Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-1-Phosphat unter Verwendung von Mikroorganismen.

Glucose-1-Phosphat (im Folgenden als „G-1-P" abgekürzt) ist als Substrat für die Herstellung von Wirkstoffen und Sacchariden von Nutzen.

G-1-P wird hauptsächlich durch Phosphorolyse von Stärke oder Dextrin mit Maltodextrin-Phospholylase (MDPase) gewonnen, und ein Verfahren unter Verwendung von MDPase aus Kartoffel (japanische Patentveröffentlichung Nr. 95492/1994) und das sogenannte enzymatische Verfahren unter Verwendung von MDPase aus Mikroorganismen wurden bislang beschrieben.

Als Beispiele für das enzymatische Verfahren unter Verwendung von MDPase aus Mikroorganismen wurde ein Verfahren unter Verwendung eines Enzyms aus Escherichia coli (Weinhäusel et al., Enzyme Microb. Technol. 17, 140–146, (1995)) und ein Verfahren unter Verwendung eines Enzyms aus Corynebacterium callunae (Nidetzki et al., J. Carbohdrate Chem., 14, 1017–1028 (1995)) beschrieben. Unlängst wurden Verfahren zur Produktion von G-1-P unter Verwendung von hitzestabiler MDPase aus moderat thermophilen Bakterien und hoch-thermophilen Bakterien wie Bacillus stearothermophilus (japanische Patentanmeldung, Offenlegungsnummer 14580/1998) und Thermus caldophilus (Shin et al., J. Industrial Microbiol., 24, 89–93 (2000)) beschrieben.

Solche enzymatischen Verfahren unter Verwendung des eigentlichen Enzyms erfordern jedoch komplizierte Schritte wie z. B. ein Extraktionsschritt eines Enzyms aus Pflanzen oder Bakterien und die Herstellung eines immobilisierten Enzyms und es war daher wünschenswert, ein einfacheres Verfahren zur Herstellung von G-1-P zu entwickeln.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von G-1-P bereitzustellen, durch das eine große Menge an G-1-P bereitgestellt werden kann, ohne komplizierte Schritte anzuwenden.

Die hier genannten Erfinder haben verschiedene Untersuchungen an Bakterien durchgeführt, welche durch Züchtung G-1-P in großen Mengen in einem Medium herstellen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass, wenn Bakterien der Gattung Corynebacterium unter Bedingungen der Gegenwart eines Saccharids und einer hohen Konzentration von Phosphorsäure oder eines Derivats davon gezüchtet werden, eine hohe Konzentration von G-1-P direkt in einem Medium hergestellt werden kann, um G-1-P in großen Mengen herzustellen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-1-Phosphat bereitgestellt, umfassend die Schritte der Züchtung von Bakterien der Gattung Corynebacterium in einem Medium, das ein Saccharid und mindestens 1 mM Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Polyphosphorsäure, Diphosphorsäure, Polymetaphosphorsäure oder Phosphate oder ein Salz davon enthält, und der Gewinnung des hergestellten und im Medium angehäuften Glucose-1-Phosphats.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Bakterien der Gattung Corynebacterium, sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie zur Gattung Corynebacterium gehören und G-1-P in einem Medium in der Gegenwart eines Saccharids und einer festgelegten Konzentration an Phosphorsäure oder eines Derivats oder Salzes davon herstellen. Beispiele hierfür umfassen Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium vitaeruminis und Corynebacterium pilosum. Unter diesen werden Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium vitaeruminis bevorzugt, wobei die Stämme Corynebacterium callunae IFO 15359, Corynebacterium glutamicum JCM 1321 und Corynebacterium vitaeruminis JCM 1323 besonders bevorzugt werden.

Bevorzugte Beispiele von Sacchariden, die dem Medium zugegeben werden, beinhalten Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide, die Glucose als Saccharidbestandteil enthalten, und &agr;-1,4-Glucan enthaltende Saccharide; zum Beispiel werden Stärke, Amylose, Dextrin, Maltose, Maltooligosaccharide, Amylopektin und Glykogen als stärker bevorzugte Beispiele erwähnt. Von diesen werden preiswerte Stärke, Dextrin und Maltooligosaccharide besonders bevorzugt.

Solche Saccharide können entweder einzeln oder einer beliebigen Kombination davon verwendet werden.

Beispiele von Derivaten oder Salzen der Phosphorsäure, die dem Medium zugegeben werden, beinhalten Metaphosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Polyphosphorsäure, Diphosphorsäure, Polymetaphosphorsäure, Phosphate und Salze dieser Derivate. Als Salze werden Natrium- und Kaliumsalze bevorzugt. Beispiele der besonders bevorzugten Phosphate beinhalten Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Mononatriumphosphat und Dinatriumphosphat. In der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, ein Gemisch aus Phosphorsäure oder einem Derivat davon und einem Salz davon, oder ein Gemisch aus einigen Arten von Phosphaten oder Salzen der Derivate zu verwenden.

Die Konzentration der Phosphorsäure oder der Derivate oder Salze davon im Medium muss aus dem Gesichtspunkt der Wirkung mindestens 1 mM betragen, und es ist wünschenswert, dass die Konzentration im Bereich von vorzugsweise 1 mM bis 1 M, stärker bevorzugt von 5 mM bis 500 mM, besonders bevorzugt von 100 mM bis 500 mM liegt.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Medium ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt, nur insoweit als Bakterien der Gattung Corynebacterium darin wachsen können und ein Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Metallminerale, Vitamine etc. zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Sacchariden und der Phosphorsäure oder den Derivaten oder Salzen davon enthält, kann verwendet werden.

Beispiele von anderen Kohlenstoffquellen als den Sacchariden beinhalten Salze organischer Säuren wie Acetate.

Beispiele für Stickstoffquellen beinhalten Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat und Stickstoff enthaltende organische Substanzen wie Harnstoff, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte und Caseinhydrolysate und Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Alanin und Methionin.

Beispiele von Metallmineralen beinhalten Natriumchlorid, Eisensulfat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Zinksulfat und Calciumcarbonat. Diese Metallminerale können nach Bedarf entweder einzeln oder in einer beliebigen Kombination davon verwendet werden.

Die Züchtung wird durch geeignete Anpassung von pH-Wert und Temperatur durchgeführt, um Bedingungen zu erhalten, bei denen die Mikroganismen ausreichend wachsen können.

Es wird jedoch im Allgemeinen bevorzugt, dass die Züchtung für 12 bis 96 Stunden bei einem pH-Wert von 5 bis 8 und einer Temperatur von 25 bis 40°C durchgeführt wird.

Als eine Züchtungsmethode kann eine ruhende bakterielle Reaktion und eine immobilisierte bakterielle Reaktion ebenso verwendet werden, wie eine Schüttelkultur und eine Züchtung im Fermenter.

Die Gewinnung des hergestellten und angehäuften G-1-P kann beispielsweise durch Abtrennen und Entfernen der verwendeten Bakterien und Kombination von Zentrifugation, Ultrafiltration, Ionenaustausch, Umkehrosmose, Elektrodialyse, Aussalzen, Kristallisation etc. miteinander gemäß eines gemeinhin bekannten Verfahrens durchgeführt werden.

Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann dadurch im Vergleich zum enzymatischen Verfahren unter Verwendung eines Enzyms eine hohe Konzentration von G-1-P direkt im Medium hergestellt und so eine große Menge von G-1-P hergestellt werden, ohne komplizierte Schritte durchzuführen. Wie in den Beispielen, die nachfolgend beschrieben werden, gezeigt wird, wird ein solcher Effekt kaum erkannt für die MDPase aus Bakterien der Gattung Bacillus (japanische Patentanmeldung, Offenlegungsnummer 14580/1998), in welchen die MDPase in den Bakterien wie bei den Bakterien der Gattung Corynebacterium enthalten ist und deren spezifische Aktivität 4,2 U/ml beträgt und vergleichbar mit der MDPase aus den Bakterien der Gattung Corynebacterium ist, deren spezifische Aktivität 5,3 U/mg beträgt (J. Carbohydrate Chem., 14, 1017–1028 (1995)) und ein charakteristischer Effekt der Bakterien der Gattung Corynebacterium ist.

Die Bestimmung von G-1-P wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Weinhausle (Enzyme Microb. Technol., 17, 140–146 (1995)) durchgeführt, wobei das Verfahren modifiziert wurde.

Genauer gesagt, eine enzymatische Reaktionslösung (100 &mgr;l, enthaltend 100 mM Tris-Acetatpuffer (pH 6,8), 2 mM EDTA, 10 mM Magnesiumsulfat, 2 mM NAD, 10 &mgr;M Glucose-1,6-Diphosphat, 1,2 U/ml Phosphoglucomutase (aus Kaninchenmuskel, Produkt von Roche Diagnostics Co.) und 1,2 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (aus Leuconostoc mesenteroides, Produkt von Roche Diagnostics Co.)) wurde zu einer auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geeignet verdünnten Probe (100 &mgr;l) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten belassen, um dann die Absorption bei 340 nm zu messen.

Eine Platinöse von Corynebacterium callunae IFO 15359, Bacillus subtilis IFO 3037, Bacillus subtilis IFO 1372 oder Bacillus licheniformis JGM 2505 wurde in ein Medium (enthaltend 3,5% lösliche Stärke, 3,0% Lablemco-Pulver (Produkt von OXOID Co.), 0,05% Magnesiumsulfat, 0,04% Monokaliumphosphat und 0,1% Dinatriumphosphat) überimpft, um eine Schüttelkultur über Nacht bei 30°C zur Züchtung der Arten durchzuführen.

Von jeder (1%) der Bakterienarten, die, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet wurden, wurde eine Überimpfung in ein Medium durchgeführt, das durch Zugabe von Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) zu 3,5% löslicher Stärke, 3,0% Lablemco-Pulver (Produkt von OXOID Co.), 0,05% Magnesiumsulfat hergestellt wurde, so dass eine Phosphatkonzentration von 10 mM, 20 mM oder 40 mM erhalten wurde, um eine Züchtung bei 30°C für 5 Tage als Hauptkultur durchzuführen. Die Konzentration von G-1-P im so erhaltenen Überstand wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Eine Platinöse von Corynebacterium callunae IFO 15359, Corynebacterium glutamicum JCM 1321, Corynebacterium vitaeruminis JCM 1323, Bacillus subtilis IFO 3037, Bacillus subtilis IFO 1372 oder Bacillus licheniformis JGM 2505 wurde in ein Medium (enthaltend 3,5% lösliche Stärke, 3,0% Lablemco-Pulver (Produkt von OXOID Co.), 0,05% Magnesiumsulfat, 0,04% Monokaliumphosphat und 0,1% Dinatriumphosphat) überimpft, um eine Schüttelkultur über Nacht bei 30°C zur Züchtung durchzuführen.

Die Bakterien, die, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet wurden, wurden jeweils geerntet, und jede Art wurde in ein Medium überimpft, das durch Zugabe eines Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) zu einer 0,67%igen Hefe-Stickstoff-Basis (Produkt von Difco Co.) und 10% Dextrin (aus Kartoffel, Produkt von SIGMA Co.) hergestellt wurde, um eine Phosphatkonzentration von 100 mM, 200 mM, 400 mM oder 500 mM zu erhalten, so dass die OD_600nm 10 beträgt, wobei die Züchtung bei 30°C für 5 Tage als Hauptkultur durchgeführt wird. Die Konzentration von G-1-P im so erhaltenen Überstand wurde bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Als Ergebnis des vorstehend Aufgeführten war es möglich, G-1-P mit guter Effizienz konzentrationsabhängig unter Verwendung von Bakterien der Gattung Corynebacterium und unter Anpassung der Phosphatkonzentration herzustellen.

Gemäß des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung kann, wie vorstehend beschrieben, eine große Menge von G-1-P bereitgestellt werden, ohne komplizierte Schritte durchzuführen, wie der Schritt der Extraktion eines Enzyms aus Pflanzen oder Bakterien und die Herstellung eines immobilisierten Enzyms, welche für das enzymatische Verfahren benötigt werden.