Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und einen Assay bereitzustellen, mit dem die adulte Neurogenese einfach, sicher und effektiv bestimmt werden kann.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der adulten Neurogenese, wobei in mindestens einer Nervenzelle transient postmitotisch exprimierte endogene Zellbestandteile bestimmt werden. Im Sinne der Erfindung kann es beispielsweise vorgesehen sein, die adulte Neurogenese in Ab- und Anwesenheit von Substanzen zu bestimmen, die dahingehend untersucht werden sollen, ob ihre Anwesenheit bzw. Abwesenheit die adulte Neurogenese verändert bzw. moduliert. Hierzu kann die auf ihre neurogene Wirksamkeit hin zu untersuchende Substanz beispielsweise in ein Versuchstier in einer für die betreffende Versuchsreihe standardisierten Weise und für eine bestimmte Dauer verabreicht werden. Dies kann bevorzugt durch tägliche parenterale Verabreichung der Substanz für eine Dauer von 1 bis 4 Wochen erfolgen. Die exakten Werte sind dem Fachmann bekannt und richten sich nach den Vorerfahrungen und gegebenenfalls nach Pilotversuchen mit den entsprechenden Substanzen. Am Ende der jeweiligen durch Pilotversuche bestimmten Versuchszeit wird den Versuchsorganismen eine Probe aus dem Gehirn entnommen oder das Gehirn komplett, bevorzugt werden sie hierzu vorab getötet. Es kann selbstverständlich auch vorgesehen sein, nur ein bestimmtes Hirnareal zu entnehmen, so dass die Tötung des Versuchsorganismus im Sinne der Erfindung nicht zwangsläufig ist. Das entnommene Gehirn bzw. die entnommenen Gewebeteile können entsprechend den üblichen Standardverfahren für die histologische bzw. für die immunhistologische Untersuchung fixiert und vorbereitet werden. Mit spezifischen Erkennungssubstanzen werden dann die transient postmitotisch exprimierten Zellbestandteile und somit die unreifen Nervenzellen im histologischen bzw. im immunhistochemischen Verfahren sichtbar gemacht. Bei den Erkennungssubstanzen kann es sich beispielsweise um Substanzen handeln, die auf der Nukleinsäure- bzw. auf der Aminosäureebene die Zellbestandteile detektieren können. Hierbei kann es sich beispielsweise um Antikörper, um fluoreszierende Markersubstanzen, um Antisense-Konstrukte, um Chelatoren oder um andere dem Fachmann bekannte Strukturen handeln, die mit Zellbestandteilen bevorzugt auf der Proteinebene so wechselwirken können, dass ihre Detektion und insbesondere ihre qualitative und quantitative Bestimmung möglich ist. Bei den zu detektierenden endogenen Zellbestandteilen kann es sich beispielsweise um exprimierte Eiweiße oder um Kohlenhydrate und Lipide handeln. Unter transienter postmitotischer Expression im. Sinne der Erfindung wird die Messbarkeit des ausgewählten endogenen Zellbestandteils während einer Reifeperiode einer neuen Nervenzelle nach Abschluss der Zellteilung verstanden, die unterscheidbar über oder unter der entsprechenden Messbarkeit in reifen Nervenzellen liegt.

Wenn ein Zellbestandteil nur vorübergehend und nur während eines bestimmten Entwicklungsstadiums der Zelle exprimiert wird, so lässt sich umgekehrt durch Detektion dieses Zellbestandteils in Erfahrung bringen, ob sich eine bestimmte Zelle zum Untersuchungszeitpunkt in diesem Entwicklungsstadium befindet.

Die Wechselwirkung der Erkennungsmoleküle mit den zu detektierenden endogenen Zellbestandteilen führt zu einer Markierung bestimmter Zellen, deren Zahl bestimmt wird und gegebenenfalls zur Gesamtzahl der Nervenzelle in der betreffenden Hirnregion ins Verhältnis gesetzt wird. Die Wirksamkeit verschiedener Substanzen auf die Produktion junger Nervenzellen kann so einfach, sicher und effizient verglichen werden und als Maß für die Nervenzellneubildung im erwachsenen Gehirn und die neurogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen genommen werden. Eine Substanz oder eine andere Maßnahme, die zu mehr Nervenzellen in einem frühen Stadium der Entwicklung führt, würde als einer Substanz, in deren Gegenwart nur wenige solcher Zellen gefunden werden, in dieser Hinsicht überlegen angesehen werden.

Es ist selbstverständlich möglich, das Verfahren mit einem Marker oder mit einer Kombination aus zwei oder mehreren durchzuführen. So kann es vorgesehen sein, einen prozentualen Anteil bestimmter Marker zu verwenden. Das Verfahren kann invasiv oder nicht invasiv durchgeführt werden; selbstverständlich ist es möglich, ein nichtinvasives und ein invasives Verfahren zu kombinieren. So kann zunächst eine Bestimmung anhand eines oder mehrerer Marker nicht-invasiv erfolgen, wobei im Anschluss eine invasive Bestimmung mit den gleichen oder anderen Markern wie bei der nicht-invasiven Bestimmung durchgeführt wird.

Ein derartiges Verfahren ermöglicht eine schnelle Durchführung der Testung der adulten Neurogenese und es werden mehr Informationen aus einem einzigen Experiment gewonnen, wobei eine Abfolge an Experimenten, aber auch ein Einzelexperiment mit dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht standardisierbar ist. Sofern das Verfahren an Versuchstieren durchgeführt wird, folgt daraus eine Minimierung der zu verwendenden Versuchstiere. Es ist im Sinne der Erfindung, selbstverständlich nicht zwingend, dass das Verfahren an Tieren durchgeführt wird, es kann selbstverständlich auch im humanen Bereich angewendet werden. Sofern das erfindungsgemäße Verfahren beim Menschen angewendet wird, erfolgt die qualitative und/oder quantitative Bestimmung der adulten Neurogenese bevorzugt durch die Erfassung neu gebildeter Zellen, wobei nichtinvasive Verfahren und Vorrichtungen eingesetzt werden. Hierbei kann es sich beispielsweise um bildgebende und nuklearmedizinische Verfahren handeln, wie beispielsweise Positronenemissionstomographie, SPECT, Computertomographie und/oder Kernspintomographie und andere.

Der Nachweis der adulten Neurogenese mittels der genannten Marker, insbesondere Calretinin hat mehrere Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren.

Um Aussagen über die Wirksamkeit einer Substanz in der Regulation der Nervenzellneubildung zu machen, sind rein qualitative Aussagen nämlich wenig hilfreich, da ja gegebenenfalls die Überlegenheit der einen Substanz über eine andere dokumentierbar sein sollte und diese sich eben in einem zähl- und messbaren Mehr an Nervenzellen ausdrückt.

In bestimmten experimentellen Kontexten kann das auch bedeuten, dass sich Vorteile in Bezug auf rein qualitative Aussagen ergeben. Insbesondere Calretinin ist im Zytoplasma der neuen Nervenzellen exprimiert, so dass z. B. eine immunhistochemischen Markierung von Calretinin die Struktur der Zelle gut sichtbar macht. Wenn eine zu testende Wirksubstanz sich auf das Aussehen der Zelle auswirkt, kann dies leicht erfasst werden. Auch dies ist bei den bekannten Methoden, deren Markerantigene sich nur im Zellkern befinden, anders: während der Zellkörper und seine Fortsätze eine veränderte Morphologie gut sichtbar machen, ist das am Zellkern sehr viel schwieriger abzulesen. Man wird also insbesondere mit Calretinin den neugebildeten Nervenzellen leichter ansehen können, ob sie sich normal und gesund entwickelt haben.

Die Methode, die Zahl der neugebildeten Nervenzellen über die Zahl der Zellen, die Calretinin exprimieren, abzuschätzen, hat entscheidende praktische Vorteile. Alle neuen Nervenzellen weisen ein sogenanntes Calretininstadium auf, aber dieses Stadium folgt erst, wenn sich die Zahl der Zellen nicht mehr stark ändert, da die Zellen im Calretininstadium die Zellteilungsaktivität eingestellt haben, d. h. postmitotisch geworden sind. Deshalb ist die erfindungsgemäße Methode sehr sensitiv. Da nur die neugebildeten Nervenzellen Calretinin oder die anderen genannten Marker exprimieren, ist die erfindungsgemäße Methode auch sehr spezifisch. Der Hauptvorteil der neuen Methode liegt darin, dass es insbesondere mit Calretinin einen Marker gibt, der die neugebildeten Zellen von anderen Zellen der gleichen Hirnregion unterscheidet, so dass sie einfach erfasst werden können. In jedem anderen bekannten Verfahren müssen die sich entwickelnden Zellen zunächst aufwendig markiert werden, um post hoc in einem weiteren Schritt bestimmen zu können, ob sich markierte Zellen in neue Nervenzellen entwickelt haben. Dies ist umständlicher und weniger ökonomisch, erfordert mehr Tiere im Tierversuch, sofern invasive Verfahren mit Versuchstieren durchgeführt werden, erhöht die Fehlerwahrscheinlichkeit, da die Auswertung schwieriger ist, und ist auch kaum automatisierbar, quantitativ ist die klassische Methode etwas weniger genau, da die Analyse in zwei Schritten erfolgen muss. Die Vorteile der Calretininmethode sind also:

• • Hohe Sensitivität und Spezifität
• • Einfache, direkte Quantifizierbarkeit mit hoher Genauigkeit und Verlässlichkeit
• • Qualitative Aussagen zur Zellstruktur und Morphologie sind problemlos im gleichen Untersuchungsgang möglich
• • Geringerer experimenteller Aufwand mit weniger Tieren und billigeren Reagenzien
• • potentiell gute Automatisierbarkeit
• • Einfacherer Aufbau des Tests (nur eine histologische Färbung, die am normalen Lichtmikroskop ausgewertet werden kann und ebenfalls potentiell automatisierbar ist)
• • Die Versuchsorganismen erhalten einzig die Testsubstanz, deren Wirkung auf die Nervenzellneubildung untersucht werden soll, aber keine zusätzliche Markersubstanz, so dass die Auswirkungen möglicher Interaktionen zweier applizierter Substanzen auf das Messergebnis entfallen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den postmitotisch exprimierten endogenen Zellbestandteilen um Proteine, Kohlenhydrate und/oder Lipide einschließlich ihrer Modifikationen, wie beispielsweise Phosphorylierungen, Glykosylierungen, Polysyalilierungen und enzymatische Spaltungen. Besonders bevorzugt sind die Calcium-bindenden Proteine, insbesondere Calbindin, Parvalbumin, Calretinin, MRP8, MRP14 sowie die Familie der 5100 calcium-bindenden Proteine, insbesondere S100B (oder beta) und andere, ganz besonders bevorzugt ist Calretinin.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem endogenen Zellbestandteil um Calretinin oder Calbindin. Bevorzugt ist es durch die Detektion von diesem Protein auf der Aminosäure- bzw. auf der Nukleinsäureebene möglich, die adulte Neurogenese schnell und sicher zu bestimmen. Neben Parvalbumin, Calbindin gehört Calretinin zu den Calcium-bindenden Proteinen, die in verschiedenen Neuronentypen nachgewiesen werden können. Calretinin ist ein Calcium-Bindungsprotein, welches in bestimmten Typen von Nervenzellen, insbesondere Interneuronen exprimiert wird. Es findet sich jedoch auch als transient exprimiertes Molekül in reifenden Körnerzellen des Hippocampus. Calbindin ist ein Calciumbindungsprotein, das in der Produktion, Stabilisierung und Aufrechterhaltung der Zytoskelettelemente involviert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nervenzellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Körnerzellen von Hippocampus (Gyrus dentatus), Riechhirn (Bulbus olfactorius, Wände der Seitenventrikel und rostraler Migrationsstrom) und Kleinhirn, Projektionsneurone (insbesondere auch Pyramidenzellen) des Cortex und subcorticaler Hirnabschnitte, Principalzellen im Hippocampus (Gyrus dentatus, Hilus, CA3, CA2 und CA1) und Riechhirn, Interneurone in Hippocampus, Hirnrinde, Riechhirn und subcorticalen Hirnabschnitten. Die Gruppe umfaßt auch neurosekretorische Nervenzellen des Hypothalamus, Purkinjezellen des Kleinhirns und sensorische Nervenzellen der Sinnesorgane und nachgeschalteten Zentren. Im Sinne der Erfindung ist ein Neuron (eine Nervenzelle) jede Zelle, die zu einem Aktionspotential fähig ist. Die genannten Zellen können Bestandteil einer Probe für das erfindungsgemäße Verfahren sein. Durch die Analyse der Probe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Aussagen über die adulte Neurogenese innerhalb der Probe zu generieren.

Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches Gut oder eine Teilmenge bzw. eine kleine Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden kann, insbesondere um aus dieser Probe Erkenntnisse zur adulten Neurogenese zu gewinnen; die Probe kann zum Beispiel eine Ansammlung von Zellen sein oder ein Stück eines Hirns. Die Probenentnahme oder -gewinnung erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch die Untersuchung bzw. aus der Probe ermittelten Merkmale können der Beurteilung der adulten Neurogenese in der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge zulässt, verwendet werden. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zerteilen, Separieren, Vorfraktionieren, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung der Proben bekannt. Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Eine Probe sind vor allem biologische Materialien, die Strukturen umfassen, die mit der Weiterleitung bzw. Speicherung von Informationen auf biologischer Grundlage geeignet sind. Hierzu gehören beispielsweise das ZNS bzw. Teile davon, der Hippocampus (mit seinen Unterabschnitten plus angrenzenden Arealen, insbesondere Subiculum, Parasubiculum) das Rückenmark und das verlängerte Mark, inklusive des Hirnstammes, der Neokortex und subcorticale Hirnabschnitte, das Striatum, das Kleinhirn und andere. Es kann sich aber in bestimmten Fällen weiterhin um Flüssigkeiten, Zellansammlung bzw. Gewebe handeln, die z.B. vorzugsweise Körnerzellen umfassen; aber auch um Strukturen, die Nervenzellen (nach obiger Definition und Liste von Beispielen) enthält. Die Probe kann demgemäß zahlreiche andere Materialien umfassen, wie zum Beispiel Blut, Lymphe, Gehirnflüssigkeit und viele andere mehr. Es ist aber auch möglich, dass die Probe nur Teile der Nervenzellen insbesondere beispielsweise das Soma oder die Fortsätze (Neuriten, Neuropil) enthält.

Neuronen im Sinne der Erfindung sind alle Nervenzellen, die als hoch differenzierte Zellen zum Empfang, zur Bearbeitung und zur Weiterleitung nervöser Erregungen befähigt sind. Diese Zellen kommen beispielsweise im zentralen, peripheren und autonomen Nervensystem und in den Sinnesorganen vor und können eine Teilmenge der Probe sein.

Bei den Nervenzellen kann es sich beispielsweise um Nervenzellen aus Tieren oder Menschen handeln, bevorzugt sind insbesondere Körnerzellen, Pyramidenzellen und Interneurone im Hippocampus und Interneurone im Riechhirn.

Die Zellen können aus verschiedenen Geweben entnommen werden. Das Zentrale Nervensystem wird im Sinne der Erfindung in Gehirn und Rückenmark eingeteilt. Das Nervensystem teilt man ein in periphere, zentrales und autonomes Nervensystem. Neokortex und Striatum sind Teile des Gehirns. Wichtige Regionen mit adulter Neurogenese sind der Hippocampus und Riechhirn (Ventrikelwand, einschließlich den darunterliegenden Basalganglien, den Riechkolben und die dazwischenliegende Migrationsstrecke des rostralen Migrationspfads). Aber selbstverständlich können auch Nervenzellen aus anderen Regionen, in denen eine Neubildung von Nervenzellen beschrieben wird, eingesetzt werden.

Im Sinne der Erfindung sind Nervenzellen (Neurone) insbesondere Zellen, die im ZNS und dort insbesondere im Hippocampus und Riechhirn vorkommen. Diese Neuronen müssen jedoch im Sinne der Erfindung nicht ausschließ1ich im ZNS vorkommen.

Im Sinne der Erfindung sind Neurone bzw. Nervenzellen insbesondere solche, die aus Stamm- und Vorläuferzellen des erwachsenen Gehirns physiologischerweise oder nach Stimulation hervorgehen. Diese Zellen finden sich im gesamten Gehirn, bilden aber physiologischerweise nur im Hippocampus und Riechhirn neue Nervenzellen. Stamm- oder Vorläuferzellen sind undifferenzierte Zellen, die zur Selbsterneuerung fähig sind und aus denen ausreifende Zellen einer oder mehrerer Typen hervorgehen können. Im Rahmen dieser Differenzierung findet sich zwischen dem Stadium der Stamm- oder Vorläuferzellen und dem der ausgereiften Neurone ein intermediäres Stadium, das beispielsweise anhand der Expression von Calretinin identifizierbar ist.

Im Sinne der Erfindung erfolgt insbesondere die Bestimmung der Modulation der adulten Neurogenese durch verschiedene pharmakologische Substanzen im Hinblick auf neurologische und psychiatrische Erkrankungen umfassend Demenz, Temporallappenepilepsie oder Depressionen.

Die Modifikation bzw. die Veränderung gegenüber der adulten Neurogenese gegenüber einem Normalwert kann im Sinne der Erfindung mit allen vom Gehirn ausgehenden oder von diesem geprägten Krankheiten assoziiert sein. Beispielsweise kann die Modifikation der Neurogenese mit einer Demenz assoziiert sein.

Eine Demenz im Sinne der Erfindung ist der Verlust erworbener intellektueller Fähigkeiten, insbesondere des Gedächtnisses und Personlichkeitsveränderungen beispielsweise als Folge einer hirnorganischen Erkrankung. Demenz im Sinne der Erfindung ist weiterhin der Rückgang kognitiver Leistungen im Alter. Demenz im Sinne der Erfindung sind aber auch Merkfähigkeits- und Gedächtnisstörungen, Orientierungsstörungen, wahnhafte Zustände oder der Verlust der Persönlichkeit.

Auch angeborene Minderungen der kognitiven Leistungsfähigkeit, sofern sie mit einer Störung der Nervenzellneubildung im erwachsenen Gehirn assoziierbar ist, gehören zu den neuropsychiatrischen Erkrankungen im Sinne der Erfindung.

Demenz ist insbesondere in höherem Alter die häufigste Ursache von Pflegebedürftigkeit in den Industrieländern. Die Diagnose der Demenz erfolgt erfindungemäß bevorzugt anhand klinischer Kriterien differentialdiagnostisch, weiterhin können (i) internistische, (ii) neurologische und/oder (iii) psychiatrische Krankheitsbilder berücksichtigt werden, die die Demenz begleiten oder die Demenz-artige oder Demenz-assoziierte Erkrankungen im Sinne der Erfindung sind, werden im Folgenden aufgeführt, wobei dem Fachmann bekannt ist, dass bei einer Demenz die internistischen, (ii) neurologischen und/oder (iii) psychiatrischen Krankheitsbilder das klinische oder medizinische Bild einer Demenz dominieren oder aber völlig abwesend sein können; die internistischen (ii) neurologischen und (iii) psychiatrischen Krankheitsbilder können durch die erfindungsgemäße Lehre je nach Krankheitsverlauf selbstverständlich mit erfasst sein.

zu (i): chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, chronische Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen, rezidivierende Asystolien, Hypothyreose, Hyperthyreose, Hypoparathyreoidismus, Hyperparathyreoidismus, chronische Urämie, Leberzirrhose, Folsäuremangel, Vitamin-B₆-Mangel, Vitamin-Bl2-Mangel, Intoxikationen durch Industriegifte z.B. Kohlenmonoxid, Quecksilber, Blei, Perchloräthylen, Intoxikationen durch Medikamente z.B. Psychopharmaka, Anticholinergika, Antihypertonika, Antikonvulsiva, Betablocker, Digoxin, Immunvaskulitis, Exsikkose, Elektrolytstörungen – Hyponatriämie und Hypernatriämie –, rheologisch bedingte Hirndurchblutungsstörungen z.B. bei Polyzythämie und multiplem Myelom;

zu (ii): chronisch subdurales Hämatom, Hirntumoren, Parkinson Krankheit, Hydrocephalus aresorptivus, Chorea Huntington, Multiple Sklerose, chronischer Alkoholismus, infektiöse Erkrankungen wie Meningoenzephalitiden, Lues, Hirnabszess, Creutzfeldt-Jakob Krankheit oder einem Demenzkomplex mit Lewy Körperchen und

zu (iii): Depression, Oligophrenie oder Schizophrenie.

Durch die Offenbarung der vorliegenden Erfindung, kann der Fachmann die adulte Neurogenese im Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen. bestimmen. Die Klassifikation dieser Krankheiten kann auf mehrere Arten erfolgen. Dem Fachmann ist bekannt, dass er die genannten Krankheiten auch anders klassifizieren kann, z.B. in affektive Erkrankungen, insbesondere die Majordepression und bipolare Störungen, posttraumatische Streßerkrankungen, psychotische Krankheitsbilder insbesondere die Schizophrenie in ihren Ausprägungsformen; Autismus, Persönlichkeitsstörungen, Zwangserkrankungen, Hyperaktivitätssyndrome und Aufmerksamkeitsstörungen. Aber auch Prionenerkrankungen in ihrer erworbenen oder familiären Form sind eine Demenz im Sinne der Erfindung.

Wichtige Demenzformen im Sinne der Erfindung sind die primär kortikal-degenerative Form vom Alzheimer Typ und die angeborenen (insbesondere zum Beispiel CADASIL) oder erworbenen vaskulären Formen der Demenz mit den Begleitsymptomen: Depression, Schlafstörung, Sprach- und Bewegungsstörungen, Harn- und Stuhlinkontinenz sowie chronische Obstipation. Es kann vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäße Therapie in einem ganzheitlichen Konzept eingebettet ist, dessen Ziel die Aktivierung des Patienten, die Verbesserung seiner kognitiven Leistungsfähigkeit und die Kompensation seiner gestörten sozialen Integration ist.

Eine Demenz im Sinne der Erfindung kann z.B. nach DSM IV definiert werden; dem Fachmann ist diese Einteilung aus Standardwerken im Detail bekannt, es wird daher im Folgenden nur auf einzelne Beispiele verwiesen:

Unter 300 = Organische und psychotische Störungen, Wahn und Autismus

über 300 = Neurosen, und (fast) alles andere

• 0 = nicht organisch, neurotisch, reaktiv in der Genese
• 1 = (vermuteter) leichter organischer Verursachungsfaktor

• 290 = Alzheimer
• 291-2 = Substanzentzug oder -intoxikation mit Delir, Wahn, organischen Störungen
• 293 = Störungen aufgrund eines medizinischen Krankheitsfaktors
• 294 = andere Demenzen
• 295 = Schizophrenien und schizoaffektive Störung
• 296 = Affektive Störungen (nicht neurotisch)
• 297 = Wahn
• 298 = reaktive und atypische Psychosen
• 299 = Autismus und andere Entwicklungsstörungen (nicht näher bezeichnet)
• 300 = Neurosen (im klassischen Sinn)
• 301 = Persönlichkeitsstörungen
• 302 = Sexualstörungen (ohne medizinschen Krankheitsfaktor)
• 303 = Alkoholabhänigkeit und -intoxikation
• 304 = Abhängigkeit von psychotropen Substanzen
• 305 = Substanzmißbrauch und -intoxikation
• 307 = spezielle Entwicklungs- und Schlafstörungen
• 308-9 = Anpassungs- und Belastungsstörungen
• 310 = organisch bedingte Persönlichkeitsstörungen
• 311 = depressive Störungen (nicht näher bezeichnet)
• 312 = Störungen der Impulskontrolle, Monomanien
• 314 = Aufmerksamkeitsstörungen und Hyperaktivität
• 315 = Sprach-, Rechen- und Motorikstörungen bei Kindern
• 316 = körperliche Zustände bei denen psychische Faktoren eine Rolle spielen
• 317-9 = Oligophrenien

• 332-3 = Neuroleptikanebenwirkungen und -folgen
• 347 = Narkolepsie
• 607-25 = sexuelle Funktionsstörungen aufgrund eines medizinischen Krankheitsfaktors
• 780 = Schlafstörungen aufgrund eines medizinischen Krankheitsfaktors
• 780.09 = Delir (nicht näher bezeichnet)
• 780.9 = altersbedingter kognitiver Abbau
• 787 = Enkopresis mit Verstopfung und Überlaufinkontinenz

Besonders bevorzugt ist neben dementieller Entwicklung (Kognitiver Abbau) im Rahmen des Alterns (Nachlassen der geistigen Leistungsfähigkeit, kombiniert mit schneller Ermüdbarkeit, fortschreitenden Störungen des Gedächtnisses und der Orientierung, etc.) insbesondere die Demenz in der Form von Alzheimer. Alzheimer im Sinne der Erfindung ist eine multifaktorielle, familäre oder erworbene senile, zumeist im 5. bis 6. Lebensjahrzehnt klinische manifest werdende Form der Demenz, pathologisch gekennzeichnet durch eine fortschreitende Großhirnrindenatrophie mit senilen Plaques, Degeneration von Neurofibrillen und kongophiler Angiopathie. Alzheimer ist im Sinne der Erfindung unter Umständen mit verwaschenen Herdsymptomen (Aphasie, Apraxie) kombiniert.

Im Sinne der Erfindung wird der Begriff Depression sehr weit definiert. Dieser Begriff ist nicht an typische altersbedingte oder endogene bzw. exogene Faktoren gebunden. Bevorzugt ist die Majordepression, die nicht zwingend eine erkennbare körperliche Erkrankung als Ursache haben muss oder mit einem äußeren seelischen Anlass begründbar ist. Jede Form der traurigen Verstimmung, des Gefühls der Hoffnungslosigkeit und inneren Leere, der Willens-, Denk- und Antriebshemmung, die gegebenenfalls auch körperlich empfunden werden können, beispielsweise als Schwäche oder Herzangst, sind endogene Depressionen im Sinne der Erfindung. Verminderte Konzentration und Aufmerksamkeit sowie vermindertes Selbstwertgefühl und Selbstvertrauen, Gefühle von Schuld und Wertlosigkeit wie auch negative und pessimistische Zukunftsperspektiven und Suizidgedanken, -pläne und/oder -handlungen, wie auch Schlafstörungen und verminderter Appetit sind im Sinne der Erfindung Symptome, bevorzugt Zusatzsymptome zu Depressionserkrankungen. Kernsymptome sind bevorzugt eine depressive Stimmung in dem Sinne, wie sie dem durchschnittlichen Fachmann bekannt ist, der Verlust von Interesse und Freude sowie die erhöhte Ermüdbarkeit. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die nähere Charakterisierung von Demenz bzw. Depressionen durch die Bestimmung der Modifikation der adulten Neurogenese beschränkt, sämtliche neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen können mit einer Veränderung der Neurogenese einhergehen.

Im Sinne der Erfindung kann die adulte Neurogenese im Zusammenhang mit der Diagnose oder Therapie folgender Erkrankungen bestimmt werden: neurodegenerative Erkrankungen insbesondere der Morbus Parkinson und andere Bewegungsstörungen, Morbus Alzheimer und andere demenzielle Syndrome, Tumorerkrankungen des Gehirns, insbesondere Glioblastoma multiforme, Gangliogliome und Neurocytome, Suchterkrankungen, insbesondere Alkohol, Cannabis und Opiatmißbrauch, Entzündungserkrankungen des Gehirns, insbesondere Multiple Sklerose, und die Folgen von Minderdurchblutung (Ischämie, Schlaganfall, Bluthochdruck) und Hirnverletzungen. Dem Fachmann sind weitere neurologische Erkrankungen bekannt.

Bevorzugt ist weiterhin eine genauere Analyse der Temporallappenepilepsie durch die erfindungsgemäße Bestimmung der adulten Neurogenese. Die Temporallappenepilepsie ist eine partielle Epilepsie mit Lokalisation der neuronalen Entladung im Lobus temporalis oder Teilen davon. Sie zeigt fokale und sekundär oder primär generalisierte Symptome motorischer oder sensorischer Art, mit oder ohne Aura, insbesondere auch psychomotoriche Anfälle, wie sie dem Fachmann bekannt sind.

Bei der Epilepsie im Sinne der Erfindung kann es sich bevorzugt um eine der folgenden Epilepsien handeln, um die adversive, akinetische, audiogene, audiotive, corticalis, cursiva, diffuse, diurna, emotionelle, fokale, fotogene, generalisierte, genuine, halluzinatorische, hereditäre, idiopathische, laryngealis, limbische, major, menstrualis, metabolische, minor, musikogene, myoklonische, nocturna, nonconvulsiva, partialis, partialis continua, propulsiva, psychogene, psychomotorische, salivatorische, senilis, sensorische, symptomatische, tarda, traumatica, versive, visuelle, zentrenzephale, zerebellare Epilepsie.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nervenzellen Körnerzell-Neuronen, insbesondere im erwachsenen Hippocampus eines Säugers.

Eine bevorzugte Methode basiert z. B. darauf, Calretinin in den interessierenden Zellen anzufärben und ihre Zahl zu bestimmen. Diese kann als direktes Maß für die Zahl der neugebildeten Nervenzellen genommen werden. In der bevorzugten Form handelt es sich um einen immunhistochemischen Nachweis im Gewebeschnitt am Hirngewebe von Mäusen, die die Testsubstanzen, deren Wirkung auf die Neubildung von Nervenzellen untersucht werden soll, verabreicht bekommen haben. Die gefärbten Schnitte werden am Lichtmikroskop ausgewertet. Die Zellen, die Calretinin enthalten, werden dabei gezählt. Dies erfolgt nach Regeln, wie sie dem Fachmann bekannt sind und die eine Auswertung von Stichproben erlauben. Man erhält als Ergebnis die Zahl der Calretinin-positiven Zellen pro Hippocampus. Diese korreliert direkt mit der Zahl neuer Nervenzellen. Ein Mehr an Calretinin wäre dann gleichbedeutend mit einem Mehr an Nervenzellneubildung.

Hieraus ergibt sich, dass die Untersuchung nicht allein immunhistochemisch erfolgen muss, sondern zum Beispiel auch proteinbiochemisch (Western Blot, HPLC) an homogenisierten Proben des Hirngewebes.

Auch kann die Methode dahingehend modifiziert werden, dass Calretinin in Zellen nicht immunhistochemisch mit Antikörpern gegen Calretinin sichtbar gemacht wird, sondern z. B. ein transgenes Tiermodell genutzt wird, in dem das grün fluoreszierende Protein GFP oder ein ähnliches Reportergen unter regulatorischen Genabschnitten des Calretiningens exprimiert wird. Calretinin-positive Zellen wären damit im Gewebe direkt sichtbar. Sie können wiederum mikroskopisch analysiert und quantifiziert werden oder aber beispielsweise mit Hilfe von fluoreszenzaktivierten Zellsortern oder Magnetseparation aus dem Gewebe extrahiert werden und so weiter untersucht werden. Für diese bevorzugte Variante der Methode werden geeignete regulatorische Sequenzen des Calretiningens („Calretinin-Promotor"), insbesondere solche, die für die nervenzellspezifische Calretininexpression verantwortlich sind, identifziert und in einem gentechnischen Konstrukt (Vektor) so mit dem Reportergen verbunden, dass bei Aktivierung der regulatorischen Elemente die Information für das Reportergen abgelesen wird und das dem Reportergen entsprechende Reporterprotein von der Zelle gebildet wird. Dieses Protein verteilt sich in der Zelle und kann dort nachgewiesen werden. Das Reportergen GFP oder die ihm verwandten rot-fluoresziierenden Reportergene beispielsweise lassen die exprimierenden Zellen bei Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge grün (bzw. rot) aufleuchten. Es ist somit kein antikörpervermittelter Schritt notwendig, um die Calretinin-exprimierenden Zellen sichtbar zu machen. Um dies nutzen zu können, muss mit Hilfe des Vektorkonstruktes ein transgenes Tiere, bevorzugt eine transgene Maus, produziert werden, die dann untersucht werden kann.

Mit geeigneten radiologischen oder nuklearmedizinischen Methoden könnte die Zahl der Calretinin-positiven Zellen auch am lebenden Organismus bestimmt werden, was Langzeituntersuchungen im Zeitverlauf möglich machen würde. In jedem Fall entspräche der nachgewiesene Wert der Calretininexpression dem Ausmaß der ablaufenden Nervenzellneubildung. Während die mikroskopische Untersuchung am Hirnschnitt gleichzeitig qualitative und quantitative Aussagen zulässt, sind mit biochemischen oder bildgeberischen Verfahren insbesondere quantitative Aussagen möglich.

Der Nachweis von Calretinin kann in Mehrfachmarkierungen mit dem Nachweis anderer Marker kombiniert werden, so dass Aussagen über Untergruppen von Calretinin-positiven Zellen möglich sind. Besonders bevorzugt ist die Kombination mit MRP8, MRP14, Parvalbumin, 5100 und/oder Calbindin. Die Marker MRP8, MRP14, Parvalbumin und/oder 5100 können auch isoliert zur Detektion der adulten Neurogenese verwendet werden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung transient postmitotisch exprimierter endogener Zellbestandteile zur Bestimmung der adulten Neurogenese. Bevorzugt wird hierbei die adulte Neurogenese in einem ausgewachsenen Gehirn anhand der Calretinin-Expression bestimmt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung eines die adulte Neurogenese modifizierenden Mittels, wobei die adulte Neurogenese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in Gegenwart und/oder in Abwesenheit des Mittels durchgeführt und die Modifikation der Neurogenese detektiert wird und die Modifikation einen Hinweis auf ein Neurogenese-modifizierendes Mittel ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst dieses Verfahren weiterhin die Formulierung des identifizierten Mittels oder eines Derivates oder eines Homologen hiervon mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Die Erfindung betrifft auch ein Mittel zur Modifikation der adulten Neurogenese, erhältlich durch

• a) in-Kontakt-bringen eines Mittel-Kandidaten mit Nervenzellen,
• b) Bestimmung der adulten Neurogenese,
• c) Abgleich der bestimmten Neurogenese mit einer Standard-Neurogenese und
• d) gegebenenfalls Vergleich, ob das Mittel die adulte Neurogenese modifiziert.

Mittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die vorliegend synonym verwendet werden können, sind erfindungsgemäß Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper die adulte Neurogenese zu modifizieren. Medizinische Hilfsstoffe sind erfindungsgemäß solche Stoffe, die zur Produktion als aktive Ingredienzien von Arzneimitteln eingesetzt werden. Pharmazeutischtechnische Hilfsstoffe dienen der geeigneten Formulierung des Arzneimittels oder der pharmazeutischen Zusammensetzung und können sogar, sofern sie nur während des Herstellungsverfahrens benötigt werden, anschließend entfernt werden oder können als pharmazeutisch verträgliche Träger Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt.

Die Arzneimittelformulierung oder Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden, beispielsweise in einem Bereich von 1 &mgr;g bis 10 g an Molekülen pro Tag und Patient (Mensch oder Tier). Bevorzugt werden dabei Dosen von 1 mg bis 1 g. Bevorzugt wird eine Verabreichung von möglichst wenigen und niedrigen Dosen und weiter bevorzugt eine einmalige Dosis, beispielsweise auch eines radioaktivmarkierten Moleküls für die Diagnose oder die Untersuchung einer Zivilisationskrankheit.

Die Verabreichung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intrarektal, intragastrointestinal, intranodal, intramuskulär, lokal, aber auch subkutan, intradermal oder auf der Haut oder über die Schleimhäute. Die Verabreichung von Nukleinsäuren – wie z.B. Antisense-Konstrukten – kann auch in Form von Gen-Therapie geschehen, beispielsweise virale Vektoren. Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Größe, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen oder das Arzneimittel umfasst insbesondere das gefundene Mittel, dessen Stimulatoren oder -Agonisten, -Inhibitoren oder -Antagonisten, Erkennungsmoleküle gegen dieses, oder/und diese kodierende Nukleinsäuremoleküle in einer geeigneten Lösung oder Verabreichungsform enthält. Diese können entweder alleine mit den entsprechenden unter Arzneimitteln oder pharmazeutischen Zusammensetzungen beschriebenen Hilfsstoffen verwendet werden.

Die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel kann selbstverständlich auch eine Kombination von zwei oder mehreren der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Arzneimittel sein sowie eine Kombination mit anderen Arzneimitteln, die auf eine geeignete Weise zeitlich gemeinsam oder getrennt verabreicht beziehungsweise angewandt werden. Die Herstellung oder pharmazeutische Zusammensetzungen der Arzneimittel erfolgen nach an sich bekannten Methoden.

Bevorzugt ist es, das Mittel als Diagnose-, Prophylaxe, Therapie-, Nachbehandlungs- und/oder Verlaufskontrollmittel einzusetzen, z. B. um die Behandlung der Modifikation der adulten Neurogenese zu verfolgen.

Die Erfindung betrifft auch einen Bioassay und einen Kit, die Erkennungsmoleküle umfassen, mit denen transient postmitotische exprimierte endogene Zellbestandteile, wie Calbindin, MRP8, MRP14 und/oder Parvalbumin, bevorzugt Calretinin, bestimmt und detektiert werden können. Bei den Erkennungsmolekülen im Kit oder Bioassay kann es sich beispielsweise um Antikörper, um Antisense-Konstrukte, um Chelatoren, um spezifisch wechselwirkende Lipide und Kohlenhydrate bzw. um Lektine, Helix-Bündel-Proteine, Fusionsproteine, und/oder Lipocaline handeln, deren Wechselwirkung mit den transient postmitotisch exprimierten endogenen Zellbestandteilen, bevorzugt Calretinin, so bestimmbar ist, dass eine Aussage über die adulte Neurogenese möglich ist. Weiterhin bevorzugt sind MRP8, MRP14 oder Parvalbumin. Antikörper im Sinne der Erfindung sind neben vollständigen Antikörpern single chain Antikörperfragmente, Multibodies, Fab-Fragmente, Fusionsproteine z.B. aus einem Antikörperfragment mit Peptiden oder Proteinen und/oder einem Immunglobulin der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE, IgD und/oder deren Subklassen. Hierbei kann es sich murine, chimärisierte, humanisierte, humane, partiell humane Antikörper oder Antikörperfragment handeln.

Der Bioassay wie auch der Kit können weitere chemische Reagenzien umfassen, die zur Detektion der endogenen Zellbestandteile erforderlich sind, bevorzugt kann es sich z.B. um Antikörper oder deren Fragmente handeln, die eine immunologische bzw. histologische Detektion der adulten Neurogenese ermöglichen. Im Sinne der Erfindung wird unter Bioassay sowohl ein Verfahren als auch eine Anordnung oder Vorrichtung, umfassend Biokomponenten oder Reagenzien zur Bestimmung der adulten Neurogenese, verstanden; diese Doppelbedeutung des Begriffs Assay ist dem Fachmann bekannt. Der Kit kann Informationen zum Kombinieren der Inhalte des Kits und/oder zur Bereitstellung einer Formulierung des Kits haben. Bei dieser Information kann es sich beispielsweise um einen Beipackzettel handeln oder um eine Information, die auf einer Homepage zur Verfügung gestellt wird. Kit und Assay können weiterhin Hilfs- oder Trägerstoffe, Enzyme, Markersubstanzen aber auch Aufbewahrungsbehältnisse, Objektträger, optische Instrumente, Injektionsvorrichtungen, Mikrotome und/oder andere Vorrichtungsteile umfassen, die eine biologische, chemische und/oder physikalische Bestimmung der adulten Neurogenese ermöglichen oder unterstützen.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispieles näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.