Diffusionskoeffizienten der zu analysierenden Substanz und der Indikatorsubstanz, der Strömungsgeschwindigkeiten und der Kanalgrößen durchgeführt werden.

2 zeigt eine Fluoreszenzmikroskopaufnahme des T-Sensors aus 1 mit einem Indikatoreinlassstrom 45, der eine schwach gepufferte Indikatorfarbstofflösung mit einem pH-Wert von 5 ist, und einem einfachen Einlassstrom 55, der eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9 ist. Der helle Bereich rechts ist Licht, das sich auf dem Silizium spiegelt und in keinem Verhältnis oder Zusammenhang mit dem Probenstrom oder dem Indikatorstrom steht. Der Probenstrom 80 erscheint als dunkles, klares Fluid auf der rechten Seite. Der helle Bereich links ist der Bezugsbereich 85, wo Teilchen einer zu analysierenden Substanz noch nicht in den Indikatorstrom 70 diffundiert sind. Der graue Bereich in der Mitte ist der Detektionsbereich 90 für Teilchen einer zu analysierenden Substanz, wo OHIonen von dem Probenstrom 80 in den Indikatorstrom 70 diffundiert sind, um den Detektionsbereich 90 auszubilden. Die unscharfe rechte Ecke des grauen Detektionsbereiches 90 wird dadurch verursacht, dass Farbstoffteilchen in den Probenstrom 80 diffundieren. Ein gleichmäßiger Diffusionsbereich von Teilchen einer zu analysierenden Substanz wird bei 120 gezeigt, wo die OHIonen gleichmäßig diffundiert sind. Das stärkste Signal befindet sich in der Mitte des Detektionsbereiches 90.

3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der T-Sensor-Kanalzellenvorrichtung der vorliegenden Erfindung mit mehreren Probenkanälen und Ansichtsfenstern, die in Abständen über die Länge des Strömungskanals angeordnet sind. In 3 tritt ein Einlassstrom 45 von rechts (und nicht von links wie in 1 und 2) an dem Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 ein. Eine Lösung aus Indikatorfarbstoff in einem Puffer geringer Ionenstärke mit einem pH-Wert von 9 wird verwendet. Ein Probeneinlassstrom 55, der eine 0,15 M Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 ist, tritt von links an einem Probenstrom-Einlassstutzen 30 ein. Die Konzentration des Farbstoffes beträgt nur etwa 10% der in 2 verwendeten Farbstoffkonzentration. Der Indikatorstrom 45 bzw. der Probenstrom 55 strömen entlang dem Indikatorstrom-Einlasskanal 40 bzw. dem Probenstrom-Einlasskanal 50 und treffen sich an dem T-Stoß 58 und strömen gemeinsam in Laminarströmung entlang des Strömungskanals 100. Untersuchungsströme 145 von dem Indikatorstrom 70, die den Indikatorfarbstoff enthalten, werden kontinuierlich an verschiedenen Stellen aus dem Strömungskanal 100 entnommen. Diese Untersuchungsströme 145 strömen durch Erweiterungen, die als Ansichtsfenster 140 dienen. Aufgrund der Größe der Ansichtsfenster 140 (mehrere Quadratmillimeter) kann die Fluoreszenzstärke problemlos durch ein Fluoreszenzmikroskop bzw. direkt mit einem Photodetektor überwacht werden.

Das am nahesten an dem T-Stoß 58 gelegene Ansichtsfenster enthält vorwiegend ungestörte Farbstofflösung, wohingegen das am nahesten an dem Austrittsstutzen 60 gelegene Ansichtsfenster den Probenstrom 80 in vollständigem Gleichgewicht mit dem Indikatorstrom 70 enthält. Die dazwischen befindlichen Ansichtsfenster enthalten den Indikatorstrom 70 in verschiedenen Graden von Gleichgewicht mit den Probenkomponenten. Je näher sie an dem T-Stoß 58 liegen, umso wahrscheinlicher ist es, dass das Ansichtsfenster nur kleine Ionen aus der Probe enthält. Ein Fluoreszenz-Gefügebild der Ansichtsfenster zeigt, dass die Farbe in dem am nahesten an dem T-Stoß 58 gelegenen Ansichtsfenster die rote Farbe der Basenform des ungestörten Indikatorfarbstoffes ist, wohingegen die gelb-grüne Farbe der am nahesten an dem Austrittsstutzen 60 gelegenen Ansichtsfenster die Säureform des Farbstoffes darstellt, nachdem sich der pH-Wert des Indikatorstroms 70 bei Erreichen des diffusionsbasierten Gleichgewichts von basisch nach sauer geändert hat.

Der Ansichtsfenster-T-Sensor aus 3 eignet sich für einfache Bezugsverfahren. Die integrale Fluoreszenzstärke eines jeden Ansichtsfensters auf einer Wellenlänge oder mehreren Wellenlängen kann problemlos mit einem Fluoreszenzmikroskop bzw. direkt mit Fotodioden gemessen werden. In dem einfachsten Fall, mit einem Indikatorfarbstoff, der keine Querempfindlichkeiten gegenüber anderen Probenkomponenten aufweist, ergibt das Intensitätsverhältnis zwischen ausgewählten Ansichtsfenstern einen Messwert, der weitgehend unabhängig von der Farbstoffkonzentration und der Erregerlichtintensität ist. Messen an mehr als einem Ansichtsfenster erhöht die Redundanz und daher die Messgenauigkeit.

In Fällen von Querempfindlichkeit des Indikators gegenüber größeren Probenkomponenten (z. B. größere Biomoleküle, wie beispielsweise Albumin) kann diese Interferenz herausgenommen werden, indem die Verhältnisse der verschiedenen Ansichtsfenster verglichen werden. Die näher an dem T-Stoß 58 gelegenen Ansichtsfenster werden vorwiegend kleinere Probenkomponenten enthalten, wohingegen die den Strömungskanal 100 weiter stromaufwärts gelegenen Ansichtsfenster auch größere Teilchen enthalten werden.

Die T-Sensor-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann mit Reporter-Kügelchen verwendet werden, um den pH-Wert, die Sauerstoffsättigung und den Ionengehalt in biologischen Fluiden zu messen. (US-Patent Nr. 5,747,349 "Fluorescent Reporter Beads for Fluid Analysis" beschreibt fluoreszierende und absorptionsfähige Reportermoleküle und Reporter-Kügelchen.) Reporter-Kügelchen können ebenso zum Detektieren und Messen von Alkoholen, Pestiziden, organischen Salzen, wie zum Beispiel Lactat, von Zuckerarten, wie zum Beispiel Glukose, von Schwermetallen und Arzneimitteln, wie zum Beispiel Salicylsäure, Halothan oder Narkotika, verwendet werden. Jedes Reporter-Kügelchen umfasst ein Substratkügelchen mit einer Vielzahl von wenigstens einer Art darauf immobilisierter fluoreszierender Reportermoleküle. Vielzahl bedeutet bei Verwendung in dieser Schrift mehr als eins. Eine fluoreszierende Eigenschaft des Reporter-Kügelchens, wie zum Beispiel Intensität, Lebensdauer oder Wellenlänge, ist empfindlich gegenüber der entsprechenden zu analysierenden Substanz. Reporter-Kügelchen werden der Fluidprobe zugegeben, und die Konzentration der zu analysierenden Substanz wird durch Messung der Fluoreszenz einzelner Kügelchen beispielsweise in einem Durchfluss-Zytometer bestimmt. Alternativ dazu können absorptionsfähige Reportermoleküle, die die Extinktion in Abhängigkeit von der Konzentration der zu analysierenden Substanz ändern, eingesetzt werden. Die Verwendung von Reporter-Kügelchen ermöglicht die gleichzeitige Messung einer Vielzahl von zu analysierenden Substanzen, und bei biologischen Zellen kann gleichzeitig der Zellgehalt gemessen werden, da die Kügelchen mit verschiedenen Reportermolekülen markiert werden kön nen.

Die fluoreszierenden Reportermoleküle der vorliegenden Erfindung können beliebige fluoreszierende Moleküle mit fluoreszierenden Eigenschaften sein, die in Abhängigkeit von der Konzentration einer bestimmten zu analysierenden Substanz bzw. einer Klasse von zu analysierenden Substanzen stehen. Zahlreiche bekannte Farbstoffe und Fluorchromarten können in der vorliegenden Erfindung als Reportermoleküle verwendet werden (siehe beispielsweise R. P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Handbuch der fluoreszierenden Proben und Forschungschemikalien), 5. Ausgabe, Molecular Probes Inc., Eugene, 1992). Die Kriterien für die Auswahl der Reportermoleküle sind, dass die Moleküle auf einem Substratkügelchen immobilisiert werden können und dass ihre Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Konzentration einer zu analysierenden Substanz steht. Im Gegensatz zu bisher verwendeten fluoreszierenden Kügelchen, bei denen sich die Anzahl der Kügelchen in einem Aggregat ändert, müssen die Reporter-Kügelchen aus dem US-Patent Nr. 5,747,349 kein Immunreagens, wie zum Beispiel ein Ligan, Antiligand, Antigen oder einen Antikörper, auf der Oberfläche in Kombination mit den Reportermolekülen aufweisen.

Fluoreszierende Reportermoleküle treten auf eine Art und Weise in Wechselwirkung mit der zu analysierenden Substanz, dass die fluoreszierenden Eigenschaften des Reportermoleküls geändert werden. In einigen Fällen reagiert das Reportermolekül mit der zu analysierenden Substanz, wie zum Beispiel in dem Fall der Albumin-Detektion durch AB 580 (Spacer). In einigen Fällen ist die Wechselwirkung keine chemische Reaktion. Zum Beispiel kann die Fluoreszenz von Reportermolekülen durch strahlungsfreie Energieübertragung zu den zu analysierenden Substanz gelöscht werden, wie zum Beispiel in dem Fall der O2-Detektion durch Rutheniumdiphenylphenanthrolin. Bei einigen Reportermolekülen ist die Fluoreszenz empfindlich gegenüber Polaritätsänderungen in dem Fluid, was zum Detektieren von organischen Lösungsmitteln und Kohlenwasserstoffen in einem wässrigen Fluid genutzt werden kann. Die Wechselwirkung kann auch durch andere Lösungsmitteleffekte erfolgen, wobei die Ionenstärke des Lösungsmittels die Fluoreszenz beeinflusst. Lösungsmitteleffekte können zur Bestimmung der Gesamtkonzentration aller gelösten Ionen verwendet werden. Die Wechselwirkung kann eine Ligand/Antiligand- oder eine Antigen/Antikörper-Reaktion sein. Die Wechselwirkung führt vorzugsweise nicht zu einem Aggregat mit anderen Teilchen und erzeugt insbesondere kein Aggregat, das eine Vielzahl von Reporter-Kügelchen enthält. Es wird bevorzugt, dass die Wechselwirkung der zu analysierenden Substanz mit den Reportermolekülen die Konzentration der zu analysierenden Substanz in dem Fluid nicht signifikant stört.

In dem Fall von fluoreszierenden Reporter-Kügelchen ist wenigstens eine Fluoreszenzeigenschaft der Reportermoleküle eine Abhängigkeit der Konzentration der zu analysierenden Substanz. Die für die Reporter-Kügelchen gemessene Eigenschaft kann eine beliebige Eigenschaft sein, die durch die Wechselwirkung der zu analysierenden Substanz mit den Kügelchen beeinflusst wird, wie zum Beispiel die Fluoreszenzintensität, die Zerfallszeit oder das Spektrum.

Alternativ dazu können Reportermoleküle Absorptionsindikatoren sein, wie zum Beispiel der auf einem Substratkügelchen immobilisierte physiologische pH-Indikator N9 (Merck Deutschland). Diese Indikatoren ändern ihr Absorptionsvermögen in Abhängigkeit von der Konzentration der zu analysierenden Substanz. Üblicherweise ändert sich die Farbe der Moleküle (d. h. die Wellenlänge ihrer größten Absorption ändert sich).

Absorptionsfähige Reportermoleküle können in Kombination mit fluoreszierenden Reportermolekülen auf einem Substratkügelchen verwendet werden, und absorptionsfähige Kügelchen können in Kombination mit fluoreszierenden Kügelchen verwendet werden.

Die Aufgabe des Substratkügelchens besteht darin, die Detektion einer zu analysierenden Substanz sowie wahlweise ihrer Konzentration mit optischen Messungen von Einzelkügelchen zu ermöglichen. Mehr als eine Art von Reporter-Kügelchen, d. h. Kügelchen mit darauf immobilisierten verschiedenen Reportermolekülen, können zur Analyse einer gegebenen Probe verwendet werden, solange die Art der Kügelchen festgestellt oder identifiziert werden kann. Kügelchen können mit verschiedenen Mitteln festgestellt werden, unter anderem mit Mitteln unter Verwendung der Kügelchengröße, wie zum Beispiel Lichtstreuung; mit fluoreszierenden Markierungen, die an das Kügelchen angehangen werden, das eine unterschiedliche Erregungs- und/oder Emissionswellenlänge als das an diesem Kügelchen angehangene fluoreszierende Reportermolekül hat; oder durch direkte Identifikation des an das Kügelchen angehangenen Reportermoleküls. Damit wird die Detektion von mehr als einer zu analysierenden Substanz gleichzeitig möglich. Das Substratkügelchen bewirkt weiterhin die Immobilisierung der Reportermoleküle, um deren Diffusion in den Probenstrom hinein zu verhindern. Die Reportermoleküle können auf der Oberfläche des Substratkügelchens oder aber in dem Substratkügelchen vorliegen. Die Kügelchen können aus einer Reihe von Materialien hergestellt werden und eine beliebige Form aufweisen, die nicht auf kugelförmig beschränkt ist. Geeignete Materialien sind unter anderem Glas, Latex, Hydrogels, Polystyrol und Liposome. Die Kügelchen können zusätzliche Oberflächengruppen haben, um das Anhängen von Reportermolekülen, wie zum Beispiel von Carboxylgruppen auf Latex und modifiziertem Polystyrol, zu ermöglichen.

Verschiedene Verfahren können zur Immobilisierung der Reportermoleküle auf dem Substratkügelchen verwendet werden. Adsorptionsbasierte Beschichtungen können durch Eintauchen der Substratkügelchen in eine Reportermoleküllösung und nachfolgendes Abwaschen überschüssiger Reportermoleküle vorbereitet werden. Reportermoleküle können analog in den Hohlraum gesteuerter Porenglaskügelchen diffundiert werden. Reportermoleküle können ebenso kovalent immobilisiert werden, indem sie chemisch an Funktionsgruppen geeigneter Substratkügelchen angehangen werden. Polymerisierte Kügelchen können in einer Lösung, die Reportermoleküle enthält, ausgebildet werden, wobei die Moleküle in einem festen Polymerhohlraum eingeschlossen werden. Um Reportermoleküle in einem Liposom zu immobilisieren, können Lipide mit einer Reportermoleküllösung gemischt werden, kann die Lösung geschüttelt werden und können die Liposome getrennt werden.

Um Reporter-Kügelchen für die erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen, werden die Kügelchen mit einer Fluidprobe gemischt, und die Fluoreszenz bzw. Absorption einzelner Kügelchen wird gemessen. Die Kügelchen können vor dem Vermischen mit der Probe trocken oder in einem Fluid dispergiert sein. Für Messungen im Mikromaßstab sollen das zugegebene Kügelchen-Volumen und etwaige Begleitfluide im Vergleich zu dem Probenvolumen klein sein (zum Beispiel < 1%), so dass sich eine nicht signifikante Probenverdünnung ergibt.

Die erfindungsgemäßen Kanalzellen können durch beliebige bekannte Verfahren ausgebildet werden, vorzugsweise durch Ätzen der Strömungskanäle auf die horizontale Oberfläche eines Silizium-Mikrochips, und durch Platzieren eines Deckels, vorzugsweise aus einem optisch klaren Material, wie zum Beispiel Glas oder einer Silikongummifolie, auf dem geätzten Substrat. Andere Mittel zum Herstellen der erfindungsgemäßen Kanalzellen sind unter anderem die Verwendung von Siliziumstrukturen oder anderer Materialien als Schablone für das Formen der Vorrichtung in Kunststoff, die Mikrofertigung und andere bekannte Verfahren, insbesondere die nachstehend beschriebenen Verfahren.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung haben erfindungsgemäße Kanalzellen wasseraufnehmende Oberflächen, um die Strömung von Flüssigkeit darin zu unterstützen und um Betreiben der Vorrichtung ohne die Notwendigkeit der Beaufschlagung mit Druck zu ermöglichen. Das Substrat kann nach der Fertigung der Kanäle mit bekannten Mitteln behandelt werden, um es wasseraufnehmend zu machen. Der Deckel wird ebenfalls behandelt, um ihn wasseraufnehmend zu machen.

Das erfindungsgemäße T-Sensor-Kanalsystem kann in Fluidverbindung mit einem V-Rillenkanal oder mit mehreren V-Rillenkanälen stehen. Ein Silizium-Mikrochip kann geätzt werden, um eine V-Rille mit reflektierenden Oberflächen/Wänden der Kanäle auszubilden. Somit können optische Messungen Auflicht anstelle von Durchlicht nutzen. Detektion kann durch Reflexion erzielt werden, d. h. durch Detektieren von Auflicht. Kleinwinkel-Streulicht (von der Oberfläche von beliebigen Teilchen in dem Kanal gestreut) wird ebenfalls von der V-Rillenwand gestreut und kann durch einen Kleinwinkel-Photodetektor erfasst werden. Großwinkel-Streulicht und Fluoreszenzlicht können ohne Reflexion aus dem Kanal austreten und durch einen Großwinkel-Photodetektor erfasst werden. Zusätzlich verstärkt die Reflexionswand der V-Rille hinter dem beleuchteten Teilchen die Fluoreszenzerfassungsleistung. Beliebige Teile des Auflichts, wie zum Beispiel Laserstrahl, die sich nicht in dem V-Rillenkanal befinden, werden von der Siliziumoberfläche in einer Richtung weg von dem Kleinwinkeldetektor bzw. dem Großwinkeldetektor reflektiert. Die von dem Deckel, wie zum Beispiel einer transparenten Abdeckplatte, reflektierte Lichtfraktion in einem Fall, wenn Licht aus der Luft ohne direkte Kopplung in den Deckel/die Abdeckplatte eintritt, wird ebenfalls dem Kleinwinkeldetektor und dem Großwinkeldetektor weg gerichtet, wobei unerwünschte Hintergrundlichtstärke von den Messungen reduziert wird.

Da der V-Rillenkanal das Auflicht reflektiert anstelle es zu leiten, ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Mikrokanalsystems äußerst einfach. Der Mikrokanal wird aus einem einzelnen Mikrochip aus Silizium hergestellt, der auf einer Seite gemustert ist. Eine transparente Abdeckplatte ist an dem Oberteil des Mikrochips angebracht, um den Kanal abzudichten.

4 zeigt einen V-Rillen-Strömungskanal und einen wahlweisen optischen Kopf. Der Silizium-Mikrochip 210 hat eine V-Rille 211 darin. Der Ausdruck V-Rille wird in dieser Schrift für eine im Wesentlichen "V"-förmige Rille in der Oberfläche eines Silizium-Mikrochips verwendet. Je nach Herstellungsverfahren kann die Spitze des "V" flach sein (eine Trapezrille), jedoch nur, wenn der flache Abschnitt nicht in den Detektionsbereich einer zu analysierenden Substanz fällt, die von dem Schnittpunkt des Beleuchtungsstrahles mit der Probenströmung definiert wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel hat der Mikrochip 210 eine Oberflächenorientierung <100> und die Wände der Rille 211 befinden sich entlang von Ebenen <111>, wobei sich ein Winkel von 54,7 Grad zwischen den Wänden der Rille und der Ebene der Oberfläche des Mikrochips ergibt. Die transparente Abdeckplatte 220 ist gegen die Oberfläche des Mikrochips 210 abgedichtet. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht die Abdeckplatte aus Pyrex und sie ist durch eine anodische Bondverbindung mit dem Silizium-Mikrochip verbunden. In dem veranschaulichten Ausführungsbeispiel umfasst die Lichtquelle einen Diodenlaser 310, eine optische Faser 312 und einen Fokussierkopf 314. Ungestreutes Licht, d. h. Licht, das nicht von einem Teilchen gestreut wird, wird von einer Wand des Kanals 211 spiegelreflektiert und wandert entlang des Pfades 322. Kleinwinkel-Streulicht (vorwärtsgestreutes Licht) weicht etwas von dem Pfad 322 ab und prallt auf den Kleinwinkeldetektor 320. Ein Teil des im großen Winkel gestreuten Lichtes wandert entlang des Pfades 332 zu dem Großwinkel-Photodetektor 330. Die Photodetektoren können Photodioden oder Photovervielfacher sein. Der Großwinkeldetektor 330 kann verwendet werden, um Großwinkelstreuung und/oder Fluoreszenz zu messen.

Mittel zur Beaufschlagung von Druck auf die Strömung des Speisefluids durch die Vorrichtung können ebenfalls bereitgestellt werden. Solche Mittel können an den Speiseeinlässen und/oder dem Auslass bereitgestellt werden (z. B. als Vakuum, das durch chemische oder mechanische Mittel erzeugt wird). Mittel für die Beaufschlagung des Druckes sind nach dem Stand der Technik bekannt, werden zum Beispiel in Shoji, S. und Esashi, M. (1994) "Microflow devices and systems", J. Micromechanics and Microengineering, 4: 157–171 beschrieben und umfassen die Verwendung einer Wassersäule oder anderer Mittel zum Beaufschlagen von Wasserdruck, elektroendosmotische Kräfte, optische Kräfte, Gravitationskräfte und Oberflächenspannungskräfte. Drücke von etwa 6,89 mPa (10–5 psi) bis etwa 68,9 kPa (10 psi) können verwendet werden, jeweils in Abhängigkeit von den Forderungen des Systems. Vorzugsweise wird ein Druck von etwa 6,89 Pa (10–3 psi) verwendet. Am bevorzugtesten liegen die Drücke zwischen etwa 19,6 Pa (2 mm) und etwa 980 Pa (100 mm Wasserdruck).

Ein Beispiel eines Ausführungsbeispieles unter Verwendung von Mehrfachströmen ist eine Kanalzelle mit drei Einlassströmen, die in Laminarströmung fließen, wobei der mittlere Strom ein Reagensstrom ist. Beispielsweise kann der Probenstrom Blut sein, der mittlere Strom kann Glukoseoxidase sein und der dritte Strom kann ein Indikatorstrom sein, der einen pH-Wert-empfindlichen Farbstoff enthält. Wenn Glukoseteilchen durch den Reagensstrom diffundieren, werden sie zu Glukonsäure umgesetzt, die von einem pN-Wert-empfindlichen Farbstoff detektiert wird, wenn die Glukonsäuremoleküle in den Indikatorstrom hinein diffundieren. Andere Beispiele von Mehrstromsystemen sind unter anderem Systeme mit mehreren Probenströmen mit zu analysierenden Substanzen in verschiedenen Konzentrationen zur Kalibrierung des Detektionsmittels. Nicht neben den Probenströmen gelegene Indikatorströme können auch als Kontrollströme verwendet werden.

Der Indikatorstrom kann vor und nach erfolgter Diffusion der Teilchen in den Strom durch das Detektionsmittel gemessen werden, und die Messungen sowie die Änderungsgeschwindigkeit des Indikatorstromes über seine Länge kann verwendet werden, um die Konzentration der zu analysierenden Substanz zu untersuchen. Zusätzlich können Mehrfachdetektionsmittel verschiedener Arten verwendet werden, um den Indikatorstrom zu messen. Ionen- oder chemikalienempfindliche Feldeffekte können an verschiedenen Stellen in der Vorrichtung gemessen werden.

Die erfindungsgemäßen Kanalzellen und die Kanäle in denselben können entsprechend der Größe zu detektierenden Teilchen dimensioniert werden. Wie nach dem Stand der Technik bekannt ist, steht der Diffusionskoeffizient für die Teilchen einer zu analysierenden Substanz in einem umgekehrten Verhältnis zu der Größe des Teilchens. Wenn der Diffusionskoeffizient für die zu detektierenden Teilchen einmal bekannt ist, können die Kontaktzeit der beiden Ströme, die Größe des Mittelkanals, die relativen Stromvolumina, die Drücke und Geschwindigkeiten eingestellt werden, um das gewünschte Diffusionsmuster zu erzielen.

Das fluiddynamische Verhalten steht in einem direkten Verhältnis zu der Reynoldsschen Zahl der Strömung. Die Reynoldssche Zahl ist das Verhältnis von Trägheitskräften zu Zähigkeitskräften. Mit abnehmender Reynoldsscher Zahl sind die Strömungsmuster stärker von Zähigkeitseffekten und weniger von Trägheitseffekten abhängig. Unterhalb einer bestimmten Reynoldsschen Zahl, wie zum Beispiel 0,1, können Trägheitseffekte im Wesentlichen ausgeklammert werden. Die erfindungsgemäßen Mikrofluid-Vorrichtungen benötigen keine Trägheitseffekte, um ihre Aufgaben zu erfüllen, und daher sind ihrer Miniaturisierung aufgrund der Reynoldsschen Zahl aus sich heraus keine Grenzen gesetzt. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen benötigen turbulenzfreie Laminarströmung, und sie sind daher entsprechend der vorgenannten Grundsätze ausgelegt, um Strömung mit niedrigen Reynoldsschen Zahlen, wie zum Beispiel Reynoldsschen Zahlen von unter etwa 1, zu erzeugen.

Die Reynoldssche Zahl ist das Verhältnis von Trägheitskräften zu Zähigkeitskräften. Mit abnehmender Reynoldsscher Zahl hängen die Strömungsmuster stärker von Zähigkeitseffekten und weniger von Trägheitseffekten ab. Unterhalb einer bestimmten Reynoldsschen Zahl, wie zum Beispiel unterhalb von etwa 1 (auf der Grundlage der Lumengröße für ein Kanalsystem mit Biegungen und Änderungen der Lumengröße) können die Trägheitseffekte im Wesentlichen ausgeklammert werden. Die erfindungsgemäßen Mikrofluid-Vorichtungen benötigen keine Trägheitseffekte, um ihre Aufgaben zu erfüllen, und daher gibt es an sich auch keine Begrenzung ihrer Miniaturisierung aufgrund von Miniaturisierungseffekten. Die Kanalzellenkonstruktionen des Anmelders weichen signifikant von früher beschriebenen Ausführungen ab, arbeiten jedoch in diesem Bereich. Die erfindungsgemäßen Mikrofluid-Vorrichtungen erfordern eine turbulenzfreie Laminarströmung und sind gemäß den vorstehenden Grundsätzen ausgelegt, um Strömungen mit niedriger Reynoldsscher Zahl zu erzeugen.

Die Vorrichtungen des bevorzugten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, eine Probe einer Größe zwischen etwa 0,01 Milliliter und etwa 20 Mikrolitern innerhalb weniger Sekunden zu analysieren, wie zum Beispiel innerhalb von etwa drei Sekunden. Sie können weiterhin wiederverwendet werden. Verstopfen wird minimiert und ist umkehrbar. Die Größe und Geschwindigkeit von 100 &mgr;m breit und 100 &mgr;m/s beispielsweise weisen eine Reynoldssche Zahl (Rc = plv/&eegr;) von etwa 10–2 aus, so dass sich das Fluid in einem Regime befindet, wo die Zähigkeit über die Trägheit dominiert.

Die Größe des Druckabfalls, der benötigt wird, um eine Durchschnittsgeschwindigkeit gegen ein Fluid absoluter Viskosität &eegr;und Dichte p durch einen kreisförmigen Kanal zu erzielen (Länge, 1, Durchmesser d), kann aus dem Hagen-Poiseuill'schen Gesetz (Bachelor, G. K., An Introduction to Fluid Dynamics, Cambridge Univ. Press 1967) abgeleitet werden.

Durch Einsetzen von v = 100 &mgr;m/s und d = 100 &mgr;m erhalten wir einen Druckabfall gleich etwa 2,94 Pa (0,3 mm Wassersäule) pro Zentimeter Kanallänge. Da das Hagen-Poiseuill'sche Gesetz streng genommen nur für kreisförmige Strömungskanäle gilt und da die erfindungsgemäßen Kanäle im Querschnitt im Wesentlichen rechteckig sind, kann dies lediglich als annährende Beziehung zwischen den Variablen dargestellt werden.

Wenn eine Flüssigkeit in eine Vorrichtung eingeleitet wird, liegt zunächst ein Effektivdruck Peff = P0 + Peff gleich der Summe aus dem Beaufschlagungsdruck P0 und einem Druck aufgrund von Oberflächenspannung vor

Pst ist eine Funktion der Oberflächenspannung des Fluids &ggr;, des Randwinkels des Fluids mit der Oberfläche &thgr; und des Krümmungsradius der Fluidoberfläche r.

Bei wasserannehmenden Oberflächen ist cos &thgr; nahe 1 und bei kleinen Kanälen muss die Vorrichtung nicht mit einem Beaufschlagungsdruck benetzt werden. Dies wird als "Benetzen durch Kapillarwirkung" bezeichnet. Nachdem die Vorrichtung jedoch vollständig nass ist, muss man auf die Oberflächenspannung in dem Austrittsbereich achten. Bei der Vorrichtung des hierin beschriebenen Beispiels betrug der Krümmungsradius des Fluids in dem Austrittsbereich mehrere Millimeter, so dass der Druck aufgrund der Oberflächenspannung ausgeklammert werden konnte.

Bei einer Kanalbreite von 100 &mgr;m beträgt Pst etwa 98,1 Pa (1 cm Wassersäule), so dass die Oberflächenspannung an dem Austrittskanal signifikant ist. Wenn jedoch wie unten beschrieben ein Ätzmittel, wie zum Beispiel EPW F-Etch, verwendet wird, das die Ebenen <100> von Silizium angreift, bedeutet das, dass die geätzten Ecken nicht so scharf sind wie in den Abbildungen gezeigt. Dies führt zu einer schrittweisen Verbreiterung des Kanals auf etwa 1 mm, wodurch der Effekt der Oberflächenspannung reduziert wird.

Durch Anpassung der Ausführung der Kanäle entsprechend den oben diskutierten Grundsätzen, um eine geeignete Kanallänge bereitzustellen, können die Strömungsgeschwindigkeit und die Kontaktzeit zwischen dem Probenstrom und dem Indikatorstrom, die Größe der in dem Probenstrom verbleibenden und der in den Indikatorstrom diffundierenden Teilchen kontrolliert werden. Die erforderliche Kontaktzeit kann als Funktion des Diffusionskoeffizienten des Teilchens D und des Abstandes d, über den das Teilchen diffundieren muss, durch t = d2/D berechnet werden. Teilchen oder Moleküle mit Diffusionskoeffizienten von größer D werden in den Indikatorstrom diffundieren, und Teilchen oder Moleküle mit einem Diffusionskoeffizienten im Wesentlichen kleiner als D werden dies nicht tun. Wenn der Diffusionskoeffizient der größeren Teilchen etwa zehn Mal kleiner ist als D, muss der Indikatorstrom vollständig frei von den großen Teilchen sein.

Bei einer gegebenen Strömungsgeschwindigkeit und einigen zu analysierenden Substanzen mit relativ kleinen Diffusionskoeffizienten ergibt ein gerader Kanalzellensystemkanal (T-Sensor-Kanal), vorzugsweise 5 mm bis 50 mm lang, keinen ausreichend langen Strömungskanal, damit angemessene Diffusion eintritt. Üblicherweise haben Silizium-Mikrochips einen Durchmesser von 7,62 cm, 10,16 cm, 15,24 cm bzw. 20,32 cm (3 Zoll, 4 Zoll, 6 Zoll bzw. 8 Zoll). Ein in einen solchen Mikrochip geätzter gerader Kanal kann nicht länger als der Durchmesser des Mikrochips sein. Detektion von zu analysierenden Substanzen mit relativ kleinen Diffusionskoeffizienten, wie zum Beispiel relativ große zu analysierende Substanzen oder nicht kugelförmige zu analysierende Substanzen, arbeitet vorzugsweise mit einem gewundenen Strömungskanal. Ein wie hierin beschrieben verwendeter gewundener Strömungskanal bezieht sich auf einen Strömungskanal, der nicht gerade ist. 5 und 6 zeigen zwei unterschiedliche Kanalgeometrien, die längere Strömungskanäle auf einem Silizium-Mikrochip von üblicherweise 3 Zoll bis 4 Zoll ergeben.

In dem Kanalzellensystem (T-Sensor) aus 5 haben der linke und der rechte Strom, zum Beispiel der Probenstrom und der Indikatorstrom, die gleiche Gesamtweglänge. Wenn bei diesem Ausführungsbeispiel mehrere Messungen durchgeführt werden, müssen sie entlang der vertikalen Mittellinie des Sensors durchgeführt werden, so dass beide Ströme mit der gleichen Strömungsgeschwindigkeit strömen und den gleichen Strömungsweg zurückgelegt haben. Bei diesem Ausführungsbeispiel, wobei der gewundene Strömungskanal eine Rechteckwellenform wie die in 5 hat, strömen die Ströme mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Kurven. Daher ist es möglicherweise vorzuziehen, kleinere Strömungsgeschwindigkeiten als die in geraden Strömungskanälen verwendeten Geschwindigkeiten zu verwenden, da die engen/schmalen Kurven und die Scherkräfte zwischen den mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten strömenden Strömen Bereiche verursachen können, in denen Laminarumwälzung auftritt. Laminarumwälzung ist keine Turbulenz; die Strömung ist nach wie vor laminar und vorhersagbar. Dennoch ist Laminarumwälzung nicht vorzuziehen und kann vermieden werden, indem eine Reynoldssche Zahl von unter etwa 1 aufrecht erhalten wird.

Das Kanalzellensystem (T-Sensor) aus 6 zeigt einen gewendelten/spiralförmigen Strömungskanal. Bei dieser Geometrie können vier separate T-Sensoren mit einem jeweils 220 mm langen Strömungskanal auf einem einzigen Mikrochip von 7,62 cm (3 Zoll) hergestellt werden. Da der Biegeradius bei dieser Geometrie größer ist als bei der Rechteckwellengeometrie ist das Auftreten von Laminarumwälzung weniger wahrscheinlich. Die Differenz in den relativen Strömungsgeschwindigkeiten zwischen dem linken und dem rechten Strom (Probenstrom und Indikatorstrom) ist minimal, wodurch geringere Scherspannung zwischen den beiden Strömen auftritt, wenn die beiden Ströme unterschiedliche Viskositäten aufweisen. Diese Kanalgeometrie erzeugt jedoch unterschiedliche Gesamtströmungswege für den linken und den rechten Strom.

7A und 7B veranschaulichen Kanalzellensysteme (T-Sensor-Vorrichtungen) der vorliegenden Erfindung, wobei der T-Stoß 58 abgerundet ist. 7A zeigt einen T-Sensor ähnlich dem in 1 gezeigten, wobei jedoch der T-Stoß 58 in 7A abgerundet ist. 7B zeigt einen Ansichtsfenster-T-Sensor ähnlich dem in 3 gezeigten, wobei jedoch der T-Stoß 58 in 7B abgerundet ist. Ein abgerundeter T-Stoß ist vorzuziehen, da er hilft, Laminarumwälzung in dem T-Stoß zu verhindern, die bei einer Reynoldsschen Zahl von über etwa 1 auftreten kann. Ein abgerundeter T-Stoß ist weiterhin vorzuziehen, da er die Möglichkeit der Verunreinigung des Probenstroms mit dem Indikatorstrom reduziert und umgekehrt.

Das erfindungsgemäße Kanalzellensystem kann verwendet werden, um die Konzentration einer zu analysierenden Substanz als Funktion der Entfernung (von dem T-Stoß) und nicht der Zeit zu messen. Ein Zuwachs an Entfernung ist proportional zu einem Zuwachs an Zeit. Bei Laminarströmung und einer bekannten Strömungsgeschwindigkeit kann ein Zuwachs an Entfernung in einen Zuwachs an Zeit umgerechnet werden.

Bei anderen Verfahren der Durchführung kinetischer Messungen wird die Konzentration bzw. eine physikalische Eigenschaft, die sich aus der Konzentration ergibt, wie zum Beispiel Extinktion oder Fluoreszenz, als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Die Abnahme der Konzentration eines Ausgangsmaterials bzw. der Anstieg der Konzentration eines Produkts über Zeit bestimmt die kinematische Geschwindigkeitskonstante für eine Reaktion.

Die Geschwindigkeit bzw. die Geschwindigkeitskonstante für eine Reaktion kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen T-Sensor-Vorrichtung bestimmt werden. Detektion, wie zum Beispiel Absorptions- oder Fluoreszenzmessungen, kann an einem Detektionsbereich oder an mehreren Detektionsbereichen zu analysierender Substanz durchgeführt werden. Unter Bezugnahme auf 8 kann eine Vielzahl von Detektoren 410 für zu analysierende Substanz in verschiedenen Entfernungen von dem T-Stoß 58 angeordnet werden. Alternativ dazu kann ein Detektor verwendet werden, um den Strömungskanal in verschiedenen Entfernungen von dem T-Stoß 58 zu überwachen. 8 zeigt einen rechteckwellen-/serpentinenförmigen Strömungskanal. Jedoch kann ein T-Sensor einer beliebigen Geometrie, der Laminarströmung aufrecht erhält, verwendet werden, um kinetische Messungen durchzuführen, insbesondere entsprechend den hierin beschriebenen Verfahren. Ein Probenstrom wird über einen Probenstrom-Einlassstutzen 30 eingeleitet, und ein Indikatorstrom wird über einen Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 eingeleitet. Die beiden Ströme treffen sich an dem T-Stoß 58. Zu analysierende Substanzen aus dem Probenstrom beginnen, in den Indikatorstrom zu diffundieren, und eine messbare Änderung, wie zum Beispiel eine Zunahme der Fluoreszenz, tritt ein. Eine messbare Änderung tritt als Ergebnis dessen, dass zu analysierende Substanzen in den Indikatorstrom diffundieren, ein und zeigt sich in den Detektionsbereichen 90 zu analysierender Substanz.

Die Intensität von Fluoreszenz oder Extinktion in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz und die Breite des Detektionsbereiches zu analysierender Substanz werden in verschiedenen Entfernungen von dem T-Stoß 58 gemessen. Die Intensität und die Breite des Detektionsbereiches zu analysierender Substanz sind abhängig von der gemessenen Konzentration zu analysierender Substanz. Wenn die zu analysierende Substanz in den Indikatorstrom diffundiert, tritt in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz eine Änderung der Farbe (d. h. eine Änderung der optischen Extinktion) oder der Fluoreszenz ein. Diese optische Änderung wird mit zunehmender Entfernung von dem T-Stoß intensiver, da die zu analysierende Substanz und der Indikator länger Zeit hatten, miteinander in Wechselwirkung zu treten. Die Breite des Detektionsbereich für zu analysierende Substanz nimmt mit zunehmender Entfernung von dem T-Stoß ebenfalls zu. Zwei voneinander unabhängige Ursachen führen zu der Erhöhung der Breite. Erstens diffundieren die zu analysierenden Substanzen mit zunehmender Zeit weiter, und daher auch mit zunehmender Entfernung. Zweitens wird die Extinktion bzw. die Fluoreszenz in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz größer, je weiter die Wechselwirkung zwischen der zu analysierenden Substanz und dem Indikator fortgeschritten ist. Daher können Extinktion bzw. Fluoreszenz bei einer größeren Breite in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz detektiert werden.

Unter Bezugnahme auf 8 wird der Detektionsbereich 90 zu analysierender Substanz mit zunehmender Entfernung von dem T-Stoß 58 breiter und intensiver.

Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine Geschwindigkeitskonstante für eine Reaktion mit lediglich einer Messung, wie zum Beispiel Fluoreszenz in einer bestimmten Entfernung von dem T-Stoß, ermittelt werden. Bekanntermaßen führt die Erhöhung der Anzahl der Messungen zu erhöhter Genauigkeit der aus den Messungen berechneten kinematischen Geschwindigkeitskonstante.

In einem anderen Ausführungsbeispiel kann das erfindungsgemäße T-Sensor-Kanalzellensystem verzweigte Strömungskanäle 401 und 402 wie in 9A veranschaulicht umfassen. Die kleine zu untersuchende Moleküle enthaltende Probe wird durch einen Probenstrom-Einlassstutzen 30 in die Vorrichtung eingeleitet, von wo sie in den Probenstrom-Einlasskanal 50 strömt. Ein Indikatorstrom wird in den Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 eingeleitet, von wo er in den Indikatorstrom-Einlasskanal 40 strömt. Die beiden Ströme strömen in Laminarströmung parallel zueinander, und kleine Moleküle (zu analysierende Substanzen) aus dem Probenstrom diffundieren in den Indikatorstrom. Verzweigte Strömungskanäle, wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Strömungskanäle in Fluidverbindung mit dem Strömungskanal 100. Ein W-Stoß 400 wie in 9A und 9B gezeigt kann verwendet werden, um die verzweigten Strömungskanäle 401 und 402 mit dem Strömungskanal 100 zu korrigieren. Verzweigte Strömungskanäle ermöglichen die Detektion sowohl ungelöster wie auch gelöster Teilchen. Ein Detektor, der vorzugsweise oberhalb oder unterhab der Vorrichtung angeordnet wird, überwacht den Strömungskanal 100 und die V-Rillen 403 bzw. 404. Dieses Ausführungsbeispiel mit Doppeldetektion kann gelöste und ungelöste Teilchen in dem Strömungskanal 100 sowie ungelöste Teilchen, die einreihig in der (den) V-Rille(n) strömen, detektieren. Teilchendetektion kann mittels standardmäßiger optischer Verfahren, wie zum Beispiel Abbildung, Lichtstreuung oder Spektroskopie, erfolgen, wenn die Teilchen durch eine oder beide der V-Rillen 403 bzw. 404 strömen, die in Fluidverbindung mit den verzweigten Strömungskanälen 401 bzw. 402 stehen. Die verzweigten Strömungskanäle 401 und 402 stehen in Fluidverbindung mit den Austrittsstutzen 405 bzw. 406.

Bei diesem Ausführungsbeispiel kann zum Beispiel eine Probe, wie zum Beispiel Vollblut, über den Probenstrom-Einlassstutzen 30 eingeleitet werden, von wo sie in den Probenstrom-Einlasskanal 50 strömt, und eine Reporter-Kügelchen enthaltende Pufferlösung kann über den Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 eingeleitet werden, von wo sie in den Indikatorstrom-Einlasskanal 40 strömt. Der Probenstrom und der Indikatorstrom strömen in Laminarströmung parallel zueinander in dem Strömungskanal 100. Kleine zu analysierende Substanzen, wie zum Beispiel Protonen, diffundieren in den Indikatorstrom. Unter Bezugnahme auf 9A strömt die Probe in den verzweigten Strömungskanal 402 und danach in die V-Rille 404, durch die Teilchen, wie zum Beispiel rote und weiße Blutzellen, einreihig strömen. Gleichzeitig strömen die Reporter-Kügelchen in den verzweigten Strömungskanal 402 und danach in die V-Rille 403, durch die die Kügelchen einreihig strömen. Ein optischer Detektor, der vorzugsweise oberhalb oder unterhalb der Vorrichtung angeordnet ist, überwacht gleichzeitig die beiden Ströme in dem Strömungskanal 100 und die ungelösten Probenteilchen in der V-Rille 404 und die Kügelchen in der V-Rille 403, wobei die Kügelchen Indikatoren von gelösten Probensubstanzen sind.

Alternativ dazu kann der Indikatorstrom einen gelösten Indikatorfarbstoff enthalten, der mit der Überwachung der ungelösten Probenteilchen überwacht wird, wenn dieses Ausführungsbeispiel der vorliegenden Vorrichtung verwendet wird. Ein gelöster Indikatorfarbstoff muss in einer V-Rille nicht überwacht werden. Daher müssen nicht beide verzweigten Strömungskanäle mit V-Rillen verbunden sein, wie in 9C veranschaulicht.

Ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung mit Doppeldetektion ist das Folgende. Eine Probe aus Vollblut kann in einer V-Rille überwacht werden, um die Anzahl von weißen Blutzellen zu detektieren. Danach strömt die Probe in einen T-Sensor, der in Fluidverbindung mit dem V-Rillenkanal steht. In dem T-Sensor reagieren die weißen Blutzellen mit den fluoreszierenden Reporter-Kügelchen, die mit einem Antikörper markiert sind. Danach strömt die Probe in einen anderen V-Rillenkanal, der in Fluidverbindung mit dem T-Sensor steht. In diesem V-Rillenkanal werden die weißen Blutzellen durch Fluoreszenz identifiziert.

Das T-Sensor-Kanalsystem der vorliegenden Erfindung kann weiterhin einen Abfallstutzen 407 umfassen, wie in 9B veranschaulicht. Um sicherzustellen, dass ausschließlich Probenstrom in den verzweigten Strömungskanal 402 eintritt und dass ausschließlich Indikatorstrom in den verzweigten Strömungskanal 401 eintritt, kann ein Teil eines jeden Stromes zu einem Abfallstutzen 407 umgeleitet werden. Der Abfallstutzen steht an dem W-Stoß in Fluidverbindung mit den Strömungskanälen, um einen Teil eines jeden Stromes zu einem Abfallauslass umzuleiten.

9C veranschaulicht einen Probenstrom (mit x dargestellt) und einen Indikatorstrom (mit Rechtecken dargestellt), die durch das erfindungsgemäße Kanalsystem strömen, das verzweigte Strömungskanäle und einen Abfallstutzen umfasst. 9C veranschaulicht weiterhin, dass die verzweigten Strömungskanäle nicht geschlossen geführt werden müssen und nicht parallel zu dem Strömungskanal 100 strömen müssen. Die verzweigten Strömungskanäle können in einem beliebigen gewünschten Winkel mit dem Strömungskanal 100 verbunden sein.

Detektion von gelösten und ungelösten Teilchen in einer Vorrichtung unter Verwendung des vorliegenden Ausführungsbeispieles ist wirtschaftlich vorteilhaft, da Messungen mit nur einem Satz Pumpen und einem Detektor durchgeführt werden können.

Ein weiteres Mittel zum Detektieren ungelöster Teilchen in einer einreihigen Strömung verwendet ein Hüllenflussmodul. Eine Probe kann zuerst durch einen Strömungskanal eines T-Sensors strömen, wo die Probe mit Reporter-Kügelchen reagiert; zum Beispiel diffundiert eine zu analysierende Substanz in der Probe in einen Reporter-Kügelchen enthaltenden Indikatorstrom. Das Reporter-Kügelchen enthaltende Fluid kann sodann in ein Hüllenflussmodul strömen, das in Fluidverbindung mit dem T-Sensor-Strömungskanal steht. In dem Hüllenflussmodul werden die Kügelchen fokussiert, so dass sie für Detektion einreihig strömen.

Wie bei dem V-Rillenkanal kann die Reihenfolge des Hüllenflussmoduls und des T-Sensors umgekehrt werden, d. h. die Fluide können zuerst durch das Hüllenflussmodul und danach durch den T-Sensor strömen. 10A ist ein Längsschnitt durch die Mitte eines Strömungsmoduls gemäß Beschreibung in dem US-Patent Nr. 6,159,739 "Device and Method for 3-Dimensional Alignment of Particles in Microfabricated Flow Channels" (eingereicht am 26. März 1997). Die Platte 501 wird maschinell gefertigt, geformt oder geätzt, um den Strömungskanal auszubilden. Die Platte kann unter anderem ausgewählt werden aus Siliziumscheiben, Kunststoffen, wie zum Beispiel Polypropylen, und Gusswerkstoffen. Verfahren für das Ätzen von Siliziumscheiben, für das Formen und für maschinelles Bearbeiten von Kunststoffen sind hinreichend bekannt. Ein Laminarströmungskanal 508 wird in einer flachen Ebene der Platte ausgebildet. Ein erster Einlass 510 geht an dem stromaufwärtigen Ende des Kanals durch die Platte hindurch und trifft an dem ersten Einlassknoten 511 auf den Strömungskanal. Ein Auslass 530 geht an dem stromabwärtigen Ende des Kanals hindurch und trifft an dem Auslassknoten 531 auf den Strömungskanal. Ein zweiter Einlass 520 geht zwischen dem ersten Einlass und dem Auslass durch die Platte hindurch und trifft an dem zweiten Einlassknoten 521, der schmaler ist als der erste Einlassknoten, auf den Strömungskanal. Eine zweite Platte 505 ist an die flache Ebene der ersten Platte angeschlossen, wobei eine Seite des Laminarströmungskanals ausgebildet wird. Eine Ansicht der Kanaloberfläche ist in 10B veranschaulicht. Die relativen Breiten der Einlassknoten werden gezeigt, ebenso wie die Kante 512 des Strömungskanals 508. Der zweite Einlassknoten 521 ist schmaler als der erste Einlassknoten 511. Unter Bezugnahme auf 10A und 10B wird ein Hüllenfluid über einen ersten Einlass 510 in den Strömungskanal 508 eingeleitet und strömt durch den Strömungskanal zu dem Auslass 530. Ein Mittelfluid wird über den zweiten Einlass 520, vorzugsweise bei einem niedrigeren Druck und einer geringeren Geschwindigkeit als das Hüllenfluid eingeleitet. 10C ist ein Querschnitt des Strömungskanals aus 10A und 10B und veranschaulicht die in einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung erhaltene Hüllenströmung. In diesem Ausführungsbeispiel ist der Strömungskanal 508 trapezförmig. Ein Mittelfluid 554, das von einem Einlass 520 eingespritzt wird, ist von beiden Seiten (links und rechts) und von oben von einem Hüllenfluid 553 umgeben.

Wie oben diskutiert ermöglicht die Ausbildung des Kanalsystems in einem spiegelnden Material optische Reflexionsmessungen. Alternativ dazu können in dem als nächstes beschriebenen Ausführungsbeispiel optische Transmissionsmessungen durchgeführt werden. Ein T-Sensor-Kanalsystem kann durch die gesamte Substratplatte, wie zum Beispiel einen Silizium-Mikrochip oder eine sonstige Materialplatte, geätzt werden. Das gesamte Kanalsystem kann durchgehend geätzt werden und bildet daher einen Schnittpunkt, d. h. es erstreckt sich über die gesamte Breite der Substratplatte. Alternativ dazu kann nur derjenige Teil des Kanalsystems, der den Detektionsbereich 90 für zu analysierende Substanz enthält, durchgehend geätzt werden und erstreckt sich daher über die Breite der Substratplatte wie in 11 gezeigt. Der Indikatorstrom-Einlassstutzen 20, der Probenstrom-Einlassstutzen 30 und der Austrittsstutzen 60 werden ebenfalls gezeigt. Eine optisch transparente Platte, wie zum Beispiel eine Abdeckplatte, ist auf beiden Seiten mit dem Mikrochip verbunden. Wenn nur ein Teil des Kanalsystems durchgehend durch den Mikrochip geätzt ist, muss die transparente Platte lediglich den betreffenden Teil des Mikrochips abdecken.

Wie in den anderen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung werden die Abmessungen der Vorrichtung so gewählt, dass Laminarströmung aufrecht erhalten wird. Wenn bei diesem Ausführungsbeispiel ein Silizium-Mikrochip durch anisotropes EPW-Ätzen geätzt wird, soll vorzugsweise ein dünner Mikrochip verwendet werden, so dass der Kanaldurchmesser ausreichend klein gehalten werden kann, um Laminarströmung aufrechtzuerhalten. Anisotropes EPW-Ätzen erzeugt Kanäle, die an dem Kanaloberteil breiter sind als an dem Kanalboden. Durchgehendes Ätzen eines Mikrochips kann einen Kanal erzeugen, der an dem Oberteil unerwünscht breit ist und der daher einen unerwünscht großen Kanaldurchmesser hat. Unerwünscht große Kanaldurchmesser halten möglicherweise Laminarströmung nicht aufrecht. Bevorzugte Breiten eines dünnen Mikrochips liegen zwischen 100 und 300 Mikrometern und insbesondere vorzugsweise zwischen 100 und 200 Mikrometern. Alternativ können andere Verfahren zum Ätzen von Silizium, wie zum Beispiel reaktives Ionenätzen, verwendet werden, um die Kanaldurchmesser ausreichend klein zu halten, damit Laminarströmung aufrecht erhalten wird. Andere Werkstoffe, wie zum Beispiel Kunststoffe, die maschinell bearbeitet oder geformt werden, um das Kanalsystem auszubilden, müssen nicht unbedingt dünn sein, um die Kanaldurchmesser klein zu halten.

Ein Mikrochip kann vor der Ausbildung des Kanalsystems in demselben durch Ätzen dünner gemacht werden. Ein unbeschichteter Mikrochip, d. h. ein Mikrochip ohne Photoresist darauf, kann dünner gemacht werden, indem er in eine Ätzlösung eingetaucht wird. Ein Kanalsystem bzw. wenigstens der Detektionsbereich für zu analysierende Substanz kann danach durchgehend durch den gesamten Mikrochip geätzt werden.

Alternativ dazu kann ein T-Sensor-Kanalsystem, das eine niedrige Reynoldssche Zahl hat, d. h. Laminarströmung, aufrecht erhält, ausgebildet werden, wobei die Höhe des Kanals größer ist als die Breite. Da jedoch die Strömungsgeschwindigkeit parabolisch in Bezug auf die Kanalbreite ist, d. h. sie ist in der Kanalmitte am größten und nähert sich an den Wänden an Null an, sollen die Kanalabmessungen vorzugsweise dergestalt sein, dass Diffusion von oben nach unten und von unten nach oben diesem parabolischen Strömungsgeschwindigkeitsprofil entgegenwirkt. Mit zunehmender Höhe des Strömungskanals nimmt der Effekt von Diffusion von oben nach unten und von unten nach oben ab.

Zahlreiche Ausführungsbeispiele neben den hierin erwähnten werden für den Durchschnittsfachmann ohne weiteres erkennbar sein und fallen in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sollen die Erfindung jedoch in keiner Weise einschränken.

BEISPIELE Beispiel 1: Fertigung von Kanalzellen

Ein Zwei-Ebenen-Maskenverfahren wurde für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Kanalzelle auf einer Siliziumscheibe verwendet. Der Strömungskanal der Kanalzelle war 400 Mikrometer breit und 20 mm lang. Die "Verzweigungen" bzw. der Querstrich des "T", die Einlasskanäle umfassend, war eine 30 mm lange und 200 Mikrometer breite Rille. Der Kanal war 50 Mikrometer hoch.

Die erste Maskenebene definierte die Einlässe und die Auslassstutzen, die durchgehend durch die Scheibe hindurch bis zu der Rückseite des Siliziums geätzt waren. Die zweite Ebene definierte die Fluidtransportkanäle.

Chrommasken 10,16 cm (4 Zoll) wurden von der Photo Sciences, Inc. (Torance, Kalifornien) nach diesen Vorgaben hergestellt, und Scheiben 7,62 cm (3") ((100), n-Typ) mit 500 nm gewachsenem SiO2 wurden verwendet.

Die Scheiben wurden vor der Verarbeitung in einem Piranha-Bad (H2SO4 und H2SO2) (2 : 1) gereinigt. Eine Grundierung (HMDS, aufgeschleudert bei 3.000 U/min.) wurde verwendet, um die Photoresisthaftung zu verbessern. Etwa ein Mikrometer des Photoresist AZ-1370-SF (Hoechst) wurde durch Aufschleudern (3.000 U/min.) beschichtet; dem folgte Weichbrand (30 Minuten lang bei 90°C).

Ein Kontaktausrichter wurde verwendet, um die Scheiben auszurichten und zu belichten. Die Belichtungszeit wurde variiert, um bessere Ergebnisse zu erhalten. Es wurde kein Nachbelichtungsbrennen durchgeführt. Die Scheiben wurden eine Minute lang in AZ-351 (verdünnt im Verhältnis 4 : 1) (Hoechst) entwickelt und in Deionat gespült. Blaues Heftband (Semiconductor Equipment Corporation, Moorpark, Kalifornien) wurde auf der Rückseite der Scheiben angebracht, um das Oxid gegen das Oxid-Ätzmittel zu schützen.

Die Scheiben wurden elf Minuten lang in ein gepuffertes Oxid-Ätzmittel (BOE, 10 : 1 HF (49%ig) und NH4F (10%ig) eingetaucht, um das ungeschützte Oxid vollständig wegzuätzen. Das blaue Heftband wurde von Hand entfernt, und der Photoresist wurde in einer Acetonspülung entfernt.

Siliziumätzen wurde in einem Gemisch aus Ethylendiamin, Brenzcatechin und Wasser (Ätzmittel EPW F gemäß Beschreibung in Reisman, A. et al. (1979) J. Electrochem. Soc. 126: 1406–1415) in einem Rückfluss-Kochkolben durchgeführt. Dieses Ätzmittel greift die Ebenen (100) von Silizium mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 um pro Stunde an. Fluidanschlussstutzen wurden in dem ersten Schritt etwa drei Stunden lang geätzt. Der Photoresist wurde erneut aufgebracht, und die Maske, die Strömungskanäle zwischen Fluidanschlüssen und der Sperrschicht enthielt, wurde freigelegt. Die Scheiben wurden in diesem zweiten Schritt etwa eine Stunde lang entwickelt und geätzt.

Nach der Endverarbeitung wurden die Scheiben erneut in einem Piranha-Bad gereinigt und in Deionat gespült. Danach wurden sie in einzelne Vorrichtungen von etwa 1 cm Mal 1 cm zerteilt.

Anodisches Bonden gemäß Wallis, G. und Pomerantz, D. I (1969) J. Appl. Physics 40: 3946–3949 wurde verwendet, um Pyrexglas an den Siliziumvorrichtungen anzubringen. Quadratische Teile 2,54 cm (1 Zoll) aus Pyrexglas (100 um dick) von der Esco Products Inc. (Oak Ridge, New Jersey) wurde verwendet. Zuerst wurden das Silizium und das Pyrexglas in eine Lösung aus H2O2, NH4OH und H2O (im Verhältnis 1 : 4 : 6) eingetaucht und danach auf 50°C erhitzt. Diese Behandlung entfernt alle organischen Stoffe von der Oberfläche und macht die Oberfläche wasserannehmend. Nach 20 Minuten in dieser Lösung wurden das Silizium und das Pyrex mit Deionat gespült und getrocknet. Anodisches Bonden wurde bei 400°C durchgeführt, wobei 400 V zwischen dem Glas und dem Silizium angelegt wurden.

Beispiel 2: Fluoreszenzfarbenänderungen mit pH-Wert

Fünf Pufferlösungen 0,01 M HEPES mit pH-Werten von 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 und 8,0 wurden aus analysenreinen Chemikalien (Aldrich) vorbereitet. Die entstehenden Lösungen wurden danach nacheinander als Probenströme verwendet. Die bei diesem Versuch zu analysierende Substanz ist H+ bzw. OH. 1 mg des fluoreszierenden Indikatorfarbstoffes Carboxy-SNAFL (Molecular Probes, Eugene, Oregon) wurde in 2 ml DM-SO (((,9%ig, Aldrich) aufgelöst. 0,1 ml dieser Lösung wurde mit 1 ml eines Puffers 0,0001 M HEPES mit einem pH-Wert von 7,0 gemischt. Die entstehende Lösung wurde als der Indikatorstrom verwendet.

Die T-Sensor-Kanalzelle wurde an dem Objekttisch eines Mikroskops so angebracht, dass sich die Fuge des T-Sensors in dem Gesichtsfeld des Objektivs befand. Die Einlassstutzen und der Auslassstutzen wurden mit den Injektorschleifen und den stehenden Rohren, die mit Wasser gefüllt waren, so verbunden, dass ein Druckgefälle von 294 Pa (30 mm Wassersäule) zwischen den Einlassstutzen und dem Auslassstutzen vorlag. Beide Einlassstutzen wurden dem gleichen Druck ausgesetzt, so dass sich die beiden Ströme in der Mitte des T-Stoßes trafen und parallel zueinander zu dem Auslassstutzen strömten. Eine Injektorschleife war mit Indikatorfarbstofflösung gefüllt, die andere Schleife war mit einem der Probenströme gefüllt. Die Schleifen hatten ein ausreichendes Volumen, um die Vorrichtung etwa eine Stunde lang zu betreiben.

Nachdem beide Injektorschleifen in den T-Sensor geströmt waren und nach einer Minute der Einstellung eines Gleichgewichts und Spülzeit wurden Aufnahmen durch einen Fotozusatz an dem Mikroskop gemacht. Die Mittelwellenlänge des Erregungsfilters betrug 480 nm; der Emissionsfilter war ein Langpassfilter 510 nm.

Der Versuch ergab Aufnahmen, bei denen die Farbe des Detektionsbereichs der zu analysierenden Substanz zwischen dem Indikatorstrom und dem Probenstrom in Abhängigkeit von dem pH-Wert des Probenstroms stand. Die Farbe änderte sich von rot über orange nach gelb in dem Maße, in dem der pH-Wert von 8,0 auf 7,2 zurück ging. Computerverbesserte Bilder wiesen die Farbe des Indikatorstroms von vornherein als gelb aus und den Detektionsbereich zu analysierender Substanz von rot bis orange, wohingegen der farblose Probenstrom schwarz erschien. Durch Farbmapping werden Zahlenwerte den verschiedenen Farben, die zur Kalibrierung des Systems verwendet werden, zugeordnet. Alternativ dazu wird die Lichtstärkenänderung bei zwei Wellenlängen gemessen, wobei die Abnahme des roten Anteils und die Zunahme des gelben Anteils des Spektrums bei abnehmendem pH-Wert gemessen werden.

Beispiel 3: kinetische Messungen in Abhängigkeit von der Entfernung

Alkalische Phosphatase in Serum und 0,1 M p-Nitrophenolphosphat (PNPP) (schwach gelb) in einem Puffer 0,1 M HEPES mit einem pH-Wert von 7,40 wurden in eine T-Sensor-Vorrichtung eingespritzt. Die alkalische Phosphatase katalysierte die Reaktion von PNPP zu p-Nitrophenol (stark gelb) und Phosphat. Die Bildung (und Bildungsgeschwindigkeit) von p-Nitrophenol wurde durch eine Zunahme der gelben Farbe detektiert. Die Änderungsgeschwindigkeit der Intensität der gelben Farbe in Abhängigkeit von der Entfernung von dem T-Stoß war eine Abhängigkeit von der Enzymkonzentration, wodurch die Berechnung einer Geschwindigkeitskonstanten ermöglicht wurde.


Anspruch[de]
  1. Kanalzellensystem (10) zum Detektieren der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in einem Probenstrom (80), der auch größere Teilchen umfaßt, umfassend:

    a) einen Laminarströmungskanal (100),

    b) mindestens zwei Einlaßmittel (40 und 50) in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal (100) für das entsprechende Durchleiten eines Indikatorstroms (70) und des Probenstroms (80) durch den Laminarströmungskanal, wobei der Laminarströmungskanal (100) eine ausreichend geringe Tiefe, um eine laminate Strömung der Ströme zu gestatten, und eine ausreichende Länge, um es den Teilchen der zu analysierenden Substanz zu gestatten, in den Indikatorstrom (70) zu diffundieren, aufweist,

    c) Detektionsmittel (410), angeordnet um einen Detektionsbereich (90) zu prüfen, der gebildet ist, wo die Teilchen einer zu analysierenden Substanz, die in den Indikatorstrom diffundieren, eine detektierbare Änderung in dem Indikatorsfrom bewirken, und

    d) – Auslaßmittel (60) zum Durchleiten der Ströme aus dem Laminarströmungskanal (100), um einen einzigen Mischungsstrom zu bilden,

    dadurch gekennzeichnet, daß der Detektionsbereich angeordnet ist, wo die größeren Teilchen keine signifikante Diffusion in den Indikatorstrom zeigen.
  2. System nach Anspruch 1, auch umfassend einen Fluoreszenzdetektor zum Detektieren von Änderungen in einer in dem Indikatorstrom getragenen Indikatorsubstanz als ein Ergebnis des Kontakts mit Teilchen einer zu analysierenden Substanz.
  3. System nach Anspruch 1, auch umfassend Mittel zum Durchleiten von Untersuchungsströmen (145) aus dem Indikatorstrom (70) in aufeinanderfolgenden Intervallen entlang der Länge des Laminarströmungskanals (100) und Mittel zum Messen von Signalen (410) aus dem Indikatorstrom (70) in jedem Untersuchungsstrom, wodurch die Konzentration der zu analysierenden Substanz in dem Probenstrom (80) bestimmt werden kann.
  4. Kanalzellensystem nach Anspruch 1, ferner umfassend einen Kanal mit V-Rillenform (211) in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal (100).
  5. Kanalzellensystem nach Anspruch 1, ferner umfassend ein Hüllenflußmodul in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal (100).
  6. Kanalzellensystem nach Anspruch 1, wobei der Indikatorstrom (70) Reporter-Kügelchen (130) umfaßt.
  7. Kanalzellensystem nach Anspruch 1, wobei der Laminarströmungskanal (100) aufgewickelt ist.
  8. Kanalzellensystem nach Anspruch 1, wobei der Probenstrom (80) sowohl gelöste als auch ungelöste Teilchen umfaßt, das Kanalsystem ferner mindestens einen verzweigten Strömungskanal (401) in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal umfaßt, wobei die gelösten Teilchen in dem Laminarstnömungskanal (100) detektiert werden und die ungelösten Teilchen in dem verzweigten Strömungskanal (401) detektiert werden.
  9. Kanalzellensystem nach Anspruch 1, gebildet in einer Substratplatte, zum Detektieren der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in einem Probenstrom (80), der auch größere Teilchen umfaßt, durch Transmission, wobei der Detektionsbereich für die zu analysierende Substanz zwischen dem Einlaßmittel und dem Auslaßmittel angeordnet ist, wobei der Kanal ferner umfaßt:

    a) optisch transparente Platten, die an beiden Seiten der Substratplatte abgedichtet sind, und

    b) wobei der Detektionsbereich für die zu analysierende Substanz (90) zwischen den transparenten Platten in einem Schnitt durch den Raum durch die Breite der Substratplatte liegt,
  10. Verfahren zum Delektieren der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in einem Probenstrom (84), der auch großere Tellchen umfaßt, unter Verwendung des Systems nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

    a) Durchleiten des Probenstroms (80) durch einen Laminarstrümungskanal (100),

    b) Durchleiten eines Indikatorstroms (70) durch den Laminarströmungskanal (100),

    wobei der Probenstrom und der Indikatorstrom (70) in benachbarten laminaren Strömen in dem Kanal fließen,

    c) Gestatten, daß die Teilchen einer zu analysierenden Substanz in den Indikatorstrom (70) diffundieren,

    d) Detektieren der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz in dem Indikatorstrom (70).
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Indikatorstrom (70) eine Indikator substanz umfaßt, die die Anwesenheit der Teilchen einer zu analysierenden Substanz durch eine detektierbare Änderung der Eigenschaft, wenn mit Teilchen der zu analysierenden Substanz kontaktiert, anzeigt, und der Detektionsschritt das Detektieren einer Änderung der Eigenschaft der Indikatorsubstanz umfaßt.
  12. Verfahrn zum Bestimmen der kinetischen Geschwindigkeitskonstante einer Reaktion unter Verwendung des Kanalzellensystems (10) nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

    a) Durchleiten des Probenstroms (80) und des Indikatorstroms (70) durch den Laminarströmungskanal (100), der einen Einlaß aufweist,

    b) Gestatten, daß die Teilchen einer zu analysierenden Substanz in den indikatorstrom (70) diffundieren, um einen Detektionsbereich für die zu analysierende Substanz (90) zu bilden, und

    c) Detektieren der Anwesenheit der zu analysierenden Substanz in dem Indikatorstrom (70) in einem bekannten Abstand vom Einlaß.
Es folgen 10 Blatt Zeichnungen






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