Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Genexpressionsprofilierung in verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebeverbands.

Unter (Gen-)Expressionsprofilierung versteht man die Erstellung einer qualitativen und quantitativen Aussage über die Umsetzung genetischer Informationen in entsprechende Genprodukte. Die erhaltenen Ergebnisse über An- und Abwesenheit beziehungsweise Menge bestimmter Genprodukte liefern ein so genanntes Expressionsmuster, anhand dessen beispielsweise ein potentiell pathologischer Zustand eines Zell- oder Gewebeverbands im Vergleich mit gesundem Gewebe abgelesen werden kann. Bei der Expressionsprofilierung wird einerseits die in einem Organismus, einer Zelle oder einer Körperflüssigkeit unter definierten Bedingungen vorhandene Proteinausstattung (Proteom) oder die Gesamtheit aller aus der Transkription hervor gehenden RNA-Moleküle (Transkriptom) qualitativ und quantitativ erfasst. Die Auswertung erfolgt meistens mittels Microarrays, wobei biologische Makromoleküle wie z.B. Nukleinsäuren, Peptide oder Proteine in hoher Dichte an eine feste Trägersubstanz gebunden wird, die es erlaubt, große Mengen an Proben in geregelten Abständen aufzubringen, so dass diese für parallele Vergleichsexperimente genutzt werden können.

Ein Problem für die zweifelsfreie Zuordnung und Analyse der Genprodukte zu einem bestimmten Zelltyp innerhalb eines gewählten Organs oder Gewebes stellt allerdings die erfolgreiche Markierung und Vereinzelung definierten Zellmaterials unter Erhaltung der Integrität der biologischen Makromoleküle dar. Mit den derzeit verwendeten Methoden zur Transkriptom- und Proteomprofilierung ist die Komplexität zellulärer Genexpression im Gewebeverband nicht auflösbar. Dieses Problem hat sich insbesondere bei Expressionsprofilierungsstudien im Gehirn, also im zentralen Nervensystem (ZNS), als schwierig heraus gestellt. Das ZNS ist zellulär äußerst komplex und heterogen. Beispielsweise liegt die Zahl glialer Zellen im Gehirn mindestens eine Grössenordnung über der von neuronalen Zelltypen (Serafini, 1999), wobei die Zahl neuronaler Zelltypen z.B. im Neokortex etwa auf über 100 geschätzt werden kann (Serafini, 1999; Geschwind 2000). Durch die Heterogenität des Nervengewebes, d.h. hoher Anteil an Gliazellen, sowie durch die Anwesenheit stark exprimierter Gene ist die Analyse selten vorkommender Transkripte (mit weniger als 50 Molekülen pro Zelle gegenüber einer Gesamtzahl von 500.000 Molekülen) in neuronalen Zelltypen mit den bisher beschriebenen Ansätzen nicht möglich.

Aus dem Stand der Technik kennt der Fachmann beispielsweise die Verwendung von Gewebe anatomisch definierter Gehirnregionen als Ausgangsmaterial für in situ-Hybridisierungen mit den spezifisch für die Regionen identifizierten Genen. Unter den erfolgreich anhand in situ-Hybridisierung identifizierten Gene wiesen jedoch selbst die Gene, welche spezifisch für eine so definierte ZNS-Kernregion wie die Amygdala sind, zusätzlich eine hohe zelluläre Heterogenität der Expression auf (Zirlinger et al., 2001, Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 98, Seiten 5270-5275). Die offensichtlichen Nachteile bei der Charakterisierung zelltypspezifischer Genexpression mittels in situ-Hybridisierungen liegen im Aufwand der notwendigen Einzelanalysen und in der unzureichenden Sensitivität.

Eine Erhöhung der Sensitivität wird beispielsweise auch durch die Selektion einzelner Zellen oder Zellgruppen aus Gewebeschnitten mit Hilfe von Lasern erzielt. Die Laservermittelte objektorientierte Mikrodissektion ermöglicht die Isolation von Gewebeanteilen im Bereich weniger &mgr;m. Damit ist die Isolierung von Zellen und zellulärer Substrukturen möglich. Das Präparat kann Paraffin-fixiert oder schockgefroren konserviert werden. Als Objekt dienen Mikrotom- oder Kryostat-Dünnschnitte zwischen 5-30 &mgr;m, also im Grössenbereich eukaryontischer Zellen. Histologisch interessante Strukturen werden im Mikroskop identifiziert und computergesteuert mit einem Mikrolaser aus dem Gewebeverband herausgeschnitten. Optimale Ergebnisse lassen sich allerdings nur mit dehydrierten Gewebeschnitten erzielen, da die Energie des Mikrolasers für nicht völlig wasserfreie Objekte oft nicht ausreicht und unfixiertes Gewebematerial starken Schädigungen unterworfen ist. Aus technischen Gründen ist es nicht möglich, qualitativ hochwertige RNA aus Paraffin- oder Formaldehyd-fixierten Schnitten zu isolieren. Als Fixations- und Trocknungsmittel eignen sich daher nur alkoholisch präzipitierende Flüssigkeiten (Ethanol, Aceton, Methanol). Diese beeinträchtigen jedoch besonders bei Gefrierschnitten des Gehirns die morphologischen Strukturen und erschweren die Etablierung gängiger immunhistochemischer Markierungsverfahren.

Zusammengefasst müssen die verwendeten Gewebepräparate und Markierungen für eine schonende Isolation definierter Zelltypen mittels Mikrodissektion folgenden Ausgangsvoraussetzungen genügen:

• 1) Die Art des Gewebeschnittes muss den in vivo relevanten Zustand der Zellen reflektieren.
• 2) Die Verwendung kreuzvernetzender Fixationsmittel muss vermieden werden.
• 3) Die Markierung muss mit der vollständigen Trocknung des Gewebeschnittes kompatibel sein.
• 4) Die Markierung sollte die Behandlung durch alkoholische Fixationsmittel überstehen.
• 5) Zur Einbindung automatisierter Erkennungsverfahren muss die morphologische Markierung charakteristisch und vergleichbar sein.

Aus dem Stand der Technik sind keine richtungsweisenden Studien über die Isolierung verschiedener Zelltypen des peripheren und zentralen Nervensystems durch Mikrodissektion bekannt, die den genannten Kriterien entsprechen. In der ersten Studie über Zelltypen des peripheren Nervensystems wurden die Zelltypen durch eine klassische histologische Färbetechnik (Nissl Färbung) charakterisiert (Luo et al, 1999), wenngleich eine genetische Heterogenität nicht ausgeschlossen werden konnte. Demnach reicht eine Zahl von etwa 1000 isolierten Zellen aus, um eine reproduzierbare, kompetitive Arrayhybridisierung durchführen zu können. In einer weiteren Studie wurden einzelnen Neurone aus dem Hippokampus von Ratten isoliert und aufgrund der Arrayergebnisse gruppiert. Eine vorherige Charakterisierung der Zelltypen durch entsprechende Markierungsverfahren konnte nicht durchgeführt werden (Kamme et al, 2003). In einer unabhängigen Studie wurden Neurone aus den Riechkolben von Mäusen und deren Vorläuferzellen zunächst in Kultur genommen, einzeln isoliert und deren Transkriptionsprofile nachfolgend mit Microarrays bestimmt (Tietjen et al, 2003). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist keine Studie bekannt, bei der Zellpopulationen gezielt genetisch markiert wurden, somit definiert isoliert werden konnten und deren Transkriptom mit Microarrays zu einem definierten Zeitpunkt charakterisiert werden konnte.

Bisher verwendete Reportergene oder zelluläre Markierungsverfahren sind in Bezug auf ihre Verwendbarkeit im Hinblick auf eine anschliessende schonende Mikrodissektion definierter Zelltypen in den meisten Fällen ungeeignet. Gängige histologische Färbungen (wie z.B. Hematoxilin/Eosin, Thionin) lassen nur die Identifizierung bestimmter Zellpopulationen in anatomisch klar abgegrenzten Regionen zu. Eine zelltypspezifische Isolation frei von Kontaminationen ist damit aber nicht möglich, zumal morpholgisch nicht unterscheidbare Zellen auf molekularer Ebene verschiedene Zelltypen einschließen können. Diese Markierungsverfahren erfordern darüber hinaus eine Inkubation der Gewebeschnitte in wässrigem Milieu. Dies kann zur Degradation z.B. zellulärer RNAs führen. Die Markierung von verschiedenen Zelltypen mit immunhistochemischen Methoden erfordert ebenfalls eine Inkubation der Gewebeschnitte in wässrigem Milieu, wodurch zelluläre RNAs degradiert werden. Eine anschließende Isolierung definierten und intakten Zellmaterials ist somit nur bedingt möglich. Einschränkend wirken sich auch kreuzvernetzende Gewebefixierungsmittel (z.B. Formaldehyd-basierte Substanzen) aus, die zwar die Detektion vereinfachen, aber die Isolation intakter Proteine oder RNAs erschweren. Weiterhin ist für eine eindeutige Markierung der Einsatz zelltypspezifischer Antikörper notwendig. Die Expression enzymatischer Reporterproteine erlaubt grundsätzlich die genetische Markierung definierter Zelltypen in vivo durch transgene Expression von entsprechenden Reporterproteinen, wie z.B. der beta-Galaktosidase von E.coli oder der humanen alkalischen Phosphatase. Für den Nachweis sind jedoch Inkubationen mit fluoreszenten oder präzipitierenden Substraten notwendig. Der Erhalt der vollständigen Integrität des biologischen Materials ist nicht gegeben. Schonende Fixierungsverfahren sind mit den notwendigen Nachweisverfahren nur eingeschränkt kompatibel.

Transgene Mäuse, die fluoreszente Reporterproteine unter der Kontrolle zelltypspezifischer Promotoren in Geweben exprimieren, ermöglichen die Markierung definierter Zelltypen in vivo ohne jegliche zusätzlich notwendige Manipulation. Durch entsprechende mikroskopische Verfahren ist die Visualisierung auch in Gewebekulturen oder sogar im lebenden Tier möglich. Die bisher zur Zellmarkierung verwendeten zytoplasmastisch lokalisierten löslichen fluoreszenten Proteine, wie u.a. das Green Fluorescent Protein (GFP), sind aber für die Isolation durch Mikrodissektion bei Beibehaltung der Integrität der Makromoleküle nicht geeignet. Eine Isolation durch mechanische Vereinzelung und nachfolgender FACS-Analyse (Fluorescent Activated Cell Sorting) ist zwar möglich, erfordert jedoch eine Inkubation in wässrigem Milieu unter Zusatz von proteolytischen Enzymen. Dies kann einen Einfluß auf die Zusammensetzung des Transkriptoms und Proteoms nehmen. Eine vollständig kontaminationsfreie Isolation ist kaum möglich. Zudem ist die mechanische Vereinzelung z.B. älteren Gehirngewebes wegen der sehr starken Verästelung der Zellen nur sehr eingeschränkt möglich. Einzelne, definierte Zellen lassen sich mit diesem Vorgehen prinzipiell nicht isolieren.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zu finden, das es ermöglicht, Zellen im komplexen Gewebeverband, insbesondere im Nervengewebe, zu markieren. Die Markierung soll unter Bedingungen erfolgen, die es erlauben, nach Isolation die Integrität des isolierten Materials zu erhalten. Die bisher verwendeten zellulären Markerproteine sind nicht mit einer schonenden Isolierung vereinbar, da eine Gewebefixierung mit vernetzenden Substanzen notwendig ist um eine lokalisierte Fluoreszenz zu erhalten.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine genetische Zellmarkierung in vivo mittels zellulär fixierter fluoreszenter Proteinderivate, welche vollständig mit der Isolierung des Zellmaterials durch Laser-vermittelte Mikrodissektion kompatibel ist. Die Markierung ist morphologisch eindeutig zu identifizieren und ermöglicht die Einbindung morphometrischer Software und damit eine weitgehende Automatisierung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur in vivo-Markierung eines definierten Zelltyps innerhalb eines Gewebeverbands, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das zelltypspezifische Exprimieren einer für ein subzellulär lokalisiertes Autofluoreszenzprotein kodierenden Nukleinsäure in einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier umfasst, die Nukleinsäure enthaltend die folgenden Nukleinsäuresequenzen:

• (a) einen zelltypspezifischen Promotor,
• (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Autofluoreszenzprotein kodiert und mit dem Promotor funktional verbunden ist, und
• (c) eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine subzelluläre Lokalisation des Autofluoreszenzproteins bewirkt,

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem „subzellulär lokalisierten" Autofluoreszenzprotein um ein autofluoreszierendes Protein, das mittels dem Fachmann bekannter gentechnologischer und biochemischer Verfahren modifiziert ist, so dass es im Gegensatz zum unmodifizierten Wildtypprotein nicht löslich im Zytosol vorliegt. Mit dem Begriff „subzellulär" sind daher für das erfindungsgemäße Verfahren Strukturen wie zelluläre Membranen, Organellen oder intrazelluläre Filamente, wie zum Beispiel Zytoskelettfilamente (Aktin, Tubulin) umfasst.

Demzufolge enthält die für das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure Nukleinsäuresequenzen, die für Aminosäuresequenzen kodieren, welche die Lokalisation des Autofluoreszenzproteins in oder an zelluläre Membranen, Organellen oder intrazelluläre Filamente bewirken.

Zur Lokalisation an oder in eine einer Zellmembran kann die für das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz enthalten, so dass in dem davon kodierten Autofluoreszenzprotein eine Konsensussequenz zur Myristoylierung, Palmytoylierung, Geranylgeranylisierung oder Farnesylierung bereit gestellt wird, infolgedessen das Autofluoreszenzprotein membran-assoziiert vorliegt. Bekannte Konsensussequenzen sind z.B. „CAAX" (Farnesylierung), Met-Gly-X-X-X-Ser/Thr (Myristoylierung). Membranständige Autofluoreszenzproteine können außerdem durch das Einbringen einer für eine Transmembranregion kodierende Nukleinsäuresequenz erzeugt werden.

In einer weiteren Ausführungsform kann die für das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die für Lokalisierungssignale für Organellen kodieren. Derartige Lokalisierungssignale sind dem Fachmann bekannt für Organellen wie z.B. Golgi-Apparat, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrien, Peroxisomen, Endosomen oder Zellkern. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein im Zellkern vor. Eine Reihe der dieser Erfindung zugrunde liegenden Autofluoreszenzproteine beruhen auf Konstrukten der Firma BD Biosciences (siehe Beispiel 2). Zur Lokalisation des subzellulär lokalisierten Autofluorezenzproteins an intrazellulären Filamenten, wie z.B. Zytoskelettstrukturen, kann die die für das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die beispielsweise für Aktiv oder Tubulin oder Teile davon kodiert.

Der Begriff „Autofluoreszenzprotein" umfasst unter anderem fluoreszierende Proteine der Gattung Aequora wie das Green Fluorescent Protein (GFP), und Varianten davon, die in einem anderen Wellenlängenbreich fluoreszieren (z.B. Yellow Fluorescent Protein, YFP; Blue Fluorescent Protein, BFP; Cyan Fluorescent Protein, CFP) oder deren Fluoreszenz verstärkt ist (enhanced GFP oder EGFP, beziehungsweise EYFP, EBFP oder ECFP). Ferner umfasst die vorliegende Erfindung andere autofluoreszierende Proteine, z.B. DsRed, HcRed, AsRed, AmCyan, ZsGreen, AcGFP, ZsYellow, wie sie von BD Biosciences bekannt sind.

Bei dem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier handelt es sich bevorzugt um ein Nagetier, besonders bevorzugt um eine Maus.

Als Zelltyp kommen für das erfindungsgemäße Verfahren im Grunde alle innerhalb eines Gewebeverbands wie z.B. Gehirn, Leber, Lunge, Nieren, Haut, Darm, Muskel, Herz, Gonaden, Drüsen, Sinnesorgane, vorhandenen Zelltypen wie beispielsweise Epithelzellen, Nervenzellen (neuronale Zellen), Gliazellen, Fibroblasten, Endothelzellen, Mastzellen, Perizyten, Chondrozyten, Osteozyten, Hyalozyten, Keratinozyten, Muskelzellen, Macrophagen, B- und T-Lymphozyten, Erythrozyten in Betracht. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Gewebeverband um das Gehirn und bei dem Zelltyp um neuronale Zellen.

Der Nachweis des mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens markierten Zelltyps erfolgt nach Entnahme des entsprechenden Gewebes aus dem getöteten transgenen, nichtmenschlichen Säugetiers.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine zur Herstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers geeignete, für ein subzellulär lokalisiertes Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält die folgenden Nukleinsäuresequenzen:

• (a) einen zelltypspezifischen Promotor,
• (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Autofluoreszenzprotein kodiert und mit dem Promotor funktional verbunden ist, und
• (c) eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine subzelluläre Lokalisation des Autofluoreszenzproteins bewirkt,

Als „zelltypspezifischer Promotor" sind alle Promotoren denkbar, die eine gewebe- bzw. zelltypspezifische oder gegebenenfalls auch eine ubiquitäre (als Kontrolle) Expression des subzellulär lokalisierten Autofluoreszenzproteins in einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier erlauben. Durch die Wahl des Promotors werden Ort und Menge des Transgens bestimmt. Durch das zusätzliche Anbringen von Kontrollelementen kann die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure gezielt in bestimmten Geweben beziehungsweise zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert werden. Geeignete Promotoren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Als nicht abschließende Liste von Beispielen von Promotoren seien genannt beta-Aktin, GFAP (glial fibrillary acidic protein), ROSA26, Gad1 (glutamic acid decarboxylase I), Prnp (Prionprotein), CaMKII (calcium-calmodulin-dependent protein kinase type II), Thy-1, Thy-2 (Gehirn-Thymocyten-spezifische Alloantigene 1 und 2), PLP (Myelin-Proteolipidprotein), Tek (endothelial-spezifischer Rezeptor TK), UBC (Ubiquitin C), endogene IL-4-regulatorische Elemente, Cnp1, DBH (dopamine beta-hydroxylase), Epas-1 (endothelial PAS domain protein 1), Mt-1 (metallothionenin 1), Nes (nestin), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor I), rtTA/tTA-responsives Element (responsive to tet transactivator, auch tetO bzw, tetop genannt), Zfy-1 und -2 (zinc finger protein 1, Y linked), TIMP3 (tissue inhibitor of metalloproteinase 3), UAS (upstream activating sequence), Wnt1 (wingless-related MMTV integration site 1), Maf (musculoaponeurotic fibrosarcoma) und Foxd1.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thy-1, beta-Aktin, GFAP, Cnp1, PLP und ROSA26.

Der Promotor, z.B. ROSA26 oder beta-Aktin, kann zusätzlich eine von so genannten loxP-Stellen flankierte STOP-Cassette umfassen, welche durch Kreuzung des die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende transgene Säugetier mit einem weiteren Säugetier, welches eine cre-Rekombinase exprimiert, herausgeschnitten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in 7 dargestellte Struktur auf.

Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Wirts- bzw. Zielzelle (Transformation oder Transfektion) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch so genannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, sowie beliebige Kombinationen davon, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Lithiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation.

Für die Expression und das Einbringen der Nukleinsäure in eine Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. nukleinsäurehaltige Zusammensetzung in einem so genannten Expressionsvektor inseriert ist. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante DNA und einen Expressionsvektor, welcher die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen, bakteriellen oder einen retroviralen Vektor, Plasmid, Bacteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren, z.B. Liposomen, die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet sind. Falls gewünscht oder erforderlich, kann die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten, operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber auch Introns oder ähnliche Elemente sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors, die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen oder dazu beitragen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers, welches ein für ein Autofluoreszenzprotein kodierendes Transgen trägt, wobei das Verfahren die chromosomale Inkorporierung einer für ein subzellulär fixiertes Autofluoreszenzprotein kodierenden Nukleinsäure in das Genom des nicht-menschlichen Säugetiers umfasst. Die zu inkorporierdende Nukleinsäure enthält folgende Nukleinsäuresequenzen:

• (a) einen zelltypspezifischen Promotor,
• (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Autofluoreszenzprotein kodiert und mit dem Promotor funktional verbunden ist, und
• (c) eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine subzelluläre Lokalisation des Autofluoreszenzproteins bewirkt,

Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise transgene, menschliche Säugetiere hergestellt werden können. Ein allgemein gebräuchliches Verfahren ist beispielsweise die Erzeugung transgener Tiere durch Mikroinjektion von Fremd-DNA. Ein das Transgen, z.B. die für das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure, tragender rekombinationsfähiger Vektor wird in einen der beiden Vorkerne befruchteter Eizellen injiziert. Die so behandelten Eizellen werden in „Leihmütter" überführt, weibliche Mäuse, die man durch Paarung mit Männchen mit durchtrenntem Samenleiter pseudoschwanger gemacht hat. Nach einem anderen Verfahren isoliert man embryonale Stammzellen (ES) aus einer Blastozyste, bringt den Vektor, der die für das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure enthält, in die ES ein, führt diese genetisch modifizierten ES in eine weitere Blastozyste ein, welche in eine pseudoschwangere Maus eingepflanzt wird, wodurch ein chimäres Tier ensteht. Dieses wird gegebenenfalls mit einem Wildtyp-Tier gekreuzt, wodurch bis zu 25% Nachkommen entstehen, die das Transgen tragen. Drei Wochen nach der Geburt prüft man die Nachkommen auf Anwesenheit des Transgens, indem man die DNA, die man aus einem kleinen Stück des Mäuseschwanzes isoliert, einer Southern-Blot-Analyse unterwirft. Das Screening lässt sich mittels Polymerasekettenreaktion unter Einsatz geeigneter Primer durchführen. Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Nukleinsäuren, die sich zum Einbau in einen Rekombinationsvektor und zur Herstellung eines transgenen, nichtmenschlichen Säugetiers, welches ein für subzellulär lokalisiertes Autofluoreszenzprotein kodierendes Transgen trägt, sind in 7a–7c dargestellt.

Dem Fachmann ist weiterhin bekannt, dass man zur Herstellung eines transgenen, nichtmenschlichen Säugetiers, welches das Autofluoreszenzprotein gewebespezifisch exprimieren soll, zunächst ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier erzeugt, bei dem die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines ubiquitär funktionellen, allgemeinen Promotors (z.B. ROSA26 oder beta-Aktin) steht, die konstitutive Expression des Transgens aber durch eine so genannte „floxed" STOP-Cassette (transkriptionelle/translationelle STOP-Cassette mit flankierenden loxP-Stellen, welche als Erkennungssignal für die cre-Rekombinase dienen) zwischen Promotor und Transgen verhindert wird. Durch Kreuzung mit einem weiteren transgenen, nichtmenschlichen Säugetier, welches die so genannte cre-Rekombinase unter Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotors exprimiert, wird die STOP-Cassette aufgrund der cre-Rekombinase-Aktivität herausgeschnitten und das subzellulär lokalisierte Autofluoreszenzprotein zelltypspezifisch (siehe 7).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein transgenes, nichtmenschlichen Säugetiers, welches ein für ein Autofluoreszenzprotein kodierendes Transgen trägt, hergestellt durch die chromosomale Inkorporierung einer Nukleinsäure, die die vorstehend genannten Merkmale aufweist, in das Genom des nicht-menschlichen Säugetiers.

Bevorzugt umfasst der in der Nukleinsäure enthaltene Promotor die Promotoren beta-Aktin, GFAP, ROSA26, Gad1, Prnp, CaMKII, Thy-1, Thy-2, UBC, endogene IL-4-regulatorische Elemente, Cnp1, PLP, DBH, Epas-1, Mt-1, Nes, PAI-1, rtTA/tTA-responsives Element, Zfy-1 und -2, TIMP3, Wnt1, Maf und Foxd1.

Besonders bevorzugt ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus beta-Aktin, CaMKII, GFAP, ROSA26, Thy-1, PLP und Cnp1.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Erstellung eines Expressionsprofils eines definierten Zelltyps innerhalb eines Gewebeverbands, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

• (a) Bereitstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers, welches ein für ein subzellulär lokalisiertes Autofluoreszenzprotein kodierendes, unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotors stehendes Transgen trägt,
• (b) Isolierung des Gewebeverbands, das den gewünschten Zelltyp enthält, aus dem transgenen Säugetier aus a)
• (c) Herstellung von Schnitten aus dem Gewebeverband aus (b),
• (d) Verifizierung des gesuchten Zelltyps anhand Analyse der Schnitte aus c),
• (e) Vereinzelung des verifizierten Zelltyps,
• (f) Isolierung nachzuweisender, biologischer Moleküle aus verifiziertem und vereinzelten Zelltyp und gegebenenfalls Anreicherung besagter biologischer Moleküle, und
• (g) qualitative und/oder quantitative Bestimmung besagter biologischer Moleküle im Vergleich mit geeigneten Referenzproben.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es besonders günstig, wenn es sich bei den Schnitten um Gefrierdünnschnitte, da Gefrierdünnschnitte sich für Mikrodissektion besonders gut eignen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Gefrierdünnschnitte alkoholisch fixiert und getrocknet.

Mit „biologischen Molekülen" sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, Proteine und Peptide gemeint. Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Nukleinsäuren umfassen DNA- und RNA-Moleküle. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den biologischen Molekülen um mRNA.

Mit „Referenzproben" sind Gewebe, Zellen/Zelltypen bzw. die daraus gewonnenen biologischen Moleküle gemeint, die in der beschriebenen Weise aus einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier isoliert wurden, welches im Gegensatz zur untersuchten Probe nicht, länger oder kürzer der Inkubation mit einer bestimmten Testsubstanz oder einem Verfahren ausgesetzt war. Darüber hinaus kann die Referenzprobe aus einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier stammen, bei dem im Gegensatz zur eigentlichen Probe ein oder mehrere Gene fehlen. Außerdem kann die Referenzprobe aus einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier stammen, das eine bestimmte Krankheit aufweist. Darüber hinaus kann es sich bei der Referenzprobe um ein anderes Gewebe als die eigentliche Probe, aber aus dem selben transgenen Säugetier stammend, handeln. In den genannten Beispielen werden eigentliche und Referenzprobe auf die potentiell unterschiedliche Expression von Genen analysiert.

Die den einzelnen Verfahrensschritten zugrunde liegenden Methoden sind dem Durchschnittsfachmann geläufig. Die Anreicherung der biologisch relevanten Moleküle, insbesondere mRNA-Moleküle, erfolgt üblicherweise durch reverse Transkription mit anschließender Polymerasekettenreaktion. Die so angereicherten Moleküle werden üblicherweise mittels bekannter Hybridisierungsverfahren (Southern Blot, Northern Blot) unter Einsatz geeigneter Hybridisierungssonden, am zweckmäßigsten im Microarray-Format, quantitativ und qualitativ analysiert.

1: Die Markierung definierter Zellen durch Expression zytoplasmatischen EGFP geht nach der Herstellung von Gefrierschnitten verloren

Dargestellt sind fluoreszenz-mikroskopische Abbildungen von Gefrierdünnschnitten von verschiedenen GFAP-GFP transgenen Mäusen. Die Schnitte zeigen alle einen vergleichbaren Ausschnitt des Kleinhirns. Die Mäuse wurden unter Betäubung mit den folgenden Substanzen perfundiert: PFA (4%ige gepufferte Paraformaldehyd Lösung), PBS (Phosphate buffered saline), RNA later ('RNAlater' (Ambion) kommerzielle RNA stabilisierende Lösung), 10% sucrose (eine 10%ige Sucrose Lösung in PBS), 10% Glycerol/1% DMSO (eine 10%ige Glyzerin und 1%ige DMSO Lösung in PBS). Anschliessend wurden die Gehirne entnommen und Gefrierdünnschnitte (10 &mgr;m) hergestellt. Lediglich die Perfusion mit PFA führte zu einer zellulären Fixierung des Fluoreszenzsignals, nach Perfsusion mit den anderen Substanzen konnte keine klare zelluläre Struktur detektiert werden.

2: Die Funktionalität des GFP Proteins ist nach einem Einfrier-Auftau Zyklus nicht dramatisch reduziert

Gleiche Mengen eines Extraktes von pEGFP/C1-Plasmid (BD Biosciences) transfizierten HeLa Zellen wurden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Sucrose (0%ige, 10%ige bzw. 30%ige Lösung in PBS) ein- oder zweimalig eingefroren und wieder aufgetaut. Anschließend wurde die relative GFP-Fluoreszenz spektrometrisch bestimmt (Anregung bei 488 nm, Emission bei 515 nm). Durch einen Einfrier-Auftauzyklus wird die GFP-Fluoreszenz nicht vermindert, nach einem zweiten Einfrier-Auftauzyklus ist die GFP-Fluoreszenz um etwa 20% vermindert, der Verlust an Fluoreszenz kann durch eine kryoprotektive 10%ige Sucrose-Lösung aufgehoben werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Funktionalität des GFP-Proteins durch einen Gefriervorgang nicht beeinträchtigt ist.

3: Das Fluoreszenzsignal membran-assozierter EGFP Varianten nach ethanolischer Fixierung und Trocknung

Die Expressionsplasmide pEGFP-C1, pEGFP-F und pTM-EGFP wurden durch Elektroporation in COS1 Zellen transfiziert, 36 h nach Transfektion wurden die Zellen sowohl mit einer 4%igen PBS-gepufferten Paraformaldehyd-Lösung (PFA) und einer 70%igen Ethanol (70% EtOH) fixiert. Die Zellen wurden luftgetrocknet und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Nach PFA Fixierung konnte für jede GFP-Variante eine starke zytoplasmatische bzw. membrangebundene Fluoreszenz beobachtet werden. Nach Fixierung mit 70% EtOH konnte mit der zytosolischen GFP-Variante (EGFP) kein Signal detektiert werden, die Signale der membran-assoziierten GFP-Varianten (EGFP-F und TM-EGFP) waren deutlich reduziert und die Morphologie des Signals stark verändert.

4: Das Fluoreszenzsignal nukleär lokalisierten EYFP nach ethanolischer Fixierung und Trocknung bzw. Rehydrierung

HeLa-Zellen wurden mit Lipofektamin 2000 (Invitrogen) nach den Angaben des Herstellers und dem für ein Zellkern lokalisiertes Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFPnuc) kodierendes Expressionsplasmid pEYFP-nuc transfiziert. 36 h nach Transfektion wurden die Zellen entweder mit PBS gewaschen oder mit Azetone (Acetone), einer 70%igen Ethanol Lösung (70% EtOH) oder einer 4%igen PBS-gepufferten Paraformaldehyd-Lösung (PFA) fixiert, getrocknet (dry) und ein Teil des Ansatatzes wieder rehydriert (wet). Anschließend wurden die Präparate fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Das nukleär lokalisierte EYFP ist sowohl nach einer Fixierung mit Aceton als auch mit Ethanol deutlich im Kern lokalisierbar. Nach Rehydrierung kommt es zu einem Verlust des Signals nach alkoholischer Fixierung.

5: Erhalt der Morphologie des Fluoreszenzsignals nukleär lokalisierten EYFP nach ethanolischer Fixierung und einem Einfrier- bzw. Auftauzyklus.

HeLa-Zellen wurden mit Lipofektamin 2000 (Invitrogen) nach den Angaben des Herstellers und dem für ein Zellkern lokalisiertes Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFPnuc) kodierendes Expressionsplasmid pEYFP-nuc transfiziert. 36 h nach Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen, getrocknet und für 12 h bei –80°C gelagert. Ein Teil der so behandelten Zellen wurde anschließend mit einer 70%igen Ethanol Lösung (70% EtOH) fixiert. Das nukleär lokalisierte EYFP Fluoreszenzsignal ist sowohl nach einem Einfrier- Auftauzyklus erhalten als auch nach einer nachfolgenden ethanolischen Fixierung.

6: RNA Isolation aus Gewebeschnitten nach Trocknung ohne Fixation Gezeigt ist die mit einem Bioanalyzer (Agilent) nach Angaben des Herstellers

durchgeführte Analyse der Qualität der Gesamt RNA, die aus jeweils einem Gefrierdünnschnitt (10 &mgr;m) des Gehirns einer adulten Maus isoliert wurde. Dazu wurde die Maus betäubt, das Gehirn wurde entnommen und auf Trockeneis eingefroren. Anschließend wurden Gefrierdünnschnittte von 10 &mgr;m Dicke hergestellt und unter Vakuum getrocknet. Die RNA Isolation mit Trizol (Sigma) erfolgte nach Angaben des Herstellers und wurde sofort nach Trocknung (0h) bzw. 1h, 2h, 3h und 4h nach Trocknung durchgeführt. Der RNA wurde durch Präzipitation aufkonzentriert und die Hälfte mit dem Bioanalyzer (Agilent) analysiert. Jede Präparation wurde doppelt durchgeführt. Die Integrität der 28S rRNA (28S) und der 18S rRNA (18S) Banden zeigt die Qualität der isolierten Gesamt RNA an.

7: Vorgeschlagene Nukleinsäurekonstrukte zum Einbau in einen rekombinativen Vektor, der zur Herstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers verwendet werden kann.

• (a) Thy-1 Minigen pTSC 2.1-EYFPnuc: „Prom" steht für Promotor, „ORF" steht für open reading frame (offenes Leseraster), „tg" steht für Transgen
• (b) ROSA26 oder beta-Aktin KI allele ROSA26 (oder beta-Aktin-)-STOP-EYFPnuc: „Prom" steht für Promotor, „KI" steht für „knock-in" „PGKneo" bezeichnet das Neomycin-Phosphotransferasegen (verleiht Resistenz gegen Neomycin) unter Kontrolle des Phosphoglyceratkinase-1-Promotors, EYFPnuc bezeichnet das Gen für nukleär lokalisiertes „enhanced yellow fluorescent protein", pA steht für Polyadenylierungssignal.
• (c) ROSA26 oder beta-Aktin KI allele ROSA26 (oder beta-Aktin-)-STOP-EYFPnuc: „Prom" steht für Promotor, „PGKneo" bezeichnet das Neomycin-Phosphotransferasegen unter Kontrolle des Phosphoglyceratkinase-1-Promotors, EYFPnuc bezeichnet das Gen für nukleär lokalisiertes „enhanced yellow fluorescent protein", CRE bezeichnet die für die cre-Rekombinase kodierende Nukleinsäure, pA steht für Polyadenylierungssignal.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:

Es wurden Gefrierdünnschnitte und Vibratomschnitte von Gehirnen transgener Mäuse hergestellt, die das Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) sowohl unter der Kontrolle des GFAP-Promoters in Astrozyten und unter der Kontrolle des CamKII-Promoters in Neuronen des Gehirns exprimieren. Dazu wurden die Gehirne adulter Tiere entnommen und sagittal in zwei vergleichbare Hälften geteilt. Eine Gehirnhälfte wurde auf Trockeneis eingefroren, die andere wurde für 3 h in einer 4%igen neutral gepufferten Paraformaldehyd (PFA)-Lösung inkubiert. Nachfolgend wurden von den tiefgefrorenen Gehirnen mit einem Cryostat der Firma Leica Gefrierdünnschnitte hergestellt (10 &mgr;M). Von dem mit PFA fixierten Gehirnen wurden mit einem Vibratom der Firma Leica ebenfalls Dünnschnitte hergestellt (30 &mgr;M). Zur Analyse wurden die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop (Firma Leica) und EGFP kompatiblen Fluoreszenzfiltern analysiert. Es zeigte sich, dass ein klar zellulär fixiertes Fluoreszenzsignal nur in den PFAbehandelten Schnitten sichtbar war. Die Fluoreszenz in den gefriergeschnittenen Präparaten war lediglich als diffuses Signal im Schnitt detektierbar (siehe 1). Nach verlängerter Lagerung der Gefrierschnitte bei –70°C war kein Fluoreszensignal mehr zu detektieren. Diese Beobachtungen lassen sich vermutlich durch das Diffundieren der löslichen EGFP Proteine nach Membranschädigungen durch das Einfrieren und nachfolgende Schneiden erklären. Um die Gewebeschädigungen durch Einfrieren zu verhindern, wurden nachfolgend transgene Mäuse mit kryoprotektiven Substanzen (gepufferte Sucrose, Glyzerin/DMSO Lösungen in verschiedenen Konzentrationen und Zusammensetzungen) perfundiert. In keinem Fall konnte der gefrierverursachte Verlust der zellspezifischen Markierung aufgehoben werden (s. 1).

Folgende Varianten- des Green Fluorescent Protein oder spektral verwandter Derivate wurden zur Analyse der Kryostabilität und Signalresistenz gegenüber alkoholischen Fixationsmitteln nach transienter Expression in COS1 und HeLa-Zellen getestet (3, 4, 5):

Die Expressionsplasmide pEGFP/C1, pEGFP/N1, pEGFP-F, pEYFPmem, pEYFP-Golgi, pEYFP-ER, pEYFPnuc sind bei der Firma Clontech kommerziell erhältlich. Die Plasmide pTM-EGFP und pEYFP-lamB1 wurden wie folgt als Fusionskonstrukte des offenen Leserasters von EGFP bzw. EYFP hergestellt:

pTM-EGFP: EGFP wurde an den C-terminus eines synthetischen Membranproteins (Signalsequenz und Transmembrandomäne des PDGF-R alpha) kloniert.

pEYFP-lamB1: EYFP wurde an den C-terminus des Kernporteins lamin B1 der Maus kloniert.

Die Expression in eukaryontischen Zellen wurde bei allen Konstrukten durch den humanen CMV-Promoter vermittelt.

Die Fluoreszenssignale aller subzellulär lokalisierten oder membran gebundenen Varianten blieb nach Trocknung bzw. alkoholischer Fixierung (70% Ethanol) ohne Einbettung erhalten (4 und 5). Das kernlokalisierte EYFP zeigte den besten Erhalt der Gesamtfluoreszenz und Vergleichbarkeit mit der ursprünglichen Verteilung in der Zelle, selbst nach einem zusätzliche Einfriervorgang (5).

Gängige Verfahren zur Isolierung von Zellmaterial aus Gewebeschnitten beruhen entweder auf PFA- oder alkoholisch-fixierten Präparate. PFA-fixiertes Material ist für die Isolation von z.B. intakter RNA höchster Qualität vollkommen ungeeignet. Alkoholische Fixierung erlaubt zwar die Isolation intakter RNA, bei der Analyse der relativen Stärken der Fluoreszenzsignale zellulär fixierter ergab sich jedoch ein deutlicher Verlust an Signalstärke. In den nachfolgend beschriebenen Experimenten wurde analysiert ob aus getrockneten, unfixierten Gefrierdünnschnitte von Gehirngewebe vollständig intakte RNA isoliert werden kann. Dazu wurden Gehirngewebe-Gefrierdünnschnitte von 10 &mgr;m an einem Kryostaten hergestellt und auf Glasobjektträger aufgezogen und unmittelbar im Vakuum getrocknet. Die Schnitte wurden zu verschiedenen Zeiten nach Trocknung (bis zu 4 Stunden) mit 200 &mgr;l Trizol-Lösung (Sigma) überlegt. Die Trizol Lösung führte zu einer sofortigen Solubilisierung des Gewebes. Das Lösungsgemisch wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und die RNA wurde entsprechend der Herstellerangaben isoliert. Ein Aliquot der gewonnen Gesamt-RNA wurde auf einem Bioanalyzer (Agilent) analysiert (6). Die vollständige Integrität der RNA lässt sich an der Schärfe der 18S-rRNA und 28S-rRNA Banden erkennen und ist nicht von verlängerten Lagerungszeiten bis zu vier Stunden beeinflußt (6).

Aus den Analysen der Kompatibilität der Markierung durch zellulär fixierte Derivate des Green Fluorescent Proteins (GFP) und der Isolation intakter RNA aus unfixierten Schnitten ergibt sich folgende Strategie zur komplexen Analyse zelltypspezifischer Genexpression mit z.B. Transkriptomics- oder Proteomics Methoden:

• – Die Markierung definierter Zelltypen durch transgene Expression subzellulär fixierter GFP-Varianten in Tieren. Kernlokalisierte GFP-Varianten werden hier bevorzugt, wegen des besten Erhaltes der Fluoreszenz nach Trocknung und der klar definierten Morphologie der Struktur. Die Zelltypspezifität lässt sich durch die Verwendung zelltypspezifischer Kontrollelemente steuern.
• – Herstellung von Gefrierdünnschnitten, Trocknung
• – Visualisierung und Charakterisierung des gewünschten Zelltyps durch Fluoreszenzmikroskopie und eventuell durch Gegenfärbungen in benachbarten Schnittpräparaten.
• – Isolation der definierten Zelltypen durch Mikrodissektion
• – Gewebeaufschluss und z.B. RNA- bzw. Proteinisolation
• – Falls notwendig und möglich, Amplifikation des biologischen Materials (z.B. RNA)
• – Analyse der Zusammenstzung biologisch relevanter Moleküle in den definierten Zelltypen durch z.B. Microarrays oder andere Technologien.