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Dokumentenidentifikation DE69433243T2 29.07.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000716591
Titel Verwendunf von ApoE zum Binden von TAU und MAP2c Proteinen und zur Behandlung von Alzheimer's Krankheit
Anmelder Duke University, Durham, N.C., US;
The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US;
Medical Research Council, London, GB
Erfinder STRITTMATTER, J., Warren, Durham, US;
ROSES, D., Allen, Durham, US;
GOEDERT, Michel, Cambridge CD2 2QH, GB;
WEISGRABER, H., Karl, Walnut Creek, US;
SAUNDERS, M., Ann, Durham, US;
SCHMECHEL, E., Donald, Durham, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69433243
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.08.1994
EP-Aktenzeichen 949257562
WO-Anmeldetag 05.08.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/US94/08881
WO-Veröffentlichungsnummer 0095006456
WO-Veröffentlichungsdatum 09.03.1995
EP-Offenlegungsdatum 19.06.1996
EP date of grant 15.10.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.07.2004
IPC-Hauptklasse A61K 7/46
IPC-Nebenklasse A61K 38/17   A61K 48/00   G01N 33/68   A61P 25/28   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft in-vitro-Verfahren der Bindung von Tau-Protein in Zellen, der Bindung von MAP2-Protein in Zellen, der Hemmung der Bildung von neurofibrillären Tangles, Verwendungen zur Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit durch Bindung von Tau-Protein an entweder ein Apolipoprotein E oder ein Apolipoprotein-E-Fragment, welches an Tau bindet, und Verwendungen zur Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit durch Bindung von MAP2c-Protein an entweder ein Apolipoprotein E oder ein Apolipoprotein-E-Fragment, welches an MAP2c-Protein bindet.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Apolipoprotein E existiert bei Menschen in drei verschiedenen Isoformen. Diese Isoformen sind als Apolipoprotein E2, Apolipoprotein E3 und Apolipoprotein E4 (abgekürzt ApoE2, ApoE3 bzw. ApoE4) bekannt. ApoE3 ist in der allgemeinen Population die häufigste Isoform und enthält ein einzelnes Cystein am Rest 112. ApoE4 enthält ein Arginin an dieser Position, aber ist ansonsten identisch mit ApoE3.

ApoE4 ist genetisch mit spät beginnender familiärer und sporadischer Alzheimer-Krankheit verknüpft. Siehe z. B. W. Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1977 (1993). Die Allelfrequenz von ApoE4 ist bei Patienten in Familien mit spät beginnender Alzheimer-Krankheit statistisch in hohem Maße vergrößert. Darüber hinaus war bei einer Reihe von 176 Patienten mit durch Autopsie bestätigter spät beginnender sporadischer Alzheimer-Krankheit die Allelfrequenz von ApoE4 ebenfalls deutlich erhöht. Weiterhin wird das Risiko von Alzheimer-Krankheit als Funktion der ererbten Dosis von ApoE4 vergrößert, und das mittlere Alter des Beginns wird mit jedem ApoE4-Allel herabgesetzt. Bis zu dem Alter von 80 Jahren entwickeln praktisch alle Personen, die homozygot für ApoE4 sind, Alzheimer-Krankheit. Siehe E. Corder et al., Science 261, 921 (1993). So wird die Krankheit als codominantes Merkmal vererbt und manifestiert sich, wenn die Individuen lange genug leben, um gefährdet zu sein. Diese Arbeit stellt ein wichtiges diagnostisches und prognostisches Werkzeug zur Identifizierung von Patienten mit Alzheimer-Krankheit oder Personen, die in Gefahr sind, Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, bereit. Sie zeigt jedoch nicht direkt eine zugrundeliegende Ursache für Alzheimer-Krankheit an.

Alzheimer-Krankheit wird von der Bildung neurofibrillärer Tangles und der Ablagerung von Amyloid-beta-Peptid (A&bgr;) begleitet. Es wird allgemein akzeptiert, daß Demenz bei Alzheimer-Krankheit besser mit der Pathologie der neurofibrillären Tangles als mit dem Ausmaß der A&bgr;-Ablagerung korreliert. Diese neurofibrillären Tangles enthalten gepaarte helikale Filamente, deren Hauptbestandteil abnorm phosphoryliertes Tau (Ptau), ein Mikrotubulus-assoziiertes Protein, ist. Jedoch ist der genaue Grund für die Ansammlung von Ptau und die daraus folgende Bildung von neurofibrillären Tangles nicht bekannt.

Das Mikrotubulus-assoziierte Protein MAP2c bewirkt auch Aufbau und Stabilität des Mikrotubulus. Tau und MAP2 sind beide Mitglieder einer Familie neuronaler Mikrotubulus-assoziierter Proteine (MAPS), die den Mikrotubulusaufbau fördern und Mikrotubuli stabilisieren.

Sowohl Tau- als auch MAP2-Protein enthalten einen Wiederholungsbereich hochkonservierter Mikrotubulusbindung, obgleich der Wiederholungsbereich von jedem sich in der Sequenz unterscheidet (siehe Lewis et al., Science 242, 936 (1988); Bulinski, MAP4, in Microtubules, Hyams und Lloyd (Hrsg.), Wiley-Liss, New York, S. 167–182 (1994)). MAP2c ist eine 70-kDa-Form von MAP2, die aus alternativem mRNA-Splicing des MAP2-Gens entsteht (Garner und Matus, J. Cell. Biol., 106, 779 (1988)). Wie andere Formen von MAP2 enthält MAP2c drei oder vier Kopien der Mikrotubulus-Bindungswiederholungen, welche in hohem Maße homolog zu den Mikrotubulus-Bindungswiederholungen von Tau sind.

V. Ingram und H. Roder, PCT-Anmeldung WO 93/03148, beschreiben die Verwendung von Inhibitoren der Kinasen PK40 und PK36 (z. B. ATP), um die Bildung von gepaarten helikalen Filamenten in Zellen zu hemmen, um die Bildung von neurofibrillären Tangles in Zellen zu hemmen und um Alzheimer-Krankheit bei Patienten zu behandeln.

C. Preston und I. Ace, PCT-Anmeldung WO 91/02788, beschreiben die Verabreichung der Nervenwachstumsfaktor-Beta-Untereinheit durch eine Mutante des Herpes-simplex-Virus Typ 1 für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß ApoE3 begierig an das Tau-Protein bindet, aber ApoE4 das nicht tut, daß weder ApoE3 noch ApoE4 an phosphoryliertes Tau bindet und daß ApoE3 begierig an das MAP2c-Protein bindet, aber ApoE4 das nicht tut. So stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Bildung von gepaarten helikalen Filamenten und/oder neurofibrillären Tangles in einer Zelle durch Verabreichen an (oder Einführen in) die Zelle entweder eines Apolipoproteins E, welches an Tau bindet (z. B. ApoE2, ApoE3), oder eines Apolipoprotein-E-Fragments, welches an Tau in dieser Zelle bindet, bereit. Die Verabreichung kann entweder durch Zuführen des wirksamen Mittels direkt in die Zelle oder durch Zuführen von genetischem Material in die Zelle, welches dann wieder das wirksame Mittel in die Zelle zuführt, ausgeführt werden.

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung für die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles und/oder der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, von ApoE, welches an Tau bindet, oder eines Fragments davon, welches an Tau bindet.

Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, umfassend ein ApoE, welches an Tau bindet, oder ein Fragment davon, welches an Tau bindet, (d. h. „das wirksame Mittel") in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Vorzugsweise ist der Träger einer, der das wirksame Mittel durch die Blut-Hirn-Schranke trägt. So stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines wie vorstehend angegebenen wirksamen Mittels für die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles und/oder die Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit bereit.

Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung für die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, eines wirksamen Mittels, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apolipoprotein E, welches an Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2c (MAP2c) bindet, und Apolipoprotein-E-Fragmenten, welche an MAP2c binden, in einer Menge, die wirksam ist, um Alzheimer-Krankheit bei dem Patienten zu bekämpfen.

Ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, verwendbar zur Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit, umfassend ein wirksames Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ApoE, welches an MAP2 bindet, und Fragmenten davon, welche an MAP2 binden, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, wie vorstehend bemerkt, die Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles und/oder der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, indem an einen Patienten ein Vektor verabreicht wird, der imstande ist, in die Nervenzellen einzutreten. Der Vektor kann entweder sein (a) ein Vektor, der eine Nucleinsäure trägt, kodierend ein ApoE, welches Tau oder Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2c (MAP2c) bindet, oder eines Fragments davon, welches Tau oder MAP2c bindet, welche Nucleinsäure operabel mit einem Promotor assoziiert ist, welcher die Nucleinsäure in einer Nervenzelle exprimiert; oder (b) ein Vektor, enthaltend eine Nucleinsäure, welche imstande ist, in einer Nervenzelle das Codon des ApoE-Gens, kodierend die Aminosäure am Rest 112 darin, in Cystein umzuwandeln (z. B. das Apo4-Gen in vivo in das Apo3-Gen umzuwandeln, indem das Codon, das Arginin kodiert, in Cystein am Rest 112 umgewandelt wird).

Ebenfalls offenbart hierin sind ein Vektor, wie vorstehend beschrieben, pharmazeutische Formulierungen, enthaltend einen derartigen Vektor, und die Verwendung derartiger Vektoren für die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles und/oder der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf.

Die vorhergehenden und andere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden ausführlich in den Zeichnungen hierin und in der nachstehend angegebenen Beschreibung erklärt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 veranschaulicht die Bindung des Tau-Proteins an ApoE3.

2A veranschaulicht die pH-unabhängige Bindung von Tau an ApoE3 und die Abwesenheit der Bindung von phosphoryliertem Tau an ApoE3.

2B veranschaulicht die Abwesenheit der Tau-Bindung an ApoE4 und die Abwesenheit der Bindung von phosphoryliertem Tau an ApoE4.

3 veranschaulicht die Bindung verschiedener ApoE3-Fragmente an Tau.

4 veranschaulicht den Zeitverlauf der Bindung von MAP2c an ApoE3; der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an.

5 veranschaulicht die Abwesenheit der Bindung von MAP2c an ApoE4.

6 veranschaulicht die Konzentrationsabhängigkeit von ApoE3 bei der Bindung von MAP2c. Der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an.

7 veranschaulicht die Konzentrationsabhängigkeit von MAP2c bei der Bindung von ApoE3. Der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zellen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden, sind typischerweise Säugerzellen (z. B. Mensch, Hund, Katze, Ratte, Maus) und sind typischerweise Nervenzellen. Die Nervenzellen können Nervenzellen des zentralen Nervensystems oder des peripheren Nervensystems sein.

Die Zellen können in vitro oder in vivo in einem tierischen Wirt behandelt werden. Das Verfahren ist beim Analysieren des Beitrages der Tau-Phosphorylierung zu der Zellerhaltung, ebenso wie beim Analysieren des Beitrages der Tau-Phosphorylierung, der Bildung gepaarter helikaler Filamente und/oder der Bildung neurofibrillärer Tangles zu der neurozellulären Degenerierung sowohl in vitro als auch in vivo verwendbar. Das Verfahren ist auch beim Analysieren des Beitrags von MAP2c-Protein zu neurozellulärer Degeneration sowohl in vitro als auch in vivo verwendbar.

Geeignete Patienten für die Ausführung der vorliegenden Erfindung sind typischerweise männliche oder weibliche menschliche Patienten und schließen sowohl diejenigen, bei denen vorher festgestellt worden ist, daß sie gefährdet sind, Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, als auch diejenigen, bei denen anfänglich diagnostiziert worden ist, daß sie an Alzheimer-Krankheit leiden, ein. Zum Beispiel sind Patienten, bei denen diagnostiziert oder festgestellt ist, daß sie an Demenz leiden, besonders Patienten, die zuvor klinisch normal gewesen sind, bei denen festgestellt ist, daß sie an progressiver Demenz leiden, geeignete Versuchspersonen. Die vorliegende Erfindung kann bei der Bekämpfung sowohl von familiärer Alzheimer-Krankheit (spät beginnend und früh beginnend) als auch von sporadischer Alzheimer-Krankheit angewandt werden. Eine zu bevorzugende Gruppe von Versuchspersonen sind diejenigen, bei denen festgestellt worden ist, daß sie heterozygot oder homozygot für das ApoE4-Gen sind. Verfahrensweisen zum Auswählen und Bewerten von Versuchspersonen werden weiterhin diskutiert in A. Roses, W. Strittmatter, G. Salvensen, J. Enghild und D. Schmichel, Methods of Detecting Alzheimer's Disease (Verfahren zum Nachweisen der Alzheimer-Krankheit), US-Patentanmeldung, Seriennummer 08/114448, eingereicht am 31. August 1993 (Anwaltsregister-Nr. 5405-75A), welche eine teilweise Fortsetzung von A. Roses et al. US-Patentanmeldung, Seriennummer 07/959992 (eingereicht 13. Oktober 1992) ist (siehe auch W. Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1977 (1992); E. Corder et al., Science 261, 921 (1993 )).

Die Begriffe „bekämpfen" und „Bekämpfung", wie sie hier verwendet werden, sollen keine Umkehrung der Bildung gepaarter helikaler Filamente, der Bildung neurofibrillärer Tangles oder des Alzheimer-Krankheitsprozesses anzeigen, sondern sie sollen statt dessen eine Verlangsamung dieser Ereignisse, wie beispielsweise eine Verzögerung des Beginns von Demenz oder eine Verlangsamung des Fortschreitens von Demenz anzeigen. So kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung entweder therapeutisch bei einem Patienten ausgeführt werden, bei dem anfängliche Zeichen von Alzheimer-Krankheit vorhanden sind, oder prophylaktisch bei einer Versuchsperson, die gefährdet ist, Alzheimer-Krankheit zu entwickeln.

ApoE2, ApoE3 und Fragmente davon, welche an Tau-Protein und/oder MAP2c-Protein binden, ("wirksame Mittel") können nach Standardtechniken hergestellt werden. Fragmente, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung angewendet werden, können Peptide, abgeleitet von ApoE, sein, die N-terminale, C-terminale oder sowohl N-terminale als auch C-terminale Aminosäurereste deletiert haben, aber die biologische Aktivität des Stammproteins, wie hier beschrieben, behalten (z. B. vorzugsweise ein Cystein in der Position in dem Fragment, entsprechend der Position l 12 des vollständigen ApoE2- oder ApoE-3-Proteins, behalten und Tau an der Stelle, gebunden durch vollständiges ApoE3, binden) und MAP2c an der Stelle, gebunden durch vollständiges ApoE3, binden. Zu Beispielen derartiger Fragmente, die Tau binden, gehören die ApoE3-Fragmente 1–191, 1–244 und 1–272 (wobei 1 die N-terminale Aminosäure des ursprünglichen Moleküls bezeichnet). Derartige wirksame Fragmente können durch enzymatische Digestion eines ApoE (insbesondere ApoE3 oder ApoE4), durch direkte Synthese oder durch Verfahrensweisen der Gentechnik hergestellt werden. Verfahren zur Bewertung der Bindung derartiger Fragmente an Tau oder an MAP2c sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Es ist ebenfalls leicht ersichtlich, daß einige Fragmente imstande sein können, sowohl Tau- als auch MAP2c-Proteine zu binden.

Die Begriffe ApoE (z. B. ApoE2, ApoE3) und ApoE-Fragmente, wie sie verwendet werden, sollen die Analogen davon einschließen. Ein „Analoges" ist eine chemische Verbindung, ähnlich in der Struktur einer anderen, welche eine ähnliche physiologische Wirkung hat (z. B. ein anderes Peptid). Solche Analoge können am Anfang durch Hinzugeben, Verändern oder Deletieren von Aminosäuren hergestellt werden. Zum Beispiel können von 1 bis 5 zusätzliche Aminosäuren zu dem terminalen N, terminalen C oder sowohl dem terminalem N als auch dem terminalen C eines wirksamen Fragments hinzugegeben werden. In einem anderen Beispiel können eine oder mehrere Aminosäuren einer synthetischen Peptidsequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt werden, welche die Aktivität dieser Sequenz nicht beeinflussen. Analoge können auch kleine organische Verbindungen sein, die die Aktivität der Stammverbindung, wie beispielsweise ApoE3, nachahmen oder sie haben, wie hierin beschrieben ist (z. B. an das Tau-Protein an der Bindungsstelle, gebunden durch ApoE3, binden). Änderungen in der Stammverbindung zum Aufbau des Analogen können durch bekannte Ähnlichkeiten zwischen Aminosäuren und anderen Molekülen oder Substituenten in physikalischen Merkmalen, wie beispielsweise Ladungsdichte, Hydrophobie, Hydrophilie, Größe und Konfiguration usw., gesteuert werden. Zum Beispiel kann Thr durch Ser ersetzt werden und umgekehrt, kann Asp durch Glu ersetzt werden und umgekehrt und kann Leu durch Ile ersetzt werden und umgekehrt. Weiterhin kann die Auswahl von Analogen durch dem Fachmann bekannte Techniken des Massenscreenings (z. B. Screening nach Verbindungen, die an die Bindungsstelle an dem Tau-Protein, gebunden durch ApoE3, binden) getroffen werden.

Wirksame Mittel der vorliegenden Erfindung können für sich oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes verabreicht werden. Zu solchen pharmazeutisch verträglichen Salzen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, diejenigen, die aus den folgenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoff , Bromwasserstoff , Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Salicyl-, p-Toluolsulfon-, Wein-, Zitronen-, Methansulfon-, Ameisen-, Malon-, Succin-, Naphthalin-2-sulfon- und Benzolsulfonsäure. Außerdem können pharmazeutisch verträgliche Salze, wie beispielsweise Alkalimetall- oder Erdalkalisalze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze einer Carbonsäuregruppe, hergestellt werden.

Die Menge von wirksamem Mittel, die an eine Versuchsperson zu verabreichen ist, variiert abhängig von dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten, dem besonderen wirksamen Mittel, das zugeführt wird, dem Zuführungsplan und anderen derartigen Faktoren, aber beträgt im allgemeinen von 0,1 Nanogramm bis 100 Mikrogramm, und beträgt typischerweise eine Menge in dem Bereich von 1 Nanogramm bis 10 Mikrogramm.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung enthalten, können in entweder flüssiger oder fester Form hergestellt werden. Um die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung herzustellen, werden eines oder mehrere der wirksamen Mittel entsprechend herkömmlichen pharmazeutischen Compoundierungstechniken innig mit einem pharmazeutischen Träger vermischt, und dieser Träger kann eine breite Vielfalt von Formen annehmen, die von der Form der Zubereitung abhängen, die für die Verabreichung gewünscht wird, z. B. oral oder parenteral (z. B. intravenös, subkutan, intrathekal). Bei der Herstellung der Zusammensetzungen in oraler Dosierungsform kann ein beliebiges der gewöhnlichen pharmazeutischen Medien angewendet werden. Somit gehören für flüssige orale Zubereitungen, wie zum Beispiel Suspensionen, Elixiere und Lösungen, zu geeigneten Trägern und Zusatzstoffen Wasser, Glycole, Öle, Alkohole, Duftmittel, Konservierungsstoffe, Färbemittel und dergleichen; für feste orale Zubereitungen, wie zum Beispiel Pulver, Kapseln und Tabletten, gehören zu geeigneten Trägern und Zusatzstoffen Stärken, Zucker, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Schmiermittel, Bindemittel, Aufschlußmittel und dergleichen. Wegen ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste Form der oralen Dosierungseinheit dar, und in diesem Fall werden selbstverständlich feste pharmazeutische Träger verwendet. Wenn gewünscht, können Tabletten durch Standardtechniken zuckerbeschichtet oder enterisch beschichtet werden. Für parenteral injizierbare Zusammensetzungen wird der Träger gewöhnlich steriles pyrogenfreies Wasser oder sterile, pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung umfassen, obgleich andere Bestandteile, zum Beispiel für Zwecke wie Unterstützung der Löslichkeit oder zur Konservierung, eingeschlossen werden können. Parenteral injizierbare Suspensionen (z. B. für intravenöse oder intrathekale Injektion) können ebenfalls hergestellt werden, in welchem Fall geeignete flüssige Träger, Suspendiermittel und dergleichen angewendet werden können.

Wenn notwendig, kann die pharmazeutische Zusammensetzung so hergestellt werden, daß das wirksame Mittel durch die Blut-Hirn-Schranke hindurchtritt. Ein Weg, um den Transport durch die Blut-Hirn-Schranke zu bewerkstelligen, ist, das wirksame Mittel mit einem sekundären Molekül (einem „Träger"), welches entweder ein Peptid oder eine nichtproteinartige Einheit ist, zu koppeln oder zu paaren. Der Träger wird so ausgewählt, daß er imstande ist, die Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen. Beispiele geeigneter Träger sind Pyridinium-, Fettsäure-, Inositol-, Cholesterin- und Glucosederivate. Alternativ kann der Träger eine Verbindung sein, die durch ein spezifisches Transportsystem in Endothelzellen des Gehirns, wie beispielsweise Transportsysteme zur Übertragung von Insulin oder den insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II, in das Gehirn eintritt. Diese Kombination von wirksamem Mittel und Träger wird ein Prodrug genannt. Beim Eintreten in das zentrale Nervensystem kann das Prodrug intakt bleiben oder kann die chemische Verknüpfung zwischen dem Träger und dem wirksamen Mittel hydrolysiert werden, wodurch der Träger von dem wirksamen Mittel getrennt wird. Siehe allgemein die US-Patentschrift 5017566 von Bodor.

Ein alternatives Verfahren zum Transportieren des wirksamen Mittels durch die Blut-Hirn-Schranke ist, den Träger in ein Lipidvesikel, wie beispielsweise ein Mikrokristall oder Liposom, einzukapseln. Solche Lipidvesikel können einzeln oder mehrschichtig sein und das wirksame Mittel entweder in ihrer Mitte oder zwischen ihren Schichten einkapseln. Solche Zubereitungen sind bekannt. Zum Beispiel beschreibt die PCT-Anmeldung WO 91/04014 von Collins et al. ein Liposomzuführungssystem, in welchem das therapeutische Mittel innerhalb des Liposoms eingekapselt ist und zu der äußeren Schicht des Liposoms Moleküle hinzugefügt worden sind, die normalerweise durch die Blut-Hirn-Schranke transportiert werden. Solche Liposome können auf endogene Hirntransportsysteme zielen, die spezifische Liganden durch die Blut-Hirn-Schranke transportieren, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, der Übertragung von Insulin und den insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II. Alternativ können Antikörper zu Hirnendothelzellen-Rezeptoren für solche Liganden zu der äußeren Liposomschicht hinzugefügt werden. Die US-Patentschrift 4704355 von Bernstein beschreibt Verfahren zum Koppeln von Antikörpern mit Liposomen.

Ein anderes Verfahren der Formulierung des wirksamen Mittels für den Durchtritt durch die Blut-Hirn-Schranke ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben herzustellen, wobei das wirksame Mittel in Cyclodextrin eingekapselt wird. Ein beliebiges geeignetes Cyclodextrin, welches durch die Blut-Hirn-Schranke hindurchtritt, kann angewendet werden, einschließlich &bgr;-Cyclodextrin, &ggr;-Cyclodextrin und Derivaten davon. Siehe allgemein die US-Patentschrift 5017566 von Bodor; die US-Patentschrift 5002935 von Bodor; die US-Patentschrift 4983586 von Bodor.

Ein anderes Verfahren zum Hindurchführen des wirksamen Mittels durch die Blut-Hirn-Schranke ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben herzustellen und zu verabreichen, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Glycerolderivat einschließt, wie in der US-Patentschrift 5153179 beschrieben ist.

In einer alternativen Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung ausgeführt, indem an den Patienten ein Vektor verabreicht wird, der eine Nucleinsäure als wirksames Mittel trägt, welcher Vektor imstande ist, in Nervenzellen einzutreten. Derartige Vektoren können mit pharmazeutischen Trägem formuliert und in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben verabreicht werden. Geeignete Vektoren sind typischerweise virale Vektoren, die DNA-Viren (wobei das wirksame Nucleinsäure-Mittel DNA ist) und RNA-Viren oder Retroviren (wobei das wirksame Nucleinsäure-Mittel RNA ist) einschließen. Es wird bevorzugt, aber nicht wesentlich, daß der Vektor ein neurotroper Vektor ist, der vorzugsweise Nervenzellen infiziert. Techniken zur Ausführung der Gentherapie sind bekannt. Siehe z. B. T. Friedmann, Progress Toward Human Gene Therapy (Fortschritt in Richtung humaner Gentherapie), Science 244, 1275 (1989); 1. Pastan, US-Patentschrift 5166059.

Verfahren zum Hindurchführen von genetischem Material durch die Blut-Hirn-Schranke, speziell von viralem oder retroviralem Capsidmaterial, sind in der US-Patentschrift 4866042 von Neuwelt beschrieben.

Herpes-Virus-Vektoren (z. B. Herpes-Virus Typ 1, Herpes-Virus Typ 2, Cytomegalovirus) sind ein besonderer Typ von Vektor, welcher angewendet werden kann, um die vorliegende Erfindung auszuführen. Vektoren des Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) werden besonders bevorzugt. Solche Vektoren umfassen im allgemeinen mindestens die Capsidbildungssegmente eines HSV-1-DNA-Genoms in einem HSV-1-viralen Capsid. Die HSV-1-DNA trägt ein heterologes DNA-Insert, welches entweder das DNA-Molekül des wirksamen Mittels enthält oder das DNA-Molekül enthält, welches das zu exprimierende Peptid oder Protein enthält. Wo das Insert-DNA-Molekül ein Protein oder Peptid kodiert, steht das Insert unter Kontrolle eines Promotors, der in Nervenzellen operativ ist, so daß das Protein oder Peptid in Nervenzellen exprimiert wird. Der Promotor kann eine beliebige geeignete Herkunft einschließlich viraler Herkunft haben (z. B. Promotoren, welche die Latenz-assoziierten Transkripte (Lat-s) von HSV-1 steuern; der Immediate-Early-4/5-Promotor von HSV-1) und aus Promotoren bestehen, die normalerweise in Säuger-Nervenzellen operabel sind (z. B. der Tau-Protein-Promotor). Das heterologe Insert wird typischerweise in eine beliebige Region des viralen Genoms insertiert, welche für die Kultur des Virus nicht wesentlich ist, um die Produktion davon in Zellkultur und wenn notwendig in Helferzellen zu ermöglichen. Solche Herpes-Virus-Vektoren sind bekannt. Siehe z. B. A. Geller und X. Breakefield, Science, S. 1667 (23. Sept. 1988); C. Ace et al., J. Virol. 63, 2260 (1989); C. Preston et al., PCT-Anmeldung WO 91/02788.

Ein Promotor ist für homologe Rekombinationsstrategien nicht wesentlich. In derartigen Strategien umfaßt, an Stelle einer DNA, die exprimiert werden soll, das heterologe Insert ein DNA-Molekül, welches imstande ist, in einer Nervenzelle durch homologe Rekombination das Codon des ApoE-Gens, kodierend die Aminosäure am Rest 112 darin, in Cystein umzuwandeln. Das DNA-Molekül hat typischerweise eine Länge von 50 oder 100 bis 300 oder 5000 Nucleotiden und ist ausreichend homolog zu der chromosomalen ApoE4-DNA als Ziel, um an den komplementären Strang davon anzulagern und mit dem Teil des chromosomalen DNA-Segments, welcher das Codon, kodierend den ApoE4-Aminosäurerest 112, enthält, durch homologe Rekombination auszutauschen, wodurch das den Rest 112 kodierende Codon in ein Cystein kodierendes umgewandelt wird. Verfahrensweisen der homologen Rekombination sind bekannt. Siehe z. B. O. Smithies, Nature 317, 230 (1985); W. Bertling, US-Patentschrift 4950599.

Hier wird auch ein Verfahren zum Screening von Verbindungen nach der Fähigkeit offenbart, eine oder mehrere von den Wirkungen der Bindung von Tau, der Hemmung der Phosphorylierung von Tau, der Hemmung der Bildung gepaarter helikaler Filamente, der Hemmung der Bildung neurofibrillärer Tangles und der Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit, zu erreichen. Ein derartiges Verfahren umfaßt, eine Testverbindung mit dem Tau-Protein in Kontakt zu bringen und dann nachzuweisen, ob die Testverbindung an die Bindungsstelle an Tau bindet, welche durch ApoE3 gebunden ist. Das Format des Tests und die Art, in der der Schritt des Inkontaktbringens ausgeführt wird, ist nicht kritisch, und eine Vielfalt von Möglichkeiten wird dem Fachmann leicht ersichtlich sein. Typischerweise wird der Schritt des Inkontaktbringens in vitro in einer wässerigen Lösung ausgeführt und wird der Schritt des Nachweisens mittels eines kompetitiven Bindungstests ausgeführt, bei welchem eine bekannte Verbindung, die an die ApoE3-Bindungsstelle an Tau bindet, wie vorstehend beschrieben ist, in die Lösung eingeschlossen wird und die Fähigkeit der Testverbindung, die Bindung der bekannten Verbindung zu hemmen, bestimmt wird. Für derartige Tests wird die bekannte Verbindung mit einer geeigneten nachweisbaren Gruppe, wie beispielsweise Tritium, markiert. Andere Tests, wie beispielsweise die Tests der Verschiebung der Gelmobilität, können ebenfalls angewendet werden. Das Vorhandensein von Bindung an die Stelle, die durch ApoE3 gebunden ist, zeigt an, daß die Verbindung verwendbar ist oder sein kann, um eine oder mehrere der vorstehend vermerkten Wirkungen zu erreichen. Die in dieser Weise nachgewiesenen Verbindungen sind für die Untersuchung in vitro und in vivo der Tau-Phosphorylierung, der Bildung gepaarter helikaler Filamente, der Bildung neurofibrillärer Tangles und die Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbar.

Ebenfalls offenbart hierin ist ein Verfahren zum Screening von Verbindungen auf die Fähigkeit, eine oder mehrere der Wirkungen der Bindung von MAP2c und der Bekämpfung von Alzheimer-Krankheit zu erreichen. Ein derartiges Verfahren umfaßt Inkontaktbringen einer Testverbindung mit dem MAP2c-Protein und dann Nachweisen, ob die Testverbindung an die Bindungsstelle an MAP2c bindet, welche durch ApoE3 gebunden ist. Das Format des Tests und die Art, durch welche der Schritt des Inkontaktbringens ausgeführt wird, ist nicht kritisch, und eine Vielfalt von Möglichkeiten wird dem Fachmann leicht ersichtlich sein. Typischerweise wird der Schritt des Inkontaktbringens in vitro in einer wässerigen Lösung ausgeführt und wird der Schritt des Nachweisens mittels eines kompetitiven Bindungstests ausgeführt, bei welchem eine bekannte Verbindung, die an die ApoE3-Bindungsstelle an MAP2c, wie vorstehend beschrieben, bindet, in die Lösung eingeschlossen wird und die Fähigkeit der Testverbindung, die Bindung der bekannten Verbindung zu hemmen, bestimmt wird. Für derartige Tests wird die bekannte Verbindung mit einer geeigneten nachweisbaren Gruppe, wie beispielsweise Tritium, markiert. Andere Tests, wie beispielsweise Tests der Verschiebung der Gelmobilität, können ebenfalls angewendet werden. Das Vorhandensein von Bindung an die Stelle, die durch ApoE3 gebunden ist, zeigt an, daß die Verbindung verwendbar ist oder sein kann, um eine oder mehrere der vorstehend vermerkten Wirkungen zu erreichen. Die in dieser Weise nachgewiesenen Verbindungen sind für die Untersuchung in vitro oder in vivo von neurozellulärer Degeneration und die Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbar.

Die vorliegende Erfindung wird in größerer Ausführlichkeit durch die folgenden Beispiele erklärt. Diese Beispiele sind für die vorliegende Erfindung veranschaulichend und sind nicht als deren Begrenzung auszulegen.

BEISPIEL 1 APOE3 BINDET AN TAU-PROTEIN

Rekombinantes Tau-40 (die größte Tau-Isoform im Gehirn) wurde in Übereinstimmung mit bekannten Techniken exprimiert und gereinigt (siehe M. Goedert et al., Neuron 3, 519 (1989)). ApoE wurde, ebenfalls in Übereinstimmung mit bekannten Techniken, von Individuen, homozygot für ApoE3 oder ApoE4, gereinigt (siehe S. Rall et al., Methods Enzymol. 128, 273 (1986)). Das aminoterminale 22-kDa-Fragment von ApoE3 oder ApoE4 wurde durch Thrombinspaltung hergestellt (siehe W. Bradley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 109, 1360 (1982)). Tau-40 (2 &mgr;g Protein) und ApoE (2 &mgr;g Protein) wurden in einem Gesamtvolumen von 20 &mgr;l phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,30, für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wurde durch Hinzufügen von 20 &mgr;l von 2 × Laemmli-Puffer ohne &bgr;-Mercaptoethanol (außer den Bahnen 9 und 10, die 0,2 Vol.-% &bgr;-Mercaptoethanol enthielten) beendet. Die Proben wurde für 5 min in siedendem Wasser erhitzt. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf einem 7,5%-Polyacrylamid-Gel getrennt und auf Immobilon P überführt. Die Membran wurde in Übereinstimmung mit Standardtechniken gewaschen und über Nacht in primärem Antikörper inkubiert. Der primäre Antikörper ist ein im Handel erhältlicher monoklonaler Anti-Tau-Antikörper (erhalten von Boehringer, Mannheim), verdünnt 1 : 2000 in Blotto (5% getrocknete Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,6). Nach dem Waschen wurde die Membran mit Ziegen-anti-Maus-F(ab')2, konjugiert mit Meerettichperoxidase (1 : 1500), für eine Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Meerettichperoxidase mit einem Nachweis-Kit mit verbesserter Chemilumineszenz (Amersham) sichtbar gemacht und Hyperfilm ECL ausgesetzt (siehe Y. Namba et al., Brain Res. 541, 163 (1991)).

In 1 sind Werte angegeben, welche eine Demonstration der Bindung von Tau an ApoE3 bereitstellen. Der geschlossene Pfeil zeigt die Position des ApoE3/Tau-Komplexes an; der offene Pfeil zeigt die Position des aminoterminalen 22-kDa-Fragments des ApoE3/Tau-Komplexes an. Die Bedingungen für die verschiedenen Bahnen sind wie folgt: Bahn 1) Tau-40 allein; Bahn 2) Tau-40 und ApoE3; Bahn 3) Tau-40 und ApoE4; Bahn 4) Tau-40 und aminoterminales 22-kDa-Fragment von ApoE3; Bahn 5) Tau-40 und 22-kDa-Fragment von ApoE4; Bahn 6) ApoE3 allein; Bahn 7) ApoE4 allein; Bahn 8) Blindprobe; Bahn 9) Tau-40 und ApoE3, inkubiert und dann in Laemmli mit &bgr;-Mercaptoethanol gekocht; Bahn 10) Tau-40 und ApoE4, inkubiert und dann in Laemmli mit &bgr;-Mercaptoethanol gekocht.

Diese Werte zeigen, daß in vitro ApoE3 rekombinant exprimiertes Tau bindet, wobei ein bimolekularer Komplex gebildet wird, der Dissoziation durch Kochen in 2%igem Natriumdodecylsulfat widersteht. Wie in 1 gezeigt ist, hat der ApoE3/Tau-Komplex ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 105000 Dalton (Tau-40-Isoform in diesen Experimenten, 68000 Dalton; glycosyliertes ApoE3, 39000 Dalton) und wird in keiner Proteinzubereitung allein beobachtet. Die Bindung von Tau und ApoE3 ist innerhalb von dreißig Minuten bei 37°C maximal und ist zwischen pH 7,6,6 vorhanden. Der ApoE3/Tau-Komplex wird durch Kochen mit dem Reduktionsmittel &bgr;-Mercaptoethanol zerstört (1).

BEISPIEL 2 UND 3 APOE4 BINDET NICHT AN TAUWEDER APOE3 NOCH APOE4 BINDEN AN PHOSPHORYLIERTES TAU

Die pH-unabhängige Bindung von Tau und ApoE3, die Abwesenheit von Tau-Bindung mit ApoE4 und die Abwesenheit von Bindung von phosphoryliertem Tau mit entweder ApoE3 oder ApoE4 sind in 2A und 2B gezeigt. ApoE3 (2A) oder ApoE4 (2B) wurden mit entweder Tau-40 (Bahnen 1–5 in sowohl 2A als auch 2B) oder phosphoryliertem Tau-40 (Bahnen 6–10 in sowohl 2A als auch 2B) in Zitronensäure-Na2HPO4-Puffer (6) bei dem angezeigten pH für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wurde, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, gestoppt, die Proteine wurden durch Elektrophorese getrennt und dann auf Immobilon überführt. Tau-immunoreaktives Material wurde wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben nachgewiesen. In 2A und 2B zeigt der geschlossene Pfeil die Position des ApoE3/Tau-Komplexes an und zeigen offene Pfeile vorhergesagte Positionen von ApoE4/Tau- oder ApoE3/P-Tau-Komplexen an. Phosphoryliertes Tau wurde durch Inkubieren von rekombinantem Tau-40 mit dem Überstand von homogenisiertem Gehirn in Übereinstimmung mit bekannten Techniken (siehe J. Biernat et al., EMBO J. 11, 1593 (1992)) hergestellt. Man beachte die langsamere Wanderung von phosphoryliertem Tau (markiert b), verglichen mit nichtphosporyliertem Tau (markiert a). Die 2A und 2B zeigen zusammengenommen, daß es unbedeutende Bindung von Tau durch ApoE4 unter einer Vielfalt von Bedingungen, einschließlich vermehrter Dauer der Inkubation, vermehrter Konzentration von ApoE4 oder zwischen pH 7,6–4,6 gibt.

In gepaarten helikalen Filamenten ist Tau an ser-pro- und thr-pro-Stellen abnorm phosphoryliert (siehe N. Gustke et al., FEBS Letter 307, 199 (1992)). Rekombinantes Tau kann an diesen Stellen in Übereinstimmung mit bekannten Techniken durch Inkubation mit einem Extrakt von rohem Rattenhirn phosphoryliert werden (siehe J. Biernat et al., vorstehend). Rekombinantes Tau, das durch diese Mittel phosphoryliert war, wurde sogar mit verlängerter Inkubation von zwölf Stunden durch weder ApoE3 noch ApoE4 gebunden (2A und 2B).

BEISPIEL 4 HERSTELLUNG VON APOE3-FRAGMENTEN

Das Plasmid pTV 194, das ApoE3 mit voller Länge in Escherichia coli exprimiert (T. Vogel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8696–8700 (1985)), wurde modifiziert, um vier carboxylterminal verkürzte Varianten von ApoE3 zu erzeugen. Diese Varianten enden an den Resten 266 (Glu), 244 (Glu), 223 (Ser) und 191 (Arg). Sie unterscheiden sich von nativem ApoE3 nur dadurch, daß sie ein anfängliches Methionin an dem Aminoende haben und an dem endständigen Carboxyl verkürzt sind. Sie werden als Met-E266, Met-E244, Met-E223 bzw. Met-E191 bezeichnet. Die kürzeste Variante, Met-E191, ist mit dem 22-kDa-Thrombin-Fragment von ApoE (Reste 1–191) äquivalent. Die Verkürzungen wurden durch Einführen von Stopcodons erzeugt, wobei mutagene Primer und die Polymerasekettenreaktion verwendet wurden, um DNA-Inserts zu erzeugen, die in pTV 194 1igiert wurden.

Der Stamm E. coli N4830-1 (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) wurde mit den vorstehend beschriebenen Ligationsprodukten transformiert, und Kolonien auf Ampicillin-Platten wurden auf das Vorhandensein von Inserts und auf geeignete Proteinexpression gescreent. Die Integrität jedes Konstrukts wurde durch doppelsträngige DNA-Sequenzierung bestätigt (R. Kraft et al., BioTechniques 6, 544 (1988)). Humanes ApoE3 und seine zwei hauptsächlichen thrombolytischen Fragmente wurden in Übereinstimmung mit bekannten Techniken hergestellt (T. Innerarity et al., J. Biol. Chem. 258, 12341 (1983); S. Rall et al., Methods Enzymol. 128, 273 (1986)). Verkürzte Proteine wurden in Übereinstimmung mit Standardtechniken exprimiert und gereinigt (siehe H. Yorie et al., J. Biol. Chem. 267, 11962 (1992)). Gereinigte Proteine wurden in 100 mM NH4HCO3 dialysiert, nach dem Verfahren von Lowry (J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)) quantifiziert und bis zum Gebrauch bei –20°C gehalten. Durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), durchgeführt wie früher beschrieben (J. Wetterau et al., J. Biol. Chem. 263, 6240 (1988)), wurde bewertet, daß die Zubereitungen zu mehr als 98% rein waren.

BEISPIEL 5 APOE3-FRAGMENT-BINDUNG AN TAU

Die Bindung von ApoE3-Fragmenten an Tau ist in 3 gezeigt. Rekombinante Fragmente von ApoE3 wurden wie vorstehend in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und gereinigt, und 2 &mgr;g Protein wurden mit Tau-40 inkubiert, wie ebenfalls vorstehend beschrieben ist. Der Pfeil in 3 zeigt Tau-40, 68000 kDa, an. Die Bedingungen in 3 sind wie folgt: Bahn 1) Tau-40 allein; Bahn 2) Tau-40 und ApoE3 (natives Protein; Aminosäuren 1–299); Bahn 3) Tau-40 und aminoterminales 22-kDa-Fragment von ApoE3 (Aminosäuren 1–191); Bahn 4) Tau-40 und rekombinantes ApoE (Aminosäuren 1–244); Bahn 5) Tau-40 und rekombinantes ApoE (Aminosäuren 1–266), Bahn 6) Tau-40 und rekombinantes ApoE (Aminosäuren 1–272); Bahn 7) Tau-40 allein; Bahn 8) Tau-40 und ApoE4 (natives Protein; Aminosäuren 1–299); Bahn 9) Tau-40 allein.

ApoE enthält zwei funktionell wichtige Domänen, eine, die den LDL-Rezeptor, und die andere, die Lipoproteinteilchen bindet (VLDL oder HDL). Thrombin spaltet ApoE an den Resten 191 und 215 und ergibt ein aminoterminales 22-kDa-Fragment und ein carboxylterminales 10-kDa-Fragment (W. Bradley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 109, 1360 (1982); T. Innerarity et al., vorstehend). Die Rezeptorbindungsdomäne befindet sich innerhalb des aminoterminalen 22-kDa-Fragments, und das 10-kDa-Fragment enthält die Lipidbindungsregion von ApoE (N. Gustke et al., vorstehend) und die Region, die das A&bgr;-Peptid bindet. Tau bindet an das aminoterminale 22-kDa-Fragment von ApoE3 (1). Rekombinante ApoE3-Fragmente, 1–244, 1–266 und 1–272, binden äquivalente Mengen von Tau, verglichen mit denen, die durch das 22-kDa-Fragment (Aminosäuren 1–191) gebunden werden (3). So bindet Tau das Fragment von ApoE3, welches auch den LDL-Rezeptor bindet, in einer Region, unterschiedlich von der Domäne (zwischen den Aminosäuren 245–272), die Lipoproteinteilchen und das A&bgr;-Peptid bindet. Das aminoterminale 22-kDa-Fragment von ApoE4 bindet Tau nicht (1).

BEISPIEL 6 MAP2C BINDET AN APOE3, ABER NICHT AN APOE4

Ratten-MAP2c (siehe Kindler et al., J. Biol. Chem., 265, 19679 (1990)) wurde durch eine Modifizierung einer bekannten Verfahrensweise (Goedert and Jakes EMBO J. 9, 4225 (1990)) in Escherichia coli exprimiert. Das MAP2c-Protein wurde durch Innenaustausch-Chromatographie auf einer Säule Mono-S HR 5/5 (Pharmacia) unter Verwendung einer Modifizierung der zuvor beschriebenen Verfahrensweise von Goedert und Jakes gereinigt. Humane ApoE3- und ApoE4-Isoformen wurden unter Verwendung bekannter Techniken (siehe Rall et al., Methods Enzymol., 128, 273 (1986)) von Patienten mit den E3/3- und E4/4-homozygoten Phänotypen isoliert.

MAP2c (0,2 &mgr;g; endgültige Konzentration 3 × 10–7 M) wurde mit 0,1 &mgr;g ApoE3 oder ApoE4 (endgültige Konzentration 3 × 10–7 M) in einem Gesamtvolumen von 10 &mgr;l in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,30, bei 37°C für 1, 2 oder 4 Stunden inkubiert. Die Inkubation wurde durch Hinzufügen von 10 &mgr;l von 2 × Laemmli-Puffer (2% Natriumdodecylsulfat, ohne (3-Mercaptoethanol) beendet. Die Proben wurden für 5 Minuten in siedendem Wasser erhitzt. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel getrennt und dann auf eine PVDF-Membran (Millipore) überführt, wie früher beschrieben ist (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 8098 (1993)). Die Membran wurde in Übereinstimmung mit Standardtechniken gewaschen und über Nacht in Antikörper inkubiert. Der primäre Antikörper war ein im Handel erhältlicher monoklonaler Anti-MAP2-Antikörper (erhalten von Boehringer, Mannheim), der den MAP2c-ApoE-Komplex nachwies. Die Bindung von MAP2c an ApoE3, die einen in Natriumdodecylsulfat stabilen Komplex erzeugte, war innerhalb von 1 Stunde der Inkubation nachweisbar (4; der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an). Jedoch wurde, sogar nach einer Inkubation von 4 Stunden (Bahn E), keine derartige Bindung von MAP2c durch ApoE4 beobachtet. 4 zeigt Ergebnisse der MAP2c- und ApoE3-Inkubation; Ergebnisse der MAP2c- und der ApoE4-Inkubation sind in 5 gezeigt. In 4 und 5 erfolgte Inkubation mit rekombinantem MAP2c für 1 Stunde (Bahn C); 2 Stunden (Bahn D); 4 Stunden (Bahne E); oder 8 Stunden (Bahn F). Die Bahnen A und H enthalten ApoE und kein MAP2c; die Bahnen B und G enthalten MAP2c und kein ApoE.

Um die niedrigste Konzentration von ApoE3, die nachweisbar MAP2 bindet, zu bestimmen, wurden 0,2 &mgr;g MAP2c mit 0,1, 0,01 oder 0,001 &mgr;g (endgültige Konzentrationen von 3 × 10–7, 3 × 10–8 bzw. 3 × 10–9 M) ApoE3 in 10 &mgr;l PBS für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Wie in 6 zu sehen, war der MAP2c-ApoE3-Komplex noch bei einer ApoE3-Konzentration von 3 × 10–8 M nachweisbar. Die Menge von gebundenem ApoE3 nahm mit der Konzentration von ApoE3 zu. Die in 6 dargestellten ApoE3-Konzentrationen sind: 3 × 10–7 M (Bahn A); 3 × 10–8 M (Bahn B); und 3 × 10–9 M (Bahn C). Bahn D enthielt MAP2c und kein ApoE3. Der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an.

In ählicher Weise wurde die niedrigste Konzentration von MAP2c, die an ApoE3 bindet, bestimmt, indem 0,1 &mgr;g ApoE3 mit 0,2, 0,02 oder 0,002 &mgr;g MAP2c (endgültige Konzentration von 3 × 10 7, 3 × 10–8 bzw. 3 × 10–9 M) in 10 &mgr;l PBS für 2 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Die in 7 angegebenen Werte zeigten, daß der MAP2c-ApoE3-Komplex bei einer MAP2c-Konzentration von 3 × 10 9 M nachweisbar war. Die Menge des gebildeten Komplexes nahm mit der MAP2c-Konzentration zu. Die in 7 dargestellten MAP2c-Konzentrationen sind: 3 × 10–8 M (Bahnen A und B); 3 × 10–9 M (Bahnen C und D). Die Bahnen A und C enthielten kein ApoE3. Der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an.

Diese Ergebnisse demonstrieren, daß MAP2c mit hoher Avidität ApoE3 bindet, aber ApoE4 nicht bindet. Diese Ergebnisse unterstützen weiterhin die verallgemeinerte Schutzfunktion der ApoE3-Bindung an Mikrotubulus-assoziierte Proteine, einschließlich Tau.

BEISPIEL 7 APOE IST IN HIPPOKAMPALEN NEURONEN VORHANDEN

Immunozytochemie wurde verwendet, um ApoE3-Lokalisation in dem Hippokampus von histologisch bestätigten Fällen von Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD) und normalen Kontrollen zu vergleichen (Han et al., Experimental Neurology, im Druck). ApoE-Lokalisation wurde mit A&bgr;-nachgewiesener Plaque und Tau-nachgewiesener Tangle-Pathologie verglichen.

Verfahren: Gehirne wurden eine bis drei Stunden nach dem Tod von 24 AD-Patienten, 5 Patienten mit idiopathischer PD ohne Demenz, 8 PD-Patienten mit Demenz (AD-Pathologie) und sechs klinisch untersuchten nicht demenzkranker Patienten, die an nicht-neurologischer Krankheit starben, gesammelt. Die 24 AD-Patienten schlossen jeden hauptsächlichen ApoE-Genotyp ein: APOE 3/3, APOE 3/4 und APOE 4/4. Die pathologischen Diagnosen wurden durch Routineuntersuchung unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken gestellt. Der mittlere hippokampale Block mit angrenzendem unteren temporalen Gyrus wurde für immunozytochemische Analyse verwendet. APOE-Genotypisierung wurde für jeden Patienten wie früher beschrieben unter Verwendung von Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion ausgeführt (Saunders et al., Neurology, 43, 1467 (1993)).

Immunozytochemie: Routinemäßige Blöcke der hippokampalen Region, des Frontallappens und des Parietallappens, entnommen bei der Autopsie, wurden 5–7 Tage lang in 10%igem Formalin fixiert und dann zur pathologischen Analyse in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte von 6–8 Mikrometern wurden geschnitten und auf beschichteten Objektträgern für Immunozytochemie befestigt. Die Schnitte wurden entparaffiniert, für 3–5 Minuten mit 90%iger Ameisensäure behandelt, gewaschen und dann zur Immunlokalisation mit spezifischen Antikörpern inkubiert. Die verwendeten Antikörper waren: polyklonaler Kaninchenantikörper für humanes ApoE (Verdünnung 1 : 5000), welcher auf Western Blots eine einzelne Bande zeigt und mit allen ApoE-Isoformen reagiert (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977 (1993) und Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8098 (1993)); monoklonales Mäuse-„Clone Tau-2" für Rinder-Tau (Verdünnung 1: 1000, Leinco Technologies, St. Louis, MO), welches sowohl phosphoryliertes als auch nichtphosphoryliertes humanes Tau erkannte (Binder et al., 1985); monoklonales Mäuse-„Clone 10D5" für A&bgr; 1–28 (Athena Neurosciences), welches beta-gefaltetes A&bgr;-Fragment erkennt (Hyman et al., J. Neuropath. Exp. Neurol., 51, 76 (1992)). Kontrollen des Verfahrens, unter Auslassung von primärem Antikörper oder Substitution von anderen Mäuse-Monoklonalen, wurden mit jeden Durchlauf einbezogen. Für ApoE wurde Präimmunserum parallel mit den gleichen Konzentrationen wie der post-immune primäre Antikörper laufen gelassen. Parallele Kontrollen waren ungefärbt. Der Tau-Antikörper färbte bei Patienten mit AD-Pathologie zuverlässig und empfindlich senile oder neuritische Plaquen, Neuropilfäden und Neuronen mit mutmaßlichen neurofibrillären Tangles oder ungeordnetem Zytoskelett.

Immunozytochemie für ApoE wurde für jeden der vorstehenden Fälle auf routinemäßigen Paraffinschnitten von dem Paraffin-fixierten hippokampalen Block durchgeführt und mit Immunozytochemie von &bgr;-Amyloid (A&bgr;) und Tau kombiniert, um senile Plaque und neuronale Pathologie zu definieren. Die Ergebnisse spiegeln fest gebundenes ApoE wider, dessen Antigenität resistent gegenüber chemischer Fixierung, Extraktion während der Prozeduren der Fixierung, Dehydratisierung, Paraffineinbettung und Entwachsung war und weiterhin der Extraktion während der Ameisensäurebehandlung widerstand.

Immunozytochemische Analyse: Mehrere Personen beobachteten Schnitte von jedem Fall. In der Analyse wurden nur Schnitte von der hippokampalen Region verwendet. Neuronen, die als ApoE-immunoreaktiv angegeben wurden, waren diejenigen, die mehrere Felder zeigten, die immunoreaktive Neuronen enthielten, die dunkel genug waren, um mit einem 10X-Objektiv (2,92 mm2 Feld) bemerkt zu werden, und wo zytologische und immunochemische Identifizierung bei höherer Vergrößerung positiv war. Angrenzende Schnitte, analysiert auf ApoE-Tau-Colokalisation, wurden von zwei Beobachtern unter Verwendung der Camera Lucida und eines 20X-Objektivs untersucht. Jedes Feld wurde mit geeigneten Erkennungspunkten dargestellt und auf jedem Schnitt wurden immunoreaktive Neuronen verglichen.

Ergebnisse in Kontrollen und nicht demenzkranken PD-Patienten: Die Ergebnisse sind in TABELLE 1 angegeben. ApoE-Immunoreaktivität ließ Färbung von Gliazellen, deren Morphologie der von Astrozyten ähnelte, zahlreichen kleinen und größeren zerebralen Gefäßen und oftmals Ependymzellen, die den hippokampalen Recessus des Seitenventrikels auskleideten, sehen. Die am meisten intensive und übereinstimmende ApoE-Immunofärbung erfolgte in den Wänden zerebraler Gefäße (nicht gezeigt). Diese Färbung schloß kleine Parenchymgefäße ebenso wie an die Ependymgrenze angrenzende größere Gefäße ein. Meningeale Gefäße waren gewöhnlich nicht stark immunoreaktiv. ApoE-Immunoreaktivität (ApoE-IR) wurde auch in der gelegentlichen senilen Plaque (SP) oder im amyloiden Gefäß (ungeeignet, den CERAD1 Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (Konsortium zur Erstellung eines Registers für die Alzheimer-Krankheit) (CERAD). Siehe Mirra et al., Neurology, 41, 479 (1991). -Kriterien für AD-Diagnose zu entsprechen, außer in einem Fall, siehe TABELLE 1) beobachtet, welche leicht mit A&bgr;-Färbung in angrenzenden Schnitten nachgewiesen wurde. ApoE-IR wurde in Gliazellen beobachtet, von denen durch ihre Größe angenommen wurde, daß sie Astrozyten sind. Im allgemeinen variierte die Intensität von ApoE-Immunoreaktivität in Gehirnen von nicht demenzkranken Personen in breitem Maße, wobei vier von den sechs Fällen relativ schwache Färbung von Gefäßen und Gliazellen, kaum oberhalb des Untergrunds der Kontrollen, aufwiesen.

ApoE-Immunoreaktivität wurde in hippokampalen Neuronen von 2 der sechs nicht demenzkranken Kontrollgehirne gefunden. Das Gehirn eines Patienten (APOE 3/4) erfüllte die CERAD-Kriterien für AD-Pathologie für Plaque-Zählungen, aber hatte im wesentlichen keine neurofibrillären Tangles (keine Werte angegeben). Die andere normale Kontrolle (APOE 3/3) hatte mehrere Felder von ApoE-IR-Neuronen

ApoE-Immunoreaktivität wurde in fünf PD-Fällen ohne Demenz gefunden. Bei jedem der fünf Patienten wurden mehrere Felder von ApoE-immunoreaktivem hippokampalen Neuron beobachtet. Gliale und vaskuläre Färbung ähnlich nicht demenzkranken Kontrollen wurde ebenfalls beobachtet.

Bei den sechs nicht demenzkranken normalen Kontrollen und den fünf PD-Patienten stellten ApoE-immunoreaktive Neuronen deutlich Färbung von Neuronen ohne Tau-Immunoreaktivität oder neurofibrilläre Tangles dar. Bei keinem dieser elf Patienten waren nennenswerte Tau-immunoreaktive Neuronen vorhanden oder wurden während routinemäßiger neurophathologischer Untersuchung Neuronen mit neurofibrillären Tangles nachgewiesen.

ApoE bei AD-Patienten und demenzkranken PD-Patienten: In allen 24 AD-Fällen wurde ApoE-Immunoreaktivität von zerebralen Gefäßen, Gliazellen, von denen vermutet wurde, daß sie Astrozyten sind, und hippokampalen Neuronen beobachtet und war qualitativ ähnlich derjenigen, die bei nicht demenzkranken Kontrollen gesehen wurde. Zusätzlich zu ApoE-Immunoreaktivität von senilen Plaquen wurden amyloide Gefäße und Neuronen mit neurofibrillären Tangles, wie früher beschrieben, gefunden (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977 (1993)). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der ApoE-Immunolokalisation unter den APOE-Genotypen gefunden, abgesehen von einer größeren Anzahl amyloider meningealer Gefäße und größeren Plaquedichten in vielen APOE-4/4-Fällen, wie früher berichtet, durch A&bgr;-Immunolokalisation (Schmechel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 9649 (1993)). Hippokampale Schnitte von acht Patienten mit PD und Demenz (AD-Pathologie) wurden ebenfalls untersucht; ApoE-Immunlokalisation in diesen acht Fällen ähnelte derjenigen, die in AD-Fällen beobachtet wurde (TABELLE 1).

ApoE-Immunoreaktivität und A&bgr;-nachgewiesene extrazelluläre Amyloid-Ablagerungen: ApoE-Immunoreaktivität korrelierte im allgemeinen mit A&bgr;-Immunoreaktivität in angrenzenden Schnitten einschließlich diffusen subpialen Ablagerungen, amyloiden Gefäßen und senilen Plaquen (Werte nicht angegeben). Stark ApoE-immunoreaktive amyloide Gefäße in angrenzenden Schnitten waren ebenfalls A&bgr;-immunoreaktiv. Übereinstimmend mit früheren Berichten (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977 (1993); Schmechel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 9649 (1993)) unterstützen diese Ergebnisse eine enge Entsprechung zwischen ApoE und Amyloid-Ablagerung.

ApoE-Immunoreaktivität von vaskulären Endothelzellen und Gliazellen: Im Gegensatz zu Kontrollen stand die ApoE-Immunoreaktivität in AD-Gehirnen offensichtlich in Zusammenhang mit sowohl parenchymalen als auch meningealen Gefäßen. Zusätzlich zur Färbung von Kapillaren und kleinen Gefäßen, die in Kontrollen gesehen wurde, waren mittlere bis große Gefäße bei AD-Patienten oft stark immunoreaktiv für ApoE-Antikörper (Werte nicht angegeben). Ausgedehnte Regionen von ApoE-immunoreaktiven Gliazellen und zerebralen Gefäßen in sowohl grauer als auch weißer Substanz des Hippokampus waren bei AD-Patienten aller ApoE-Genotypen (Werte nicht angegeben) häufig. In einigen Fällen konnten intensive isolierte Herde von ApoE-immunoreaktiven Gliazellen mit der Morphologie von Astrozyten nahe bei und umgebend ein einzelnes ApoE-IR-Gefäß beobachtet werden (Werte nicht angegeben). Die Möglichkeit, daß einige dieser immunoreaktiven Gliaprofile aktivierte Mikrogliazellen darstellten, konnte nicht ausgeschlossen werden, da in den Kontrollgehirnen keine Zellen mit klar mikroglialer Morphologie beobachtet wurden.

ApoE-Immunoreaktivität von Neuriten in senilen Plaquen: ApoE-Immunozytochemie von AD-Gehirnen ließ zahlreiche immunoreaktive Plaquen erkennen (Werte nicht angegeben). Mit nur wenigen Ausnahmen entsprach jeder immunoreaktive ApoE-Herd einer A&bgr;-immunoreaktiven Plaque (Werte nicht angegeben). Jedoch war, während die ApoE-Immunoreaktivität übereinstimmend senile Plaquen nachwies, der Charakter der ApoE-Färbung nicht identisch mit A&bgr;-Immunoreaktivität.

ApoE-Immunoreaktivität von hippokampalen Neuronen bei AD-Patienten: In dem Hippokampus von AD-Patienten waren ApoE-immunoreaktive Neuronen bei allen Patienten häufig (Werte nicht angegeben). Die ApoE-immunoreaktiven Neuronen waren in veränderlicher Anzahl in allen Sektoren des Hippokampus und der angrenzenden Temporallappenrinde vorhanden, wobei sie in einigen Fällen Neuronen der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus einschlossen.

Beziehung von ApoE-immunoreaktiven Neuronen zu Tau-nachgewiesenen neurofibrillären Tangles: In vielen Fällen hatte das Muster der Apo-Immunoreaktivität in einigen Neuronen deutlich die Morphologie intrazellulärer neurofibrillärer Tangles mit linearer, Zytoplasma verzerrender immunoreaktiver Gestalt. Jedoch war es öfter nicht sofort ersichtlich, daß ApoE- und Tau-Immunoreaktivität in dem gleichen Neuron vorhanden sein könnten, abgesehen von der Tatsache, daß der spezielle Sektor eine reichliche Anzahl von gesondert identifizierten ApoE- und Tau-immunoreaktiven Neuronen enthielt. ApoE-Tau-Cololoka1isation in benachbarten Schnitten, gefärbt für A&bgr;-, Tau- und ApoE-Immunolokalistion, wurde versucht. Es wurden hippokampale Neuronen gefunden, die sowohl ApoE-immunoreaktiv als auch Tau-immunoreaktiv waren (Werte nicht angegeben). Andere Tau-immunoreaktive Neuronen in dem angrenzenden ApoE-Neuron waren nicht gefärbt. Diese Werte lassen vermuten, daß einige ApoE-immnoreaktive Neuronen bei AD-Patienten Tau-immunoreaktiv sind, aber daß ApoE- und Tau-Immunoreaktivität unter den Bedingungen dieser Untersuchung (Formaldehydfixierung, Paraffineinbettung und Entwachsen, Ameisensäurebehandlung) häufiger nicht überlappen.

Dem Überlappen von ApoE- und Tau-Immunoreaktivität wurde sich auch zugewandt, indem mit der Camera Lucida die Profile von ApoE- und Tau-immunoreaktiven Neuronen in angrenzenden Schnitten dargestellt wurden und Koinzidenzen der Färbung verglichen wurden. Zählungen von mehreren Feldern im CAI-2-Sektor und im entorhinalen Kortex (ca. 380 Neuronen insgesamt) eines einzelnen Patienten ließ eine extensive Anzahl von ApoE- und Tau-immunoreaktiven pyramidalen Neuronen in jedem Feld erkennen (100 Tau-IR-Neuronen/mm2 und 1010 ApoE-IR-Neuronen/mm2 pro Feld) (Werte nicht angegeben).

Diskussion: Die vorliegende Untersuchung der ApoE-Lokalisation im humanen Hippokampus und ihre Beziehung zu A&bgr;- und Tau-definierter AD-Pathologie war darauf angelegt, systematisch zu untersuchen, ob (1) ApoE an relevanten Zellstellen mit AD-Pathologie vorhanden ist und ob (2) das Vorhandensein von ApoE in Neuronen eine direkte und frühe Rolle in der neuronalen Pathologie unterstützen würde. Die immunozytochemischen Ergebnisse unterstützen die erwartete Lokalisation von ApoE in Astrozyten. Korrelation mit A&bgr;-Lokalisation bei AD-Patienten bestätigt den nahen Zusammenhang von ApoE mit extrazellulären Amyloid-Ablagerungen in senilen Plaquen und zerebralen Gefäßen. Diese Erkenntnisse zeigen an, daß ApoE nicht nur in den erwarteten nicht-neuronalen Zellklassen in dem Hippokampus älterer Menschen – Astrozyten, vaskuläre Endothelzellen und Ependymzellen – vorhanden ist, sondern auch in hippokampalen Neuronen ohne neurofibrilläre Veränderungen vorhanden ist. Intraneuronales ApoE ist nicht spezifisch für AD, da ApoE auch in hippokampalen Neuronen in zwei von sechs nicht demenzkranken Kontrollen, ebenso wie in dreizehn Gehirnen von Patienten mit Parkinson-Krankheit mit und ohne Demenz gefunden wurde. Diese Erkenntnisse zeigen an, daß ApoE im Inneren vieler „normaler" hippokampaler pyramidaler Neuronen bei älteren Personen vorhanden ist, und stellen eine mögliche Basis für die Wirkung von ApoE auf den neuronalen Metabolismus bereit.

Die Ergebnisse zeigen, daß ApoE- und Tau-immunoreaktive Neuronen in befallenen Sektoren des Hippokampus von AD-Patienten zahlreich sind, und daß es eine signifikante Überlappung geben kann. Die Beobachtung von ApoE in Neuronen mit neurofibrillären Tangles in vielen normalen Kontrollen und Patienten ohne AD läßt vermuten, daß ApoE imstande sein würde, die neuronale Pathologie von AD von den frühesten Zeitpunkten an zu beeinflussen. Die vorstehenden Werte zeigen an, daß neurofibrilläre Tangles ein Nebenprodukt von abnormem ApoE/Tau-neuronalen Metabolismus sein können.

BEISPIEL 8 Apolipoprotein und Lokalisation in kortikalen Neuronen

Trotz Berichten über ApoE in Neuronen mit neurofibrillären Tangles (siehe z. B. Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977 (1993)) ist das Vorhandensein von ApoE in anderen Neuronen noch umstritten. Um die subzelluläre Verteilung von ApoE auf dem ultrastrukturellen Niveau zu bestimmen, wurden chirurgische Prüfstücke von humanen Temporallappen von fünf Patienten erhalten, die sich wegen internistisch schwer zu behandelnder Temporallappenepilepsie einer Temporallappenentfernung unterzogen. Nach Fixieren, Schneiden und spezieller Immunozytochemie für ApoE wurde das Gewebe für Licht- und Elektronenmikroskopie verarbeitet. Inspektion dieses Gewebes im Elektronenmikroskop unterstützte frühere lichtmikroskopische Beobachtungen humaner Gehirne von Patienten mit AD und bejahrten Kontrollen: ApoE war in Astrozyten stark lokalisiert und schwächer, aber gerade so definitiv, in Neuronen lokalisiert (Strittmatter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977 (1993); Han et al., Exp. Neural. (1994) (im Druck)). In Gliazellen füllte ApoE-Immunoreaktivität das perinukleare Zytoplasma ebenso wie distale Prozesse. In Neuronen war ApoE-Immunoreaktivität in einer punktförmigen Weise lokalisiert und war auf den Zellkörper beschränkt. Das Vorhandensein von ApoE in kortikalen Neuronen von AD-Patienten in altersmäßig angepaßten Kontrollen und relativ jungen Patienten mit Epilepsie läßt vermuten, daß das astrozytische Protein ApoE in einigen kortikalen Neuronen häufig vorhanden sein kann. Weiterhin bringt die Lokalisation von ApoE in dem Zellkörper von Neuronen es in eine Position, um mit dem intraneuronalen, Mikrotubulus-assoziierten Protein, Tau, in Wechselwirkung zu treten und so die Geschwindigkeit der AD-Pathologie zu beeinflussen (siehe Strittmatter et al., Exp. Neurol., 125, 163 (1994)).

Gewebezubereitung: Blöcke von Temporallappengewebe wurden zu der Zeit der Operation von der Temporallappenrinde von drei männlichen und zwei weiblichen internistisch schwer zu behandelnden Anfall-Patienten, die im Alter von 21 bis 55 Jahre reichten, und bei der Autopsie von einem 77 Jahre alten männlichen Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD-Patient) erhalten. Das Gewebe wurde sofort in 4 %iges Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gelegt. Bald danach wurden die Blöcke von jedem Fall in zwei Portionen geschnitten, wobei eine Portion in 4%igem Paraformaldehyd belassen wurde und die andere in eine Lösung mit 2% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) überführt wurde. Nach Immersionsfixierung für 24 Stunden bei 4°C wurden beide Blöcke in 0,05 M Phosphatpuffer mit normaler Kochsalzlösung (PBS) gespült und bis zum Zerschneiden für die Immunozytochemie in 2%igem Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) aufbewahrt.

Immunozytochemie mit Voreinbettung: Serienschnitte wurden auf einem Vibratom mit 35–50 Mikrometern geschnitten und freischwimmend in PBS gesammelt. Die Schnitte wurden in frisch hergestellter 90%iger Ameisensäure für 3–5 Minuten oder in 1% Methanol-Wasserstoffperoxid für 5 Minuten vorbehandelt, um die Immunogenität zu erhöhen und um endogene Peroxidaseaktivität zu unterdrücken. Nach einer Serie von drei Spülungen in PBS für jeweils 5 Minuten wurden die Schnitte für 1 Stunde bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4°C in einer Lösung, enthaltend einen monoklonalen Mäuse-Antikörper, gegen humanes ApoE (3H1, verdünnt 1 : 1000 in 2%igem normalen Ziegenserum) inkubiert. Der 3H1-Antikörper wurde unter Verwendung von Tests der Hemmung von Heparinbindungsstellen auf ApoE entdeckt und erkennt die Aminosäurereste 243–272 (Weisgraber et al., J. Biol. Chem. 261, 2068 (1986)).

Nach 3 Waschungen für jeweils 5 Minuten in PBS wurden die Gewebeschnitte dann für 30 Minuten in biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG (verdünnt 1 : 50, Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubiert, nachfolgend gewaschen und für 30 Minuten in Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vector Laboratories) inkubiert.

Die Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubieren der Schnitte für 7–10 Minuten in einer Lösung, enthaltend 0,01% 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) und 0,0003% Wasserstoffperoxid in PBS, sichtbar gemacht. Um nichtspezifische Bindung auszuschließen und die Spezifität sicherzustellen, wurden Kontrollreaktionen an angrenzenden Schnitten durchgeführt, wobei entweder das primäre Antiserum weggelassen wurde oder der relevante sekundäre Antikörper durch einen in einer anderen Spezies gezüchteten ersetzt wurde. Nach der DAB-Reaktion wurden 35-Mikrometer-Schnitte auf Objektträgern befestigt, in einer Serie von Alkoholen dehydratisiert, in Xylol geklärt und mit einem Deckglas bedeckt. Die 50-Mikrometer-Schnitte wurden für Elektronenmikroskopie verarbeitet.

Elektronenmikroskopie: Die immunoumgesetzten 50-Mikrometer-Schnitte wurden in einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Phosphatpuffer nachfixiert, in einer abgestuften Serie von Alkoholen dehydratisiert und in Epon flach eingebettet. Nach lichtmikroskopischer Beobachtung der gehärteten Schnitte wurden kleine Bereiche, enthaltend ApoE-immunoreaktive Neuronen und Gliazellen, aus dem Schnitt zurechtgeschnitten, auf eine Epon-Stütze geklebt und auf einem Reichert-Ultramikrotom zu ungefähr 80 nm geschnitten. Diese Schnitte wurden auf Formvar-beschichteten Gittern mit Schlitzen gesammelt und zur Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop JEOL 1200EX mit 80 kV ungefärbt belassen. Die Schnitte wurden untersucht und interessierende Bereiche wurden mit Vergrößerungen von 4400–20000 X für weitere Analyse photographiert.

Lichtmikroskopische Ergebnisse: Mit dem Lichtmikroskop wurde ApoE-Immunoreaktivität in Schnitten beobachtet, die sowohl aus dem Autopsie-Prüfstück des Temporallappens des Patienten mit AD als auch aus den fünf chirurgischen Prüfstücken des Temporallappens genommen wurden (Werte nicht angegeben). Sowohl bei dem AD- als auch dem Temporallappenepilepsie-Material war das Muster der Immunoreaktivität spezifisch für den anti-ApoE-Antikörper, und es wurde in Kontrollschnitten keine Färbung beobachtet. In den AD-Fällen entsprachen Plaquen, viele Gliazellen und das Muster der Immunoreaktivität früheren Beobachtungen in unserem Laboratorium über ApoE-Lokalisation in Prüfstücken von humanem Gehirn, erhalten bei der Autopsie von 32 Patienten, die normale Kontrollen, Patienten mit AD und Patienten mit Parkinson-Krankheit einschlossen (Han et al., Exp. Neurol (1994) (im Druck)). In den chirurgischen Fällen, wo keine neuritischen Plaquen oder neurofibrillären Tangles beobachtet wurden, waren nur Gliazellen und Neuronen ApoE-immunoreaktiv (Werte nicht angegeben).

ApoE-Immunoreaktivität wurde in Gewebe beobachtet, das in 2% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd fixiert war, ebenso wie in Gewebe, das in 4%igem Paraformaldehyd fixiert war; jedoch war die ApoE-Immunoreaktivität in dem Gewebe, das in nur Paraformaldehyd fixiert war, robuster. In diesen Gewebeblöcken war die Färbung von astrozytischen Gliazellen besonders dicht und vollständig; intensive ApoE-Immunoreaktivität war nicht nur in dem dünnen Rand von Zytoplasma, das den Zellkern umgab, vorhanden, sondern auch in den Prozessen, wenn sie sich durch das Neuropil ausbreiteten und wenn sie an Blutgefäßen endeten (Werte nicht angegeben). Im Gegensatz dazu war die Färbung von Neuronen weniger intensiv und auf die Region von Zytoplasma gerade um den Zellkern herum und in proximalen Prozessen beschränkt (Werte nicht angegeben). Gelegentlich wurden ApoE-immunoreaktive Satellitengliazellen in enger Nachbarschaft zu markierten Neuronen beobachtet.

Ausgeprägte Astrogliose wurde sowohl in dem AD-Gehirn als auch in den chirurgischen Temporallappen-Prüfstücken beobachtet, und intensive ApoE-Färbung von Astrozyten wurde besonders in Schicht I und in subkortikaler weißer Substanz beobachtet. Gefärbte Gliazellen schlossen Zellen mit der Morphologie von protoplasmatischen und fibrillären Astrozyten ebenso wie neuronale Satellitengliazellen ein. Es wurde keine offensichtliche Immunoreaktivität von Oligodendrozyten der weißen Substanz beobachtet. Es wurde etwas Färbung von Endothelzellen und Blutgefäßwänden beobachtet. Es wurde etwas Färbung von Endothelzellen und Blutgefäßwänden beobachtet und wurde der starken Einhüllung astrozytischer Endfüßchen zugeordnet.

Elektronenmikroskopische Ergebnisse: Kontrollschnitte, die parallel unter Weglassen von primärem Antikörper umgesetzt wurden, waren auf dem Niveau des Lichtmikroskops ungefärbt (Werte nicht angegeben), und es wurde in ihren dünnen Begleitschnitten im ultrastrukturellen Niveau in keiner Zellklasse ein Immunopräzipitat gefunden (Werte nicht angegeben). Im Gegensatz dazu ließen Schnitte, die mit anti-ApoE-Antikörper umgesetzt waren, auf lichtmikroskopischem Niveau stark gefärbte Gliazellen erkennen (Werte nicht angegeben) und zeigten auf dem Niveau des Elektronenmikroskops reichliche Profile von stark immunoreaktiven Gliazellen mit dichtem HRP-Reaktionsprodukt, das ihre Zellkörper und Prozesse füllte (Werte nicht angegeben). Obgleich Immunoreaktivität oft die äußeren Membranen von Mitochondrien ausstattete, wurde keine spezifische Kompartimentierung des Reaktionsprodukts beobachtet. Die meisten Strukturen waren stark immunomarkiert, und die Markierung anderer angemessener Organellen, wie beispielsweise Golgi-Vesikel oder Cisternae, konnte nicht gesichert werden. Die gleiche intensive Immunoreaktivität der Somas von Gliazellen wurde auch in zahlreichen kleineren Prozessen in dem umgebenden Neuropil beobachtet. Basierend auf den Lichtmikroskop-Schnitten und auf ihrer intensiven Immunoreaktivität sind diese Prozesse wahrscheinlich kleinere distale Prozesse immunoreaktiver Gliazellen. In diesen Prozessen wurden keine assoziierten synaptischen Dichten oder Vesikel beobachtet. Die starke Immunoreaktivität von Astrozyten aus dem Soma gegenüber distalen Prozessen wird durch die Färbung der astrozytischen Endfüßchen unterstützt, die auf zerebralen Blutgefäßen endete, welche über ihre gesamte Ausdehnung stark immunoreaktiv waren (Werte nicht angegeben).

In ApoE-immunoumgesetzten Schnitten war viel von dem Neuropil ungefärbt. Insbesondere waren häufig große ungefärbte Bereiche von feinen axonalen und dendritischen Prozessen mit gelegentlichen Profilen von stark immunoreaktiven, vermutlich astrozytischen Prozessen zu sehen. Färbung von Neuronen oder Neuropil wurde in den Kontrollschnitten nicht beobachtet (Werte nicht angegeben). In ApoE-immunoumgesetzten Schnitten, untersucht auf dem ultrastrukturellen Niveau, waren häufig Neuronen zu finden, die in Regionen von Neuropit, die immunoreaktive Prozesse enthielten, keine Immunoreaktivität enthielten. Jedoch waren, wie durch die für Lichtmikroskopie hergestellten Begleitschritte vermutet, einige Neuronen deutlich ApoE-immunoreaktiv. Im Gegensatz zu den Gliazellen enthielten diese Neuronen Reaktionsprodukt, das leichter und in punktförmiger Verteilung war (Werte nicht angegeben). Wie in Gliazellen war die ApoE-Immunoreaktivität nicht auf irgendein besonderes subzelluläres Kompartiment begrenzt, sondern war eher in Klumpen in dem Zytoplasma vorhanden, anscheinend assoziiert mit der Membran des endoplasmatischen Retikulums oder anderen Organellen und Zellstrukturen. Schweres Immunopräzipitat wurde auf den äußeren Membranen von Strukturen mit dem Aussehen von Mikrokörpern ebenso wie auf Mitochondrien gesehen (Werte nicht angegeben); Immunopräzipitat im Inneren definierter Organellen oder auf dem Plasma oder der Kernmembran wurde nicht gesehen. Ungleich der Situation für Gliazellen wurde trotz Inspizieren vieler Felder mit Profilen von distalen prä- und postsynaptischen neuronalen Elementen, eng angrenzend an stark immunoreaktive kleine Prozesse, von denen vermutet wurde, daß sie glial sind, kein Beweis für irgendeine Immunoreaktivität oder irgendwelche identifizierten distalen neuronalen Prozesse, weder axonal noch dendritisch, gefunden.

Diese Ergebnisse demonstrieren die Immunolokalisation von ApoE in kortikalen Neuronen ebenso wie in Gliazellen. Der zusätzliche licht- und elektronenmikroskopische Beweis für neuronale Lokalisation von ApoE steht im Gegensatz zu dem häufig vertretenen Gesichtspunkt, daß ApoE nur in Astrozyten und Gliazellen lokalisiert ist (siehe z. B. Rebeck et al., Neuron 11, 575 (1993)). Die meisten früheren Untersuchungen zu der Immunolokalistion von ApoE sind in Nagetiergehirn ausgeführt worden und haben über das Vorhandensein von ApoE in Gliazellen und insbesondere Astrozyten berichtet. Eine astrozytische Lokalisation für ApoE paßt zu der Beobachtung, daß ApoE rnRNA nur in Gliazellen und nicht in Neuronen im zentralen Nervensystem gefunden wird.

Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren, daß (a) ApoE in der Zellkörperregion vieler kortikaler Neuronen ist, (b) ApoE in dem Zytoplasma vorhanden ist, (c) ApoE X oftmals mit der äußeren Membranoberfläche einiger, aber nicht aller intrazellulären Organellen assoziiert ist und (d) der scheinbare Gehalt von ApoE in Neuronen weniger reichlich ist als in Gliazellen.

Der Mißerfolg bei der Beobachtung neuronaler Lokalisation von ApoE in anderen Untersuchungen könnte zurückzuführen sein auf angewendete Immunoreagenzien, Verlust von Antigen/Veränderung von Antigen während der Fixierung und Verarbeitung, und Spezies oder individuelle Unterschiede in der ApoE-Lokalisation.

Schließlich sind die meisten Untersuchungen, die über die Abwesenheit von ApoE in Neuronen berichten, in Nagetieren durchgeführt wurden. Wir finden, daß bei Nagetieren ApoE in kortikalen Neuronen kaum lokalisiert ist, oftmals nur in älteren Prüfstücken (Arbeit in Vorbereitung). Wie in Beispiel 7 beschrieben ist, wurde in normalen, humanen bejahrten Kontrollen Lokalisation von ApoE in hippokampalen Neuronen in 2 von 6 Fällen gefunden, und neuronale ApoE-Lokalisation wurde in im wesentlichen allen Fällen von AD und PD gefunden.

Diese Ergebnisse zeigen an, daß ApoE direkt an neuronaler Funktion beteiligt ist und in einer Position ist, um mit dem Mikrotubulus-assoziierten Protein, Tau, in Wechselwikung zu treten.

Die vorstehenden Beispiel sind veranschaulichend für die vorliegende Erfindung und sollen nicht als deren Begrenzung ausgelegt werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert.


Anspruch[de]
  1. Verwendung eines wirksamen Mittels, ausgewählt aus Apolipoprotein E oder einem Apolipoprotein-E-Fragment, welches an Tau-Protein oder Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2c (MAP2c) bindet, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit.
  2. Verwendung eines wirksamen Mittels nach Anspruch 1, wobei das wirksame Mittel aus der Gruppe, bestehend aus ApoE2, ApoE3 und N-terminalen Fragmenten davon, welche Aminosäurereste 1 bis 191 davon einschließen, ausgewählt ist.
  3. Verwendung eines wirksamen Mittels nach Anspruch 1, wobei die Zelle heterozygot für ApoE4 ist.
  4. Verwendung eines wirksamen Mittels nach Anspruch 1, wobei die Zelle homozygot für ApoE4 ist.
  5. Verwendung eines wirksamen Mittels nach Anspruch 1, wobei das wirksame Mittel in einer pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden soll.
  6. In-vitro-Verfahren zur Hemmung der Bildung von neurofibrillären Tangles in einer Zelle, wobei das Verfahren Verabreichen eines wirksamen Mittels, ausgewählt aus Apolipoprotein E oder einem Apolipoprotein-E-Fragment, welches an Tau-Protein oder Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2c (MAP2c) bindet, in einer zur Hemmung der Bildung von neurofibrillären Tangles in der Zelle wirksamen Menge in die Zelle umfaßt.
  7. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 6, wobei das wirksame Mittel aus der Gruppe, bestehend aus ApoE2, ApoE3 und N-terminalen Fragmenten davon, welche Aminosäurereste 1 bis 191 davon einschließen, ausgewählt ist.
  8. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle heterozygot für ApoE4 ist.
  9. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle homozygot für ApoE4 ist.
  10. Verwendung eines Vektors, welcher in Nervenzellen eines Patienten eintritt, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit, wobei der Vektor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

    (a) Vektoren, welche eine Nucleinsäure tragen, kodierend ein ApoE oder ein Fragment davon, welches Tau oder MAP2c bindet, welche Nucleinsäure operabel mit einem Promotor assoziiert ist, welcher die Nucleinsäure in einer Nervenzelle exprimiert; und

    (b) Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäure, welche in Nervenzellen durch homologe Rekombination das Codon des ApoE-Gens, kodierend die Aminosäure am Rest 112 darin, zu Cystein umwandeln.
  11. Verwendung eines Vektors nach Anspruch 10, wobei der Vektor ein Herpes-Virus-Vektor ist.
  12. Vektor, welcher in Nervenzellen eintritt, wobei der Vektor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

    (a) Vektoren, welche eine Nucleinsäure tragen, kodierend ein ApoE oder ein Fragment davon, welches Tau oder MAP2c bindet, welche Nucleinsäure operabel mit einem Promotor assoziiert ist, welcher die Nucleinsäure in einer Nervenzelle exprimiert; und

    (b) Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäure, welche in Nervenzellen durch homologe Rekombination das Codon des ApoE-Gens, kodierend die Aminosäure am Rest 112 darin, zu Cystein umwandeln;

    wobei der Vektor zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten verwendbar ist.
  13. Vektor nach Anspruch 12, wobei der Vektor ein Herpes-Virus-Vektor ist.
  14. Vektor nach Anspruch 12, wobei der Vektor ein pharmazeutisch verträglicher Träger ist.
  15. Verfahren zum Screening von Verbindungen auf die Fähigkeit, das Tau-Protein zu binden und die Bildung von neurofibrillären Tangles in einer Zelle zu hemmen, umfassend:

    Inkontaktbringen einer Testverbindung mit dem Tau-Protein und dann

    Nachweisen, ob die Testverbindung an Tau-Protein an der Bindungsstelle, gebunden durch ApoE3, bindet.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Schritt des Inkontaktbringens in vitro ausgeführt wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Schritt des Inkontaktbringens in vitro in einer wässerigen Lösung ausgeführt wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Schritt des Nachweisens ein kompetitiver Bindungstest ist.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen






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