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Dokumentenidentifikation DE69915310T2 10.03.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001109571
Titel METHODEN ZUR BEHANDLUNG DER SALZABHÄNGIGEN HYPERTONIE
Anmelder Scios Inc., Fremont, Calif., US;
University of Washington, Seattle, Wash., US
Erfinder SCHREINER, F., George, Los Altos Hills, US;
JOHNSON, J., Richard, Seattle, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69915310
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 09.09.1999
EP-Aktenzeichen 999686314
WO-Anmeldetag 09.09.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/20481
WO-Veröffentlichungsnummer 0000013703
WO-Veröffentlichungsdatum 16.03.2000
EP-Offenlegungsdatum 27.06.2001
EP date of grant 03.03.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.03.2005
IPC-Hauptklasse A61K 38/19
IPC-Nebenklasse A61K 39/395   A61P 9/00   G01N 33/50   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Salz-abhängiger Hypertonie, wobei ein Faktor verwendet wird, nämlich VEGF, der die Angiogenese stimuliert und/oder die Gefäßdurchlässigkeit fördert.

Hintergrund der Erfindung

Systemische Hypertonie ist die vorherrschende Herz-Kreislauf-Erkrankung in den Vereinigten Staaten und betrifft über 60 Millionen Amerikaner. Trotz des steigenden öffentlichen Bewusstseins und die schnell steigende Anzahl von blutdrucksenkenden Medikamenten bleibt die Hypertonie eine der Hauptursachen für die kardiovaskuläre Krankheitshäufigkeit und Sterberate. Die Behandlungen von Hypertonie haben sich auf die Stimulation der Relaxation von peripheren Gefäßen (Gefäßerweiterung), die Herabsetzung der Herzfunktion oder die Stimulation des Salztransports durch Hemmung des epithelialen Transports von Natrium oder Chlorid (Harnfluss) konzentriert. „Textbook of Medical Physiology", Guyton und Hall, Hrsg., S. 234 (1996) WB Saunders. Außerdem wurden ungünstige metabolische Effekte bei der Behandlung beobachtet, wenn bestimmte Klassen einer blutdrucksenkenden Behandlung bei der Prävention von koronaren Herzerkrankungen verwendet wurden. „Cecil Textbook of Medicinne", S. 252–269 (1992), WB Saunders. Daher besteht eine Notwendigkeit, verbesserte Verfahren zur Behandlung von Hypertonie zu entwickeln.

Die primäre Hypertonie ist der pathologische Ausdruck der Unfähigkeit, eine ernährungsbedingte Natriumlast effizient auszuscheiden. Die Gründe für die Entwicklung einer primären Hypertonie und ihre Mechanismen sind vollkommen unklar. Gemäß einer von verschiedenen möglichen Theorien hängt die Exkretion einer Natriumlast von der Durchlässigkeit der vaskulären/epithelialen Barriere in den Ausscheidungsorganen wie z. B. der Niere ab und/oder von dem Oberflächengebiet der vaskulären/epithelialen Strukturen, die für den Flüssigkeitsdurchsatz der gelösten Stoffe verfügbar sind.

In Geweben dient die Basalmembran dazu, die Epithelzellen von den Blutgefäßen zu trennen, welche Endothelzellen enthalten, besonders in Hinblick auf den Transport oder den Flüssigkeitsdurchsatz von gelösten Stoffen in Lösung wie z. B. Natriumchlorid durch die Basalmembran. Normalerweise ist das Endothelium relativ undurchlässig, wodurch der Flüssigkeitsdurchsatz von gelösten Stoffen und Flüssigkeiten durch die Basalmembran begrenzt wird, neben der es lokalisiert ist. Die Funktion von mehreren spezialisierten Geweben benötigt jedoch durchlässige Kapillarbetten, um den Flüssigkeitsdurchsatz von gelösten Stoffen zu unterstützen. Solche Funktionen schließen die Filtration von gelösten Stoffen durch die Niere ein, um das intravaskuläre Volumen zu regulieren und den normalen Blutdruck zu erhalten, die Reabsorption von Flüssigkeitsausscheidungen in den Lungen, um die Lungenoxygenation zu erhalten, die Reabsorption von Flüssigkeiten, die gelöste Stoffe enthalten, im Darm, um Nährstoffe zur Verfügung zu stellen, die Herstellung von Hirnflüssigkeit im Plexus choroideus des Gehirns, um das Zentralnervensystem zu unterstützen und zu schützen, die Diffusion von Nährstoffen zum nicht vaskulären Gewebe, wie es in bestimmten Teilen des Auges oder bei der Wundheilung vorkommt, und die Reabsorption von Darmflüssigkeit vom Bauchfell. Ein beeinträchtigter Transport von gelösten Stoffen über die Basalmembrane trägt neben anderen Erkrankungen auch bei zur primären Hypertonie, zur Nierenerkrankung, zum akuten Atemwegserkrankungssyndrom, zur Makulaischämie, zu Entzündungserkrankungen des Darms, zur Meningitis, zum Schlaganfall, zur Bauchwassersucht, zur geschwächten Effizienz der peritonealen Dialyse und zur geschwächten Wundheilung oder verstärkt diese.

Eine Anzahl von Faktoren kann möglicherweise den Flüssigkeitsdurchsatz von gelösten Stoffen zwischen dem Endothelbett und dem Epithelgewebe beeinflussen, welche: (1) die Stoffwechselaktivität der Epithelzellen eines bestimmten Gewebes; (2) die Anzahl der Blutgefäße angrenzend am Epithelium und seiner Basalmembran; und (3) die Porosität oder die Durchlässigkeit der Blutgefäße einschließen. Einige der vorstehen zitierten Erkrankungen sind mit Epithelzelltoxizität wie z. B. das akute Atemnotsyndrom und Nierenerkrankung oder mit der veränderten Integrität der kapillaren Blutgefäße, wie sie bei der Gefäßentzündung oder bei der Ischämie vorkommt, assoziiert. Andere Krankheitssyndrome wie z. B. die primäre Hypertonie besitzen keinen definierten zentralen Mechanismus. Die vorstehend zitierten Erkrankungen können mit einer verringerten Anzahl an Kapillaren oder mit einer veränderten Porosität der Kapillargefäße assoziiert sein.

Die Angiogenese, das heißt das Wachstum neuer kapillarer Blutgefäße, ist ein Prozess, der für die normale Bildung und Reparatur von Gewebe wichtig ist. Folglich sind die Faktoren, welche die Angiogenese fördern können, nützlich als Mittel zur Wundheilung. Die Angiogenese ist ein aus vielen Schritten aufgebauter Prozess, der das Wachstum kapillarer Endothelzellen; die Migration und die Penetration von Gewebe involviert. Eine Anzahl bekannter Faktoren einschließlich des basischen und des sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktors, des transformierenden Wachstumsfaktors &agr; und des epidermalen Wachstumsfaktors sind verbreitet mitogen für eine Vielzahl von Zelltypen sowie Angiogenese fördernd und sind daher möglicherweise nützlich für die Reparatur von Gewebe. Mitogenese mit breitem Spektrum ist in vielen Arten von Anwendungen der Gewebereparatur wünschenswert. Es gibt jedoch spezifische Arten von Anwendungen der Gewebereparatur, in denen es wünschenswert wäre, eine endothelzellspezifische mitogene Aktivität zu haben, da das Zellwachstum von anderen Zelltypen zusammen mit den Endothelzellen eine Blockierung und/oder einen verminderten Blutfluss verursachen könnte.

Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist ein sezerniertes Mitogen für Endothelzellen, welches die Bildung von neuen Blutgefäßen fördert, wenn es in vivo verabreicht wird. Das VEGF-Protein besteht aus zwei Polypeptidketten, die durch zwei Disulfidbrücken verbunden sind. Obwohl das Protein im Allgemeinen als ein Homodimer beschrieben wird, wurde ebenfalls von heterodimeren Arten berichtet. Durch alternatives Spleißen des VEGF-RNA-Transkripts können fünf unterschiedliche Formen der Monomerkette hergestellt werden, die sich über 121, 145, 165, 189 und 206 Aminosäurereste in der Länge erstrecken. Tischer et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 11947–11954; Houck et al., Mol. Endocrinol. 5 (1991), 1806–1814; Charnock-Jones et al., Biol. Reprod. 48 (1993), 1120–1128; und Neufeld et al., Cancer Metastasis Rev. 15 (1996), 153–158. Die Form von VEGF mit 121 Resten (VEGF121) ist einzigartig unter den fünf Formen in der Art, dass sie nicht an Moleküle bindet, die dem Heparin ähnlich sind und mit der extrazellulären Matrix assoziiert sind. VEGF121 und die Form mit 165 Resten, VEGF165, scheinen die am häufigsten in vivo vorherrschenden Formen zu sein.

VEGF ist dafür bekannt, die Bildung neuer Blutgefäße durch die Stimulation des Zellwachstums von Endothelzellen und durch die Induktion der Chemotaxis der Endothelzellen zu stimulieren. Im Gegensatz zu anderen Mitogenen wie z. B. dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor besitzt VEGF einen deutlich begrenzteren Bereich der Zielzellenart und ist fast ausschließlich mitogen bei Endothelzellen. VEGF ist ebenfalls dafür bekannt, die vaskuläre Durchlässigkeit zu verstärken, und kann die Relaxation von Blutgefäßen durch die Ausschüttung von endothelialem Stickstoffmonoxid auslösen. Hariawala et al., J. Surgical Res. 63 (1996), 77–82; und Sellke et al., Am. J. Physiol. 271 (1996), H713–H720. Zusätzlich wurde gezeigt, dass VEGF die Expression anderer Wachstumsfaktoren und von biologischen Botenstoffen reguliert und an einer Wachstumsfaktorkaskade teilnehmen kann, welche die Re-Modellierung und die Reparatur von Gewebe fördert.

Die Wirkung von VEGF wird durch die Interaktion mit spezifischen Membranrezeptoren auf Zielgeweben vermittelt, ganz besonders auf vaskulärem Endothelium. Sowohl VEGF121 als auch VEGF165 sind dafür bekannt, mit zwei Tyrosinkinaserezeptoren zu interagieren: den Kinaseinsertions-Domänen enthaltenden Rezeptor (KDR; auch als Flk-1 bekannt) und die fms-ähnliche Tyrosinkinase-1 (Flt-1). deVries et al., Science 255 (1992), 989–991; Terman et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 187 (1992), 1579–1586; und Millauer et al., Cell 72 (1993), 835–846. Sowohl KDR als auch Flt-1 bestehen aus extrazellulären Liganden-Bindungsdomänen und intrazellulären Tyrosinkinasedomänen, wobei die Letztere bei Beteiligung von VEGF funktionell aktiviert wird. KDR wird nur auf Endothelzellen gefunden, während Flt-1 auf Endothelzellen und Monocyten gefunden wird. Die Angiogenese fördernden Eigenschaften und andere bekannte Funktionen von VEGF scheinen durch KDR und Flt-1 vermittelt zu werden.

Jede menschliche Niere umfasst ungefähr eine Millionen Nephrone, wobei jede einzelne Urin erzeugen kann. Jedes Nephron besitzt zwei Hauptkomponenten: ein Glomerulus, durch das große Mengen Flüssigkeit aus dem Blut gefiltert werden, und ein langes Kanälchen, in dem die gefilterte Flüssigkeit in Urin umgewandelt wird. Die glomeruläre Kapillare hat drei Hauptschichten: das Endothelium, die Basalmembran und eine Schicht von Epithelzellen. Das kapillare Endothelium ist mit Tausenden von kleinen Löchern perforiert, die Fenestrae genannt werden.

VEGF kann die Durchlässigkeit von Blutgefäßen für gelöste Stoffe auf langfristiger Basis durch die Induktion der Bildung von Fenestration zwischen Endothelzellen erhöhen. Roberts und Palade, J. Cell Sci. 108 (1995), 2369–2379; und Esser et al., J. Cell. Biol. 140 (1998), 947–959. Von einigen Geweben wie z. B. dem Glomerulus der Niere ist bekannt, dass das glomeruläre Epithelium dauerhaft VEGF sezerniert, wahrscheinlich um die Fenestration im Epithelium der glomerulären Kapillare zu erhalten. Das Ultrafiltrat der gelösten Stoffe, das schließlich den Urin bildet, der von der Niere hergestellt wird, fließt durch diese Fenestrationen. Der Plexus choroideus im Gehirn, der für die Herstellung der Hirnflüssigkeit verantwortlich ist, und das distale Kanälchen der Niere, in dem Natrium und Kalium zur endgültigen Kontrolle der Konzentration der gelösten Stoffe im Urin ausgetauscht werden, enthält ebenfalls ein mit Fenestrae durchsetztes Endothelium angrenzend an ein Epithelium, das VEGF herstellt. Der richtige Austausch von Natrium und Kalium im distalem Kanälchen ist essentiell für die Erhaltung des normalen intravaskulären Volumens.

Andere Epithelgewebe, von denen bekannt ist, dass sie konstitutiv VEGF herstellen, schließen das Epithelgewebe der Lunge, des Darms und der Haut ein. Ferrara and Davis-Smith, Endocine Rev. 18 (1997), 4–25; und Monacci et al., Am. J. Physiol. 264 (1993), C995–C1002. Nicht-Epithelzellen, die VEGF herstellen, sind Fibroblasten und vaskuläre glatte Muskelzellen, die VEGF als Reaktion auf Sauerstoffmangel im Gewebe sezernieren und damit die Bildung von neuen Blutgefäßen stimulieren. Ferrara and Davis-Smith, Endocine Rev. 18 (1997), 4–25.

Im Gegensatz zu den Mesenzymzellen, die VEGF herstellen, scheint Sauerstoffmangel kein Stimulus für die Herstellung von VEGF in Epithelzellen zu sein. Spezialisierte Epithelgewebe, die VEGF-Rezeptoren in der Abwesenheit von Sauerstoffmangel exprimieren, schließen die glomerulären und peritubulären Kapillaren der Niere, die Kapillaren des Plexus choroideus und die Endothelgewebe im Darm, in der Lunge, Retina und Herzklappe ein. Es ist wenig über die Modulation der VEGF-Sekretion von Epithelgeweben bekannt. Es ist bekannt, dass in der Niere Sauerstoffmangel kein Signal für die Sekretion von VEGF ist. Krämer et al., Kidney International 51 (1997), 444–447. WO98/20027 offenbart die Verwendung von VEGF oder eines Agonisten davon in der Behandlung von intrimaler Hyperplasie, Bluthochdruck und Atherosklerose und bei Bedingungen, die empfänglich für die Behandlung mit Wirkstoffen sind, die Stickstoffmonoxid oder Prostacyclin herstellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Salz-abhängiger Hypertonie. Die Verfahren involvieren im Allgemeinen die Bereitstellung eines Stimulators der Angiogenese und/oder der Porosität der Blutgefäße, um den Transport von gelösten Stoffen einschließlich Natriumchlorid und Flüssigkeit über die Basalmembran zu erhalten oder zu korrigieren, welche die Blutgefäße oder andere Gefäße, die ein Endothelium enthalten, von Epithelzellen trennt. Dieser Transport kann vom Blutgefäß über die Basalmembran zu oder durch die Epithelzellen stattfinden; oder er kann von oder durch die Epithelzellen über die Basalmembran zu den Blutgefäßen vorkommen. Die Stimulation der Anzahl der Gefäße oder ihrer Porosität wird verwendet, um die Effizienz oder das Ausmaß des Transports der gelösten Stoffe zu erhöhen und damit das Blutvolumen und die Begleiterscheinung des Bluthochdrucks zu vermindern.

Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) oder eines Agonisten davon, in einer Menge, die wirksam ist, um den Blutdruck auf einen normalen Bereich zu senken, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Salz-abhängiger Hypertonie. VEGF kann einzeln oder in Kombination mit einem weiteren blutdrucksenkenden Wirkstoff wie z. B. einem anderen angiogenetischen Faktor verabreicht werden.

Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus nativem hVEGF145 (7, SEQ ID NO: 2), nativem hVEGF165 (8, SEQ ID NO: 3), nativem hVEGF189 (9, SEQ ID NO: 4), nativem hVEGF206 (10, SEQ ID NO: 5) und Agonisten von jedem dieser nativen VEGF-Proteine besteht.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform fehlt dem VEGF-Molekül die Fähigkeit Heparin zu binden und es ist z. B. hVEGF121.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines zur Auswahl stehenden blutdrucksenkenden Agonisten eines VEGF-Moleküls für die Herstellung eines Prüfmedikaments, um die Fähigkeit des zur Auswahl stehenden Agonisten im Vergleich zum VEGF-Molekül zu identifizieren, Salz-abhängige Hypertonie in einem Standard-Tiermodell für Salz-abhängige Hypertonie zu behandeln.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine schematische Darstellung der verschiedenen Formen von VEGF, die durch alternatives Spleißen der VEGF-mRNA erzeugt werden. Die Proteinsequenzen, die von jedem der acht Exons des VEGF-Gens codiert werden, sind durch nummerierte Boxen dargestellt. Die Sequenzen, die durch Exon 6 und 7 codiert werden, sind reich an basischen Aminosäureresten und übertragen die Fähigkeit mit Heparin und Heparin-ähnlichen Molekülen zu interagieren. Die Sternchen deuten N-verbundene Glycosylierungsstellen an. Exon 1 und der erste Teil von Exon 2 (dargestellt durch einen engeren Balken) codieren die Sequenz für das Sekretionssignal des Proteins.

2 ist ein Graph, der die Kinetiken der Eliminierung von VEGF121 und VEGF165 aus dem Plasma darstellt, wenn sie intravenös verabreicht werden. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt der Werte dar, die von sechs Ratten erhalten wurden.

3 ist ein Graph, der die Kinetiken der Eliminierung von VEGF121 und VEGF165 aus dem Plasma darstellt, wenn sie subkutan verabreicht werden. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt der Werte dar, die von sechs Ratten erhalten wurden.

4ac sind Graphen des systolischen Blutdrucks, aufgetragen gegen die Tage der Behandlung. 4a: Eine Gruppe von Ratten (ausgefüllte Rauten) wurden mit Futter gefüttert, das normale Mengen (0,1 Gew.-% NaCl) Salz enthielt, während eine zweite Gruppe von Ratten (offene Rauten) für drei Tage ein Futter bekam, das 4 Gew.-% Natriumchlorid enthielt. Der vertikale Pfeil zeigt den Beginn der Nahrung mit hohem Salzgehalt an. 4b: Ratten, die mit Futter mit normalem Salzgehalt (ausgefüllte Rauten) oder mit hohem Salzgehalt (offene Rauten) gefüttert wurden, wie in 4a gezeigt, wurden mit Angiotensin II von Tag 0 bis 14 behandelt. Der vertikale Pfeil zeigt das Absetzen der Behandlung mit Angiotensin II an. 4c: VEGF wurde für 14 Tage zusammen mit einer 7-tägigen Infusion von Angiotensin II (ausgefüllte Dreiecke), Angiotensin II wurde einzeln (ausgefüllte Quadrate) oder keines von beiden (ausgefüllte Rauten) wurde an Ratten verabreicht, die Futter mit hohem Salzgehalt bekamen. Der vertikale Pfeil zeigt den Beginn der VEGF- und/oder der Angiotensin II-Behandlung an.

5 stellt das Gewicht von Herz und Niere von Ratten dar, die behandelt wurden, wie in 4c beschrieben wurde.

6 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 1) und die codierende Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 6) des nativen hVEGF121.

7 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 2) und die codierende Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 7) des nativen hVEGF145.

8 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 3) und die codierende Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 8) des nativen hVEGF165.

9 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 4) und die codierende Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 9) des nativen hVEGF189.

10 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 5) und die codierende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr: 10) des nativen hVEGF206.

11 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 11) des nativen hVEGF110.

12 zeigt die Fähigkeit der VEGF-Behandlung, die Entwicklung der experimentellen Salz-abhängigen Hypertonie in Ratten zu hemmen.

ARTEN DER AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Bei Tieren und bei Patienten mit einer primären Hypertonie kann die Niere einen normalen oder einen fast normalen Blutdruck aufrecht erhalten, wenn das Vorhandensein von Natriumchlorid in der Nahrung stark verringert wird. In dem Modellsystem, das hierin beschrieben wird, sehr ähnlich wie bei der primären Hypertonie eine Salz-abhängige Hypertonie erzeugt, bei der vorrübergehende Kontakt mit einem vorangegangenen hypertensiven Stimulus wie z. B. Angiotensin II (AII) oder Norepinephrin eine Anfälligkeit für Bluthochdruck verleiht, die von der Menge an Natriumchlorid oder von gelösten Stoffen in der Nahrung abhängig ist. Johnson und Schreiner, Kidney International 52 (1997), 1169–1179. Wie bei dem Fall der primären Hypertonie können Nieren mit einem vorangegangenen Kontakt mit einem transienten oder labilen hypertensiven Stimulus nicht die gesteigerte, filtrierte Last von gelösten Stoffen verarbeiten, die durch Kontakt mit Nahrung entsteht, was die Entwicklung eines erhöhten Blutdrucks zur Folge hat. Johnson und Schreiner (1997).

In den meisten Formen der Nierenerkrankung ist die renale Herstellung von VEGF vermindert. Shulman et al., J. Am. Soc. Nephrol. 7 (1996), 661–666. Sowohl VEGF als auch eNOS sind konstitutiv gemeinsam in den Sammelkanälen und dem markhaltigen, dicken, aufsteigenden Schenkel tubulärer Zellen des äußeren Marks der Ratte lokalisiert. Bei der akuten Vasokonstriktion wie z. B. eine, die durch Cyclosporin induziert wurde, kann ein Anstieg sowohl des kortikalen Sauerstoffmangels als auch der VEGF-Expression dokumentiert werden und dies ist in Übereinstimmung mit der bekannten Fähigkeit des Sauerstoffmangels, VEGF-Expression zu induzieren. Unsere Gruppe hat jedoch einen Verlust von VEGF im äußeren Mark beobachtet, besonders im markhaltigen, dicken, aufsteigenden Schenkel, wenn sich eine chronische tubulointerstitielle Erkrankung entwickelt. Diese Ergebnisse wurden nicht nur in Ratten mit einer Cyclosporin induzierten Nephropathie beobachtet, sondern auch bei der tubulointerstitiellen Erkrankung, die mit Altern, Hypokalämie und nach einer Infusion mit Angiotension II einhergeht.

Die meisten Formen einer Nierenerkrankung sind auch mit Bluthochdruck assoziiert, was die Möglichkeit eröffnet, dass die geschwächte Exkretion von gelösten Stoffen bei einer Nierenerkrankung teilweise durch die verringerte endogene Herstellung von VEGF hervorgerufen wird, was eine Abnahme von entweder der Dichte oder der Durchlässsigkeit der renalen Kapillarbetten zur Folge hat.

Während die primäre Hypertonie nicht per se mit einer Nierenerkrankung verbunden ist, ist sie mit einer verringerten renalen, natriuretischen Reaktion auf Salzbelastung oder mit dem erhöhten intravaskulären Volumen oder mit dem erhöhten systemischen Blutdruck assoziiert. Johnson und Schreiner (1997). Bluthochdruck als ein Ausdruck des veränderten Transports von Natriumchlorid über die Basalmembran in der Niere kann eine Folge der verringerten Anzahl oder Porosität des kapillaren Plexus sein, welcher dem Natriumchlorid transportierenden Epithelgewebe des Nierennephrons nützlich ist.

Es wurde nun gezeigt, dass bei der Verwendung eines Models für den Bluthochdruck, das abhängig vom erhöhten Natriumgehalt in der Nahrung ist, die Verabreichung eines angiogenetischen Faktors, der die Anzahl und/oder die Porosität der Kapillare angrenzend an das transportierende Epithelium erhöht, eine erhöhte Last an gelösten Stoffen in der Nahrung erlaubt, so dass sie in einer nicht-hypertensiven Weise verarbeitet werden kann.

Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, könnte ein relativer Mangel an VEGF eine Prädisposition für eine primäre Hypertonie auf verschiedene Weise hervorrufen. Erstens könnte der Verlust der konstitutiven VEGF-Expression an Stellen einer tubulointerstitiellen Schädigung eine Rolle bei dem Verlust an Kapillaren an diesen Stellen spielen, da VEGF ein potenter angiogenetischer Faktor ist. Zweitens ist das Endothelium in den Glomeruli und den peritubulären Kapillaren relativ einzigartig in der Art, dass es eine Fenestration exprimiert. VEGF ist das einzige bekannte Cytokin, dass die endotheliale Fenestration induziert, und die konstitutiven Stellen der VEGF-Expression in der Niere (Podocyten und Sammelkanalzellen) deuten darauf hin, dass sie normalerweise helfen, diesen endothelialen Phänotyp zu erhalten. Es ist möglich, dass der örtliche Verlust von VEGF diese Fenestration verringern könnte und dass dies eine Wirkung auf die glomeruläre Durchlässigkeit (kf) oder die relative Durchlässigkeit der peritubulären Kapillaren hat, die in der Druck-Natriurie (das heißt ein „interstitieller" kf) involviert sind. Schließlich könnte, da VEGF ein potenter Auslöser der eNOS-Expression und der NO-Erzeugung ist, ein Verlust an VEGF theoretisch in einem verringerten Spiegel der lokalen NO-Konzentration resultieren.

Experimente, die in den Beispielen dargelegt werden, in denen VEGF121 in Ratten mit einer tubulointerstitieller Erkrankung infundiert wurde, die entweder durch Angiotension II (AII) oder durch Cyclosporin (CSA) induziert wurde, zeigten, dass eine VEGF-Infusion die Entwicklung der Salz-abhängigen Hypertonie verhindern konnte, und im CSA-Model wurde gezeigt, dass dieser Effekt anhält, auch nachdem die Verabreichung von VEGF beendet wurde.

Ein angiogenetischer Faktor wie z. B. VEGF könnte die richtige Reaktion auf Salzbelastung durch die Wiederherstellung des Trans-Basalmembran-Transports von gelösten Stoffen wie Natrium und Chlorid wiederherstellen. Dem entsprechend kann die Behandlung von Bluthochdruck nun durch die Erhöhung von entweder der Dichte der Kapillaren angrenzend an die Basalmembran, der Porosität der Kapillaren oder von beiden vermittelt werden.

Es gab keinen vorhergehenden Versuch, die Exkretion von Natriumchlorid durch die Niere durch Stimulation der Angiogenese und/oder der Porosität der Blutgefäße zu stimulieren, welches die Normalisierung des Blutdrucks zur Folge hat. Keine vorangegangene Therapie hat auf das Endothelium gezielt, um die Effizienz des Transports von gelösten Stoffen zu verbessern. Tatsächlich wurde bisher vermutet, dass die Verabreichung eines angiogenetischen Faktors in diesem Kontext nachteilig sein würde. Es wurde nun herausgefunden, dass, unähnlich anderen Therapien, die angiogenetische Therapie sich auch an die Mechanismen richtet, durch welche die Niere geschädigt ist mit Bezug auf die Exkretion einer erhöhten Salzlast.

Dem entsprechend behandeln die Verfahren der vorliegenden Erfindung Bluthochdruck durch die Verabreichung einer Menge eines angiogenetischen Faktors, die effektiv ist, den Bluthochdruck zu senken. Solche Faktoren können die Angiogenese stimulieren und/oder die vaskuläre Durchlässigkeit fördern.

Allgemeine Techniken

Die Ausübung der vorliegenden Erfindung wird, außer es wird anders angezeigt, konventionelle Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), der Mikrobiologie, der Zellbiologie, der Biochemie und der Immunologie verwenden, welche dem Fachgebiet angehören. Solche Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt, wie z. B. in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); „Oligonucleotide Synthesis" (MJ Gait, Hrsg., 1984); „Animal Cell Culture" (RI Freshney, Hrsg., 1987); „Methods of Enzymology" (Academic Press, Inc.); „Handbook of Experimental Immunolgy" (DM Weir & CC Blackwell, Hrsg.); „Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (JM Miller & MP Calos, Hrsg., 1987); „Current Protocols in Molecular Biology" (FM Ausubel et al., Hrsg., 1987); „PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., Hrsg., 1994); und „Current Protocols in Immunology" (JE Coligan et al., Hrsg., 1991).

Definitionen

Der Ausdruck „angiogenetischer Faktor", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedes beliebige Molekül (einschließlich Polypeptide, Peptide und kleine Moleküle), die das Wachstum von neuen Blutkapillargefäßen aus dem existierenden Endothelgewebe (Angiogenese) fördern und/oder die vaskuläre Durchlässigkeit erhöhen können (Förderung der Porosität der Blutgefäße). Angiogenetische Faktoren schließen vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (VEGFs) in allen Formen ein, einschließlich der VEGF-Moleküle mit nativer Sequenz von jeder beliebigen Tierart, einschließlich des Menschen, und ihre funktionellen Derivate, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) wie z. B. saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (aFGFs und bFGFs) in allen Formen, einschließlich der FGF-Moleküle mit nativer Sequenz von jeder beliebigen Tierart, einschließlich des Menschen, und ihre funktionellen Derivate, und VEGF-verwandte Moleküle wie z. B. PIGF, VEGF-B und VEGF-C/VRP, einschließlich aller Formen mit nativer Sequenz von jeder beliebigen Tierart, einschließlich des Menschen und anderer Säugerarten wie z. B. murine Arten, Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Hunde oder Katzen, und ihre funktionellen Derivate, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Definition schließt besonders homo- und heterodimere Formen von diesen und von verwandten Molekülen ein, wenn Dimerisierung für die biologische Aktivität notwendig ist.

Solche Faktoren schließen VEGF, in jeder seiner Formen, und andere angiogenetische Faktoren ein, einschließlich des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors und des sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktors, sind aber nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich schließen diese Faktoren solche ein, welche die Herstellung von VEGF oder anderer angiogenetischer Faktoren oder die Expression von VEGF-Rezeptoren oder von Rezeptoren anderer angiogenetischer Faktoren stimulieren. Solche Faktoren schließen von Trombocytenstammenden Wachstumsfaktor (PDGF), den transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-&agr; oder -&bgr;), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) in jeder seiner Formen, den Heparin-bindenden, epidermalen Wachstumsfaktor (HBEGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Adenosin, Prostaglandine (PGs) und Wirkstoffe, welche die Proteinkinase C, Proteinkinase A oder GTPaseaktivierende Ras-Proteine aktivieren, ein, aber nicht auf diese beschränkt.

Additionen, Substitutionen oder Deletionen von Teilen jedes beliebigen angiogenetischen Faktors sind akzeptierbar, solange die Modifikationen dem Faktor erlauben, seine biologische Aktivität zu behalten. Repräsentative Messverfahren der biologischen Aktivität sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen die Initiation oder die Förderung von Angiogenese in vivo und/oder die Förderung der Porosität von Blutgefäßen in vivo oder die Stimulation der endothelialen Mitose oder Chemotaxis oder die Herstellung von Stickstoffmonoxid in vitro oder in vivo oder die Förderung der Erzeugung und der Absonderung von Faktoren, welche die vorstehend erwähnten Effekte erzeugen, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise ist ein „biologisch aktiver, angiogenetischer Faktor" einer, der die Angiogenese verstärkt und/oder die vaskuläre/kapillare Durchlässigkeit erhöht. Ein angiogenetischer Faktor kann ein Teil eines Fusionspolypeptids sein, z. B. eines, das einen Teil umfasst, welches der angiogenetische Faktor ist, und wenigstens ein weiteres Teil, das ein anderes Polypeptid umfasst. Beispiele schließen Epitop-markierte angiogenetische Faktoren ein. Kovalente Modifikationen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sind ebenfalls möglich und sind für die Verwendung hierin eingeschlossen. Eine besonders erklärte biologische Aktivität für den Zweck dieser Erfindung ist die Fähigkeit Hypertonie zu vermindern, vorzugsweise zu normalisieren.

Der Ausdruck „ein Faktor, der die Herstellung eines angiogenetischen Faktors stimuliert" und grammatikalische Äquivalente davon werden im weitesten Sinn verwendet und schließen Verbindungen (native Polypeptide und Peptide und deren Varianten, kleine Moleküle, Antikörper, etc.) ein, welche die Expression von angiogenetischen Faktoren oder von Rezeptoren von angiogenetischen Faktoren stimulieren, unabhängig vom Mechanismus durch den diese Stimulation hervorgerufen wird. Wie vorstehend angemerkt, solche Faktoren schließen zum Beispiel den von Trombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) in allen Formen, den transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) in allen Formen, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) in allen Formen, den Heparin-bindenden, epidermalen Wachstumsfaktor, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Adenosin, Prostaglandine oder Wirkstoffe ein, welche die Proteinkinase C, Proteinkinase A oder GTPaseaktivierende Ras-Proteine aktivieren. Die Bezeichnungen der aufgelisteten angiogenetischen Faktoren schließen besonders alle natürlich vorkommenden Formen von jeder beliebigen Tierart ein, einschließlich des Menschen und anderer Säugeraten wie z. B. murine Arten, Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Hunde oder Katzen, und funktionelle Derivate davon.

Der Ausdruck „vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor" oder „VEGF", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jede natürlich vorkommende (native) Form eines VEGF-Polypeptids (auch bekannt als „vaskulärer Permeabilitätsfaktor" oder „VPF") von jeder beliebigen Tierart, einschließlich des Menschen und anderer Säugerarten wie z. B. murine Arten, Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Hunde oder Katzen, und funktionelle Derivate davon. Der „native, menschliche VEGF" besteht aus zwei Polypeptidketten, die im Allgemeinen als Homodimere vorkommen. Jedes Monomer kommt als eine von fünf bekannten Isoformen vor, die aus 121, 145, 165, 189 und 206 Aminosäureresten in der Länge bestehen. Diese Isoformen werde hierin nachstehend als hVEGF121, hVEGF145, hVEGF165, hVEGF189 beziehungsweise als hVEGF206 bezeichnet. Ähnlich dem menschlichen VEGF sind der „native murine VEGF" und der „native Rinder-VEGF" dafür bekannt, in mehreren Isoformen mit 120, 164 und 188 Aminosäuren in der Länge zu existieren, die im Allgemeinen als Homodimere vorkommen. Mit der Ausnahme von hVEGF121 sind alle nativen, menschlichen VEGF-Polypeptide basische, Heparin-bindende Moleküle. Der hVEGF121 ist ein schwach saures Polypeptid, das nicht an Heparin bindet. Diese und ähnliche native Formen, unabhängig davon, ob sie bekannt sind oder in Zukunft offenbart werden, sind alle in der Definition des „nativen VEGF" oder des „VEGF mit nativer Sequenz", unabhängig von der Art ihrer Herstellung eingeschlossen, gleichermaßen ob sie von der Natur isoliert, synthetisiert, durch Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie oder durch Kombination von diesen oder anderen Techniken hergestellt wurden. Der Ausdruck „vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor" oder „VEGF" schließt VEGF-Polypeptide in monomeren, homodimeren und heterodimeren Formen ein. Die Definition von „VEGF" schließt auch eine 110 Aminosäuren lange, menschliche VEGF-Art (hVEGF110) ein und ihre homologen Formen von anderen Säugerarten wie z. B. murine Arten, Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Hunde oder Katzen und funktionelle Derivate davon. Zusätzlich deckt der Begriff „VEGF" chimäre, dimere Proteine ab, in denen ein Teil der primären Aminosäurestruktur entweder einem Teil der Untereinheit der A-Kette oder der Untereinheit der B-Kette des von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktors entspricht, und ein Teil der primären Aminosäurestruktur entspricht, einem Teil des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors. In einer besonderen Ausführungsform wird ein chimäres Molekül zur Verfügung gestellt, das aus einer Kette besteht, die mindestens einen Teil der Untereinheit der A- oder B-Kette des von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktors umfasst, der über eine Disulfidbrücke mit einer zweiten Kette verbunden ist, die mindestens einen Teil des VEGF-Moleküls umfasst. Mehr Details solcher Dimere werden zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,194,596 und 5,219,739 und im Europäischen Patent EP-B 0 484 401 zur Verfügung gestellt. Die Nucleotid- und die Aminosäuresequenzen von hVEGF121 und Rinder-VEGF120 sind zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,194,596 und 5,219,739 und im Europäischen Patent EP 0 484 401 offenbart. Der hVEGF145 ist in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/10071 beschrieben, der hVEGF165 ist im U.S. Patent Nr. 5,332,671 beschrieben; der hVEGF189 ist im U.S. Patent Nr. 5,240,848 beschrieben; und der hVEGF206 ist in Houck et al., Mol. Endocrinol. 5 (1991), 1806–1814 beschrieben. Andere VEGF-Polypeptide und -Polynucleotide wurden beschrieben, einschließlich zum Beispiel zvegf2 (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/24811) und VRP (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/09427) und sind ebenfalls mit dem Begriff VEGF eingeschlossen. Für die Offenbarung der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von verschiedenen menschlichen VEGF-Isoformen vgl. auch Leung et al., Science 246 (1989), 1306–1309; Keck et al., Science 246 (1989), 1309–1312; Tisher et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 11947–11954; EP 0 370 989; und PCT-Veröffentlichung WO 98/10071. Die Formen von VEGF sind schematisch in 1 dargestellt. Die 211 (SEQ ID Nr: 1–10) zeigen die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von verschiedenen VEGF-Arten. Für einen ausführlicheren Übersichtsartikel vgl. auch Klagsburn und D'Amore, Cytokine and Growth Factor Reviews 7 (1996), 259–170.

Der Ausdruck „VEGF" umfasst ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die im Wesentlichen homolog zu einer oder zu mehreren der vorstehend genannten nativen VEGF-Polypetiden ist, und das eine biologische Aktivität behält, die mit VEGF assoziiert ist. Eine Aminosäuresequenz wird hierin als „im Wesentlichen homolog" eingestuft, wenn der Grad der Aminosäuresequenzhomologie mindestens ungefähr 50% beträgt, vorzugsweise mindestens ungefähr 80%, stärker bevorzugt mindestens ungefähr 90% und am stärksten bevorzugt mindestens ungefähr 95%, wenn sie mit dem in Frage kommenden, nativen VEGF-Protein verglichen wird.

In dem Bereich des „VEGF" sind hierin ebenfalls biologisch aktive Fragmente davon sowie Versionen davon, die am N-Terminus oder C-Terminus erweitert sind, oder Analoge davon eingeschlossen, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste substituiert und/oder deletiert oder inseriert sind und die qualitativ die biologischen Aktivitäten des hierin beschriebenen Proteins behalten. Bevorzugte Analoge schließen solche ein, in denen ein oder mehrere Cysteinreste, die nicht notwendig für die biologische Aktivität sind, durch einen anderen Aminosäurenrest substituiert sind, vorzugsweise Serin. Die Substitution von einem oder mehreren Cysteinresten vermindert die Möglichkeit für intermolekulare und intramolekulare Bildung von Disulfidbrücken und macht damit das Molekül stabiler. Es gibt zum Beispiel neun Cysteinreste, die in hVEGF121 und hVEGF165 enthalten sind. Von diesen sind acht in PDGF konserviert. Dementsprechend ist ein bevorzugtes Analog eines, in dem der neunte Cysteinrest durch Serin substituiert ist. Dieser Cysteinrest liegt an Position 160 von hVEGF165 und an Position 116 von hVEGF121. Substitutionen von Aminosäuren können durch die ortspezifische Mutagenese der hierin beschriebenen DNA-Sequenzen erreicht werden, wobei gut bekannte Techniken verwendet werden. Vgl. z. B. Zoller and Smith, Nucleic Acids Research 10 (1982), 6487–6500.

Der Ausdruck „VEGF" schließt besonders homodimere und heterodimere Formen des VEGF-Moleküls ein, in denen das Dimer durch Disulfidbindungen zwischen den Ketten von zwei Untereinheiten erzeugt wird. Homodimere können an beiden ihrer Untereinheiten nicht glycosyliert oder glycosyliert sein, während in Heterodimeren eine Untereinheit glycosyliert und die andere nicht glycosyliert sein kann. Der Ausdruck „VEGF" schließt im Besonderen nicht nur Varianten der Aminosäuresequenz, sondern auch Varianten der Glycosylierung des nativen VEGF-Moleküls ein.

Der Ausdruck „VEGF" deckt zusätzlich chimäre, dimere Proteine ab, in denen ein Teil der primären Aminosäurestruktur entweder einem Teil der Untereinheit der A-Kette oder der Untereinheit der B-Kette des von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktors entspricht, und Teil der primären Aminosäurestruktur einem Teil des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors entspricht. In einer besonderen Ausführungsform wird ein chimäres Molekül zur Verfügung gestellt, das aus einer Kette besteht, die mindestens einen Teil der Untereinheit der A- oder B-Kette des Thrombozyten-Wachstumsfaktors umfasst und die über eine Disulfidbrücke mit einer zweiten Kette verbunden ist, die mindestens einen Teil des VEGF-Molküls umfasst. Mehr Details von solchen Dimeren werden zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,194,596 und 5,219,739 und im Europäischem Patent EP-B 0 484 401 zur Verfügung gestellt, wobei die Offenbarung davon hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen werden.

Das Nummerierungssystem der Aminosäuresequenz, das hierin für VEGF verwendet wurde, basiert auf die reifen Formen des Proteins, das heißt auf die post-translational, prozessierten Formen. Dementsprechend ist der als Nummer Eins bezeichnete Rest in menschlichen Proteinen Alanin, welches der erste Rest der isolierten, reifen Formen dieser Proteine ist.

Ein „Polynucleotid, das Sequenzen umfasst, die einen angiogenetischen Faktor codieren", schließt ein Polynucleotid ein, das Sequenzen umfasst, die einen beliebigen der vorstehend erwähnten angiogenetischen Faktoren codieren. Viele solcher Polynucleotide wurden offenbart, einschließlich zum Beispiel die in den vorstehend erwähnten Referenzen, wobei VEGF-Polypeptide offenbart werden. Der Ausdruck umfasst Polynucleotid-Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit den offenbarten Sequenzen hybridisieren, solange das davon codierte Polypeptid biologisch aktiv ist, das heißt, es erhöht die Angiogenese und/oder es erhöht die vaskuläre Durchlässigkeit.

Die Ausdrücke „Vektor", „Polynucleotidvektor", „Konstrukt" und „Polynucleotidkonstrukt" werden hierin austauschbar verwendet. Ein Polynucleotidvektor dieser Erfindung kann in jeder von verschiedenen Formen vorliegen, einschließlich RNA, DNA, in einer Adenovirushülle verkapselte DNA, in einer anderen viralen oder virusähnlichen Form (wie zum Beispiel Herpes simplex und AAV) verpackte DNA, in Liposomen eingekapselte DNA, mit Polylysin komplexierte, mit synthetischen, polykationischen Molekülen komplexierte, mit Transferrin konjugierte, mit Verbindungen wie PEG komplexierte DNA, um das Molekül immunologisch zu „maskieren" und/oder die Halbwertzeit zu erhöhen, oder mit einem nicht-viralen Protein konjugierte DNA, ist aber nicht darauf beschränkt. Ein Polynucleotidvektor dieser Erfindung kann in der Form eines beliebigen Verabreichungsvehikels vorliegen, das hierin beschrieben wurde. Vorzugsweise ist das Polynucleotid DNA. „DNA", wie der Begriff hierin verwendet wird, schließt nicht nur die Basen A, T, C und G ein, sondern es schließt auch jedes beliebige Analog von ihnen ein oder modifizierte Formen dieser Basen wie z. B. methylierte Nucleotide, Internucleotid-Modifikationen wie z. B. ungeladene Bindungen und Thioate, die Verwendung von Zucker-Analogen und modifizierte und/oder alternative Rückgratstrukturen wie z. B. Polyamide.

„Unter transkriptioneller Kontrolle" ist ein Begriff, der auf dem Fachgebiet gut verstanden wird und der andeutet, dass die Transkription einer Polynucleotidsequenz, normalerweise einer DNA-Sequenz, abhängig davon ist, dass sie funktional (operativ) an ein Element gebunden ist, das zu der Vereinheitlichung der Transkription beiträgt oder diese fördert.

Eine „Wirtszelle" schließt eine individuelle Zelle oder eine Zellkultur ein, die ein Empfänger von jedem beliebigen Vektor dieser Erfindung sein kann oder wurde. Wirtszellen schließen die Nachkommen einer einzelnen Wirtszelle ein und die Nachkommen müssen durch natürliche, zufällige oder absichtliche Mutationen und/oder Veränderungen nicht notwendigerweise zu der ursprünglichen Elternzelle vollständig identisch (in Morphologie oder im vollständigen DNA-Gehalt) sein. Eine Wirtszelle schließt Zellen ein, die transfiziert oder in vivo mit einem Vektor infiziert wurde, der ein Polynucleotid umfasst, das einen angiogenetischen Faktor codiert.

Ein „Individuum" ist ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch. Säuger schließen Farmtiere, Sporttiere und Haustiere ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.

Eine „effektive Menge" ist eine Menge, die ausreichend ist, um ein günstiges oder ein erwünschtes klinisches Resultat zu erzielen. Eine effektive Menge kann in einer oder in mehreren Verabreichungen verabreicht werden. Für die Zielsetzungen dieser Erfindung ist eine effektive Menge eines angiogenetischen Faktors eine Menge, die ausreichend ist, um das Fortschreiten des Krankheitsstadiums zu lindern, zu bessern, zu stabilisieren, umzukehren, zu verlangsamen oder zu verzögern. Die „effektive Menge" für die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung ist insbesondere definiert als eine Menge, die Bluthochdruck in einem akzeptierten Tiermodell für die Hypertonie vermindern und vorzugsweise, zumindest transient, normalisieren kann, wie zum Beispiel im Tiermodell für Salz-abhängige Hypertonie, das hierin in Beispiel 2 enthüllt wird.

Der Ausdruck die „Behandlung", wie er hierin verwendet wird, ist ein Ansatz für die Erzielung von günstigen oder erwünschten klinischen Ergebnissen. Für die Zielsetzungen dieser Erfindung schließen günstige oder erwünschte klinische Ergebnisse die Linderung von Symptomen, die Verminderung des Ausmaßes der Erkrankung, die Stabilisierung (das heißt die Nicht-Verschlechterung) des Erkrankungsstadiums, die Verzögerung oder die Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung, die Verbesserung oder Linderung des Krankheitsstadiums und die Remission (entweder partiell oder vollständig) ein, unabhängig davon, ob dies detektierbar oder nicht detektierbar ist, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die „Behandlung" kann ebenfalls die Verlängerung des Überlebens bedeuten, wenn diese mit dem erwarteten Überleben verglichen wird, wenn keine Behandlung erhalten wird. Die „Behandlung" ist ein Eingriff, die mit der Intention durchgeführt wird die Entwicklung zu verhindern oder die Pathologie einer Erkrankung zu verändern. Dementsprechend bezieht sich die „Behandlung" sowohl auf eine therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Diejenigen, die eine Behandlung benötigen, schließen solche ein, welche die Erkrankung bereits haben, sowie solche, bei denen die Erkrankung verhindert werden soll. Dementsprechend ist die Behandlung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Eingriff, der mit der Absicht durchgeführt wird, die Entwicklung eines hohen Blutdrucks in Risiko-Patienten zu verhindern und/oder einen erhöhten Blutdruck zu vermindern, vorzugsweise auf einen normalen Wert. Für die Erhaltung von akzeptierbaren Werten des Blutdrucks können wiederholte Behandlungen für eine ausgedehnte Zeitperiode notwendig sein.

Die „Linderung" einer Erkrankung bedeutet, dass das Ausmaß und/oder die unerwünschten, klinischen Manifestationen eines Krankheitsstadiums verringert wird und/oder der Zeitverlauf des Fortschreitens verlangsamt oder verlängert werden im Vergleich zu der Nicht-Verabreichung eines Faktors, der die Angiogenese verstärkt und/oder die vaskuläre Durchlässigkeit erhöht.

Die Effektivität wird durch den gesenkten Blutdruck in Antwort auf eine Salzbelastung bestimmt. Verfahren zum Messen des Blutdrucks sind auf dem Fachgebiet bekannt und müssen hierin nicht beschrieben werden.

Die „Sequenzidentität" ist als prozentualer Anteil der Aminosäurereste einer zur Auswahl stehenden Sequenz definiert, die mit den Aminosäureresten einer nativen Polypeptidsequenz nach dem Ausrichten der Sequenzen und dem Einführen von Lücken, falls notwendig, um die maximale, prozentuale Sequenzidentität zu erzielen identisch sind, wobei alle beliebigen konservativen Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität berücksichtigt werden. Die %-Werte der Sequenzidentität werden mittels der NCBI BLAST2.0-Software erzeugt, wie sie durch Altschul et al., „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25 (1997), 3389–3402 definiert ist. Die Parameter werden als Defaultwerte festgesetzt mit der Ausnahme des Penalty-Werts für Ungleichheit, der auf –1 festgelegt wird.

Für die Zielsetzung der Behandlung beziehen sich „Säuger" auf jedes beliebige Tier, das als Säuger klassifiziert ist, einschließlich des Menschen, einheimischer und Farmtiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere wie z. B. Pferde, Schafe, Kühe, Schweine, Hunde Katzen, etc. Vorzugsweise ist der Säuger ein Mensch.

„Träger", wie der Begriff hierin verwendet wird, schließen pharmazeutisch verträgliche Träger, Excipienten oder Stabilisatoren ein, die nichttoxisch für die Zelle oder für den Säuger sind, die damit in den verwendeten Dosen und Konzentrationen in Kontakt kommen. Häufig ist der physiologisch verträgliche Träger eine wässrige, pH gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch verträgliche Träger schließen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit einem niedrigen Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste); Proteine wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatbildende Stoffe wie z. B. EDTA; Zuckeralkohle wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische grenzflächenaktive Mittel wie z. B. TWEENTM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICSTM ein.

Die Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Wirkstoffen schließt die gleichzeitige (zusammenfallende) und die konsekutive Verabreichung in jeder Reihenfolge ein.

Der Ausdruck „Agonist" wird im weitesten Sinn verwendet und schließt jedes Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines nativen angiogenetischen Faktors nachahmt, wie z. B. eines nativen VEGF-Polypeptids, das hierin offenbart wird. Für die Zielsetzung der hierin beanspruchten Verfahren ist die nachgeahmte biologische Aktivität die Fähigkeit, einen erhöhten Blutdruck zu reduzieren. Geeignete Moleküle schließen ins besondere einen agonistischen oder antagonistische Antikörper oder agonistische oder antagonisitische Antikörperfragmente ein, Fragmente oder Varianten von Aminosäuresequenzen nativer Polypeptide, Peptide, kleine organische Moleküle, etc.

Ein „kleines Molekül" ist hierin so definiert, dass es ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Dalton hat.

„Native Antikörper" und „native Immunglobuline" sind im Allgemeinen heterotetramere Glycoproteine von etwa 150000 Dalton, die aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten aufgebaut sind. Jede leichte Kette ist mit einer schweren Kette durch eine kovalente Disulfidbindung verbunden, während die Anzahl der Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten bei verschiedenen Isotypen der Immunglobuline variiert. Jede schwere und leichte Kette hat ebenfalls in regelmäßigen Abständen Disulfidbrücken innerhalb derselben Kette. Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne (VH), die von einer Anzahl konstanter Domänen gefolgt wird. Jede leichte Kette hat an einem Ende eine variable Domäne (VL) und eine konstante Domäne am anderen Ende; die konstante Domäne der leichten Kette ist mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette angeordnet und die variable Domäne der leichten Kette ist mit der variablen Domäne der schweren Kette angeordnet. Von besonderen Aminosäureresten wird angenommen, dass sie eine Schnittstelle zwischen den variablen Domänen der leichten und der schweren Kette bilden.

In Abhängigkeit von der Aminosäurensequenz der konstanten Domäne der schweren Ketten können Immunglobuline in verschiedene Klassen unterteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen der Immunglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM und mehrere von diesen können weiter in Unterklassen (Isotypen) wie z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2 unterteilt werden. Die konstanten Domänen der schweren Ketten, die den verschiedenen Klassen der Immunglobuline entsprechen, werden als &agr;, &dgr;, &egr;, &ggr; beziehungsweise &mgr; bezeichnet. Die Strukturen der Untereinheiten und die drei-dimensionalen Konfigurationen der verschiedenen Klassen der Immunglobuline sind gut bekannt.

Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass sich bestimmte Teile der variablen Domäne deutlich in der Sequenz bei Antikörpern unterscheiden und dass sie für die Bindung und für die Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein bestimmtes Antigen verwendet werden. Die Variabilität ist jedoch nicht gleichmäßig über die gesamte variable Domäne der Antikörper verteilt. Sie ist in drei Segmenten konzentriert, welche die Komplementarität bestimmende Regionen (CDRs) oder die hypervariable Regionen sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette als auch der schweren Kette genannt werden. Die stärker konservierten Teile der variablen Domänen werden Gerüst (FR) genannt. Die variablen Domänen der nativen schweren und leichten Ketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, wobei sie größtenteils eine &bgr;-Faltblattkonfiguration annehmen und durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen, die die &bgr;-Faltblattstruktur zusammenhalten und in einigen Fällen Teile der &bgr;-Faltblattstruktur bilden. Die CDRs in jeder Kette werden in enger Nachbarschaft durch die FR-Regionen beieinander gehalten und tragen zusammen mit den CDRs von der anderen Kette zu der Erzeugung des antigenbindenden Orts des Antikörpers bei (vgl. Kabat et al., NIH Veröffentl.-Nr. 91-3242 (1991), Bd. I, Seiten 647–669). Die konstanten Domänen sind nicht direkt bei der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, aber sie zeigen mehrere Effektor-Funktionen wie z. B. bei der Teilnahme des Antikörpers in der Antikörper abhängigen zellulären Toxizität.

Der Ausdruck „hypervariable Region", wenn er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste von einer „Komplementarität bestimmenden Region" bis „CDR" (das heißt Reste 21–34 (L1), 50–56 (L2) und 89–97 (L3) in der variablen Domäne der leichten Kette und 31–35 (H1), 50–65 (H2) und 95–102 (H3) der variablen Domäne der schweren Kette; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausg. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD [1991]) und/oder solche Reste von einer „hypervariablen Schleife" (das heißt Reste 26–32 (L1), 50–52 (L2) und 91–96 (L3) in der variablen Domäne der leichten Kette und 26–32 (H1), 53–55 (H2) und 96–101 (H3) in der variablen Domäne der schweren Kette; (Clothia und Lesk, J. Mol. Biol. 19–6: 901–917 [1987]). „Gerüst"- oder „FR"-Reste sind solche Reste von variablen Domänen, die keine Reste der hypervariablen Region sind, wie sie hierin definiert wurden.

Der Ausdruck „Antikörper" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und deckt besonders, ohne Eingrenzungen, intakte, monoclonale Antikörper, polyclonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper), die von mindesten zwei intakten Antikörpern erzeugt wurden, und Antikörperfragmente ab, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.

„Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder die variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele von Antikörperfragmenten schließen zum Beispiel Fab-, Fab'-, F(ab')2- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057–1062 [1995]); Einzelketten-Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper ein, die von Antikörperfragmenten gebildet werden.

Der Ausdruck „monoclonaler Antikörper", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Antikörper, der von einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, das heißt, die individuellen Antikörper, welche die Population umfassen, sind identisch mit Ausnahme von möglichen, natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorkommen können. Monoclonale Antikörper sind hochspezifisch, wobei sie gegen einen einzelnen Antigenort gerichtet sind. Des weiteren ist jeder monoclonale Antikörper im Gegensatz zu den konventionellen (polyclonalen) Antikörperherstellungen, die typischerweise verschiedene Antikörper einschließen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Die nähre Bestimmung „monoclonal" zeigt den Charakter des Antikörpers an, dass er von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wurde, und sollte nicht so ausgelegt werden, dass die Herstellung des Antikörpers ein bestimmtes Verfahren benötigt. Zum Beispiel können die monoclonalen Antikörper, die im Einvernehmen mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch das Hybridomverfahren hergestellt werden, dass zuerst von Köhler et al., Nature 256 (1975), 495 beschrieben wurde, oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (vgl. z. B. US-Patent Nr. 4,816,567). Die „monoclonalen Antikörper" können ebenfalls aus Phagen-Antikörper-Banken isoliert werden durch Verfahren, die zum Beispiel in Clackson et al., Nature 352 (1991) 624–628 oder in Marks et al., J Mol Biol 222 (1991), 581–597 beschrieben wurden.

Die monoclonalen Antikörper hierin schließen spezifisch „chimäre" Antikörper ein, in denen die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Antikörpers von einer Säugerart (typischerweise von einem Nagetier, z. B. einer Maus, Ratte oder einem Kaninchen) abgeleitet ist, während die konstante Region von einer anderen Säugerart (typischerweise von einem Menschen) abgeleitet ist, sowie Fragmente von solchen Antikörpern, solange sie die gewünschte, biologische Aktivität zeigen (US-Patent Nr. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851–6855).

„Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z. B. murinen) Antikörper enthalten minimale Sequenzen, die von nicht-menschlichen Immunglobuline abgeleitet sind. Hauptsächlich sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste von der CDR des Empfängers durch Reste von der CDR einer nicht-menschlichen An (Spender-Antikörper) wie z. B. von Maus, Ratte oder Kaninchen ausgetauscht werden, welche die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität besitzen. In einigen Fällen sind die Fv-FR-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ausgetauscht. Des weiteren können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Empfänger-Antikörper noch in den importierten CDR- oder den Gerüstsequenzen gefunden werden. Der humanisierte Antikörper wird optimalerweise wenigstens einen Teil einer konstanten Region (Fc) des Immunglobulins enthalten, typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin. Für weitere Details vgl. Jones et al., Nature 321 (1986), 522–525; und Reichmann et al., Nature 332 (1988), 323–329. Der humanisierte Antikörper schließt einen PRIMATIZEDTM-Antikörper ein, wobei die antigenbindende Region des Antikörpers von einem Antikörper abgeleitet ist, der durch die Immunisierung von Makanen-Affen mit dem Antigen des Interesses hergestellt wird.

„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und die VL-Domänen des Antikörpers, wobei diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid des weiteren einen Polypetid-Linker zwischen den VH- und VL-Domänen, welcher dem Fv ermöglicht, die gewünschte Struktur die Antigenbindung zu erzeugen. Für einen Übersichtsartikel über sFv vgl. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg and Moore Hrsg., Springer Verlag, New York, S. 269–315 (1994).

Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, deren Fragmente eine variable Domäne der schweren Kette (VH) umfassen, die mit einer variablen Domäne der leichten Kette (VL) in der gleichen Polypeptidkette (VH – VL) verbunden ist. Durch die Verwendung eines Linkers, welcher zu kurz ist, um eine Paarbildung zwischen den beiden Domänen der gleichen Kette zu erlauben, werden die Domänen dazu gebracht, eine Paarbildung mit den komplementären Domänen einer anderen Kette einzugehen und zwei Antigen-Bindungsstellen zu erzeugen. Diabodies sind vollständiger zum Beispiel in EP 404,097; WO 93/11161; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444–6448 beschrieben.

Angiogenetische Faktoren

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Salz-abhängiger Hypertonie, wobei sie die Verabreichung einer effektiven Menge von VEGF umfasst. Der VEGF, der geeignet für die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist, kann die Angiogenese fördern (oder erhöhen oder induzieren) und/oder die vaskuläre oder kapillare Durchlässigkeit fördern (oder erhöhen oder induzieren). VEGF kann einzeln oder in Kombination mit (einem) anderen angiogenetischen Faktoren) oder anderen therapeutischen Wirkstoffen verwendet werden.

Ein angiogenetischer Faktor kann eine biologische oder eine chemische Verbindung sein wie z. B. ein einfaches oder ein komplexes organisches oder anorganisches Molekül, ein Peptid oder ein Protein. Eine große Bandbreite von Verbindungen kann synthetisiert werden, z. B. Oligopeptide und synthetische, anorganische und organische Verbindungen, die auf verschiedene Kernstrukturen basieren, und diese sind ebenfalls eingeschlossen.

Ob ein angiogenetischer Faktor die Angiogenese fördert, kann durch jedes beliebige bekannte Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein Material, das als Matrix für das Eindringen von neuen Blutgefäßen dient wie zum Beispiel Gelatine oder Matrigel, subkutan in ein Tier implantiert werden. Der implantierte Schwamm kann mit einem mutmaßlichen angiogenetischen Faktor behandelt werden und nach einem geeigneten Zeitraum, z. B. nach 7 oder 14 Tagen, kann das Implantat entfernt und morphometrisch zur Quantifizierung der Blutgefäße untersucht werden, die in das Implantat eingedrungen sind. In einer anderen Ausführungsform können die Implantate auf die Anwesenheit eines endothelialen Zellmarkers wie z. B. dem von Willebrand-Faktor oder CD34 analysiert werden oder der Hämoglobingehalt des Implantats kann bestimmt werden. Die Vaskularisierung eines Implantats, das einen mutmaßlichen angiogenetischen Faktor enthält, wird mit einem Implantat verglichen, dem der Faktor fehlt. In-vitro-Verfahren zur Beurteilung der Angiogenese wurden ebenfalls beschrieben und können verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Substanz ein angiogenetischer Faktor ist. Magee et al., Am. J. Physiol. 267 (1994), pL433–441; Pepper et al., Biochem. Biophys. Res Comm 189 (1992), 824–831; und Nicosia et al., Am: J. Pathol. 145 (1994), 1023–1029.

Ein Anzeichen, dass ein Faktor die Angiogenese fördert, ist seine Fähigkeit die Mitogenese von vaskulären Endothelzellen zu induzieren. Die mitogene Aktivität für vaskuläre Endothelzellen kann durch eine Analyse bestimmt werden, die als Zielzellen von der Nebennierenrinde abgeleitete Kapillarendothelzellen (ACE-Zellen) verwendet. Diese Analyse wird im Wesentlichen durchgeführt, wie in Gospodarowicz et al. (J. Cell. Physiol. 127 (1986), 121–136) beschrieben wurde. Im Allgemeinen werden Stammkulturen von ACE-Zellen in der Gegenwart von Dulbecco's modifizierten Eagle Medium (DMEM-21) gehalten, das mit 10% Kälberserum ergänzt. Die Antibiotika Penicillin (50 IU/ml), Streptomycin (50 &mgr;g/ml), Gentamycin (50 &mgr;g/ml) und Fungizon (0,25 &mgr;g/ml) und 2 mM L-Glutamin können ebenfalls dem Medium zugegeben werden. Die Zellen werden wöchentlich in Gewebekulturplatten mit einem Teilungsverhältnis zwischen 1 : 40 und 1 : 200 Passagen unterworfen (das bevorzugte Teilungsverhältnis ist das, welches 2,5 × 105 Zellen in 15 ml Medium in einer T75-Flasche ergibt). Für die mitogene Analyse werden die Zellen in Platten mit 12-Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Vertiefung in 1 ml Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium ausgesät, das mit 10% Kälberserum und mit Antibiotika ergänzt wurde, wie in Gospodarowicz et al. (Eur. J. Cell. Biol. 46 (1988), 144–151) beschrieben wurde. In einer anderen Ausführungsform werden die ACE-Zellen in 35-mm-Schalen oder Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 5–10 × 103 Zellen pro Schale oder pro Vertiefung in 2 ml Medium ausplattiert, wie es in Gospodarowicz et al. (1986) beschrieben wurde. Aliquots von je 10 Mikrolitern der geeigneten Verdünnungen jeder Probe werden anschließend in die Duplikate oder Triplikate Vertiefungen der Schalen am Tag 0 und 2 gegeben. Nach 4 oder 5 Tagen in Kultur werden die Platten trypsiniert und die Zelldichte wird in einem Coulter-Zähler bestimmt. Für die Zielsetzungen der Beschreibung hierin wird ein Faktor eingestuft, eine mitogene Aktivität für vaskuläre Endothelzellen zu besitzen, wenn die Zelldichte am Ende dieser Analyse mindestens 1,5 mal und vorzugsweise mindestens 3 mal höher ist als die Zelldichte der Kontrollvertiefungen, die keine Zusätze von Faktoren erhalten haben.

Die Bestimmung, ob ein angiogenetischer Faktor die kapillare Durchlässigkeit erhöht, kann durch jedes beliebige, bekannte Verfahren bestimmt werden. Das verwendete Verfahren kann von dem Gewebe abhängen, das untersucht wird. Für die Bestimmung der Durchlässigkeit von peritubulären Kapillaren der Niere können zum Beispiel einem Tier Proteine mit verschiedenen Molekulargewichten verabreicht werden, die mit einem Farbstoff markiert sind, der durch ein Elektronenmikroskop detektiert werden kann. Venkatachalam und Karnovsky, J. Lab. Invest. 27 (1972), 435–444. In einer anderen Ausführungsform können die Proteine Enzyme sein, die auf ein Substrat wirken, um ein Signal zu erzeugen. Ein anderes Verfahren, um die Durchlässigkeit von peritubulären Kapillaren zu messen, erfolgt mittels renaler Mikropunktur. Vgl. zum Beispiel Baer et al., Kidney Int. 13 (1978), 452–466. Verfahren, um die kapillare Durchlässigkeit der Lunge zu beurteilen, wurden beschrieben (Lull et al., Semin. Nucl. Med. 13 (1983), 223–237), genauso wie Verfahren, um die cerebrale, vaskuläre Durchlässigkeit zu messen (Terada et al., Neuroradiol. 34 (1992), 290–296).

Die Dichte von Kapillaren kann immunhistochemisch gemessen werden, wobei im Handel erhältliche Antikörper verwendet werden, die spezifisch an Endothelzellen-spezifische Zelloberflächenmarker wie z. B. dem von Willebrand-Faktor oder CD34 binden.

Um zu bestimmen, ob ein VEGF-Molekül effektiv bei der Behandlung einer Salz-abhängigen Hypertonie ist, kann ein Tiermodell verwendet werden, wie es hierin beschrieben wird. Hypertonie wird induziert, wie in Beispiel 1 beschrieben wird, ein mutmaßlicher angiogenetischer Faktor wird verabreicht und der Blutdruck wird überwacht. Ein gesenkter Blutdruck als Reaktion auf die Behandlung mit dem Faktor, wenn er mit dem eines hypertensiven Tiers verglichen wird, das nicht mit dem Faktor behandelt wurde, ist ein Anzeichen dafür, dass der Faktor effektiv bei der Behandlung von Hypertonie ist. Andere Tiermodelle für Hypertonie sind auf dem Fachgebiet bekannt und können dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein angiogenetischer Faktor effektiv bei der Behandlung von Hypertonie ist. Dies schließt die Dahl-Ratte ein. Roman et al., Am J Physiol 251 (1986), F57–F65.

Herstellung von VEGF

Verfahren zur Herstellung eines bekannten VEGF sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können verwendet werden, um ein VEGF herzustellen. Diese Verfahren schließen synthetische und rekombinante Verfahren ein sowie Verfahren zur Isolation von angiogenetischen Faktoren von natürlichen Quellen, von Gewebekulturüberständen und dergleichen. VEGF kann auf jede bekannte Weise hergestellt werden, einschließlich derer, die im US-Patent Nr. 5,194,596 beschrieben sind.

Aminosäuresequenzvarianten der nativen VEGF

Variationen in der Aminosäuresequenz von nativen VEGF-Polypeptiden schließen die Substitution, die Deletion und/oder die Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der nativen Polypeptidsequenz. Substitutionen von Aminosäuren können das Ergebnis des Austausch von einer Aminosäure mit einer anderen Aminosäure sein, die ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften hat, wie z. B. der Austausch von Leucin durch Serin, das heißt ein konservativer Austausch von Aminosäuren. Insertionen oder Deletionen können wahlweise im Bereich von 1 bis zu 5 Aminosäuren sein. Die erlaubten Variationen können durch die systematische Erzeugung von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz und durch das Testen der resultierenden Varianten auf die Aktivität in jeder beliebigen Analyse des Bluthochdrucks bestimmt werden, wie z. B. durch die Analyse, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird.

In einer bevorzugten Gruppe von Aminosäuresequenzvarianten werden eine oder mehrere Cystein-Reste in der VEGF-Struktur durch eine andere Aminosäure ausgetauscht. Solche Substitutionen verminderten die Möglichkeit zur Erzeugung von intermolekularen und intramolekularen Disulfidbindungen, wodurch das Molekül stabiler wurde. Es existieren neun Cystein-Reste in hVEGF121, hVEGF165 und in den entsprechenden Rinder-Homologen. Von diesen sind acht in PDGF konserviert. Dementsprechend ist das am stärksten bevorzugte Analog das, in dem der neunte Cystein-Rest durch Serin substituiert ist. Dieser Cystein-Rest liegt an Position 160 von hVEGF165 und Position 116 von hVEGF121 und an den entsprechenden Positionen der Rinderformen. Einige zusätzliche Informationen über Varianzformen von VEGF-Molekülen werden im US-Patent Nr. 5,332,671 zur Verfügung gestellt. Spezifisch werden hierin die Varianten von VEGF-Molekülen eingeschlossen, die in der PCT-Veröffentlichung WO 98/36075 beschrieben sind. Solche VEGF-Moleküle enthalten Modifikationen in der C-terminalen Heparin-bindenden Domäne, von denen berichtet wird, dass sie in funktionellen Modifikationen des pharmakokinetischen Profils resultieren und Moleküle ergeben, die eine verringerte Clearance-Rate haben, verglichen mit den entsprechenden Heparin bindenden, nativen VEGF-Molekülen. Bevorzugte Ausführungsformen schließen den Austausch von positiv geladenen Aminosäuren mit negativ geladenen oder neutralen Aminosäuren innerhalb der Heparin bindenden Domäne von einer Heparin-bindenden VEGF-Art ein. Zusätzlich sind VEGF-Varianten im Unfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, in denen Teile der C-terminalen Heparin bindende Domäne deletiert sind.

Die Variationen können durch Verfahren erzeugt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z. B. Oligonucleotid vermittelte (ortspezifische) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortspezifische Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13 (1986), 4331; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10 (1987); 6487], Kassetten-Mutagenese [Wells et al., Gene 34 (1985) 315], Restriktionsauswahl-Mutagenese [Wells et al., Philos. Trans R. Soc. London SerA 317 (1986) 415] oder andere bekannte Techniken können an clonierter DNA durchgeführt werden, um die DNA herzustellen, die eine VEGF-Variante codiert.

Die Scanning-Aminosäurenanalyse kann ebenfalls angewendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure innerhalb dieser Gruppe, weil es die Seitenketten hinter dem beta-Kohlenstoff eliminiert und mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit die Konformation der Hauptkette der Variante verändert [Cunningham und Wells, Science 244 (1989), 1081–1085]. Alanin wird ebenfalls typischerweise bevorzugt, weil es die häufigste Aminosäure ist. Des weiteren wird es häufig sowohl in versteckten als auch in exponierten Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol. 150 (1976), 1]. Wenn eine Alanin-Substitution nicht in adäquater Menge von Varianten resultiert, kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.

Vehikel zur Verabreichung, die Polynucleotide umfassen, die ein VEGF-Molekül codieren

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vehikel zur Verabreichung, die für die Verabreichung eines Polynucleotids in Zellen (entweder in vivo, ex vivo oder in vitro geeignet sind, das ein VEGF-Molekül codiert. Im Allgemeinen wird ein Polynucleotid, das ein VEGF-Molekül codiert, funktionell mit einem Promoter und einem heterologen Polynucleotid verbunden sein. Ein Polynucleotid, welches das VEGF-Molekül codiert, kann in einem Clonierungs- oder Expressionsvektor oder in einem viralen Vektor enthalten sein, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Diese Vektoren (besonders Expressionsvektoren) können ihrerseits manipuliert werden, um jede beliebige Anzahl von Formen anzunehmen, welche zum Beispiel die Verabreichung und/oder den Eintritt in eine Zielzelle erleichtern können. Die Verabreichung von Polynucleotid-Konstrukten der Erfindung an eukaryontische Zellen, besonders an Säugerzellen, und ganz besonders an distale Kanälchenzellen der Niere, kann durch jedes geeignete Verfahren erreicht werden, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Die Verabreichung kann in vivo, ex vivo oder in vitro erreicht werden.

Die Vehikel zur Verabreichung, die zur Aufnahme eines Polynucleotids geeignet sind, das ein VEGF codiert, für die Einbringung in eine Wirtszelle schließen nichtvirale Vehikel und virale Vektor ein. Verma und Somia, Nature 389 (1997), 239–242.

Eine große Anzahl von nichtviralen Vehikeln zur Verabreichung eines Polynucleotids, das ein VEGF-Molekül codiert, ist auf dem Fachgebiet bekannt und ist in der vorliegenden Erfindung einbezogen. Ein Polynucleotid, das VEGF codiert, kann einer Zelle als nackte DNA verabreicht werden (US-Patent Nr. 5,692,622; WO 97/40163). In einer anderen Ausführungsform kann ein Polynucleotid, das ein VEGF codiert, einer Zelle verabreicht werden, wobei es auf vielen Wegen mit einer Vielzahl von Substanzen (Formen der Verabreichung) assoziiert sein kann, einschließlich aber nicht beschränkt auf kationische Lipide; biokompatible Polymere, einschließlich natürlicher Polymere und synthetische Polymere; Lipoproteine; Polypeptide; Polysaccharide; Lipopolysaccharide; künstliche, virale Hüllen; Metallpartikel; und Bakterien. Ein Vehikel zur Verabreichung kann ein Mikropartikel sein. Gemische oder Konjugate dieser unterschiedlich Substanzen können ebenfalls als Vehikel zur Verabreichung verwendet werden. Ein Polynucleotid, das ein VEGF-Molekül codiert, kann nicht kovalent oder kovalent mit diesen vielzähligen Formen der Verabreichung assoziiert sein. Liposomen können auf bestimmte Zelltypen gerichtet sein, z. B. auf glomeruläre Epithelzellen.

Virale Vektoren schließen virale DNA-Vektoren, wie z. B. solche, die auf Adenoviren, dem Herpes-simplex-Virus, Poxviren wie z. B. dem Vaccinia-Virus und den Parvoviren, einschließlich dem Adenoassoziiertem Virus basieren, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt; und virale RNA-Vektoren, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, retroviraler Vektoren. Retrovirale Vektoren schließen den murinen Leukämievirus und Lentiviren wie z. B. den menschlichen Immunschwächevirus ein. Naldini et al., Science 272 (1996), 263–267.

Nicht virale Vehikel zur Verabreichung, die ein Polynucleotid umfassen, das ein VEGF-Molekül codiert, können in eine Wirtszelle und/oder in eine Zielzelle durch jedes Verfahren eingebracht werden, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie z. B. als Transfektion durch das Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahren; durch Elektroporation, durch Elektropermeabilisation; durch Liposomen vermittelte Transfektion; durch ballistische Transfektion; durch biolistische Verfahren einschließlich der Bombardierung durch Mikropartikel, durch Düseninjektion und durch Nadel- und Spritzeninjektion; oder durch Mikroinjektion. Zahlreiche Verfahren zur Transfektion sind dem Fachmann bekannt.

Virale Vehikel zur Verabreichung können durch Infektion in Zellen eingebracht werden. In einer anderen Ausführungsform können virale Vehikel in jede der nicht viralen Vehikel zur Verabreichung eingebracht werden, die vorstehend zur Verabreichung in Zellen beschrieben wurden. Zum Beispiel können virale Vektoren mit kationischen Lipiden (Hodgson und Solaiman, Nature Biotechnol. 14 (1996), 339–342); oder mit lamellären Liposomen (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 3471; und Faller et al., J. Virol. 49 (1984), 269).

Zur Verabreichung in vivo kann/können der/die Vehikel zur Verabreichung in ein Individuum durch eine beliebige Anzahl von Verfahren eingebracht werden, von denen jedes auf dem Fachgebiet bekannt ist.

Arzneimittel

Arzneimittel zur Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung können ein Polynucleotid umfassen, das ein VEGF-Molekül codiert, oder in einer anderen Ausführungsform können Arzneimittel ein VEGF-Molekül selbst umfassen.

Geeignete Formen sind teilweise von der Verwendung oder von der An des Eintritts abhängig, zum Beispiel oral, transdermal oder durch Injektion. Solche Formen sollten es dem Wirkstoff oder der Zusammensetzung ermöglichen, eine Zielzelle zu erreichen, unabhängig davon, ob die Zielzelle in einem vielzelligen Wirt oder in einer Kultur vorliegt. Zum Beispiel sollten pharmakologische Wirkstoffe oder Zusammensetzungen, die in den Blutstrom injiziert werden, löslich sein. Andere Faktoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Überlegungen wie z. B. Toxizität und Formen ein, die den Wirkstoff oder die Zusammensetzung davon abhalten, ihre Effekte auszuüben.

Zusammensetzungen, die ein VEGF-Molekül oder ein VEGF-Molekül codierendes Polynucleotid umfassen, können auch als pharmazeutisch verträgliches Salz (z. B. als Säure-Additionssalze) und/oder Komplexe davon formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze sind nicht toxisch in den Konzentrationen, in denen sie verabreicht werden.

Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen Säure-Additionssalze ein, wie z. B. solche, die Sulfat, Hydrochlorid, Phosphat, Sulfonat, Sulfamat, Sulfat, Acetat, Citrat, Lactat, Tartrat, Methansulfonat, Ethansulfonat, Benzolsulfonat, p-Toluolsulfonat, Cyclohexylsulfonat, Cyclohexylsulfamat und Quinat enthalten. Pharmazeutisch verträgliche Salze können von Säuren wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfonsäure, Sulfaminsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Cyclohexylsulfonsäure, Cyclohexylsulfaminsäure und Chinasäure erhalten werden. Solche Salze können zum Beispiel durch die Reaktion der freien Säure- oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalenten der geeigneten Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder im Medium, in denen das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie z. B. Wasser, welches anschließend im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch den Austausch der Ionen eines existierenden Salzes gegen ein anderes Ion an einem geeigneten Ionen-Austauschharz, hergestellt werden.

Träger oder Excipienten können ebenfalls verwendet werden, um die Verabreichung der Verbindung zu ermöglichen. Beispiele von Trägern und Excipienten schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, zahlreiche Zucker wie z. B. Lactose, Glucose oder Saccharose oder Arten von Stärke, Cellulosederivate, Gelatine, pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und physiologisch kompatible Lösungsmittel ein. Die Zusammensetzungen oder die Arzneimittel können über verschiedene Wege verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intravenöse, intraperitoneale, subkutane und intramuskuläre, orale und örtliche Wege oder über die Schleimhaut.

Die gewünschte, Isotonie der Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Natriumchlorid oder anderer pharmazeutisch verträglicher Wirkstoffe wie Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol, Polyole (wie z. B. Mannit und Sorbit) oder andere anorganische oder organische, gelöste Stoffe erzielt werden.

Arzneimittel, die ein VEGF-Molekül oder ein Polynucleotid, umfassen, das ein VEGF-Molekül codiert, können für zahlreiche Arten der Verabreichung formuliert werden, einschließlich der systemischen, der örtlichen oder der lokalen Verabreichung. Techniken und Formulierungen können im Allgemeinen in Remington's Pharmaceutical Science, 18. Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990) gefunden werden. Vgl. auch Wang und Hanson „Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report Nr. 10, Erg. 42–25 (1988). Ein geeignetes Format für die Verabreichung kann am besten durch einen Mediziner für den einzelnen Patienten bestimmt werden.

Für die systemische Verabreichung wird die Injektion bevorzugt, z. B. intramuskulär, intravenös, intraperitoneal, subkutan, intrathekal oder intracerebrovaskulär. Für die Injektion werden die Verbindungen in flüssige Lösungen formuliert, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer wie z. B. die Hank-Lösung oder die Ringer-Lösung. In einer anderen Ausführungsform werden die Verbindungen in einen oder mehreren Excipienten (z. B. Propylenglykol) formuliert, die im Allgemeinen gemäß USP-Standards als sicher eingestuft werden. Sie können zum Beispiel in einem trägen Öl suspendiert werden, wobei pflanzliche Öle wie z. B. Sesam-, Erdnuss-, Olivenöl oder andere verträgliche Träger geeignet sind. Vorzugsweise werden sie in einem wässrigen Träger wie zum Beispiel einer isotonischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 5,6 bis 7,4 suspendiert. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder sie können sterilgefiltert werden. Diese Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten, wie es benötigt wird, um physiologische Bedingungen zu erreichen, wie z. B. pH-Wert puffernde Wirkstoffe. Nützliche Puffer schließen zum Beispiel Natriumacetat/Essigsäurepuffer ein. Eine Form einer Lager- oder „Depot-" Herstellung mit langsamer Freisetzung kann verwendet werden, so dass therapeutisch effektive Mengen der Herstellung in den Blutstrom über viele Stunden oder Tage verabreicht werden, nachdem eine transdermale Injektion oder Verabreichung stattgefunden hat. Zusätzlich können die Verbindungen in einer festen Form formuliert und unmittelbar vor der Verwendung wieder gelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind ebenfalls eingeschlossen.

In einer anderen Ausführungsform können die Verbindungen oral verabreicht werden. Für die orale Verabreichung werden die Verbindungen in konventionelle orale Dosierungsformen wie z. B. Kapseln, Tabletten und Tonika formuliert.

Eine systemische Verabreichung kann über die Schleimhaut oder die Haut erfolgen oder die Moleküle können oral verabreicht werden. Für die Verabreichung über die Schleimhaut oder die Haut werden Penetriermittel in der Formulierung verwendet, die für die Barriere, die durchdrungen werden soll geeignet sind. Solche Penetriermittel sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel für die Verabreichung über die Schleimhaut Gallensalze und Derivate der Fusidinsäure ein. Zusätzlich können Detergenzien verwendet werden, um die Permeation zu erleichtern. Die Verabreichung über die Schleimhaut kann z. B. mittels Nasensprays oder durch Verwendung von Zäpfchen erfolgen. Für die orale Verabreichung werden die Moleküle in konventionelle Dosierungsformen zur oralen Verabreichung wie z. B. Kapseln, Tabletten und flüssigen Herstellungen formuliert.

Für die örtliche Verabreichung werden die Verbindungen der Erfindung in Salben, Pflaster, Gele oder Cremen formuliert, wie es im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt ist.

Falls gewünscht, können Lösungen der vorstehenden Zusammensetzungen mittels eines Verdickungsmittels wie z. B. Methylcellulose eingedickt werden. Sie können in Form vom Emulsionen, entweder als Wasser in Öl oder als Öl in Wasser, hergestellt werden. Jedes beliebige einer großen Anzahl von pharmazeutisch verträglichen emulgierenden Wirkstoffen verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Akazienpulver, ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel (wie z. B. Tween) oder ein ionisches grenzflächenaktives Mittel (wie z. B. alkalische Polyetheralkoholsulfate oder -sufonate, z. B. ein Triton).

Zusammensetzungen, die nützlich für die Erfindung sind, werden durch Mischung der Inhaltsstoffe hergestellt, wobei allgemein akzeptierte Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel können die ausgewählten Komponenten einfach in einem Mischgerät oder in einem anderen Standardgerät gemischt, um konzentrierte Gemische herzustellen, die anschließend auf die endgültige Konzentration und Viskosität durch die Zugabe von Wasser oder von Verdickungsmittel und möglicherweise eines Puffers, um den pH-Wert zu kontrollieren, oder von zusätzlichen, gelösten Stoffen, um den ausgeglichenen osmotischen Druck zu kontrollieren, eingestellt werden.

Die Mengen der zahlreichen Verbindungen, die verabreicht werden sollen, zur Verwendung in der Erfindung können durch Standardverfahren bestimmt werden. Im Allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame Menge zwischen etwa 1 nMol und 3 &mgr;Mol des Moleküls, vorzugsweise zwischen etwa 10 nMol und 1 &mgr;Mol, in Abhängigkeit vom Alter und der Größe des Patienten und der Krankheit oder die Störung, die mit dem Patienten assoziiert ist. Im Allgemeinen ist es eine Menge, die zwischen etwa 0,05 und 50 mg/kg, vorzugsweise zwischen 1 und 20 mg/kg des Individuums liegt, das behandelt werden soll.

Für die Verwendung durch den Mediziner werden die Zusammensetzungen als Form von Dosiseinheiten zur Verfügung gestellt, die eine Menge eines VEGFs enthalten.

Antikörper

Einige der zur Auswahl stehenden Arzneistoffe sind gemäß der vorliegenden Erfindung agonistische Antikörper, welche die anti-hypertensiven Eigenschaften eines VEGFs nachahmen.

Verfahren zur Herstellung von polyclonalen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt. Polyclonale Antikörper können in einem Säuger zum Beispiel durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Wirkstoffs und, falls erwünscht, eines Adjuvans erzeugt werden. Typischerweise wird der immunisierende Wirkstoff und/oder das Adjuvans dem Säuger durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Es kann nützlich sein, den immunisierenden Wirkstoff mit einem Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, dass es immunogen in dem Säuger ist, der immunisiert wird, wie z. B. Serumalbumin oder den Trypsininhibitor von Sojabohnen. Beispiele von Adjuvanten, die verwendet werden können, schließen das komplette Freundsche Adjuvans und MPL-TDM ein.

Gemäß eines Ansatzes können monoclonale Antikörper unter Verwendung des Hybridomverfahrens hergestellt werden, wie z. B. von Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495 beschrieben. Bei dem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Wirkstoff immunisiert, um Lymphocyten hervorzurufen, welche die Antikörper herstellen oder herstellen können, die den immunisierenden Wirkstoff spezifisch binden. In einer anderen Ausführungsform können die Lymphocyten in vitro immunisiert werden. Im Allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten („PBL") verwendet, wenn Zellen mit einem menschlichen Ursprung gewünscht werden, oder es werden Milzzellen oder Zellen aus Lymphknoten verwendet, wenn nichtmenschliche Säugetierquellen gewünscht werden. Die Lymphocyten werden anschließend mit einer immortalisierten Zelllinie fusioniert, wobei ein geeignetes Fusionsmittel wie z. B. Polyethylenglykol verwendet wird, um Hybridomzellen zu erzeugen [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), S. 59–103]. Immortalisierte Zelllinien sind im Allgemeinen transformierte Säugerzellen, besonders Myelomzellen mit einem Nagetier-, Rinder- oder einem menschlichen Ursprung. Üblicherweise werden Ratten- oder Mäuse-Myelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der nicht fusionierten, immortalisierten Zellen inhibieren. Bevorzugte, immortalisierte Zelllinien sind solche, die effizient fusionieren, einen stabilen, hohen Grad an Expression des Antikörpers durch die ausgewählte Antikörper herstellende Zelle unterstützen und die sensitiv auf ein Medium wie z. B. das HAT-Medium reagieren.

Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann anschließend auf die Anwesenheit von monoclonalen Antikörpern analysiert werden, die gegen den bestimmten VEGF gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der monoclonalen Antikörper, die von den Hybridomzellen hergestellt werden, durch Immunpräzipitation oder durch eine in vitro-Bindungsanalyse wie z. B. eine Radioimmunanalyse (RIA) oder eine enzymverbundene Immunadsorptionsanalyse (ELISA) bestimmt. Solche Techniken und Analysen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Bindungsaffinität des monoclonalen Antikörpers kann zum Beispiel durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107 (1980), 220 bestimmt werden.

Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert sind, können die Clone durch limitierende Verdünnungsverfahren subcloniert werden und mittels Standardverfahren kultiviert werden [Goding, vorstehend]. Geeignete Kulturmedien für diese Zielsetzung schließen zum Beispiel das Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium und das RPMI 1640-Medium ein. In einer anderen Ausführungsform können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säuger kultiviert werden.

Die monoclonalen Antikörper, die von den Subclonen sezerniert werden, können von dem Kulturmedium oder der Aszitesflüssigkeit durch konventionelle Verfahren zur Immunglobulinreinigung wie zum Beispiel durch Protein A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie isoliert oder gereinigt werden.

In einer anderen Ausführungsform können die monoclonalen Antikörper durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, wie z. B. solche, die im US-Patent Nr. 4,816,567 beschrieben sind. DNA, die den monoclonalen Antikörper der Erfindung codiert, kann leicht isoliert und sequenziert werden, wobei konventionelle Verfahren verwendet werden (z. B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die spezifisch an Gene binden können, welche die schweren und die leichten Ketten der murinen Antikörper codieren). Die Hybridomzellen, die vorstehend diskutiert wurden, dienen als eine bevorzugte Quelle für eine solche DNA. Sobald sie isoliert ist, kann die DNA des Expressionsvektoren eingebracht werden, die anschließend in Wirtszellen wie z. B. COS-Zellen, Eierstockzellen des chinesichen Hamsters (CHO) oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein herstellen, um die Synthese der monoclonalen Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen.

Die Antikörper, einschließlich der Antikörperfragmente wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder anderer Antigenbindender Subsequenzen von Antikörpern, können humanisiert werden. Humanisierte Antikörper enthalten minimale Sequenzen, die von einem nichtmenschlichen Immunglobulin abgeleitet sind. Genauer beschrieben, in humanisierten Antikörpern sind Reste von einer die Komplementarität bestimmenden Region (CDR) eines menschlichen Immunglobulins (der Empfänger) durch Reste von einer CDR einer nichtmenschlichen Art (Spenderantikörper) wie z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen ausgetauscht, welche die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität haben. In einigen Fällen sind Reste des Fv-Gerüsts des menschlichen Immunglobulins ebenfalls durch entsprechende nichtmenschliche Reste ausgetauscht. Humanisierte Antikörper können zusätzlich Reste umfassen, die weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen gefunden werden [Jones et al., Nature 321 (1986), 522–525; Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323–329].

Verfahren zur Humanisierung von nichtmenschlichen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Im Allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurerest, die von einer nichtmenschlichen Quelle eingebracht wurden. Diese nichtmenschlichen Aminosäurereste werden häufig als „importierte" Reste bezeichnet, die typischerweise von einer „importierten", variablen Domäne entnommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321 (1986), 522–525; Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323–327; Verhoeyen et al., Science 239 (1988), 1534–1536] durch Substitution von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen des menschlichen Antikörpers durchgeführt werden.

Zusätzlich können menschliche Antikörper unter Verwendung zahlreicher Techniken hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich der Phagen-Display-Genbanken [Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227 (1991), 381; Marks et al., J. Mol. Biol. 222 (1991), 581]. Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind ebenfalls für die Herstellung menschlicher, monoclonaler Antikörper erhältlich [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1991), 86–95]. Menschliche Antikörper können auf ähnliche Weise durch das Einbringen von menschlichen Immunglobulin-Loci in transgene Tiere wie z. B. Mäuse hergestellt werden, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig inaktiviert wurden. Nach der Provokation wird eine Herstellung von humanen Antikörpern beobachtet, die in allen Aspekten, einschließlich der Genumlagerung, des Aufbaus und des Antikörper-Repertoires, denen sehr ähneln, die im Menschen beobachtet werden. Dieser Ansatz wird z. B. in den US Patenten Nr. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 und in den nachfolgenden wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10 (1992), 779–783; Lonberg et al., Nature 368 (1994), 856–859; Morrison, Nature 368 (1994), 812–13; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 845–51; Neuberger, Nature Biotechnology 14 (1996), 826; Lonberg ud Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 (1995), 65–93.

Die Antikörper können bispezifisch sein, wobei eine Spezifität gegen ein VEGF gerichtet ist und eine andere Spezifität gegen ein anderes Protein wie z. B. ein anderer angiogenetischer Faktor oder ein anderes Epitop auf dem selben VEGF.

Durchmusterungs-Analysen für zur Auswahl stehende Arzneistoffe

Durchmusterungs-Analysen für zur Auswahl stehende Arzneistoffe sind derart gestaltet, um Agonisten wie z. B. aus kleinen Molekülen bestehende Agonisten von VEGF zu identifizieren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Durchmusterungs-Analysen werden Analysen einschließen, die der Durchmusterung von chemischen Banken mit hohem Durchsatz dienen, was sie besonders geeignet für die Identifizierung von zur Auswahl stehenden, aus kleinen Molekülen bestehenden Arzneistoffen macht. Kleine Moleküle, die in Erwägung gezogen werden, schließen synthetische, organische oder anorganische Verbindungen ein, einschließlich Peptiden, vorzugsweise löslichen Peptiden, (Poly)Peptid-Immunglobulin-Fusionen und Antikörper, einschließlich, ohne Begrenzung, poly- und monoclonale Antikörper und Antikörperfragmente, Einzelketten-Antikörper, anti-idiotypische Antikörper und chimäre oder humanisierte Versionen von solchen Antikörpern oder Fragmenten sowie menschliche Antikörper und Antikörperfragmente. Diese Analysen können in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungsanalysen, biochemischen Durchmusterungs-Analysen, Immunanalysen und auf Zellen basierende Analysen, die im Fachgebiet gut charakterisiert sind.

Zusätzlich können zur Auswahl stehende Arzneistoffe getestet werden oder ihre anfängliche Aktivität kann in zahlreichen Tiermodellen für die Hypertonie (z. B. der Salz-abhängigen Hypertonie) bestätigt werden. Eine mikrovaskuläre Verletzung wurde als möglicher Mechanismus für eine tubuinterstitielle (TI) Verletzung und eine assoziierte, Salz-abhängige Hypertonie identifiziert. Zum Beispiel wurde berichtet, dass eine kurzzeitige Infusion von Angiotensin II (AII) in einer fokalen TI-Verletzung resultiert und Ratten empfänglich für eine nachfolgende Ausbildung einer Salz-abhängigen Hypertonie macht (Lombardi et al., Hypertension 33 (1999), 1013–1019). Gleichermaßen wurde das Altern deutlich mit einer Salz-abhängigen Hypertonie assoziiert (Weinberger und Fineberg, Hypertension 18 (1991), 67–71) und es wurde gezeigt, dass eine tubulointerstitielle Verletzung in der alternden Ratte diese ebenfalls für eine Salz-abhängige Hypertonie anfällig macht (Masilamani et al., Am. J. Kid. Des. 32 (1998), 605–610).

Verfahren der Behandlung unter Verwendung eines VEGF

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Salz-abhängiger Hypertonie. Die Verfahren involvieren im Allgemeinen die Verabreichung einer Menge von einem VEGF an ein Individuum, die effektiv ist, um eine Salz-abhängige Hypertonie zu senken. Eine effektive Menge ist eine, die vorstehend beschrieben wurde. Die Effektivität der Behandlung wird durch den gesenkten Blutdruck bestimmt, im Besonderen als Antwort auf eine Salzbelastung.

Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die Erfindung darzustellen, nicht aber, um sie zu limitieren.

BEISPIEL 1 Eliminationskinetiken aus dem Plasma von VEGF121 und VEGF165

Studien wurden durchgeführt, um Plasma-Eliminationskinetiken von VEGF121 oder VEGF165 zu bestimmen, wenn diese intravenös oder subkutan verabreicht wurden. Rekombinanter VEGF121 oder VEGF165 wurde als ein 10 &mgr;g/kg-Bolus in die Schwanzvenen von Ratten injiziert. Plasmaproben wurden über die nachfolgenden zwei Stunden entnommen und die Konzentration von VEGF in den Proben wurde unter Verwendung einer Sandwich-ELISA-Analyse bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Rekombinanter VEGF121 und VEGF165 wurden in Ratten als ein 100 &mgr;g/kg-Bolus subkutan injiziert. Plasmaproben wurden über die nachfolgenden acht Stunden entnommen und die Konzentration von VEGF in den Proben wurde wie zuvor bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Diese Daten deuten darauf hin, dass VEGF121 die Eigenschaften zeigt, schnell in den Blutkreislauf nach der subkutanen Injektion aufgenommen zu werden, für einen deutlichen Zeitraum in der Zirkulation zu verbleiben und anschließend eliminiert zu werden.

BEISPIEL 2 Tiermodell für die Salz-abhängige Hypertonie

Laborratten (z. B. Sprague-Dawley) können in einer Salz-abhängigen Weise hypertensiv gemacht werden, wobei sie dem menschlichen Beispiel der primären Hypertonie gleich sind. Tatsächlich bestätigten kürzlich veröffentlichte Daten (Lombardi er al., Hypertension 33 (1999), 1013–1019), dass die kurzzeitige Infusion von Angiotensin II (AII) in einer fokalen, tubulointerstitiellen (TI) Verletzung resultiert und dass die Ratten für eine nachfolgende Entwicklung einer Salz-abhängigen Hypertonie empfänglich gemacht werden.

Das Modell, das in dem vorliegenden Experiment verwendet wird, besteht darin, normale Laborratten mit einem Futtermittel mit einer erhöhten Menge an Natriumchlorid (4 Gew.-%) für drei Tage zu füttern. Die Ratten wurden ausschließlich mit diesem Futtermittel bis zu zwei Wochen lang gefüttert. Diese Ratten zeigten keine Hypertonie im Vergleich zu Ratten, die normales Laborfutter bekamen, welches 0,1% NaCl umfasste (4a).

Nach drei Tagen wurden bei den Ratten eine kontinuierliche, intravenöse Infusion von Angiotensin II (AII) mit 200 ng/kg/min für 1–2 Wochen durchgeführt. Wie in 4b gezeigt ist, entwickelten alle mit AII behandelten Tiere eine systolische Hypertonie. Wenn die Ratten durchgehend Futter mit einem niedrigen Salzgehalt bekamen, normalisierte sich der Blutdruck schnell. Wenn die Tiere Futter mit einem hohen Salzgehalt bekamen, blieb der Blutdruck erhöht, nachdem die Infusion mit AII beendet wurde, was eine Form der Salz-abhängigen Hypertonie zeigt. Wie in 4c gezeigt wird, sind, wenn die Ratten VEGF121 mit 20 &mgr;g/kg/Tag für 14 Tage zusammen mit einer über 7 Tage dauernden Infusion von AII erhielten, beide Gruppen in Hinsicht auf die anfängliche Erhöhung des Blutdrucks vergleichbar. Beide Gruppen von Ratten wurden mit Futter mit einem hohen Salzgehalt gefüttert. Nach Beendigung der AII-Gabe fiel der systolische Blutdruck der Tiere, die zusätzlich mit VEGF behandelt wurden, auf normale Werte oder darunter, während der systolische Blutdruck der Tiere, die transient AII ausgesetzt waren, erhöht blieb. Der Vergleich von Organen aus diesen Tiergruppen zeigte, dass die Nieren der Tiere, die mit VEGF behandelt wurden, eine deutliche Hypertrophie zeigten, während solche, die einem hohen Salzgehalt ausgesetzt waren oder einem hohen Salzgehalt plus einer Infusion mit AII dies nicht taten (5). Dieses unerwartete Ergebnis zeigt, dass die angiogenetische Stimulation die Hypertrophie der Niere erleichtert, um sich den Ansprüchen an die Filterung anzupassen, die durch eine Futter mit einem hohen Salzgehalt und einem vorgehenden oder einem gleichzeitigen Stadium der Hypertonie auferlegt werden.

BEISPIEL 3 Behandlung von einer Salz-abhängigen Hypertonie, die durch transientes Angiotensin II (AII) hervorgerufen wurde, mit hVEGF121

Laborratten (männliche Sprague-Dawley mit einem Gewicht von 300 Gramm), die Futter mit einem hohen Salzgehalt (4% NaCl) bekamen, erhielten eine kontinuierliche Infusion von Angiotensin II (AII) (444 ng/kg/min, s. c.) über 7 Tage. Die Ernährung mit hohem Salzgehalt wurde 3 Tage vor der Infusion von AII begonnen und wurde über den Zeitraum des Experiments fortgesetzt (zusätzliche 7 Tage). VEGF121 (20 &mgr;g/kg/Tag, i. v.) oder das Vehikel (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) wurde während des Zeitraums von 14 Tagen verabreicht. Die VEGF-Behandlung senkte nicht den Blutdruck von Ratten, die Futter mit einem normalen Salzgehalt bekamen, oder verminderte nicht die anfängliche, hypertensive Reaktion auf die akute Infusion von AII. Der Blutdruck war während des Zeitraums nach der Verabreichung von AII jedoch deutlich niedriger als bei Ratten, die mit dem Vehikel behandelt wurden, und ähnlich dem der Kontrollratten, die Futter mit einem hohen Salzgehalt erhielten, aber nicht AII exponiert wurden (Tag 14: AII/Vehikel: 167 ± 5; AII/VEGF: 136 ± 3; Kontrolle mit hohem Salzgehalt: 138 ± 5, p < 0,05). Die Infusion mit VEGF war ebenfalls mit einer erhöhten Ausscheidung von Nitrit im Urin (VEGF vs. Vehikel, 150 vs. 35 nmol/Tag, p < 0,01) und mit der Hyppertrophie des renalen Knochemarks assoziiert.

Jede Infusion resultiert in einer Deregulation der VEGF-Expression mit Veränderungen in den interstitiellen Kapillarstrukturen und der Herstellung von Stickstoffmonoxid, welches die Ratten empfänglich für die Salz-abhängige Hypertonie macht. Die Infusion von VEGF korrigiert die Abnormalitäten des Stickstoffmonoxids und verhindert die Entwicklung einer post-AII-induzierten Hypertonie.

BEISPIEL 4 VEGF121 reduzierte den Blutdruck als Reaktion Futter mit einem hohen Salzgehalt in Ratten mit einer chronischen Cyclosporin-Nephropathie

Cyclosporin (CSA) wurde mit der tubulointerstitiellen Erkrankung und der Entwicklung einer Salz-abhängigen Hypertonie assoziiert. Frühere Studien deuteten an, dass die renale Vasokonstriktion und Verletzung durch eine Verminderung der lokalen Konzentration von Stickstoffmonoxid vermittelt werden könnte (Kidney Int. 53 (1998), 897). Wir entschieden uns, zu testen, ob VEGF die Entwicklung einer Salz-abhängigen Hypertonie in Ratten mit einer etablierten, chronischen CSA-Nephropathie verhindern kann. Das Modell wurde in Laborratten (männliche Sprague-Dawley mit einem Gewicht von 300 Gramm) durch eine subkutane Injektion von CSA (15 mg/kg/Tag) für 45 Tage induziert, während die Ratten Futter mit einem niedrigen Salzgehalt (0,125% NaCl) bekamen. Nach 5 Tagen einer Auswaschperiode (Tag 50) wurde Futter eine mit einem hohen Salzgehalt (4% NaCl) gewechselt und die Ratten erhielten für 14 Tage eine subkutane Injektion mit VEGF121 (100 &mgr;g/kg/Tag) oder mit Vehikel. Anschließend wurde die Behandlung für zusätzliche 5 Tage ausgesetzt und die Ratten wurden getötet.

Die VEGF behandelten Ratten hatten einen niedrigeren Blutdruck als Reaktion auf das Futter mit einem hohen Salzgehalt während der post-CSA-Injektionsperiode und dieser Effekt blieb auch nach Beendigung der Injektion von VEGF121 für 5 Tage erhalten. Interessanterweise gab es keine Unterschiede in der Histologie (Lichtmikroskop) oder der renalen Funktion (BUN) in den VEGF und den Vehikel-behandelten Ratten am Ende der Studie. Harn-Nitrate/Nitrite (Metaboliten von Stickstoffmonoxid) waren nicht detektierbar im Urin von VEGF und Vehikel-behandelten Ratten für 7 Tage und waren nicht unterschiedlich nach der Tötung (2932 ± 738 vs. 2516 ± 564 nMol/Tag, p = ns). Diese Daten deuten darauf hin, dass VEGF den Blutdruck als Reaktion auf einem hohen Salzgehalt in Ratten, die CSA exponiert wurden, reduziert und dass der Effekt erhalten bleibt, auch nachdem die Verabreichung von VEGF beendet wurde.

BEISPIEL 5 Inhibition der Salz-abhängigen Hypertonie in Ratten durch die Behandlung mit VEGF

Laborratten (männliche Sprague-Dawley im Alter von 3 Monaten) wurden in drei Behandlungsgruppen und in eine Kontrollgruppe aufgeteilt, wobei jede Gruppe 10 Tiere umfasste. Gruppe 1 bekam Futter mit einem hohen Salzgehalt (4% NaCl) und erhielt eine kontinuierliche Infusion (mittels einer Alzetpumpe) von Angiotension II (AII) (440 ng/kg/min, s. c.) für 7 Tage. Gruppe 2 bekam Futter mit einem niedrigen Salzgehalt (0,01% NaCl) gehalten und erhielt eine kontinuierliche Infusion (mittels einer Alzetpumpe) von Angiotension II (AII) (440 ng/kg/min, s. c.) für 7 Tage. Gruppe 3 bekam Futter mit einem hohen Salzgehalt genau wie Gruppe 1 gehalten, erhielt aber ebenfalls rhVEGF121 (100 &mgr;g/kg/Tag, s. q.), angefangen am Tag 0 und durchgehend bis Tag 48, wobei anschließend für Beobachtungszwecke die Verabreichung beendet wurde. Gruppe 4 (Kontrollgruppe) erhielt keine Behandlung. Der Blutdruck der Tiere von allen Gruppen wurde zweimal wöchentlich gemessen an den Tagen 1, 2, 4, 7, 11, 14, 21, 25, 28, 32, 35, 41 und 48. Urin wurde in der zweiten Woche von Tieren aus Gruppe 1, Gruppe 3 und Gruppe 4 (6 Tiere aus jeder Gruppe) gesammelt und die Proben wurden zentrifugiert und gefroren für zukünftige Messungen von Proteinen, Elektrolyten, Kreatin, und Urinnitraten aufgehoben. Wie in 12 dargestellt, zeigten die Tiere aus allen Behandlungsgruppen eine hypertensive Reaktion auf die akute Infusion von AII. Wenn die Behandlung mit AII ausgesetzt wurde, normalisierte sich der Blutdruck, stieg aber wieder in der Gruppe an, die Futter mit einem hohen Salzgehalt, in Abwesenheit der Behandlung mit VEGF bekam (Gruppe 1). Im Gegensatz dazu hielt die Behandlung mit VEGF den Blutdruck von Tieren, die Futter mit einem hohen Salzgehalt bekamen auf einen normalen Wert (Gruppe 3), wobei gezeigt wurde, dass die Behandlung mit VEGF die Entwicklung einer Hypertonie in diesem experimentellen Modell der Salz-abhängigen Hypertonie verhindern kann.

Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben ist, wird dem Fachmann offenkundig sein, dass viele Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne dass der Bereich der beigefügten Patentansprüche verlassen wird.


Anspruch[de]
  1. Verwendung von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) oder eines Agonisten davon, in einer Menge, die wirksam ist, um den Blutdruck auf einen normalen Bereich zu senken, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Salz-abhängiger Hypertonie.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei VEGF ausgewählt ist aus nativem hVEGF121 (6, SEQ ID Nr: 1), nativem hVEGF145 (7, SEQ ID Nr: 2), nativem hVEGF165 (8, SEQ ID Nr: 3), nativem hVEGF189 (9, SEQ ID Nr: 4) und nativem hVEGF206 (10, SEQ ID Nr: 5).
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei VEGF die Fähigkeit Heparin zu binden fehlt.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei VEGF ein natives hVEGF121 (6, SEQ ID Nr: 1) oder ein Agonist davon ist.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei VEGF eine Heparin-bindende Domäne umfaßt, die modifiziert wurde, um sie unfähig zur Heparinbindung zu machen.
  6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 3–5, wobei VEGF eine Aminosäureveränderung innerhalb seiner Heparin-bindenden Domäne umfaßt.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Agonist ein Anti-VEGF-Antikörper ist.
  8. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Agonist ein Molekül, mit einem Molekulargewicht von unter etwa 500 Dalton ist.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 von zwei oder mehreren VEGFs.
  10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament ferner einen anderen angiogenetischen Faktor umfaßt.
  11. Verwendung eines zur Auswahl stehenden blutdrucksenkenden Agonisten eines VEGF-Moleküls für die Herstellung eines Prüfmedikaments, um die Fähigkeit des zur Auswahl stehenden Agonisten zu identifizieren, Salz-abhängige Hypertonie in einem Standard-Tiermodell für Salz-abhängige Hypertonie zu behandeln, im Vergleich zum VEGF-Molekül.
  12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Agonist ein Antikörper ist.
  13. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Agonist ein Molekül, mit einem Molekulargewicht von unter etwa 500 Dalton ist.
  14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Tiermodell ein durch Angiotension-II (AII) oder Cyclosporin (CSA) induziertes Rattenmodell für Salz-abhängige Hypertonie ist.
Es folgen 11 Blatt Zeichnungen






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B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
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H Elektrotechnik

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