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Dokumentenidentifikation DE19751363B4 22.07.2004
Titel Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von Substanzemissionen
Anmelder Dräger Safety AG & Co. KGaA, 23560 Lübeck, DE
Erfinder Polzius, Rainer, Dr., 23564 Lübeck, DE;
Wuske, Thomas, 23714 Malente, DE;
Mahn, Jessica, 23617 Stockelsdorf, DE;
Manns, Andreas, Dr., 23552 Lübeck, DE
DE-Anmeldedatum 20.11.1997
DE-Aktenzeichen 19751363
Offenlegungstag 10.06.1999
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 22.07.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.07.2004
IPC-Hauptklasse G01N 31/00
IPC-Nebenklasse G01N 1/22   G01N 1/28   G01N 33/53   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von Substanzemissionen.

Die Anreicherung und der Nachweis von Spurenstoffen aus der Gasphase ist in vielen Anwendungsgebieten von großer Bedeutung. Besondere Schwierigkeiten ergeben sich beim Nachweis von Substanzemissionen, also von Gasen, Dämpfen oder Aerosolen, die aus der Oberfläche von Gegenständen, wie bspw. Verpackungen, Textilien, Balken, Täfelungen, etc. emittiert werden.

Entsprechende Aufgaben stellen sich in der Lebensmittelanalytik, wo die Diffusion und/oder Penetration von Substanzen durch Verpackungsmaterialien nachzuweisen sind, oder der Umweltanalytik, wo die Ausgasung von Schadstoffen aus Objekten zu bestimmen ist.

Zur Quantifizierung von Substanzemissionen aus Objekten wird bisher die Prüfkammermethode (Matthews, T.G. 1987: Atmospheric Environment 21, 321-329) eingesetzt. Der Nachteil dieser Methode besteht in der aufwendigen Durchführung der Probenahme und der anschließenden instrumentellen Analytik, die zeitaufwendig ist und von Fachleuten durchgeführt werden muß.

In der DE 195 38 075 ist ein Verfahren beschrieben, das die Anreicherung von Substanzemissionen vereinfacht. Dabei fixiert man man ein selbstklebendes Probenahmesystem auf dem zu beprobenden Gegenstand, wodurch eine Anreicherung von aus Objekten ausgasenden Substanzen in einem Sorbens ermöglicht wird. Der Nachweis des Analyten kann anschließend mittels einer chemischen oder biochemischen Reaktion erfolgen, die in einem mehrstufigen Verfahren nach Extraktion des Analyten aus dem Sorbens oder nach Inkubation des Sorbens in verschiedenen Lösungen auszuwerten ist.

Biochemische Nachweisverfahren sind in der medizinischen Diagnostik (Hage, D.S. 1993: Analytical Chemistry 65, 420R-424R) und in der Lebensmittelanalytik bereits etabliert. Entsprechende Verfahren werden auch in zunehmendem Maße in der Umweltanalytik eingesetzt (Bangs B.L. und Meza, M.B. 1995: IVD Technology 2). Aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit und hohen Sensitivität sind dabei insbesondere die sog. Immunoassays von großem Interesse, die auf der Antikörper-Antigen-Reaktion basieren.

Im Stand der Technik sind auch Verfahren zum immunchemischen Nachweis von Analyten aus der Gasphase bekannt. In der DE 41 21 493 ist bspw. ein Verfahren zum Nachweis von Schadstoffen aus der Gasphase beschrieben, bei dem eine kompetitive Reaktion zwischen Analyten oder markierten Tracer und Antikörpern angezeigt wird.

Die DE 44 25 963 offenbart demgegenüber Verfahren, bei denen der gasförmige Analyt durch immunologische Bindung an einen in einer Trägermatrix vorliegenden Bindungspartner gebunden und anschließend nachgewiesen wird.

Die EP 650 054 betrifft schließlich Verfahren zum Nachweis von Analyten aus der Gasphase, bei denen ein Gas durch eine Trägermatrix geleitet wird, wobei die nachzuweisenden Substanzen an einen in der Matrix enthaltenen Bindungspartner gebunden werden.

Keine der in den genannten Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren oder Vorichtungen ist jedoch zum Nachweis von Substanzemissionen aus Gegenständen geeignet.

Der vorliegenden Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die als Probenahme- und Analysesystem einen schnellen und einfachen Nachweis von Substanzemissionen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 19 gelöst. Hierbei wird eine Vorrichtung, die eine selbstklebende Schicht, eine Sammelmatrix und eine Nachweismatrix aufweist, auf der Oberfläche eines Gegenstandes fixiert und anschließend der in der Sammelmatrix akkumulierten Analyt nachgewiesen, indem man den Analyt durch Zugabe einer Entwicklerlösung in einem einstufigen Verfahren mit einem Bindungspartner umsetzt, wodurch die Gegenwart oder Abwesenheit des Analyten in der Nachweismatrix zur Anzeige gebracht wird. Durch diese einstufige Verfahren ist lediglich die Zugabe der Entwicklerlösung notwendig, und es werden keine weiteren Behandlungs- oder Analyseschritte benötigt wie dies in den bekannten mehrstufigen Verfahren der Fall war.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen Nachweis für Substanzemissionen zur Verfügung, das überraschenderweise hohe Empfindlichkeit und Selektivität mit schnellem Nachweis und einfacher Handhabung kombiniert. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals einen vor- Ort Nachweis von Substanzemissionen, wie etwa von Gasen, Dämpfen und/oder Aerosolen, die aus Gegenständen diffundieren. Der Nachweis kann auch von Nicht-Fachleuten in kürzester Zeit durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäß durchgeführter Nachweis kann beispielsweise nach drei bis zehn Minuten ausgewertet werden.

Das Verfahren kann dabei einen quantitativen oder qualitativen Nachweis ermöglichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in vorteilhafter Weise dazu geeignet, beliebige Analyte nachzuweisen, die aus Gegenständen diffundieren. Bevorzugt wird ein Nachweis von Geruchs- oder Aromastoffen, Drogen, Sprengstoffen, Pestiziden oder Umweltschadstoffen. Dabei kann es sich bspw. Verbindungen wie Cocain, Tetrahydrocannabinol, Trinitrotoluol, Nitroglycerin, Hexogen, polyaromatische Kohlenwasserstoffe oder polychlorierte Biphenyle handeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner so ausgestaltet sein, daß ein Nachweis mehrerer Analyte mittels einer Vorrichtung möglich ist.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegen alle für den Nachweis eines Analyten erforderlichen Reaktionspartner bereits zu Beginn des Nachweises in der Vorrichtung und/oder der Entwicklerlösung vor. Besondere Vorteile ergeben sich, wenn der Bindungspartner, der markiert sein kann, in trockener Form in der Nachweismatrix vorliegt.

Die Nachweisreaktion wird durch Aufdosieren oder Freisetzen der Entwicklerlösung initiiert. Ein Vorratsbehälter für die Entwicklerlösung kann dafür bereits in die Vorrichtung integriert sein. Bei der Entwicklerlösung kann es sich um eine beliebige Lösung handeln, in der der Analyt und der Bindungspartner gelöst werden. Erfindungsgemäß bevorzugt sind gepufferte, wässrige Lösungen, die einen Anteil von bis zu 50 Vol.-% an organischen Lösungsmitteln und anderen Lösungsvermittlern, wie z.B. Detergentien, enthalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Analyt während der Diffusion der Entwicklerlösung durch die Sammelmatrix in der Lösung angereichert. Dies hat zur Folge, daß auch sehr kleine Substanzmengen in der nachgeschalteten Nachweismatrix detektiert werden können.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung initiiert die Zugabe der Entwicklerlösung die Reaktion zwischen Analyt und Bindungspartner. Erfindungsgemäß sind Immunglobuline, deren Fragmente oder Derivate als Bindungspartner bevorzugt. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Antikörper, wobei monoklonale Antikörper besonders bevorzugt sind.

Der Bindungspartner kann nach im Stand der Technik üblichen Verfahren markiert sein, wobei eine Markierung mit Enzymen, Fluorophoren, radioaktiven Isotopen, Metallkoloiden und/oder gefärbten Partikeln bevorzugt ist. Eine Markierung mit gefärbten Partikeln und/oder Metallkoloiden ist besonders bevorzugt, da diese eine unmittelbare, visuelle Auswertung ermöglichen.

Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren beschrieben, die den Nachweis einer Reaktion zwischen Analyt und Bindungspartner ermöglichen. Die Verwendung entsprechender Nachweisverfahren in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird lediglich durch deren Eignung für einen sensitiven und schnell auswertbaren Nachweis begrenzt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt dem Nachweis eine immunchemischen Festphasenreaktion zugrunde, bei der ein spezifischer Bindungspartner in der Nachweismatrix immobilisiert wird. Die Kopplung an die Festphase kann adsorptiv, ionisch, kovalent oder durch Verbrückung des spezifischen Bindungspartners mit z.B. Protein A, Avidin oder Latexpartikeln erfolgen.

Abhängig vom Format des immunchemischen Nachweises kann die Festphasenreaktion in der Ausbildung des Komplexes aus immobilisiertem Bindungspartner, nachzuweisender Substanz und Bindungspartner (Zweiseitentest) oder des Komplexes aus immobilisiertem Bindungspartner und weiterem Bindungspartner (kompetitiver Test) bestehen.

Im kompetitiven Test werden neben den spezifischen Bindungspartnern oder deren Fragmenten die nachzuweisende Substanz bzw. deren Derivate, die an Makromoleküle gekoppelt sein können, als weitere Bindungspartner verwendet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zum Nachweis von Substanzemissionen, bei denen die Freisetzung von Analyten aus dem zu beprobenden Gegenstand durch Erwärmen des Gegenstandes oder durch Verwendung elektrochemischer Verfahren, bspw. der Iontophorese, verstärkt wird.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Vorrichtungen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren. Entsprechende Vorrichtungen weisen eine selbstklebende Schicht, eine Sammelmatrix und eine Nachweismatrix auf und sind so ausgestaltet, daß ein in der Sammelmatrix akkumulierter Analyt in einem einstufigen Verfahren durch Zugabe einer Entwicklerlösung mit einem Bindungspartner, der sich auf der Nachweismatrix befindet, umgesetzt und die Reaktion zur Anzeige gebracht werden kann.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind Vorrichtungen, bei denen die selbstklebende Schicht bei Fixierung der Vorrichtung auf dem zu beprobenden Gegenstand einen geschlossenen Probenahmeraum zwischen dem Gegenstand und der Sammelmatrix entstehen läßt. Umgebungseinflüsse, wie Konvektion, sichtbares Licht und Staubkonzentration werden dadurch ausgeschlossen. Die Probennahme wird nur durch die Temperatur beeinflußt.

Zusätzlich kann die selbstklebende Schicht die Fixierung des Probenahmesystems auf dem Gegenstand selbst ermöglichen. Als Materialien für die selbstklebende Schicht oder Barriere können sowohl rigide Gehäuse aus verschiedenen Kunststoffen oder Metallen verwendet werden als auch flexible Klebefolien, die den Vorteil haben, sich der Topographie des beprobten Objektes anzupassen.

Bei dem Material für die Sammelmatrix kann es sich um beliebiges Material handeln, das im trockenen Zustand eine Adsorption und Anreicherung des jeweiligen Analyten ermöglicht. Der Analyt muß sich ferner durch Zugabe einer Entwicklerlösung aus der Sammelmatrix eluieren lassen. Dafür muß die Sammelmatrix auch über eine kapillaraktive Wirkung verfügen. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Membranen oder Vliese als Sammelmatrix geeignet sind. Als besonders vorteilhaft haben sich Vliese aus Glasfasern, Cellulose, Kunststoffen oder Silika erwiesen.

Erfindungsgemäß bevorzugt werden Vorrichtungen, deren Sammelmatrix aus einem Material besteht, das eine lineare Wasseraufnahmerate zwischen 1 mm/min und 10 cm/min und/oder einen Porendurchmesser zwischen 0,1 &mgr;m und 50 &mgr;m, wobei Materialien mit einem Porendurchmesser zwischen 0,5 &mgr;m und 10 &mgr;m und/oder einer linearen Wasseraufnahmerate zwischen 5 mm/min und 5 cm/min besonders bevorzugt sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Sammelmatrix eine Dicke zwischen 100 &mgr;m und 1 cm auf.

Als Materialien für die Nachweismatrix kommen alle Arten von Material in Frage, die einen Fluidkontakt zur vorgeschalteten Sammelmatrix bilden können und die dadurch gekennzeichnet sind, daß die nachzuweisenden Substanzen nicht oder nur in geringem Maße an das Material binden. Die Nachweismatrix kann aus nur einem Material oder aus mehreren unterschiedlichen Materialien bestehen, die im Fluidkontakt zueinander stehen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Membranen oder Vliese, die eine Dicke zwischen 100 &mgr;m und 1 cm und/oder einen Porendurchmesser zwischen 0,1 &mgr;m und 50 &mgr;m und/oder eine lineare Wasseraufnahmerate von 1 mm/min bis 10 cm/min aufweisen. Die Nachweismatrix kann aus demselben Material wie die Sammelmatrix bestehen.

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können ferner einen Abstandhalter aufweisen, der einen direkten Kontakt zwischen der Sammelmatrix und der Oberfläche des beprobten Gegenstandes verhindert. Dabei ist es besonders bevorzugt einen Abstandhalter zu verwenden, der eine netzartige Struktur mit einer freien Fläche von mehr als 50% und einer Dicke zwischen 10 &mgr;m und 100 &mgr;m aufweist. Als Materialien können bspw. dünne Metall-, Textil- oder Kunststoffgewebe verwendet werden, die keine oder nur eine geringe Adsorption gegenüber der nachzuweisenden Substanz aufweisen sollten.

Wird die Vorrichtung für ein kompetitives Nachweisverfahren verwendet, so sind Ausgestaltungen der Vorrichtung bevorzugt, die eine Abfangzone aufweisen. Diese Abfangzone hat die Aufgabe nicht an Analyte gekoppelte Bindungspartner zu immobilisieren. Dieses Prinzip ist aus der Durchbruchchromatographie bekannt (vgl. C.R. Lowe und P.D.G. Dean, Affinity Chromatography, Wiley & Sons, New York, 1974; und EP 052 769) und hat zur Folge, daß nur die durchbrechenden Bindungspartner die Nachweiszone erreichen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Vorrichtung so ausgestaltet, daß die Applikation der Entwicklerlösung an einer bestimmten Stelle der Vorrichtung möglich ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen in den Zeichnungen beschrieben, in denen:

1: eine Querschnittansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum objektbezogenen Nachweis von Substanzemissionen zeigt;

2a: eine Aufsicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit unidirektionalem Flüssigkeitstransport darstellt;

2b: eine Aufsicht einer analogen Vorrichtung mit radialem Flüssigkeitstransport zeigt; und

3: eine bevorzugte Ausführungsform mit unidirektionalem Flüssigkeitstransport schematisch als Aufsicht darstellt.

Die in den 1 bis 3 dargestellten Vorrichtungen sollen den prinzipiellen Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtungen erläutern. Die jeweilige Darstellung schließt jedoch nicht aus, daß ein anderer Aufbau gewählt und/oder weitere Komponenten in die Vorrichtung integriert werden können.

Die Vorrichtung in l besteht aus den Komponenten selbstklebende Schicht 2, Sammelmatrix 3 und Abstandhalter 4 und wird auf der Oberfläche eines substanzfreisetzenden Gegenstands 1 fixiert. Die über die Oberfäche des Gegenstandes 1 emittierte Substanz dringt durch den Abstandhalter in die Sammelmatrix ein und wird dort angereichert.

Die selbstklebende Schicht oder Barriere 2 hat die Aufgabe, äußere Einflüsse weitestgehend auszuschließen und stellt die Gasdichtigkeit gegenüber der gesammelten Substanz sicher.

Als Sammelmatrix 3 können unterschiedliche Materialien als Membranen oder Vliese eingesetzt werden. Der Abstandhalter 4 verhindert im Falle der Diffusionsbeprobung den direkten Kontakt der Sammelmatrix mit der Oberfläche des beprobten Objekts.

In 2a ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit unidirektionalem Flüssigkeitstransport dargestellt. Nach Aufgabe der Entwicklerlösung am distalen Ende x der Sammelmatrix 3 gelangt die Probenflüssigkeit durch kapillare Saugwirkung in die Nachweismatrix 5, in der die immunchemische Nachweisreaktion erfolgt.

Analog zu dieser Vorrichtung zeigt 2b eine Vorrichtung mit radialem Flüssigkeitstransport. Infolge des lateralen Flüssigkeitstransports durch die Sammelmatrix wird der Analyt in der Flüssigkeitsfront angereichert. Dies hat zur Folge, daß auch sehr kleine Substanzmengen in der nachgeschalteten Nachweismatrix 5 detektiert werden können.

Die markierten Bindungspartner können in der Sammelmatrix 3 oder in der Nachweismatrix 5 in trockener Form enthalten sein. Infolge des Flüssigkeitstransports der Entwicklerlösung werden die markierten Bindungspartner aus der Matrix herausgelöst und in die Zone transportiert, in der eine immunchemische Festphasenreaktion stattfindet .

In 3 ist eine bevorzugte Ausführungsform mit unidirektionalem Flüssigkeitstransport schematisch als Aufsicht dargestellt.

Dem Abstandhalter 4 liegt die immunchromatographische Teststrecke auf, die aus den Komponenten Sammelmatrix 3 und Nachweismatrix 5 besteht und von der Schicht 2 abgedeckt wird. Die Schicht 2 weist eine Aussparung 6, die zur Applikation der Entwicklerlösung dient, und eine optische Apertur 7 auf, die eine Detektion des immunchemischen Signals in der Nachweismatrix ermöglicht. Die Aussparung 6 kann während der Sammelphase mit Hilfe einer Klebefolie abgedeckt sein und wird unmittelbar vor dem Aufbringen der Entwicklerlösung entfernt.

Die Durchführung der Bestimmung erfolgt in der Weise, daß die Vorrichtung mit Hilfe der an der Schicht 2 enthaltenen Klebeflächen auf dem zu beprobenden Gegenstand aufgeklebt wird. Nach einer bestimmten Sammeldauer wird die Entwicklerlösung auf die Aussparung 6 aufdosiert oder freigestzt und somit der immunchromatographische Nachweis der gesammelten Substanz ausgelöst. Das Signal wird über die optische Apertur 7 visuell abgelesen und ausgewertet.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einer Vorrichtung zum Nachweis einer Pentachlorphenol (PCP)-Freisetzung aus Hölzern und eines entsprechenden Nachweisverfahrens beispielhaft beschrieben:

Beispiel A) Anreicherungseffizienz verschiedener Sammelmatrizes

Verschiedene 2 cm2 große Vliese oder Membranen wurden für 4 Stunden mit einer luftundurchlässigen Klebefolie auf ein Modellholz geklebt, das mit 1 g PCP/m2 behandelt war. Ein Abstandhalter (Estal Mono PE 220 HC Super, Schweizer Seidengazefabrik, Schweiz) verhinderte einen direkten Kontakt der Sammelmatrix mit der beprobten Oberfläche.

Anschließend wurden die Sorbentien in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 8,0 im Ultraschallbad extrahiert und der PCP-Gehalt der Extrakte mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-ELISA analysiert. Es ergaben sich deutliche Unterschiede in der Anreicherungseffizienz verschiedener Sammelmatrizes.

B) Extraktionseffizienz verschiedener Sammelmatrizes

50 ng PCP in Methanol wurde auf verschiedene 2 cm2 große Vliese oder Membranen aufpipettiert. nach Abdampfen des Methanols wurden die Sorbentien in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 8,0 (PBS-Puffer) im Ultraschallbad extrahiert und der PCP-Gehalt der Extrakte mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-ELISA analysiert.

Es zeigten sich größere Unterschiede bei der Extraktionseffizienz verschiedener Sammelmatrizes:

C) Herstellung der Goldmarkierung

0,5 L destilliertes und filtriertes (0,2 &mgr;m) Wasser wurden in einem silikonisierten Becherglas unter Rühren zum Sieden erhitzt und 5 ml 1 %ige Goldsäure wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde weitere 5 Minuten gekocht und dann wurde 20 ml 1%ige Natriumcitrat-Lösung rasch hinzugegeben. Nach weiteren 10 Minuten zeigte ein Farbumschlag von blau nach rot das Ende der Reaktion an. Das Kolloid wurde im Eisbad auf RT abgekühlt und durch Zugabe von 5 ml 2 %iger NaN3-Lösung und von 0,5 ml 1 %igen PEG (Polyethylenglykol) 20000 stabilisiert (alle Angaben dieses Abschnitts sind in Gew.-%).

D) Herstellung des Goldmarker-Konjugats

Der pH-Wert der Goldkolloid-Lösung wurde durch Zugabe von 0,2 M K2CO3 auf pH 9 eingestellt. 10 mg eines für PCP spezifischen, monoklonalen Antikörpers wurde zur Lösung zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der Zugabe von 200 mg Protein C zur Lösung wurde für weitere 30 Minuten inkubiert und anschließend für 15 min bei 40000 × g zentrifugiert. Die Ronjugate aus Antikörper und Goldmarker wurden erhalten, indem das Pellet in 0,1 M HEPES (Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure)-Puffer, pH 7,0, mit 0,1 % Protein C und 0,05 % PEG 20000 aufgenommen wurde.

E) Herstellung des PCP-Konjugats

1 mg 5-(4-Hydroxy-2,3,5,6-Tetrachlorphenoxy)-Valeriansäure wurden zusammen mit 1,7 mg N-Hydroxy-Succinimid (NHS) und 6,2 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodümid (DCC) in DMF gelöst und für 18 h bei RT inkubiert. Anschließend gab man die Mischung tropfenweise zu einer Lösung von 2 mg Ziegen-IgG in 2 ml 0,15 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, inkubierte weitere 3 h und dialysierte für 2 Tage gegen PBS-Puffer.

F) Herstellung der Goldmarkerzone

F075-14 Glasfaservliesmaterial (Whatman, UK) wurde in 1 cm breite Streifen geschnitten, in der Goldmarker-Konjugat Lösung (Optische Dichte bei 520 nm auf 10 eingestellt) getränkt und bei 40°C für 20 Minuten im Umluftofen getrocknet.

G) Herstellung der Abfangzone

F-286-13carboxylgruppenmodifiziertes Glasfaservliesmaterial (Whatman, UK) wurde in 1 cm breite Streifen geschnitten und in einer Lösung aus 0,2 mg/ml PCP-Konjugat und 0,1 mg/ml 1-Ethyl-3(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid in PBS, pH 7,0 für 2 h bei RT inkubiert. Anschließend wurde das Vliesmaterial 4 h mit PBS gewaschen und bei 40 °C für 20 Minuten im Umluftofen getrocknet.

H) Aufbau der immunchromatographischen Teststrecke

Entsprechend 2a wurde eine immunchromatographische Teststrecke, die durchgängig eine Breite von 0,5 cm aufwies, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebands auf einem Kunststofllaminat mit einer Stärke von 1 mm fixiert. Die Sammelmatrix (3) wurde aus einem 2 cm langen Glasfasermaterial F075-14 (Whatman, UK) und angrenzend aus der Goldmarkerzone (f) zusammengefügt. Die Nachweismatrix (5), die im Fluidkontakt mit der Sammelmatrix stand, setzte sich aus der Abfangzone (g) und einer angrenzenden Anzeigezone aus 1 cm langem Glasfaservlies GFF (Whatman, IJK) zusammen. Der Fluidkontakt zwischen den Elementen wurde durch Überlappung der Zonen um 1 mm erzielt.

I) Vorrichtung zum Nachweis von Substanzemissionen

Die immunchromatographische Teststrecke aus der Stufe H wurde mit der plastifizierten Seite auf einem luftundurchlässigen Klebeband in der Art fixiert, daß zu allen Seiten eine Klebesaum von 2 cm Länge bestand. Der Abstandhalter (Estal Mono PE 220 HC Super, Schweizer Seidengazefabrik, Schweiz) wurde anschließend über der immunchromatographischen Teststrecke aufgespannt, indem er durch Überlappung um 0,5 cm auf der Klebefolie befestigt wurde.

J) Herstellung der Entwicklerlösung

Einem PBS-Basispuffer, pH 8,0, wurde 0,1 % Natriumazid, 0,5 % Triton X-100 und 0,5 % Polyethylenglycol 2000 zugesetzt.

K) Beprobung und Nachweis

Die in Stufe I erstellte Vorrichtung wurde auf ein Modellholz aufgeklebt, das mit 1 g PCP/m2 behandelt war. Als Referenz wurde eine entsprechende Vorrichtung auf einer Stahlplatte fixiert.

Nach 10 stündiger Exposition wurden die Probenahme- und Analysesysteme von den beprobten Gegenständen entfernt und mit der nicht-klebenden Seite auf eine horizontale Oberfläche abgelegt. Durch Aufdosieren von 200 &mgr;l der Entwicklerlösung (J) mit Hilfe einer Tropflasche am Anfang der Sammelmatrix (s. 2a, x) wurde der immunchemische Nachweis des in der Sammelmatrix akkumulierten PCPs in Gang gesetzt.

Nach 5 Minuten ergab sich für das PCP-Modellholz in der Anzeigezone eine rote Färbung, während im Falle der Stahlplatte keine Färbung sichtbar wurde.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Nachweis von Substanzemissionen, bei dem man eine Vorrichtung, die eine selbstklebende Schicht, eine Sammelmatrix und eine Nachweismatrix aufweist, auf der Oberfläche eines Gegenstandes fixiert und anschließend den in der Sammelmatrix akkumulierten Analyten nachweist, dadurch gekennzeichnet, daß man den in der Sammelmatrix akkumulierten Analyten durch Zugabe einer Entwicklerlösung eluiert und in einem einstufigen Verfahren mit einem Bindungspartner in der räumlich getrennten, in kapillarer Flüssigkeitsverbindung mit der Sammelmatrix stehenden Nachweismatrix umsetzt, wodurch die Gegenwart oder Abwesenheit des Analyten in der Nachweismatrix zur Anzeige gebracht wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis quantitativ oder qualitativ erfolgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Substanzemissionen um Gase, Dämpfe und/oder Aerosole handelt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analyten um Geruchs- oder Aromastoffe, Drogen, Sprengstoffe, Pestizide oder Umweltschadstoffe handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analyten um Cocain, Tetrahydrocannabinol, Trionitrotoluol, Nitroglycerin, Hexogen, polyaromatische Kohlenwasserstoffe oder polychlorierte Biphenyle handelt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß alle für den Nachweis eines Analyten erforderlichen Reaktionspartner in der Vorrichtung und der Entwicklerlösung vorliegen.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Entwicklerlösung um eine gepufferte, wässrige Lösung handelt, die einen Anteil von bis zu 50% organische Lösungsmittel und Lösungsvermittler enthalten können.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt bei der Diffusion der Entwicklerlösung durch die Sammelmatrix in der Lösung angereichert wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Bindungspartner um Immunglobuline, deren Fragmente oder Derivate handelt.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Bindungspartner um Antikörper handelt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Bindungspartner um monoklonale Antikörper handelt.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner markiert ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner mit Enzymen, Fluorophoren, radioaktiven Isotopen, Metallkoloiden und/oder gefärbten Partikeln markiert ist.
  14. Verfahren nach einem der, Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion eine Festphasenreaktion umfaßt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion ein kompetitives oder nicht-kompetitives Format aufweist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion einen Zweiseitentest umfaßt.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung von Analyten aus dem zu beprobenden Gegenstand durch Erwärmen des Gegenstandes oder durch Verwendung elektrochemischer Verfahren verstärkt wird.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrochemische Verfahren Iontophorese ist.
  19. Vorrichtung zur Verwendung in einem Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, die eine selbstklebende Schicht, eine Sammelmatrix und eine Nachweismatrix aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelmatrix und die davon räumlich getrennte Nachweismatrix, die einen Bindungspartner für den Analyten aufweist, auf der selbstklebenden Schicht fixiert sind und miteinander in Flüssigkeitsverbindung stehen, so daß ein kapillarer Flüssigkeitstransport der Entwicklerlösung, ausgehend von der Sammelmatrix, in die Nachweismatrix stattfindet.
  20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die selbstklebende Schicht bei Fixierung der Vorrichtung auf einem zu beprobenden Gegenstand einen geschlossenen Probenahmeraum zwischen dem Gegenstand und der Sammelmatrix entstehen läßt.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Sammel- und/oder Nachweismatrix um Membranen oder Vliese handelt.
  22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammel- und/oder Nachweismatrix aus Glasfaser, Cellulose, Kunststoffen oder Silika besteht.
  23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammel- und/oder die Nachweismatrix aus einem Material besteht, das einen Porendurchmesser zwischen 0,1 &mgr;m und 50 &mgr;m und/oder eine lineare Wasseraufnahmerate zwischen 1 mm/min und 10 cm/min und/oder eine Dicke zwischen &mgr;m 100 &mgr;m und 1 cm aufweist.
  24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung ferner einen Abstandhalter aufweist, der einen direkten Kontakt zwischen der Sammelmatrix und der Oberfläche des beprobten Gegenstandes verhindert.
  25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Abfangzone aufweist, in der nicht an Analyten gekoppelte Bindungspartner abgefangen werden.
  26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung so ausgestaltet ist, daß die Applikation der Entwicklerlösung an einer bestimmten Stelle der Vorrichtung möglich ist.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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