Stimulierung der Aktivität eines Isoform des Lysyloxidase zum Bekämpfen von einigen Pathologien, die durch eine unvollständige, fehlende oder desorganisierte Elastogenese verursacht sind

Dokumentenidentifikation	DE102004028300A1 24.03.2005
Titel	Stimulierung der Aktivität eines Isoform des Lysyloxidase zum Bekämpfen von einigen Pathologien, die durch eine unvollständige, fehlende oder desorganisierte Elastogenese verursacht sind
Anmelder	COLETICA Ltd. Co., Lyon, FR; Centre National de la Recherche Scientifique Public Establishment of Scientifical & Technical Nature, Paris, FR
Erfinder	Cenizo, Valérie, Vaulx-Milieu, FR; Bouez, Charbel, Lyon, FR; Sommer, Pascal, Saint-Genis Laval, FR; Damour, Odile, Saint-Genis Laval, FR; Gleyzal, Claudine, Lyon, FR; Andre, Valérie, Ampuis, FR; Reymermier, Corinne, Charly, FR; Orly, Isabelle, Irigny, FR; Perrier, Eric, Les Cotes d'Arey, FR
Vertreter	Bosch, Graf von Stosch, Jehle Patentanwaltsgesellschaft mbH, 80639 München
DE-Anmeldedatum	11.06.2004
DE-Aktenzeichen	102004028300
Offenlegungstag	24.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt	24.03.2005
IPC-Hauptklasse	C12Q 1/26
Zusammenfassung	Die Erfindung betrifft die Stimulation der Aktivität einer Isoform der Lysyloxidase und insbesondere der Isoform LOX (Lysyloxidase). Die Erfindung betrifft besonders ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffs, welcher die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben und/oder in Fällen von einigen ekzemartigen Pathologien reguliert. Das Ziel der Erfindung ist es hauptsächlich, ein solches Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffen bereitzustellen, um so Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine Elastogenese in den als zu regulierenden angeführten Fällen ermöglichen.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Stimulation der Aktivität einer Isoform der Lysyloxidase und insbesondere der Isoform von LOX (Lysyloxidase).

Stand der Technik:

Die Eigenschaften der Resistenz und der Elastizität der Haut und der Schleimhäute werden im Wesentlichen durch die Kollagenfasern und die Elastinfasern der Dermis bestimmt. Elastin ist ein Protein, welches die elastischen Fasern bildet, die ebenfalls aus anderen Molekülen, wie Fibrilinen und MAGPs (Mikrofibrillär Assoziierte Glykoproteine), aufgebaut sind.

Die elastischen Fasern werden aus Elastin gebildet, welches auf den Mikrofibrillen aufgelagert ist. Elastin wird in Form von löslichem Tropoelastin synthetisiert, welches seine physikalischchemischen Eigenschaften (Unlöslichkeit, Elastizität) nach seiner intra- und inter-molekularen Quervernetzung durch eine Lysyloxidase und seiner nachfolgenden Auflagerung auf den Mikrofibrillen erwirkt. Die elastischen Fasern sind für die elastischen Eigenschaften der Organe, die sie enthalten (Blutgefäße, Lungenparenchym, elastische Knorpel, Haut ...) verantwortlich. Die elastischen Fasern sind hauptsächlich aus Elastin aufgebaut, welches auf den Mikrofibrillen gelagert ist. Der Name "Elastin" wurde für das Protein reserviert, das den amorphen Anteil der elastischen Fasern bildet, und das ihnen ihre Elastizität verleiht.

Kürzlich wurden die Bestandteile dieser elastischen Fasern in der Epidermis nachgewiesen.

Die Kollagenfibrillen werden durch die trimäre Anordnung der Kollagenketten gebildet. Diese Kollagenfasern werden ebenfalls durch die Lysyloxidase LOX quervernetzt. Die Kollagenfasern werden das ganze Leben hindurch in den Bindegeweben synthetisiert. Es existieren fünf bekannte Isoformen in der Familie der Lysyloxidasen (LOs: LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4 (Csiszar, Lysyl Oxidases: A novel multifunctional amine oxidase family, Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, Bd 70, S. 2-28). LOX ist an der Quervernetzung der Kollagenfasern beteiligt (Seve et al., Expression analysis of recombinant lysyl oxidase (LOX) in myofibroblast-like cells, Connective Tissue Research, 2002, 43: 613-619). LOX ist ebenfalls mit der Instandhaltung der zellulären Homöostase assoziiert und kann als ein Regulator angesehen werden, der für die Instandhaltung der zellulären Homöostase durch die Regulation von NF-kappaB erforderlich ist (Jeay S, Pianetti S, Kagan HM, Sonenshein GE. Lysyl oxidase inhibits ras-mediated transformation by preventing activation of NF-kappaB. Mol Cell Biol 23: 2251-63, 2003).

Die Synthese von Kollagen ist in Fällen pathologischer, desorganisierter und/oder nichtfunktioneller Elastogenese, wie Fibxose oder Sonnen-Elastosis („solar elastosis"), sowie in Fällen einiger Krebserkrankungen ("cancerous pathologies"), begleitend dereguliert. Die Synthese von Kollagen ohne die Expression von LOX ist mit pathologischen Modifikationen der extrazellulären Matrix verbunden, wie im Fall von Krebs. Im Gegensatz dazu ist die Synthese von Kollagen und LOX mit einer Verdichtung der Matrix als ein Verteidigungsmechanismus gegen Zellangriffe assoziiert (Decitre et al., Lab. Invest., 78, 143-151, 1998).

Die Synthese von Elastin ist in Fällen pathologischer, desorganisierter und/oder nicht funktioneller Elastogenese, wie Fibrose oder Sonnen-Elastosis, und in Fällen einiger Krebserkrankungen dereguliert. Diese angeordnete Synthese von Elastin führt zu der Bildung von hieraus abgeleiteten Peptiden, welche im Allgemeinen als vorteilhaft für das Tumorpotential von Zellen angesehen wird (Brassart B, Fuchs P, Huet E, Alix AJ, Wallach J, Tamburro AM, Delacoux F, Haye B, Emonard H, Hornebeck W, Debelle L. Conformational dependence of kollagenase (matrix metalloproteinase-1) up-regulation by elastin peptides in cultured fibroblasts. J. Biol. Chem. 276(7): 5222-7, 2001).

Der Stand der Technik ist nicht in der Lage, Kriterien bereitzustellen, die es ermöglichen, den Einfluss von Wirkstoffen, welche die Regulation der Elastogenese („elastogenesis") ermöglichen, auf die dermatologische Kosmetik („dermato-cosmetology") zu bewerten. In diesem Zusammenhang ist es ebenfalls sehr schwierig, objektive Kriterien zu erstellen, die es ermöglichen, den Einfluss dieser Wirkstoffen zu beurteilen. Die gegenwärtigen Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffe beziehen sich auf die Evaluierung der Expression der Gene, welche bei der Bildung der elastischen Fasern, wie Elastin oder den Fibrillinen, involviert sind.

Weiterhin sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt Tierexperimente in der Kosmetik in Europa verboten und eine humane Experimentation ist ethisch umstritten. Es ist daher für die Erfinder nicht möglich, Screening-Verfahren für kosmetische Anwendungen durchzuführen, welche Tieren oder Menschen einsetzen.

In dreidimensionalen Zellmodellen, wie Mimeskin^® (Coletica, Frankreich), induzieren Keratinocyten die Synthese von Tropoelastin und die Ablagerung von Tropoelastin auf den Mikrofibrillen (Duplan-Perrat et al., Keratinocytes influence the maturation and organization of the elastin network in a skin equivalent. J. Invest. Dermatol. 114: 365-70, 1999). In dem Mimeskin^®-Modell zeigte die extrazelluläre Matrix eine ultra-strukturelle Organisation, ähnlich zu der von Haut, in welcher das Kollagen in Strahlen und elastischen Fasern organisiert ist, die aus Elastin aufgebaut sind, das auf den Mikrofibrillen aufgelagert ist. Dieses Modell ist ebenfalls verwendet worden, um die Effektivität bestimmter Moleküle, wie Inhibitoren von Lysyloxidasen, zu testen. Dies hat es ermöglicht zu zeigen, dass die Inhibierung der Lysyloxidasen eine Desorganisation der Kollagenfasern und der Elastinfasern induziert, aber ebenfalls eine Abweichung von dem Differenzierungsprogramm der Keratinocyten durch eine Reduktion des Expressionslevels der Marker für die terminale Differenzierung, wie Filaggrin (Französisches Patent 01 10443, CNRS, Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire and le genie tissulaire). In diesem Patent wird kein Unterschied zwischen den verschiedenen Isoformen von LOX gemacht.

Diese Studien ermöglichten es nicht, ein Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffen zu entwickeln, welche die Expression von LOX stimulieren, und welche die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen (Schwangerschaftsstreifen) („stretch marks"), und/oder von dystrophen Narben („dystrophic scars") und Krebserkrankungen, herunterregulieren.

Der Stand der Technik ermöglicht es daher nicht, Wirkstoffe bereitzustellen, welche die Expression von LOX stimulieren, und welche die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrosis, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben, herunterregulieren.

Weiterhin ermöglicht es der Stand der Technik nicht, das Gebiet, in dem die Isoform der Lysyloxidase LOX exprimiert wird, präzise zu lokalisieren, insbesondere dadurch, dass die im Stand der Technik bereitgestellten Verfahren, unpräzise sind und im Hinblick auf die verschiedenen Isoformen der Lysyloxidase nicht ausreichend spezifisch sind.

Ziele der Erfindung:

Das Ziel der Erfindung ist es hauptsächlich, die oben angeführten technischen Probleme zu lösen, und insbesondere das technische Problem zu lösen, ein Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffen bereitzustellen, welche die Expression von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon stimulieren, um die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Estaogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben zu regulieren. Mit "funktionell elastischen Fasern" ist deren allgemeine bzw. herkömmliche Bedeutung aus dem oben beschriebenen Stand der Technik gemeint und besonders, im Rahmen mit der Erfindung, sind elastische Fasern gemeint, deren elastische Eigenschaften aus einer dreidimensionalen Struktur resultieren.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der Isoform der Lysyloxidase und eines Wirkstoffs (einer Wirksubstanz, einer Substanz), welcher die Expression des Proteins Elastin inhibiert, insbesondere zum Regulieren der Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben. Der Effekt, der erzielt wird, ist folglich synergistisch.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Wirkstoffs, welcher die Enzymaktivität oder die Expression der Isoform der Lysyloxidase stimuliert, wobei der Wirkstoff die Expression des Proteins Elastin inhibiert, oder mit einem zweiten Wirkstoff kombiniert wird, welcher die Expression des Proteins Elastin inhibiert, insbesondere zum Regulieren der Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben. Der Effekt, der erzielt wird, ist folglich synergistisch.

Durch die Erfindung wird ebenfalls das technische Problem gelöst, welches in dem Bereitstellen eines effektiven Verfahrens zum Lokalisieren der Expression von LOX und zum Verfolgen von deren Expression besteht.

Zusammenfassung der Erfindung

In diesem Text meinen die Erfinder mit dem Begriff "LOX" oder "hLOX" die Isoform des humanen Proteins Lysyloxidase LOX mit der Sequenz ID Nr. 1.

In diesem Text meinen die Erfinder mit dem Begriff "Elastin" das humane Protein Tropoelastin oder das Protein Elastin mit der SEQ ID Nr. 3.

In diesem Text meinen die Erfinder mit dem Begriff "Kollagen" die verschiedenen Typen von Kollagen, die im humanen kutanen Gewebe vorhanden sind.

In diesem Text meinen die Erfinder mit dem Begriff "LOXL" oder "hLOXL" das Isoformähnliche („isoform-like") (L) des humanen Proteins Lysyloxidase LOXL mit der SEQ ID Nr. 6.

Mit "Stimulieren der Expression der Isoform der Lysyloxidase LOX" meinen die Erfinder die Stimulation der Expression des Gens, welches für LOX kodiert, und insbesondere die Stimulation der Synthese von messenger RNA, welche für LOX kodiert, ebenfalls die Stimulation des Proteins LOX, welches aus dieser Messanger RNA synthetisiert wird. Die LOX cDNA besitzt die SEQ ID Nr. 2.

Mit "Inhibieren der Expression des Proteins Elastin" meinen die Erfinder die Inhibierung der Expression des Gens, welches für das Protein Elastin kodiert, und insbesondere die Inhibierung der Synthese von messenger RNA, welche für das Protein Elastin kodiert, und ebenfalls die Inhibierung der Synthese des Proteins Elastin oder seines Vorläufers Tropoelastin aus dieser messenger RNA. Die cDNA des Proteins Tropoelastin besitzt die SEQ ID Nr. 4.

Mit "Stimulieren der Expression von Kollagen I" meinen die Erfinder die Stimulation der Expression des Gens, welches für Kollagen I alpha1 kodiert, und insbesondere die Stimulation der Synthese von messenger RNA, welche für das Kollagen I alpha1 kodiert, und ebenfalls die Stimulation der Synthese von Kollagen I oder von seinem Vorläufer Prokollagen I aus dieser messenger RNA.

Diese Stimulation der Expression von LOX muss so durchgeführt werden, dass sie ausreichend effektiv ist, um zum Regulieren der Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben, beizutragen. Bei einigen Pathologien (Krankheitsbildern) ist es wünschenswert, die Expression des Proteins Elastin zu inhibieren, um einen wirksamen Effekt zu erzielen, der eine desorganisierte Elastogenese reguliert, die insbesondere in den Fällen von Sonnen-Elastosis oder von Fibrose beobachtet wird.

Mit dieser Erfindung haben die Erfinder folglich das Ziel, entweder die Expression von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon oder die enzymatische Aktivität von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon zu stimulieren und die Expression des Proteins Elastin zu inhibieren.

Mit "eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon" ist eine homologe Form der Isoform der Lysyloxidase LOXL gemeint, welche die gleiche oder ähnliche Aktivität wie das hierin definierte LOXL besitzt.

Die Wirkstoffe sind als wirksam anzusehen, wenn sie eine zweifache Erhöhung der Expression und/oder der Aktivität von LOX bewirken und parallel eine 0,5-fachen Herabsetzung der Expression der mRNA von Elastin (Eln) in einem Modell bewirken, welches mindestens einen Zelltyp umfasst, bei dem eine Expression und/oder eine Aktivität von LOX auf den Kontakt mit diesen Wirkstoffen hin auftritt, bezogen auf den Expressionslevel und/oder die Aktivität von LOX in einem Kontrollmodell (ohne Kontakt mit den Wirkstoffen).

Demnach betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz, welche die Aktivität und/oder die Bildung von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon fördert, zum Regulieren der Elastogenese in Fällen von anormaler oder pathologischer Elastogenese, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– In-Kontakt-Bringen eines potentiellen Wirkstoffs mit mindestens einem Typ von Zellen, die vorzugsweise lebendig sind, und die in der Lage sind, LOX oder eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon zu exprimieren und
– Analysieren der Expression von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, insbesondere mit dem Ziel herauszufinden, ob der potentielle Wirkstoff die Expression von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon stimuliert.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren das In-Kontakt-Bringen des potentiellen Wirkstoffs mit mindestens einem Typ von Zellen, welche in der Lage sind, das Protein Elastin zu exprimieren, wobei diese Zellen die gleichen sein können, wie solche, die LOX exprimieren, und umfasst das Analysieren der Expression des Proteins Elastin, insbesondere mit dem Ziel herauszufinden, ob der potentielle Wirkstoff die Reduktion oder die Inhibition der Synthese von Elastin fördert.

Vorteilhafterweise wird danach gesucht, ob die Wirksubstanz:

– die Expression mindestens eines Teils einer Nukleotidsequenz, welche für das Protein LOX kodiert, stimuliert und/oder
– die Expression einer Aminosäuresequenz, welche in der Struktur des Proteins LOX vorhanden ist, stimuliert; und
– die Expression mindestens eines Teils einer Nukleotidsequenz, welche für das Protein Elastin kodiert, inhibiert und/oder
– die Expression einer Aminosäuresequenz, welche in der Struktur des Proteins Elastin vorhanden ist, inhibiert.

Vorteilhafterweise wird das Analysieren der Expression von LOX und/oder des Proteins Elastin durch qualitative und/oder quantitative Analyse der Expression einer Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert und/oder, für Tropoelastin kodiert, durchgeführt.

Vorteilhafterweise erfolgt das Analysieren der Expression von LOX und/oder des Proteins Elastin unter Verwendung einer reversen Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), welche die Verwendung von Primern, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der komplementären DNA, welche für LOX (SEQ ID Nr. 2) kodiert, hybridisieren, um mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert, zu amplifizieren und/oder welche die Verwendung von Primern, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der komplementären DNA, welche für Tropoelastin (SEQ ID Nr. 5) kodiert, hybridisieren, um mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz, welche für Tropoelastin kodiert, zu ampliftzieren, umfasst.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren ebenfalls einen Schritt des Lokalisierens der Expression von LOX, welcher anhand eines Hautrekonstruktionsmodells oder anhand einer Biopsie durchgeführt wird:

– durch in situ Hybridisierung, insbesondere von mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert, insbesondere durch Verwenden von mindestens einer DNA-Sonde, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert, hybridisiert und/oder insbesondere von mindestens einem Teil einer Nukleotidsequenz, welche für Tropoelastin kodiert, zum Beispiel mit einer DNA-Sonde, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz, welche für Tropoelastin kodiert, hybridisiert und/oder
– durch Immun-Detektion, insbesondere von mindestens einem Teil der Aminosäuresequenz, welche für LOX kodiert, insbesondere durch Verwenden von mindestens einem Antikörper, welcher in der Lage ist, das gesamte oder einen Teil von LOX zu erkennen, und/oder von mindestens einem Antikörper, welcher in der Lage ist, das gesamte oder einen Teil von Elastin zu erkennen.

Vorteilhafterweise ermöglicht es der Schritt der Immun-Detektion oder der in situ Hybridisierung, den Nachweis (die Nachweisbarkeit) von LOX und von Elastin durchzuführen, insbesondere in epithelialen Geweben und/oder in den Bindegeweben, wobei das Gewebe aus mindestens einem Hautrekonstruktionsmodell oder aus Biopsien stammt.

Vorteilhaferweise umfasst das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz den Vergleich der Expression von LOX mit der Expression von LOX, das in einer Kontrolle exprimiert wird, welche die Wirksubstanz nicht umfasst und/oder den Vergleich der Expression von dem Protein Elastin, das in einer Kontrolle exprimiert wird, welche die Wirksubstanz nicht umfasst.

Vorteilhafterweise umfassen die Zellen Fibroblasten, die insbesondere aus normaler humaner Haut stammen, wie zum Beispiel aus junger Haut (Vorhaut) („prépuce", „foreskin") oder aus der Haut eines adulten Probanden (Subjekts).

Vorteilhafterweise umfassen die Zellen epitheliale Zellen, wie Keratinocyten, die insbesondere aus normaler humaner Haut stammen, wie zum Beispiel aus junger Haut (Vorhaut) oder aus der Haut eines adulten Probanden.

Vorteilhafterweise stammen die lebendigen Zellen aus mindestens einer Haut mit einer charakteristischen Lokalisation, zum Beispiel dem Gesicht, dem Abdomen oder der Brust, und die dadurch gekennzeichnet werden kann, „Foto-gealtert" zu sein oder der Sonnenstrahlung „punktuell ausgesetzt" zu sein oder nicht.

Vorteilhafterweise erfolgt das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells, bevorzugt mindestens eines Dermis-Modells, welches Fibroblasten umfasst, oder eines Biopsie-basierten Modells.

Vorteilhafterweise erfolgt das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells, bevorzugt mindestens eines Epidermis-Modells, welches Keratinocyten umfasst.

Das verwendete Hautmodell ist vorteilhafterweise das Mimeskin^® Hautrekonstruktionsmodell, kann jedoch ebenfalls ein Modell aus Bindegewebsmatrix, aus Epidermis oder aus Epithel oder aus rekonstruierter Haut oder Schleimhaut sein:

1) Das dreidimensionale Kultivierungsmodell aus Bindegewebsmatrix (Dermis oder Chorion) umfasst einen Träger, der mit Stromazellen ausgelegt wird, um rekonstruierte Dermis oder ein rekonstruiertes Chorion zu bilden. Dieser Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer semipermeablen synthetischen Membran, insbesondere einer semipermeablen Nitrocellulose-Membran, einer semipermeablen Nylon-Membran, einer Teflon-Membran oder einem Teflon-Schwamm, einer semipermeablen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen oder aus Polyethylenterephthalat (PET), einer semipermeablen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester-(HATF)-Membran, einer semipermeablen Biopore-CM-Membran, einer semipermeablen Polyester-Membran, einer Membran oder einem Film aus Polyglycolsäure. In dieser Gruppe befinden sich beispielsweise die dermalen Modelle Skin^{2 TM} Modell ZK1100 und Dermagraft^® und Transcyte^® (Advanced Tissue Sciences);

– einem Zellkultur-behandelten Plastik (Kunststoff) (formation d'un feuillet dermique: Michel M. et al. in In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35: 318-326);

– einem Gel oder einer Membran, das auf Hyaluronsäure (Hyalograft^® 3D – Fidia Advanced Biopolymers) und/oder auf Kollagen und/oder auf Fibronektin und/oder auf Fibrin basiert; in dieser Gruppe befindet sich beispielsweise das dermale Modell Vitrix^® (Organogenesis);

– einer porösen Matrix, welche beschichtet oder nicht beschichtet ist, hergestellt aus Kollagen, die einen oder mehrere Glykosaminoglykan(e) und/oder eventuell Chitosan enthalten kann (EP 0 296 078 A1 von CNRS, WO 01/911821 und WO 01/92322 von Coletica).
2) Das dreidimensionale Kultivierungsmodell aus Epidermis oder Epithel umfasst einen Träger, welcher vorher mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, ausgelegt wird oder nicht, und dann mit epithelialen Zellen und insbesondere Keratinocyten ausgelegt wird, um rekonstruierte Epithelien oder rekonstruierte Epidermis zu erzielen. Dieser Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer semipermeablen synthetischen Membran, insbesondere einer semipermeablen Nitrocellulose-Membran, einer semipermeablen Nylon-Membran, einer Teflon-Membran oder einem Teflon-Schwamm, einer semipermeablen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen oder aus Polyethylenterephthalat (PET), einer semipermeablen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester(HATF)-Membran, einer semipermeablen Biopore-CM-Membran, einer semipermeablen Polyester-Membran; in dieser Gruppe befinden sich sowohl die rekonstrutierten Modelle Epiderm und Epithelia (Skinethic^®) als auch die Modelle Epi-Derm^®, EpiAirway^®, EpiOccular^® (Mattek Corporation);

– einem Film oder einer Membran, die auf Hyaluronsäure und/oder auf Kollagen und/oder auf Fibronektin und/oder auf Fibrin basiert. In dieser Gruppe können insbesondere die Modelle: Episkin^® (L'Oreal) und Laserskin^® (Fidia Advanced Biopolymers) genannt werden.
3) Das dreidimensionale Kultivierungsmodell aus rekonstruierter Haut oder Schleimhaut umfasst einen Matrixträger (dermal oder aus Chorion), welcher mit epithelialen Zellen ausgelegt wird, um eine rekonstruierte Haut zu erhalten. Dieser Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer semipermeablen synthetischen Membran, insbesondere einer semipermeablen Nitrocellulose-Membran, einer semipermeablen Nylon-Membran, einer Teflon-Membran oder einem Teflon-Schwamm, einer semipermeablen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen oder aus Polyethylenterephthalat (PET), einer semipermeablen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester(HATF)-Membran, einer semipermeablen Biopore-CM-Membran, einer semipermeablen Polyester-Membran; wobei der inerte Träger Stromazellen, insbesondere Fibroblasten enthält,

– einem Gel, basierend auf Kollagen und/oder Hyaluronsäure und/oder Fibronektin und/oder auf Fibrin, das Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, umfasst,

– einer porösen Matrix, welche beschichtet oder nicht beschichtet ist, hergestellt aus Kollagen, die einen oder mehrere Glykosaminoglykan(e) und/oder eventuell Chitosan enthalten kann, wobei in diese porösen Matrizen Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, eingebaut sind,

– einer humann oder tierischen de-epidermisierten (entepidermisierten) Dermis oder einer toten Dermis.

In dieser Gruppe können insbesondere sowohl die Modelle Apligraf^® (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems^® Biotechnologie Vertrieb) als auch Skin² ^TM (ZK1200-1300-2000 – Advanced Tissue Science) genannt werden.

Weiterhin existieren Modelle, die für die Gewebetherapie gedacht sind, und die ebenfalls Gegenstand solcher Untersuchungen sein können. Die Modelle Epidex^TM (Modex Thérapeutiques), Epibase^® (Laboratoire Genevrier), Epicell^TM (Genzyme), Autoderm^TM und Transderm^TM (Innogenetics) können hier genannt werden.

Vorteilhafterweise wird die Wirksubstanz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pflanzen- oder synthetischen Polyphenolen, einem Extrakt aus Galega oder Kardamom, einer gesättigten Fettsäure, einem Polyol, wie Xylitol, Gum Adragant, einem Extrakt aus Getreide, wie Gerste oder Hafer.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von LOX mit der SEQ ID Nr. 1 oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, oder einer ersten Substanz, welche die Aktivität und/oder die Bildung von LOX fördert, kombiniert mit einer zweiten Substanz, welche die Reduktion oder die Inhibierung der Synthese von Elastin fördert, zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche insbesondere dazu gedacht ist, die Elastogenese in Fällen von anormaler oder pathologischer Elastogenese zu regulieren. Diese Zusammensetzung ist vorteilhafterweise dazu gedacht, die enzymatische Aktivität oder die Expression der Isoform der Lysyloxidase LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon zu stimulieren und die Synthese des Proteins Elastin zu inhibieren.

Vorteilhafterweise stehen die anormale oder pathologische Elastogenese insbesondere im Zusammenhang mit Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen, von dystrophen Narben, von Ekzemen und/oder einer Reaktion des Stromas auf Krebsarten, die mit einem desorganisierten und/oder nicht-funktionellen elastischen Gewebe assoziiert sind.

Vorteilhafterweise sind die erste Substanz und die zweite Substanz identisch.

Vorteilhafterweise fördert die zweite Substanz die Reduktion oder die Inhibierung der Synthese von Tropoelastin mit der SEQ ID Nr. 3 oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, dem Vorläufer-Protein von Elastin.

Vorteilhafterweise gilt für die zweite Substanz, dass sie:

i) eine Region umfasst, welche an mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz des Promotors des humanen Elastingens (Pr) (SEQ ID Nr. 4) oder an eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon bindet, oder
ii) die Expression eines Proteins moduliert, welches an mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz des Promotors des humanen Elastingens (Pr) (SEQ ID Nr. 4) oder eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon bindet, um die Synthese von Tropoelastin zu reduzieren oder zu inhibieren.

Vorteilhafterweise wird die Wirksubstanz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pflanzen- oder synthetischen Polyphenolen, einem Extrakt aus Galega oder aus Kardamom, einer gesättigten Fettsäure, einem Polyol, wie Xylitol, Gum Adragant, einem Extrakt aus Getreiden, wie Gerste oder Hafer.

Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine kosmetische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Wirksubstanz, wie oben definiert, umfasst, optional in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine nutrazeutische Zusammensetzung (Nahrungsmittelzusammensetzung) („neutraceutical composition"), die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Wirksubstanz, wie oben definiert, umfasst, optional in einer Mischung mit einem Träger, der für Nahrungsmittel akzeptabel ist.

Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Wirksubstanz, wie oben definiert, umfasst, optional in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Der Wirkstoff oder die Kombination aus Wirkstoffen oder die Kombination aus dem Enzym LOX oder einer Derivatform mit einem Wirkstoff, welcher die Synthese des Proteins Elastin inhibiert, liegen vorteilhafterweise in einer Mischung mit einem Träger vor, der für den humanen Körper akzeptabel ist. Zum Beispiel enthält der Träger mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Konservierungsmittel, Weichmachern, Emulgatoren, oberflächenaktiven Stoffen, Feuchthaltemitteln, Verdickungsmitteln, Konditionierern, „les agents matifiant" („matifying agents"), Stabilisatoren, Antioxidantien, Strukturbildungsstoffen („les agents de texture"; „texture agents"), Aufhellern, Filmbildenden Stoffen, Lösungsvermittlern, Pigmenten, Farbstoffen, Duftstoffen und Sonnenfiltern. Diese Träger werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren und ihren Derivaten, Polyglycerolen, Estern, Polymeren und Cellulosederivaten, Lanolinderivaten, Phospolipiden, Lactoferrinen, Lactoperoxidasen, Sucrose-basierten Stabilisatoren, Vitamin E und seinen Derivaten, natürlichen und synthetischen Wachsen, Pflanzenölen, Triglyceriden, unverseifbaren Stoffen („insaponifiables"), Phytosterolen, Pflanzenestern, Silikonen und ihren Derivaten, Proteinhydrolysaten, Jojobaöl und seinen Derivaten, lipo-/wasserlöslichen Estern, Betainen, Aminoxiden, Pflanzenextrakten, Sucroseestern, Titandioxiden, Glycinen und Parabenen, und stärker bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus Butylenglycol, Steareth-2, Steareth-21, Glycol-15-Stearylether, Cetearylalkohol, Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Butylenglycol, natürlichen Tocopherolen, Glycerin, Natriumdihydroxycetyl, Isopropylhydroxycetylether, Glycolstearat, Triisononaoin, Octylcocoat, Polyacrylamid, Isoparaffin, Laureth-7, einem Carbomer, Propylenglycol, Glycerin, Bisabolol, Dimethicon, Natriumhydroxid, einem Duftstoff, PEG 30-Dipolyhydroxystearat, Caprin-/Capryltriglyceriden, Cetearyloctanoat, Dibutyladipat, Traubenkeimöl, Jojobaöl, Magnesiumsulfat, EDTA, Cyclomethicon, Xanthangummi, Zitronensäure, Natriumlaurylsulfat, Mineralwachsen und -ölen, Isostearylisostearat, Propylenglycoldipelargonat, Propylenglycolisostearat, PEG 8, Bienenwachs, hydrogenierten Palmenherzölglyceriden, hydrogenierten Palmenölglyceriden, Lanolinöl, Sesamöl, Cetyllactat, Lanolinalkohol, Castoröl, Titandioxid, Färbemitteln und Pigmenten, Lactose, Sucrose, Polyethylen mit niederer Dichte und einer isotonischen Kochsalzlösung.

Vorteilhafterweise werden die oben bezeichneten Zusammensetzungen in einer Form formuliert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Lösung, welche wässrig oder ölig ist, einer wässrigen Creme oder einem wässrigen Gel oder einem öligen Gel, insbesondere in einem Tiegel oder in einer Tube, insbesondere einem Duschgel, einem Shampoo; einer Milch; einer Emulsion, einer Mikroemulsion oder einer Nanoemulsion, insbesondere einer Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl- oder multiplen oder Silikon-enthaltenden Mikroemulsion oder Nanoemulsion; einer Lotion, insbesondere in einer Glasflasche, einer Plastikflasche oder in einer Dosierflasche oder in einer Sprühflasche; einer Ampulle; einer flüssigen Seife; einem dermatologischen Strang ("pain dermatologique"; dermatological bar"); einer Salbe, einem Schaum; einem wasserfreien Produkt, bevorzugt einem flüssigen, pastösen oder festen wasserfreien Produkt, zum Bespiel in Form eines Stiftes, insbesondere in Form eines Lippenstiftes.

Vorteilhafterweise können die Zusammensetzungen, die ausreichend flüssig sind, insbesondere über den parenteralen, okularen, pulmonaren, oralen oder nasalen Weg verabreicht werden.

Vorteilhafterweise können die pastösen oder trockenen Zusammensetzungen (Pasten, Puder, Tabletten, Kapseln, Granulate, Zäpfchen ...) insbesondere über den oralen, sublingualen, nasalen oder rektalen Weg in den Körper eingeführt werden.

Vorteilhafterweise, wenn die Formulierung der Zusammensetzung es erlaubt, ist der Verabreichungsweg kutan oder transmukös, insbesondere durch die Applikation der Zusammensetzung auf die Haut oder eine Schleimhaut.

Vorteilhafterweise wird der Fachmann aus den verschiedenen Formulierungen und Verabreichungswegen eine/einen auswählen, die/der adäquat für die jeweils verfolgte Wirkung ist.

Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kosmetischen Pflege, welches das Anwenden einer effektiven Menge von mindestens einem Wirkstoff oder von einer der Kombinationen, wie oben definiert, oder von einer Zusammensetzung, wie oben definiert, umfasst, insbesondere in Fällen von Sonnen-Elastosis, Dehnungsmalen und/oder dystrophen Narben.

Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon und optional des Proteins Elastin in Geweben, mit dem Ziel, den Nachweis (Nachweisbarkeit) der Neo-Kollagenogenese („neo-kollagenogenesis") und/oder Neo-Elastogenese, insbesondere in epithelialen Geweben und/oder in den Bindegeweben durchzuführen, wobei die Gewebe aus mindestens einem Hautrekonstruktionsmodell oder aus einer Biopsie stammen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Schritt der Immun-Detektion des Proteins LOX und optional des Proteins Elastin, zum Beispiel durch spezifische Antikörper, umfasst.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression der Isoform der Lysyloxidase LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, welches einen Schritt der Immun-Detektion oder der in situ Hybridisierung umfasst, besonders mit dem Ziel, den Nachweis (die Nachweisbarkeit) der Neo-Elastogenese, insbesondere in den epithelialen Geweben und/oder den Bindegeweben durchzuführen.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Behandlung eines Mangels der enzymatischen Aktivität der Isoform des Proteins Lysyloxidase LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, welche die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge einer Zusammensetzung an einen Probanden umfasst, welcher einen Wirkstoff oder eine der Kombinationen, wie oben definiert, umfasst, wodurch die enzymatische Aktivität des Proteins Lysyloxidase LOX oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon erhöht wird und die Synthese des Proteins Elastin inhibiert wird.

Vorteilhafterweise wird dieses Behandlungsverfahren zum Regulieren der Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese verwendet, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen, von dystrophen Narben, von Ekzemen und/oder von einer Reaktion des Stromas auf Krebsarten, die mit einer desorganisierten und/oder nicht-funktionellen elastischen Gewebe assoziiert sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die Erfinder haben unerwarteterweise gezeigt, dass die Isoform LOX der Lysyloxidase lokal nicht ausreichend stimuliert wird, um die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben, zu regulieren. Die Erfinder haben unerwarteterweise gezeigt, dass es in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nichtfunktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben, insbesondere zum Schutz der Haut vor Alterung, vor UV-Strahlen oder in Fällen von Ekzemen und anderen vergleichbaren Dysfunktionen, erforderlich ist, die Expression von LOX re-induzieren zu können, indem die Synthese von Elastin reduziert wird, welches eine Tendenz besitzt, überproduziert zu werden und auf nichtfunktionelle Weise in den oben genannten Fällen aufgelagert zu werden.

Die Erfinder haben in der Tat gezeigt, dass diese Isoform der Familie der Lysyloxidasen (LO) in einem Hautrekonstruktionsmodell, welches elastische Fasern herstellt, mit der Elastogenese assoziiert ist. Bei der Suche, ob diese Isoform in der Haut verschiedener Altersstufen und bei Hautveränderungen vorhanden oder abwesend ist, haben die Erfinder die gleichzeitige Gegenwart oder Abwesenheit dieser Isoform und der Elastogenese bemerkt; hierdurch ist es möglich anzugeben, dass die Reaktivierung der Expression dieser Isoform von LO (LOX) und ebenfalls die Inhibierung der Synthese von Elastin das Regulieren der Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie in Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben, ermöglicht.

Die Erfinder haben daher ein Verfahren entwickelt, welches das Visualisieren erhöhter Expressionen dieser Isoform von LOX ermöglicht, und haben dann nach Wirkstoffen gesucht, insbesondere unter Pflanzenextrakten oder chemischen Molekülen, die insbesondere die Expression der mRNAs, welche für LOX kodieren, stimulieren, und nach Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Expression des Proteins Elastin gleichzeitig oder auch nicht gleichzeitig zu inhibieren. Die ausgewählten Wirkstoffe oder eine Kombination des Enzyms LOX mit einem Wirkstoff, welcher die Expression des Proteins Elastin inhibiert, wurden/wurde dann für Anwendungen zum Reduzieren pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese in kosmetische und dermo-pharmazeutische Formulierungen eingebaut.

Die Erfinder haben spezifische Antikörper von reifen LOX und LOXL-Formen entwickelt (siehe Beispiele 1 und 2) und haben auf diesem Weg gezeigt, dass die Abwesenheit der Isoform der Lysyloxidase LOX hauptverantwortlich für Probleme bei der Bildung von Kollagenfasern, insbesondere während einer pathologischen, desorganisierten und/oder nicht-funktionellen Elastogenese, ist.

Die Isoformen LOXL2, LOXL3 und LOXL4 werden nicht oder nur gering in der Dermis exprimiert und sind nicht an der Elastogenese beteiligt (siehe Beispiel 4). LOX ist das Enzym, welches für die Reifung von Kollagen (durch Quervernetzung) verantwortlich ist, was erklärt, dass dieses Enzym an der Verdichtung des Stromas beteiligt sein dürfte.

Im Rahmen mit der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOX implementiert. Dieses Lokalisierungsverfahren umfasst insbesondere die Immun-Detektion von LOX. Die Expression des Proteins Elastin kann mit diesem Verfahren ebenfalls nachgewiesen werden. Durch die Untersuchungen der Erfinder ist gezeigt worden, dass LOX mit den Mikrofibrillen und mit der Bildung von Kollagen assoziiert ist (5). Elastin wurde in den gleichen dichten Ablagerungen (dépots dense") und in den Mikrofibrillen detektiert. Diese Detektion wurde anhand von Hautrekonstruktionsmodellen, und insbesondere anhand von Hautrekonstruktionsmodellen, die 30 Tage nach dem Einbringen der Keratinocyten beobachtet wurden, durchgeführt. Die Assoziation von LOX mit den Mikrofibrillen und mit den Kollagenfasern wurde ebenfalls auf der Stufe junger Haut (Vorhaut) ("au niveau de la peau de prépuce") bestätigt, insbesondere durch Elektronenmikroskopie nach der Immun-Detektion. LOX wird in der Dermis der jungen Haut (Vorhaut) exprimiert, die jungen Patienten (einige Monate), die noch eine starke Synthese von Elastin aufweisen, entnommen wurde. LOX wird auf der Stufe der Dermis von Adulten immer exprimiert, besonders in der Dermis der Haut des Nackens, der Brust, des Abdomens oder des Gesichts. Eine starke Expression von LOX wurde ebenfalls in der Epidermis von humaner Haut beobachtet, jedoch mit einem späten Ausbleiben der Expression dieses Enzyms, wenn die humane Haut aus alten Probanden (91 Jahre) stammt (siehe Beispiel 6).

Im Fall von Narben wurde LOX in diesen Bereichen nicht detektiert, weder drei Monate nach der Bildung der Narbe noch fünf Jahre nach der Bildung der Narbe. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass Elastin, das nach drei Monaten exprimiert wird, fünf Jahre nach der Bildung der Narbe nicht mehr im Narbengewebe vorhanden ist.

Die Erfinder haben folglich die Rolle von LOX bei der Bildung von Kollagenfasern und Elastinfasern nachgewiesen, insbesondere durch das Verwenden von Hautrekonstruktionsmodellen und oder von Dermis aus der jungen Haut (Vorhaut) von jungen Patienten.

Die Erfinder haben ebenfalls das Fehlen der Expression von LOX in Narbengeweben demonstriert.

Die Gesamtheit der Untersuchungen der Erfinder hat es ermöglicht, ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffs zu entwickeln, der die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie Sonnen-Elastogenese, reguliert. Diese Regulierung erfolgt insbesondere durch die Quervernetzung von Kollagen und Elastin.

Im Rahmen mit der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein Verfahren der in situ Hybridisierung eingesetzt, wodurch das Lokalisieren und Nachweisen der Gegenwart der Expression von messenger RNAs, welche insbesondere für LOX kodieren, ermöglicht wird. Diese in situ Hybridisierung wird insbesondere mit doppelsträngigen DNA-Sonden, die mit Digoxigenin markiert werden, auf Abschnitten von 35 Tage alten Hautrekonstruktionsmodellen, die in Paraffin eingeschlossen sind, durchgeführt. Diese in situ Hybridisierung wurde ebenfalls durchgeführt, um die Expression der messenger RNAs von Tropoelastin und von Kollagen I&agr;1 nachzuweisen (siehe Beispiel 7).

Die Expression von mRNAs von LOX wird durch die gesamte Dermis hindurch beobachtet. In der Epidermis exprimieren die Zellen der Basalschichten LOX nicht oder nur gering, während die Zellen der dornigen („spinous") und granulären Schichten es stark exprimieren. Die Expression der mRNA von Kollagen I&agr;1 ist in der Dermis, jedoch nicht in der Epidermis, lokalisiert.

Es ist daher ein Ziel, die Erfindung auf den Nachweis der Stimulierung der mRNAs von LOX und eventuell der Inhibierung der mRNAs von Elastin in einem Hautrekonstruktionsmodell anzuwenden, zum Beispiel nach der Applikation eines Wirkstoffs, welcher eventuell die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funkioneller Elastogenese, wie Fibrose oder Sonnen-Elastose, reguliert.

Im Rahmen mit der vorliegenden Erfindung wurde das hLOX-Gen durch die Zugabe von Keratinocyten in einem Hautrekonstruktionsmodell, und insbesondere in dem Hautrekonstruktionsmodell Mimeskin^® (Coletica, Lyons, Frankreich) aktiviert. Die Induktion der Synthese von mRNAs von LOX wird gleichzeitig mit der von mRNAs von Kollagen I alpha1 (COL1 alpha1) beobachtet, und tritt insbesondere ungefähr 6 Tage nach der Zugabe von Keratinocyten auf das Dermis-Äquivalent auf.

Die Expression der Gene von Interesse, nämlich denen, die für LOX kodieren, für Elastin kodieren, für LOXL kodieren, sowie dem, dass für Actin kodiert, wurde mittels Echtzeit-RT-PCR analysiert. Diese Technik ermöglicht ein präzises Quantifizieren der Expression eines Gens durch Verglieche mit jener von Actin bezogen wird, welche als konstant betrachtet wird. Demzufolge kann die Regulation des Expressionslevels dieser Gene quantifiziert werden, insbesondere die Expression des für Gens, das für LOX kodiert, und des Gens, das für Elastin kodiert.

Die Synthese von LOX mRNA nimmt durchschnittlich um 40% in den Fibroblasten ab, die aus alten Spendern stammen, bezogen auf jene Fibroblasten, die aus junger Haut (Vorhaut) stammen (siehe Beispiel 8). Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, welches ein Quantifizieren der Expression von LOX, insbesondere in den Fibroblasten, ermöglicht. Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, diese verschiedenen Techniken einzusetzen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die das Regulieren der Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie Fibrose oder Sonnen-Elastosis, ermöglichen.

Im Allgemeinen setzen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Suche nach der Expression von dem Protein LOX und von Elastin, und insbesondere nach der Expression von messenger RNAs, die für LOX kodieren, und solchen, die für Elastin kodieren, ein (siehe Beispiel 9).

Die Erfindung betrifft ebenfalls Wirkstoffe, die die Expression von LOX stimulieren, und die die Expression von dem Protein Elastin inhibieren, um die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie Fibrose oder Sonnen-Elastosis zu regulieren (siehe Beispiele 9 bis 11).

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung dieser Wirkstoffe zur Herstellung von kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen (siehe Beispiele 12 bis 18).

Die Unterschiede in der Expression von LOX und von Elastin können auf der Ebene des Gens, der messenger RNA oder dem Protein direkt beobachtet werden. Diese Unterschiede ermöglichen es, die Elastogenese in Fällen von pathologischer, desorganisierter und/oder nicht-funktioneller Elastogenese, wie Fibrose oder Sonnen-Elastosis, insbesondere durch die Quervernetzung des Kollagens durch das Enzym LOX, zu regulieren.

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden vom Fachmann beim Lesen der erklärenden Beschreibung, welche auf die folgenden Beispiele verweist, offensichtlich erkannt.

Die Beispiele stellen einen integralen Teil der vorliegenden Erfindung dar und jedes beliebige Merkmal, welches bezogen auf den Stand der Technik aus der Beschreibung, einschließlich der Beispiele, neu erscheint, ist in seiner Gesamtheit einbezogen, und stellt einen integralen Teil in seiner Funktion und in seiner Allgemeinheit dar.

Daher ist jedes Beispiel von allgemeiner Bedeutung.

Weiterhin sind in den Beispielen alle Prozentsätze als Gewichts-% angegeben, solange nichts anderes angegeben ist, die Temperatur wird in Grad Celsius ausgedrückt, solange nichts anderes angegeben ist, und der Druck ist gewöhnlicher Luftdruck, solange nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1: Zubereitung spezifischer Antikörper der reifen Formen von LOX und LOXL

Die Erfindung hat als erste die Entwicklung neuer spezifischer Antikörper der reifen Formen von LOX und LOXL abgedeckt. Die Antikörper wurden gegen die reifen Regionen von LOX und LOXL entwickelt. Die antigenen Regionen wurden so ausgewählt, dass sie das Minimum an Ähnlichkeit mit den entsprechenden Regionen auf anderen Isoformen der Lysyloxidasen (LOs) darstellen. Die Antikörper, die gegen die Regionen des Peptids LOX^V228-S280 erhalten wurden, wurden anti-LOXmat genannt und vergleichbar wurden die Antikörper, die gegen die Region des Peptids LOX^R231-G368 erhalten wurden, anti-LOXLpro genannt.

1: Beschreibung der Sequenzen von den LOs, die bestimmt wurden, um spezifische Antikörper herzustellen: Diese Figur stellt die Schritte dar, die zu der Selektion der antigenen Regionen zum Entwickeln der anti-LOX- und anti-LOXL-Antikörper geführt haben.

1(A): Schematische Darstellung von hLOX (humanes LOX-Protein) und hLOXL (humanes LOXL-Protein).

Die Sequenzen von hLOX und hLOXL werden durch offene Boxen angezeigt, gepunktet in den C-terminalen Regionen, um die Regionen der höchsten Ähnlichkeit hervorzuheben. Die Position der Spaltung der Prä-Region und der Spaltungsstellen durch die Prokollagen-C-Proteinase (PCP), jeweils an den Resten A22 und D169 von hLOX, wurde(n) angezeigt. Die Position der Spaltung der Prä-Region von LOXL vor dem Rest Q26 der N-terminalen Reifungsstelle des 56 kDa-Vorläufers (vor D135) und die Position der Spaltungsstellen des LOXL-Vorläufers von 56 kDa (vor den Resten D338) durch PCP werden angezeigt. Die entsprechenden LOXL-Proteine Q²⁶-S⁵⁷⁴, D¹³⁵-S⁵⁷⁴ und D³³⁸-S⁵⁷⁴ würden eine abgeleitete molekulare Masse von jeweils ungefähr 63 kDa, 54,6 kDa und 26,7 kDa darstellen. Die Lokalisation der rekombinanten Peptide, die verwendet wurden, um die anti-LOX-Antikörper zu erhalten, wurde angezeigt: das G128-L212-Peptid für den anti-LOXpro, das V228-S280-Peptid für den anti-LOXmat und das D305-N373-Peptid für den anti-LOXcat. Die Lokalisation der rekombinanten Peptide, die verwendet wurden, um die anti-LOXL-Antikörper zu entwickeln, wurde angezeigt: das R231-G368-Peptid für den anti-LOXLpro und S355-D415 für den anti-LOXLmat.

1(B): Der Prozentanteil der Ähnlichkeit zwischen den antigenen Regionen von LOX und LOXL mit ihren Äquivalenten auf den LO-Isoformen wurde in dieser Tabelle angezeigt.

In der Tabelle von 1(B) stellt hLOXL das humane LOXL-Protein dar, bLOXL stellt das LOXL-Protein aus dem Rind dar, mLOXL stellt das LOXL Protein aus der Maus dar, hLOX stellt das humane LOX-Protein dar, bLOX stellt das LOX-Protein aus dem Rind dar, hLOXL2 stellt das humane LOXL2-Protein dar, hLOXL3 stellt das humane LOXL3-Protein dar, hLOXL4 stellt das humane LOXL4-Protein dar.

Die Längsspalte (aa) enthält eine Angabe zur Anzahl der Aminosäuren, die in den entsprechenden Regionen enthalten sind.

Um die Antikörper zu erhalten, wurden die chimeren Gene konstruiert, indem die definierten Sequenzen von hLOXL oder hLOX phasengleich mit dem Gen der Glutathion-S-Transferase (GST) in die BamHI-XhoI-Stellen des Expressionsplasmids pGEX-4T-3 (Amersham Biosciences) eingeführt wurden.

Das Fusionsgen GST-LOXL^S355-D415 wurde durch Einführen der cDNA-Sequenz von hLOXL (hLOXL cDNA), die mittels PCR mit dem Sense-Primer 5'-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3' (SEQ ID Nr. 16) bzw. und dem Antisense-Primer 5'-AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC-3' (SEQ ID Nr. 17) hergestellt wurde, konstruiert. Das Fusionsgen GST-LOX^G128-L212 wurde durch Einführen der hLOX cDNA, ampliftziert mit dem Sense-Primer 5'-TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC-3' (SEQ ID Nr. 18) bzw. dem Antisense-Primer 5'-GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC-3' (SEQ ID Nr. 19), konstruiert. Das Fusionsgen GST-LOX^V228-S279 wurde durch Einführen der hLOX-Sequenz, amplifiziert mit dem Sense-Primer 5'-TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC-3' (SEQ ID Nr. 20) bzw. dem Antisense-Primer 5'-TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG-3' (SEQ ID Nr. 21), konstruiert. Das Fusionsgen GST-LOX^D306-N373 wurde durch Elnführen der hLOX cDNA, amplifiziert mit dem Sense-Primer 5'-CACTATGGATCCCTTGATGCCAACACCC-3' (SEQ ID Nr. 22) bzw. dem Antisense-Primer 5'-CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG-3' (SEQ ID Nr. 23), konstruiert. Für alle diese Amplifikationen mittels PCR wurde die Taq-Polymerase High Fidelity (Roche Diagnostic, Meyman, Frankreich) verwendet.

Die Fusionsproteine GST-LOX und GST-LOXL ebenso wie die polyklonalen Antikörper aus Kaninchen, wurden, wie oben für die Fusionsproteine, die aus der Expression der Fusionsgene GST-LOXL^S355-D415 und GAST LOX^G128-L212 stammen, beschrieben, erhalten und aufgereinigt (Borel et al., J. Biol. Chem, 276 : 48944-49, 2001; Decitre et al, Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). Für die Adsorptionsexperimente wurden die Antikörper für 3 Stunden bei 20°C mit den Fusionsproteinen inkubiert, wobei sie selbst vor der Immun-Detektion auf einer Nitrocellulose-Membran, wie der Hybond-ECL-Membran (Amersham Bioscienes), adsorbiert wurden.

Diese Teile der Arbeit haben es zum ersten Mal ermöglicht, die reifen Formen von LOX und LOXL, durch die immunchemische und biochemische Charakterisierung der reifen Proteine darzustellen (siehe Beispiel 2, 2). Die entwickelten Antikörper unterscheiden sich von den im Stand der Technik für LOXL verwendeten, die es nicht ermöglichen, die reife Form von LOXL zu erkennen (Decitre et al., Lab Invest 78: 143-151, 1998). Die Erfindung bestand in dem Verwenden der Antikörper anti-LOXLmat und anti-LOXmat, wodurch es möglich war, ein Protein von 31 kDa nachzuweisen, welches von dem anti-LOXLmat, jedoch nicht von dem anti-LOXmat, erkannt wurde, und welches der reifen Form von LOXL entspricht. Dieser Teil der Erfindung stellt einen echten Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar, insbesondere bezogen auf das Patent von Csiszar et al., welches alle Proteine beschreibt, die von Genen der LO-Familie stammen, ohne ihre Merkmale zu definieren (WO 01/83702 A2 Patent: Novel members of the lysyl oxidase family of amine oxidases related applications).

Beispiel 2: Immun-Detektion von LOX und LOXL aus Muskelzellen durch die neuen Antikörper anti-LOX und anti-LOXL

2 stellt Fotografien der Elektrophoresen dar, welche wie unten angezeigt durchgeführt wurden. Diese Elektrophoresen zeigen die Charakterisierung der reifen Proteine von LOX und LOXL aus glatten Muskelzellen ("smooth muscle cells, SMC") durch die in Beispiel 1 definierten Antikörper anti-LOX und anti-LOXL.

Die Proteine des Zellstamms (L) und des Zellkulturmediums (M) einer Zelllinie aus glattem Muskel der Ratte (entwickelt von Jean-Marie Daniel Lamaziere, Bordeaux) wurden extrahiert, mittels Western Blotting und unter Verwenden der Antikörper anit-LOXLmat, anti-LOXmat, anti-LOXLpro und anti-LOXpro detektiert. Die Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphere von 5% CO₂ in DMEM-Medium (Sigma), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 &mgr;g/ml Gentamycin, kultiviert.

Die Proteine des Zellstamms, welche zweimal mit PBS-Puffer gewaschen wurden, wurden 2 Stunden bei 4°C unter leichtem Rühren in Lysis-Puffer (16 mM Phosphat-Puffer pH 8, 0,5% NP40, Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche Diagnostics) und Harnstoff 6 M) extrahiert. Die Lysate wurden mit zwei Volumina 16 mM Phospat-Puffer pH 8 mit Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche Diagnostics, Meylan, Frankreich) verdünnt und für 20 Minuten bei 15.000 g zentrifugiert. Die löslichen Proteine wurden vor der Elektrophorese durch Zugabe von 10% Trichoressigsäure (TCA) präzipitiert. Die Proteine der Kulturmedien würden aus dem Medium von Zellen, die für 48 Stunden ohne Serum kultiviert wurden, gewonnen und durch die Zugabe von 10% TCA oder 50% gesättigtem Ammoniumsulfat präzipitiert.

Für die Immun-Detektion wurden die Proteine mittels 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese separiert. Die Proteine wurden auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) – Membran (Immobilon P^SQ, Millipore) transferiert und wie oben beschrieben immundetektiert (Borel et al., J. Biol. Chem, 276: 48944-49, 2001).

Die entwickelten Antikörper ermöglichen demzufolge die reifen und unreifen Formen von LOX und LOXL in biologischen Geweben zu charakterisieren und zu lokalisieren.

Beispiel 3: Darstellung der Rolle von LOX in der Elastogenese

Die Erfinder haben durch Immun-Histochemie gezeigt, dass die LOX- und LOXL-Proteine mit der Bildung des Bindegewebes in der Dermis von Hautrekonstruktionsmodellen in Verbindung gebracht werden können, (3). Diese Darstellung wurde durch die Verwendung von Antikörper-Paaren von anti-LOX- und anti-LOXL, die gegen die pro-enzymatischen Regionen und die reifen Regionen der zwei Enzyme (LOX und LOXL) gerichtet waren, ohne jede Mehrdeutigkeit erzielt.

3 stellt die immun-histologische Detektion von LOXL und LOX in rekonstruierter Haut (reconstructed skin, RS) und normaler humaner Haut dar:

– Immun-Detektion von LOXL (A, C, E, G) aus rekonstruierter Haut an den Tagen 16 (A), 35 (C) und 45 (E) unter Verwenden von anti-LOXL^R231-G368 (A, C, E) oder von anti-LOXL^R231-G368 die vor der Immun-Detektion (G) mit dem entsprechenden Peptid GTS-LOXL^R231-G368 adsorbiert wurden.
– Immun-Detektion von LOX (B, D, F, H) aus rekonstruierter Haut an den Tagen 16 (B), 35 (D) und 45 (F) durch Verwenden von anti-LOX^V228-S279 (B, D, F) oder anti-LOX^V228-S279, welche vor der Immun-Detektion (H) mit dem entsprechenden Peptid GTS-LOX^V228-S279 adsorbiert wurden.
– Immun-Detektion von LOXL (I) und LOX (J) aus humaner junger Haut (Vorhaut) durch Verwenden von anti-LOXL^R231-G368 (I) und anti-LOX^V228-S279 (J). Die Lage der dermal-epidermalen Verbindungsstelle wird durch einen offenen Pfeil angezeigt, die Lage des dermalen Substrats wird mit einem Pfeil und die Lokalisation der Keratinocyten an Tag 16 wird durch einen Pfeilkopf angezeigt.

Die rekonstruierte Haut (Mimeskin^®, Coletica, Lyons, Frankreich) wurde in Bouin's Fixiermittel (LOX, LOXL, Elastin) oder in einer 10%-Formol-Lösung (für Elastin) präpariert und dann in Paraffin eingeschlossen. 6 &mgr;m dicke Abschnitte wurden von dem Parafin befreit und in Glycin-HCl (100 mmol/l) gebleicht. Die Antikörper anti-LOX- und anti-LOXL wurden oben beschrieben.

Die Antikörper wurden in der folgenden Verdünnung verwendet: 1:500 (anti-LOX^R231-G368) 1:100 (anti-LOX^V228-S279, anti-LOXL^S355-D416). Die Immunkomplexe wurden mit einem anti IgG aus Kaninchen (Ziege), konjugiert mit Peroxidase (DAKO, Trappes, Frankreich), unter Verwenden von Diaminobenzidin als Substrat (DAKO) detektiert.

LOX und LOXL sind demnach Kandidaten, die an der Elastogenese in einem Hautrekonstruktionsmodell, wie insbesondere Mimeskin^®, beteiligt sind.

Beispiel 4: Darstellung der Rolle von LOXL2, LOXL3 und LOXL4 in der Elastogenese

Die Erfindung hat ebenfalls zu der Entwicklung von zwei neuen LOXL2-Antikörpern geführt, wobei einer dieser Antikörper theoretisch ebenfalls LOXL3 und LOXL4 erkennt. Hierdurch konnte festgestellt werden, ob diese Enzyme zusammen mit Elastin in der Dermis eines Hautrekonstruktionsmodells exprimiert werden. Die Analyse mittels Immunhistochemie unter Verwenden der zwei anti-LOXL2-Antikörper zeigt tatsächlich, dass dieses Antigen LOXL2, ebenso wie die zwei Antigen-verknüpften Proteine LOXL3 und LOXL4 nicht oder nur gering in der Dermis exprimiert werden, und dass sie daher nicht an der Elastogenese beteiligt sind.

In 4: wird die Immun-Detektion auf Abschnitten aus rekonstruierter Haut (16, 35 und 45 Tage) und aus humaner junger Haut (Vorhaut) mit dem Antikörper antiLOXL2^517-581 (linke Spalte) und dem Antikörper anti-LOXL2^664-720 (der theoretisch LOXL2, LOXL3 und LOXL4 erkennt) (rechte Spalte) dargestellt. Die anti-LOXL2-Antikörper wurden wie oben beschrieben gegen die Fusionspeptide GST-LOXL2 erhalten (Decitre et al, Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). Das Fusionsgen GST-LOXL2^517-581 wurde durch Einführen der Sequenz 1543 bis 1747 des humanen LOXL2-Gens (hLOXL2) in das Plasmid konstruiert, wie oben beschrieben.

Dieses Segment wurde mittels PCR mit dem Sense-Primer 5'-GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC-3' und dem Antisense-Primer 5'-GGCTGAGTCGACGAGGCAGTTCTCC-3' erzeugt.

Das Fusionsgen GST-LOXL2^664-720 wurde durch Einführen der entsprechenden hLOXL2-Sequenz mit dem Sense-Primer 5'-CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG-3' und dem Antisense-Primer 5'-TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3' erzeugt.

Die Fusionsproteine und die Anti-Kaninchen-Antikörper, die gegen diese Proteine erzeugten wurden, wurden wie oben beschrieben hergestellt. Der Antikörper gegen das Peptid 517-580 wurde anti-LOXL2 genannt, da diese Region spezifisch für LOXL2 ist.

Der Antikörper gegen das Peptid 664-734 wurde anti-LOXL-R (für "relativ zu") genannt, da diese Region von LOXL2 eine starke Ähnlichkeit mit LOXL3 und LOXL4 besitzt (ungefähr 74,6% bzw. 60,5%).

Die rekonstruierten Häute (Mimeskin^®, Coletica, Lyons, Frankreich) vom Tag 16 (RS-D16), Tag 35 (RS-D35) und Tag 45 (RS-D45) und die humane junge Haut (Vorhaut) wurden, wie oben beschrieben, mittels Immunhistochemie mit den Antikörpern anti-LOXL2-R und anti-LOXL2 analysiert. Anti-LOXL2 zeigt eine Expression von LOXL2 in der Epidermis und nicht in der Dermis. Obwohl der Antikörper, der gegen die gemeinsame C-terminale Region von LOXL2, LOXL3 und LOXL4 gerichtet ist, die Expression dieser Enzyme in der Epidermis bestätigt und eine geringe Expression in der Dermis zeigt, erfolgt dies jedoch in einem Gebiet, das nicht den Stellen der Elastogenese entspricht.

LOXL2, LOXL3 und LOXL4 sind nicht an der Elastogenese beteiligt.

Beispiel 5: Darstellung der Rolle von LOX in der Elastogenese

Die Assoziation zwischen LOXL oder LOX auf der einen Seite und den elastischen Fasern oder den Mikrofibrillen auf der anderen Seite wurde durch die vorliegende Erfindung anhand von Transmissions-Elektronenmikroskopie eindeutig dargestellt.

LOX und LOXL, die mit den Mikrofibrillen assoziiert sind, stellen das Gestell dar, auf dem das Elastin aufgelagert wird, während allein LOX mit der Bildung der Kollagenfasern assoziiert ist. (siehe 5).

5: stellt Immun-Detektion von LOXL, von LOX und von Elastin mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie in dem dermalen Teil der rekonstruierten Haut nach 45 Tagen und in der normalen humanen Haut dar.

Die Gewebe wurden für drei Stunden bei 4°C mit 4% Paraformalaldehyd in PBS-Puffer, enthaltend 0,1% Glutaraldehyd, fixiert und wurden dann in Phosphatpuffer, enthaltend 0,4 M Sucrosecacodylat und 0,2 M Lysin, gewaschen, in Ethanollösungen dehydriert und in LR White (Euromedex, Frankreich) eingeschlossen. Die Detektion wurde mit primären Antikörpern durchgeführt, die 1:50 in Tris-HCl-Puffer bei pH 8,2 verdünnt wurden, und zu denen 1% Rinderserumalbumin (BSA) hinzugefügt wurde. Die Immunkomplexe wurden mit einem anti-IgG-Antikörper aus Kaninchen detektiert, der mit Kolloid-Gold-Partikeln von 10 und 20 nm (Biocell, Tebu, Frankreich) konjugiert und auf 1:40 verdünnt wurden. Die Proben wurden mit 3% Uranylacetat und Bleicitrat ("lead citrate") kontrastiert und dann unter einem JEOL 1200 EX Elektronenmikroskop überprüft. Die Immun-Detektion wurde auf der rekonstruierten Haut (A-D) und auf der jungen Haut (Vorhaut) (F-I) ausgeführt.

Auf der rekonstruierten Haut wurde sie mit den Antikörpern: anti-LOXL (A, B), anti-LOX (C), anti-Elastin (Eln) (D) und mit einer Negativkontrolle ohne primären Antikörper in der Dermis (Kontrolle) (E) durchgeführt. Auf der jungen Haut (Vorhaut) wurde sie mit einer Doppelmarkierung (F-I) durchgeführt.

Referenzen A-D: Immun-Detektion von LOXL, LOX und Elastin mittels Elektronenmikroskopie in dem dermalen Teil der rekonstruierten Häute nach 45 Tagen.

Referenz E: Positivkontrolle mit den Antikörpern anti-Elastin und anti-Kollagen I in der Dermis von rekonstruierten Häuten nach 45 Tagen, d.h. 30 Tage nach der Zugabe von Keratinocyten.

Referenzen F-I: Doppel-Immun-Detektion von LOXL, LOX, Elastin und Kollagen mittels Elektronenmikroskopie in dem dermalen Teil von humaner junger Haut (Vorhaut).

Referenzen G-H: Doppelmarkierung in dem dermalen Teil der humanen jungen Haut (Vorhaut) mit dem Antikörper anti-LOXL aus Kaninchen (der anti-IgG aus Kaninchen wird konjugiert mit 10 nm Goldpartikeln) und dem murinen Antikörper anti-Elastin (der anti-IgG aus Maus wird konjugiert mit 20 nm Goldpartikeln).

Legende in der Figur: m: Mikrofibrillen, c: Kollagenfasern, e: amorphes Elastin. Maßstab: 500 nm.

LOXL (A-B) wird in Assoziation mit den dichten Ablagerungen („depots dense) oder auf den Mikrofibrillen, jedoch nicht mit den Kollagenfasern, welche in diesen Abschnitten weiß erscheinen, detektiert. Die Markierung von LOX (C) war gering, obwohl ein paar Goldpartikel in den dichten Ablagerungen („dépots dense"), den Mikrofibrillen und dem Kollagen gefunden werden konnten. Die anti-Elastin-Antikörper wurden in den gleichen dichten Ablagerungen („dépots dense") und den Mikrofibrillen (D) detektiert. Wie bei den Beobachtungen anhand der Hautrekonstruktionsmodelle, ist LOXL nicht mit den Kollagenfasern assoziiert, im Gegensatz zu LOX, welches stark in den Kollagenfasern vorhanden ist und schwach auf den Mikrofibrillen vorhanden ist. Die LOXL-Antigene wurden in Assoziation mit den Mikrofibrillen und rund um die elastischen Fasern der Haut von humaner junger Haut detektiert.

Der Marker von LOX wurde nicht in Assoziation mit den elastischen Fasern beobachtet, war jedoch mit den Kollagenfasern und mit den Mikrofibrillen der Haut (n assoziiert.

Beispiel 6: Darstellung der Beziehung zwischen der Expression von LOX und der Elastogenese

LOXL und LOX werden in der Dermis von junger Haut (Vorhaut), die von jungen Patienten (einige Monate) entnommen wurde, die noch eine hohe Elastin-Synthese besitzen, exprimiert. LOXL wird nicht in der Dermis von Haut aus dem Nacken, der Brust, dem Abdomen oder dem Gesicht exprimiert, während LOX immer in der Dermis exprimiert wird (6).

6: stellt die Immun-Detektion von LOX und LOXL in humaner Haut mit verschiedenen Lokalisationen dar.

Die Antikörper anti-LOX (A, C, E, G) und anti-LOXL (B, D, F, H) wurden zum Detektieren der Expression von LOX und LOXL in Proben von junger Haut (Vorhaut) (A, B), aus dem Nacken (C, D), aus der Brust (E, F) und aus dem Abdomen (G, H), welche aus der Gewebebank des Edouard Herriot Hospitals (Lyons, Frankreich) stammen, verwendet. Die Gewebe wurden mit Bouin's Reagenz fixiert, in Paraffin eingeschlossen und für die Immun-Detektion so behandelt, wie es für die oben beschriebenen Immun-Detektionen erfolgt ist.

7: stellt die Immun-Detektion von LOX und LOXL in Häuten des humanen Abdomen, die verschiedenen Altersstufen entnommen wurde, dar.

Die Antikörper anti-LOX (A, C, E, G) und anti-LOXL (B, D, F, H) wurden zum Detektieren der Expression von LOX und LOXL in Proben von Haut aus dem Abdomen verwendet, die im Alter von 1,5 Jahren (A, B), 35 Jahren (C, D), 60 Jahren (E, F) und 91 Jahren (G, H) entnommen wurde, und die von der Gewebebank des Edouard Herriot Hospitals stammten. Die Gewebe wurden mit Bouin's Reagenz fixiert, in Parafin eingeschlossen und für die Immun-Detektion wie oben beschrieben behandelt.

Während dieser Untersuchung wurde eine starke Expression von LOX und LOXL in der Epidermis von humaner Haut beobachtet, mit einer späten Extinktion der Expression dieser 2 Enzyme (Alter 91 Jahre) (7).

8: stellt die Immun-Detektion von LOX und LOXL in Häuten von Narbengewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Heilung dar.

Die Antikörper anti-LOX (A, D, G), anti-Elastin (B, E, H) und anti-LOXL (C, F, I) wurden zum Detektieren der Expression von LOX, von Elastin und von LOXL in Proben von Haut aus dem Nacken eines 17jährigen Patienten rund um die Narbe herum ("normales" Gebiet, A-C), 3 Monate (D-F) oder 5 Jahre (G-H) nach einer Heilung, verwendet. Die Gewebe wurden mit Bouin's Reagenz fixiert, in Parafin eingeschlossen und für die Immun-Detektion wie oben beschrieben behandelt.

In den Narben konnte weder LOXL noch LOX in den Narbengewebsgebieten, 3 Monate nach der Narbe und 5 Jahre nach der Narbe, beobachtet werden. Es ist festzustellen, dass Elastin nach 3 Monaten immun-detektiert wurde und nach 5 Jahren in diesen Narben verschwunden war (8).

Dieses Beispiel der Erfindung zeigt, dass (i) eine unbestreitbare Implikation von LOX in die Bildung von Geweben, die in verschiedenen Altersstufen nicht restrukturiert werden, existiert, jedoch (ii) ein wahrhaftes Defizit der Expression von LOX in Narben existiert. Dieses Beispiel zeigt, dass LOX an Stellen der Bildung von elastischen Fasern vorhanden ist, dass es jedoch nicht in den restrukturierten Narbengewebszonen vorhanden ist, die ihre Fähigkeit verloren haben, funktionelle elastische Fasern zu bilden.

Beispiel 7: Darstellung der Aktivierung von LOX durch das Einführen von Keratinocyten in ein Hautrekonstruktionsmodell

Die Aktivierung des Gens, das für LOX kodiert, wird durch in situ Hybridisierung der messenger RNA von LOX mit doppelsträngigen DNA-Sonden, welche mit Digoxigenin markiert sind, auf Abschnitten, die in Parafin eingeschlossen sind, durchgeführt.

In 9 werden die Abschnitte des Hautmodells (Mimeskin^®) an Tag 35 darstellt:

(A) die Expression von LOXL ist positiv in der tiefen Dermis und überall in der Epidermis.
(B) die Expression von LOX wird überall in der gesamten Dermis beobachtet. In der Epidermis exprimieren die Zellen der Basalschicht LOX nicht, während die dornigen und granulären Schichten es stark exprimieren.
(C) Die Expression von Tropoelastin (TE) wird in Assoziation mit den dermalen Fibroblasten in der Epidermis gefunden.
(D) Die Expression des Gens COL1A1 (Kollagen I&agr;1) wird in der Dermis, jedoch nicht in der Epidermis, detektiert.
(E) Kontrolle ohne Sonde.

Die Position des JED (engl.: „DEJ") (dermal-epidermale Verbindungsstelle) wird durch einen offenen Pfeil angezeigt, die Position des porösen dermalen Substrats wird durch Pfeile angezeigt und die positiven Zellen werden durch Pfeilköpfe angezeigt.

Die doppelsträngigen DNA-Sonden werden mittels PCR hergestellt. Es wurden jeweils die folgenden Primer verwendet:

Für das Gen des Ialpha1 Kollagens, Sense 5'-GTGGAGAGTACTGGATTG-3' (SEG ID Nr. 14) und Antisense 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3' (SEQ ID Nr. 15), für Tropoelastin, Sense 5'-GTATATACCCAGGTGGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 10) und Antisense 5'-CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG-3' (SEQ ID Nr. 11); für hLOX, Sense 5'-GGTGGCCGACCCCTACTACATCC-3' (SEQ ID Nr. 12) und Antisense 5'-GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC-3' (SEQ ID Nr. 13); für hLOXL, Sense 5'-GACATAACCGACGTGCAGCC-3' (SEQ ID Nr. 8 und Antisense 5'-ATCCACGTTCGCTCCCTGAG-3' (SEQ ID Nr. 9).

Die DNAs werden mit Taq-Polymerase (Promega, Charbonnières, Frankreich) und Dig-11-dUTP (Roche Diagnostic, Meylan, Frankreich) als Nukleotid-Marker amplifiziert und werden dann, nach der Elektropherese in einem Agarosegel, unter Verwenden des QIAquick-Extraktionskit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankreich) aufgereinigt. Die in situ Hybridisierung wurde auf Abschnitten, die in Parafin eingeschlossen waren, durchgeführt. Die Proben werden von dem Parafin befreit und mit Proteinase K (Roche) bei 2 &mgr;g/ml für 15 Minuten bei 20°C behandelt. Die endogenen Peroxydasen werden inhibiert, wie es durch das TSA⁺ Amplifizierungskit (NEN, Boston, USA) angezeigt wird. Eine Prä-Hybridisierung wird für 2 Stunden bei 37 °C in 20 mM Phosphatpuffer pH 7,4 mit 50% deionisiertem Formamid, 2 × SSC (Natriumsalzcitrat, "sodium salt citrate"), 5 mM EDTA, 2,5 × Denhardt's-Lösung, 200 &mgr;g/ml denatutierte Heringssperma-DNA, 1 mg/ml Lachssperma-DNA und 10 mg/ml tRNA durchgeführt. Die Hybridisierung wird für 16 Stunden bei 37°C in 20 mM Phosphatpuffer mit 50% deinosiertem Formamid, 2 × SSC, 5 mM EDTA, 2,5 × Denhardt's-Lösung, 200 &mgr;g/ml denaturierter Heringssperma-DNA, 10% Dextransulfat, mit oder ohne die vorher denaturierte Sonde für 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Abschnitte bei 20°C (oder 37 °C für Kollagen) in 2 × SSC/50% Formamid, 1 × SSC/50% Formamid, 1 × SSC und 0,5 × SSC gewaschen. Nach der Dehydrierung werden die mit Digoxigenin markierten Hybride mit einem anti-Dig-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Roche), detektiert. Die Enddetektion der Komplexe wird unter Verwenden des TSA⁺-Amplifizierungskits (NEN) durchgeführt. Die positiven Signale entsprechen der Aktivität der alkalischen Phosphatase, die mit der Amlifizierungsvorgehensweise des TSA-Kits verknüpft ist, nach 2 Stunden Aktivität bei Umgebungstemperatur, und die durch die Präzipitation der gebildeten Tetrazoliumsalze festgestellt wird (durch Verwenden der Nitro Blue Tetrazolium/Bromchlorylindolphosphat (NBT/BCIP) – Substrate).

Die Erfindung zeigt, dass die Gene LOXL und LOX durch die Zugabe von Keratinocyten in einem Hautrekonstruktionsmodell (Mimeskin^®, Coletica, Lyons, Frankreich) aktiviert werden können, wie die Zuordnung der Expression der mRNAs durch in situ Hybridisierung zeigt (9).

Das LOX Gen wird ebenfalls nach der Zugabe von den Keratinocyten zur gleichen Zeit aktiviert, wie das Kollagen Ialpha1-Gen (Col1alpha1).

Beispiel 8: Darstellung einer Abnahme des Expressionslevels des LOX-Gens in gealterten adulten Fibroblasten

Die Erfinder verwendeten fünf Fibroblastenstämme aus junger Haut (Vorhaut) ("fibroblasts de prépuce", FP) (von jungen Kindern stammend) und sechs Stämme von adulten Fibroblasten ("fibroblasts adults", FA, 3 von durchschnittlich 20 Jährigen und drei von durchschnittlich 60 Jährigen) aus dem Abdomen, die von Arztpraxen stammen. Die Expression der drei Gene von Interesse sowie von Actin wurde durch Echtzeit-RT-PCR (quantitative reverse Transkriptase Polymerasekettenreakion, 10) analysiert. Diese Technik ermöglicht es, die Expression eines Gens genau zu quantifizieren, indem die Expression mit der von Actin (welche als konstant betrachtet wird) verglichen wird. Die Regulation des Levels dieses Gens kann so quantifiziert werden.

10: stellt die Entwicklung der Expression der Gene von Elastin, LOX und LOXL während des Alterns (der Alterung) dar. Diese Ergebnisse wurden durch Echtzeit-RT-PCR-Analysen des Expressionslevels von LOX, LOXL und Elastin in den Fibroblasten der jungen Haut (Vorhaut) und der Adulten erhalten. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt der Expression von jedem Gen in fünf Stämmen von FP und sechs Stämmen von FA dar. Die getesteten Gene sind hLOXL, hLOX und humanes Elastin. Die Werte der RT-PCR werden mit der Amplifikation von Actin verglichen. Es ist festzustellen, dass, während die Expression des Gens von Elastin im Verlauf des Alterns (der Alterung) nicht gestört zu sein scheint, die des LOX-Gens ab dem Alter von 20 um 40% abfällt. Dieser Teil der Daten ist in Übereinstimmung mit der Literatur von Elastin: Wenn das elastische Gewebe sich verschlechtert und nicht ersetzt wird, scheint dies nicht aufgrund einer Inhibierung der Aktivität des Elastingens zu erfolgen.

Die Gesamt-RNAs werden mit dem Kit "SV 96Total RNA Isolation System" (Promega, Charbonnieres, Frankreich) aufgereinigt. Die aufgereinigten RNAs werden in 100 &mgr;l RNase-freiem Wasser (Promega, Charbonnieres, Frankreich) eluiert, bestimmt und auf einer Platte verteilt (96 Well, 10&mgr;l Gesamt-RNA bei 5 ng/&mgr;l mittels PCR). Die Primer, die für die Ausführung dieser Arbeit ausgewählt wurden, sind die folgenden und sind Gegenstand der Tabelle I:

Tabelle I:

Die Technik der Echtzeit-RT-PCR wird mit dem "Quanti Tect SYBR Green RT-PCR"-Kit (Qiagen, Frankreich) in Wells, welche mRNA enthalten, in einem OPTICON-Thermocycler, der Aplifikationszyklen ausführt, durchgeführt. Die reverse Transkription (RT) wird für 30 Minuten bei 50 °C durchgeführt gefolgt von 15 Minuten bei 95 °C, um die reverse Transkriptase zu inhibieren, die Polymerase zu aktivieren und die erhaltene komplementäre DNA (cDNA) zu denaturieren. 50 Kettenpolymerationszyklen (PCR) werden durchgeführt (15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 60 °C, 30 Sekunden bei 72°C). Am Ende von jedem Zyklus wird die Fluoreszenz, die proportional zu der Anzahl der amplifizierten Fragmente ist, gelesen. Der Expressionslevel wird durch das Verhältnis der Expression von jedem Gen in Bezug zu Actin festgelegt.

Die obigen Beispiele zeigen, dass die Synthese der Produkte der Gene LOXL und LOX auf der Gen-Ebene aktiviert werden können. Die Aktivierung des Gens, das für LOX kodiert, ermöglicht die Bildung von quervernetzten Kollagenfasern. Ein Screenen nach Wirkstoffen ermöglicht es, Moleküle zu identifizieren, die einen Anstieg der Expression von LOX und eine Abnahme der Expression von Elastin induzieren können, gleichzeitig oder nicht gleichzeitig, um so die Synthese von quervernetztem Kollagen zu stimulieren, während zur gleichen Zeit die Bildung amorpher Mengen von Elastin vermieden werden, und mit dem Ziel, die Expression von normalen Geweben in pathologischen Geweben zu re-induzieren.

Beispiel 9: Analyse der Expression der messenger RNAs von LOX und/oder Elastin, zum Beispiel durch qualitative RT-PCR, mit oder ohne das in Kontakt bringen von Wirkstoffen, deren Aktivität zu testen ist.

Die Aktivitäten wurden bei 1% (V/V) auf Fibroblasten aus normaler humaner Haut (die aus gesunden "gealterten" Adulten stammte) getestet. Die Kultivierung wurde zum Beispiel in einer Einzelschicht auf 24-Well-Kultivierungsplatten, in einem definierten Medium ohne Serum (Fibroblast Basal Medium, Promocell, Deutschland) durchgeführt. Die Zellen wurden zum Beispiel bei 40.000 pro cm² ausgelegt. Bei dem Zusammenfluss werden die Zellen mit den Wirkstoffen in Kontakt gebracht, vorteilhafterweise für 24 Stunden. Parallel werden vorteilhafterweise eine nicht behandelte Kontrolle (Medium allein) und drei Positivkontrollen (TGF-&bgr; bei 1ng/ml, IL-1&agr; bei 50 pg/ml und Phytokine^® (Coletica, Frankreich) bei 2% (V/V)) durchgeführt, zum Beispiel in den gleichen Kultivierungsplatten.

TFG-&bgr; bei 1 ng/ml und IL-1&agr; bei 50 pg/ml wurden im voraus getestet und die Stimulierung der Synthese der Elastin-mRNA, die durch diese zwei Cytokine bei diesen Konzentrationen induziert wurde, wurde mittels einer Analyse der mRNAs, z.B. durch quantitative RT-PCR (× 10 für TGF-&bgr; und × 6 für IL-1 alpha) bestätigt. Nach dem Zeitraum, für den die Wirkstoffe mit den Zellen in Kontakt gebracht werden, z.B. 24 Stunden, werden die Medien entfernt und die Zellen werden konserviert, zum Beispiel durch trockengefrieren bei –80°C, nach einem Spülen in Phosphatpuffer pH 7,4. Die Gesamt-RNAs werden extrahiert, zum Beispiel mit der Hilfe eines Extraktions-Kits von 96 Wells auf Silica-Säulen und werden in einem 96-Well Spektrophotometer bei 260 nm (Reinheitsindikator: Proteinbestimmung bei 280 nm) bestimmt. Die RNAs werden verdünnt, zum Beispiel auf 5 ng/&mgr;l. Die qualitative RT-PCR in Schritt 1 wird zum Beispiel mit 50 ng Anfangs-RNA in einer 96-Well-Platte der Gene von Actin, Elastin und LOX, durchgeführt. Die für jedes Gen spezifischen Primer wurden zum Beispiel bei 0,5 &mgr;M verwendet:

– Sense Elastin-Gen: 1Ela 5'-GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG-3'; (SEQ ID Nr. 26)
– Antisense Elastin-Gen: 2Ela 5'-CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG-3; (SEQ ID Nr. 27)
– Sense LOX-Gen: Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3; (SEQ ID Nr. 24)
– Antisense LOX-Gen: Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3; (SEG ID Nr. 25)
– Sense Actin-Gen: Actin U 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (SEQ ID Nr. 30)
– Anisense Actin-Gen: Actin D 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'. (SEQ ID Nr. 31)

Die Parameter der Amplifizierung waren vorteilhafterweise die folgenden: 48 °C, 30 Min.; 94 °C, 2 min.; (94 °C, 30 Sekunden; 60 °C, 30 Sekunden; 68 °C, 30 Sekunden) 28 Zyklen für Actin, 32 Zyklen für LOX oder 34 Zyklen für Elastin; 68 °C, 10 Min.; 14°C, unbegrenzt ("infinity"). Nach der Amplifikation werden die Produkte beispielsweise in einem Verhältnis von 3 &mgr;l Actin-Amplifizierungsprodukte + 5 &mgr;l Elastin-Gen-Amplifizierungspxodukte + 5 &mgr;l LOX-Gen-Amplifizierungsprodukte gemischt. Es wird ein Ladepuffer (2 &mgr;l) zugefügt und das Gesamtvolumen (20 &mgr;l) wird auf ein vorgegossenes Agarosegel, z.B. bei 2%, aufgetragen. Die Erfinder visualisierten die Expressionslevel anhand von Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel: wurden die Banden der Proben nach der Wanderung (15 Minuten) unter UV in einer Schwarzkammer visualisiert und digital fotografiert. Die Fotografien der Gele wurden mittels Bildanalyse und einer Quantifizierung der Intensität der Banden (Phoretix1D Quantifier, Non Linear Dynamics Ltd, USA) analysiert. Die Expressionslevel der Gene Elastin und LOX wurden in prozentualer Veränderung in Bezug auf diejenige, die aus den Negativkontrollen (ohne Behandlung) erhalten wurden, ausgedrückt.

Interpretationen der Ergebnisse:

Es ist festzustellen, dass die gealterten Zellen Mengen von RNAs, die für Elastin kodieren, exprimieren, die annähernd identisch sind zu solchen, die in jungen Zellen bestimmt werden, während sie sehr stark abnehmen in den Fällen von mRNAs, die für LOX kodieren (–40%). Es ist daher möglich, diese Abnahme der Expression von LOX in gealterten Zellen rückgängig zu machen und in diesem Sinn wurde ein Screening nach Wirkstoffen durchgeführt.

Screening nach Wirkstoffen:

Die Mengen an cDNA aus jeder Untersuchung werden verglichen mit der Menge an Actin cDNA und dann mit den Negativkontrollen (ohne Aktivitäten). Eine erste Analyse ermöglicht es, die Untersuchungen, die einen ungefähr zweifachen Anstieg von LOX mRNA und einen Anstieg an Elastin (Eln) mRNA von ungefähr 0,5 anzeigen, als signifikant zu betrachten. Von mehr als 900 getesteten Molekülen oder Wirkstoffextrakten, erfüllen 8 Wirkstoffe diese Kriterien bei den getesteten Konzentrationen und unter den definierten Bedingungen. Diese Wirkstoffe sind die folgenden und sind Gegenstand der Tabelle II.

Tabelle II:

Die Pflanzenextrakte werden erhalten, indem es den Pflanzen ermöglicht wird, bei 2–5% (W/W) in einer Wasser/(Alkohol, Glycol, oder Polyol) – Mischung (wie Ethanol, Glycerin, Butylenglycol und anderen Glycolen, Xylitol usw. ...), 100/0 bis 0/100, einzuweichen. Die erhaltenen Extrakte werden anschließend filtriert oder destilliert, um die lösliche Fraktion zurückzugewinnen, die anschließend steril gefiltert wird. Die chemischen Moleküle stammen von Sigma (Saint-Louis, USA) und werden verdünnt oder dispergiert bei 1% in einem Alkohol oder einem Glycol.

Schlussfolgerungen: 8 Wirkstoffe aus der Bank von 960 Wirkstoffen sind in der Lage, unter den betrachteten Bedingungen die Syntheselevel der mRNAs der Gene, die für LOX kodieren, signifikant zu aktivieren und das Elastin in den Fibroblasten aus dem Abdomen von den "gealterten" Adulten herabzusetzen.

Beispiel 10: Untersuchung der Effektivität eines kosmetischen oder dermopharmazeutischen Wirkstoffs am Beispiel von Echtzeit-RT-PCR

Die Wirkstoffe, die nach dem ersten Screening-Schritt ausgewählt wurden, wurden bei verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,001% und 5% (V/V) auf Fibroblasten von normaler (adulter) humaner Haut untersucht. Die Kultivierung wurde beispielsweise in einer Einzelschicht in 24-Well-Platten in einem definierten Medium ohne Serum (Fibroblast Basal Medium, Promocell, Deutschland) ausgeführt. Die Zellen wurden ausgelegt, z.B. bei 40.000 pro cm². Nach dem Zeitraum, für welchen die Wirkstoffe mit den Zellen in Kontakt gebracht wurden (24 Stunden), wurden die Medien entfernt und die Zellen wurden konserviert, z.B. durch trockengefrieren bei – 80 °C, nach einem Spülen mit Phosphatpuffer pH 7,4. Am Ende der Experimentierung wird der Gehalt an mRNA von Elastin, von LOX und von Actin durch eine mRNA-Analysetechnik beurteilt, z.B. durch Echtzeit-RT-PCR. Hierfür sind die Primer-Paare, welche die Amplifikation von spezifischen Fragmenten dieser Gene ermöglichen, die oben beschriebenen (Beispiel 9).

Nach der Extraktion, zum Beispiel mit der Hilfe eines Extraktions-Kits in 96-Wells auf Silica-Säulen und der Bestimmung in einem 96-Well-Spektrophotometer bei 260 nm, werden die RNAs verdünnt, z.B. auf 5 ng/&mgr;l. Die RT-PCR-Reaktionen (reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion) wurden durch quantitative Echtzeit-RT-PCR mit der Hilfe des "Opticon"-Systems (MJ Research, USA) durchgeführt. Vorteilhafterweise war die Reaktionsmischung (50 &mgr;l), die in die Wells eingeführt wurde, für jede Probe die folgende:

– 10 &mgr;l RNA bei einer Konzentration von 5 ng/&mgr;l,
– die spezifischen Primer der verschiedenen nachgesuchten Marker,
– Reaktionsmischung (Qiagen – 25 &mgr;l 2 × QuantiTect SYBR Green RT-PCR master

mix, enthaltend 5 mM MgCl₂ + 0,5 &mgr;l QuantiTect RT mix), wobei der Marker SYBR Green I während des Verlängerungsschritts (Elongationsschritt) in die doppelsträngige DNA eingebaut wird.

Die RT-PCR-Bedingungen waren vorteilhafterweise die folgenden:

Reverse Transkription: 30 Minuten bei 50 °C, dann 15 Minuten bei 95 °C,

PCR-Reaktionen: [15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C], 50 Zyklen.

Die Abwesenheit von Kontaminationen und die Reinheit der amplifizierten Produkte wurde zum Beispiel über die Fusionskurven der amplifizierten PCR-Produkte bestätigt. Die Produkte, die einen doppelten Peak oder eine anormale Fusionstemperatur darstellten, wurden eliminiert.

Analyse und Kalkulationsverfahren:

Der Einbau von Fluoreszenz in die amplifizierte DNA wurde kontinuierlich während der PCR-Zyklen evaluiert. Durch dieses System wurden Kurven von Fluoreszenzmessungen als Funktion der Anzahl von PCR-Zyklen erhalten und so eine relative Menge amplifizierter DNA evaluiert.

Um die vorliegende Zellpopulation zu berücksichtigen, wurden alle Ergebnisse mit dem "Actin"-Signal verglichen, welches als Haushaltsgen (Housekeeping-Gen) verwendet wurde. Gemäß der Experimentierung wurde der Grenzwert der Messung von C (I) (= Zyklus-Grenzwert, "Cycle Treshold") für T zwischen 0,05 und 0,01 festgelegt, und dann wird eine willkürliche Messeinheit für jedes Gen gemäß der folgenden Formel berechnet: Sgen "x" = 10⁷ × (1/2)^C(T)Gen"x"

C (T)Gen "x" bedeutet die Anzahl der Zyklen, die erforderlich sind, um den Fluoreszenz-Grenzwert von 0,01 – 0,05 des Gens "x" zu erlangen.

Die Werte der Gene von Interesse wurden auf das "Actin"-Signal bezogen, durch Berechnung des Verhältnisses: R = SGen"x"/SActin.

Diese Verhältnisse wurden zwischen behandelten und nicht behandelten Proben verglichen, wobei "x" das LOX-Gen oder das Elastin-Gen ist.

Ergebnisse: Unter den ausgewählten Wirkstoffen werden die erhaltenen Ergebnisse, als Beispiel von zwei von ihnen, in Tabelle III dargestellt:

Tabelle III

Schlussfolgerungen: Das Kardamom-Extrakt STIMULIERT LOX bei allen Konzentrationen signifikant und INHIBIERT Elastin (Eln) bei allen Konzentrationen signifikant. Der Hafer-Extrakt STIMULIERT LOX bei 0,1% und 1% signifikant und INHIBIERT Elastin (Eln) bei 5% signifikant.

Beispiel 11: Analyse der Expression der messenger RNAs von LOX und/oder von Elastin, zum Beispiel durch qualitative RT-PCR mit oder ohne in Kontakt bringen von Wirkstoffen, deren Aktivität auf Zellen, die aus Narbengewebszonen stammen, zu testen ist

Die Aktivitäten wurden bei 1% (V/V) auf Fibroblasten aus humaner Narbengewebshaut (chirurgische Wiederherstellung von hypertrophen Narben nach Kaiserschnitt) in vorzeitiger Passage ("passage précoce"; "premature passage") (weniger als 5 Passagen) untersucht. Die Kultivierung wurde zum Beispiel in einer Einzelschicht auf 24-Well-Kultivierungsplatten, in einem definierten Medium ohne Serum (Fibroblast Basal Medium, Promocell, Deutschland), durchgeführt. Die Zellen wurden zum Beispiel bei 40.000 pro cm² ausgelegt. Bei dem Zusammenfluss wurden die Zellen mit den Wirkstoffen, vorteilhafterweise für 24 Stunden, in Kontakt gebracht. Parallel werden eine nicht behandelte Kontrolle (Medium allein) und drei Positiv-Kontrollen (TGF-&bgr; bei 1 ng/ml, IL-1&agr; bei 50 pg/ml und Phytokine^® (Coletica, Frankreich) bei 2% (V/V)) vorteilhafterweise durchgeführt, z.B. auf den gleichen Kultivierungsplatten. TGF-&bgr; bei 1ng/ml und IL-1&agr; bei 50 pg/ml wurden im voraus getestet und die Stimulierung der Synthese von Elastin mRNA, die durch diese zwei Cytokine bei diesen Konzentrationen induziert wurde, wurde durch die Analyse der mRNAs bestätigt, z.B. durch quantitative RT-PCR (× 10 für TGF-&bgr; und × 6 für IL-1 alpha). Nach dem Zeitraum, für den die Wirkstoffe mit den Zellen in Kontakt gebracht werden, z.B. 24 Stunden, werden die Medien entfernt und die Zellen konserviert, z.B. durch trockengefrieren bei –80°C, nach einem Spülen in Phosphatpuffer pH 7,4. Die Gesamt-RNAs werden extrahiert, z.B. mit Hilfe eines Extraktions-Kits von 96 Wells auf Silica-Säulen und werden in einem 96-Wells-Spektrometer bei 260 nm (Reinheitsindikator: Proteinbestimmung bei 280 nm) bestimmt. Die RNAs werden verdünnt, z.B. zu 5 ng/&mgr;l. Die qualitative RT-PCR in Schritt 1 wird z.B. mit 50 ng Anfangs-RNA auf einer 96-Well-Platte, der Gene von Actin, Kollagen I alpha1 und LOX durchgeführt. Es werden die spezifischen Primer von jedem Gen z.B. bei 0,5 &mgr;M verwendet:

Die Amplifizierungsparameter waren vorteilhafterweise die folgenden: 50 °C, 30 Min; 94 °C, 2 Min; (94 °C, 30 Sekunden; 60 °C, 30 Sekunden, 68 °C, 30 Sekunden) 28 Zyklen für Actin, 26 Zyklen für COLL1, 32 Zyklen für LOX; 72°C, 10 Min; 14 °C, unbegrenzt. Nach der Amplifizierung werden die Produkte zum Beispiel in einem Verhältnis von 3&mgr;l Actin Amplifizierungsprodukte + 5 &mgr;l Kollagen I Gen-Amplifizierungsprodukte + 5 &mgr;l LOX Gen-Amplifizierungsprodukte gemischt. Es wird ein Ladepuffer hinzugefügt, (2 &mgr;l) und das Gesamtvolumen (20 &mgr;l) wird auf ein vorgegossenes Agarosegel, z. B. bei 2%, aufgetragen. Die Erfinder visualisierten die Expressionslevel anhand von Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel: die Banden der Proben wurden nach der Wanderung (15 Minuten) unter UV in einer Schwarzkammer visualisiert und wurden digital fotografiert. Die Fotografien der Gele wurden analysiert mittels Bildanalyse und Quantifizierung der Intensität der Banden. Der Expressionslevel der Gene Kollagen I und LOX wurde in prozentualer Veränderung in Bezug auf diejenigen, die für die Negativkontrollen (ohne Behandlung) erhalten wurden, ausgedrückt und mit den Ergebnissen verglichen, die für die Positivkontrollen erhalten wurden.

Die selektierten Wirkstoffe stellen einen ungefähr zweifachen Anstieg an LOX mRNA und eine normale oder reduzierte Expression der COL1 mRNA dar. Von über 900 getesteten Wirkstoffmolekülen oder -extrakten erfüllt insbesondere ein Extrakt aus Hafer diese Kriterien positiv.

Für die Beispiele 12 bis 16: Der Fachmann wird wissen, wie er aus diesen Beispielen die adäquate Lehre beziehen kann, um die beschriebenen verschiedenen Zusammensetzungen (Formulierungen) herzustellen.

Beispiel 12: Verwendung der Produkte der Erfindung in kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen des Öl-in-Wasser-Emulsionstyps

Formulierung 12a

Formulierung 12b

Formulierung 12c

Beispiel 13: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Wasser-in-Öl-Typ-Formulierung

Beispiel 14: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Shampoo- oder Duschgel-Typs

Beispiel 15: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Lippenstift-Typs und anderer wasserfreier Produkte

Beispiel 16 : Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung von wässrigen Gelen (Eveliner, "amincissants" ("slimmer") usw.)

Beispiel 17: Zubereitung von pharmazeutischen Formulierungen, die LOX enthalten Formulierung 17a: Zubereitung von Tabletten

Formulierung 17b: Zubereitung einer Salbe

Formulierung 17c: Zubereitung einer injizierbaren Formel

Phase A und Phase B werden separat in Ampullen verpackt und vor der Verwendung gemischt.

Beispiel 18: Evaluierung der kosmetischen Akzeptanz einer Zubereitung, welche den Gegenstand der Erfindung enthält

Es wurden toxikologische Untersuchungen wurden anhand der Verbindungen, die gemäß den Beispielen 9 bis 11 erhalten wurden, und die mit 10% in ein 0,5% Xantangel eingebaut wurden, durch okulare Evaluierung beim Kaninchen, durch die Untersuchung des Ausbleibens anormaler Toxizität durch orale Einzelverabreichung an die Ratte und durch die Untersuchung der Sensibilisierungskraft im Meerschweinchen, ausgeführt.

Evaluierung der Anfangsreizung der Haut beim Kaninchen

Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden ohne Verdünnung mit einer Dosis von 0,5 ml auf die Haut von 3 Kaninchen angewendet, gemäß dem Verfahren, das von der Richtlinie der OCDE in Bezug auf die Untersuchung „der akute Reiz/ätzende Effekt auf der Haut" vorgeschlagen wurde.

Die Produkte wurden gemäß den Kriterien klassifiziert, die in der Entscheidung vom 1/2/1982, veröffentlicht in dem Amtsblatt der Französischen Republik („Official Journal of the French Republic") („JORF") vom 21/02/82, definiert sind.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen ermöglichten die Schlussfolgerung, dass die Zubereitung, welche die gemäß Beispiel 11 erhaltene Verbindung enthielt, als nicht-reizend für die Haut klassifiziert wurde.

Evaluierung der okularen Reizung beim Kaninchen:

Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden rein und in einer Einzelverabreichung von 0,1 ml in die Augen von drei Kaninchen eingeträufelt, gemäß dem Verfahren, das durch der Richtlinie der OCDE Nr. 405 vom 24. Februar 1987 in Bezug auf die Untersuchung des „akuten reizenden/ätzenden Effekts auf den Augen" vorgeschlagen wurde.

Die Ergebnisse dieses Test ermöglichten die Schlussfolgerung, dass die Zubereitungen pur verwendet oder ohne Verdünnung als nicht-reizend für die Augen betrachtet weiden können, im Sinne der Richtlinie 91/326 EEC, und zwar rein oder ohne Verdünnung verwendet.

Untersuchung des Ausbleibens anormaler Toxizität durch orale Einzelverabreichung an die Ratte:

Die beschriebenen Zubereitungen wurden in einer oralen Einzelverabreichung mit einer Dosis von 5g/kg Körpergewicht an 5 männliche Ratten und 5 weibliche Ratten verabreicht, gemäß einem Protokoll, das an die Richtlinie des OCDE Nr. 401 vom 24. Februar 1987 angelehnt und an kosmetische Produkte angepasst wurde.

Für DL0 und DL50 („LD0 and LD50") wurde gefunden, dass sie größer als 5000 mg/kg sind. Die getesteten Zubereitungen sind daher nicht unter die Zubereitungen klassifiziert, die gefährlich bei der Nahrungsaufnahme sind.

Evaluierung der kutanösen Sensibilisierungskraft beim Meerschweinchen:

Die beschriebenen Zubereitungen wurden einer Maximierungs-Untersuchung unterworfen, die von Magnusson und Kligmann beschrieben wurde, einem Protokoll, welches in Übereinstimmung mit der Richtlinie Nr. 406 des OCDE ist.

Die Zubereitungen wurden als nicht-sensibilisierend durch den Kontakt mit der Haut klassifiziert.

Angaben zu den beschriebenen Sequenzen:

Sequenz ID Nr. 1: Ist die Aminosäuresequenz des humanen Proteins LOX.
Sequenz ID Nr. 2: Ist die Nukleotidsequenz der cDNA, welche für das humane Protein LOX, beschrieben in Sequenz ID Nr. 1, kodiert.
Sequenz ID Nr. 3: Ist die Aminosäuresequenz des humanen Proteins Tropoelastin.
Sequenz ID Nr. 4: Ist die Nukleotidsequenz der cDNA, welche den Promotor (Basenpaare von -2171 bis ATG) des humanen Gens, welches für das humane Elastin-Protein kodiert, kodiert.
Sequenz ID Nr. 5: Ist die Nukleotidsequenz der cDNA, welche für das humane Protein Tropoelastin, beschrieben in Sequenz ID Nr. 3, kodiert.
Sequenz ID Nr. 6: Ist die Aminosäuresequenz des humanen Proteins LOXL.
Sequenz ID Nr. 7: Ist die Nukleotidsequenz der cDNA, welche für das humane Protein LOXL, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 6, kodiert.

Für die doppelsträngigen DNA-Sonden:

Sequenz ID Nr. 8: Ist ein Sense Primer der DNA, die für das humane Protein LOXL, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 6, kodiert.
Sequenz ID Nr. 9: Ist ein Antisense Primer der DNA, welche für das humane Protein LOXL, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 6, kodiert.
Sequenz ID Nr. 10: Ist ein Sense Primer der DNA, die für das humane Protein Tropoelastin, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 3, kodiert.
Sequenz ID Nr. 11: Ist ein Antisense Primer der DNA, die für das humane Protein Tropoelastin, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 3, kodiert.

Sequenz ID Nr. 12: Ist ein Sense Primer der DNA, die für das humane Protein LOX, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 1, kodiert.
Sequenz ID Nr. 13: Ist ein Antisense Primer der DNA, die für das humane Protein LOX, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 1, kodiert.
Sequenz ID Nr. 14: Ist ein Sense Primer der DNA, die für das humane Protein Kollagen I &agr;1L kodiert.
Sequenz ID Nr. 15: Ist ein Antisense Primer der DNA, die für das humane Protein Kollagen I &agr;1L kodiert.

Für die GST-Fusionsgene:

Sequenz ID 16: Ist ein Sense Primer der DNA des Fusionsgens GST S355-D415.
Sequenz ID Nr. 17: Ist ein Antisense Primer der DNA des Fusionsgens GST S355-D415.
Sequenz ID Nr. 18: Ist ein Sense Primer der DNA des Fusionsgens GST G128-L212.
Sequenz ID Nr. 19: Ist ein Antisense Primer der DNA des Fusionsgens GST G128-L212.
Sequenz ID Nr. 20: Ist ein Sense Primer der DNA des Fusionsgens GST V228-S279.
Sequenz ID Nr. 21: Ist ein Antisense Primer der DNA des Fusionsgens GST V228-S279.
Sequenz ID Nr. 22: Ist ein Sense Primer der DNA des Fusionsgens GST D306-N373.
Sequenz ID Nr. 23: Ist ein Antisense Primer der DNA des Fusionsgens GST D306-N373.

Für die PCR Primer:

Sequenz ID Nr. 24: Ist ein Sense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein LOX, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 1, kodiert.
Sequenz ID Nr. 25: Ist ein Antisense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein LOX, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 1, kodiert.
Sequenz ID Nr. 26: Ist ein Sense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein Tropoelastin, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 3, kodiert.
Sequenz ID Nr. 27: Ist ein Antisense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein Tropoelastin, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 3, kodiert.
Sequenz ID Nr. 28: Ist ein Sense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein LOXL, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 6, kodiert.
Sequenz ID Nr. 29: Ist ein Antisense Primer für die Sequenz der mRNA, die für das humane Protein LOXL, beschrieben in der Sequenz ID Nr. 6, kodiert.
Sequenz ID Nr. 30: Ist ein Sense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein Actin kodiert.
Sequenz ID Nr. 31: Ist ein Antisense Primer für die RT-PCR der mRNA, die für das humane Protein Actin kodiert.

Sequenzprotokoll

Anspruch[de]

Verwendung von LOX mit der Sequenz ID Nr. 1 oder einer ersten Substanz, welche die Aktivität und/oder die Bildung von LOX fördert, kombiniert mit einer zweiten Substanz, welche die Reduktion oder die Inhibierung der Synthese von Elastin fördert, zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche insbesondere dazu gedacht ist, die Elastogenese in Fällen von anormaler oder pathologischer Elastogenese zu regulieren.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die anormale oder pathologische Elastogenese insbesondere im Zusammenhang steht mit Fällen von Fibrose, von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen, von dystrophen Narben, von Ekzemen und/oder mit einer Reaktion des Stromas auf Krebsarten, welche mit einem desorganisierten und/oder nicht-funktionellen elastischen Gewebe assoziiert sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Substanz und die zweite Substanz identisch sind.
Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Substanz die Reduktion oder die Inhibierung der Synthese von Tropoelastin mit der Sequenz ID Nr. 3, dem Vorläufer-Protein von Elastin, fördert.
Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Substanz:

i) eine Region umfasst, an mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz des Promotors des humanen Elastingens (Pr) (SEQ ID Nr. 4) bindet, oder

ii) die Expression eines Proteins modeliert, welches an mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz des Promotors des humanen Elastingens (Pr) (SEQ ID Nr. 4) bindet,

um die Synthese von Tropoelastin zu reduzieren oder zu inhibieren.
Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pflanzen- oder synthetischen Polyphenolen, einem Extrakt aus Galega oder aus Kardamom, einer gesättigten Fettsäure, einem Polyol, wie Xylitol, Gum Adragant, einem Extrakt aus Getreide, wie Gerste oder Hafer.
Kosmetische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Wirksubstanz gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, optional in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger.
Nutrazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Wirksubstanz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, optional in einer Mischung mit einem Träger, der für Nahrungsmittel akzeptabel ist.

Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Wirksubstanz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, optional in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verfahren zum Identifizieren („Screening") einer Substanz, welche die Aktivität und/oder die Bildung von LOX fördert, zum Regulieren der Elastogenese in Fällen von anormaler oder pathologischer Elastogenese, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– In-Kontakt-Bringen einer potentiellen Wirksubstanz mit mindestens einem Typ von Zellen, die vorzugsweise lebendig sind, und die in der Lage sind, LOX zu exprimieren und

– Analysieren der Expression von LOX, insbesondere mit dem Ziel herauszufinden, ob die potentielle Wirksubstanz die Expression von LOX stimuliert.
Verfahren zum Identifizieren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der potentiellen Wirksubstanz mit mindestens einem Typ von Zellen, welche in der Lage sind, das Protein Elastin zu exprimieren, wobei diese Zellen die gleichen sein können, wie solche, die LOX exprimieren, umfasst und das Analysieren der Expression des Proteins Elastin umfasst, insbesondere mit dem Ziel herauszufinden, ob die potentielle Wirksubstanz die Reduktion oder die Inhibition der Synthese von Elastin fördert.
Verfahren zum Identifizieren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass danach gesucht wird, ob die Wirksubstanz:

– die Expression mindestens eines Teils einer Nukleotidsequenz, welche für das Protein LOX kodiert, stimuliert und/oder

– die Expression einer Aminosäuresequenz, welche in der Struktur des Proteins LOX vorhanden ist, stimuliert; und

– die Expression mindestens eines Teils einer Nukleotidsequenz, welche für das Protein Elastin kodiert, inhibiert und/oder

– die Expression einer Aminosäuresequenz, welche in der Struktur des Proteins Elastin vorhanden ist, inhibiert.
Verfahren zum Identifzieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse der Expression von LOX und/oder des Proteins Elastin durch qualitative und/oder quantitative Analyse der Expression einer Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert und/oder für Tropoelastin kodiert, durchgeführt wird.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse der Expression von LOX und/oder des Proteins Elastin unter Verwendung einer reversen Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) erfolgt, welche die Verwendung von Primern, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der komplementären DNA, welche für LOX (SEQ ID Nr. 2) kodiert, hybridisieren, um mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert, zu amplifizieren und/oder die Verwendung von Primern, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenzen der komplementären DNA, welche für Tropoelastin (SEQ ID Nr. 5) kodiert, hybridisieren, um mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz, welche für Tropoelastin kodiert, zu amplifizieren, umfasst.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ebenfalls einen Schritt des Lokalisierens der Expression von LOX umfasst, welcher anhand eines Hautrekonstruktionsmodells oder anhand einer Biopsie ausgeführt wird:

– durch in situ Hybridisierung, insbesondere von mindestens einem Teil einer Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert, insbesondere durch Verwenden von mindestens einer DNA-Sonde, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz, welche für LOX kodiert, und/oder insbesondere mindestens einem Teil einer Nukleotidsequenz, welche für Tropoelastin kodiert, hybridisiert, zum Beispiel mit einer DNA-Sonde, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz, welche für Tropoelastin kodiert, hybridisiert und/oder

– durch Immun-Detektion, insbesondere von mindestens einem Teil einer Aminosäuresequenz, welche für LOX kodiert, insbesondere durch Verwenden von mindestens einem Antikörper, welcher in der Lage ist, das gesamte oder einen Teil von LOX zu erkennen und/oder mindestens einem Antikörper, welcher in der Lage ist, das gesamte oder einen Teil von Elastin zu erkennen.
Verfahren zum Identifizieren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Immun-Detektion oder der in situ Hybridisierung es ermöglicht, den Nachweis von LOX und von Elastin, insbesondere in epithelialen Geweben und/oder in Bindegeweben durchzuführen, wobei das Gewebe aus mindestens einem Hautrekonstruktionsmodell oder aus Biopsien stammt.

Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Identifizieren den Vergleich der Expression von LOX mit der Expression von LOX, das in einer Kontrolle exprimiert wird, welche die Wirksubstanz nicht umfasst, und/oder den Vergleich der Expression von dem Protein Elastin mit der Expression von dem Protein Elastin, das in einer Kontrolle exprimiert wird, welche die Wirksubstanz nicht umfasst, umfasst.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Fibroblasten umfassen, die insbesondere aus normaler humaner Haut, wie z.B. aus junger Haut (Vorhaut) oder aus der Haut eines adulten Probanden stammt.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen epitheliale Zellen, wie Keratinocyten, umfassen, die insbesondere aus normaler humaner Haut stammen, wie z.B. aus junger Haut (Vorhaut) oder aus der Haut eines adulten Probanden stammen.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die lebenden Zellen aus mindestens einer Haut mit einer charakteristischen Lokalisation stammen, z.B. dem Gesicht, dem Abdomen oder der Brust, und die dadurch gekennzeichnet werden kann, „Foto-gealtert" zu sein oder der Sonnenbestrahlung „punktuell ausgesetzt" zu sein oder nicht.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Identifizieren unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells, bevorzugt mindestens eines Dermis-Modells, welches Fibroplasten umfasst, oder eines Biopsie-basierten Modells, erfolgt.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Identifizieren unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells, bevorzugt mindestens eines Epidermis-Models, welches Keratinocyten umfasst, erfolgt.
Verfahren zum Identifizieren nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pflanzen- oder synthetischen Polyphenolen, einem Extrakt aus Galega oder aus Kardamom, einer gesättigten Fettsäure, einem Polyol, wie Xylitol, Gum Adragant, einem Extrakt aus Getreide, wie Gerste oder Hafer.
Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOX und optional des Proteins Elastin in Geweben, mit dem Ziel, den Nachweis der Neo-Kollagenogenese und/oder der Neo-Elastogenese, insbesondere in epithelialen Geweben und/oder in Bindegeweben durchzuführen, wobei die Gewebe aus mindestens einem Hautrekonstruktionsmodell oder aus Biopsien stammen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Schritt der Immun-Detektion des Proteins LOX und optional des Proteins Elastin umfasst.
Verfahren zur kosmetischen Pflege, welches das Anwenden einer effektiven Menge von mindestens einem Wirkstoff oder einer der Kombinationen, wie in den Ansprüchen 1 bis 6 definiert, oder einer Zusammensetzung, wie in den Ansprüchen 7 bis 9 definiert, umfasst, insbesondere in Fällen von Sonnen-Elastosis, von Dehnungsmalen und/oder von dystrophen Narben.

Es folgen 8 Blatt Zeichnungen

IPC
A	Täglicher Lebensbedarf
B	Arbeitsverfahren; Transportieren
C	Chemie; Hüttenwesen
D	Textilien; Papier
E	Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F	Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G	Physik
H	Elektrotechnik

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