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Dokumentenidentifikation DE69727466T2 16.12.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000863858
Titel AUF MASSE BASIERTE KODIERUNG UND QUALITATIVE ANALYSE VON KOMBINATORISCHEN BIBLIOTHEKEN
Anmelder Glaxo Group Ltd., Greenford, Middlesex, GB
Erfinder GEYSEN, Mario, Hendrik, Research Triangle Park, US;
KINDER, Start,, Daniel, Research Triangle Park, US;
WAGNER, Daniel,, Craig, Research Triangle Park, US
Vertreter HOFFMANN · EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69727466
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.04.1997
EP-Aktenzeichen 979211091
WO-Anmeldetag 08.04.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/05701
WO-Veröffentlichungsnummer 9737953
WO-Veröffentlichungsdatum 16.10.1997
EP-Offenlegungsdatum 16.09.1998
EP date of grant 04.02.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.12.2004
IPC-Hauptklasse C07B 61/00
IPC-Nebenklasse C07K 1/04   

Beschreibung[de]

Ein Teil der Offenbarung dieses Patentdokuments enthält Material, das nicht dem Urheberrechtschutz unterliegt. Der Urheberrechtsinhaber hat keine Einwände gegen die naturgetreue Nachbildung des Patentdokuments oder der Patentoffenbarung durch Dritte, wie sie in den Akten oder Aufzeichnungen des Patent- und Markenamtes erscheint, aber behält sich ansonsten alle Urheberrechte vor.

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der kombinatorischen Chemie und betrifft insbesondere das Codieren der Bibliotheksprodukte der kombinatorischen Synthese.

Der neuere Trend auf dem Gebiet der Forschung nach neuen chemischen und speziell pharmakologischen Mitteln hat sich auf die Herstellung sogenannter "chemischer Bibliotheken" als potentielle Quellen für neue Hinweise zur Wirkstoffindung konzentriert. Chemische Bibliotheken sind absichtlich geschaffene Sammlungen unterschiedlicher Moleküle, die entweder synthetisch oder biosynthetisch hergestellt und auf biologische Aktivität in einer Vielzahl unterschiedlicher Formate durchmustert werden können. Man kann Bibliotheken löslicher Moleküle besitzen; Bibliotheken von Verbindungen, die an Harzperlen, Siliciumdioxid-Chips oder andere feste Träger gebunden sind; oder rekombinante Peptidbibliotheken, die auf Bakteriophagen oder anderen biologischen Abbildungsvektoren abgebildet sind. Chemische Bibliotheken werden vorteilhaft unter Verwendung von Techniken aus dem Gebiet der kombinatorischen Chemie hergestellt. Das Gebiet der kombinatorischen Chemie ist eine Synthesestrategie, die zu großen chemischen Bibliotheken führt. Kombinatorische Chemie kann als die systematische und repetitive kovalente Verbindung eines Satzes unterschiedlicher Bausteine mit variierenden Strukturen miteinander zum Erhalt einer großen Anordnung verschiedener molekularer Einheiten definiert werden.

Traditionell stammen neue medizinische chemische Leitstrukturen aus der Isolierung von Naturprodukten aus mikrobiologischen Fermentationen, Pflanzenextrakten und tierischen Quellen; aus der Durchmusterung der Verbindungsdatenbanken pharmazeutischer Unternehmen; und in jüngerer Zeit durch die Anwendung von Ansätzen sowohl auf Mechanismusbasis als auch auf Strukturbasis auf die rationelle Wirkstoffentwicklung. All diese Verfahren sind relativ teuer. Kürzliche Kostenuntersuchungen legen nahe, daß die durchschnittlichen Kosten für das Schaffen einer neuen molekularen Einheit in einem großen pharmazeutischen Unternehmen ca. 7500 $ pro Verbindung betragen, wobei die traditionelle chemische Synthesetechnologie verwendet wird, die die mehr oder weniger konstante praktische Handhabung von Reagenzien und Vorrichtungen und die Aufmerksamkeit eines Chemikers erfordert. Außerdem hat das Aufkommen automatisierter Hochleistungstechniken die robotisierte Durchmusterung von mehr als Hunderten von Tausenden individueller Verbindungen pro Jahr pro Wirkstoffziel ermöglicht. Die Verfügbarkeit dieser Fähigkeit in Kombination mit den relativ hohen Kosten der traditionelleren handwerklichen Chemie hat eine globale Verschiebung der Betonung hin zum Konzept der Massenerzeugung verursacht, welches ein industrielles Konzept ist, das unter Verwendung des Ansatzes der kombinatorischen Chemie umgesetzt werden kann.

Die Leistungsschwächen der handwerklichen Chemie werden somit weitgehend durch eine Veränderung zum Konzept der Verwendung kombinatorischer chemischer Technologien zur schnellen Synthese von Verbindungssammlungen beantwortet. So ist es durch Einsatz eines Bausteinansatzes und durch systematisches Zusammensetzen dieser Blöcke in vielen Kombinationen unter Verwendung chemischer Verfahren möglich, chemische Bibliotheken als ausgedehnte Bestände von Molekülen zu erzeugen. Ein wesentlicher Ausgangspunkt für die Erzeugung molekularer Vielfalt ist eine Auswahl kleiner reaktiver Moleküle, die als chemische Bausteine betrachtet werden können. Das Universum struktureller Vielfalt, das durch Zusammensetzen selbst eines kleinen Satzes von Bausteinelementen zugänglich ist, ist potentiell sehr groß, und das Entfesseln der dem Bausteinansatz innewohnenden Kraft ist wesentlich für den Erfolg der kombinatorischen Methode. Das Bausteinargument wird leicht wie folgt erläutert. Theoretisch wird die Anzahl möglicher unterschiedlicher individueller Verbindungen, N, die durch eine ideale kombinatorische Synthese hergestellt werden, durch zwei Faktoren bestimmt; die Anzahl der für jeden Schritt "B" verfügbaren Blöcke und die Anzahl von Syntheseschritten im Reaktionsschema, s. Falls eine gleiche Anzahl von Bausteinen in jedem Reaktionsschritt verwendet werden, dann ist N = BS. Falls die Anzahl von Blöcken, die man für jeden Schritt wünscht, variiert (z. B. b, c, d in einer dreistufigen Synthese), dann ist N = bcd.

Aus dem obigen ist ersichtlich, daß ein relativ konservatives kombinatorisches Syntheseverfahren, das 20 Blöcke in einem dreistufigen Syntheseverfahren beinhaltet, 203 = 8000 Verbindungen erzeugen wird. Diese relativ großzügige Erzeugungsleistung führt dann zur nächsten Frage, die lautet: wie werden die Verbindungen identifiziert werden? Z. B. ist eine typische kombinatorische Synthesetechnik diejenige der "Split-Synthese" (Mischsynthese). Als ein Beispiel für die Split-Synthese in der Festphasensynthese von Peptiden wird eine Charge Harzträger (typischerweise kleine Harzperlen) in n Fraktionen unterteilt, wobei eine einzelne monomere Aminosäure an jede Teilmenge in einer separaten Reaktion gekuppelt und dann alle Harzteilchen sorgfältig miteinander vermischt werden. Die Wiederholung dieses Protokolls für insgesamt x Durchläufe kann eine stochastische Ansammlung von bis zu nx unterschiedlichen Molekülen erzeugen, wie es durch eine hypergeometrische Verteilung geregelt wird. Zur Sicherstellung der Darstellung der Mehrheit möglicher Liganden muß man mit einer Vielzahl von Perlen beginnen. Ein typischer Wert würde 10-mal so viele Perlen wie die gewünschte Anzahl von Liganden sein. Theoretisch existiert ein Satz von jeder möglichen Kombination der Bausteine in den Teilmengen. Um die Zusammensetzung einer besonderen Verbindung zu bestimmen, von der festgestellt wird, daß sie von Interesse ist, könnte man ohne direkte Ligandenstrukturanalyse bevorzugt auf einem Massenspektrometer auf einer Typ-zu-Typ-Basis vorgehen. Eine typische kombinatorische Synthese findet jetzt typischerweise auf einer Reaktionsplatte mit 96 bis 2 304 Reaktionsvertiefungen statt. Man identifiziert die Produktverbindungen von echtem Interesse durch eine positive Antwort in einem entsprechenden Test. Jedoch besteht das Problem mit einem herkömmlichen massenspektrometrisch-analytischen Ansatz selbst bei Tests, die die Anzahl von Verbindungen deutlich reduzieren werden, die im Test nicht aktiv sind, darin, daß viele individuelle Analysenversuche erforderlich sind, daß es nur sehr geringe Mengen von verfügbarem Material nach dem Durchlaufen einer kombinatorischen Synthese geben mag, und daß die Gesamtumlaufzeit ziemlich lang sein kann. Es besteht dann eine Notwendigkeit, Verbindungen in irgendeiner Weise zu markieren, wenn sie durch ihre kombinatorischen Schritte gehen. Wenn Verbindungen z. B. an Harzperlen gebunden sind, haben Lösungen des Standes der Technik zu dem Problem das Anbringen chemischer Identifizierungsmarken an die Perlen eingeschlossen, die mit jedem Blockkopplungsschritt in der Synthese übereinstimmen. Die unterschiedlichen chemischen Eigenschaften jeder Marke würden dann vermitteln, welcher Baustein in einem besonderen Schritt der Synthese gekuppelt wurde, und die Gesamtstruktur eines Liganden an jeder Perle könnte durch "Auslesen" des Satzes von Marken an der Perle abgeleitet werden, wodurch effektiv die Perle codiert wurde.

Marken sollten idealerweise einen hochdiskreten Informationsgehalt haben, einer sehr hochempfindlichen Detektion und Decodierung zugänglich sein und stabil gegenüber den in der Ligandensynthese verwendeten Reagenzien sein. Die an Perlen angebrachten Marken des Standes der Technik haben Nukleotide, Peptide oder eine kombinierte Reihe von Kohlenwasserstoffhomologen und polychlorierten Aromaten eingeschlossen. WO 97/14814 (SmithKline Beecham Corp.) offenbart ein Markierungsverfahren, in dem die Marke 13C und/oder 15N enthält, das unter Verwendung von NMR-Techniken nachgewiesen wird. Einsträngige Oligonukleotide werden an Harzperlen aufgebaut, auf denen die Peptidsynthese durchgeführt wird, und die anschließend durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert und sequenziert werden. Eine andere Technik ist eine solche, in der orthogonal differenzierte Diaminlinker in der Konstruktion löslicher chimärer Peptide verwendet werden, die einen "bindenden" Strang und einen "codierenden" Strang umfassen. Wenn Aminosäure-Monomerbausteine an den bindenden Strang gekuppelt werden, wird dies durch Aufbauen eines Aminosäurecodes am "codierenden" Strang aufgezeichnet. Die Sequenz des codierenden Stranges wird dann durch Edman-Abbau aufgelöst. Ein Problem bei diesem Ansatz besteht darin, daß er einen besonderen chemischen Schritt für jeden Schritt erfordert, der in der Konstruktion der Bibliothek vorgenommen wird. Ein anderes Problem bei diesem Ansatz besteht darin, daß er orthogonale Syntheseverfahren zum Aufbau einer Marke in Verbindung mit der Synthese von Liganden erfordert, d. h. er erfordert die Addition gleicher Einheiten, wohingegen ein sehr großes Interesse am Auffinden von Verfahren zur Erzeugung von Verbindungen besteht, die nicht auf die sequenzielle Addition von gleichen Einheiten beschränkt sind. Solche Verfahren würden z. B. Anwendung in der Modifikation von Steroiden, Antibiotika, Zuckern, Coenzymen, Enzyminhibitoren, Liganden und dgl. finden, die häufig eine mehrstufige Synthese beinhalten, in der man die Reagenzien und/oder Reaktionsbedingungen gerne variieren würde, um eine Vielzahl von Verbindungen bereitzustellen. In solchen Verfahren können die Reagenzien organische oder anorganische Reagenzien sein, in denen Funktionalitäten eingeführt oder modifiziert, Seitengruppen angebracht oder entfernt, Ringe geöffnet oder geschlossen und die Stereochemie verändert werden kann und dgl. Damit ein solches Verfahren lebensfähig ist, wird jedoch ein zweckmäßiger Weg zur Identifizierung der Strukturen der großen Anzahl von Verbindungen benötigt, die aus einer großen Vielzahl von unterschiedlichen Modifikationen resultieren.

Eine Technik, die zur Durchmusterung nicht-sequenzierbarer organischer Moleküle nützlich ist, die durch mehrstufige kombinatorische Synthese hergestellt wurden, wird in WO 95/28640 (Trustees of Columbia University) beschrieben. Sie verwendet eine Reihe gaschromatographisch auftrennbarer Kohlenwasserstoff-Derivate als molekulare Marken, die bei Anbringen an reaktive Gruppen auf der Perlenoberfläche einen binären Code darstellen können, der die chemische Geschichte jedes Elements einer Bibliothek widerspiegelt. Statt der Oligonukleotid- oder Peptid-Codierungsansätze, in denen die Reihenfolge der Anordnung der chemischen Bausteine für jedes Bibliothekselement in der Sequenz eines einzelnen erkennenden Markierungsmoleküls bewahrt wird, verwendet die binäre Strategie eine einzigartig definierte Mischung aus Marken, um jeden Baustein bei jedem besonderen Schritt der Synthese dazustellen. So kann ein Satz von N Marken verwendet werden, um die kombinatorische Synthese einer Bibliothek von 2N unterschiedlichen Elementen zu codieren. Nach dem Zusammenbau werden die Marken photolysiert und durch Elektroneneinfang-Kapillargaschromatographie analysiert.

WO 96/30392 (Ciba-Geigy AG) offenbart eine binäre Markierungstechnik, in der die Marke ein elementares Atom oder Ion ist, das nicht-kovalent an die Perle gebunden sein kann.

In allen Fällen verkompliziert die Verwendung von Reportermarken die Synthesestrategien, erhöht das Risiko von Nebenreaktionen und Nebenprodukten und liefert nur einen indirekten Nachweis der Struktur. Daher besteht ein Bedarf, einen Weg zu finden, durch den die Reaktionsgeschichte einer Verbindung aufgezeichnet und die Struktur der resultierenden Verbindung identifiziert werden kann.

Die Verwendung von ortsspezifischen 13C-Markern auf dem Liganden selbst wurde ebenfalls im Zusammenhang mit 13C-NMR-Spektroskopie als Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens in der kombinatorischen Festphasensynthese verwendet.

Noch ein anderes Verfahren ist dasjenige der Verwendung eines Chips, der die separate Analyse an physikalisch getrennten Stellen auf der Oberfläche des Chips erlaubt. Indem man weiß, welcher Reaktand sequenziell an einer jeden solchen Stelle hinzugegeben wird, kann man die Sequenz der Ereignisse aufzeichnen und somit die Reihe der Reaktionen. Falls man dann den Chip einem Durchmusterungsverfahren auf eine besondere gewünschte Charakteristik unterwirft und die Charakteristik detektiert, kann man leicht die Verbindung bestimmen, die an der Stelle synthetisiert wurde, die die Charakteristik zeigt.

WO 97/08190 (SmithKline Beecham plc) offenbart ein Verfahren zur Entwicklung einer Selektionsstrategie für chemische Reagenzien zur Verwendung in einer kombinatorischen Bibliothek um sicherzustellen, daß Massenhäufigkeiten kontrolliert werden, was es erlaubt, das letztlich abgespaltene Produkt durch Massenspektroskopie zu identifizieren.

Eine diskrete probenweise Analyse wird eine große Menge belangloser Information liefern, da alles in der Probe analysiert werden wird. Jedoch ist es bei der Analyse der Ergebnisse einer kombinatorischen Synthese wünschenswert, im linearen Sinne verfolgen zu können, da all das, was durch ein lineares Verfahren verfolgt wird, das ist, was zum interessierenden Konstrukt in der Synthese hinzugegeben wird, was die Gegenwart von Lösungsmitteln, Harzstückchen, Nebenreaktionen und Verunreinigungen auslassen wird.

Im Hinblick auf die obigen Bedürfnisse und Nachteile des Standes der Technik ist es eine primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die erforderliche Zeit zu reduzieren, um die Produkte einer kombinatorischen Synthese auszulesen und zu decodieren. Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Codierung kombinatorischer Konstrukte bereitzustellen, das keine orthogonale Chemie erfordert, d. h. Chemie, die sorgfältig ausgewählt wurde, um nicht mit der Chemie zu wechselwirken, die als Teil der kombinatorischen Synthese selbst durchgeführt wird. Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, die Höhe der Kapitalinvestition zu minimieren, die zur Entwicklung einer Codierungsstrategie erforderlich ist, und die nicht mehr erfordert, als das, was zur ursprünglichen Entwicklung eines Satzes geeigneter fester Trägerbindungen erforderlich ist.

Anders als die Verfahren des Standes der Technik verkörpert die vorliegende Erfindung ein Verfahren der isotopischen statt chemischen Codierung eines Monomers, um eine Synthesegeschichte auszulesen. Auslesbare Unterschiede in den codierenden Einheiten beruhen daher auf einer physikalischen Differenzierung anstelle einer chemischen Differenzierung. Das isotopisch codierte Monomer ist jedoch chemisch an den interessierenden Liganden während der Synthese gebunden, im Gegensatz zu Identifizierungsverfahren des Standes der Technik, in denen differenzierbare Isotope physikalisch mit Massenchemikalien oder Verbrauchsmitteln vermischt und eingestreut werden, um ihre Herstellungsquelle zu identifizieren. Die Erfindung vertraut ebenfalls nicht auf dem Markieren eines Moleküls wie in anderen Ansätzen des Standes der Technik.

Beschreibung der Figuren

1 ist eine Anordnung von MS-Peaks, die die beobachteten Peak-Signaturen für die in der nachfolgenden Beschreibung beschriebenen dotierten Glycin-Codeblöcke darstellt.

2 ist ein Diagramm, das die beobachtete Korrelation zwischen der vorhandenen Anzahl von Kohlenstoffatomen und des Bruchteils von Bindungsgehalt zeigt, der N15 aufweist. Das Diagramm kann verwendet werden, um Peak-Signaturen gleicher Intensität zu berechnen.

3 erläutert eine Codierungsstrategie mit zwei Peakpositionen für ein Molekül, das durch die Aufspaltung von MS-Peaks zu Dubletts zur Erhöhung der Code-Erkennung gekennzeichnet ist.

4 erläutert die beobachtete Korrelation zwischen der MS-Peakfläche und dem Verhältnis von in einer Code-Probe vorhandenem N15 für eine Reihe von Code-Proben, die sich im N15-Gehalt um 5%-Schritte unterscheiden.

5 ist ein NMR-Peakmuster für die Verbindung:

wobei angegeben wird, daß 55% des Kohlenstoffs in der vorletzten Position mit C13 dotiert war.

6 ist ein NMR-Peakmuster für die Verbindung:

wobei angegeben wird, daß 60% des Kohlenstoffs in der vorletzten Position mit C13 dotiert war.

7 ist ein NMR-Peakmuster für die Verbindung:

wobei angegeben wird, daß 75% des Kohlenstoffs in der vorletzten Position mit C13 dotiert war.

8 ist ein NMR-Peakmuster für die Verbindung:

wobei angegeben wird, daß 80% des Kohlenstoffs in der vorletzten Position mit C13 dotiert war.

9 ist ein Diagramm, das das beobachtete Verhältnis von C13 zu C12 in den NMR-Spektren der 5 bis 8 mit dem Prozentanteil von C13 korreliert, der in jedem vorhanden ist.

10 bis 12 zeigen Spektren, die im Zusammenhang mit dem Verfahren aus Beispiel 23 zur Reaktionsdurchmusterungsausführungsform der Erfindung beobachtet werden.

13 bis 17 zeigen Synthese-Flußdiagramme, die in der Offenbarung des Beispiels 23 zur Reaktionsdurchmusterungsausführungsform der Erfindung verwendet werden.

18 bis 51 zeigen Spektren, die im Zusammenhang mit der Offenbarung des Beispiels 24 zur Verhältniscodierungsausführungsform der Erfindung beobachtet werden.

52 bis 110 zeigen Spektren, die im Zusammenhang mit der Offenbarung von Beispiel 25 zur Codierung von Styrol und von Beispiel 26 erzeugt werden, das die Copolymerisation von Styrol und F-Styrol offenbart.

111 bis 132 zeigen Spektren, die das Decodieren einer parallelen Synthese einer Bibliothek an codierten Harzperlen darstellen, wobei ein Ansatz mit dualem Linker verwendet wird, in dem ein erster Linker ein photolytisch abspaltbarer Linker war und ein zweiter Linker ein Knorr-Linker war.

133 bis 286 sind Spektren, die durch einen Satz von Codeblöcken erzeugt werden, die in einem Typ von Verhältniscodierung organisiert sind, der als Vierpeak-Verhältniscodierung bezeichnet wird, wobei vier isotopisch unterschiedliche F-moc-geschützte Versionen von Alanin verwendet werden.

287 ist ein Flußdiagramm für ein Computerprogramm, das das Decodieren eines Satzes von Codeblöcken und ihren verbundenen Spektren automatisieren kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt ist die Erfindung die Anwendung der Massen- oder Isotopencodierung in der Einprägung von codierten Informationen auf oder im Zusammenhang mit Materialien oder Verfahren, so daß die Einzelheiten der Komponenten oder Verfahrensschritte leicht durch eine oder mehrere der Verfahren der Massenspektrometrie, Kernspinresonanzspektroskopie oder Infrarotspektroskopie, einschließlich der Technik der Raman-Spektroskopie, bestimmt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung ein Verfahren zur Codierung der Produkte der kombinatorischen Synthese durch isotopisches Dotieren eines Teils eines Konstrukts der kombinatorischen Chemie und Analysieren der kombinatorischen Reaktionsprodukte durch Massenspektrometrie, Kernspinresonanzspektroskopie oder Infrarotspektroskopie. In der Übersicht umfaßt die Erfindung mehrere Ausführungsformen. Zuerst umfaßt die Erfindung ein nicht-chemisches Verfahren auf Massenbasis zur Aufzeichnung der Reaktionsgeschichte einer Reaktionsreihe an jedem einer Mehrzahl spezifischer fester Träger, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

  • (a) in einer Massenblock-Insertionsstufe Umsetzen einer Mehrzahl von Massenmitteln, die jeweils eine spezifische definierte Masse besitzen, mit jeweils einer Gruppe der spezifischen festen Träger, so daß jede Gruppe der spezifischen festen Träger umgesetzt wurde mit einem Mittel mit definierter Masse, das verschieden von jedem anderen Mittel ist, das mit einer anderen der Gruppen der spezifischen festen Träger umgesetzt wurde;
  • (b) Umsetzen einer jeden festen Trägergruppe mit unterschiedlichem definierten Massenmittel mit einem unterschiedlichen ersten chemischen Reagens;
  • (c) Vermischen der Gruppen miteinander und anschließendes Unterteilen der Mehrzahl spezifischer fester Träger in eine Mehrzahl von Gruppen für eine zweite intermediäre oder letzte Stufe;
  • (d) Wiederholen des Umsetzens mit einem chemischen Reagens wenigstens einmal, um eine Mehrzahl von Endprodukten bereitzustellen, wobei unterschiedliche Produkte an den unterschiedlichen individuellen spezifischen festen Trägern vorliegen;
wobei die spezifischen definierten Massenmittel analysiert werden können und worin die Analyse die Wahl eines ersten chemischen Reagens definiert. Das Verfahren ist besonders bevorzugt in der Durchführung eines Tests oder der Verwendung von Trenntechniken, einschließlich Säulen- oder Plattenchromatographie oder fluoreszenzgestützter Zelldurchmusterung, um Reaktionsprodukte mit einer interessierenden Eigenschaft zu finden, und in der anschließenden Durchführung der Identifizierungsanalyse an solchen Reaktionsprodukten. Dieses Verfahren ist besonders bevorzugt in bezug auf die Bestimmung des ersten chemischen Reagens, das zur Reaktionssequenz gegeben wird. Reaktionsprodukte können ein Nicht-Oligomer einschließen, das aliphatisch, alicyclisch, aromatisch oder heterocyclisch ist, oder ein Oligomer, das ein Oligopeptid, Oligonukleotid, Oligosaccharid, Polylipid, Polyester, Polyamid, Polyurethan, Polyharnstoff, Polyether, Polyphosphor-Derivat, worin der Phosphor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Phosphit oder Phosphinamid besteht, oder Polyschwefel-Derivat ist, wobei der Schwefel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sulfon, Sulfonat, Sulfit, Sulfinamid oder Sulfenamid besteht.

Bevorzugte Mittel zur Analyse sind durch Massenspektrometrie (MS), Kernspinresonanz-(NMR)-Spektroskopie und Infrarot- oder Ramanspektroskopie. Diese Mittel der Analyse erzeugen spezifische Peakmuster, die in Analyse, Identifizierung, Codierungs- und Decodierungsstrategien verwendet werden. Das Massenspektrometer erzeugt insbesondere spezifische Einzelmassenpeaks, spezifische Doppelmassenpeaks, spezifische Paare von Einzelmassenpeaks, spezifische Paare von Doppelmassenpeaks und andere spezifische multiple Peakmuster, die zusätzlich in maschinenlesbare Muster, einschließlich Strichcodes ("Barcodes"), übersetzt werden können. Die NMR-, IR- und Raman-Verfahren erzeugen auch nützliche spezifische Peakmuster, die in maschinenlesbare Muster, einschließlich Strichcodes, umgewandelt werden können. Solche Muster, einschließlich maschinenlesbarer Muster, können in Codierungsstrategien zugeordnet werden, so daß sie diskrete chemische Reagenzien darstellen, die in einer chemischen Reaktionsreihe zugegeben werden, oder zugeordnet werden, so daß sie diskrete chemische Reaktionsbedingungen darstellen, unter denen ein chemisches Reagens in einer Reaktionsreihe zugegeben wurde, einschließlich aber nicht beschränkt auf Konzentrationen, Temperaturen, Drücke, Katalysatoren, Enzyme, auf das System einwirkende elektromagnetische Energie (Bedingungen von sichtbarem Licht, Bestrahlung etc.) usw. Dies erfolgt durch ursprüngliches Erzeugen von Erkennungsmustern für spezifische massendefinierte Mittel, die entweder mit dem Auge ablesbar oder maschinenlesbar sind. Die aus den Analysenschritten resultierenden Muster werden dann mit den Erkennungsmustern zur Identifizierung und Decodierung mit oder ohne Hilfe einer Maschine verglichen. Erkennungsmuster und Analysenmuster, die maschinenlesbar sind, können elektronisch in einem geeigneten Computerspeicher und Speichereinrichtungen, die den Fachleuten wohlbekannt sind, gespeichert werden, und solche gespeicherten Muster bilden eine leicht abfragbare Datenbank, die ebenfalls eine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung bildet.

In diesem Verfahren verwendete Massenmittel sind bevorzugt eine molekulare Einheit, wie z. B. ein Linker einer Trägerharzperle der Festphasenchemie, in der eines oder mehrere seiner Atome durch ein Isotop des Atoms ausgetauscht wurden, wodurch die Masse, aber nicht die chemischen Eigenschaften der chemischen Einheit verändert wurden. Ein weiteres alternatives Massenmittel ist die einfache Wiederholung des Auftretens einer solchen molekularen Einheit für eine ganze Anzahl von Malen in einem linearen chemischen Konstrukt.

Das Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung der Festphasenchemie oder Lösungschemie durchgeführt werden. Reaktionsprodukte können von einem festen Träger zur Analyse abgespalten werden, oder das gesamte Konstrukt kann analysiert werden. Chemische Reagenzien, die zu einer Reaktionsreihe hinzugegeben werden, können eines oder mehrere einschließen, die als Substrat für die Bestimmung der Bindungsspezifität mit einer chemischen Verbindung von Interesse fungieren können. Beliebige oder alle der Schritte der Codierung, Synthese, Analyse und Decodierung können mit Hilfe geeigneter Computermittel und Robotermittel automatisiert werden, alles durch Methodiken, die den Durchschnittsfachleuten in der kombinatorischen Chemie, Spektroskopie, in den Computerwissenschaften, in der Robotik und auf dem Gebiet der optischen Durchmusterung wohlbekannt sind.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und besten Durchführung der Erfindung

Der Begriff "Isotopendotierung" oder "isotopendotiert" wird hier verwendet, um die Einführung eines Isotops eines oder mehrerer der Atome, die normalerweise in einem Molekül auftreten, in das Molekül zu bezeichnen.

Eine "Verknüpfung" ist eine kovalente Bindung oder eine molekulare Einheit, die zum Verbinden zweier Teile eines Konstruktes geeignet ist.

Ein "Linker" ist eine Einheit, die aus einem Codeblock, einer ersten Verknüpfung zur Bindung des Codeblocks an einen festen Träger oder eine andere Gruppe und einer zweiten Verknüpfung für die Bindung des Codeblocks an einen Liganden oder eine andere Gruppe umfaßt.

Eine "Linkermischung" ist eine Mischung aus zwei isotopisch verschiedenen, aber chemisch identischen Molekülen, wobei die Mischung ein spezifisches Verhältnis des ersten Isotops zum zweiten Isotop hat.

Ein "Codeblock" ist ein Molekül oder eine Reihe von Molekülen, das/die ein oder mehrere isotopendotierte Atome enthalten oder eine wiederkehrende Anzahl von Molekülen in Reihe aufweist, so daß seine/ihre Masse diskret definiert und von jedem anderen Codeblock unterschieden werden kann.

Ein "dotiertes" Atom, ein solcher Codeblock oder eine solche Gruppe bezeichnet eine Einheit, in der ein Atom in einem Molekül durch eines seiner Isotope ersetzt wurde. Dotierte Atome, wie sie von dieser Erfindung erwogen werden, schließen alle Atome ein, die in der organischen Chemie gefunden werden und Isotope besitzen, und insbesondere Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Fluor und Sauerstoff. Nicht-radioaktive Isotope sind allgemein gegenüber radioaktiven Isotopen bevorzugt.

Der Begriff "Monomer" wird hier nicht nur zur Bezeichnung von Untereinheiten verwendet, die ein lineares Molekül aufbauen, wie z. B. Aminosäuren, sondern ebenfalls zur Bezeichnung von chemischen Ausgangsstoffen und chemischen Reagenzien, die miteinander in der organischen Synthese der kombinatorischen Chemie chemisch umgesetzt werden, um Moleküle zu erzeugen, die nicht linear sind, wie z. B. Produkte, die sogenannte "kleine Moleküle" einschließen, welches organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von 500 Dalton oder weniger sind. Wie sie hier verwendet werden, sind die Begriffe "Monomer" und "chemisches Reagens" austauschbar.

Eine "Reaktionsreihe", wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine Reihe von Schritten in einer chemischen Synthese in einem kombinatorischen Syntheseformat.

Ein "fester Träger" ist eines der Materialien, auf denen Synthesen der kombinatorischen Chemie durchgeführt werden können, einschließlich Perlen, feste Oberflächen, feste Substrate, Partikel, Pellets, Scheiben, Kapillaren, Hohlfasern, Nadeln, massive Fasern, Celluloseperlen, Porenglasperlen, Kieselgele, Polystyrolperlen, die gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetzt sind, gepfropfte Copolymerperlen, Polyacrylamidperlen, Latexperlen, Dimethylacrylamidperlen, die gegebenenfalls mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin vernetzt sind, Glaspartikel, die mit einem hydrophoben Polymer überzogen sind, Fullerene und lösliche Träger, wie z. B. nicht-vernetztes Polystyrol mit niedrigem Molekulargewicht.

Ein "Konstrukt" ist eine kovalent gebundene Gruppe, die in beliebiger Kombination einen Typ von festem Träger, einen oder mehrere Linker, einen oder mehrere Codeblocks und einen oder mehrere Liganden umfaßt.

Ein "Ligand" ist ein interessierendes chemisches Reaktionsprodukt. Ein Ligand kann Teil eines größeren Konstrukts sein, wenn das letztliche Ziel die Identifizierung und/oder Abspaltung des Liganden vom Rest des Konstrukts ist.

Allgemein machen die Verfahren der Erfindung Gebrauch von einer gewissen Variante eines Konstrukts der nicht-beschränkenden allgemeinen Formel:

Isotope werden in solche Konstrukte über dotierte Verknüpfungen eingeführt. D. h. nach der Festlegung, was eine chemisch geeignete Verknüpfung darstellen wird, wird die Verknüpfung unter Verwendung eines oder mehrerer Atome der Verknüpfung synthetisiert, die mit einer Isotopenform des Atoms substituiert wurde. Die Isotopenform ist chemisch von der Nicht-Isotopenform der Verknüpfung ununterscheidbar. Die Isotopenform ist jedoch physikalisch von den anderen Isotopenformen durch MS- oder NMR-Analyse unterscheidbar. Dieser physikalische Unterschied manifestiert sich durch unterschiedlich auftretende MS-, IR- oder NMR-Peakmuster. Eine große Vielzahl von Isotopeneinfügungs- oder -dotierungsstrategien sind verfügbar, was zu einer großen Anzahl physikalisch unterscheidbarer chemischer Gruppen führt, die jeweils ihr eigenes spezifisches Peakmuster besitzen. Die Existenz solcher spezifischen Peakmuster bedeutet, daß die Isotopenformen verwendet werden können, um einen Code zu erzeugen, der in verschiedenen Codierungsstrategien verwendet werden kann, um unterschiedliche chemische Gruppen oder Bedingungen einfach zu identifizieren, die während einer kombinatorischen Synthese verwendet werden können. Verschiedene solcher Codierungsstrategien werden nachfolgend angegeben.

Die Elektrospraymassenspektrometrie liefert Informationen zu Masse und ionischer Ladungsintensität für eine gegebene molekulare Gruppe. Allgemein treten kleinere Moleküle im Spektrum nur einmal als einfach geladene Art auf, und die Wirkung der isotopischen Zusammensetzungsvariation führt zu einer sehr vorhersagbaren Quantenmassenverschiebung. So wird z. B. ein Molekül mit einem Molekulargewicht von 304 einen Peak von 305 (M + 1) in einem Massenspektrometer-(MS)-Spektrum erzeugen. Falls ein Stickstoffatom in einem solchen Molekül mit einem Atomgewicht von 14 (N14) durch das Isotop N15 ersetzt wird (durch Isotopendotierung, wie der Begriff hier verwendet wird), dann wird sich der MS-Peak genau um eine Einheit zur Rechten auf 306 verschieben. Außerdem wird eine solche Isotopendotierung nicht die Ionisation oder chemische Reaktivität des Moleküls beeinträchtigen. Die Fähigkeit zur Messung sowohl der Eigenschaften der Masse als auch der Ionenintensität mit vernünftiger Genauigkeit (d. h. Masse auf ca. 0,1 Atommasseneinheiten und relative Intensität auf ca. 3%) liefert die Basis für eine neue Codierungsstrategie unter Verwendung von Isotopen, um ein Monomer isotopisch statt chemisch zu codieren, um eine Synthesegeschichte auszulesen, anstatt ein Molekül selbst zu markieren. Unter Verwendung der Verfahren der Erfindung werden Codierungsstrategien aus der Verwendung der Masseninformation allein, der relativen Intensitätsinformation in zwei oder mehr Massenpeaks allein oder einer Kombination der beiden entwickelt. Die grundsätzliche Methodik der Erfindung, die auf dem Einfügen unterschiedlicher Isotope in kombinatorische Konstrukte zur Identifizierung der Addition von Monomeren oder chemischer Bedingungen liegt, führt zu mehreren alternativen Ausführungsformen zur Codierung und Decodierung, die individuell oder in ausgewählten Kombinationen implementiert werden können.

Multiple bevorzugte Codierungsansätze unter Verwendung definierter Massenmittel werden erörtert werden. Diese Beispiele sind nicht beschränkend, und andere Codierungsansätze sollen nicht ausgeschlossen werden.

Beispiel 1: Codierungsansätze Codierungsbeispiel A: Verhältniscodierungsansatz

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Reihe von isotopendotierten Linkermischungen n hergestellt, wobei jede Linkermischung in der Reihe ein diskretes Verhältnis des ersten zum zweiten Isotyp umfaßt und wobei sich jede Linkermischung in der Reihe im Verhältnis von der vorhergehenden oder nachfolgenden Mischung in der Reihe durch einen gleichen Betrag unterscheidet. So kann z. B. eine Reihe von 21 Ansätzen von dotiertem Monomer hergestellt werden, wobei der erste Ansatz in der Reihe ein Verhältnis von 100% des ersten Isotops zu 0% des zweiten Isotops hat, der zweite Ansatz ein Verhältnis von 95% des ersten Isotops zu 5% des zweiten Isotops hat usw. bis zum 21. Ansatz, der 0% des ersten Isotops und 100% des zweiten Isotops aufweisen wird. Jeder Linker ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß er so abgespalten werden kann, daß ein Abspaltungsteil immer die isotopendotierte molekulare Gruppe enthalten wird. Jede Linkermischung wird chemisch mit einem Trägermittel an einer Seite des Linkers umgesetzt, um n Ansätze von Träger-Linker zu ergeben, die wiederum ein diskretes Verhältnis des ersten zum zweiten Isotop haben. Dann wird ein interessierendes Reagens zu jedem Ansatz hinzugegeben, um n Ansätze von Träger-Linker-Molekül zu ergeben, die gleichsam die diskreten Verhältnisse der zwei Isotope aufweisen. Falls jetzt z. B. ein Split-Syntheseverfahren verfolgt wird, dann werden die n Ansätze in einem einzlenen Mischgefäß vereinigt, und die resultierende Mischung wird dann in n Teilmengen unterteilt, und zu jeder Teilmenge wird ein zweites interessierendes Reagens hinzugegeben, und die resultierenden Reaktionen läßt man fortschreiten. Der vorhergehende Schritt der Vereinigung aller Teilmengen und ihrer anschließende Aufspaltung in n Teilmengen wird wiederholt, und ein drittes interessierendes Reagens kann hinzugegeben werden. Falls alle möglichen Reaktionen zur Vollendung fortgeschritten sind, wird es dann n3 Produkte geben. Die Linker können abgespalten werden, so daß das isotopenmarkierte Fragment mit dem chemischen Produkt zusammenbleibt, und das resultierende Konstrukt aus Isotopenmarkierung und chemischem Produkt wird mit einem Massenspektrometer analysiert. Das resultierende Massenspektrogramm wird ein Peakmuster aufzeigen, das das Verhältnis des ersten Isotops zum zweiten Isotop widerspiegelt, das im Linkerfragment vorhanden ist, wodurch identifiziert wird, welches das erste chemische Reagens war, das zur besonderen Reaktionsvertiefung hinzugegeben wurde. Fall so z. B. das Isotopenverhältnis 100% für das erste Isotop zu 0% für das zweite Isotop beträgt, dann wird ein relativ hoher Peak im Spektrogramm an der Position des Spektrums erscheinen, die von der diskreten Atommasse besetzt wird, die diese Gruppe hat (die Durchschnittsfachleute werden einsehen, daß natürlich andere, relativ kleine Peaks auftreten werden, aber gerade ein hervorstechender Peak, der charakteristisch für das Molekül ist, wie es im Identifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Falls das Isotopenverhältnis 95% des ersten Isotops zu 5% des zweiten Isotops ist, dann wird es einen ersten hervorstechenden Peak und einen zweiten hervorstechenden Peak geben, wobei der erste hervorstechende Peak ca. 95% der Gesamtfläche unter den kombinierten hervorstechenden Peaks aufweist und der zweite hervorstechende Peak die verbleibenden ca. 5% aufweist, wodurch ein ein spezifisches hervorstechendes Peakmuster gebildet wird, das zur eindeutigen Identifizierung des Isotopenverhältnisses und dadurch des chemischen Reagens dient. Es ist selbstverständlich, daß ein anderer kleiner Peak, der nicht Teil der Muster ist, die die Codes der Erfindung bilden, aufgrund der natürlichen Menge von C13 erscheinen wird, und seine relative Größe kann unter Verwendung der folgenden Analyse vorhergesagt werden. Falls eine gegebene Gruppe 24 Kohlenstoffe und Stickstoff enthält und sie auf ein 50/50-Verhältnis von N14/N15 dotiert wurde, dann wird Peak 1 aus dem vorhandenen N14/C12 zu (0,898)24 × 0,5 = 0,383 berechnet werden; Peak 2 wird aus dem vorhandenen N15/C12 und N14/C13 zu (0,989)24 × 0,5 + (0,989)23 (0,011) × 24 × 0,5 = 0,485 berechnet werden; und der dritte Peak wird aus dem vorhandenen N15/C13 zu (0,989)23 × (0,011) × 24 × 0,5 = 0,102 berechnet werden, was in einem spezifischen Muster mit zwei in etwa gleichen hervorstechenden Peaks und dem relativ kleinen Nebenpeak resultiert. Idealerweise sollten sich die isotopisch verschiedenen Arten um zwei oder mehr atomare Masseneinheiten (AME) unterscheiden, da dies gut getrennte Peaks erzeugen würde, die nicht durch das natürliche Vorhandensein von 13C beeinträchtigt werden. Um dies mit den Atomen zu erreichen, die am häufigsten in einer solchen Chemie verwendet werden (C, H, N, O), ist es typischerweise erforderlich, daß mehr als ein Atom isotopisch substituiert ist, da sich erhältliche stabile Isotope von C, H und N um nur eine Masseneinheit unterscheiden.

Zur Identifizierung der dritten Komponente im kombinatorischen Konstrukt kann die dritte Komponente anschließend durch ihre Reaktionsvertiefungsnummer identifiziert werden. Wenn jetzt die Identität der ersten Komponente aufgrund des Massenspektrogramms bekannt ist und die dritte Komponente aufgrund der Vertiefungsnummer bekannt ist, werden ihre kombinierten Molekulargewichte vom Gesamtmolekulargewicht des Konstrukts subtrahiert, um zu einer Restmasse zu gelangen, die die zweite Komponente des Konstrukts identifiziert.

Man sollte einsehen, daß die Verwendung der Verfahren und Konstrukte der Erfindung eine vollständige Reihe codierter Linker liefert, die große wirtschaftliche Einsparungen bereitstellen, da die einzige zusätzliche Synthese, die anfänglich erforderlich ist, das isotopische Dotieren eines festen Träger-Linkers ist, der von vornherein konstruiert werden mußte. Keine anderen chemischen Modifikationen sind für die Linker erforderlich, die anfänglich für die kombinatorische Festphasensynthese ausgewählt wurden.

Codierungsbeispiel B: Doppelverhältnis-Codierungsansatz

Für Synthesen mit mehr als drei Schritten wird das oben beschriebene Verfahren der Verhältniscodierung dadurch befolgt, daß eine Reihe von isotopendotierten Linkermischungen n hergestellt wird, wobei jede Linkermischung in der Reihe ein diskretes Verhältnis des ersten Isotops zum zweiten Isotop umfaßt, und wobei sich jede Mischung in der Reihe im Verhältnis von der vorhergehenden oder nachfolgenden Mischung in der Reihe durch einen gleichen Betrag unterscheidet. Jedoch wird auch ein zweiter Typ von Atom isotopendotiert, so daß es zwei Typen von vorhandenen atomaren Isotopen gibt. Z. B. kann eine Stickstoffposition mit einer Mischung aus N14 und N15 dotiert werden, während eine Kohlenstoffposition mit einer Mischung aus C12 und C13 dotiert werden kann. Wiederum wird dieses Beispiel dem Verlauf von 5%-Schritten folgen, so daß es 21 mögliche Stickstoffverhältniskombinationen und 21 möglich Kohlenstoffverhältniskombinationen gibt. Außerdem wird die Kohlenstoffposition mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt, die entschützt werden kann, um einem Reaktionsschritt in der kombinatorischen Synthese zu entsprechen. Dadurch identifiziert das Massenspektrogramm-Peakmuster für den dotierten Stickstoff die erste Synthesekomponente, das Massenspektrogramm-Peakmuster für den dotierten Kohlenstoff identifiziert die zweite Synthesekomponente, ein Test identifiziert die vierte Komponente, und die dritte Komponente wird durch Subtraktion der ersten, zweiten und vierten Komponenten vom Gesamtgewicht des Produkts identifiziert.

Gelegentlich kann eine Code-Degenerierung auftreten, wenn mehr als ein Typ von Isotop verwendet wird, wie in dem Fall, in dem eine Gruppe eine N15-C12-Kombination trägt und eine andere eine N14-C13-Kombination trägt, von denen beide das gleiche Atomgewicht haben und daher ununterscheidbare Peakmuster in einem Massenspektrogramm ergeben würden. Dieses Problem kann auf eine oder zwei allgemeine Weisen umgangen werden. Zunächst wird dieser Typ von Code-Degenerierung durch Auswahl von C12 und C14 als Kohlenstoff-Isotopenpaar vermieden. Oder, falls Radioaktivität vermieden werden soll, können C12 und C13 noch durch die Technik der Kombination von Massenspektrographie mit Fragmentierung verwendet werden. Z. B. kann eine Amid-Gruppe der Struktur CH3-NH-CO-CH2-CH3 auf zwei Weisen dotiert werden, die das gleiche Atomgewicht wie folgt liefern werden:

oder

Wenn sie jedoch entlang der angegebenen Spaltungslinien fragmentiert werden, wird Gruppe I ein Fragment mit einem dotierten N und einem normalen C liefern, während Gruppe II ein Fragment mit einem dotierten C und einem normalen N liefern wird, wodurch unterschiedliche Peakmuster im MS erhalten werden.

Das folgende Schema erläutert den Einzelpeak-Positionierungscodierungsansatz.

Codierungsbeispiel C: Einzelpeak-Positionierungscodierung Schema 2

Unter Befolgen des Verfahrens in Schema 2 kann eine andere alternative Ausführungsform der Erfindung der Isotopencodierung einem Einzel-MS-Peak-Positionierungsansatz folgen. Dieser Ansatz erzeugt einen MS-Peak. In diesem Format wird die Masse des Codierungsblocks so konstruiert, daß sie in einem zweckmäßigen Teil des Spektrums erscheint, und sie wird verwendet, um das erste Monomer oder den ersten Baustein darzustellen, das/der in der Synthese einer besonderen Verbindung verwendet wird. Nach der Beendigung der kombinatorischen Synthese wird Verknüpfung 2 gespalten, um das Molekulargewicht des Liganden zu bestimmen, Dann wird Verknüpfung 1 gespalten, um die Identifizierung des Codeblocks zu ermöglichen, der die Identifizierung des ersten Reservoirmonomers bestimmt.

Die ersten und zweiten Verknüpfungen in einem Linkerschema können gleich oder, verschieden sein. Die Verknüpfungen können gleich sein, wenn ein Direktbindungstest verwendet wird, gefolgt von der Entfernung positiver Perlen. Wenn die Verknüpfungen unterschiedlich sind, erlaubt dies, daß der Test entweder durch Direktbindung oder mit abgespaltenem Liganden allein erfolgt.

Das Decodieren einer kombinatorischen Bibliothek aus drei Monomeren wird mit drei Schritten erreicht. Die Masse des Codeblocks wird bestimmt, wodurch der Code identifiziert wird, der das erste Reservoirmonomer identifiziert. Die Reservoirnummer der letzten Monomeraddition bestimmt das letzte Monomer, aus dem die Masse des letzten Monomers bekannt ist. Dann werden die Massen der ersten und dritten Reservoirmonomere vom Gesamtmolekulargewicht des gesamten Konstrukts subtrahiert, wodurch die Masse des zweiten Reservoirmonomers zurückbleibt, aus der die Identität des zweiten Reservoirmonomers abgeleitet wird.

Der Einzelpeak-Positionierungscodierungsansatz ist besonders nützlich, wenn aktive Liganden durch Verwendung einer Chromatographiesäule durchmustert werden und die gebundenen Konstrukte dann eluiert werden.

Das folgende Schema erläutert den Doppelpeak-Positionierungscodierungsansatz.

Codierungsbeispiel D: Doppelpeak-Positionierungscodierung Schema 3

Unter Befolgen des Verfahrens in Schema 3 kann eine andere alternative Ausführungsform der Erfindung der Isotopencodierung einer Doppel-MS-Peakpositionierungsstrategie folgen. Dieser Ansatz liefert zwei MS-Peaks. Z. B. wird ein Satz von Harzperlen hergestellt, worin die Perlen zwei geschützte Stellen tragen, wie z. B. BOC und FMOC. Eine erste geschützte Stelle wird entschützt. Eine Anzahl von Isotopen-Codeblocks n wird hergestellt, und jeder Code wird mit einer ersten entschützten Stelle verknüpft. Die zweite geschützte Stelle wird entschützt. Eine Standard-Referenzgruppe mit einer unterschiedlichen Masse wird mit der zweiten entschützten Stelle verknüpft. Bei MS wird dies einen Peak für die Standardreferenz und einen zweiten Peak für den Code liefern, wobei der Massenunterschied zwischen den zwei Peaks die Codierungseinheit ist. Das Decodieren einer kombinatorischen Bibliothek aus drei Monomeren wird mit drei Schritten erreicht. Die Masse des Liganden + Codeblock wird bestimmt, wodurch der Code identifiziert wird, der das erste Reservoirmonomer identifiziert. Die Reservoirnummer der letzten Monomeraddition bestimmt das letzte Monomer, aus dem die Masse des letzten Monomers bekannt ist. Dann werden die Massen der ersten und dritten Reservoirmonomere vom Gesamtmolekulargewicht des gesamten Konstrukts subtrahiert, wodurch die Masse des zweiten Reservoirmonomers zurückbleibt, aus dem die Identität des zweiten Reservoirmonomers abgeleitet wird.

In einem alternativen Konstrukt wird der Codeblock hergestellt, damit er zwei gleiche Arten enthält, eine, die konstant ist und als Referenzmasse dient, während die andere variable Massenblöcke besitzt, ähnlich denjenigen, die für das Einzelpeak-Positionierungscodierungsschema beschrieben wurden. Nach Spaltung der Verknüpfung an das Harz wird ein Ligand mit einer verbundenen variablen Codeerhöhung erzeugt. Die codierte Information wird jetzt aus dem Massenunterschied der Codierungseinheit und der Referenzmasseneinheit bestimmt. Der Vorteil liegt darin, daß der Code am Liganden verbleiben kann und zur gleichen Zeit ausgelesen werden kann, wenn die Masse des gesamten Konstrukts durch MS bestimmt wird. Diese Strategie ergibt zwei Massenpeaks, die den Liganden entweder an den Referenzcode oder an den variablen Code angebracht darstellen. Die Massendifferenz wird verwendet, um die Identität von Monomer 1 zu bestimmen, während Monomer 3 aus dem entsprechenden Reservoir bekannt ist und daher Monomer 2 wie oben beschrieben abgeleitet wird.

Die Erfindung ermöglicht ebenfalls eine alternative Ausführungsform, die im Ergebnis einen Strichcodierungsmechanismus (Barcode) schafft. Verschiedene nicht-beschränkende exemplarische Versionen der Festphasenkonstrukte sind wie folgt möglich.

Codierungsbeispiel E: Der Strichcodierungsansatz

Version 1: Masse allein
Harzperle
Version 2: Masse und Intensität Harzperle
Version 3: Masse allein Harzperle
Version 4: Masse und Intensität Harzperle

In diesem Ansatz und seinen Variationen besteht ein Codeblock höchst vorteilhaft aus einem Dimer, wobei jede Einheit ein, zwei oder drei diskrete Massen besitzt. Z. B. enthält ein Konstrukt der Struktur:

einen Codeblock mit zwei Massenblöcken M1 und M2, die in diesem Beispiel aus einer, zwei oder drei Aminosäuren bestehen. Die Aminosäuren werden dotiert, um drei diskrete Massen zu ergeben, was z. B. Glycin (G0) mit einer Masse von 57, Glycin, das N15 trägt (G1), mit einer Masse von 58 und Glycin, das zwei Deuteriumatome (G2) am Kohlenstoff 2 trägt, mit einer Masse von 59 liefert. Zusammenbau dieser drei Gruppen in 7 mögliche Massensätze liefert die folgenden Codes und ihre Fraktionen von der Gesamtheit: Zusammensetzung Relative Präsenz G0 100% G1 100% G2 100% G0G1 50% und 50% G0G2 50% und 50% G1G2 50% und 50% G0G1G2 33,3%, 33,3% und 33,3%

Es ist jetzt möglich, diesen Massensätze in Blöcken M1 und M2 zusammenzubauen und vorherzusagen, was das charakteristische MS-Peakmuster für jeden Codeblock sein wird. Für diese Gruppe von Massensätzen in Version 1 des Strichcodierungsansatzes wird das folgende MS-Peakmuster vorhergesagt:

In dieser Tabelle wird für Codeprobe 1 ein einzelner Peak bei 114 vorhergesagt, da die kombinierten Massen von jedem G0 57 + 57 = 114 sind. Für Codeprobe 2 werden zwei gleiche Peaks bei 114 und 115 vorhergesagt, da sich G0 in M1 plus G0 in M2 zu 114 aufaddiert und sich G0 in M1 plus G1 in M2 zu 115 aufaddiert. In Codeprobe 6 werden zwei einzelne Peaks bei 114 und 188 vorhergesagt, und eine Redundanz bei 116 wird vorhergesagt, um einen Peak zu liefern, der etwa zweimal so hoch wie die Peaks bei 114 und 118 ist.

In der folgenden Tabelle werden vorhergesagte MS-Peakmuster für 25 Codeproben gezeigt. Die tatsächlichen MS-Peakmuster sind im Anschluß an die Tabelle des vorhergesagten Peakmusters gezeigt, und es ist ersichtlich, daß es eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen beobachteten und vorhergesagten Peakmustern gibt. Verweise auf G0, G1 und G2 sind ausgelassen, obwohl die gleichen drei isotopendotierten Versionen von Glycin, die oben beschrieben wurden, noch in dieser Tabelle verwendet werden. (Man bemerke, daß sich die numerischen Werte für das MS in 1 auf die Gesamtmasse des gesamten Konstrukts beziehen, einschließlich eines Lysinrestes und der Linker, die in den Bereich von 300 bis 309 Masseneinheiten fallen.)

Sobald das MS an einer vollendeten kombinatorischen Syntheseprobe durchlaufen wurde, wird das Muster mit einem vorhergesagten Muster verglichen, das wiederum den Code identifiziert, der wiederum das erste Reservoirmonomer identifiziert. Die vorhergesagten Muster können eine Art von maschinenlesbarem Strichcode bilden, der unter Verwendung von Verfahren, die den Durchschnittsfachleuten für die optische Abtastung allgemein bekannt sind, die schnelle Dateneingabe, -deocodierung und -interpretation ermöglicht.

Andere Codierungsstrategien

Es ist möglich, Elemente aus einem oder allen der Verhältnis-, Einzelpeak-, Doppelpeak- oder Strichcodeverfahren zu kombinieren, um Codekonstrukte zu ergeben. Codeblocks müssen nicht im Vorfeld eines Konstrukts hinzugegeben werden – sie können an jedem Punkt hinzugegeben werden, unter der Annahme, daß ein geeignetes Reagens verfügbar ist, z. B.:

worin die Isotopendotierung an der Perlenverknüpfung auftritt und an das Ende eines Liganden mit drei Monomeren gebunden ist, wie durch den Stern angezeigt. Die Isotopendotierung könnte auch am anderen Ende des Liganden durchgeführt werden.

Da Isotope leicht durch Kernspinresonanz (NMR) ausgelesen werden können, kann dies in einer anderen alternativen Ausführungsform der Erfindung anstelle von oder zusammen mit MS-Spektroskopie verwendet werden. NMR bietet die Vorteile einer höheren Genauigkeit (man kann Verhältnisreservoirs in Schritten von bis herab zu 1% durchführen), die Perlen müssen nicht vor der Analyse vom Konstrukt abgespalten werden, und NMR ist anders als MS zerstörungsfrei.

Andere Konstrukte können die allgemeinen nicht-beschränkenden exemplarischen Formeln annehmen:

133 bis 286 zeigen Spektrogramme, die mit einer anderen Variation der Verhältniscodierung verbunden sind, die ein Vier-Peak-Verhältniscodierungsschema ist. In der folgenden Tabelle stellt die erste Spalte den Codeblock dar, die zweite Spalte ist eine interne Referenz-Nr., und die dritten, vierten, fünften und sechsten Spalten stellen die jeweiligen Molfraktionen der FMOC-geschützten Alanine dar, wobei unterschiedliche ganzzahlige Massen die Isotopendotierung verwenden, d. h. A0, A3, A2 und A1 (A ist Referenzalanin, A3 ist Alanin plus 3 atomare Masseneinheiten, A2 ist Alanin plus zwei atomare Masseneinheiten, etc.)

In der folgenden Tabelle wird jeder der gerade zuvor aufgeführten durchgezählten Codeblöcke mit einer Spektrogramm-Nr. korreliert, die in der zweiten Spalte identifiziert und in der ersten Zeile des jeweiligen Spektrums in den Figuren gezeigt ist. Codeblock Nummer, die das Spektrum identifiziert 1 ASA 008683 2 ASA 008684 3 ASA 008685 4 ASA 008686 5 ASA 008687 6 ASA 008688 7 ASA 008689 8 ASA 008690 9 ASA 008691 10 ASA 008692 11 ASA 008693 12 ASA 008694 13 ASA 008695 14 ASA 008696 15 ASA 008697 16 ASA 008698 17 ASA 008699 18 ASA 008700 19 ASA 008701 20 ASA 008702 21 ASA 008703 22 ASA 008704 23 ASA 008705 24 ASA 008706 25 ASA 008707 26 ASA 008708
27 ASA 008709 28 ASA 008710 29 ASA 008711 30 ASA 008712 31 ASA 008713 32 ASA 008714 33 ASA 008715 34 ASA 008716 35 ASA 008717 36 ASA 008718 37 ASA 008719 38 ASA 008720 39 ASA 008721 40 ASA 008722 41 ASA 008723 42 ASA 008724 43 ASA 008725 44 ASA 008726 45 ASA 008727 46 ASA 008728 47 ASA 008729 48 ASA 008730 49 ASA 008731 50 ASA 008732 51 ASA 008733 52 ASA 008734 53 ASA 008735 54 ASA 008736 55 ASA 008737 56 ASA 008738 57 ASA 008739 58 ASA 008740 59 ASA 008741 60 ASA 008742
61 ASA 008743 62 ASA 008744 63 ASA 008745 64 ASA 008746 65 ASA 008747 66 ASA 008748 67 ASA 008749 68 ASA 008750 69 ASA 008751 70 ASA 008752 71 ASA 008753 72 ASA 008754 73 ASA 008755 74 ASA 008756 75 ASA 008757 76 ASA 008758 77 ASA 008759 78 ASA 008760 79 ASA 008761 80 ASA 008762 81 ASA 008763 82 ASA 008764 83 ASA 008765 84 ASA 008766 85 ASA 008767 86 ASA 008768 87 ASA 008769 88 ASA 008770 89 ASA 008771 90 ASA 008772 91 ASA 008773 92 ASA 008774 93 ASA 008775 94 ASA 008776
95 ASA 008177 96 ASA 008778 97 ASA 008779 98 ASA 008780 99 ASA 008781 100 ASA 008782 101 ASA 008783 102 ASA 008784 103 ASA 008785 104 ASA 008786 105 ASA 008787 106 ASA 008788 107 ASA 008789 108 ASA 008790 109 ASA 008791 110 ASA 008792 111 ASA 008793 112 ASA 008794 113 ASA 008795 114 ASA 008796 115 ASA 008797 116 ASA 008798 117 ASA 008799 118 ASA 008800 119 ASA 008801 120 ASA 008802 121 ASA 008803 122 ASA 008804 123 ASA 008805 124 ASA 008806 125 ASA 008807 126 ASA 008808 127 ASA 008809 128 ASA 008810
129 ASA 008811 130 ASA 008812 131 ASA 008813 132 ASA 008814 133 ASA 008815 134 ASA 008816 135 ASA 008817 136 ASA 008818 137 ASA 008819 138 ASA 008820 139 ASA 008821 140 ASA 008822 141 ASA 008823 142 ASA 008824 143 ASA 008825 144 ASA 008826

Während prinzipiell jede Anzahl von Codes erzeugt werden kann, wird die größte Anwendbarkeit durch Minimierung der Größe der Codierungseinheit erreicht, was gleichsam die chemische Investition minimieren wird.

Die Offenbarung der folgenden Literaturstellen wird hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt: E. Atherton und R. C. Sheppard (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. A. Bodanszky und M. Bodanszky (1984), The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin.

Beispiel 2

Drei handelsübliche (isotopendotierte) Bromessigsäuren liefern drei Codierungsgruppen

Das folgende Syntheseschema erläutert eine Variante des Verhältnisansatzes. 21 Reservoirs von Bromessigsäure, die jeweils Verhältnisse von C12 zu C13 besitzen, die in 5%-Schritten von 0 zu 100% fortschreiten, werden hergestellt, wobei in diesem Fall die Isotopendotierung nur am Kohlenstoff Nr. 1 erfolgt.

Die R1-Gruppe wird durch die C12/C13-Verhältnisprobe codiert, R3 wird durch die Reservoirnummer codiert, aus der R3 entnommen wurde, und die R2-Gruppe wird durch Subtraktion der bekannten R1- und R3-Massen von der Gesamtkonstruktmasse codiert.

Beispiel 3: Ein Beispiel für Isotopencodierung unter Verwendung des N14,15-Isotopenverhältnisses in Form eines Reagens N14,15H4OAc

(a) Codiertes Harz, 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol, Diisopropyl-carbodiimid, DMF; (b) trans-(±)-3-Phenyl-2-(phenylsulfonyl)-oxaziridin, CHCl3; (c) Aldehyd, (X% : Y%) 14NH4OAc : 15NH4OAc, AcOH/CHCl3 (50 : 50); (d) (i) Pd(PPh3)4, CHCl3/4-Methylmorpholin/AcOH (90 : 5 : 5), (ii) Natriumdiethyldithiocarbamat/Diisopropylethylamin/DMF (99 : 0,5 : 0,5); (e) Amin, PyBOP, Diisopropylethylamin, DMF; (f) TFA/H2O (95 : 5)

Beispiel 4: Ein Beispiel für Isotopencodierung unter Verwendung des 1,2H-Isotopenverhältnisses in Form eines Reagens NaCNBD4

Dieses Beispiel beinhaltet durch Verweis die Offenbarung von M. Lebel et al., Drug Development and Research 1994, 33, 146–156.

Beispiel 5: Codierung unter Verwendung von vier möglichen Diastereomeren von Verknüpfung 1, Code 2 und Verknüpfung 2
Beispiel 6: Ein Beispiel für Isotopencodierung unter Verwendung des H1,2-Isotopenverhältnisses in Form eines Reagens NaCNBD4
Schema für Beispiele 7 bis 13
Beispiel 7

1 – In einen mit einem Rührstab, Rückflußkondensator und 60 ml-Tropftrichter (unter Stickstoff) versehenen 500 ml-Dreihalsrundkolben wurden 50,5 g 4-Hydroxybenzoesäure und 95 ml 1,3-Dimethoxybenzol gegeben. 123,33 g Zinkchlorid wurden hinzugegeben, und die Mischung wurde mit einem Ölbad auf 60° erwärmt. 126 ml Phosphoroxychlorid wurden während ca. 30 Minuten hinzugetropft. Nach der Zugabe lief die Reaktion für 90 Minuten bei 60°. Die dunkelrote Mischung wurde auf 1,5 l Eis gegossen (unter starkem Vermischen), und dazu wurden 276 g Natriumcarbonat in kleinen Portionen gegeben (eine signifikante Gasentwicklung wurde beobachtet). 400 ml Ethylacetat wurden hinzugegeben, und die wäßrige Schicht wurde mit weiteren 500 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Anteile wurden vereinigt und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum bei 40° aufkonzentriert und weiter unter Vakuum getrocknet, um 142,2 g eines rötlich-rosafarbenen Feststoffs zu ergeben. Der Feststoff wurde mit 400 ml heißem Hexan verrieben, filtriert und getrocknet, um 63,3 g eines rosafarbenen Feststoffs zu ergeben. Umkristallisation aus 75 ml heißem Methanol ergab eine erste Ausbeute von reinem 2,4-Dimethoxy-4-hydroxy-benzophenon (1) als hellrosafarbenen Feststoff (21,9%).

Beispiel 8

2 – In einen 500 ml-Rückgewinnungskolben wurden 20,043 g 2,4-Dimethoxy-4-hydroxy-benzophenon, 150 ml Wasser, 0,75 g Kaliumiodid und 82,5 Natriumchloracetat gegeben. Die Mischung wurde dann in einem Ölbad auf 85° erwärmt. Zur Mischung wurde 50%iges NaOH (G/V) in kleinen Mengen gegeben, um den pH auf 11–14 zu halten. Die Reaktion wurde durch DC (2/5 Methanol/Methylenchlorid) verfolgt, bis die Reaktion vollständig war (3 h). Die Reaktionslösung wurde noch heiß in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt und auf Raumtemperatur abgekühlt. 150 ml Ethylacetat wurden hinzugegeben, und die Lösung wurde mit konzentriertem HCl auf pH 2 angesäuert. Die Lösung wurde über Nacht vermischt. Die große Menge von weißem Niederschlag wurde abfiltriert und mit 3 × 50 ml Wasser gewaschen. Der cremefarbene Feststoff wurde unter Vakuum getrocknet, um eine erste Ausbeute von 16,17 g reinem (2) zu ergeben (66%).

Beispiel 9

3 – In einen 100 ml-Rückgewinnungskolben wurden 1,00 g (2), 32 ml Methanol und 3,2 ml 1 N NaOH gegeben. Diese klare Lösung wurde in einem Ölbad auf 50° erwärmt. Zur Lösung wurden 0,18 g Natriumborhydrid in kleinen Mengen gegeben. Die Reaktion ließ man für 2,5 h fortschreiten. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und die Lösung wurde auf ein kleines Volumen auf konzentriert. Die Mischung wurde mit 2 N HCl angesäuert, und die Lösung wurde weiter zur Entfernung des Methanols auf konzentriert. Der Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Anteile wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, aufkonzentriert und unter Vakuum getrocknet, um 0,98 g eines hellrosafarbenen Schaums (3) zu ergeben (97,5%). Das Produkt wurde unmittelbar für den nächsten Schritt verwendet.

Beispiel 10

In einen 200 ml-Rückgewinnungskolben wurden 10,0 g Fmoc-Cl gegeben, das in 100 ml 80%igem Dimethoxyethan gelöst war. Zu dieser Mischung wurden ca. 35 ml 10%iger 15N-Ammoniak in Wasser gegeben. Ein weißer Niederschlag begann sich zu bilden. Der pH der Mischung wurde auf 7–9 gebracht. Die Reaktion wurde für 3 min fortschreiten gelassen. Die Reaktion wurde mit 12 N HCl angesäuert, und der weiße Feststoff wurde abfiltriert und luftgetrocknet. weiteres Trocknen unter Vakuum ergab eine erste Ausbeute von 8,072 g reinem Fmoc-15NH2 als weißen kristallinen Feststoff.

Beispiel 11

4 – In den zur Trocknung von (3) verwendeten 100 ml-Rückgewinnungskolben wurden 20 ml Dioxan, 0,75 g Fmoc-15NH2 und 0,25 g Benzolsulfonsäure gegeben. Die Reaktion wurde für 18 h auf 40°C erwärmt. Eine große Menge von hellgrauem Niederschlag wurde festgestellt. Die Mischung wurde zu Wasser gegeben, und der hellbraune Feststoff wurde abfiltriert und durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (100% Ethylacetat, dann 98% Ethylacetat/Essigsäure), um 0,37 g reines (4) als hellbraunes Öl zu ergeben.

Beispiel 12

5 – In ein 10 ml-Schüttelrohr wurden 0,50 g aminomethyliertes Polystyrol (0,21 mmol/g) gegeben. Zum Harz wurden eine Lösung aus 0,1845 g (4) 15N-Knorr-Linker und 0,184 g kommerziellem 14N-Knorr-Linker in 5 ml DMF und 0,164 ml Diisopropylcarbodiimid gegeben. Die Kupplung lief an einem Schüttler für 5 h ab. Die Kupplungslösung wurde abfiltriert, und das Harz wurde mit DMF und CH2Cl2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet (ninhydrinnegativ), um (5) zu ergeben.

Beispiel 13

6a & 6b – In zwei 5 ml-Schüttelrohre mit jeweils ca. 10 mg von Harz (5) wurden 2 × 4 ml 20% Piperidin/DMF zu jedem gegeben. Beide wurden dann mit DMF gewaschen (ninhydrinpositiv). Zum ersten Schüttler wurden 0,0246 g 4-Brommethylbenzoesäure, 0,05 ml DIC in 1,0 ml DMF gegeben. Zum zweiten wurden 0,0168 der Ylidsäure, 0,05 ml DIC, in 1,0 ml DMF gegeben. Jede Reaktion lief an einem Schüttler über Nacht ab. Die Harze wurden mit DMF und Methylenchlorid gewaschen und unter Vakuum getrocknet (ninhydrinnegativ). Zu den trockenen Harzen wurde 1,0 ml 95% TFA/Wasser gegeben, und die Spaltung erfolgte für 1 h. Die Lösungen wurden filtriert und aufkonzentriert, um (6a) und (6b) zu ergeben. ESI-MS zeigte ein 15N-Verhältnis von ca. 46%.

Beispiel 14 – Herstellung von massenmarkierten photolytisch spaltbaren Linkern
Beispiel 15 – Verhältniscodes

1 – Eine Lösung aus 1,511 g 2-Nitrobenzaldehyd (10,0 mmol), 1,563 g Malonsäure (15,0 mmol), 2,00 g 15N(98%)-Ammoniumacetat (25,6 mmol) in 5,0 ml Essigsäure (99,999%) wurde mit einem Ölbad auf 100° erwärmt. Wie im experimentellen Teil von Oelschläger angemerkt, gab es während des Erwärmens einen temporären, fast farblosen Niederschlag (Ammoniumsalz der Benzyliden-Verbindung). Nach 5 Stunden Erwärmen wurden 8,0 ml 25% HCl hinzugegeben und das Erwärmen für weitere 5 Stunden fortgesetzt. Zu dieser Mischung wurden 12,0 ml Wasser gegeben, und die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Ein hellbrauner Niederschlag wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde fast zur Trockene eingedampft. Die Lösung wurde dann kurz mit Aktivkohle aufgekocht und filtriert. Das Filtrat wurde durch Zugabe von konzentriertem Ammoniumhydroxid basisch gemacht. (1) fiel als gelblicher Feststoff aus. Der Feststoff wurde dann zweimal mit Wasser, einmal mit 50% Methanol in Wasser, einmal mit 1 : 1 Methanol-Ether und dreimal mit Ether gewaschen. Der Feststoff wurde unter Vakuum unter Erhalt von 0,8 g reinem Produkt (1) (38%) getrocknet.

0,470 g (2,22 mmol) von (1) wurden in 5,0 ml Wasser suspendiert und anschließend durch Zugabe von 0,299 ml (2,13 mmol) Triethylamin gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,757 g Fmoc-OSU (2,25 mmol) in 5,0 ml Acetonitril gegeben. Die Reaktion lief dann für 30 Minuten ab (pH ≈ 10). Die Aufschlämmung wurde eingedampft und mit 5,0 ml Wasser und 10,0 ml Ethylacetat verdünnt. Der pH wurde mit 12 N HCl auf 2 eingestellt. Ein weißer Feststoff fiel aus, der filtriert und mit Ethylacetat extrahiert wurde. Die organischen Anteile wurden mit 2 N HCl, H2O und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der nach Verreiben mit Ethylacetat und Hexan 0,36 g reines (2) ergab (0,37%).

Vertiefungsanordnung

Prozentanteil/Verhältnis-Lösungen von 14N/15N-Photolinker wurden in der folgenden Weise erzeugt (aus 10,5 ml Vorratslösungen DMF von jedem Photolinker).

0% = 20 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 0 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

5% = 19 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 1 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

10% = 18 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 2 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

15% = 17 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 3 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

20% = 16 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 4 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

25% = 15 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 5 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

30% = 14 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 6 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

35% = 13 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 7 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

40% = 12 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 8 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

45% = 11 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 9 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

50% = 10 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 10 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

55% = 9 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 11 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

60% = 8 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 12 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

65% = 7 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 13 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

70% = 6 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 14 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

75% = 5 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 15 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

80% = 4 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 16 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

85% = 3 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 17 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

90% = 2 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 18 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

95% = 1 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 19 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

100% = 0 × 0,050 ml von 10,5 ml 14N-Photolinker und 20 × 0,050 ml von 10,5 ml 15N-Photolinker

Ausgehend von 6,3 g Aminomethylpolystyrol (0,21 mmol/g), unterteilt in 21 gleiche Chargen von jeweils 0,300 g, wurden die 1,0 ml-Lösungen mit variierenden Verhältnissen von 15N-(2) und 14N-(2) in 5%-Schritten hinzugegeben (0%, 5%, 10% bis 100% 15N-(2)-Photolinker) (siehe CDW 1). Diese Lösungen wurden erzeugt durch Auflösen von 0,4988 g 14N-(2)-Photolinker und 0,500 g 15N-(2)-Photolinker und unter Verwendung von 0,050 ml-Teilmengen von jedem (20 : 0, 19 : 1, 18 : 2 bis 0 : 20). Zur Mischung wurden dann 0,169 ml Diisopropylcarbodiimid gegeben. Die Proben wurden dann vermischt, und das Kuppeln lief über Nacht ab (ca. 16 Stunden). Die Harze wurden achtmal mit 1,5 ml DMF und dann mit ausgiebigen Mengen von Methanol gewaschen.

Ca. 0,1 g von jeder Charge wurde in 7 Chargen kombiniert, die aus den folgenden Verhältnissen pro Charge bestanden (siehe CDW 2). Diese 7 Harzchargen wurden in der tertiären Amin-Bibliotheksuntersuchung verwendet.

Vertiefungsanordnung

Ca. 0,1 g von jedem Harzchargenverhältnis wurden mit 0,50 ml von 10,5 ml Lösung von 0,55 g 15N-Fmoc-Alanin-OH in DMF gekuppelt, gefolgt von Zugabe von 0,169 ml DIC. Das Kuppeln lief dann über Nacht ab. Die Harze wurden mit ausgiebigen Mengen von Methanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet (ninhydrinnegativ).

Eine kleine Menge von jeder Harzcharge, ca. 0,01 g, wurde photolytisch für 4 h in 0,200 ml 3 : 1 Wasser/THF gespalten. MS wurde anschließend durchgeführt.

Beispiel 16 – Herstellung von Codes auf Massenbasis, die durch NMR unterscheidbar sind

Novabiochem TGR-Harz, gekuppelt mit 13C2-Fmoc-Gly-OH. Sowohl der Carbonylkohlenstoff als auch Methylenkohlenstoff von Glycin waren durch 13C-NMR des Harzes in CDCl3 offensichtlich. Zusätzlich könnten diese Kohlenstoffe gegen das Standard-PEG-Signal integriert werden, das durchgehend konstant geblieben wäre, und die Verhältnisse von 13C-Linker/Ligand könnten variiert und anschließend durch dieses zerstörungsfreie Verfahren bestimmt werden (Ligandenauflösung).

Novabiochem TG-Harz, gekuppelt mit 13C2-Fmoc-GlyOH

Novabiochem TG-Harz, gekuppelt mit 13C2 15N-Photolinker. Dieser Linker könnte ein schweres Verhältnis 13C- zu 13C-Marke sowie eine spaltbare 15N-Marke haben.

Beispiel 17 – NMR-Verhältniscodierungsansatz

13C-NMR-Quantifizierungsuntersuchung an einem Verhältnis von 13Cmarkierter Essigsäure zu nicht-markierter Essigsäure, gebunden an Tenta-Gel-NH2-Harz. Die 13C-Essigsäurecarbonyl-Gruppe kann gegen natürlich vorkommendes 13C im PEG-Anteil des TG-NH2-Harzes integriert werden. Eine Differenzierung von 5%-Schritten wird beobachtet.

Beispiel 18 – Herstellung von FMOC-geschützten isotopendotierten Codeblocks

Isotopenmarkiertes Glycin von Cambridge Isotope Laboratories
Isotopenmarkiertes Alanin von Cambridge Isotope Laboratories
N-Fmoc-L-Glycin

1 g von jedem isotopenmarkierten Glycin (13,3 mmol) wurde in 15 ml gereinigtem Wasser und 1,4 g Natriumcarbonat gelöst (siehe Figur GP1). 15 ml 1,4-Dioxan wurden langsam zu jedem hinzugegeben und gerührt. Über einen Zeitraum von 2 Stunden wurden 4,5 g Fmoc-OSu (9-Fluorenylmethyl-N-hydroxysuccinimid) zu jedem hinzugegeben (siehe Figur GP3 als Schema). Zusätzliches gesättigtes Natriumcarbonat in Wasser wurde hinzugegeben, um einen pH = 10 aufrecht zu erhalten. Lösungen wurden über Nacht gerührt. 6 M HCl wurde langsam zur Lösung hinzugegeben, bis der pH ca. 2 betrug. Extraktion der Verbindung wurde unter Verwendung von 50 ml Ethylacetat und durch 4-maliges Waschen mit 50 ml angesäuertem/gereinigtem Wasser vollendet. Wäßrige Anteile wurden mit 50 ml Ethylacetat gewaschen. Beide Ethylacetat-Anteile wurden vereinigt. Magnesiumsulfat wurde zur Entfernung von überschüssigem Wasser hinzugegeben. Die Proben wurden filtriert und unter Verwendung eines Roto Vap auf konzentriert, bis das Endvolumen ca. ein Drittel des ursprünglichen Volumens betrug. Die Kristallisation wurde unter Verwendung von Hexan vollendet. Hexan wurde abdekantiert und die Verbindung trocknen gelassen.

N-Fmoc-L-Alanin

1 g von jedem isotopenmarkierten Alanin (11,2 mmol) wurden in 15 ml gereinigtem Wasser und 1,2 g Natriumcarbonat gelöst (siehe Figur GP2). 15 ml 1,4-Dioxan wurden langsam zu jedem hinzugegeben und gerührt. Über einen Zeitraum von zweieinhalb Stunden wurden 3,8 g Fmoc-OSu (9-Fluorenylmethyl-N-hydroxysuccinimid) zu jedem hinzugegeben (siehe Figur GP3 als Schema). Zusätzliches gesättigtes Natriumcarbonat in Wasser wurde hinzugegeben, um einen pH = 10 aufrechtzuerhalten. Lösungen wurden über Nacht gerührt. 6 M HCl wurde langsam zur Lösung hinzugegeben, bis der pH ca. 2 betrug. Die Extraktion der Verbindung wurde unter Verwendung von zweimal 150 ml Ethylacetat und viermaliges Waschen mit 300 ml angesäuertem/gereinigtem Wasser vollendet. Magnesiumsulfat wurde zur Entfernung von überschüssigem Wasser hinzugegeben. Die Proben wurden filtriert und unter Verwendung eines Roto Vap auf konzentriert, bis das Endvolumen ca. ein Drittel des ursprünglichen Volumens betrug. Die Kristallisation wurde unter Verwendung von Hexan vollendet. Hexan wurde abdekantiert und die Verbindung trocknen gelassen.

Die Offenbarung der folgenden Literaturstellen wird hier in ihrer Gesamtheit durch Verweis eingeführt: E. Atherton und R. C. Sheppard (1989), Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. A. Bodanszky und M. Bodanszky (1984), The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin.

Beispiel 18 – Synthese von isotopenmarkierten Peptiden zur Analyse durch Massenspektrometrie, was ihre Verwendung in vier Codierungsansätzen zeigt

Fmoc-geschütztes Alanin, Serin und Lysin wurden von Bachem Bioscience erworben. Fmoc-Glycin wurde von Novabiochem erworben. Isotopenmarkierte Aminosäuren wurden von Cambridge Isotope Laboratories erworben und intern (GP) Fmoc-geschützt. Fmoc-Knorr-Linker wurden von Novabiochem erworben. Fmoc-3-(2-Nitrophenyl)-3-aminopropionsäure (ein photolabiles Verknüpfungsmittel) wurde Universal Organics erworben. Aminomethylpolystyrolharz (0,81 mmol/g) wurde von Advanced ChemTech erworben.

Die Linker wurden an einen festen Träger manuell in Reaktionsschüttlern (CM) angebracht. Das Harz wurde in 85 Reaktionsgefäße an einem Advanced ChemTech ACT496 MBS aufgespalten. Das Harz wurde mit 25% Piperidin/Dimethylformamid zweimal für 10 Minuten entschützt und dann sorgfältig mit Dimethylformamid gewaschen. Die ersten Aminosäuren wurden als 0,142 M Lösungen in N-Methylpyrrolidon mit einer PyBOP/Diisopropylethylamin-Aktivierung in situ für 1,5 h bei Raumtemperatur gekuppelt. Boc-Entschützen wurde mit 25% Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten durchgeführt. Acetylierungen wurden mit 33% Essigsäureanhydrid in Dimethylformamid für 30 Minuten durchgeführt. Alle Kupplungen wurden durch Ninhydrin-Farbtests verifiziert. Die Abspaltung vom Knorr-Linker wurde in 90% Trifluoressigsäure und jeweils 3% Wasser, Phenol und Thioanisol für 1,5 Stunden erreicht. Die Proben wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet, dann in Wasser gelöst und zweimal lyophilisiert. Die photolytische Spaltung wurde in 2 : 1 Wasser : Tetrahydrofuran unter einer UV-Lampe für 12 Stunden durchgeführt. Die Proben wurden einmal lyophilisiert.

Einzelpeak-Positionierungscode

Diese Anordnung wurde entwickelt, um 20 Proben mit spezifischen Singulett-Molekulargewichten zur positiven Identifizierung durch Massenspektroskopie zu erzeugen. Die Proben wurden in doppelter Ausführung zusammengebaut, ein Satz aus 20 an einem chemisch spaltbaren festen Träger, und der zweite Satz aus 20 an einem photolytisch spaltbaren Träger. Durch Verwendung einer Kombination aus einer oder zwei Aminosäuren wurde eine "Codierungsregion" vor der Addition des synthetischen Liganden erzeugt (in diesem Fall Acetyllysin). Die 20 Codes wurden aus den folgenden Aminosäuren konstruiert:

Glycin

Glycin (15N)

Glycin (2,2-D2)

Alanin

Alanin (15N)

Alanin (1–13C)

Serin

Nach dem Zusammenbau der Codierungsregion wurde Lysin als Testligand sowie zur Erzeugung einer freien Aminoseitenkette zur Erleichterung der Beobachtung durch Massenspektroskopie gekuppelt. Die &agr;-Amino-Gruppe des Lysins wurde dann acetyliert.

Die Codes und der Ligand wurden an Polystyrolharz zusammengesetzt, das mit entweder Fmoc-Knorr- oder Fmoc-3-(2-Nitrophenyl)-3-aminopropionsäure-Linkern funktionalisiert war.

Die Anordnung für den Einzelpeak-Positionierungscode ist nachfolgend gezeigt:

Figur 1
Doppelpeak-Positionscode

Diese Anordnung wurde geschaffen, um 20 Proben mit Dublettpeaks durch Massenspektroskopie zu erzeugen, wobei ein Peak aus dem an einen spezifischen Code angebrachten Liganden herrührt und ein zweiter Peak aus einem gleichzeitig zusammengesetzten Referenzpeak resultiert (Ligand plus ein fester Rest). Wie im obigen SPPC (Einzelpeak-Positionierungscode) beschrieben, wurde durch Verwendung einer Kombination aus einer oder zwei Aminosäuren eine "Codierungsregion" vor der Zugabe des synthetischen Liganden (in diesem Fall Acetyllysin) erzeugt. Die 20 Codes wurden ebenfalls aus den folgenden Aminosäuren konstruiert:

Glycin

Glycin (15N)

Glycin (2,2-D2)

Alanin

Alanin (15N)

Alanin (1–13C)

Serin

Die Codes und der Ligand wurden an Polystyrolharz zusammengesetzt, das mit Fmoc-Knorr- oder Fmoc-3-(2-Nitrophenyl)-3-aminopropionsäure-Linkern funktionalisiert war.

Die Anordnung für den Doppelpeak-Positionierungscode ist nachfolgend gezeigt:

Figur 2

In jeder der in diesem Experiment erzeugten Proben wird das oben gezeigte Peptid-Molekulargewicht überlagert mit dem durch Ac-Ls-Gly-NH2 erzeugten Referenzpeak auftreten. Dies ist zum Aufzeigen der Fähigkeit zur Identifizierung sowohl der ersten Reservoircharge als auch des durch den unbekannten Liganden erzeugten Molekülions.

Zur Erzeugung von Proben, die den codierten Doppelpeak zeigen, wurde ein orthogonales Schutzschema verwendet. Die erste Fmoc-geschützte Aminosäure der Codierungsregion wurde gleichzeitig mit einer äquimolaren Menge Boc-Glycin gekuppelt. Die Codierungsregion wurde unter Verwendung von Fmoc-Chemie zusammengesetzt, dann wurde die Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure entfernt. Nach einer letzten Entfernung der Code-Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin (was gleichzeitig TFA-Salze am exponierten Amin des Glycin neutralisierte) wurde der Ligand (Acetyllysin) gekuppelt. Nach photolytischer Spaltung wurden zwei Verbindungen in äquimolaren Mengen freigesetzt: der an eine Referenzaminosäure (Glycin) gebundene Ligand und der an einen spezifischen Code gebundene Ligand. Die Massendifferenz zwischen den zwei Peaks zeigt die Identität des Codes und damit die Identität des ersten Monomers des gekuppelten Liganden an.

Massenspektrum-Strichcode

Diese Anordnung wird 25 Proben erzeugen, die jeweils ein spezifisches Molekülion oder Peakmuster durch Massenspektroskopie zeigen. Unter Verwendung von allein Kombinationen aus isotopenmarkiertem Glycin an nur zwei Positionen werden 25 spezifische "Strichcodes" erzeugt. Auf diese Weise kann die erste Reservoircharge von jeder einzelnen Perle, die aus einer Split-Combine-Bibliothek stammt, leicht identifiziert werden.

In diesem Experiment wurden Fmoc-geschützte Aminosäuren entweder als diskrete oder äquimolare Mischungen aus zwei oder drei Aminosäuren gekuppelt. Die Anordnung für den Massenspektrum-Strichcode ist nachfolgend gezeigt;

Figur 3
Beispiel 19

4 g aminomethyliertes Polystyrol (0,81 mmol/g) wurden in jeden von zwei 250 ml-Schüttlern gegeben. Das Harz wurde mit Dimethylformamid (DMF) gequollen und abgegossen. Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin/DMF für ca. 3 Minuten gewaschen und abgegossen. Das Harz wurde dreimal mit DMF, einmal mit Dichlormethan (DCM ): DMF 1 : 1 und zweimal mehr mit DMF gewaschen.

Zum ersten Schüttler wurden 3,5 Äquivalente Knorr-Linker (6,12 g, 11,34 mmol) und 3,5 Äquivalente PyBop (5,9 g, 11,34 mmol) gegeben. Ausreichend DMF wurde hinzugegeben, um das Harzbett zu bedecken. Die Lösung wurde dann mit 10,5 Äquivalenten DIEA (5,93 ml, 34,02 mmol) aktiviert. Die Reaktion lief für 1 Stunde unter manuellem Schütteln alle 5–10 Minuten.

Zum zweiten Schüttler wurden 3,5 Äquivalente Photolinker (4,89 g, 11,34 mmol) und 3,5 Äquivalente PyBop (5,9 g, 11,34 mmol) gegeben. Ausreichend DMF wurde hinzugegeben, um das Harzbett zu bedecken. Die Lösung wurde dann mit 10,5 Äquivalenten DIEA (5,93 ml, 34,02 mmol) aktiviert. Die Reaktion lief für 1 Stunde unter manuellem Schütteln alle 5–10 min.

Nach 1 Stunde wurden beide Schüttler abgelassen. Ninhydrintests zeigten die vollständige Kupplung für beide Linker an. Das Harz wurde viermal mit DMF, einmal mit Dichlormethan (DCM) : DMF 1 : 1 und zwei weitere Male mit DMF gewaschen.

Das Harz wurde in einen Teflon-Reaktionsblock ACT 496 mit 96 Vertiefungen aufgespalten.

Beispiel 20 – Doppelpeak-Positionierungscode
Beispiel 21 – Verhältniscode unter Verwendung von tertiärem Amin

Die sieben Harzchargen (CDW 2) wurden in 10 ml-Schüttler unter Verwendung von Dimethylformamid (DMF) überführt. Die Schüttler wurden dann mit Aluminiumfolie abgedeckt. Der Linker war Fmoc, zweimal entschützt für jeweils 5 Minuten unter Verwendung von 20% Piperidin/DMF. Das Harz wurde viermal mit DMF, einmal mit Dichlormethan (DCM) : DMF 1 : 1 und zweimal mit DMF gewaschen.

0,315 ml von jeder von 7 Halogensäuren wurden in getrennte Fläschchen eingewogen, und eine äquimolare Menge von PyBop wurde zu jedem hinzugegeben. Die Halogensäuren wurden dann in 2 ml DMF gelöst. Jede Lösung wurde dann zur entsprechenden Harzcharge gegeben und mit 165 &mgr;l Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Kupplung lief für 1 Stunde. Nach der Kupplung wurden die Harze abgelassen und viermal mit DMF, einmal mit DCM : DMF 1 : 1 und zweimal mit DCM zur Trocknung des Harzes gewaschen.

0,315 mmol von jeder von sieben Halogensäuren wurden in getrennte Fläschchen eingewogen, und eine äquimolare Menge von HBTU wurde zu jedem hinzugegeben. Die Halogensäuren wurden dann in 2 ml DMF gelöst. Jede Lösung wurde dann zur entsprechenden Harzcharge gegeben und mit 165 &mgr;l DIEA aktiviert. Die Kupplung lief für 1 Stunde. Nach dem Kuppeln wurden die Harze abgelassen und viermal mit DMF, einmal mit DCM : DMF 1 : 1 und zweimal mit DMF gewaschen. Das Kuppeln war gemäß Ninhydrin vollständig.

Die Harzchargen wurden kombiniert und in 24 Vertiefungen eines Polypropylen-Reaktionsblocks ACT 396 mit 96 Vertiefungen aufgespalten. Das Harz wurde zweimal mit DCM gewaschen und getrocknet.

Das Harz wurde mit DMF gequollen und abgelassen. 1 ml von 1,0 M Aminlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Reaktion lief über Nacht. Das Harz wurde abgelassen und zweimal mit DMF, einmal mit DMF : Methanol : Wasser (1 : 1 : 1) und drei weitere Male mit DMF gewaschen. Die 24 Harzchargen wurden dann kombiniert und zurück in 24 Vertiefungen aufgespalten.

350 &mgr;l Aldehyd-Lösung (3,0 M/DMF) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 2 Minuten vermischt. Weitere 250 &mgr;l Trimethylorthoformiat wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 Minute vermischt, gefolgt von 100 &mgr;l 3% Essigsäure in DMF. Die Reaktion wurde für 15 Minuten vor einer letzten Zugabe von 1 ml 1,5 M NaBH3CN vermischt. Die reduktive Aminierungsreaktion lief für 3 Stunden. Das Harz wurde abgelassen und zweimal mit DMF gewaschen.

Eine zweite reduktive Aminierung erfolgte unter Verwendung von Natriumtriacetoxyborhydrid. 350 &mgr;l Aldehyd-Lösung (3,0 M/DMF) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 2 Minuten vermischt. Weitere 250 &mgr;l Trimethylorthoformiat wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 Minute vermischt, gefolgt von 100 &mgr;l 3% Essigsäure in DMF. Die Reaktion wurde für 15 Minuten vor einer letzten Zugabe von 1 ml 1,5 M NaBH(O2CCH3) vermischt. Die Reaktion lief über Nacht. Das Harz wurde abgelassen und zweimal mit DMF, dreimal mit DMF : Methanol : Wasser, dreimal mit DCM und drei letzte Male mit Methanol gewaschen.

Beispiel 22 – Einzelpeak-Positionierungscode mit photolabiler Spaltung
Beispiel 23 – Reaktionsdurchmusterung

Die Synthese eines Satzes von seriell codierten Harzen enthielt 192 Kombinationen aus isotopenmarkierten Aminosäuren (Glycin G0, G1, G2, G3 und Alanins A0, A1, A2 und A3), und sie waren durch Knorr-Linker wie nachfolgend gezeigt getrennt:

Die Reaktionsdurchmusterung wird am Ligandenteil des Moleküls durchgeführt, worin drei unterschiedliche Monomere zur Kupplung der primären Amine an Allylbromide sowie vier unterschiedliche Reaktionsbedingungen verwendet wurden, um insgesamt 12 Kombinationen zu ergeben. Die Acylierung von sekundären Aminen mit Carbonsäuren beinhaltete vier unterschiedliche Säuren und vier verschiedene Reaktionsbedingungen, um weitere 16 Kombinationen zu ergeben. Das Harz wurde vereinigt und mit 36 unterschiedlichen Bedingungen zur letzten intramolekularen Heck-Reaktion behandelt, um über 6900 potentielle Verbindungen zu ergeben, die unterschiedliche Monomere und Reaktionsbedingungen enthalten. Bei Einzelperlenabspaltung mit TFA/MeCl2 und 6% Triethylen werden sowohl der codierte Teil als auch der Ligand wie oben umrissen freigesetzt. Der Ligand wird ebenfalls durch das Einfügen von Glycin(0) und Glycin(2) codiert, um die Identifizierung der Ligandenpeaks im Massenspektrum zu unterstützen.

Die Massenspektren, die in 10 bis 12 gezeigt sind, enthalten sowohl den Code (544–562) als auch den Liganden (462 und 464), (504 und 506), (478 und 480). Die Monomere und Bedingungen, die für das besondere Massenspektrum verwendet wurden, sind im Spektrum aufgeführt.

Aus diesen Ergebnissen kann man den kombinatorischen Ansatz verwenden, um verschiedene Reaktionsbedingungen und Monomere an einer einzelnen Perle zu betrachten und sowohl den Code als auch den Liganden abzulesen, wenn das Material von der Perle abgespalten wird.

Beispiel 24 – Verhältniscode: IR-, NMR- und MS-Analyse

16 Harzproben wurden synthetisiert, worin R durch eine simultane Kupplung der Monomere 1 bis 3 in unterschiedlichen Verhältnismustern definiert wurde (Verhältnisse nachfolgend angegeben). Diese Harze konnten dann durch verschiedene Analysentechniken analysiert werden, um ihre Verhältnisidentität auszuwerten. Die Perlen wurden durch IR-, massenspektrometrische, NMR- und Aminosäureanalyse analysiert. Die für die simultane Kupplung erzeugten Verhältnisse sind als R1 : R2 : R3 definiert und waren für die 16 Proben wie folgt: Probe #1 – 1 : 1 : 5; Probe #2 – 1 : 2 : 5, Probe #3 – 1 : 3 : 5; Probe #4 – 1 : 4 : 5; Probe #5 – 2 : 1 : 5; Probe #6 – 2 : 2 : 5, Probe #7 – 2 : 3 : 5; Probe #8 – 2 : 4 : 5; Probe #9 – 3 : 1 : 5; Probe #10 – 3 : 2 : 5, Probe #11 – 3 : 3 : 5; Probe #12 – 3 : 4 : 5; Probe #13 – 4 : 1 : 5; Probe #14 – 4 : 2 : 5; Probe #15 – 4 : 3 : 5; Probe #16 – 4 : 4 : 5. Die Spektren für diese Verhältnisse sind in den begleitenden 18 bis 51 wie folgt gezeigt:

Beispiel 25 – Codierung von Styrol

Die Perlen selbst, die allgemein als feste Träger in der Festphasensynthese verwendet werden, können isotopendotiert werden. Styrolperlen, die Styrol umfassen, können leicht mit C13, F20 oder H2 dotiert werden. Zusätzlich ist es möglich, isotopendotierte Konstrukte mit Perlen zu kombinieren, die selbst mit einer oder mehreren aus einer Reihe von Monomeren codiert oder markiert wurden.

Styrol (Ms), 2-Fluorstyrol (M1), 3-Fluorstyrol (M2) und 4-Fluorstyrol (M3) wurden vor der Polymerisation de-inhibiert, indem sie durch eine Aluminiumoxid-Adsorptionssäule geleitet wurden. Der Initiator 2,2-Azobisisobutyronitril (AIBN) wurde durch Kristallisation aus Methanol gereinigt. Toluol Zur Spektroskopie wurde als Lösungsmittel in einer Radikalpolymerisation ohne weitere Reinigung verwendet.

Copolymerisation von Styrol und F-Styrol
Beispiel 26 – Codierung einer Peptoidbibliothek

Eine Bibliothek aus 1000 Komponenten, die aus drei Monomer-Positionen bestand, wurde geschaffen, um die Brauchbarkeit der Codierungsstrategie zu zeigen. Die Bibliothek wurde unter Verwendung der Split-Mix-Methodik ("Trennungs-Mischungs-Methodik") synthetisiert, um eine 10 × 10 × 10 – Bibliothek zu schaffen. Da das Split-Mix-Verfahren eine Verbindung pro Perle liefert und die Perlen zweimal während der Synthese vermischt werden, muß die Chemie oder Monomerzugabe in jedem Schritt auf der Perle aufgezeichnet werden, um die Verbindung zu decodieren.

Die erste Position wird durch Steuerung des Verhältnisses von 12C : 13C2 codiert, das mit Bromessigsäure im ersten Syntheseschritt eingeführt wird. Zehn spezifische Verhältnisse wurden mit 9%-Schritten im Bereich von 9 : 91 bis 90 : 10 eingesetzt. Die Verwendung von 9%-Schritten vermied die Endpunkte von entweder 0 : 100 oder 100 : 0, während insgesamt 10 Codes zugelassen wurden. Das dritte Monomer war bereits bekannt, weil die Bibliothek nach der Addition des letzten Monomers nicht rekombiniert wurde (nur ein Monomer aus Satz drei war in jedem Reservoir vorhanden). Diese Position war daher reservoir- oder räumlich codiert.

Die zweite Position wurde durch das Molekulargewicht der Verbindung codiert. Da Monomer 1 durch die Isotopenreaktion und Monomer 3 durch das letzte Reservoir bekannt ist, kann Monomer 2 unter Verwendung des Molekulargewichts berechnet werden, das durch das Massenspektrometer bestimmt wird. Dies stellt eine Beschränkung für jede Bibliothek dar: Die Monomere in der zweiten Position müssen unterschiedliche Molekulargewichte haben. Die anderen Monomere besitzen keine Einschränkungen. Für dieses Testbeispiel waren die letzten Reservoirs aus Verbindungen mit spezifischen Molekulargewichten zusammengesetzt, um die Decodierung zu erleichtern.

20 einzelne Perlen aus jedem der 10 Reservoirs wurden individuell abgespalten. Die Verbindungen wurden dann durch Massenspektrometrie analysiert und durch das Isotopenverhältnis und Molekulargewicht der analysierten Peaks identifiziert. Der aus dem protonierten, monoisotopischen Ion resultierende Peak wurde als M0H+ bezeichnet, während der aus dem diisotopischen Ion (M0H + 2)+ resultierende als M2H+ bezeichnet wurde. Die absichtliche Dotierung mit 13C2 steuerte die Intensität des M2H+-Peaks relativ zum M0H+-Peak.

Massenspektrumsdaten aus einer einzelnen Perle in Reservoir 3 zeigten, daß M0H+ und M2H+ 552 bzw. 554 waren. Das M0H+ : M2H+-Verhältnis wurde zu 10 : 90 berechnet, was relativ nahe am tatsächlichen Verhältnis für Ion 552 war, welches 9 : 91 war. Unter Verwendung von M0H+ als 550 und M2H+ als 552 betrug das berechnete M0H+ : M2H+-Verhältnis 56 : 44. Die Verbindung mit einem M0H+-Ion in Reservoir 2 hatte ein theoretisches Verhältnis von 54 : 56, erneut in sehr enger Übereinstimmung mit dem berechneten Verhältnis. In einigen Fällen können Nebenreaktionen, die an der Addition von Monomeren beteiligt sind, die Spektren kompliziert machen. Das nachfolgende Spektrum 2C zeigt das Massenspektrum einer einzelnen Perle aus Reservoir 1. Das Ion mit der höchsten Intensität im Spektrum liegt bei m/z 586. Jedoch stimmt das berechnete M0H+ : M2H+-Verhältnis (65 : 35) nicht mit dem bekannten Verhältnis für die Verbindung in Reservoir 1 mit M0H+ von 586 überein. Diese scheinbare Diskrepanz beruht auf der Addition des dritten Monomers für Reservoir 1, ein Nitril. Es ist bekannt, daß Nitrile unter sauren Bedingungen (Spaltungsbedingungen) zu einem Amid hydriert werden können. Bei der Zugabe von Wasser verschieben sich die Peaks für das M0H+-Ion bei 586 zu 586 (M0H+ + 18). Somit verifiziert das M0H+ : M2H+-Verhältnis für die Peaks bei 586 und 588 die Codierung für das Ion bei 568 (das seinen eigenen, schwächeren Satz von Peaks mit dem gleichen Verhältnis hat). Das bekannte Verhältnis für die Verbindung in Reservoir 1 mit einem M0H+-Ion von 568 beträgt 63 : 37, was mit dem berechneten Wert übereinstimmt. Diese besondere Hydratisierungsreaktion wurde für alle Verbindungen in Reservoir 1 beobachtet. Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit zur Decodierung von Verbindungen und zur Bestimmung von Nebenreaktionen, eine wirksame Steigerung gegenüber anderen Codierungsmethodiken, die sehr nützlich während der Entwicklung der Festphasenchemie wäre.

Beispiel 27 – Pseudocode-Programmauflistung für die computergestützte Detektion von isotopencodierten Verbindungen in einem Massenspektrum
  • 1. Eingabe der Molekülformel und der Isotopenverhältnisse für eine codierte Verbindung.
  • 2. Berechnung des monoisotopischen Molekulargewichts aus Schritt 1.
  • 3. Berechnung der theoretischen Isotopenverteilung aus Schritt 1.
  • 4. Öffnen der Massenspektrum-Ausgabedatei.
  • 5. Lokalisierung des monoisotopischen Molekulargewichts in der Massenspektrum-Ausgabedatei auf innerhalb +/– 0,3 AME und Überprüfung auf entsprechende Isotopenpeaks.
  • 6. Falls Schritt 5 erfolgreich war, Vergleichen der theoretischen Verteilung aus Schritt 3 mit den gemessenen Werten im Massenspektrum unter Verwendung eines Chi-Quadrat-Tests. Das Ergebnis des Chi-Quadrat-Tests bestimmt die Gegenwart oder Abwesenheit der codierten Verbindung.

Copyright 1996, Glaxo Wellcome, Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Diese Erfindung ist auf einem Macintosh-Computer oder einem IBM-PC-kompatiblen Computer mit den Betriebssystemen Windows 95, Windows NT oder Macintosh OS, der eine CPU, einen Hauptspeicher, Eingabe/Ausgabe-Einrichtungen und eine Benutzerschnittstelle einschließlich einer manuell bedienten Tastatur und Maus einschließt, ausführbar.


Anspruch[de]
  1. Nicht-chemisches Verfahren auf Massenbasis zur Aufzeichnung der Reaktionsgeschichte einer Reaktionsreihe an jedem einer Mehrzahl spezifischer fester Träger, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

    (a) in einer Massenblock-Insertionsstufe Umsetzen einer Mehrzahl von Massenmitteln, die jeweils eine spezifische definierte Masse besitzen, mit jeweils einer Gruppe der spezifischen festen Träger, so daß jede Gruppe der spezifischen festen Träger umgesetzt wurde mit einem Mittel mit definierter Masse, das verschieden von jedem anderen Mittel ist, das mit einer anderen der Gruppen der spezifischen festen Träger umgesetzt wurde;

    (b) Umsetzen einer jeden festen Trägergruppe mit unterschiedlichem definierten Massenmittel mit einem unterschiedlichen ersten chemischen Reagens;

    (c) Vermischen der Gruppen miteinander und anschließendes Unterteilen der Mehrzahl spezifischer fester Träger in eine Mehrzahl von Gruppen für eine zweite intermediäre oder letzte Stufe;

    (d) Wiederholen des Umsetzens mit einem chemischen Reagens wenigstens einmal, um eine Mehrzahl von Endprodukten bereitzustellen, wobei unterschiedliche Produkte an den unterschiedlichen individuellen spezifischen festen Trägern vorliegen; wobei die spezifischen definierten Massenmittel analysiert werden können und worin die Analyse die Wahl eines ersten chemischen Reagens definiert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Mehrzahl definierter Massenmittel molekulare Einheiten sind, die sich voneinander dadurch unterscheiden, daß wenigstens eines ihrer Atome durch ein unterschiedliches Isotop des Atoms ersetzt ist, vorausgesetzt, daß die chemische Strukturformel der definierten Massenmittel die gleiche ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Mehrzahl definierter Massenmittel molekulare Einheiten sind, die sich voneinander dadurch unterscheiden, daß sie wenigstens eine Isotopensubstitution an unterschiedlichen atomaren Positionen innerhalb des Moleküls aufweisen, vorausgesetzt, daß die chemische Strukturformel der definierten Massenmittel die gleiche ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Mehrzahl definierter Massenmittel sich gleichmäßig wiederholende molekulare Einheiten sind, die sich voneinander durch eine ganzzahlige Anzahl der sich wiederholenden molekularen Einheiten unterscheiden.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die definierten Massenmittel durch Massenspektroskopie analysiert werden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils einen spezifischen einzelnen Massenpeak bei Analyse durch Massenspektroskopie erzeugen.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils einen spezifischen doppelten Massenpeak bei Analyse durch Massenspektroskopie erzeugen.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils ein spezifisches Paar einzelner Massenpeaks bei Analyse durch Massenspektroskopie erzeugen.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils ein spezifisches Paar doppelter Massenpeaks bei Analyse durch Massenspektroskopie erzeugen.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils ein spezifisches Muster aus einem oder mehreren Massenpeaks erzeugen.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die spezifischen Peakmuster für jedes der definierten Massenmittel als ein maschinenlesbares Muster ausgedrückt werden können.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die maschinenlesbaren Muster Barcodes sind.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils unabhängig ein spezifisches massenspektrometrisches Massenpeakmuster erzeugen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus spezifischen einzelnen Massenpeaks, spezifischen doppelten Massenpeaks, spezifischen Paaren einzelner Massenpeaks, spezifischen Paaren doppelter Massenpeaks und spezifischen Peakmustern, die als maschinenlesbare Muster ausgedrückt werden können, besteht.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die definierten Massenmittel durch Kernspinnresonanzspektroskopie analysiert werden.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils ein spezifisches Muster aus einem oder mehreren Kernspinnresonanzpeaks erzeugen.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, worin die spezifischen Peakmuster für jedes der definierten Massenmittel als maschinenlesbares Muster ausgedrückt werden können.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, worin die maschinenlesbaren Muster Barcodes sind.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das definierte Massenmittel durch Infrarotspektroskopie oder durch Raman-Spektroskopie analysiert wird.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, worin die definierten Massenmittel so ausgewählt werden, daß sie jeweils ein spezifisches Muster aus einem oder mehreren Infrarotspektroskopie- oder Raman-Spektroskopiepeaks erzeugen.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin die spezifischen Peakmuster für jedes der definierten Massenmittel als maschinenlesbares Muster ausgedrückt werden können.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 20, worin die maschinenlesbaren Muster Barcodes sind.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das erste, zweite oder anschließende Reagens ein Substrat zur Bestimmung der Bindungsspezifität an eine interessierende chemische Verbindung ist.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die massenspektroskopische Analyse Massenpeaks liefert, die als Repräsentanten für kodierte Reagenzien erkannt werden können.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin zusätzlich Massenpeaks erzeugt werden, die als Kennungspeaks für die positive Identifizierung relevanter Massenpeaks dienen.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin wenigstens zwei Gruppen der spezifischen festen Träger bei jedem Umsetzen eingesetzt werden.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 1, das den zusätzlichen Schritt der Durchmusterung der Endprodukte an den spezifischen festen Trägern auf eine interessierende Eigenschaft und der Identifizierung der Reaktionsgeschichte wenigstens eines Endprodukts mit der interessierenden Eigenschaft umfaßt.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 1, das den zusätzlichen Schritt der Abspaltung der Endprodukte von den festen Trägern und der Durchmusterung der Endprodukte umfaßt.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Analyse automatisiert ist.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Reaktionsschritte automatisiert sind.
Es folgen 287 Blatt Zeichnungen






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