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Dokumentenidentifikation DE102004029340A1 24.02.2005
Titel Verfahren zur Herstellung von L-Threonin
Anmelder Degussa AG, 40474 Düsseldorf, DE
Erfinder Kruse, Daniela, Dr., 33602 Bielefeld, DE;
Hermann, Thomas, Dr., 33739 Bielefeld, DE;
Rieping, Mechthild, Dr., 33619 Bielefeld, DE;
Thierbach, Georg, Dr., 33613 Bielefeld, DE
DE-Anmeldedatum 17.06.2004
DE-Aktenzeichen 102004029340
Offenlegungstag 24.02.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.02.2005
IPC-Hauptklasse C12P 13/08
IPC-Nebenklasse C12N 15/52   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von L-Threonin produzierenden Bakterien der Familie Enterobacteriaceae.

Beschreibung[de]

Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae.

L-Threonin findet in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung.

Es ist bekannt, dass L-Threonin durch Fermentation von Stämmen der Familie der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli, hergestellt werden kann. Wegen der großen Bedeutung dieser Aminosäure wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z.B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z.B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z.B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen, d.h. die genetisch bedingten Leistungseigenschaften des Bakteriums selbst betreffen.

Es ist bekannt, dass Threonin durch Fermentation von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli, im Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) hergestellt werden kann. Im Satzverfahren werden alle Nährstoffe direkt zu Beginn der Fermentation vorgelegt. Im Zulaufverfahren wird ein Zusatz-Nährmedium der Kultur zugeführt. Dieser Zulauf kann direkt zu Beginn der Kultivierung oder nach Ablauf einer bestimmten Kultivierungszeit starten, beispielsweise dann wenn eine mit dem vorgelegten ersten Nährmedium eingebrachte Komponente verbraucht worden ist. Bei Fermentationsende wird der komplette Inhalt des Fermenters geerntet und das in der Fermentationsbrühe enthaltene Threonin isoliert und gereinigt oder anderweitig verarbeitet. Dieser Prozess ist beispielsweise in den Patentschriften US 5,538,873, EP-B-0593792, WO 01/4525 und bei Okamoto et al. (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 61 (11), 1877 – 1882, 1997) beschrieben.

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Threonin unter Verwendung von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli, ist in der Patentschrift US 6,562,601 beschrieben. Es besteht darin, dass das Bakterium zunächst nach dem Zulaufverfahren kultiviert wird, wobei sich Threonin in der Fermentationsbrühe anreichert. Zu einem gewünschten Zeitpunkt wird ein Teil, d.h. 10 bis 99% der im Fermenter enthaltenen Fermentationsbrühe geerntet. Der restliche Teil der Fermentationsbrühe verbleibt im Fermenter. Die im Fermentierbehälter verbleibende Fermentationsbrühe wird mit Nährmedium aufgefüllt und eine weitere Fermentation nach dem Zulaufverfahren durchgeführt Der beschriebene Zyklus wird gegebenenfalls mehrfach durchgeführt.

Bei einer anderen Art der Fermentation, der kontinuierlichen Fermentation oder Chemostat Kultivierung wird ein Nährmedium der Kultur kontinuierlich zugeführt, während Kulturbrühe kontinuierlich oder semi-kontinuierlich abgeführt wird, so dass das Volumen der Kulturbrühe im Fermenter in etwa konstant bleibt. Eine kontinuierliche Fermentation kann theoretisch unbegrenzt betrieben werden. Die Verlängerung der Fermentation hat einen signifikant positiven Effekt auf die Gesamtproduktivität eines Fermenters (durchschnittliche Menge an Produkt produziert pro Stunde), da der Einfluss der Zeit zwischen zwei Fermentationen auf die Gesamtproduktivität eines Fermenters reduziert wird.

Die industrielle Nutzung von kontinuierlichen Prozessen zur Herstellung von Aminosäuren ist nur vereinzelt beschrieben. Der Hauptgrund dafür liegt in der oft beobachteten Degeneration der Kultur. Aminosäuren werden häufig mit genetisch optimierten Mikroorganismen produziert, die auf hohe Substrat/Produkt Ausbeuten selektioniert wurden. Dabei haben sie im Gegensatz zu ihren Vorläufern häufig schlechtere Wachstumseigenschaften. Während einer lang andauernden Kultivierung kann eine Reversion zu weniger produzierenden Varianten auftreten. Dies führt zu einem Verlust der Produktivität der Kultur.

US 6,025,169 und FR 2669935 beschreiben, dass Aminosäuren durch aerobe Zulauf-/kontinuierliche oder kontinuierliche Kultivierung mit Zellrückführung von Mikroorganismen hergestellt werden können.

Im Abstract von JP62-289192 wird die Verbesserung eines kontinuierlichen Verfahrens zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren mit Corynebakterium glutamicum beschrieben. Verbesserungen wurden erzielt durch Variation der Kohlenstoffkonzentration in der zugeführten Nährlösung, der Rührergeschwindigkeit, des Redoxpotentials, der Sauerstoffkonzentration und der Belüftungsstärke.

In JP62-289192 betrifft einen kontinuierlichen Prozess für die fermentative Herstellung von Aminosäuren mit Aminosäure produzierenden Bakterien, in dem Prozess verbessert werden kann, wenn die Konzentration der Kohlenstoffquelle der kontinuierlich zugeführten Nährlösung über 10% und das Redoxpotential in der Kultur über –200 mV liegt. Es wird beschrieben, dass die Verwendung mehrerer Fermenter die Verwertung der Kohlenstoffquelle verbessern kann, wenn in der abgezogenen Kulturbrühe größere Mengen der Ausgangsstoffe zurückbleiben.

In JP60180598 (abstract) wird L-Threonin mit Brevibacterium lactofermentum in Satzfermentationen produziert. Am Ende der Fermentation werden die Zellen filtriert und in einer neuen Fermentation mit frischem Medium eingesetzt.

In EP-A-139592 wird ein zulaufverfahren beschrieben um Aminosäuren fermentativ herzustellen. Dabei wird aus dem Reaktor Kulturbrühe entnommen und die Zellen per Filtration unter Wachstumslimitierung abgetrennt und in den Prozess zurückgeführt.

In US 5,260,216 wird ein kontinuierlicher, fermentativer Prozess beschrieben, um Aminosäure mit Bakterien unter Zellrückführung herzustellen. Für die Zellseparation wird dem Reaktor kontinuierlich Kulturbrühe entnommen. Bevor die Bakterienzellen abgetrennt und in den Prozess zurückgeführt werden, werden Luftblasen aus der Kulturbrühe abgetrennt, um den Fließwiderstand der Flüssigkeiten in den Rohrleitungen zu erhöhen.

Kiyoshi Toda, 2003, Theoretical and methodological studies of continuous microbial bioreactors, J. Gen. Appl. Microbiol., 49, 219-233, beschreibt einen kontinuierlichen Tryptophan Prozess mit Zellrückführung. Im Vergleich zu einer Satzkultur, konnte, mit diesem Prozess, die Zellkonzentration um den Faktor 10 und die Produktionsrate von Tryptophan um den Faktor 0,57 erhöht werden,

Aufgabe der Erfindung

Es war Aufgabe dieser Erfindung, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

  • a) ein L-Threonin produzierendes Bakterium der Familie Enterobacteriaceae in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und kultiviert,
  • b) anschließend mindestens ein weiteres Nährmedium oder mehrere weitere Nährmedien in einem (F1) oder mehreren Zufütterungsströmen (F1+) der Kultur kontinuierlich zuführt, wobei das weitere Nährmedium oder die weiteren Nährmedien mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, unter Bedingungen die die Bildung von L-Threonin erlauben, und gleichzeitig der Kultur Kulturbrühe entsprechend der Summe des Entnahmestroms F2 plus des zellabgereicherten Entnahmestroms F3 oder entsprechend der Summe aus mehreren Entnahmeströmen (F2+) plus des zellabgereicherten Entnahmestroms F3 entnimmt, der oder die im wesentlichen dem Zufütterungsstrom F1 oder der Summe der Zufütterungsströme F1+ entspricht/entsprechen, wobei
  • c) die Zellen mit einem Rücklaufverhältnis, R, von größer als 0 und kleiner gleich 1 (0 < R ≤ 1) ganz oder teilweise durch entsprechende Verfahren aus dem oder den Entnahmeströmen F4 abgetrennt werden und in den Kultivierungsschritt b) zurückgeführt werden.

Hierbei sind wie in 1 dargestellt: F1 = ein erfindungsgemäßer Zufütterungsstrom von Nährmedium; F1+ = mehrere erfindungsgemäße Zufütterungsströme von Nährmedien; F2 = ein erfindungsgemäßer Entnahmestrom; F2+ = mehrere erfindungsgemäße Entnahmeströme; F3 = erfindungsgemäßer zellabgereicherter Entnahmestrom (= F4 – F5); F4 = ein oder mehrere Entnahmeströme zur Abtrennung von Zellen; und F5 = der teilweise zurückgeführte Entnahmestrom F4 (= F4 – F3).

Unter einem „zellabgereichertem Entnahmestrom" versteht man einen Entnahmestrom bei dem die Zellen (= Biomasse) der L-Threonin ausscheidenden Bakterien zumindest teilweise entnommen worden sind.

Erfindungsgemäß kann die Anlagenleistung eines L-Threonin produzierenden Fermenters dadurch gesteigert werden, dass man in dem oben beschriebenen ersten Schritt a) nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) kultiviert, wobei bei Verwendung des Zulaufverfahrens mindestens ein Zusatz-Nährmedium eingesetzt wird. In dem beschriebenen Schritt b) werden mindestens ein weiteres Nährmedium oder mehrere weitere Nährmedien in einem oder mehreren Zufütterungsströmen der Kultur kontinuierlich zugeführt und gleichzeitig wird der Kultur Kulturbrühe mit mindestens einem oder mehreren Entnahmeströmen entnommen, der oder die im wesentlichen dem Zufütterungsstrom oder der Summe der Zufütterungsströme entspricht/entsprechen.

Während des Schrittes b) werden in einem Schritt c) die in dem oder den Entnahmeströmen enthaltenen Zellen bzw. Biomasse mit einem Rücklaufverhältnis, R, von größer als 0 und kleiner gleich 1 (0 < R ≤ 1) ganz oder teilweise durch geeignete Verfahren aus dem oder den Entnahmeströmen F4 abgetrennt und in den Kultivierungsschritt b) zurückgeführt.

Unter dem Begriff Anlagenleistung versteht man, dass in einer Anlage (plant) wie z. B. einem Fermenter die Masse bzw. Menge eines Produktes z. B. L-Threonin mit einer bestimmten Ausbeute und mit einer bestimmten Geschwindigkeit bzw. Produktivität oder Raum-Zeit-Ausbeute hergestellt wird. Diese Parameter bestimmen weitgehend die Kosten bzw. die Wirtschaftlichkeit eines Verfahrens.

Als Rücklaufverhältnis, R, bezeichnet man das Verhältnis des erfindungsgemäßen zellabgereicherter Entnahmestroms bzw. des Flusses des biomasseabgereicherten Permeats oder Sedimenterüberlaufs (F3) zu den gesamten Zulaufströmen der Fermentation (F1 bzw. F1+). Bei R = 1 werden die Zellen komplett zurückgehalten und das Wachstum geht gegen Null, während R = 0 den normalen Chemostatbetrieb darstellt (Horst Chmiel, Bioprozesstechnik: Einführung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1991).

Erfindungsgemäß soll das Rücklaufverhältnis im Bereich von 0 < R ≤ 1 liegen, bevorzugt zwischen 0,1 < R ≤ 1, 0,2 < R ≤ 1, 0,3 < R ≤ 1, 0,4 < R ≤ 1, 0,5 < R ≤ 1, 0,6 < R ≤ 1, 0,7 < R ≤ 1, 0,8 < R ≤ 1, 0,9 < R ≤ 1.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Biomassekonzentrationen im Vergleich zu einem freien Kultursystem erhöht. Das heißt, bei Einsatz eines gleichen Mikroorganismus, werden erfindungsgemäß die Biomassekonzentrationen um mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20%, mindestens 25%, mindestens 30%, mindestens 50%, mindestens 80%, mindestens 100%, mindestens 150%, oder sogar um mindestens 200% oder mehr erhöht. Mit „freiem Kultursystem" ist ein Verfahren ohne Zellrückhaltung, also mit freiem Überlauf gemeint. Typischerweise bleibt die Biomassekonzentration in einem freien Kultursystem kleiner als 50 g/l, kleiner als 40 g/l, kleiner als 30 g/l oder gar kleiner als 20 g/l. Diese unterschiedlichen Biomassekonzentrationen in einem freien Kultursystem sind abhängig von den eingesetzten Mikroorganismen und den eingesetzten Verfahren.

Für die Zellabtrennung eignen sich Zentrifugen, Separatoren und Abscheider (nach Flockung) sowie Kreuzstrom-, Mikro- und Ultrafilter (Biotechnologie, von x. Weide, J. Páca und W. A. Knorre, Gustav Fischer Verlag, Jena, 1991). Die Zellabtrennung kann dabei in einem Schritt erfolgen, oder durch mehrere Separationsschritte, die beispielsweise sequentiell angeordnet sind. Die abgetrennte Biomasse wird anschließend in den Fermenter zurückgeführt.

Unter einer Kulturbrühe versteht man die durch die Kultivierung eines Mikroorganismus – im Falle der vorliegenden Erfindung ein L-Threonin produzierendes Bakterium – in einem Nährmedium unter Verwendung eines Fermenters oder Kulturgefäßes entstandene Suspension eines Mikroorganismus.

Während des Kultivierungsschrittes a) wird das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) kultiviert. Bei Verwendung des Zulaufverfahrens wird nach mehr als 0 bis maximal 10 Stunden, vorzugsweise nach 1 bis 10 Stunden, bevorzugt nach 2 bis 10 Stunden und besonders bevorzugt nach 3 bis 7 Stunden ein Zusatz-Nährmedium zugeführt.

Das erste Nährmedium enthält als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 1 bis 100 g/kg oder 1 bis 50 g/kg, bevorzugt von 10 bis 45 g/kg, besonders bevorzugt von 20 bis 40 g/kg. Unter Stärkehydrolysat versteht man erfindungsgemäß das Hydrolysat von Stärke aus Mais, Getreide, Kartoffeln oder Tapioka.

Als Stickstoffquelle im erste Nährmedium können organische, Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat Kaliumnitrat, Kaliumnatriumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 1 bis 40 g/kg, bevorzugt von 10 bis 30 g/kg, besonders bevorzugt von 10 bis 25 g/kg, ganz besonders bevorzugt 1 bis 30 g/kg oder 1 bis 25 verwendet werden.

Als Phosphorquelle im ersten Nährmedium können Phosphorsäure, Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure, insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze, Polymere der Phosphorsäure oder das Hexaphosphorsäureester des Inosits, auch Phytinsäure genannt, in den Konzentrationen von 0,1 bis 5 g/kg, bevorzugt von 0,3 bis 3 g/kg, besonders bevorzugt von 0,5 bis 1,5 g/kg verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Diese Substanzen liegen in den Konzentrationen von 0,003 bis 3 g/kg vor. Schließlich werden essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z.B. Homoserin) und Vitamine (z.B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden.

Das Zusatz-Nährmedium, welches in einem Zulaufverfahren (fed batch) angewandt wird, enthält im Allgemeinen ledighich als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 300 bis 700 g/kg, bevorzugt von 400 bis 650 g/kg, und gegebenenfalls eine anorganische Stickstoffquelle wie z.B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat. Alternativ können diese und andere Komponenten auch separat zugefüttert werden.

Es wurde gefunden, dass bei der kontinuierlichen Kultivierung gemäß Schritt b) die Bestandteile des weiteren Nährmediums in Form eines einzigen weiteren Nährmediums sowie in einer Vielzahl von weiteren Nährmedien der Kultur zugeführt werden können. Erfindungsgemäß wird das weitere Nährmedium beziehungsweise werden die weiteren Nährmedien in mindestens einem (1) Zufütterungsstrom oder in einer Vielzahl an Zufütterungsströmen mindestens 2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 7 oder 2 bis 5 Zufütterungsströmen der Kultur zugeführt.

Der Begriff „kontinuierlich" bedeutet, dass der Zufütterungsstrom bzw. die Zufütterungsströme im wesentlichen ununterbrochen erfolgt. Das heißt, dass mit höchstens kurzen, einzelnen Pausen der Kultur Nährmedium bzw. Nährmedien hinzugefügt wird/werden. Die einzelnen Unterbrechungen oder Pausen betragen bis zu maximal 0,5, maximal 1, maximal 2 oder maximal 3 Stunden. Die Summe der einzelnen Unterbrechungen bzw. Pausen bei der Kultivierung gemäß Schritt b) beträgt maximal 10%, maximal 8%, maximal 6%, maximal 4%, maximal 2% oder maximal 1% der Gesamtzeit der Kultivierung gemäß Schritt b).

Das weitere Nährmedium bzw. die weiteren Nährmedien enthält/enthalten als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 20 bis 700 g/kg, bevorzugt von 50 biso 650 g/kg.

Weiterhin enthält das weitere Nährmedium bzw. enthalten die weiteren Nährmedien eine Stickstoffquelle bestehend aus organischen, Stickstoff-haltigen Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat und/oder Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 5 bis 50 g/kg, bevorzugt von 10 bis 40 g/kg, verwendet werden.

Weiterhin enthält das weitere Nährmedium bzw. enthalten die weiteren Nährmedien eine Phosphorquelle bestehend aus Phosphorsäure oder den Alkali- oder Erdalkalisalzen der Phosphorsäure, insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natriumhaltigen Salze, Polymere der Phosphorsäure oder das Hexaphosphorsäureester des Inosits auch Phytinsäure genannt bzw, die entsprechenden Alkali- oder Erdalkalisalze.. Die Phosphorquellen können einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 0,3 bis 3 g/kg, bevorzugt von 0,5 bis 2 g/kg verwendet werden. Das weitere Nährmedium bzw. die weiteren Nährmedien muss/müssen weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind, in den Konzentrationen von 0,003 bis 3 g/kg, bevorzugt in den Konzentrationen von 0,008 bis 2 g/kg. Schließlich werden essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z.B. Homoserin) und Vitamine (z.B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden.

Bei Verwendung eines einzigen weiteren Nährmediums wird dieses typischerweise in einem Zufütterungsstrom der Kultur zugeführt. Bei Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien werden diese in einer entsprechenden Vielzahl an Zufütterungsströmen zugeführt. Bei der Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien ist zu beachten, dass diese jeweils nur eine der beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-, oder Phosphorquellen enthalten können, aber auch eine Mischung von den beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-, oder Phosphorquellen.

Erfindungsgemäß wird das zugeführte Nährmedium oder die zugeführten Nährmedien so eingestellt, das ein Phosphor zu Kohlenstoffverhältnis (P/C Verhältnis) von maximal 4; von maximal 3; von maximal 2; von maximal 1,5; von maximal 1; von maximal 0,7; von maximal 0,5; maximal 0,48; maximal 0,46; maximal 0,44; maximal 0,42; maximal 0,40; maximal 0,38; maximal 0,36; maximal 0,34; maximal 0,32; maximal 0,30 mmol Phosphor/mol Kohlenstoff besteht.

Der Zufütterungsstrom oder die Summe der Zufütterungsströme in dem erfindungsgemäßen Verfahren werden mit einer Geschwindigkeit entsprechend einer mittleren Verweilzeit von kleiner als 30 Stunden, bevorzugt kleiner als 25, ganz besonders bevorzugt kleiner als 20 Stunden hinzugeführt. Dabei ist die mittlere Verweilzeit (residence time) die theoretische Zeit, die Teilchen in einer kontinuierlich betriebenen Kultur verbleiben. Die mittlere Verweilzeit wird beschrieben durch das Verhältnis des Flüssigkeitsvolumens des Reaktors und der Durchflussmenge (Biotechnologie; H. Weide, J. Páca und W. A. Knorre; Gustav Fischer Verlag Jena; 1991).

Starkes Wachstum zu Beginn der Kultivierung gemäß Schritt (a) ist normalerweise eine logarithmische Wachstumsphase. Der logarithmischen Wachstumsphase folgt im Allgemeinen eine Phase von geringerem Zellwachstum als in der logarithmischen Phase.

Nach 10 bis 72 Stunden, vorzugsweise 15 bis 48 Stunden, bzw. während oder nach der logarithmischen Wachstumsphase wird wie oben beschrieben mindestens ein weiteres Nährmedium oder mehrere weitere Nährmedien in einem oder mehreren Zufütterungsströmen der Kultur kontinuierlich zugeführt und gleichzeitig der Kultur Kulturbrühe mit einem oder mehreren Entnahmeströmen entnommen, der oder die im wesentlichen dem Zufütterungsstrom oder der Summe der Zufütterungsströme entspricht/entsprechen und wobei die Zellen mit einem Rücklaufverhältnis, R, von größer als 0 und kleiner gleich 1 (0 < R ≤ 1) ganz oder teilweise aus dem oder den Entnahmeströmen F4 abgetrennt und in den Kultivierungsschritt b) zurückgeführt werden.

Im wesentlichen bedeutet hier, dass die Summe des Entnahmestroms F2 plus F3 oder die Summe der Entnahmeströme F2+ plus F3 80% – 120%, 90% – 110% oder 95% – 105% des zufütterungsstroms F1 oder der Summe der Zufütterungsströme F1+ entspricht. Die Entnahme kann durch Abpumpen und oder durch Ablassen der Kulturbrühe technisch realisiert werden.

Erfindungsgemäß wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung gemäß Schritt c) und/oder d) im Allgemeinen bei maximal 30 g/l, bei maximal 20 g/l, bei maximal 10 g/l, bevorzugt bei maximal 5 g/l, besonders bevorzugt maximal 2 g/l eingestellt. Diese Konzentration wird mindestens während 75%, bevorzugt mindestens während 85%, besonders bevorzugt während mindestens 95% der Zeit der Kultivierung gemäß Schritt b) und/ oder c) aufrechterhalten. Dabei wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle anhand von Methoden bestimmt, die Stand der Technik sind. &bgr;-D-Glukose wird z.B. in einem Glukoseanalysator YSI 02700 Select der Firma Yellow Springs Instruments (Yellow Springs, Ohio, USA) bestimmt.

1 ist ein Diagramm, dass Zufütterungs- bzw. die Entnahme- und Rücklaufströme eines erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt. In dieser 1 bedeuten: F1 = ein erfindungsgemäßer Zufütterungsstrom von Nährmedium; F1+ = mehrere erfindungsgemäße Zufütterungsströme von Nährmedien; F2 = ein erfindungsgemäßer Entnahmestrom; F2+ = mehrere erfindungsgemäße Entnahmeströme; F3 = erfindungsgemäßer zellabgereicherter Entnahmestrom (= F4 – F5); F4 = ein oder mehrere Entnahmeströme zur Abtrennung von Zellen; und F5 = der teilweise zurückgeführte Entnahmestrom F4 (= F4 – F3).

Wie 1 zeigt, werden erfindungsgemäß Zellen mit einem Rücklaufverhältnis, R, von 0 < R ≤ 1 ganz oder teilweise durch entsprechende Verfahren aus dem Entnahmestrom (F4) abgetrennt und als F5 in den Kultivierungsschritt (b) zurückgeführt. Dieses Rücklaufverhältnis ist gleichbedeutend mit einer Rückführung von größer als 0% bis zu einschließlich 100% der abgeführten Zellen bzw. Biomasse, bevorzugt von 10% bis zu einschließlich 100%, von 20% bis zu einschließlich 100%, von 30% bis zu einschließlich 100%, von 40% bis zu einschließlich 100%, von 50% bis zu einschließlich 100%, von 60% bis zu einschließlich 100%, von 70% bis zu einschließlich 100%, von 80% bis zu einschließlich 100%, oder von 90% bis zu einschließlich 100%.

Die Zellabtrennung kann dabei bspw. durch Mikro- oder Ultrafiltration in einem Schritt erfolgen, oder durch verschiedene Zentrifugations- oder Separationsschritte sequentiell. Erfolgt die Abtrennung der Biomasse in einem Schritt zu 100% kann ein Teil der zurückgehaltenen Biomasse wieder in das Kulturgefäß/den Fermenter zurückgeführt werden und zwar entsprechend einem Rücklaufverhältnis R, von 0 < R ≤ 1. Bei sequentieller Abtrennung der Biomasse, beispielsweise durch sequentielle Zentrifugationsschritte oder sequentielle Sedimentationsschritte, kann das Rücklaufverhältnis R dadurch bestimmt werden, dass eine bestimmte Fraktion des Zentrifugats rückgeführt wird. Weiterhin können bestimmte Fraktionen miteinander gemischt werden, um ein gewünschtes Rücklaufverhältnis einzustellen.

Die Einstellung des Rücklaufverhältnisses erfolgt durch Bestimmung der Biomassekonzentration im Kulturgefäß bzw. Fermenter und/oder durch Bestimmung der Biomassekonzentration im Rücklauf. Die Bestimmung der Biomassekonzentration erfolgt durch die üblicherweise angewandten Techniken, wie z.B. Auszählen des Zelltiters in einer geeichten Zählkammer, cytometrisch mit oder ohne Anfärbung der Zellen, Bestimmung der optischen Dichte der Kultur oder durch Bestimmung der Biotrockenmasse. Die Auszählung der Zelltiters kann aber auch automatisiert erfolgen, indem beispielsweise die Biomassekonzentration in einer Filtrat- oder Zentrifugatstufe durch optische Methoden wie Photometrie oder Cytometrie bestimmt wird, oder indem physikalische Methoden wie etwa die Bestimmung der Leitfähigkeit oder die Absorption von Strahlung des nahen Infrarot- oder mittleren Infrarot-Bereiches herangezogen wird.

Gegebenenfalls kann die entnommene Kulturbrühe mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas versehen werden bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle unter 2 g/l; unter 1 g/l; oder unter 0,5 g/l sinkt.

In einem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt die Ausbeute mindestens 31%, mindestens 33%, mindestens 35%, mindestens 37%, mindestens 38%, mindestens 40%, mindestens 42%, mindestens 44%, mindestens 46% oder mindestens 48%. Dabei ist die Ausbeute definiert als das Verhältnis von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Menge an L-Threonin zu der Gesamtmenge der eingesetzten oder verbrauchten Kohlenstoffquelle.

In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von mindestens 1,5 bis 2,5 g/l pro Std., von mindestens 2,5 bis 3,5 g/l pro Std., von mindestens 2,5 bis mehr als 3,5 g/l pro Std., von mindestens 3,5 bis 5,0 g/l pro Std., von mindestens 3,5 bis mehr als 5,0 g/l pro Std., oder von mindestens 5,0 bis 8,0 g/l pro Std. oder mehr wie beispielsweise mindestens 9 g/l pro Std. Std. gebildet. Dabei ist die Raum-Zeit-Ausbeute definiert als das Verhältnis von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Threoninmenge zu dem Volumen der Kultur über den gesamten Zeitraum der Kultivierung gesehen. Die Raum-Zeit-Ausbeute wird auch volumetrische Produktivität genannt.

Naturgemäß wird bei einem Fermentationsverfahren wie dem erfindungsgemäßen das Produkt mit einer bestimmten Ausbeute und mit einer bestimmten Raum-Zeit-Ausbeute (volumetrische Produktivität) hergestellt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann L-Threonin mit einer Ausbeute von mindestens 31% und einer Raum-Zeit-Ausbeute von mindestens 1,5 bis 2,5 g/l pro Std. hergestellt werden. Weitere Kopplungen von Ausbeute mit Raum-Zeit-Ausbeute wie beispielsweise eine Ausbeute von mindestens 37% und eine Raum-Zeit-Ausbeute von mindestens 2,5 g/l pro. Std. ergeben sich zwanglos aus den obigen Ausführungen.

Die Kultivierung in den Schritten a) und b) erfolgt unter Bedingungen die die Bildung von L-Threonin erlauben Während der Kultivierung wird die Temperatur in einem Bereich von 29 bis 42°C, vorzugsweise von 33 bis 40°C, eingestellt. Die Kultivierung kann bei Normaldruck oder gegebenenfalls bei Überdruck, vorzugsweise bei 0 bis 1,5 bar Überdruck durchgeführt werden. Der Sauerstoffpartialdruck wird auf 5 bis 50%, vorzugsweise ca. 20%, Luftsättigung geregelt. Dabei wird die Kultur gerührt und mit Sauerstoff versorgt. Die Regelung des pH-Wertes auf pH ca. 6 bis 8, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 kann mit 25%igem Ammoniakwasser erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wenigstens ca. 72 Stunden vorzugsweise 100 bis ≥ 300 Stunden besonders bevorzugt 200 bis ≥ 300 Stunden betrieben. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Volumen der Kultur mindestens ein halbes Mal, mindestens 1 Mal, mindestens 2 Mal, mindestens 3 Mal, mindestens 4 Mal, mindestens 6 Mal, mindestens 8 Mal, mindestens 10 Mal, mindestens 12 Mal ausgetauscht.

Aus der entnommenen Kulturbrühe kann das L-Threonin gewonnen, gesammelt oder konzentriert und gegebenenfalls gereinigt werden.

Es ist ebenfalls möglich aus der entnommenen Kulturbrühe (= Fermentationsbrühe) ein Produkt herzustellen, indem man die in der Kulturbrühe enthaltene Biomasse des Bakteriums vollständig (1000 oder nahezu vollständig d.h. mehr als oder größer als (>)90%, >95%, >97%, >99% entfernt und die übrigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend d.h. zu 30% – 100%, 40% – 100%, 50% – 100%, 60% – 100%, 70% – 100%, 80% – 100%, oder 90% – 100%, bevorzugt größer gleich (≥)50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥0% oder ≥95% oder auch vollständig (1000 im Produkt belässt.

Zur Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung oder eine Kombination hieraus eingesetzt.

Die erhaltene Brühe wird anschließend mit bekannten Methoden wie beispielsweise mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder einer Kombination hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert.

Diese aufkonzentrierte Brühe wird anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen Pulver aufgearbeitet. Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Das Wasser wird hierbei insgesamt zu mehr als 90% entfernt, sodass der Wassergehalt im Produkt kleiner als 10%, kleiner als 5% beträgt.

Die angegebenen Verfahrensschritte müssen nicht notwendigerweise in der hier aufgeführten Reihenfolge durchgeführt sondern können gegebenenfalls in technisch sinnvoller Weise kombiniert werden.

Die Analyse von L-Threonin und anderen Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190–1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind L-Threonin produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia geeignet. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.

Die Bakterien enthalten mindestens eine Kopie eines thrA-Gens oder Allels, das für eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I kodiert. In der Literatur wird in diesem Zusammenhang auch von „feed back" resistenten oder auch von desensibilisierten Varianten gesprochen. Derartige Bakterien sind typischerweise resistent gegen das Threoninanalogon &agr;-Amino-&bgr;-Hydroxyvaleriansäure (AHV) (Shiio und Nakamori, Agricultural and Biological Chemistry 33 (8), 1152–1160 (1969)). Biochemische Untersuchungen zu „feed back" resistenten Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I Varianten sind beispielsweise bei Cohen et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 19(4), 546–550 (1965)) und bei Omori et al. (Journal of Bacteriology 175(3), 785–794 (1993)) beschrieben. Gegebenenfalls wird die Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I überexprimiert.

Methoden der Überexpression sind im Stand der Technik hinlänglich – beispielsweise bei Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512–538 (1996)) – beschrieben. Durch Verwendung von Vektoren wird die Kopienzahl um mindestens eine (1) Kopie erhöht. Als Vektoren können Plasmide wie beispielsweise in der US 5,538,873 beschrieben verwendet werden. Als Vektoren können ebenfalls Phagen, beispielsweise der Phage Mu, wie in der EP 0 332 448 beschrieben, oder der Phage lambda (&lgr;) verwendet werden. Eine Erhöhung der Kopienzahl kann auch dadurch erzielt werden, dass eine weitere Kopie in eine weitere Stelle des Chromosoms – beispielsweise in die attsite des Phagen &lgr; (Yu und Court, Gene 223, 77–81 (1998)) – eingebaut wird. In der US 5,939,307 wird beschrieben, dass durch Einbau von Expressionskassetten oder Promotoren wie beispielsweise tac-Promotor, trp-Promotor, lpp-Promotor oder PL-Promotor und PR-Promotor des Phagen &lgr; stromaufwärts des chromosomalen Threoninoperons eine Erhöhung der Expression erzielt werden konnte. In gleicher Weise können die Promotoren des Phagen T7, die gear-box-Promotoren oder der nar-Promotor verwendet werden. Derartige Expressionskassetten oder Promotoren können auch verwendet werden um, wie in der EP 0 593 792 beschrieben, plasmidgebundene Gene zu überexprimieren. Durch Verwendung des lacIQ-Allels lässt sich wiederum die Expression plasmidgebundener Gene kontrollieren (Glascock und Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Durch Entfernung des Attenuators des Threonin-Operons (Park et al., Biotechnology Letters 24, 1815–1819 (2002)) oder durch Verwendung der thr79-20 Mutation (Gardner, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76(4), 1706-1710 (1979)) oder durch Mutation des für die Threonyl-t-RNA-Synthetase kodierenden thrS-Gens wie bei Johnson et al. (Journal of Bacteriology 129(1), 66–70 (1977) beschrieben kann ebenfalls eine Überexpression erzielt werden. Durch die beschriebenen Maßnahmen wird die intrazelluläre Konzentration der jeweiligen Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I Proteinvariante um mindestens 10% im Vergleich zum Ausgangsstamm erhöht.

Ein geeignetes thrA-Allel ist in der US 4,278,765 beschrieben und in Form des Stammes MG442 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) unter der Zugangsnummer CMIM B-1628 erhältlich. Andere geeignete thrA-Allele sind in der WO 00/09660 und WO 00/09661 beschrieben und bei dem Korean Culture Centre of Microorganisms (KCCM, Seoul, Korea) unter den Zugangsnummern KCCM 10132 und KCCM 10133 erhältlich. Ein weiteres geeignetes thrA-Allel ist in dem Stamm H-4581 vorhanden, der in der US 4,996,147 beschrieben und unter der Zugangsnummer Ferm BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) erhältlich ist. Schließlich sind weitere thrA-Allele in der US 3,580,810 beschrieben, welche in Form der bei der ATCC hinterlegten Stämme ATCC 21277 und ATCC 21278 erhältlich sind. Ein weiteres Allel ist in der US 3,622,453 beschrieben und in Form des Stammes KY8284 unter der Zugangsnummer ATCC 21272 bei der ATCC erhältlich. Darüber hinaus ist in der WO 02/064808 ein weiteres thrA-Allel beschrieben und in Form von Stamm pGmTN-PPC12 unter der Zugangsnummer KCCM 10236 bei der KCCM hinterlegt.

Gegebenenfalls können thrA-Allele, die für „feed back" resistente Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I Varianten kodieren, mit den hinlänglich bekannten Methoden der konventionellen Mutagenese von Zellen unter Verwendung von mutagenen Stoffen beispielsweise N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (MNNG) oder Ethylmethansulfonat (EMS) oder mutagenen Strahlen beispielsweise UV-Strahlen und anschließender Selektion von Threoninanaloga (beispielsweise AHV) resistenten Varianten isoliert werden. Derartige Mutagenesemethoden sind beispielsweise bei Shiio und Nakamori (Agricultural and Biological Chemistry 33 (8), 1152–1160 (1969)) oder bei Saint-Girons und Margerita (Molecular and General Genetics 162, 101–107 (1978)) oder in dem bekannten Handbuch von J. H. Miller (A Short Course In Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1992) insbesondere auf den Seiten 135 bis 156 beschrieben. Shiio und Nakamori behandeln beispielsweise eine Zellsuspension von Escherichia coli für ca. 15 Minuten mit 0,5 mg/ml MNNG in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer von pH 7 bei Raumtemperatur (d. h. im Allgemeinen ca. 16 bis 26°C) zur Erzeugung von Mutationen. Miller empfiehlt beispielsweise eine Behandlung für 5 bis 60 Minuten mit 30 &mgr;l EMS pro 2 ml Zellsuspension in 0,1 M TRIS-Puffer bei pH 7,5 bei einer Temperatur von 37°C. Diese Mutagenesebedingungen können in naheliegender Weise abgeändert werden. Die Selektion von AHV-resistenten Mutanten erfolgt auf Minimalalgar, der typischerweise 2 bis 10 mM AHV enthält. Die entsprechenden Allele können anschließend kloniert und einer Sequenzbestimmung und die von diesen Allelen kodierten Proteinvarianten einer Aktivitätsbestimmung unterzogen werden. Gegebenenfalls können die erzeugten Mutanten auch direkt verwendet werden. Das Wort „direkt" bedeutet, dass die erzeugte Mutante für die Herstellung von L-Threonin in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann oder dass an dieser Mutante weitere Veränderungen zur Erhöhung der Leistungseigenschaften, wie beispielsweise Abschwächung des Threoninabbaus oder Überexpression des Threoninoperons durchgeführt werden können.

In gleicher Weise können auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben sind. Entsprechende Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits" wie beispielsweise der von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3–4 (1996)) beschriebene „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene (La Jolla, USA) verfügbar.

Diese Mutagenesemethoden können naturgemäß auch auf andere Gene, Allele oder Stämme beziehungsweise Fragestellungen und Aufgaben, wie beispielsweise der Erzeugung und Isolierung von Mutanten, die gegenüber L-Threonin resistent sind, angewendet werden.

Bevorzugt werden solche thrA-Allele, die für Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I Varianten kodieren, die in Gegenwart von 10 mM L-Threonin mindestens 40%, mindestens 45%, mindestens 50%, mindestens 55% oder mindestens 60%, der Homoserin-Dehydrogenase Aktivität und/oder die in Gegenwart von 1 mM L-Threonin mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 75% oder mindestens 80%, der Homoserin-Dehydrogenase Aktivität im Vergleich zur Aktivität in Abwesenheit von L-Threonin aufweisen. Gegebenenfalls beträgt die Aspartatkinase-Aktivität der genannten Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I Varianten in Gegenwart von 10 mM L-Threonin mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75% bis oder mindestens 80% der Aktivität in Abwesenheit von L-Threonin.

Darüber hinaus sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor, ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor enthalten. Die amber-Mutation liegt vorzugsweise an der Position 33 entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Genproduktes. Als amber-Suppressor wird vorzugsweise supE eingesetzt. Diese Bakterien sind in PCT/EP02/02055 beschrieben. Ein Stamm, der die beschriebene Mutation im rpoS-Gen und den Suppressor supE enthält, ist unter der Zugangsnummer DSM 15189 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) erhältlich.

Die Nukleotidsequenz des rpoS-Gens kann dem Stand der Technik entnommen werden. Die Nukleotidsequenz des rpoS-Gens entsprechend der Accession No. AE000358 ist als SEQ ID NO. 1 dargestellt. Die Aminosäuresequenz des dazugehörigen RpoS-Genproduktes bzw. Proteins ist in der SEQ ID NO. 2 dargestellt. Die Nukleotidsequenz eines rpoS-Allels, das ein Stopkodon vom Typ amber an der Stelle der Nukleotidsequenz entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS-Genproduktes bzw. Proteins, entsprechend SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 2, enthält, ist in SEQ ID NO. 3 wiedergegeben. Der Suppressor supE ist im Stand der Technik beschrieben und als SEQ ID NO. 4 dargestellt.

Darüber hinaus sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen bzw. als Stickstoffquelle zu verwerten. Unter aeroben Kulturbedingungen versteht man solche, bei denen der Sauerstoffpartialdruck in der Fermentationskultur während 90%, bevorzugt 95%, ganz besonders bevorzugt 99% der Fermentationsdauer größer (>) 0% beträgt. Ein derartiger Stamm ist beispielsweise der von Okamoto (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61(11), 1877–1882 (1997)) beschriebene Stamm KY10935. Stämme, die nicht in der Lage sind Threonin unter Stickstoffabspaltung abzubauen, besitzen im Allgemeinen eine abgeschwächte vom tdh-Gen kodierte Threonin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.103). Das Enzym wurde von Aronson et al. (The Journal of Biological Chemistry 264(9), 5226–5232 (1989)) beschrieben. Abgeschwächte tdh-Gene sind beispielsweise bei Ravnikar und Somerville (Journal of Bacteriology, 1986, 168(1), 434–436), in der US 5,705,371, in der WO 02/26993 und bei Komatsubara (Bioprocess Technology 19, 467-484 (1994)) beschrieben.

Ein geeignetes tdh-Allel ist in der US 5,538,873 beschrieben und in Form des Stammes B-3996 unter der Zugangsnummer 1876 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) erhältlich. Ein weiteres tdh-Allel ist in der US 5,939,307 beschrieben und in Form des Stammes kat-13 unter der Zugangsnummer NRRL B-21593 bei der Agriculture Research Service Patent Culture Collection (Peoria, Illinois, USA) erhältlich. Schließlich ist ein tdh-Allel in der WO 02/26993 beschrieben und in Form des Stammes TH21.97 unter der Zugangsnummer NRRL B-30318 bei der NRRL hinterlegt. Das für eine defekte Threonin Dehydrogenase kodierende Allel tdh-1::cat1212 ist beim E. coli Genetic Stock Center (New Haven, Conn., USA) unter der Zugangsnummer CGSC 6945 erhältlich.

Darüber hinaus sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit („leaky"-Phänotyp) besitzen, welche durch Gabe von L-Isoleucin in einer Konzentration von mindestens 10, 20 oder 50 mg/l oder L-Threonin in einer Konzentration von mindestens 50, 100 oder 500 mg/l kompensierbar ist.

Unter Bedürftigkeit bzw. Auxotrophie versteht man im Allgemeinen die Tatsache, dass ein Stamm infolge einer Mutation eine Wildtypfunktion beispielsweise eine Enzymaktivität vollständig verloren hat und zum Wachstum die Zugabe eines Supplementes beispielsweise eine Aminosäure benötigt. Von partieller Bedürftigkeit oder partieller Auxotrophie spricht man dann, wenn infolge einer Mutation eine Wildtypfunktion beispielsweise die Aktivität eines Enzyms aus dem Biosyntheseweg einer Aminosäure beeinträchtigt beziehungsweise abgeschwächt aber nicht vollständig ausgeschaltet ist. Stämme mit partieller Bedürftigkeit besitzen in Abwesenheit des Supplementes typischerweise eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte, d.h. größer (>) 0% und kleiner (<) 90%, 50%, 25% oder 10% Wachstumsgeschwindigkeit. In der Literatur wird dieser Zusammenhang auch als „leaky"-Phänotyp oder „leakyness" bezeichnet (Griffiths et al.: An Introduction to Genetic Analysis. 6th edition, 1996, Freeman and Company, New York, USA).

Ein Stamm mit einer derartigen partiellen Isoleucin-Bedürftigkeit ist beispielsweise in der WO 01/14525 beschrieben und in Form des Stammes DSM9906 unter der Zugangsnummer KCCM 10168 bei der KCCM hinterlegt. Threonin ausscheidende bzw. produzierende Stämme mit einer Isoleucin-Bedürftigkeit besitzen im Allgemeinen eine abgeschwächte vom ilvA-Gen kodierte Threonin-Deaminase (E.C. Nummer 4.3.1.19). Die Threonin-Deaminase ist auch unter dem Namen Threonin-Dehydratase bekannt. Ein abgeschwächtes ilvA-Gen, das eine partielle Isoleucin-Auxotrophie bewirkt, ist beispielsweise in der US 4,278,765 beschrieben und in Form des Stammes MG442, hinterlegt unter der Zugangsnummer B-1682, bei der VKPM erhältlich.

Ein weiteres abgeschwächtes ilvA-Gen ist beispielsweise in der WO 00109660 beschrieben und in Form des Stammes DSM 9807, hinterlegt unter der Zugangsnummer KCCM-10132, bei der KCCM erhältlich. Weitere abgeschwächte ilvA-Gene sind bei Komatsubara (Bioprocess Technology 19, 467-484 (1994)) beschrieben.

Die Aminosäuresequenz einer geeigneten und neuen Threonin-Deaminase besteht beispielsweise in der Sequenz von SEQ ID NO. 6 wobei an Position 286 jede Aminosäure außer Glutaminsäure enthalten sein kann. Bevorzugt wird der Austausch Glutaminsäure gegen Lysin (E286K).

Mit dem Begriff „Aminosäure" sind insbesondere die proteinogenen L-Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin gemeint.

In SEQ ID NO. 8 ist die Aminosäuresequenz einer Threonin-Deaminase angegeben, die an Position 286 die Aminosäure Lysin enthält; die dazugehörige Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO. 7 dargestellt. Diese enthält an Position 856 die Nukleobase Adenin.

Eine andere geeignete Threonin-Deaminase ist die von Lee et al. (Journal of Bacteriology 185 (18), 5442–5451 (2003)) beschriebene Variante, bei der an Position 97 Serin gegen Phenylalanin (S97F) ausgetauscht ist. Weitere geeignete Threonin-Deaminasen sind die von Fischer und Eisenstein (Journal of Bacteriology 175 (20), 6605–6613 (1993)) beschriebenen Varianten, welche mindestens einen der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: Austausch von Asparagin an Position 46 gegen Asparaginsäure (N46D), Austausch von Alanin an Position 66 gegen Valin (A66V), Austausch von Prolin an Position 156 gegen Serin (P156S), Austausch von Glycin an Position 248 gegen Cystein (G248C) und Austausch von Asparaginsäure an Position 266 gegen Tyrosin (D266Y) besitzen.

Durch Insertions- oder Deletions-Mutagenese von mindestens einem Basenpaar beziehungsweise Nukleotid oder durch Insertion oder Deletion von mindestens einem Kodon in der Kodierregion oder durch Einbau eines Stopkodons durch Transitions- oder Transversions-Mutagenese in die Kodierregion des ilvA-Gens lassen sich Allele isolieren, bei denen die Expression des ilvA-Gens im Allgemeinen vollständig ausgeschaltet ist. Diese Methode ist auch auf andere Gene, Allele oder offene Leserahmen wie beispielsweise das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen übertragbar.

Darüber hinaus sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die in ihrem Wachstum resistent gegenüber der Hemmung durch L-Threonin und/ oder L-Homoserin sind. Threonin-resistente Stämme und deren Herstellung sind beispielsweise bei Astaurova et al. (Prikladnaya Biokhimia Microbiologiya (1985), 21(5), 485 als englische Übersetzung: Applied Biochemistry and Microbiology (1986), 21, 485–490)) beschrieben. Die von Austaurova beschrieben Mutante ist gegenüber 40 mg/ml L-Threonin resistent. Weiterhin ist beispielsweise in der US 5,175,107 der Stamm 472T23 beschrieben, der in Gegenwart von 5 mg/ml L-Threonin wachsen kann und gleichzeitig resistent gegen L-Homoserin ist. Der Stamm 472T232 ist unter der Zugangsnummer BKIIM B-2307 bei der VKPM und unter der Nummer ATCC 9801 bei der ATCC erhältlich. Weiterhin ist in der WO 00/09660 der Stamm DSM 9807 beschrieben, der auf einem festen Nährboden wachsen kann, welcher 7% L-Threonin enthält. Der Stamm DSM 9807 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10132 bei der KCCM erhältlich. Schließlich ist in der WO 01/14525 der Stamm DSM 9906 beschrieben, der in einem Medium wachsen kann, das 60% bis 70% einer L-Threonin-Fermentationsmutterlauge (L-threonine fermentation mother liquid) enthält. Der Stamm DSM 9906 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10168 bei der KCCM erhältlich.

Es ist bekannt (siehe EP 0994 190 A2 und Livshits et al. (Research in Microbiology 154, 123–135 (2003)), dass durch Verstärkung des rhtA-Gens Resistenz gegenüber L-Threonin und L-Homoserin hervorgerufen wird. Die Verstärkung kann durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens oder durch Einsatz der rhtA23-Mutation erzielt werden.

In der EP 0 994 190 A2 wird beschrieben, dass die Verstärkung des rhtB-Gens Resistenz gegenüber L-Homoserin und L-Threonin, insbesondere gegen L-Homoserin bewirkt und die Threoninproduktion verbessert. Durch Überexpression des RhtB-Genproduktes in einem als N99 bezeichneten Stamm konnte die minimale Hemmkonzentration von 250 &mgr;g/ml auf 30000 &mgr;g/ml gesteigert werden.

In der EP 1 013 765 A1 wird beschrieben, dass eine Verstärkung des rhtC-Gens Resistenz gegenüber L-Threonin hervorruft und die Threoninproduktion verbessert. Als resistent gegenüber L-Threonin wird ein Stamm bezeichnet, der in Gegenwart einer Konzentration von mindestens 30 mg/ml L-Threonin auf einem Minimalagar wachsen kann. Es wird weiterhin beschrieben, dass eine Verstärkung des rhtB-Gens Resistenz gegenüber L-Homoserin bewirkt und die Threoninproduktion verbessert. Als resistent gegenüber L-Homoserin wird ein Stamm bezeichnet, der in Gegenwart einer Konzentration von mindestens 5 mg/ml L-Homoserin auf einem Minimalagar wachsen kann. In der genannten Patentanmeldung werden Stämme beschrieben, die resistent gegenüber 10 mg/ml L-Homoserin und resistent gegenüber 50 mg/ml L-Threonin sind. In der US 4,996,147 wird der Stamm H-4581 beschrieben, der gegen 15 g/l Homoserin resistent ist. Der Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich.

In der EP 1 016 710 A2 wird beschrieben, dass eine Verstärkung des offenen Leserahmen bzw. Gens yfiK oder yeaS Resistenz gegenüber L-Threonin und L-Homoserin bewirkt. Durch Überexpression des YfiK-Genproduktes in einem als TG1 bezeichneten Stamm konnte die minimale Hemmkonzentration bezüglich L-Homoserin von 500 &mgr;g/ml auf 1000 &mgr;g/ml und bezüglich L-Threonin von 30000 &mgr;g/ml auf 40000 &mgr;g/ml gesteigert werden. Durch Überexpression des YeaS-Genproduktes konnte die minimale Hemmkonzentration bezüglich L-Homoserin von 500 &mgr;g/ml auf 1000 &mgr;g/ml und bezüglich L-Threonin von 30000 &mgr;g/ml auf 50000 &mgr;g/ml gesteigert werden. In der genannten Patentanmeldung wird weiterhin gezeigt, dass durch überexpression des YfiK-Genproduktes die Threoninproduktion verbessert wird.

Gemäß diesen technischen Anleitungen werden Stämme hergestellt die in Gegenwart von ≥ (mindestens) ≥ 5 g/l, ≥ 10, ≥ 20 g/l, ≥ 30 g/l, ≥ 40 g/l, ≥ 50 g/l, ≥ 60 g/l und ≥ 70 g/l L-Threonin wachsen können, d. h. gegenüber L-Threonin resistent sind, und für die Herstellung von L-Threonin in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind insbesondere Stämme geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:

  • a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I, welche gegebenenfalls überexprimiert vorliegt, und gegebenenfalls
  • b) ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor, ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind außerdem insbesondere Stämme geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:

  • a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I, welche gegebenenfalls überexprimiert vorliegt,
  • b) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,
  • c) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und
  • d) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind ganz besonders Stämme geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:

  • a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I, welche gegebenenfalls überexprimiert vorliegt,
  • b) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,
  • c) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit,
  • e) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin, und
  • f) ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor, ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor,.

Darüber hinaus können die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Bakterien weiterhin eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen:

  • • Abschwächung der vom pckA-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase) wie beispielsweise in der WO 02/29080 beschrieben,
  • • Abschwächung der vom pgi-Gen kodierten Phoshoglucose-Isomerase (Froman et al. Molecular and General Genetics 217(1):126-31 (1989)).
  • • Abschwächung des vom offenen Leserahmens ytfP kodierten YtfP-Genproduktes wie beispielsweise in der WO 02/29080 beschrieben,
  • • Abschwächung des vom offenen Leserahmen yjfA kodierten YjfA-Genproduktes wie beispielsweise in der WO 02/29080 beschrieben,
  • • Abschwächung der vom poxB-Gen kodierten Pruvat-Oxidase wie beispielsweise in der WO 02/36797 beschrieben,
  • • Abschwächung des vom offenen Leserahmen yjgF kodierten YjgF-Genproduktes wie beispielsweise in der PCT/EP03/14271 beschrieben. Der yjgF-Orf von Escherichia coli ist von Wasinger VC. und Humphery-Smith I. (FEMS Microbiology Letters 169(2): 375–382 (1998)), Volz K. (Protein Science 8(11): 2428–2437 (1999)) und Parsons et al. (Biochemistry 42(1): 80–89 (2003)) beschrieben worden. Die dazugehörigen Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000495 in öffentlichen Datenbanken verfügbar. Der besseren Übersichtlichkeit halber sind diese als SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10 dargestellt.
  • • Verstärkung der von den Genen pntA und pntB kodierten Transhydrogenase wie beispielsweise in der EP 0 733 712 A1 beschrieben,
  • • Verstärkung der von dem pps-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Synthase wie beispielsweise in der EP 0 877 090 A1 beschrieben,
  • • Verstärkung der vom ppc-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wie beispielsweise in der EP 0 723 011 A1 beschrieben, und
  • • Verstärkung des vom rseB-Gen kodierten Regulators RseB wie beispielsweise in der EP 1382685 beschrieben. Der Regulator RseB ist von Missiakas et al. (Molecular Microbiology 24(2), 355–371 (1997)), De Las Penas et al. (Molecular Microbiology 24(2): 373–385 (1997)) und Collinet et al. (Journal of Biological Chemistry 275(43): 33898–33904 (2000)) beschrieben worden. Die dazugehörigen Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000343 in öffentlichen Datenbanken verfügbar.
  • • Verstärkung des vom galP-Gen kodierten Galaktose-Proton Symporter's (= Galaktose-Permease) wie beispielsweise in der DE 10314618.0 beschrieben. Das galP-Gen und seine Funktion sind von Macpherson et al. (The Journal of Biological Chemistry 258(7): 4390–4396 (1983)) und Venter et al. (The Biochemical Journal 363(Pt 2): 243-252 (2002)) beschrieben worden. Die dazugehörigen Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000377 in öffentlichen Datenbanken verfügbar.
  • • Fähigkeit Saccharose als Kohlenstoffquelle verwenden zu können. Genetische Determinanten zur Saccharoseverwertung sind im Stand der Technik beispielsweise in der FR-A-2559781, bei Debabov (In: Proceedings of the IV International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982. Kodansha Ltd, Tokyo, Japan, p 254-258), Smith and Parsell (Journal of General Microbiology 87, 129–140 (1975)) und Livshits et al. (In: Conference on Metabolic Bacterial Plasmids. Tartusk University Press, Tallin, Estland (1982), p 132-134 und 144-146) und in der US 5,705,371 beschrieben. Die genetischen Determinanten zur Saccharoseverwertung des von Smith und Parsell beschriebenen Stammes H155 wurden durch Konjugation in eine gegen Nalidixinsäure resistente Mutante von Escherichia coli K-12 überführt und die entsprechende Transkonjugante am 16. März 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) als DSM 16293 hinterlegt. Genetische Determinanten zur Saccharoseverwertung sind ebenfalls in dem in der US 5,631,157 beschriebenen Stamm 472T23 enthalten, der bei der ATCC unter Bezeichnung ATCC 9801 erhältlich ist. Eine weitere genetische Determinante zur Saccharoseverwertung wurde von Bockmann et al. (Molecular and General Genetics 235, 22–32 (1992)) beschrieben und ist unter der Bezeichnung csc-System bekannt.
  • • Verstärkung des vom offenen Leserahmen yedA kodierten YedA-Genproduktes wie beispielsweise in der WO 03/044191 beschrieben.
  • • Wachstum in Gegenwart mindestens 0,1 bis 0,5 mM oder mindestens 0,5 bis 1 mM Borrelidin (Borrelidinresistenz) wie in US 5,939,307 beschrieben. Der gegen Borrelidin resistente Stamm kat-13 ist unter der Zugangsnummer NRRL B-21593 bei der NRRL erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 2 bis 2,5 g/l oder mindestens 2,5 bis 3 g/l Diaminobernsteinsäure (Diaminobernsteinsäure Resistenz) wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen Diaminobernsteinsäure resistente Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 30 bis 40 mM oder mindestens 40 bis 50 mM &agr;-Methylserin (&agr;-Methylserin Resistenz) wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen &agr;-Methylserin resistente Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von höchstens 30 mM oder höchstens 40 mM oder höchstens 50 mM Fluorobrenztraubensäure (Fluorobrenztraubensäure Sensitivität) wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen Fluorobrenztraubensäure sensitive Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 210 mM oder mindestens 240 mM oder mindestens 270 mM oder mindestens 300 mM L-Glutaminsäure (Glutaminsäure Resistenz) wie in WO 00/09660 beschrieben. Der gegen Glutaminsäure resistente Stamm DSM 9807 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10132 beider KCCM erhältlich.
  • • Eine mindestens partielle Bedürftigkeit für Methionin. Ein Stamm mit einer mindestens partiellen Methionin Bedürftigkeit ist beispielsweise der in der US 5,017,483 beschriebene Stamm H-4257, der unter der Zugangsnummer FERM BP-984 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich ist. Durch Zugabe von mindestens 25, 50 oder 100 mg/l L-Methionin ist die Bedürftigkeit kompensierbar.
  • • Eine mindestens partielle Bedürftigkeit für m-Diaminopimelinsäure. Ein Stamm mit einer mindestens partiellen m-Diaminopimelinsäure Bedürftigkeit ist beispielsweise der in der US 5,017,483 beschriebene Stamm H-4257, der unter der Zugangsnummer FERM BP-984 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich ist. Durch Zugabe von mindestens 25, 50 oder 100 mg/l m-Diaminopimelinsäure ist die Bedürftigkeit kompensierbar.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 100 mg/l Rifampicin (Rifampicin Resistenz) wie in US 4,996,147 beschrieben. Der gegen Rifampicin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Lysin (Lysin Resistenz) wie in US 4,996,147 beschrieben. Der gegen L-Lysin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 15 g/l Methionin (Methionin Resistenz) wie in US 4,996,147 beschrieben. Der gegen Methionin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich.
  • • Wachstum in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Asparaginsäure (Asparaginsäure Resistenz) wie in US 4,996,147 beschrieben. Der gegen L-Asparaginsäure resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology erhältlich.
  • • Verstärkung der vom pyc-Gen kodierten Pyruvat-Carboxylase. Geeignete pyc-Gene bzw. Allele sind beispielsweise die von Corynebacterium glutamicum (WO 99/18228, WO 00/39305 und WO 02/31158), Rhizobium etli (US 6,455,284), Bacillus subtilis (EP 1092776). Gegebenfalls kann auch das pyc-Gen von weiteren Mikrorganismen verwendet werden, die endogen eine Pyruvat-Carboxylase enthalten, wie beispielsweise Methanobacterium thermoautotrophicum oder Pseudomonas fluorescens.

Bei Verwendung Saccharose-haltiger Nährmedien werden die Stämme mit genetischen Determinanten zur Saccharoseverwertung ausgerüstet.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des offenen Leserahmens, Gens oder Allels bzw. der offenen Leserahmen, Gene oder Allele um mindestens eine (1) Kopie erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Bei den Maßnahmen der Verstärkung und auch bei den Maßnahmen der Abschwächung wird die Verwendung endogener Gene, Allele oder offener Leserahmen im Allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder offene Leserahmen oder Allele beziehungsweise Nukleotidsequenzen.

Bei Verwendung von Plasmiden zur Erhöhung der Kopienzahl werden diese gegebenenfalls stabilisiert durch einen oder mehreren der genetischen Orte (Loci) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem parB Locus des Plasmides R1 beschrieben von Rasmussen et al. (Molecular and General Genetics 209 (1), 122–128 (1987)), Gerdes et al. (Molecular Microbiology 4 (11), 1807–1818 (1990)) und Thistedt und Gerdes (Journal of Molecular Biology 223 (1), 41–54 (1992)), dem f1m Locus des F Plasmids beschrieben von Loh et al. (Gene 66 (2), 259–268 (1988)), dem par Locus des Plasmids pSC101 beschrieben von Miller et al. (Gene 24 (2-3), 309–315 (1983), dem cer Locus des Plasmids ColE1 beschrieben von Leung et al. (DNA 4 (5), 351–355 (1985), dem par Locus des Plasmids RK2 beschrieben von Sobecky et al. (Journal of Bacteriology 178 (7), 2086–2093 (1996)) und Roberts and Helinsky (Journal of Bacteriology 174 (24), 8119–8132 (1992)), dem par Locus des Plasmids RP4 beschrieben von Eber1 et al. (Molecular Microbiology 12 (1), 131–141 (1994)) and dem parA Locus des Plasmids R1 beschrieben von Gerdes and Molin (Journal of Molecular Biology 190 (3), 269–279 (1986)), Dam and Gerdes (Journal of Molecular Biology 236 (5), 1289–1298 (1994)) and Jensen et al (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95 (15), 8550-8555 (1998).

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins oder Enzyms im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen oder funktionellen Eigenschaften der Enzyme oder Proteine erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

So kann beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene um mindestens eine (1) erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder einen offenen Leserahmen oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym bzw. Protein oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins oder Enzyms im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%, 0 bis 5% oder 0 bis 1% oder 0 bis 0,1% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression der Gene oder offenen Leserahmen oder die katalytischen oder funktionellen Eigenschaften der Enzyme oder Proteine herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191–195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159–164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung beziehungsweise Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511–5515 (1998)), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)) genannt.

Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservativen Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%, 0 bis 5% 0 bis 1% oder 0 bis 0,1% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stop-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität beziehungsweise Funktion.

Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Stämme sind unter anderem der in der US 5,175,107 beschriebene Stamm BKIIM B-3996, der in der WO 00/09660 beschriebene Stamm KCCM-10132 und Isoleucin bedürftige Mutanten des in der WO 98/04715 beschriebenen Stammes kat-13 geeignet. Gegebenenfalls können Stämme mit den genannten Maßnahmen, beispielsweise durch Einbau eines Stopkodons in das rpoS-Gen, beispielsweise eines amber-Kodons an die Stelle entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins und gleichzeitigem Einbau eines korrespondierenden t-RNA-Suppressors beispielsweise supE oder durch andere Maßnahmen wie beispielsweise Überexpression des thrA-Allels, Abschwächung des unter aeroben Kulturbedingungen stattfindenden Threoninabbaus, Einführung einer mindestens partiellen Isoleucin-Bedürftigkeit bewirkenden Mutation in das ilvA-Gen oder Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin an das erfindungsgemäße Verfahren adaptiert werden.

Die genannten Eigenschaften beziehungsweise Merkmale können durch Transformation, Transduktion oder Konjugation in gewünschte Stämme übertragen werden.

Bei der Methode der Transformation wird isoliertes genetisches Material typischerweise DNA in einen Empfängerstamm eingeführt. Bei Bakterien der Familie Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia coli wird die DNA dazu in vitro in Plasmid- oder Phagen-DNA eingebaut und diese dann in den Empfängerstamm überführt. Die entsprechenden Methoden und Arbeitsvorschriften sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt und beispielsweise im Handbuch von J. Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) ausführlich beschrieben.

Mit Hilfe der Methode des Gen- bzw. Allelaustauschs unter Verwendung konditional replizierender Plasmide können definierte Mutationen in geeignete Stämme transferiert werden. Bei einer definierten Mutation ist mindestens die Position im Chromosom, vorzugsweise die exakte Position der Veränderung der Nukleobase(n) und die Art der Änderung (Substitution, d.h. Transition oder Transversion, Insertion oder Deletion) bekannt. Gegebenenfalls wird die entsprechende DNA zunächst mit gebräuchlichen Methoden sequenziert. Eine gebräuchliche Methode zur Erzielung eines Gen- bzw. eines Allelaustauschs ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)) beschriebene, bei der das temperatursensitiv replizierende pSC101-Derivat pMAK705 verwendet wird. Mit dieser Methode können Allele vom Plasmid in das Chromosom überführt werden. In gleicher Weise können chromosomale Allele auf das Plasmid überführt werden. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181: 7143–7148 (1999)), die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842-847 (2000)) oder die in der WO 01/77345 beschriebene Methode können gleichfalls benutzt werden.

Diese Methode kann unter anderem eingesetzt werden, um rpoS-Allele, die beispielsweise Stop-Kodons enthalten, Suppressorgene wie beispielsweise supE, abgeschwächte tdh-Allele, die beispielsweise Deletionen enthalten, abgeschwächte ilvA-Allele, thrA-Allele, die für „feed back" resistente Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I Varianten kodieren, die rhtA23-Mutation, abgeschwächte pck-Allele, abgeschwächte Allele des ytfP-ORF`s, abgeschwächte yjfA-ORF's, abgeschwächte poxB-Allele, abgeschwächte yjgF-ORF's in gewünschte Stämme einzufügen.

Bei der Methode der Transduktion wird ein genetisches Merkmal von einem Donorstamm unter Verwendung eines Bacteriophagen in einen Empfängerstamm übertragen. Diese Methode gehört zum Stand der Technik und ist in Lehrbüchern wie beispielsweise dem von E. A. Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed., Springer Verlag, New York, USA, 2000) beschrieben.

Bei Escherichia coli wird typischerweise der Bacteriophage P1 für die generalisierte Transduktion (generalized transduction) (Lennox, Virology 1, 190–206 (1955) verwendet. Eine Zusammenfassung über die Methode der generalisierten Transduktion gibt der Aufsatz „Generalized Transduktion" von M. Masters, der im Lehrbuch von F. C. Neidhard (Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., ASM Press, Washington, DC, USA, 1996) enthalten ist. Praktische Anleitungen sind beispielsweise im Handbuch von J. H. Miller (A Short Course In Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1992) oder dem Handbuch von P. Gerhardt „Manual of Methods for General Bacteriology" (American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) enthalten.

Mit Hilfe der Transduktion lassen sich Resistenz vermittelnde oder andere dominante genetische Eigenschaften wie beispielsweise Antibiotika-Resistenz (zum Beispiel Kanamycin-Resistenz, Chloramphenicol-Resistenz, Rifampicin-Resistenz oder Borrelidin-Resistenz), Resistenz gegen Antimetabolite (zum Beispiel &agr;-Amino-R-Hydroxyvaleriansäure-Resistenz, &agr;-Methyl-Serin-Resistenz oder Diaminobernsteinsäure-Resistenz), Resistenz gegen Metabolite (zum Beispiel Threonin-Resistenz, Homoserin-Resistenz, Glutaminsäure-Resistenz, Methionin-Resistenz, Lysin-Resistenz oder Asparaginsäure-Resistenz) oder auch die Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung in geeignete Empfängerstämme übertragen.

Die Methode der Transduktion ist ebenfalls geeignet um sogenannte nicht selektierbare genetische Eigenschaften wie beispielsweise Aminosäure-Auxotrophien bzw. Bedürftigkeiten (zum Beispiel Isoleucin-Bedürftigkeit, Methionin-Bedürftigkeit oder m-Diaminopimelinsäure-Bedürftigkeit), Vitamin-Bedürftigkeiten oder Sensitivität gegen Antimetabolite (zum Beispiel Fluorobrenztraubensäure-Sensitivität) in Empfängerstämme einzuführen. Hierzu verwendet man E. coli Stämme, die in einem Abstand von ungefähr einer Minute auf dem Chromosom das Transposon Tn10 oder Tn10kan enthalten. Diese Stämme sind unter dem Begriff „Singer Kollektion" oder „Singer/Gross Kollektion" bekannt (Singer et al., Microbiological Reviews 53, 1–24, 1989). Diese Stämme sind beim E. coli Genetic Stock Center der Universität Yale (New Haven, CT, USA) allgemein verfügbar. Weitere Angaben findet man in dem Aufsatz von M. K. B. Berlyn et al. "Linkage Map of Escherichia coli K-12, Edition 9", der im Lehrbuch von F. C. Neidhard (Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., ASM Press, Washington, DC, USA, 1996) enthalten ist. In ähnlicher Weise lassen sich nicht direkt selektierbare genetische Eigenschaften (zum Beispiel Fluorobrenztraubensäure-Sensitivität, Suppressormutationen) und auch solche, deren Mutationsort nicht bekannt ist, in verschiedene Stämme übertragen. Anleitungen hierzu findet man unter anderem in dem Lehrbuch von J. Scaife et al. (Genetics of Bacteria, Academic Press, London, UK, 1985), in dem oben erwähnten Aufsatz von M. Masters und in dem oben erwähnten Handbuch von J. H. Miller. Das mit dem Transposon Tn10 eingeführte Tetrazyklin-Resistenzgen kann gegebenenfalls mit der von Bochner et al. (Journal of Bacteriology 143, 926–933 (1980)) beschriebenen Methode wieder entfernt werden.

Bei der Methode Konjugation wird genetisches Material durch Zell-Zell Kontakt von einem Donor in einen Empfänger übertragen. Der konjugative Transfer des F-Faktors (F: feritility), der konjugative Gentransfer unter Verwendung von Hfr-Stämmen (Hfr: high frequency of recombination) und Stämmen, die einen F'-Faktor (F': F prime) tragen, gehören zu den klassischen Verfahren der Genetik. Zusammenfassende Darstellungen findet man unter anderem in dem Standardwerk von F. C. Neidhard (Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., ASM Press, Washington, DC, USA, 1996). Praktische Anleitungen sind beispielsweise im Handbuch von J. H. Miller (A Short Course In Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1992) oder dem Handbuch von P. Gerhardt „Manual of Methods for General Bacteriology" (American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) enthalten. F-, F' und Hfr-Stämme sind beim E. coli Genetic Stock Center der Universität Yale (New Haven, CT, USA) allgemein verfügbar.

Die Methode der Konjugation wurde beispielsweise eingesetzt, um die von Theze und Saint-Girons (Journal of Bacteriology 118, 990–998 (1974)) beschriebene Mutation thrC1010 in den Stamm MG442 (Debabov, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, 113–136 (2003) zu transferieren. Im Stand der Technik beispielsweise bei Schmid et al. (Journal of Bacteriology 151, 68–76 (1982)) oder Smith und Parsell (Journal of General Microbiology 87, 129–140 (1975)) und Livshits et al. (In: Conference on Metabolic Bacterial Plasmids. Tartusk University Press, Tallin, Estland (1982), p 132–134 und 144–146) sind konjugative Plasmide beschrieben, die die Fähigkeit zur Saccharoseverwertung tragen. So berichtet Debabov (In: Proceedings of the IVth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982. Kodansha Ltd, Tokyo, Japan, p 254–258) von der Konstruktion Threonin produzierender Stämme, in die mit Hilfe der Konjugation die Fähigkeit zur Saccharoseverwertung eingebaut wurde.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von L-Threonin produzierenden Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, dadurch gekennzeichnet, dass man

    a) das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und kultiviert,

    b) anschließend mindestens ein weiteres Nährmedium oder weitere Nährmedien in einem (F1) oder mehreren Zufütterungsströmen (F1+) der Kultur kontinuierlich zuführt, wobei das Nährmedium oder die Nährmedien mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, unter Bedingungen die die Bildung von L-Threonin erlauben und gleichzeitig der Kultur Kulturbrühe entsprechend der Summe des Entnahmestroms F2 plus des zellabgereicherten Entnahmestroms F3 oder entsprechend der Summe aus mehreren Entnahmeströmen (F2+) plus des zellabgereicherten Entnahmestroms F3 entnimmt, der oder die im wesentlichen dem Zufütterungsstrom (F1) oder der Summe der Zufütterungsströme (F1+) entspricht/entsprechen, wobei

    c) c) die Zellen mit einem Rücklaufverhältnis von 0 < R ≤ 1 ganz oder teilweise durch entsprechende Verfahren aus dem Entnahmestrom (F4) abgetrennt werden und in den Kultivierungsansatz zurückgeführt werden (F5).
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierungsschritt (a) nach dem Satzverfahren (batch) durchgeführt wird.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierungsschritt (a) nach dem Zulaufverfahren (fed batch) durchgeführt wird, wobei mindestens ein Zusatz-Nährmedium eingesetzt wird.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zellrückhaltung um ein Filtrations-, Zentrifugations- oder Sedimentationsverfahren handelt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete L-Threonin gereinigt wird.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst die Biomasse aus der entnommenen Kultur in Schritt (b) zu mindestens 90% entfernt und anschließend das Wasser zu mindestens 90% entfernt.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass, bezogen auf den Beginn des Satzverfahrens, das weitere oder die weiteren Nährmedien nach >0 bis 20 Stunden zugeführt wird (werden).
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass, bezogen auf den Beginn des Zulaufverfahrens, das weitere oder die weiteren Nährmedien nach >0 bis 80 Stunden zugeführt wird (werden).
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kohlenstoffquelle um eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Maltose, Xylose, Essigsäure, Ethanol und Methanol handelt.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Stickstoffquelle um eine oder mehrere organische, Stickstoff-haltige Stoffe oder Stoffgemische ausgewählt aus der Gruppe Peptone, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Malzextrakte, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff und/oder um eine oder mehrere der anorganischen Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Ammoniak, Ammonium-haltige Salze und Salze der Salpetersäure handelt.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei Ammonium haltigen Salzen und Salze der Salpetersäure um Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat und Kaliumnatriumnitrat handelt.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Phosphorquelle um Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure oder deren Polymere oder der Phytinsäure handelt.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Alkalisalzen der Phosphorsäure um Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze handelt.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit des Entnahmestroms F2 oder der Entnahmeströme F2+ 80% – 120%, 90% – 110% des Zufütterungsstroms F1 oder der Summe der Zufütterungsströme F1+ entspricht.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Bakterien der Familie Enterobacteriaceae um die Art Escherichia coli handelt.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium der Familie Enterobacteriaceae mindestens ein thrA-Gen oder Allel enthält, das für eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I kodiert.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium der Familie Enterobacteriaceae ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor, ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor enthält.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zufütterungsstrom (F1) oder die Summe der Zufütterungsströme (F1+) mit einer Geschwindigkeit entsprechend einer mittleren Verweilzeit von kleiner 30 Stunden, kleiner 25, kleiner 20 Stunden hinzugeführt wird.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zugeführtem Nährmedium oder den zugeführten Nährmedien ein Phosphor zu Kohlenstoffverhältnis (P/C Verhältnis) von maximal 4; von maximal 3; von maximal 2; von maximal 1,5; von maximal 1; von maximal 0,7; von maximal 0,5; maximal 0,48; maximal 0,46; maximal 0,44; maximal 0,42; maximal 0,40; maximal 0,38; maximal 0,36; maximal 0,34; maximal 0,32; maximal 0,30 eingestellt wird.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die entnommene Kulturbrühe mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas versehen wird bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle unter 2 g/l; unter 1 g/l; unter 0,5 g/l sinkt.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete L-Threonin gereinigt wird.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst die Biomasse aus der entnommenen Kultur in Schritt (b) zu mindestens 90% entfernt und anschließend das Wasser entfernt.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultur bei maximal 30, 20, 10 oder 5 g/l eingestellt wird.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultur bei maximal 10 g/l eingestellt wird.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultur bei maximal 5 g/l eingestellt wird.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultur bei maximal 2 g/l eingestellt wird.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute des gebildeten L-Threonins, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, mindestens 31%, beträgt.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute des gebildeten L-Threonins, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, mindestens 37%. beträgt.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute des gebildeten L-Threonins, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, mindestens 42%. beträgt.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute des gebildeten L-Threonins, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, mindestens 48%. beträgt.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 5,0 bis mehr als 8,0 g/l pro Std. gebildet wird.
  32. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 3,5 bis mehr als 5,0 g/l pro Std. gebildet wird.
  33. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 2,5 bis mehr als 3,5 g/l pro Std. gebildet wird.
  34. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zulaufverfahren im Kultivierungsschritt (a) angewandt wird, und dass L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von mindestens 2,5 bis 5,0 g/l pro Std. gebildet wird.
  35. Saccharose verwertende Transkonjugante von Escherichia coli K-12 hinterlegt als DSM 16293 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland).
  36. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme einsetzt, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:

    a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I, welche gegebenenfalls überexprimiert vorliegt, und gegebenenfalls

    b) ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor, ochre-Suppressor und amber-Suppressor.
  37. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme einsetzt, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:

    a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I, welche gegebenenfalls überexprimiert vorliegt,

    b) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen,

    c) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und

    d) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.
  38. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme einsetzt, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:

    a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I, welche gegebenenfalls überexprimiert vorliegt,

    b) ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor, ochre-Suppressor und amber-Suppressor,

    c) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,

    d) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und

    e) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.
  39. Verfahren gemäß Anspruch 36, 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte Stamm zusätzlich eines oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe

    39.1 Abschwächung der vom pckA-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase,

    39.2 Abschwächung der vom pgi-Gen kodierten Phoshoglucose-Isomerase,

    39.3 Abschwächung des vom offenen Leserahmens ytfP kodierten YtfP-Genproduktes,

    39.4 Abschwächung des vom offenen Leserahmen yjfA kodierten YjfA-Genproduktes,

    39.5 Abschwächung der vom poxB-Gen kodierten Pruvat-Oxidase,

    39.6 Abschwächung des vom offenen Leserahmen yjgF kodierten YjgF-Genproduktes,

    39.7 Verstärkung der von den Genen pntA und pntB kodierten Transhydrogenase,

    39.8 Verstärkung der von dem pps-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Synthase,

    39.9 Verstärkung der vom ppc-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Carboxylase,

    39.10 Verstärkung des vom rseB-Gen kodierten Regulators RseB,

    39.11 Verstärkung des vom galP-Gen kodierten Galaktose-Proton Symporter's,

    39.12 Fähigkeit Saccharose als Kohlenstoffquelle verwenden zu können,

    39.13 Verstärkung des vom offenen Leserahmens yedA kodierten YedA-Genproduktes,

    39.14 Wachstum in Gegenwart mindestens 0,1 bis 0,5 mM oder mindestens 0,5 bis 1 mM Borrelidin (Borrelidinresistenz),

    39.15 Wachstum in Gegenwart von mindestens 2 bis 2,5 g/l oder mindestens 2,5 bis 3 g/l Diaminobernsteinsäure (Diaminobernsteinsäure Resistenz),

    39.16 Wachstum in Gegenwart von mindestens 30 bis 40 mM oder mindestens 40 bis 50 mM &agr;-Methylserin (&agr;-Methylserin Resistenz),

    39.17 Wachstum in Gegenwart von höchstens 30 mM oder höchstens 40 mM oder höchstens 50 mM Fluorobrenztraubensäure (Fluorobrenztraubensäure Sensitivität),

    39.18 Wachstum in Gegenwart von mindestens 210 mM oder mindestens 240 mM oder mindestens 270 mM oder mindestens 300 mM L-Glutaminsäure (Glutaminsäure Resistenz),

    39.19 Eine mindestens partielle Bedürftigkeit für Methionin,

    39.20 Eine mindestens partielle Bedürftigkeit für m-Diaminopimelinsäure,

    39.21 Wachstum in Gegenwart von mindestens 100 mg/l Rifampicin (Rifampicin Resistenz),

    39.22 Wachstum in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Lysin (Lysin Resistenz),

    39.23 Wachstum in Gegenwart von mindestens 15 g/l Methionin (Methionin Resistenz),

    39.24 Wachstum in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Asparaginsäure (Asparaginsäure Resistenz), und

    39.25 Verstärkung der vom pyc-Gen kodierten Pyruvat-Carboxylase enthalten.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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