Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Isomalto-Oligosaccharidsirupen. Das Verfahren umfasst die Verwendung von Enzymen, die auf einem wiederverwendbaren Träger immobilisiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin die durch die Verwendung der immobilisierten Enzyme auf wiederverwendbaren Trägern erhaltenen Sirupe und die Verwendung der Sirupe.

Isomalto-Oligosaccharidsirupe enthalten eine wesentliche Menge an verzweigten Oligosacchariden, wie Isomaltose, Panose, Isomaltotriose, Isomaltotetraose, Nigerose, Kojibiose, Isopanose und höhere verzweigte Oligosaccharide. Die Produkte werden in Pulver- oder flüssiger Form, in Abhängigkeit von der vorgesehenen Anwendung, vertrieben.

Die potenziellen Anwendungen sind auf dem Lebensmittelgebiet beheimatet; Beispiele sind:

• – Würzmittel (Mayonnaise, Essig, Suppengrundlage, usw.)
• – Süßwaren (Bonbons, Kaugummi, Schokolade, Eiscreme, Sorbet, Sirup, Pastete)
• – verarbeitete Lebensmittel aus Obst und Gemüse (Marmelade, Konfitüre, Fruchtsoßen, Pickles), Fleisch- oder Fischlebensmittel (Schinken, Würstchen, usw.)
• – Backwaren (Brot, Kuchen, Plätzchen)
• – vorgekochte Lebensmittel (Salat, gekochte Bohnen, usw.)
• – Lebensmittel in Dosen und Flaschen, Getränke (Kaffee, Saft, Nektar, Sprudelgetränke, Limonade, Cola)
• – Fertignahrung (Instantkaffee, Instantkuchengrundlage, usw.).

Isomalto-Oligosaccharidsirupe können als Bestandteile in Tierfutter und Haustierfutter angewendet werden. Nicht-Lebensmittel-Anwendungsgebiete sind Kosmetika und Medizin (Zigarette, Lippenstift, Zahnpasta, innere Medizin, usw.).

Es ist seit einigen Jahren bekannt, dass Isomalto-Oligosaccharide genutzt werden, um das Wohlgefühl von Menschen und Tieren im Allgemeinen zu verbessern, wenn oral auf einer regelmäßigen täglichen Grundlage genommen. Die Hauptwirkung der Oligosaccharide ist es, die Anzahl von Bifidobakterien und Lactobacilli in dem Dickdarm zu erhöhen und die Konzentration an Fäulnisbakterien zu vermindern. Bifidobakterien sind mit einigen gesundheitsfördernden Eigenschaften, wie der Inhibierung des Wachstums von Pathogenen, entweder durch Säurebildung oder durch anti-mikrobielle Aktivität, verbunden. Sie sind auch mit vielfältigen Wirkungen, wie Modulierung des Immunsystems (Antitumoreigenschaften), Verminderung der Anteile von Triglyceriden und Cholesterin, Erzeugung von Vitaminen (B-Gruppe), Verminderung von Blutammoniakkonzentrationen, der Verhinderung von Translokation, Wiederaufbau der normalen Darmflora nach anti-mikrobieller Therapie, Erzeugung von Verdauungsenzymen, Verminderung von antibiotischen Nebenwirkungen, verbunden (Kohmoto T., Fukui F., Takaku H., Machida Y., et al., Bifidobacteria Microflora, 7(2)(1988), 61–69; Kohmoto K., Tsuji K., Kaneko T., Shiota M., et al., Biosc. Biotech. Biochem., 56(6)(1992), 937–940; Kaneko T., Kohmoto T., Kikuchi H., Fukui F., et al., Nippon Nogeikagaku Kaishi, 66(8)(1992), 1211–1220, Park J-H., Jin-Young Y., Ok-Ho S., Hyun-Kyung S., et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20(3)(1992), 237–242).

Die Isomalto-Oligosaccharide werden durch eine Transglucosylierungsreaktion, unter Verwendung einer D-Glucosyltransferase (E.C. 2.4.1.24, Transglucosidase, Alpha-Glucosidase), synthetisiert. Dieses Enzym katalysiert sowohl hydrolytische als auch Transferreaktionen bei der Inkubation mit Alpha-D-Glucooligosacchariden. Die Übertragung findet am häufigsten zu 6-OH (Hydroxylgruppe 6 des Glucosemoleküls) unter Erzeugen von Isomaltose aus D-Glucose oder Panose aus Maltose statt. Das Enzym kann auch auf das 2-OH oder 3-OH von D-Glucose übertragen unter Bildung von Kojibiose oder Nigerose oder zurück zu 4-OH unter erneuter Bildung von Maltose. Im Ergebnis von Transglucosidasereaktionen werden die Malto-Oligosaccharide in Isomalto-Oligosaccharide umgewandelt unter Erzeugung einer Klasse von Oligosacchariden, die einen höheren Anteil von Glucoseeinheiten, gebunden durch Alpha-D-1,6-glucosidische Bindungen, enthält. Die Transglucosidase von A. niger wirkt nur auf Oligosaccharide mit einem niedrigen DP (McCleary B. V., Gibson T. S., Carbohydrate Research 185(1989) 147–162; Benson C. P., Kelly C. T., Fogarty W. M., J. Chem. Tech. Biotechnol., 32(1982) 790–798; Pazur J. H., Tominaga Y., DeBrosse C. W., Jackman L. M., Carbohydrate Research, 61(1978) 279–290).

Isomalto-Oligosaccharide können auf verschiedenen Wegen erhalten werden. Beispielsweise werden Glucosesirupe bei einer hohen Trockenfeststoffkonzentration; d. h. 60–80% mit Glucoamylase behandelt unter Erzeugung der Bildung von Isomalto-Oligosacchariden, hauptsächlich DP2. Andere Beispiele sind Maltoseübertragung, die durch die Zugabe von Pullulanase zu verflüssigter Stärke, Verzweigung von Maltosesirupen und Behandlung von Sucrose mit Traubenzuckersucrase erreicht werden.

Es wird mitgeteilt, dass eine kommerzielle Herstellung von Isomalto-Oligosacchariden in einer nicht-kontinuierlichen Weise durchzuführen ist. Ein normales Herstellungsverfahren (JP 61-212296), Showa Sangyo Co. Ltd.) beginnt mit der Verflüssigung einer 30%igen Aufschlämmung von Mais-, Kartoffel- oder Tapiokastärke mit einer thermostabilen Alpha-Amylase zu einem 6- bis 10-DE-Verflüssigungsprodukt. Diese Verflüssigung wird auf pH 5 und 60°C gebracht und Beta-Amylase und Transglucosidase werden zugegeben und die Saccharifizierung wird für 48–72 Stunden fortgesetzt. Am Ende des Verzuckerungsvorgangs wird der Sirup filtriert und mit Aktivkohle und Ionenaustauschern verfeinert. Das reine Produkt wird schließlich auf rund 80% ds aufkonzentriert (Takaku H., Handbook of Amylases and related Enzymes, Hrsg. The Amylase Research Society of Japan, Pergamon Press, Oxford, (1988), 215–217). Die verwendete Beta-Amylase stammt aus Sojabohnen oder Weizen, die Transglucosidase kommt meistens aus einer pilzlichen Quelle, vorzugsweise Aspergillus niger.

Andere Herstellungsverfahren sind bekannt; diese schließen die Umwandlung von Stärkehydrolysat mit einem Gemisch von Alpha-Amylase und Transglucosidase (JP 41-48693, Nippon Corn Starch KK) und die Umwandlung von Stärke in einen hohen DP3- oder DP4-Sirup mit DP3- oder DP4-bildenden Alpha-Amylasen, in Verbindung mit Transglucosidase, unter Erzeugung von verzweigten Oligosacchariden, ein (JP 31-87390, Gunei, Kagaku Kogyo).

Große Aufmerksamkeit wurde löslichen Enzymsystemen zur Herstellung von Isomalto-Oligosacchariden gezollt, wobei allerdings keine solche Aktivität auf dem Gebiet von immobilisierten Enzymen beobachtet werden kann. Die Japanische Patentanmeldung JP 63-109790 (angemeldet von Showa Sangyo Co.) beschreibt die Verwendung eines immobilisierten Transglucosidase-Konjugats für die Herstellung von Isomalto-Oligosaccharidsirupen. Das Konjugat wird durch Vernetzen von Gelatine mit Glutardialdehyd in Gegenwart von Transglucosidase hergestellt. Das erhaltene Konjugat hat eine geringe mechanische Stabilität und muss zerkleinert werden, bevor der Transport zu den Durchlaufkolonnen möglich ist. Aufgrund der ziemlich heterogenen Reaktion ist das Enzym innerhalb des Trägermaterials nicht homogen verteilt, was zu gestörter Kinetik führt, die ein Endprodukt ergibt, welches nicht die maximal erhältliche Menge an Isomalto-Oligosacchariden aufweist. Ein weiterer Nachteil ist, dass der Träger nicht wiederverwendbar ist. Nach Erschöpfung der Enzymaktivität muss das gesamte Konjugat verworfen werden, was wirtschaftlich und ökologisch keine bevorzugte Lösung ist.

Die Europäische Patentanmeldung EP 301522 betrifft die Herstellung von Isomaltulose, ausgehend von einem Gemisch von Glucose und Fructose. Die Beschreibung offenbart nicht die Verwendung von wiederverwendbaren Trägern für dieses erwähnte Verfahren; zusätzlich zeigen die Beispiele nur die Verwendung von nicht-immobilisierten Enzymen zum Ausführen der Umwandlung.

US-Patent 3 935 070 betrifft die Isomerisierung von Stärkehydrolysat, um mindestens einen Teil des Traubenzuckers zu Lävulose umzuwandeln. Dieser Umwandlung kann eine Behandlung mit Transglucosidase auf Bentonit folgen. Bentonit ist ein nicht wiederverwendbarer Träger; darüber hinaus ist das Ausgangsmaterial eine Traubenzuckermutterlauge.

Die Japanische Patentanmeldung JP 04 051899 (übertragen auf NGK Insulators Ltd.) offenbart die Verwendung von Enzymen, die auf porösen Keramikteilchen, zusammengesetzt aus SiO₂ und MgO, immobilisiert sind. Diese Keramikteilchen sind nicht wiederverwendbar.

Die Japanische Patentanmeldung JP 62 278984 (angemeldet für Daikin Kogyo KK) offenbart die Verwendung eines Co-Immobilisats, zusammengesetzt aus Zellen und Enzymen. Auch ein solches Produkt ist nicht wiederverwendbar.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von Isomalto-Oligosaccharidsirupen, wobei ein Stärkehydrolysat enzymatisch durch eine Transglucosidase unter Verwendung eines wiederverwendbaren Trägers für die Immobilisation von Transglucosidase umgewandelt wird. Das Stärkehydrolysat ist ein Sirup mit einer DE zwischen 4 und 70, vorzugsweise zwischen 20 und 60.

Vorzugsweise ist der Träger ein Anionenaustauschharz und die Transglucosidase wird durch seine Adsorption immobilisiert.

Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass andere Enzyme mit der Transglucosidase co-immobilisiert werden; solche anderen Enzyme sind eine Pullulanase oder eine Alpha-Amylase. Die Enzyme können zusammen auf dem gleichen Träger immobilisiert sein, jedoch ist es auch möglich, die Enzyme getrennt zu immobilisieren. Dies ermöglicht die Trennung von zwei enzymatischen Umwandlungsschritten.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das Träger/Enzym-Konjugat durch Reaktion mit einem oder mehreren Vernetzungsmitteln weiterhin verstärkt.

Die kontinuierliche Herstellung von einem Isomalto-Oligosaccharidsirup, der mehr als 40% Isomalto-Oligosaccharide enthält, wird offenbart, vorzugsweise mehr als 45%. Diese Werte werden mit einer Fließgeschwindigkeit von mindestens 3 Bettvolumina pro Stunde und für einen Zeitraum von mindestens 25 Tagen erreicht.

In einem weiteren Aspekt wird außerdem der Isomalto-Oligosaccharidsirup verfeinert bzw. raffiniert; d. h. durch chromatographische Mittel oder durch Filtration weiterbehandelt.

Es ist ein weiterer Teil der Erfindung, dass während der Herstellung des Isomalto-Oligosaccharidsirups oder anschließend die Süße gesteigert wird. Dies kann durch Zusatz eines Süßungsmittels oder durch weitere enzymatische Umwandlung mit Glucoseisomerase oder einer Hydrolase ausgeführt werden, wodurch Glucose in Fructose umgewandelt wird. Diese enzymatische Umwandlung kann gleichzeitig mit oder aufeinanderfolgend auf die Transglucosylierung ausgeführt werden.

1 zeigt die Herstellung von Isomalto-Oligosacchariden (= % Isomaltose + % Nigerose + % Isomaltotriose + Panose + % Isomaltotetraose) als eine Funktion der Lebensdauer des Konjugats und der Menge an für das Vernetzen verwendetem Glutardialdehyd.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Isomalto-Oligosaccharidsirupen, wobei das Stärkehydrolysat enzymatisch durch eine Transglucosidase oder ein Enzym mit vergleichbarer Aktivität, unter Verwendung eines wiederverwendbaren Trägers für die Enzymimmobilisierung, umgewandelt wird. Das Stärkehydrolysat hat einen DE zwischen 4 und 70, vorzugsweise zwischen 20 und 60. Das Stärkehydrolysat wird beispielsweise durch enzymatische oder Säurehydrolyse, durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, erhalten.

Als ein Träger kann beliebiges wiederverwendbares Material angewendet werden. Für den vorliegenden Zweck bedeutet wiederverwendbar, dass der Träger von Enzym oder enzymatischer Aktivität in einer derartigen Weise befreit ist, dass das Trägermaterial intakt bleibt. Das Trägermaterial kann dann mit Enzym erneut beladen und wieder verwendet werden. Das Reinigen des Trägers kann beispielsweise durch Waschen mit saurer oder basischer Lösung ausgeführt werden; dies kann in Charge oder in der Säule durchgeführt werden. Es kann vorteilhaft sein, ein Salz zuzusetzen. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Protein-abbauenden Enzymen. Ein noch weiteres Mittel würde Erhitzen des Materials sein.

Vorzugsweise werden Materialien verwendet, die Anionenaustauschgruppen aufweisen. Solche Materialien können auf der Grundlage von Cellulose vorliegen. Andere, bevorzugtere Träger sind auf Polyacrylat- oder Polystyrol-basierende Träger mit schwach basischen Gruppen; bevorzugt sind auf Phenolformaldehyd-basierende Träger, wie Duolite^TM A568 (Rohm and Haas).

Vorzugsweise ist der Träger ein Anionenaustauschharz und die Transglucosidase wird darauf durch Adsorption; d. h. in einer nicht-kovalenten Weise, immobilisiert. Dies ermöglicht die leichte Entfernung des inaktiven Enzyms und das anschließende erneute Beladen mit frischem Enzym. Es wird in den vorliegenden Beispielen gezeigt (angemerkt in Beispiel 11), dass das Enzym leicht aus dem Träger entfernt werden kann. Das wiederbeladen des Trägers ergibt die vollständige Wiedergewinnung der Aktivität des Konjugats. Dies bedeutet, dass das Trägermaterial für einen großen Zeitraum verwendet werden kann, bevor es ersetzt werden muss.

Beispiel 1 erläutert die Immobilisierung von Transglucosidase auf einem Anionenaustauschharz. Die Anwendung dieses Katalysators in einer Säule für die Umwandlung eines 30%igen ds Maltosesirups zeigt, dass eine konstante Fließrate von etwa 3 Bettvolumen pro Stunde der Gesamtmenge von gebildeten Isomalto-Oligosacchariden etwa 40% ist und das Verfahren für mindestens etwa 30 Tage stabil ist. Eine kleine Änderung in der Menge von einzelnen Isomalto-Oligosacchariden wird beobachtet. Die Aktivität des Enzyms ist hauptsächlich in dem DP2–DP6-Bereich. Das Vernetzen der immobilisierten Transglucosidase mit Glutardialdehyd wird in Beispiel 2 beschrieben. Der Dialdehyd wurde bei einer Endkonzentration von 1% verwendet. Die Ergebnisse (Beispiel 2) zeigen, dass das Vernetzen des Enzyms Anlass zur Bildung eines Sirups mit einer anderen Zusammensetzung zu jenem, erhalten ohne Vernetzen, ergibt. Insbesondere wird die Menge an Glucose erhöht. Die Gesamtmenge an Isomalto-Oligosacchariden ist etwa 35%, wobei die Senkung um 5% fast vollständig einer Abnahme von Panose zugeschrieben werden kann.

Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass andere Enzyme mit der Transglucosidase co-immobilisiert werden, wobei solche anderen Enzyme Pullulanasen oder Alpha-Amylasen darstellen. Die Pullulanase oder Alpha-Amylase wird höhere DPn-Fraktionen in kleinere Fragmente umwandeln, welche der Wirkung von Transglucosidase zugänglich sind. Die Enzyme können zusammen auf dem gleichen Träger immobilisiert werden, jedoch ist es auch möglich, die Enzyme getrennt zu immobilisieren. Dies ermöglicht es, zwei enzymatische Umwandlungsschritte zu trennen. Die Alpha-Amylase und/oder Pullulanase können in einem solchen Fall von der Transglucosidase physikalisch getrennt gehalten werden. Sie können beispielsweise vor der Transglucosidase angeordnet sein. Der Vorteil eines solchen Verfahrens ist, dass, wenn eines der Enzyme erschöpft ist, man nicht alle Enzyme ersetzen muss; anstatt dessen würde es möglich sein, nur eines der Enzyme zu ersetzen und mit dem anderen nicht erschöpften Enzym fortzufahren. Eine solche getrennte Immobilisierung wird in Beispiel 10 offenbart.

Auch eine Behandlung mit Glutardialdehyd kann auf dem erzeugten Konjugat zum Stabilisieren der immobilisierten Enzyme durchgeführt werden.

Co-Immobilisierung von Transglucosidase mit Pullulanase (1 : 7,5 (Gewicht/Gewicht)) führte zu einem Konjugat, welches, wenn auf einen 30%igen ds Maltosesirup aufgetragen, einen Isomalto-Oligosaccharidsirup mit einem viel niedrigeren Glucosegehalt und einem erhöhten DP3-Gehalt ergibt. Der DPn-Gehalt wurde aufgrund der Aktivität von Pullulanase halbiert (Beispiel 3). Die Menge an Isomalto-Oligosacchariden begann bei etwa 48%, jedoch sank dieser Wert mit der Zeit stark. Der Katalysator ist dafür deutlich instabil. Die Menge an Panose war rund 18%.

Ein ähnlicher Versuch mit der Hälfte der Menge an Pullulanase zur Gewinnung eines anderen Isomalto-Oligosaccharidspektrums (Beispiel 4) wurde ausgeführt.

Um das Konjugat des co-immobilisierten Enzym/Trägerprodukts zu stabilisieren, wurde es mit Glutardialdehyd bei verschiedenen Konzentrationen behandelt. Anwenden von mehr als etwa 0,1% des Dialdehyds ergab eine beträchtlich höhere Stabilität. Die Gesamtmenge an Isomalto-Oligosacchariden war oberhalb 45% und verblieb oberhalb dieses Wertes, auch wenn die Fließrate auf 6 Bettvolumen pro Stunde erhöht wurde (Beispiel 6).

Beispiele 6 und 7 zeigen weiterhin, dass die erhöhte Stabilität mit sowohl 0,25 als auch 1% Glutardialdehyd erreicht wird.

Die vorliegende Erfindung offenbart somit die kontinuierliche Herstellung eines Isomalto-Oligosaccharidsirups, der mehr als 40% Isomalto-Oligosaccharide enthält, vorzugsweise mehr als 45%. Diese Werte werden mit einer Fließrate von mindestens 3 Bettvolumen pro Stunde und für einen Zeitraum von mindestens 25 Tagen erreicht.

In einem weiteren Aspekt wird der Isomalto-Oligosaccharidsirup außerdem verfeinert bzw. raffiniert; d. h. mit chromatographischen Mitteln oder durch Filtration weiter behandelt. Der hergestellte Isomalto-Oligosaccharidsirup kann mit Hilfe einer Chromatographietechnik oder durch Ultra- oder Nanofiltration zum Entfernen der Glucosefraktion und zur Gewinnung eines auf diese Weise an dem Isomalto-Oligosaccharidgehalt angereicherten Sirups fraktioniert werden.

Es ist ein weiterer Teil der Erfindung, dass während der Herstellung des Isomalto-Oligosaccharidsirups oder nachdem die Süße erhöht wird, wobei dies durch Zugabe eines Süßungsmittels oder durch eine zusätzliche enzymatische Umwandlung mit Glucoseisomerase oder einer Hydrolase ausgeführt werden kann.

In Beispiel 8 wurde ein Isomalto-Oligosaccharidsirup über eine Glucoseisomerasesäule mit einer Umwandlung von Glucose zu Fructose, ohne wesentliches Beeinflussen der anderen Oligosaccharide, umgewandelt.

Ein weiterer Weg zur Erhöhung der Süße oder des Isomalto-Oligosaccharidgehalts ist es, den hergestellten Isomalto-Oligosaccharidsirup mit einer Hydrolase (in löslicher oder immobilisierter Form), die vorzugsweise oder auch ausschließlich Malto-Oligosaccharide hydrolysiert, zu behandeln und hat nur eine kleine oder auch keine Affinität für Isomalto-Oligosaccharide. Beispiel für ein solches Enzym ist Glucoamylase aus A. niger oder anderen Quellen, wie Aspergillus sp. Oder Rhizopus sp., die vorzugsweise Malto-Oligosaccharide hydrolysieren (Manjunath P., Shenoy B. C., Raghavendra Rao M. R., Journal of Applied Biochemistry, 5(1983), 235–260; Meagher M. M., et al., Biotechnology and Bioengineering, 34(1989), 681–693; Pazur J. H., Kleppe K., The Journal of Biological Chemistry, 237(4)(1962), 1002–1006; Hiromi K., Nitta Y., et al., Biochimica et Biophysica Acta, 302(1973), 362–37).

Das Gleiche wurde unter Verwendung von Glucoamylase ausgeführt. In dem Fall gab es eine starken Erzeugung von Traubenzucker auf Kosten von allen anderen Oligosacchariden (Beispiel 9).

Auch ein Enzym, wie Alpha-D-Glucopyranosidase von Bacillus stearothermophilus, kann angewendet werden. Dieses Enzym kann Isomalto-Oligosaccharide nicht hydrolysieren und wird nur die in dem Isomalto-Oligosaccharid-reichen Sirup vorliegenden Malto-Oligosaccharide abbauen (Suzuki Y., Shinji M., Nobuyuki E., Biochimica et Biophysica Acta, 787(1984), 281–289). Auch andere Alpha-D-Glucosidasen, die Maltasen genannt werden, können verwendet werden. Die Maltase von Hefe wird beispielsweise nur Maltose und zu einem geringeren Ausmaß Maltotriose hydrolysieren (Kelly C. T., Fogarty W. M., Process Biochemistry, Mai/Juni (1983), 6–12).

Nach der Hydrolyse der Malto-Oligosaccharide zu Glucose kann der Sirup durch eine chromatographische Technik oder durch Nano- oder Ultrafiltration an Isomalto-Oligosaccharide angereichert werden.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Hauptaspekte dieser Erfindung.

Die Transglucosidaseaktivität wird durch das Verfahren von McCleary et al. (McCleary B. V., Gibson T. S., Carbohydrate Research, 185(1989), 147–162) gemessen.

Methyl-alpha-D-glucopyranosid wird in Gegenwart von Transglucosidase bei pH 5,0 und 60°C für 10 Minuten reagieren lassen und dabei zu D-Glucose umgewandelt. Die D-Glucose wird gemessen und die Aktivität wird in Internationalen Einheiten ausgedrückt. Eine Internationale Einheit (U) ist die Menge an Enzym, die erforderlich ist, ein Mikromol glucosidische Bindung pro Minute aufzubrechen. Die Pullulanaseaktivität wird durch ein modifiziertes Verfahren von Lappalainen et al. (Lappalainen A., Niku-Paavola M. -L., Suortti T., Poutanen K., Starch, 43(12)(1991), 477–482) gemessen.

Die Pullulanaseaktivität wird durch reagieren lassen von Pullulan mit der Pullulanase bei pH 5 und 50°C für 15 Minuten gemessen. Das Pullulan wird zu Oligosacchariden hydrolysiert, welche colorimetrisch durch das DNS-Reagenz quantifiziert werden. Die Enzymaktivität wird aus einer Standardkurve berechnet, die die Beziehung zwischen der Konzentration von Maltose und der Absorption ausdrückt. Eine Einheit ist die zur Erzeugung von einem Mikromol reduzierenden Gruppen erforderliche Menge an Enzym, ausgedrückt als Maltoseäquivalente pro Minute.

Die als Substrate in allen Beispielen, mit Ausnahme Beispiele 7 und 8, verwendeten Sirupe hatten die nachstehende ungefähre Zusammensetzung:

Dieses Substrat enthält eine sehr niedrige Menge an Isomalto-Oligosacchariden:

Die Verwendung von Substraten, wie in den Beispielen beschrieben, schließt nicht die Verwendung von anderen Substraten, wie Maltodextrinen (Stärkehydrolyseprodukte mit Dextroseäquivalent < 20), oder Sirupen, zusammengesetzt aus verschiedenen Mengen DP1–DP20 und höheren DPn, aus.

Die analytische Charakterisierung der Substrate und Produkte wurde an einer HPLC, ausgestattet mit einer Shodex KS-801-Säule in der Na⁺-Form und RI-Detektion, durchgeführt. Dieses Verfahren ergibt DP1-, DP2-, DP3-, DP4- und DPn-Zusammensetzung. Die DP1–DP10-Zusammensetzung wurde mit einer Bio-Rad HPX 42-A-Säule bestimmt. Die Quantifizierung der einzelnen Isomalto-Oligosaccharide wurde durch Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie ausgeführt; d. h. unter Verwendung einer Dionex Carbopac PA-1-Säule mit puls-amperometrischer Detektion.

10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit HCl auf einen pH-Wert von 3,5 konditioniert. 2 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 1 Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das hergestellte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und wurde in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. 30% ds Maltosesirup (3,3% DP1, 49,7% DP2, 21,9% DP3, 0,9% DP4, 24,2% DP ≥ 5), gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 3 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Auslass der Säule wurde durch HPLC analysiert. Tabelle 1 erläutert die Änderung der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung der immobilisierten Transglucosidase:

Tabelle 2 beschreibt die verschiedenen hergestellten Isomalto-Oligosaccharide.

Zusätzlich zu der Gesamtmenge an Isomalto-Oligosacchariden von etwa 40%, enthält auch die DPn-Fraktion eine wesentliche Menge an verzweigten Oligosacchariden mit einem DP ≥ 5. Obwohl der Gesamt-Isomalto-Oligosaccharid-Gehalt mit der Zeit konstant bleibt, kann eine kleine Änderung in der Herstellung der einzelnen Isomalto-Oligosaccharide festgestellt werden. Tabelle 3 erläutert die Änderung beim Oligosaccharidprofil nach Umwandlung des Substrats durch das Konjugat.

Aus Tabelle 3 wird deutlich, dass die Wirkung der immobilisierten Transglucosidase in dem DP2–6-Bereich liegt. Die Gesamtheit der DP2- und DP3-Moleküle wird zu Glucose und DP4–6-Molekülen umgewandelt. Die DP10+-Fraktion hat sich nicht wesentlich geändert.

10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 0,3 ml 1 M Na₂CO₃ konditioniert. 2 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. 5 ml einer 5%igen Glutardialdehydlösung (Endkonzentration 1%) wurden zugegeben und das Harz wurde für eine Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Das hergestellte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup (3,3% DP1, 49,7% DP2, 21,9% DP3, 0,9% DP4, 24,2% DP ≥ 5), gebracht auf pH 4, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 3 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Auslass der Säule wurde durch HPLC analysiert. Tabelle 4 erläutert die Änderung der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung der immobilisierten Transglucosidase:

Wenn die Ergebnisse mit jenen in Tabelle 1 angegebenen verglichen werden, wird deutlich, dass der Glutardialdehyd das Wirkungsmuster der immobilisierten Transglucosidase verändert. Das Glutardialdehyd-behandelte Konjugat erzeugt mehr Glucose als das in Beispiel 1 beschriebene Konjugat.

Tabelle 5 beschreibt die verschiedenen hergestellten Isomalto-Oligosaccharide.

Eine Erhöhung der Menge an Isomalto-Oligosacchariden wird beim Vergleich mit nicht-behandeltem TG-Konjugat beobachtet (Tabelle 2). Dies bezieht sich direkt auf die niedrigere Erzeugung von Panose in dem Glutardialdehyd-Konjugat.

10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit HCl auf einen pH-Wert von 3,5 konditioniert. 2 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. 15 g Pullulanase (Optimax L300^TM von Genencor Int., 2,6 mg Protein/g Enzymlösung, 400 PU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und die Immobilisierung wurde über Nacht fortgesetzt. Das hergestellte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup (3,3% DP1, 49,7% DP2, 21,9% DP3, 0,9% DP4, 24,2% DP ≥ 5), gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 3 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Auslass der Säule wurde durch HPLC analysiert. Tabelle 6 erläutert die Änderung der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung des immobilisierten Transglucosidase/Pullulanase-Konjugats.

Verglichen mit dem immobilisierten Transglucosidase-Konjugat, wie in Beispiel 1 hergestellt, wird weniger Glucose hergestellt, während insbesondere das DP3 viel höher ist. Weiterhin ist die DPn-Fraktion aufgrund der Wirkung der immobilisierten Pullulanase halbiert.

Eine Abnahme von Traubenzuckerbildung mit der Zeit wird festgestellt, was ausweist, dass dieses Konjugat keine hohe Stabilität besitzt.

Tabelle 7 beschreibt die verschiedenen hergestellten Isomalto-Oligosaccharide.

Aus Tabelle 7 wird deutlich, dass der Gehalt an Isomalto-Oligosacchariden mit der Zeit abnimmt.

Der Unterschied zu dem in Beispiel 3 beschriebenen Konjugat wird auf ein Verhältnis von Transglucosidaseaktivität/Pullulanaseaktivität, bezogen auf den Enzymträger, geändert.

10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit HCl auf einen pH-Wert von 3,5 konditioniert. 2 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 7,5 g Pullulanase (Optimax L300^TM von Genencor Int., 2,6 mg Protein/g Enzymlösung, 400 PU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und die Immobilisierung wurde über Nacht fortgesetzt. Das hergestellte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup (3,3% DP1, 49,7% DP2, 21,9% DP3, 0,9% DP4, 24,2% DP ≥ 5), gebracht auf pH 4, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 3 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Auslass der Säule wurde durch HPLC analysiert. Tabelle 8 erläutert die Änderung der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung des immobilisierten Transglucosidase/Pullulanase-Konjugats.

Es wird deutlich, dass auch dieses Transglucosidase/Pullulanase-Konjugat mit der Zeit an Leistung verliert, wie das in Beispiel 3 beschriebene Konjugat.

Tabelle 9 beschreibt die verschiedenen hergestellten Isomalto-Oligosaccharide.

Die in Tabelle 9 angeführten Ergebnisse zeigen, dass dieses Konjugat mit der Zeit eine abnehmende Menge an Isomalto-Oligosacchariden erzeugt. Es kann deshalb geschlussfolgert werden, dass dieses Konjugat nicht stabil ist.

10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 0,3 ml 1 M Na₂CO₃ konditioniert. 2 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 15 g Pullulanase (Optimax L300^TM von Genencor Int., 2,6 mg Protein/g Enzymlösung, 400 PU/g Enzymlösung) zugegeben und die Immobilisierung wurde weitere 4 h fortgesetzt. 5 ml einer 5%igen, 2,5%igen, 1,0%igen, 0,5%igen und 0,1%igen Glutardialdehydlösung wurden dann zugegeben, unter Gewinnung einer 1%igen, 0,5%igen, 0,2%igen, 0,1%igen bzw. 0,02%igen Glutardialdehydlösung und das Harz wurde bei Umgebungstemperatur eine Nacht gerührt. Das erzeugte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup (3,3% DP1, 49,7% DP2, 21,9% DP3, 0,9% DP4, 24,2% DP ≥ 5), gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 3 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Auslass der Säule wurde durch HPLC analysiert.

1 zeigt die Herstellung der Isomalto-Oligosaccharide (= % Isomaltose + % Nigerose + % Isomaltotriose + % Panose + % Isomaltotetraose) als Funktion der Standzeit des Konjugats.

Aus 1 folgt deutlich, dass die Glutardialdehydbehandlung eine stabilisierende Wirkung auf die Leistung von Transglucosidase/Pullulanase-Konjugaten aufweist.

Das Transglucosidase/Pullulanase-Konjugat wurde gemäß Beispiel 5 hergestellt. Das Vernetzen wurde mit Glutardialdehyd bei 0,2%iger Endkonzentration ausgeführt.

Ein 30%iger ds Maltosesirup, gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 3 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Auslass der Säule wurde durch HPLC analysiert. Tabelle 10 erläutert die Änderung der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung von immobilisierter Transglucosidase:

Wie angemerkt, wird nur eine marginale Senkung des Traubenzuckers mit der Zeit beobachtet.

Tabelle 11 beschreibt die verschiedenen hergestellten Isomalto-Oligosaccharide.

Die in Tabelle 11 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass eine stabile Erzeugung von 46% Isomalto-Oligosacchariden bei 3 BV/h mit diesem Konjugat erhalten werden kann. Eine Erhöhung der Fließrate auf rund 6 BV/h senkt den Gehalt an erzeugtem Traubenzucker, während die Menge an erzeugten Isomalto-Oligosacchariden konstant bleibt. Eine weitere Erhöhung der Fließrate auf rund 9 BV/h senkt die Menge an erzeugten Isomalto-Oligosacchariden. Tabelle 12 gibt die Variation der Oligosaccharidverteilung des erzeugten Sirups mit der Zeit an.

Tabelle 12 demonstriert, dass die meisten der in dem Sirup erzeugten Oligosaccharide im Bereich unter DP6–7 liegen, im Gegensatz zu dem Substrat, bei dem ein wesentlicher Teil (23,5%) der Oligosaccharide einen DP höher als 6 aufweist. Wenn mit dem in Beispiel 1 (Tabelle 3) beschriebenen Konjugat verglichen, wird deutlich, dass die Wirkung von co-immobilisierter Pullulanase die DP10+-Fraktion wesentlich senkt.

10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 0,3 ml 1 M Na₂CO₃ konditioniert. 2 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 15 g Pullulanase (Optimax L300^TM von Genencor Int., 2,6 mg Protein/g Enzymlösung, 400 PU/g Enzymlösung) zugegeben und die Immobilisierung wurde weitere 4 h fortgesetzt. 5 ml einer 5,0%igen Glutardialdehydlösung wurden zugegeben, unter Gewinnung einer 1%igen Glutardialdehydlösung, und das Harz wurde bei Umgebungstemperatur eine Nacht gerührt. Das erzeugte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup (3,3% DP1, 48,4% DP2, 20,8% DP3, 1,3% DP4, 26,2% DP ≥ 5), gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule bei einer Fließrate von 10 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Das Produkt am Ausgang der Säule wurde durch HPLC analysiert. Tabelle 13 erläutert die Veränderung in der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung der immobilisierten Transglucosidase:

Aus Tabelle 13 wird deutlich, dass eine Menge an Traubenzucker bei 3 BV/h erzeugt wird, während die DPn-Fraktion verglichen mit dem Substrat deutlich vermindert wird. Erhöhen der Fließrate auf 6–9 BV/h senkt die Glucoseerzeugung und erhöht gleichzeitig den restlichen DPn-Gehalt.

Tabelle 14 erläutert die Änderung der Saccharidzusammensetzung durch die Wirkung der immobilisierten Transglucosidase:

Die in Tabelle 14 gezeigten Daten beweisen, dass bei 3 BV/h rund 45–46% Isomalto-Oligosaccharide erhalten werden können. Beim Erhöhen der Fließrate auf 6 BV/h nimmt die Menge an Isomalto-Oligosacchariden nicht ab. Bei 9 BV/h wird eine Senkung der Isomalto-Oligosacchariderzeugung bemerkt.

Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Erhöhung der Süße eines Isomalto-Oligosaccharidsirups durch Umwandlung eines Teils der erhältlichen Glucose zu Fructose.

Ein Isomalto-Oligosaccharid-reicher Sirup (pH 7,8, 60% ds, 200 ppm Mg²⁺) wurde durch ein immobilisiertes Glucoseisomerase-Konjugat (thermostatisiert bei 50°C) bei 3–4,5 BV/h geschickt. Die Ergebnisse der Isomerisierung werden in Tabelle 15 angegeben.

Die Ergebnisse in Tabelle 15 zeigen, dass eine 9%ige Fructoseversion eines Isomalto-Oligosaccharidsirups leicht hergestellt wird. Natürlich können auch Isomalto-Oligosaccharidsirupe mit anderen Fructoseprozentsätzen als 9% erhalten werden.

Tabelle 16 beweist, dass die Isomalto-Oligosaccharid-Zusammensetzungen während des Isomerisationsverfahrens nahezu unverändert bleiben.

Dieses Beispiel erläutert die Wirkung einer Hydrolase, in diesem Fall Glucoamylase von A. niger, auf einem Isomalto-Oligosaccharidsirup. Ein Isomalto-Oligosaccharid-reicher Sirup (80% ds, pH 4) wurde durch ein immobilisiertes Glucoamylase-Konjugat bei rund 1 BV/h geschickt. Die Änderung im Oligosaccharidspektrum wird in Tabelle 17 angegeben.

Es wird deutlich Traubenzucker erzeugt, während die Oligosaccharide sinken.

Die Änderung in dem Isomalto-Oligosaccharidgehalt wird in Tabelle 18 gezeigt.

Tabelle 18 zeigt, dass eine wesentliche Menge Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und DPn-Fraktion zu Glucose gespalten wurde.

Natürlich kann die hydrolytische Reaktion bei niedrigerem ds, beispielsweise 30%igem ds, wie in Tabelle 19 gezeigt, durchgeführt werden.

Tabelle 19 zeigt deutlich, dass eine Senkung der Fließrate zu einem weiteren Abbau der DPn-Fraktion führt. Dies wird auch in Tabelle 20 beispielhaft angegeben.

Durch Einstellen der Fließrate kann eine maximale Menge an DPn-Fraktion abgebaut werden, ohne zu starkes Hydrolysieren der Isomalto-Oligosaccharide (Tabelle 21).

5 ml Duolite A568 wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 0,15 ml 1 M Na₂CO₃ konditioniert. 7,5 g Optimax 300L (Genencor) wurden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,008 ml Glutardialdehydlösung (25% Gewicht/Volumen)/ml Überstand. Das Gemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur mild gerührt. Das erzeugte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup, gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule bei einer Anfangsfließrate von 6 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Die Entzweigungsaktivität des Konjugats wird in Tabelle 22 deutlich gezeigt. Der entzweigte Maltosesirup wurde durch ein immobilisiertes Transglucosidase-Konjugat, wie in B) beschrieben, geschickt.

5 ml Duolite A568 wurden mit entmineralisiertem Wasser zum Entfernen von Feinstoffen gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 0,15 ml 1 M Na₂CO₃ konditioniert. 1 g Transglucosidase L „Amano" wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,08 ml Glutardialdehydlösung (25% Gewicht/Volumen). Das Gemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur mild gerührt. Das erzeugte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Das Sirupprodukt wurde durch das Pullulanase-Konjugat durch die Säule bei einer Anfangsfließrate von 6 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten. Die Erzeugung von Isomalto-Oligosaccharidsirup wird in Tabelle 23 gezeigt.

• A) 10 ml Duolite A568^TM wurden zum Entfernen von Feinstoffen mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 0,3 ml 1 M Na₂CO₃ konditioniert. 1 g Transglucosidase L „Amano" (Flüssigzubereitung, 11,2 mg Protein/g Enzymlösung, 103 TGU/g Enzymlösung) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 15 g Pullulanase (Optimax L300^TM von Genencor Int., 2,6 mg Protein/g Enzymlösung, 400 PU/g Enzymlösung) zugegeben und die Immobilisierung wurde weitere 4 h fortgesetzt. 5 ml einer 1,0%igen Glutardialdehydlösung wurden zugegeben, unter Erzeugung einer 0,2%igen Glutardialdehydlösung und das Harz wurde eine Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Das erzeugte Konjugat wurde mit entmineralisiertem Wasser gespült und in eine doppelt ummantelte Glassäule bei 50°C gegeben. Ein 30%iger ds Maltosesirup, gebracht auf pH 4,2, wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 10 BV/h (Bettvolumen/Stunde) gepumpt. Die Säulentemperatur wurde bei 50°C gehalten.
  
  Das Konjugat wurde 30 Tage unter Erzeugung von 43–45% von Isomalto-Oligosacchariden bei 3 BV/h laufen lassen.
• B) Anschließend wurde das Konjugat in ein Becherglas überführt und mit Wasser zur Entfernung von Zuckern und Feinstoffen gewaschen. Der pH-Wert des Harzes wurde auf 1,5 gebracht und das Harz wurde 1 h bei 60°C gerührt. Der pH-Wert wurde dann mit NaOH auf 12,5 erhöht und das Rühren wurde 1 Stunde, unter Halten des pH-Werts bei 12,5, fortgesetzt. Anschließend wurde das Konjugat mit entmineralisiertem Wasser zur Entfernung der Feinstoffe gewaschen.
• C) Verfahren A) wurde an dem regenerierten Harz wiederholt. Eine gleiche Enzymmenge wurde immobilisiert und das neue Konjugat erzeugte einen 43–45%igen Isomalto-Oligosaccharidsirup bei der gleichen Fließrate wie in A) beschrieben.