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Dokumentenidentifikation DE69631380T2 04.11.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000863982
Titel SYNTHETISCHE HPV11 VIRUSARTIGE PARTIKEL
Anmelder Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., US
Erfinder LUDMERER, Steven, Rahway, US;
BENINCASA, Diana, Rahway, US;
MARK, E., George, Rahway, US
Vertreter Abitz & Partner, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69631380
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 12.11.1996
EP-Aktenzeichen 969404664
WO-Anmeldetag 12.11.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/18322
WO-Veröffentlichungsnummer 9718301
WO-Veröffentlichungsdatum 22.05.1997
EP-Offenlegungsdatum 16.09.1998
EP date of grant 21.01.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 04.11.2004
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse C12Q 1/70   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher Partikel (VLP), welche sich zur Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion eignen, und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen Partikel einsetzen.

Hintergrund der Erfindung

Papillomavirus-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische infektiöse Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches Lebewesen infizieren.

Papillomaviren können auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 60 Typen eingeteilt (hinsichtlich eines Überblicks siehe Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (Hrsg.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.

Beim Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen. Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25, 36 und 46–50 verursachen flache Läsionen bei immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome der Schleimhäute der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina, Vulva und des Analkanals assoziiert. HPV6 und HPV11 sind die Ursachen für mehr als 90% aller Condylome (Genitalwarzen) und laryngealer Papillome. Der häufigste Subtyp von HPV Typ 6 ist HPV6a.

Immunologische Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Produktion neutralisierender Antikörper gegen Papillomavirus-Antigene eine Infektion mit dem homologen Virus verhindert. Die Entwicklung wirksamer Papillomavirus-Vakzine wurde durch Schwierigkeiten, die mit der Kultivierung von Papillomaviren in vitro verbunden sind, verlangsamt. Die Entwicklung eines effektiven HPV-Vakzins wurde insbesondere durch das Fehlen eines geeigneten Tiermodells verlangsamt. Die Neutralisation von Papillomavirus durch Antikörper scheint typspezifisch zu sein und abhängig von Konformationsepitopen auf der Oberfläche des Virus.

Papillomaviren sind kleine (50–60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation assoziiert.

Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55–60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75–100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist. Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins befindet. Die L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren hoch konserviert, insbesondere die 10 basischen Aminosäuren am C-Terminus. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hoch konserviert.

Die L1- und L2-Gene wurden zur Herstellung von Vakzinen für die Prophylaxe und Behandlung von Papillomavirus-Infektionen bei Lebewesen eingesetzt. Zhou et al. (1991; 1992) klonierten HPV-Typ 16-L1- und -L2-Gene in einen Vacciniavirus-Vektor und infizierten CV-1-Säugerzellen mit dem rekombinanten Vektor, um virusähnliche Partikel (VLP) zu produzieren.

Es wurden aus Bakterien stammende rekombinante Rinder-Papillomavirus-L1 und -L2 erzeugt. Neutralisierende Seren gegen die rekombinanten bakteriellen Proteine reagierten in einer Kreuzreaktion mit nativem Virus auf niedrigen Niveaus, mutmaßlich aufgrund von Unterschieden in den Konformationen der nativen und von Bakterien stammenden Proteine.

Rekombinante Baculoviren, die HPV6-L1-, HPV11-L1-, HPV16-L1-, HPV18-L1-, HPV31-L1- oder HPV16-L2-ORFs exprimieren, wurden zur Infektion von Sf9-Insektenzellen und zur Produktion von L1- und L2-Proteinen eingesetzt. Westernblot-Analysen zeigten, daß die von Baculovirus erhaltenen L1- und L2-Proteine mit Antikörper gegen HPV16 reagierten. Das von Baculovirus erhaltene L1 bildet VLPs.

Carter et al. (1991) demonstrierten die Produktion von HPV16-L1- und HPV16-L2-Proteinen durch rekombinante Stämme von Saccharomyces cerevisiae. Carter et al. demonstrierten auch die Produktion von HPV6b-L1- und -L2-Proteinen. Das HPV6b-L1-Protein war kein Vollängen-L1-Protein. Die rekombinanten Proteine wurden als intrazelluläre und als sekretierte Produkte produziert. Die rekombinanten L1- und L2-Proteine hatten ähnliche Molekulargewichte wie die nativen Proteine. Wurden die Proteine intrazellulär exprimiert, wurde die Hauptmenge des Proteins als unlöslich befunden, wenn die Zellen in Abwesenheit denaturierender Reagenzien lysiert wurden. Obwohl diese Unlöslichkeit die Reinigung des Proteins erleichtern kann, kann sie eine Analyse der nativen Epitope des Proteins behindern.

Von rekombinanten Proteinen, die von Hefe sekretiert wurden, wurde gezeigt, daß sie von Hefe stammende Kohlenhydrate enthalten. Die Anwesenheit dieser N-verknüpften Oligosaccharide kann native Epitope maskieren. Darüber hinaus können die sekretierten rekombinanten Proteine andere Modifizierungen enthalten, wie z. B. die Retention der sekretorischen Leadersequenz.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung rekombinanter Papillomavirus-Proteine mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Papillomavirus-Proteine sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung. Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher Partikel, die für die Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion geeignet sind, und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen Partikel einsetzen.

Die Erfindung beeinhaltet die Ableitung von HPV11-L1-spezifischen Resten, welche für die Bindung neutralisierender Antikörper erforderlich sind. Die Erfindung beinhaltet ferner die Ableitung von zwei HPV11-L1-spezifischen Resten, welche zusammen zur Bindung neutralisierender Antikörper erforderlich und ausreichend sind.

HPV11-L1 enthält nur 38 Aminosäureabweichungen von HPV6-L1 plus einen inserierten Rest. Trotz der starken Identität zwischen diesen beiden Proteinen wurde eine Gruppe von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern erzeugt, welche spezifisch für HPV11-VLPs sind. Wir stellten fest, welche dieser Aminosäurepositionen für die Bindung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper von Bedeutung sind. Dies erfolgte durch Beurteilung der Bindung der monoklonalen Antikörper an eine Familie von HPV11-Klonen, welche Substitutionen von HPV11-Aminosäureresten gegen HPV6b-Aminosäurereste an diesen Positionen enthielten, und anschließende Mutation von HPV6b, um der HPV11-Sequenz an diesen kritischen Positionen zu entsprechen. Wir demonstrierten, daß die neutralisierenden Antikörper HPV6b-VLPs mit so wenig wie nur zwei dieser Substitutionen binden werden und daß beide Substitutionen für die Bindung essentiell sind. Diese Arbeit definiert die minimale Einheit für die Bindung neutralisierender Antikörper.

Die Gruppe von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern für HPV11 wurde von Neil Christiansen (Pennsylvania State University, Hershey, PA) erhalten. Die monoklonalen Antikörper in der Gruppe sind HPV11-spezifisch und VLP-abhängig. Die Antikörper können voneinander dadurch unterschieden werden, welche Aminosäurereste die Bindung der individuellen Antikörper beeinflussen, obwohl es überlappende Positionen für alle der monoklonalen Antikörper gibt.

Diese Reste definieren zusammen das Epitop für Antikörper, von denen bekannt ist, daß sie HPV11 neutralisieren. Im Prinzip führt die Mutation von HPV6-L1 an nur diesen ausgewählten Positionen zur Bindung dieser HPV11-spezifischen neutralisierenden monoklonalen Antikörper. Die derivatisierten HPV6-VLPs können eingesetzt werden, um monoklonale Antikörper gegen das HPV11-neutralisierende Epitop zu erzeugen. Dies ist die Grundlage eines Freisetzungsassays zur Bestätigung, daß hergestellte HPV11-VLPs das neutralisierende Epitop enthalten.

Dieses Problem wurde in der Vergangenheit nicht gelöst und unseres Wissens ist dies die erste Demonstration der Übertragung eines konformationsabhängigen Epitops.

Es gab zwei Probleme zu bewältigen. Erstens ist das Epitop ein Konformationsepitop und herkömmliche Mittel der Epitopkartierung, die Bindung an Peptidfragmente, konnten nicht eingesetzt werden. Es war nötig, irgendein Test-L1-Protein in einer Weise zu exprimieren, welche die Bildung virusähnlicher Partikel, welche die Virusstruktur nachahmen, erleichterte. Zweitens machte die große Anzahl von L1-Klonen, welche für die Kartierung erforderlich war, die Schaffung eines leichten Mittels zur Expression der viralen Test-Hüllproteine erforderlich.

Ohne Kenntnis des neutralisierenden Epitops wäre es schwierig, die Herstellung von VLPs für den kommerziellen Einsatz zu validieren.

Eine Verwendung des derivatisierten VLP ist diejenige als Reagens in einem Freisetzungsassay für HPV11. HPV6-L1 ist mutiert, um HPV11 in den durch diese Studien bestimmten Positionen zu entsprechen. Die Bindung der HPV11-neutralisierenden monoklonalen Antikörper an diese derivatisierten HPV6-VLPs wird demonstriert werden.

Diese derivatisierten HPV6-VLPs können in einem Konkurrenzbindungsassay mit hergestellten HPV11-VLPs zur Bindung an die HPV11-neutralisierenden monoklonalen Antikörper eingesetzt werden. Nur diejenigen HPV6-Derivate, von denen demonstriert wurde, daß sie die monoklonalen Antikörper binden, werden mit authentischem Material konkurrieren.

Alternativ können monoklonale Antikörper gegen das neutralisierende Epitop auf derivatisierten HPV6 erzeugt werden; dann wird gezeigt werden, daß hergestelltes HPV11-Vakzin diese Antikörper bindet.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher Partikel, die sich für die Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion eignen, und Assays, welche die synthetischen Partikel verwenden. Die synthetischen virusähnlichen Partikel werden von Konstrukten mit der Bezeichnung HPV6:2, HPV6:4&Dgr;132 und HPV6:4,S131G hergestellt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

1 zeigt, daß VLPs mit typspezifischen Eigenschaften bei einer transienten Transfektion gebildet werden. Sf9-Zellen wurden mit BaculogoIdTM-DNA und entweder pVL1393:CRPV oder pVL1393:HPV11 kotransfiziert. Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet, Extrakte präpariert und ELISAs wie im Text beschrieben durchgeführt. Spalte 1, CRPV-VLPs; Spalte 2, HPV11-VLPs; Spalte 3, Sf9-Extrakt, Spalte 4, Baculovirus-DNA; Spalte 5, pVL1393:CRPV; Spalte 6, pVL1393:HPV11.

  • A. Primärer Antikörper ist eine 10–5-Verdünnung von CRPV.5A-Ascitesflüssigkeit.
  • B. Primärer Antikörper ist eine 10–5-Verdünnung von H11.F1-Ascitesflüssigkeit.

2 zeigt, daß das durch die transiente Transfektion produzierte immunogene Material gegenüber einer Denaturierung sensitiv ist. Sf9-Zellen wurden mit pVL1393:HPV11 und BaculoGoldTM-DNA kotransfiziert, Zellen wurden nach sechs Tagen geerntet und Extrakte wie im Text beschrieben präpariert. Ein Teil der Extrakte wurde durch Verdünnung in 0,1 M Natriumcarbonat, pH 10,5, denaturiert und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert.

Mit diesen Extrakten wurde dann eine Mikrotiterplatte beschichtet und trocknen gelassen. Mikrotiterplatten wurden mit unbehandelten Extrakten beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. ELISAs wurden wie im Methodenteil beschrieben durchgeführt unter Verwendung einer 10–5-Verdünnung von entweder H11.F1- oder H6.C6-Ascites. Spalte 1, Sf9-Extrakt; Spalte 2, pVL1393-Extrakt; A, Extrakt ist nicht denaturiert; B, Extrakt war mit Carbonatpuffer behandelt.

3 zeigt die Aminosäuresequenzen des HPV11- und HPV6-L1-Proteins. Diese Sequenzen sind auch in der EMBL GeneBank verfügbar.

4 zeigt, daß VLPs, die von dem Klon HPV6:2 (mit einer Substitution an Position 131, gefolgt von der Tyrosin-Insertion, um die Position 132 zu schaffen) gebildet wurden, die Antikörper H11.B2, H11.F1 und H11.G5 binden. Im Gegensatz dazu binden VLPs, die von HPV6:4 gebildet wurden, das entweder an der Position 131 (HPV6:4, S131G) oder 132 (HPV6:4&Dgr;132) rückmutiert war, diese Antikörper trotz der Anwesenheit der anderen drei kritischen Restsubstitutionen nicht. Die Antikörper H11.B2, H11.F1 und H11.G5 sind neutralisierende MAbs in dem Xenograft-System. H6.C6 mißt das Gesamtniveau der L1-Produktion wie in Beispiel 4 beschrieben. Der ELISA wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher Partikel (VLP), welche sich zur Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion eignen, und Assays unter Verwendung der synthetischen virusähnlichen Partikel, welche zur Überwachung und Validierung von VLPs, die mittels rekombinanter DNA-Technologien hergestellt wurden, eingesetzt werden können. Die synthetischen virusähnlichen Partikel werden von Konstrukten mit der Bezeichnung HPV6:2, HPV6:4&Dgr;132 und HPV6:4,S131G gebildet. Andere Konstrukte sind für Referenzzwecke eingeschlossen.

Papillomavirus-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren.

Papillomaviren können auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 60 Typen eingeteilt (hinsichtlich eines Überblicks siehe Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (Hrsg.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.

Beim Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen. Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25, 36 und 46–50 verursachen flache Läsionen bei immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome der Schleimhäute der Genitalien und Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina, Vulva und des Analkanals assoziiert. HPV6 und HPV11 verursachen die Mehrheit von Genitalwarzen und laryngealen Papillomen.

Immunologische Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Produktion neutralisierender Antikörper gegen Papillomavirus-Kapsidproteine eine Infektion mit dem homologen Virus verhindert. Die Entwicklung wirksamer Papillomavirus-Vakzine wurde durch Schwierigkeiten, die mit der Kultivierung von Papillomaviren in vitro verbunden sind, verlangsamt. Die Entwicklung eines effektiven HPV-Vakzins wurde insbesondere durch das Fehlen eines geeigneten Tiermodells verlangsamt. Die Neutralisation von Papillomavirus durch Antikörper scheint typspezifisch zu sein und abhängig von Konformationsepitopen auf der Oberfläche des Virus.

Papillomaviren sind kleine (50–60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und Transformation assoziiert.

Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55–60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75–100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist.

Über die Herstellung von HPV16-L1-, HPV16-L2- und HPV Typ 6-L1-Proteinen durch rekombinante Stämme von Saccharomyces cerevisiae wurde berichtet. Es wäre von Nutzen, Verfahren zur Herstellung großer Mengen von Papillomavirus-Proteinen beliebiger Spezies und beliebigen Typs durch Kultivierung rekombinanter Hefen zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, große Mengen von Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des nativen Proteins, herzustellen. Zur Erreichung dieses letzteren Ziels wäre es erforderlich, die Wirkung zahlreicher Mutationen in dem L1-Gen auf die Bindung von Antikörpern bekannter Eigenschaften (VLP-abhängig, kreuzreaktiv, etc.) zu analysieren.

Das empirische Scanning natürlicher oder konstruierter Peptidsequenzen hinsichtlich funktioneller Reste ist inhärent abhängig von der Expression einer großen Zahl von Sequenzvarianten, um deren relative funktionelle Wirksamkeit zu untersuchen. Das Niveau der erhaltenen Proteinexpression kann insbesondere im Falle von selbstassemblierenden viralen Strukturproteinen kritisch sein, da die Effizienz der Selbstassemblierung häufig konzentrationsabhängig ist. Das Baculovirus-Insektenexpressionsvektorsystem wurde in großem Umfang eingesetzt, um virale Selbstassemblierung zu untersuchen, es erfordert jedoch im allgemeinen eine vorherige Isolierung und Expansion einer plaquegereinigten rekombinanten Virenstammkultur, um brauchbare Mengen selbstassemblierter Partikel herzustellen. Bei der Prüfung einer Reihe von Möglichkeiten zur Expression analytischer Niveaus des L1-Hüll-proteins von Baumwollschwanzkaninchen- und Human-Typ 11-Papillomaviren fanden wir, daß selbst eine kurze transiente Cotransfektion von Insektenzellen mit Baculovirus-Transfervektoren und viraler DNA assemblierte Partikel ergab, welche immunologisch von Partikeln, die zuvor aus plaquegereinigten Stammkulturen erhalten worden waren, nicht unterscheidbar waren. Binnen sechs Tagen von Plasmid/Virus-DNA-Cotransfektion von Sf9-Zellen konnten mindestens 1–2 &mgr;g assemblierter L1-Partikel/100-mm-Platte demonstriert werden. Dieses Expressionsniveau ist mehr als ausreichend, um die Funktionalität zu untersuchen, und bietet mehrere Vorteile gegenüber vergleichbaren transienten Expressionssystemen in Säugerzellen.

Zur Bestimmung neutralisierender Epitope bei HPV-Infektionen mußten wir die Aminosäurereste identifizieren, welche Human-Papillomavirus-Subtypen eine antigene Typspezifität verleihen (Christensen, N. D., et al., 1990, Monoclonal antibody-mediated neutralizafion of infectious human papillomavirus type 11, J. Virol. 64, 1936–1944). Viele der typspezifischen Epitope sind konformationsabhängig und nur nach VLP-Assemblierung nachweisbar. Das L1-Strukturhüllprotein mehrerer Tier- und Human-Papillomaviren wurde befunden, bei Expression in Insektenzellen mittels rekombinanter Baculovirus-Stämme effizient selbst zu assemblieren (Christensen, N. D., et al., 1994, Assembled baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies and induce high titres of neutralizing antibodies, J. Gen. Virol. 75, 2271–2276). Die Zeit und Mühe, die mit der Herstellung rekombinanter Phagen verbunden ist, schließt die Anwendung dieses Verfahrens zum Screenen einer großen Anzahl von VLP-Varianten, welche mittels stellengerichteter Mutagenese hergestellt wurden, aus. Jedoch beobachteten wir früher, daß ein rekombinantes Protein bei Expression in dem Baculovirus-System als sekretiertes Produkt in Mengen von &mgr;g/ml innerhalb von 5–7 Tagen der ursprünglichen Transfektion von Insektenzellen mit Plasmid- und Virus-DNAs nachweisbar ist. Auf Grundlage dieser Beobachtung überprüften wir, ob sich ausreichende Mengen an Papillomavirus-L1-Protein anhäufen würden, um eine Selbstassemblierung in VLPs nach transienter Expression zu erlauben, insbesondere wenn ein effizienteres Baculovirus-Transfektionssystem wie das BaculogoIdTM-System (Pharmingen, San Diego, CA) eingesetzt würde. Unter Anwendung eines schnellen sechstägigen transienten Transfektionsprotokolls wurde das L1-Hüllprotein zahlreicher Papillomaviren, korrekt zu VLPs assembliert, gebildet. Extrakte, die aus transient transfizierten Zellen mit CRPV- oder HPV11-L1-Genkonstrukten präpariert worden waren, enthielten immunogenes Material, das von typspezifischen und VLP-abhängigen monoklonalen Antikörpern, gebildet gegen entweder CRPV- oder HPV11-VLPs, erkannt wurde. Das transient exprimierte Material war nicht kreuzreaktiv mit anderen typspezifischen Antikörpern und die Erkennung war für eine alkalische Denaturierung sensitiv, was ferner die Naturgetreuheit der VLP-Bildung demonstrierte.

Zur Kartierung des HPV11-neutralisierenden Epitops mutierten wir HPV11 individuell an den Resten, an denen die Sequenz von der HPV6b-Sequenz abweicht. Die Positionen wurden mutiert, um der HPV6b-Sequenz zu entsprechen (das Tyrosin an Position 132 wurde deletiert, um die Wirkung dieser Insertion zu analysieren). Unter Einsatz des oben beschriebenen transienten Sf9-Expressionssystems wurden diese Mutanten-HPV11-L1-Gene exprimiert und hinsichtlich Bindung von HPV11-spezifischen monoklonalen Antikörpern analysiert.

Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung näher zu erläutern, ohne die Erfindung jedoch auf die speziellen Details dieser Beispiele zu beschränken.

BEISPIEL 1 Erzeugung von Test-Expressionskonstrukten

Das HPV11-L1-Strukturgen wurde aus klinischen Isolaten unter Anwendung von PCR mit Primern, die anhand der veröffentlichten L1-Sequenz konstruiert worden waren, kloniert. Das L1-Gen wurde anschließend sowohl in BlueScript (Pharmacia) für die Mutagenese als auch in pVL1393 (Stratagene) für die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.

Mutationen wurden in das L1-Gen unter Einsatz des Amersham-Sculptor-in vitro-Mutagenesekits eingeführt. Das Auftreten der gewünschten Mutation wurde durch Sequenzierung bestätigt und das mutierte Gen in pVL1393 für die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.

Das HPV6-L1-Strukturgen wurde sowohl in pAlt-1 (Promega) für die Mutagenese als auch in pVL1393 (Stratagene) für die Expression in Sf9-Zellen subkloniert. Mutationen wurden unter Einsatz des Altered Sites II-in vitro-Mutagenesesystems (Promega) erzeugt, durch Sequenzierung verifiziert und in pVL1393 für die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.

Sequenzen der L1-Gene von HPV6 und HPV11 wurden mit den veröffentlichten Sequenzen verifiziert [(Dartmann, K., et al., 1993, EMBO J. 2: 2341; EMBL GeneBank-Zugangsnummer M14119 (HPV11-L1) und-Zugangsnummer X00203 (HPV6B-L1)].

BEISPIEL 2 Transiente Expression von L1-VLPs in Sf9-Zellen

Sf9-Zellen wurden mit Hilfe des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen) transfiziert. Die Transfektionen erfolgten im wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifizierungen. 8 × 108 Sf9-Zellen wurden in einer 100-mm-Schale mit 4 &mgr;g BaculoGold-DNA und 6 &mgr;g Test-DNA transfiziert. Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet und hinsichtlich VLP-Produktion einem Assay unterworfen.

BEISPIEL 3 Herstellung von Sf9-Extrakten und ELISA-Assays

Zellen wurden 6 Tage nach der Transfektion durch Abkratzen, gefolgt von einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, geerntet. Die Zellen wurden in 300 &mgr;l Aufbruchpuffer (1 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,6) resuspendiert und 30 Sekunden lang auf Eis mit Hilfe eines Polytron PT 1200 B mit einer PT-DA 1205/2-A-Sonde (Brinkman) in einem Falcon-1259-Röhrchen homogenisiert. Die Proben wurden drei Minuten lang bei 2500 UpM zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Röhrchen wurden mit zusätzlichen 150 &mgr;l Aufbruchpuffer gewaschen, die Überstände in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und erneut fünf Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (Brinkman) zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. ELISA-Assays wurden typischerweise am selben Tag durchgeführt.

5 &mgr;l Extrakt wurden in 50 &mgr;l 1%igem BSA in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung; 20 mM NaPO4, pH 7,0, 150 mM NaCl) verdünnt und auf eine Polystyrolplatte ausplattiert. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Extrakte wurden entnommen und die Platte mit 5% Milchpulver in PBS blockiert. Alle anschließenden Waschschritte wurden mit 1%igem BSA in PBS durchgeführt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit primärem Antikörper inkubiert. Primäre Antikörper, monoklonale Antikörper, die gegen HPV11-VLPs gebildet worden waren, wurden als Ascites-Stammlösung von Dr. Neil Christensen (Pennsylvania State University) erhalten. Sie wurden vor der Verwendung 105 in 1%igem BSA-PBS verdünnt. Nach dem Waschen wurden die Platten eine Stunde lang mit sekundärem Antikörper inkubiert. Der sekundäre Antikörper, mit Peroxidase markiertes Anti-Maus-Ziegen-IgG(&ggr;) wurde von Kirkegaard&Perry Laboratories, Inc., bezogen und in einer 103-Verdünnung in 1%igem BSA in PBS eingesetzt. Nach einem letzten Waschschritt wurde ein Meerrettichperoxidase-Assay durchgeführt und die Extinktion bei 405 nm abgelesen.

BEISPIEL 4 HPV11-Scan

Zur Kartierung der kritischen Reste für ein HPV11-spezifisches neutralisierendes Epitop nutzten wir zwei Bedingungen. Zuallererst verwendeten wir eine Gruppe monoklonaler Antikörper, welche spezifisch für HPV11-L1 sind und L1 nur erkennen, wenn es in einem VLP vorliegt. Die in Beispiel 3 beschriebenen Assaybedingungen sind derart, daß diese Antikörper nicht mit dem engverwandten HPV6b-L1-VLP kreuzreagieren können. Von diesen fünf Antikörpern ist von vier gezeigt worden, daß sie HPV11 in dem Kreider-Xenograft-System neutralisieren (Kreider et al., 1987, J. Virol. 61: 590–593).

HPV6- und HPV11-L1s sind die am engsten verwandten L1-Proteine innerhalb der Papillomavirus-Familie. HPV6-L1 hat eine Länge von 500 Aminosäureresten. HPV11-L1 hat 501 Reste. Sie können so zugeordnet werden, daß die zusätzliche Aminosäure in HPV11 an Position 132 vorliegt. Mit dieser Zuordnung sind sie in der Aminosäuresequenz in allen Positionen außer 39 Positionen (92,4%), einschließlich der Insertion, identisch.

Wir folgerten, daß die Typ 11-Spezifität der monoklonalen Antikörper innerhalb dieser Unterschiede von 39 Resten liegen muß. Durch systematischen Austausch eines Typ 11-Restes gegen einen Typ 6-Rest würden diejenigen Reste, welche kritisch für die Typ 11-Reaktion sind, durch einen Verlust der Bindungsaffinität von den Typ 11-spezifischen monoklonalen Antikörpern offenbart werden. Nachdem die Reste zu Resten mutiert würden, welche natürlicherweise in Typ 6 vorliegen, würde die Wahrscheinlichkeit, daß solche Substitutionen die VLP-Bildung beeinflußten, gering sein.

Zur Feststellung der Wirkung irgendeines speziellen Rests auf die Bindung wurden sowohl HPV11 als auch das korrespondierende HPV11-Derivat in dem transienten Expressionssystem exprimiert. Ein ELISA wurde unter Verwendung der Gruppe von HPV11-spezifischen monoklonalen Antikörpern vorgenommen und die Ergebnisse der beiden verglichen. Die L1-Produktion wurde mit dem monoklonalen Antikörper H6.C6 normalisiert. H6.C6-Antikörper ist kreuzreaktiv mit HPV11, das Epitop ist linear und unabhängig von der VLP-Bildung. Somit mißt es die L1-Produktion.

Die Ergebnisse werden einer doppelten Normalisierung unterworfen. Zuerst wird das Verhältnis der Extinktion des Testantikörpers zu H6.C6 für die Testposition berechnet. Das gleiche Verhältnis wird für HPV11 bestimmt und durch das Verhältnis für die Testposition geteilt. Somit bedeutet ein doppeltes Verhältnis in der Nähe von 1, daß es keinen nachweisbaren Unterschied in der Antikörperbindung des Testklons im Verhältnis zu HPV11 gibt. Ein doppeltes Verhältnis von weniger als 1 bedeutet, daß der Testantikörper schlechter an den Testklon bindet als an Wildtyp. In der Theorie bedeutet ein Verhältnis von größer als 1, daß der Antikörper besser an den Testklon bindet als an HPV11. In der Praxis wurde dies nicht beobachtet. Ein Verhältnis im Bereich von 0,1 bis 0,2 ist im wesentlichen Hintergrund, was bedeutet, daß wir keine Bindung des Antikörpers an das Mutanten-VLP nachweisen können.

Die Positionen in HPV11-L1, welche sich von HPV6 unterscheiden, wurden individuell mutiert, um dem entsprechenden Rest in HPV6 zu entsprechen. Die Klone wurden in Sf9-Zellen durch eine baculovirus-exprimierende Rekombinante exprimiert und die Wirkung der Bindung durch die Gruppe von HPV11-spezifischen monoklonalen Antikörpern bestimmt (Tabelle 1). Reste, welche in Spalte 2 erscheinen, gekennzeichnet als "weniger Bindung", sind Positionen, welche für die Bindung eines oder mehrerer der monoklonalen Antikörper kritisch gehalten werden. Reste, die in Spalte 1 aufgeführt sind, gekennzeichnet als "behält Bindung", werden als nicht kritisch für die Bindung irgendwelcher der monoklonalen Antikörper beurteilt. Tabelle 1 behält Bindung verliert Bindung HPV11:K28T HPV11:G131S HPV11:Y49F HPV11:Y132&Dgr; HPV11:K53R HPV11:Y246F HPV11:V54A HPV11:N278G HPV11:L119F HPV11:S346T HPV11:T170K HPV11:S173T HPV11:S166P HPV11:N179A HPV11:L2191 HPV11:V225T HPV11:T263E HPV11:D271T HPV11:L2731 HPV11:V2741 HPV11:G277S HPV11:S281T HPV11:A294G HPV11:H300N HPV11:H325Q HPV11:K347T HPV11:A349S HPV11:F366V HPV11:Q434P HPV11:D439N HPV11:M440L HPV11:F458Y HPV11:T474S HPV 11:A467I HPV11:P488A HPV11:T497A

Die Klone, die für die in Tabelle 1 unter der Spalte "verliert Bindung" beschriebenen L1-Mutanten kodieren, werden als HPV11:G131S, HPV11:Y132&Dgr;, HPV11:Y246F, HPV11:N278G und HPV11:S346T bezeichnet. Alternativ kann die Vorsilbe "HPV" weggelassen werden.

Die vier Reste, welche die Bindung beeinflussen, sind in beträchtlichen Abständen von einander angeordnet, wobei die gesamte Spannweite mehr als 200 Reste entlang der linearen Sequenz umfaßt.

Die Positionen beeinflussen die Bindung der Antikörper unterschiedlich. Nicht mehr als drei Positionen beeinflussen die Bindung irgendeines einzelnen Antikörpers. Nur Position 246 beeinflusst die Bindung aller fünf Antikörper. In allen Fällen wird ein gewisses Maß nachweisbarer Bindung beobachtet. Dies zeigt an, daß die VLP-Bildung nicht beeinflußt ist. Die Wirkung auf die Bindung durch den Austausch an Position 278 erscheint marginal und ist fraglich, ist jedoch derzeit eingeschlossen, da die leichte Verringerung reproduzierbar ist. Die Wirkung auf die Bindung, wie durch das VLP-normalisierte Affinitätsverhältnis gemessen, ist in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 3 gibt die Bindungskonfigurationen für die monoklonalen HPV11-Antikörper an, wie aus diesen Studien abgeleitet.

Tabelle 3: Antikörperbindungskonfigurationen
BEISPIEL 5 Klärungs ("Strippinq")-Assay

Zur Überwachung der Produktion von HPV11-VLPs, um sicherzustellen, daß sie das relevante neutralisierende Epitop enthalten, wird der folgende Konkurrenz-ELISA eingesetzt. HPV6-Derivat-VLPs, nicht jedoch HPV6-VLPs, konkurrieren um die Bindung an HPV11-VLPs mit den monoklonalen Antikörpern H11.B2, H11.F1 und H11.G5. Dies zeigt die Anwesenheit des neutralisierenden Epitops auf den VLPs durch die Demonstration einer spezifischen konkurrierbaren Bindung an das neutralisierende Epitop. Der Assay wird auf folgende Weise durchgeführt.

  • 1. Ausplattieren von 10–100 ng Testansatz-HPV11-VLPs pro Mulde einer 96-Mulden-ELISA-Platte. Verdünnen der Probe in 1,0%igem BSA in PBS (ELISA-Puffer). Ausplattieren einer 50-&mgr;l-Probe. Inkubieren über Nacht bei 4°C.
  • 2. Entfernen von Überständen aus den Mulden. Blockieren für eine Stunde mit 5% Milchpulver in PBS bei Raumtemperatur.
  • 3. Spülen mit ELISA-Puffer.
  • 4. Herstellen von Verdünnungen des monoklonalen Antikörpers H11.F1.
  • A. Herstellen eines Satzes von Verdünnungen mit zunehmenden Mengen an HPV6-Derivat-VLPs.
  • B. Herstellen eines Duplikatsatzes von Verdünnungen mit zunehmenden Mengen an HPV6-VLPs.
  • C. Herstellen einer Verdünnung ohne zugesetzte VLPs.
  • 5. Zugeben von 50 &mgr;l der Antikörper-Proben zu den Mulden der ELISA-Platte. Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur.
  • 6. Entfernen von Antikörpern und dreimaliges Waschen mit ELISA-Puffer.
  • 7. Zugeben von 50 &mgr;l Antimaus-Ziegen-IgG (&ggr;) bei geeigneter Verdünnung. Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur.
  • 8. Dreimaliges Waschen mit ELISA-Puffer. Entwickeln mit einem Assay mit alkalischer Phosphatase und Ablesen bei 405 nm.
  • 9. Ein starkes Signal bei 405 nm, das stark mit HPV6-Derivat-VLPs, nicht jedoch mit HPV6-VLPs konkurriert, wird die Anwesenheit des neutralisierenden Epitops auf dem Testansatz von HPV11-VLPs bestätigen.

BEISPIEL 6 Überwachung der Neutralisierung

HPV6-Derivat-VLPs werden zur Charakterisierung von Testansätzen polyklonaler Seren hinsichtlich neutralisierender Aktivität eingesetzt. Ein Ansatz polyklonaler Seren wird beispielsweise durch einen Testansatz von HPV11-VLPs erzeugt. Alternativ ist es eine humane Probe, für die eine Charakterisierung ihres Neutralisationsvermögens erwünscht ist.

Ein polyklonales Serum wird mit HPV6-VLPs vorgeklärt. Dies entfernt kreuzreaktive Antikörper, sowohl VLP-abhängige als auch nicht-abhängige. Das HPV11-neutralisierende Epitop ist Typ 11-spezifisch und dagegen gebildete Antikörper werden durch Vorinkubation mit HPV6-VLPs nicht entfernt. Jedoch binden derivatisierte HPV6-Partikel diese Antikörper und die Beobachtung einer solchen Bindung, beispielsweise in einem Standard-ELISA, demonstriert die Anwesenheit neutralisierender Antikörper in der Testserum-Probe.

Eine Testprobe polyklonaler Seren wird nach dem folgenden Verfahren geklärt.

  • 1. Es wird eine Abschätzung des gesamten VLP-bindenden Antikörpers durchgeführt. VLPs werden auf einer ELISA-Platte im Sandwich-Format unter Verwendung eines monoklonalen Anti-HPV11-Antikörpers (es stehen mehrere zur Verfügung) immobilisiert werden. Die Menge an polyklonalem Antikörper, welche bindet, wird unter Verwendung eines zweiten Anti-HPV11-Antikörpers bekannter Konzentration als Standard abgeschätzt. Alternativ wird die IgG-Konzentration des polyklonalen Antikörpers bestimmt und angenommen, daß es alles Anti-HPV11 wäre.
  • 2. HPV6-VLPs werden zu einem Aliquot Serum in einem 10fachen Überschuss in &mgr;g gegenüber der Menge an HPV11-Antikörper in dem polyklonalen Serum zugegeben, wie sie in Schritt 1 bestimmt wurde.
  • 3. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit (300.000 × g) für 5 Stunden, um die VLP-Antikörper-Komplexe zu pelletieren.
  • 4. Das Verfahren wird zwei weitere Male wiederholt.
  • 5. Das geklärte Serum wird hinsichtlich Bindung in einem Sandwich-ELISA getestet. HPV6- und HPV6-Derivat-VLPs (welche die neutralisierenden monoklonalen Antikörper binden) werden durch einen monoklonalen HPV6-Antikörper immobilisiert werden. Die geklärten polyklonalen Seren sollten nur eine minimale Bindung an HPV6-VLPs zeigen. Ein starkes Signal gegen HPV6-derivatisierte VLPs demonstriert eine Bindung an die hauptsächliche neutralisierende Domäne von HPV11 und daß das polyklonale Serum neutralisierenden Antikörper enthält.

Ein zweiter Assay kann etabliert werden, um das Neutralisierungsvermögen in einer Testserum-Probe unter Anwendung des Xenograph-Neutralisierungsassays (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64: 1936–1944; Christensen et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 2271–2276) zu demonstrieren.

  • 1. Geklärte Seren gegen HPV6-Derivat-VLPs werden nach dem oben angegebenen Protokoll hergestellt, wobei HPV6-Derivat-VLPs HPV6-VLPs ersetzen. Polyklonale Seren, mit HPV6-VLPs geklärt, werden als Kontrolle hergestellt.
  • 2. Es wird eine Reihe von Verdünnungen der polyklonalen Seren hergestellt und in dem Xenograph-Neutralisierungsassay analysiert, um die neutralisierenden Titer der Seren festzustellen.
  • 3. Parallele Sätze von Verdünnungen von HPV6-Derivat-geklärten und HPV6-geklärten Seren werden hergestellt und im Xenograph titriert.
  • 4. Die Anwesenheit von neutralisierender Aktivität in dem Xenograph-Assay, welche weitgehend durch Klärung mit HPV6-Derivat-VLPs, jedoch nicht mit HPV6-VLPs, entfernt wird, demonstriert durch einen biologischen Assay die Anwesenheit von Antikörpern in den Seren gegen das HPV11-neutralisierende Epitop.

BEISPIEL 7 Transiente Expression von VLPs in Sf9-Zellen

Das HPV11-L1-Strukturgen wurde durch Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Primern, die anhand der veröfentlichten L1-Sequenz (8,17) konstruiert worden waren, aus klinischen Isolaten geklont. Das CRPV-L1-Strukturgen wurde durch PCR aus viraler genomischer DNA kloniert. Die L1-Gene wurden für die Expression in Sf9-Zellen in pVL1393 (Stratagene) subkloniert.

Sf9-Zellen wurden mit Hilfe des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen, San Diego, Ca) cotransfiziert. Die Transfektionen erfolgten nach den Anweisungen des Herstellers mit der folgenden Modifizierung. 8 × 106 Sf9-Zellen wurden in einer 100-mm-Schale mit 4 &mgr;g BaculoGold-Virus-DNA und 6 &mgr;g Testplasmid-DNA transfiziert. Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet, soweit nicht anders angegeben, und hinsichtlich VLP-Produktion einem Westernblot- oder ELISA-Assay (unten) unterworfen.

BEISPIEL 8 Herstellung von Sf9-Extrakten und ELISA-Assays

Zellen wurden 6 Tage nach der Transfektion geerntet. Die Platten wurden abgekratzt, um die Zellen zu resuspendieren, und die Zellen wurden durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gewonnen. Die Zellen wurden in 300 &mgr;l Aufbruchpuffer (1 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,6) resuspendiert und 30 Sekunden lang auf Eis mit Hilfe eines Polytron PT 1200 B mit einer PT-DA 1205/2-A-Sonde (Brinkman) in einem Falcon-2059-Röhrchen homogenisiert. Die Proben wurden drei Minuten lang bei 2500 UpM in einer GPR-Zentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Röhrchen wurden mit zusätzlichen 150 &mgr;l Aufbruchpuffer gewaschen, die Überstände in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und erneut fünf Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (Brinkman) zentrifugiert. ELISA-Assays wurden typischerweise am selben Tag begonnen.

5 &mgr;l Extrakt wurden in 50 &mgr;l 1%igem BSA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, in Aliquots auf eine 96-Mulden-Immulon 2-Mikrotiterplatte (Dynatech Laboratories, Inc.) aufgebracht und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Extrakte wurden entnommen und die Platte mit 5% Milchpulver/PBS blockiert. Alle anschließenden Waschschritte wurden mit 1%igem BSA/PBS durchgeführt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit primärem Antikörper inkubiert. Primäre Antikörper, die monoklonalen Antikörper CRPV.5A und H11.F1, wurden als Ascites-Stammlösung von Dr. Neil Christensen erhalten. Sie sind VLP-abhängig und typspezifische Antikörper, welche CRPV-bzw. HPV11-VLPs erkennen (Neil Christensen, persönliche Mitteilung). Sie wurden vor der Verwendung 105fach in 1%igem BSA/PBS verdünnt. Nach dem Waschen in 1%igem BSA/PBS wurden die Platten eine Stunde lang mit sekundärem Antikörper, mit Peroxidase markiertem Antimaus-Ziegen-IgG(g) (Kirkegaard&Perry Laboratories, Inc.) inkubiert und in einer 103-Verdünnung in 1%igem BSA in PBS eingesetzt. Nach einem letzten Waschschritt wurde ein Meerrettichperoxidase-Assay durchgeführt und die Extinktion bei 405 nm abgelesen.

BEISPIEL 9 Übertragung des HPV11-neutralisierenden Epitops auf HPV6

Aufgrund der Untersuchungen in Beispiel 4 mutierten wir das HPV6-L1-Gen an den Aminosäureresten 131, 245 und 277, um der HPV11-L1-Sequenz zu entsprechen. Darüber hinaus inserierten wir ein Tyrosin nach Rest 131, was die Länge des mutierten HPV6-L1-Gens um einen Rest auf 501 Aminosäuren verlängerte. Wir bezeichneten diesen Klon als HPV6:4. Wir sagten voraus, daß diese vier Veränderungen, welche alle der HPV11-L1-Sequenz entsprechen, die Bindung der HPV11-spezifischen neutralisierenden Antikörper H11.B2, H11.F1 und H11.G5 erleichtern würden. Dies ist tatsächlich der Fall, wie in der folgenden Tabelle gezeigt.

Relative Affinitätswerte gegenüber HPV6 und einem Derivat

Dies bestätigt, daß die vier Aminosäurereste 131, 132, 245 und 277 die Spezifität der bindenden Stelle für die neutralisierenden Antikörper H11.B2, H11.F1 und H11.G5 definieren.

Der Antikörper H11.H3 kann von den anderen drei neutralisierenden Antikörpern durch Sensitivität für die Bindung an Position 346 und mangelnde Sensitivität für die Bindung an Position 131 unterschieden werden. Dies weist darauf hin, daß sich die Bindung dieses Antikörpers zum C-Terminus verlagert hat, jedoch immer noch mit der Bindungsstelle der anderen drei neutralisierenden monoklonalen Antikörper überlappt.

Wir derivatisierten den oben definierten HPV6-Derivat-Klon weiter durch Hinzufügung einer zusätzlichen Änderung an Position 345, um der Sequenz von HPV11 an ihrer Position 346 zu entsprechen. Wir bezeichneten diesen Klon als HPV6:5. Die Voraussage ist, daß er an alle vier neutralisierenden Antikörper, einschließlich H11.H3, binden wird. Die Daten sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Relative Affinitätswerte gegenüber HPV6 und ein Derivat

Wie erwartet, produzierte dieser Klon VLPs, welche die neutralisierenden Antikörper H11.B2, H11.F1 und H11.G5 binden konnten, und bestätigt diese Beobachtung. Unerwarteterweise band er nicht den Antikörper H11.H3, welches darauf hinweist, daß eine zusätzliche Veränderung neben der an Position 345 ebenfalls für die Bindung von H11.H3 erforderlich ist.

BEISPIEL 10 Bindung durch den neutralisierenden monoklonalen Antikörper H11.H3

Zur weiteren Untersuchung der Bindung des Antikörpers H11.H3 wird ein zusätzlicher Austausch an Rest 438 des HPV6-L1-Gens, um dem Rest von HPV11-L1 an 439 zu entsprechen, vorgenommen. Der zusätzliche Austausch wird sowohl bei dem Klon HPV6:4b (mit Austauschen bei 132, 245, 277 und 345) als auch HPV6:5 vorgenommen. Dies wird den Klon HPV5b (132, 245, 277, 345 und 435) sowie HPV6:6 ergeben. Der Klon HPV6:5b bindet den Antikörper H11.H3 und der Klon HPV6:6 bindet die Antikörper H11.B2, H11.F1, H11.G5 und H11.H3. Diese Klone zeigten die Sensitivität, welche in den Assays, die unten in den Ansprüchen 2 und 3 und oben in den Beispielen 7 und 8 ausgeführt sind, erhältlich ist.

BEISPIEL 11

Zur weiteren Untersuchung der Bindung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper mutierten wir den Klon HPV6:4 an den vier individuellen Positionen zurück und demonstrierten, daß die Rückmutation an lediglich den Resten 131 und 132 zu einem Verlust der Bindung führte. Die Erzeugung eines zusätzlichen HPV6-L1-Klons mit nur diesen beiden Veränderungen, HPV6:2, demonstrierte, daß diese beiden Veränderungen alleine für die Bindung der HPV11-neutralisierenden monoklonalen Antikörper ausreichend sind. Somit legen diese Studien zusammen das minimale Epitop für die neutralisierenden Antikörper fest.


Anspruch[de]
  1. Synthetische virus-ähnliche Partikel, gebildet aus irgendeinem der folgenden Konstrukte:

    a) HPV6:2, worin das HPV6L1-Gen mutiert wurde, so daß es für ein Protein kodiert, worin die Aminosäure 131 die gleiche ist wie im HPV11L1-Protein und zusätzlich ein Tyrosinrest als Aminosäure 132 inseriert wurde;

    b) HPV6:4&Dgr;132, welches die gleichen Mutationen wie HPV6:4 enthält, außer, daß es keine Insertion eines Tyrosinrests nach Aminosäure 131 gibt; und

    c) HPV6:4,S131G, welches die gleichen Mutationen wie HPV6:4 enthält, außer, daß der Aminosäurerest 131 Glycin ist;

    wobei HPV6:4 ein HPV6L1-Gen ist, welches mutiert wurde, so daß es für ein Protein kodiert, worin die Aminosäurereste 131, 245 und 277 die gleichen sind wie die Aminosäurereste 131, 246 und 278 in dem HPV11 L1-Protein und nach dem Aminosäurerest 131 von HPV6L1 ein Tyrosinrest inseriert wurde.
Es folgen 5 Blatt Zeichnungen






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