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Dokumentenidentifikation DE10338090A1 24.03.2005
Titel Diflunisal zur Behandlung von Krebs
Anmelder Kreutz, Werner, Prof. Dr., 79219 Staufen, DE
Erfinder Kreutz, Werner, Prof. Dr., 79219 Staufen, DE
Vertreter Lederer & Keller, 80538 München
DE-Anmeldedatum 19.08.2003
DE-Aktenzeichen 10338090
Offenlegungstag 24.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.03.2005
IPC-Hauptklasse A61K 31/60
IPC-Nebenklasse A61P 35/00   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft die Verwendung von Diflunisal für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krebs, wobei die Verabreichung des Arzneimittels so ausgestaltet ist, daß ein molekulares Verhältnis von 4 : 1 zu 6 : 1 von interstitiellem Diflunisal zu interstitiellem Albumin zur Verfügung gestellt wird.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der Verbindung Diflunisal für die Herstellung eines Medikamentes zur Bekämpfung von Krebs. Überraschenderweise wirkt Diflunisal auch als Einzelsubstanz und nicht nur in einer synergistischen Kombination mit anderen aktiven Substanzen.

Mit Medikamenten, die bisher in der Chemotherapie eingesetzt werden, können in der Regel nur Teilerfolge erzielt werden, d.h. sie führen nicht zu einer völligen Heilung. Darüberhinaus wirken anti-Tumor Substanzen, wie sie bisher eingesetzt werden, nur auf bestimmte Tumor-Arten. Ein weiterer Nachteil von vielen Chemotherapeutika sind die oft erheblichen Nebenwirkungen, da sie einen generellen cytostatischen Effekt auf proliferierende Gewebe aufweisen.

Viele bekannte Chemotherapeutika haben auch eine ungenügende Wirkung zur Verhinderung der Metastasenbildung. Dies sind die Hauptgründe, daß Krebs bis jetzt schwer behandelbar ist und in den meisten Fällen zum Tod der Patienten führt.

Die Tatsache, daß Krebsgewebe im extrazellulären Milieu einen erniedrigten pH von etwa 6.5 – 7.0 aufweist (der pH kann an der Krebszell-Oberfläche bis auf 5.0 abfallen), während der pH im Normalgewebe und im Blut etwa 7.2 – 7.5 beträgt, ist bekannt und beschrieben, z.B. in DE-A 4407 484 und in Tumor Biolog., 1994, 15, 104-310. Jeder Tumortyp zeigt einen intrinsischen mittleren interzellulären pH, der z.B. im Falle des Brust-Tumors etwa 6.7 und im Falle des Colon-Tumors 6.9 beträgt.

In den oben erwähnten Publikationen wird ausgeführt, daß auf Grund des abgesenkten extrazellulären pH Milieus in Tumoren die natürliche Immunabwehr blockiert wird, da die natürlichen Abwehrzellen ihre volle Cytotoxizität nur im basischen Milieu, d.h. bei > pH 7 entfalten. In DE-A 4407 484 wird daher vorgeschlagen, das saure extrazelluläre Milieu von Krebszellen auf den normalen physiologischen pH von 7 – 7.5 zu bringen und dadurch die Krebszellen durch die natürliche Immunabwehr zu kontrollieren. Zu diesem Zweck wird das extrazelluläre Krebszellmilieu entweder durch künstliche Alkalisierung oder durch Verhinderung der Ansäuerung auf den physiologischen pH gebracht.

Die Medikamente, die in DE-A 4407 484 beschrieben werden, bedeuten einen Fortschritt in der Krebstherapie, aber es wäre wünschenswert, Medikamente zur Verfügung zu haben, die neben der körpereigenen Immunabwehr selektiv Tumorzellen angreifen, und auf diese Weise Chemotherapeutika zu besitzen mit wenig Nebenwirkungen.

In WO 96/30003 wird vorgeschlagen, solche Verbindungen für die Tumorbekämpfung einzusetzen, die bei einem pH niedriger als 7 protoniert werden oder eine Substanz freisetzen, die protoniert wird. Die protonierte Verbindung oder freigesetzte protonierte Substanz soll einen stärkeren destruktiven Effekt auf die Krebszellen haben als die unprotonierten. WO 96/30003 schließt auch Kombinationen von 2 oder mehreren Verbindungen ein. Diese Verbindungen zeigen schon einen guten anti-Tumoreffekt, aber es sind Medikamente erforderlich mit exzellenter anti-Tumorwirkung bei pH Werten niedriger als 7, insbesondere im Bereich 6.5 bis 7.0.

In WO 98/58639 werden synergistische Kombinationen für die selektive Bekämpfung von Tumorgewebe vorgeschlagen. Die synergistischen Mischungen umfassen zumindest 2 verschiedene Benzoesäure Derivate einer Liste, zu der auch Diflunisal = 5-(2,4-Difluorophenyl) salicylsäure gehört, bekannt als Diflunisal. Gemäß WO 98/58639 wird Diflunisal nur wirksam, wenn es mit einer anderen Verbindung eine synergistische Wirkmischung bildet.

Trotz der hohen anti-Tumorwirkung der synergistischen Kombinationen, die in WO 98/58639 vorgestellt werden, besteht doch der Bedarf für andere Medikamente mit exzellenter anti-Tumor Wirkung, besonders bei pH-Werten unter 7.0, insbesondere im pH-Bereich 6.5 – 7.0.

Unerwartenderweise zeigt Diflunisal auch allein eine sehr gute anti-Krebswirkung ohne die Mitwirkung einer zweiten aktiven Substanz wie z.B. Benzoesäure Derivate, wie in WO 98/58639 dargelegt. Die vorliegende Erfindung stellt daher Diflunisal zur Herstellung eines Krebs-Medikamentes zur Verfügung, wobei Diflunisal nicht als Bestandteil eines Mittels vorliegt, das aus Diflunisal und einer zweiten aktiven Komponente besteht. Überraschenderweise kann Diflunisal als alleiniger Wirkstoff in der Krebstherapie verwendet werden, und es ist nicht notwendig es als Teil einer Kombinationstherapie mit anderen Wirkstoffen, wie anderen Benzoesäurederivaten, einzusetzen, wie es in der WO 98/58633 beschrieben ist.

Obwohl Diflunisal für sich allein schon genügende Aktivität zeigt, ohne Co-Verabreichung anderer pharmazeutisch aktiver Substanzen, ist es natürlich auch möglich, Diflunisal mit anderen aktiven Substanzen zu kombinieren, wenn Diflunisal in einer Art und Weise verabreicht wird, daß eine bestimmte interstitielle Konzentration erreicht wird, und daher stellt die vorgelegte Erfindung ebenfalls die Verwendung von Diflunisal zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs zur Verfügung, wobei das Medikament für die Verabreichung so angepaßt wird, daß ein interstitielles molekulares Verhältnis von Diflunisal zu Albumin von 4:1 bis 6:1 eingestellt wird.

Diflunisal (5-[2,4-difluorophenyl] salicylsäure) weist zwei außergewöhnliche Eigenschaften auf, die für die Krebstherapie von grundsätzlichem Interesse sind:

  • 1. induziert es pH-abhängig Apoptose in Laktat-transportierenden Zellen und
  • 2. verursacht es pH-abhängige Porenbildung in Krebszellen.

Porenbildung bedeutet, daß die Krebszellmembran „durchlässig" wird, was zum Kollaps von Konzentrationsgradienten führt und dadurch konsequenterweise zum Zelltod.

Es wurde gefunden, daß der pH-Bereich, in dem Apoptose durch Diflunisal induziert wird, abhängig ist von der eingesetzten Diflunisal-Konzentration. Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Diflunisal-Influx in die Krebszellen durch Albumin vermittelt wird und an den Laktat-Efflux gekoppelt ist, was bedeutet, daß Diflunisal-Influx als Antiport an Laktat-Efflux gekoppelt ist. Der Diflunisal-Antiport ist Konzentration- und pH-abhängig und wird durch die Albumin-Affinitätsstufen reguliert. Der Diflunisal-Antiport kann als akzellerierter Laktat-Efflux gemessen werden, wie es in den Beispielen gezeigt wird (3). Daher ist die Diflunisal-Konzentration, die für die Auslösung von Apoptose erforderlich ist, abhängig von der Albumin-Konzentration, die im interstitiellen Milieu vorliegt.

Normalerweise zeigt das interstitielle Milieu eine Albumin-Konzentration von 0.17 mM. Bis jetzt existieren in der medizinischen Literatur nur Schätzungen über interstitielle Albumin-Konzentrationen. Sie variieren von 25% bis 35% der Blut-Albumin-Konzentration, die 0.63 mM beträgt. Es wird daher vermutet, daß die interstitielle Albumin-Konzentration zwischen 0.16 bis 0.22 mM beträgt. Genaue Messungen sind nicht bekannt. Auf der Grundlage unserer experimentellen Ergebnisse sind wir jetzt in der Lage, eine genaue Bestimmung durchzuführen.

Wenn Diflunisal oral verabreicht wird, erfolgt die Resorption nicht beliebig sondern nur bis zu einem maximalen Betrag, der im Blut genau gemessen werden kann, nämlich bis zu einer maximalen Blutkonzentration von 250 &mgr;g/ml. Dies bedeutet, daß die Resorption Sättigungsverhalten zeigt. 250 &mgr;g/ml entspricht einer 1.00 mM Diflunisal-Lösung. Diese Sättigungskonzentration wird mit einer 50 mg/kg Diflunisal Dosis erreicht. Auch wenn 100 mg/kg Diflunisal verabreicht wird, wird 1.00 mM nicht überschritten. Da Diflunisal ein relativ kleines Molekül darstellt, ist zu erwarten, daß bei der Resorption von Diflunisal sich eine Gleichverteilung mit den flüssigen Systemen der Organe (Interstitium) und dem Blut einstellt, da keine nennenswerten Diffusionsbarrieren existieren. Dies bedeutet, daß im interstitiellen Milieu sich wie im Blut eine Konzentration von 1.00 mM Diflunisal einstellt.

Bindungsstudien von Diflunisal an Albumin haben ergeben, daß Albumin für Diflunisal 4 Affinitätsstufen aufweist, wobei jede Affinitätsstufe 3 Diflunisal-Moleküle binden kann. Experimente zur Reaktivität der 4 Affinitätsstufen zeigen, daß die niedrigste Affinitätsstufe mit 3 gebundenen Diflunisal keine Aktivität zeigt (vergl. 4), dagegen die zweite Affinitätsstufe mit insgesamt 6 gebundenen Diflunisal hohe Aktivität.

Um das Sättigungsverhalten von Diflunisal zu erklären, muß Albumin mit 6 Diflunisal ausgestattet sein. Wenn 6 Diflunisal gebunden sind, bedeutet dies bei einer Sättigungskonzentration von 1.00 mM Diflunisal, daß die Albumin-Konzentration 1.00/6 = 0.17 mM beträgt.

Dieser Wert liegt im Rahmen der Abschätzungen, die in der Vergangenheit gemacht wurden. Es ist ein großer Vorteil, daß die vorliegende Erfindung die Bestimmung der Albumin-Konzentration erlaubt, ohne das genaue Verteilungsvolumen zu kennen.

Es konnte ermittelt werden, daß maximal 12 Moleküle Diflunisal an 1 Molekül Albumin gebunden werden können. Dieser Bindungszustand wird durch 4 Affinitätsstufen realisiert (offensichtlich bedingt durch 12 verschiedene pK-Werte), jede von ihnen besetzt mit 3 Diflunisal und ausgestattet mit ähnlichen Affinitäten.

Überraschenderweise erfolgt aus der ersten Affinitätsstufe mit nur 3 gebundenen Diflunisal-Molekülen kein Antiport, jedoch wird mit 4 – 6 gebundenen Diflunisal, d.h. aus der zweiten Affinitätsstufe, effektiv Apoptose ausgelöst und zwar bei pH 6.0 – 7.2. Wenn 7 – 9 Moleküle Diflunisal an Albumin gebunden sind (3. Affinitätsstufe) wird Apoptose bei pH 7.0 – 7.4 ausgelöst mit einem exakten Start-pH bei 7.0. Dies wurde an Beispielen dieser Erfindung gezeigt und kann z.B. aus 1 entnommen werden.

Für Therapiezwecke ist Apoptose-Induktion bei pH 7.0–7.4 nicht akzeptabel. In diesem pH-Bereich könnte auch Normalgewebe, das auch Laktat-Transport auf einem niedrigeren Level durchführen kann, geschädigt werden. Um diese nicht tolerierbare Nebenwirkungen zu vermeiden, muß bei Diflunisal-Therapien garantiert sein, daß Diflunisal nur aus der 2. Affinitätsstufe, d.h. mit 4 – 6 gebundenen Diflunisal pro Albumin wirkt.

Bei oraler Verabreichung ist das Risiko, daß die interstitielle Diflunisal-Konzentration 1.0 mM übersteigt, bei den meisten Patienten sehr gering. Bei größeren Diflunisal-Dosierungen können aber Probleme im gastro-intestinalen Trakt auftreten, so daß ein Interesse besteht, die orale Dosis von Diflunisal so niedrig wie möglich zu halten, ohne Wirkung einzubüßen.

Es ist jedoch herausragendes und bemerkenswertes Merkmal von Diflunisal, daß bei ausschließlich oraler Verabreichung aufgrund des vorstehend erläuterten Resorptionsverhaltens keine Überdosierung auftreten kann. Daher könnte die Therapie im Prinzip selbst mit einer einzelnen hohen Depotdosis erfolgen, was für die meisten Patienten allerdings nicht akzeptabel ist.

Ferner ist die Aktivität der Atmungskette der Krebszellen von Bedeutung für die Effektivität der Therapie. Die Aktivität der mitochondrialen Atmungskette ist ein sensitiver Indikator für Zell-Tod oder Zell-Vitalität. Bei einer Diflunisal-Konzentration, die 3 gebundenen Diflunisal pro Albumin entspricht, wird keine substantielle Blockierung der Atmungskette beobachtet. Die Abweichung vom Verlauf der Atmungs-Kontrollmessung (die die pH-Abhängigkeit der Atmungskette ohne Diflunisal-Einwirkung darstellt) ist vernachlässigbar. Wenn jedoch die Diflunisal-Konzentration geändert wird, so daß sie 4 gebundene Diflunisal pro Albumin bewirkt (Übergang von der 1. zur 2. Affinitätsstufe), wird der Einfluß auf die Atmungskette signifikant. Wenn die Diflunisal-Konzentration weiter angehoben wird, so daß 6 Diflunisal pro Albumin gebunden werden, erreicht die Atmungskette-Blockade ein Optimum bis pH 6.9. Die Wirkung nimmt dann ab und verschwindet bei pH 7.2. Bei einer weiteren Erhöhung von Diflunisal, die 7 – 9 gebundenen Diflunisal entspricht, überlagert die 3. Affinitätsstufe einen Apoptose-Effekt zwischen pH 7.0 – 7.4. Auch aus der 4. Affinitätsstufe treten in diesem Bereich Apoptose-Effekte auf mit bis zu 11 gebundenen Diflunisal Molekülen pro Albumin. Dies wurde in den Beispielen dieser Erfindung gezeigt und kann z.B. aus 4 entnommen werden.

Außerdem wurden Experimente zu den Porenbildungs-Eigenschaften von Diflunisal durchgeführt. Es wurde gefunden, daß die Porenbildung erst bei hohen Konzentrationen einsetzt, bei denen Diflunisal Apoptose im pH-Bereich 7.0 – 7.4 verursacht, so daß Porenbildung ohne Nebenwirkungen nicht erzielt werden kann. Dieses Problem kann gelöst werden, wenn Diflunisal in Form einer synergistischen Mischung mit anderen Benzoesäurederivaten verwendet wird, wie es in der WO 98/58639 offenbart ist.

Die vorliegende Erfindung stellt daher eine effektive, hoch selektive, pH-abhängige Krebstherapie dar, wie vorstehend beschrieben. Ein besonderer Vorteil dieser Erfindung ist, daß sie nicht eingeschränkt ist auf die Behandlung gewisser Tumore, sondern auf alle Arten von Tumoren und Metastasen anwendbar ist.

Diflunisal sollte bei Patienten in einer derartigen Menge verabreicht werden, daß die Zahl der Diflunisal -Moleküle, die an Albumin gebunden sind, 4 – 6 beträgt, was bedeutet, daß im interstitiellen Milieu das molekulare Verhältnis von Diflunisal zu Albumin von 4:1 bis 6:1 reicht. (Es wird voraus-gesetzt, daß sich eine statistische Verteilung der Diflunisal-Moleküle am interstitiellen Albumin einstellt, was aber die Aktivität des Diflunisals nicht beeinträchtigt). Es sollte daher ein Medikament so angepaßt werden, daß es dieses Verhältnis Diflunisal zu Albumin zur Verfügung stellt.

Die normale interstitielle Albumin-Konzentration beträgt 0.17 mM und kann von Organ zu Organ leicht variieren. Daraus folgt, daß die interstitielle Diflunisal-Konzentration nicht 1.1 mM überschreiten sollte, bzw. besser nicht höher als 1.0 mM sein sollte.

Die interstitielle Diflunisal-Konzentration sollte jedoch nicht unter 0.55 mM abfallen, besser nicht unter 0.7 mM, noch besser nicht unter 0.8 oder 0.9 mM. Daher sollte gemäß der vorliegenden Erfindung einem Patienten soviel Diflunisal verabreicht werden, daß die interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.55 mM – 1.1 mM reicht, besser von 0.7 mM bis 1.1 mM oder noch besser von 0.7 – 1.0 mM, z.B. 0.8 mM oder 1.0 mM. Die vorliegende Erfindung liefert auch Medikamente, die die oben angeführten Diflunisal-Konzentration zur Verfügung stellen.

Eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 1.1 mM entspricht einer oralen Dosis (basierend auf dem Gewicht des Patienten) von ca. 55 mg/kg, eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 1.0 mM entspricht einer oralen Dosis von ca. 50 mg/kg, eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.55 mM entspricht einer oralen Dosis von ca. 27.5 mg/kg, eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.7 mM entspricht einer oralen Dosis von ca. 35 mg/kg, eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.8 mM entspricht einer oralen Dosis von ca. 40 mg/kg und eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.9 mM entspricht einer oralen Dosis von ca. 45 mg/kg. Die angegebenen Werte basieren auf einem weiblichen Patienten mit 65 ml Blut/kg Körpergewicht, im Falle von männlichen Patienten mit 77 ml Blut/kg Körpergewicht muß die Dosis um ca. 18% erhöht werden. Ein Fachmann kann leicht die passende individuelle Dosis für einen Patienten auf Grund der oben gegebenen Information ermitteln.

Es ist wichtig, daß während einer Behandlung das Verhältnis von interstitieller Diflunisal-Konzentration zu interstitieller Albumin-Konzentration von 6:1 nicht überschritten wird. Diflunisal sollte daher nur in solchen Mengen verabreicht werden, die erforderlich sind, um Diflunisal zu ersetzen, das aus dem interstitiellen Milieu verschwunden ist z.B. durch Metabolisierung oder durch Ausscheidung und durch Wirkung.

Die Diflunisal-Verabreichung sollte sicherstellen, daß die gewünschte interstitielle Diflunisal-Konzentration während der Behandlung aufrechterhalten wird, und entsprechend sollte das Medikament angepaßt sein. Bei einem angemessenem Behandlungsschema sollte zu Beginn eine hohe Dosis verabreicht werden, gefolgt von niedrigen Dosen, um ein steady-state Niveau von interstitiellem Diflunisal aufrechtzuerhalten. Eine angemessene Anfangsdosis ist vorzugsweise 30 mg/kg p.o. bis 40 mg/kg p.o., z.B. ca. 35 mg/kg p.o. und nach 12 Stunden kann eine weitere Dosis von vorzugsweise 25 mg/kg p.o. bis 35 mg/kg p.o., z.B. ca. 30 mg/kg p.o. verabreicht werden und dann alle 12 Stunden 20 mg/kg p.o. bis 30 mg/kg p.o., z.B. ca. 25 mg/kg p.o.

Bevorzugt wird folgendes Dosierungsschema:

  • a. Einem Patienten wird eine Initialdosis von 25 bis 45 mg/kg Körpergewicht verabreicht
  • b. Einem Patienten wird 12 Stunden nach der Initialdosis eine weitere Dosis Diflunisal von 20 bis 40 mg/kg verabreicht
  • c. Etwa 3 Stunden nach der zweiten Dosis wird eine dritte Dosis Difunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg Körpergewicht verabreicht
  • d. Etwa 3 Stunden nach der dritten Dosis wird eine vierte Dosis Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg Körpergewicht verabreicht
  • e. Etwa 3 Stunden nach der vierten Dosis wird dem Patienten eine fünfte Dosis Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg verabreicht
  • f. Etwa 3 Stunden nach der fünften Dosis wird dem Patienten eine sechste Dosis Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg verabreicht
  • g. 12 Stunden nach der sechsten Dosierung wird der Zyklus bei Stufe b von neuem begonnen.

Eine Variante dieses Schemas könnte sein, daß bei Stufe d. die Dosierung auf 8 bis 16 mg/kg angehoben wird und dafür Stufe f. gestrichen wird.

Das meist bevorzugte Dosierungsschema ist folgendes (für einen weiblichen Patienten mit 65 ml Blut pro kg Körpergewicht, für andere Patienten kann dieses Dosierungsschema, wenn erforderlich, angepaßt werden):

Natürlich sind auch andere Dosierungsschemata möglich, wenn sichergestellt ist, daß die interstitielle Diflunisal Konzentration der oben angeführten entspricht. Mit der Information, die durch dieses Therapie-Schema gegeben wird, kann ein Fachmann leicht entsprechend geänderte Dosierungs-Schemata finden, die eine erforderliche Diflunisal-Konzentration sicherstellen. Anstelle der oben angeführten 3 Stunden-Intervalle können auch 4 Stunden, 5 Stunden oder 6 Stunden Intervalle eingesetzt werden, oder auch 12 Stunden Intervalle sind möglich, wobei die Dosierung an die vorgegebene Intervalle angepaßt werden muß. Die Dosierung für jedes Intervall kann bezogen auf jeden Patienten und insbesondere auf die Blutmenge pro Körpergewicht jedes Patienten angepaßt werden, wie oben dargelegt wurde. Solche Variationen und Anpassungen liegen im Bereich des Kenntnisstandes eines Fachmanns.

Die Art des oralen Medikaments, das gemäß der Erfindung verwendet wird, wird nicht besonders eingeschränkt, solange es an das oben angeführte Dosierungsschema angepaßt ist.

Eine bevorzugte Möglichkeit der Diflunisal Verabreichung ist oral wie oben ausgeführt. Eine weitere bevorzugte Möglichkeit der Diflunisal-Verabreichung ist parenteral, insbesondere intravenös. Wie bei der oralen Verabreichung erfolgt auch die parenterale Verabreichung bevorzugt in Intervallen. Angemessene Dosen von Diflunisal sind solche, die oben erwähnte Diflunisal-Konzentrationen gewährleisten und die durch einen Fachmann auf der Grundlage der gegebenen Informationen und seines allgemeinen technischen Wissens bestimmt werden können.

Eine angemessene initiale parenterale Dosis, insbesondere intravenöse Dosis, für die Verabreichung ist 30 mg/kg i.v. bis 40 mg/kg i.v., z.B. 35 mg/kg i.v., gefolgt nach 12 Stunden von einer Dosis von 25 mg/kg i.v. bis 35 mg/kg i.v., z.B. 30 mg/kg i.v., gefolgt nach 12 Stunden von einer Dosis von 25 mg/kg i.v. bis 35 mg/kg i.v., z.B. 30 mg/kg i.v.. Diese Dosis wird alle 12 Stunden verabreicht.

Nach der vorliegenden Erfindung kann eine bevorzugte Behandlung mit Diflunisal auch als Kombination von oraler und parenteraler Anwendung erfolgen.

Ein angemessenes kombiniertes Dosierungsschema mit oraler und parenteraler Anwendung ist eine initiale Dosis von 30 bis 40 mg/kg p.o., z.B. 35 mg/kg p.o., gefolgt nach 12 Stunden von einer Dosis von 25 bis 35 mg/kg p.o., z.B. ca. 30 mg/kg p.o., und zusätzlich einer Dosis von 25 bis 35 mg/kg i.v., z.B. ca. 30 mg/kg i.v., und dann alle 24 Stunden einer Dosis von 25 bis 35 mg/kg p.o., z.B. 30 mg/kg p.o., und zusätzlich einer Dosis von 20 bis 30 mg/kg i.v., z.B. 25 mg/kg i.v.

Andere angemessene Dosierungsschemata können auf der Basis der vorstehend gegebenen Information durch einen Fachmann leicht gefunden werden, wenn berücksichtigt wird, daß gemäß der vorliegenden Erfindung die interstitiale Diflunisal-Konzentration im Verhältnis zu Albumin ein molekulares Verhältnis von 4:1 bis 6:1 aufweisen muß.

Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können in bekannter Weise für Medikamente für Säugetiere, bevorzugt Menschen, formuliert werden. Im Medikament sind gemäß der Erfindung die Zusammensetzungen als Mischung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen organischen oder anorganischen Exzipienten vorhanden, die für die enterale oder parenterale Verabreichung geeignet sind. Gemäß der Erfindung werden für die orale Verabreichung der Mittel Tabletten, Kapseln, Pulver oder in flüssiger Form, z.B. als Suspension, Lösung, Emulsion oder Sirup bevorzugt.

Für die Formulierung von Tabletten werden übliche pharmazeutische Exzipienten wie Natrium-Citrat, Lactose, mikrokristalline Cellulose und Stärke, Schmiermittel wie unhydratisiertes Siliziumdioxyd, hydrogeniertes Castoröl, Magnesium Stearat, Natrium-Laurylsulfat und Talcum, ferner Bindungsmittel wie Stärke, Glukose, Lactose, Gummi arabicum, Mannitol, Magnesium Trisilikat und ähnliches benutzt. Wenn die Zusammensetzung in flüssiger Form verabreicht werden soll, können die üblichen Exzipienten für Flüssig-Formulierungen benutzt werden.

Eine Formulierung für Injektionen und Infusionen ist ebenfalls bevorzugt und kann gemäß der Anleitungen in relevanten Textbüchern hergestellt werden.

Das Medikament kann bevorzugt auch als Depot-Formulierungen hergestellt werden, die die aktive Komponente d.h. das Diflunisal freisetzen und zwar gemäß dem vorstehenden Dosis-Schema. Die Herstellung solcher Depot-Formulierungen oder Präparate mit hinhaltender oder verzögernder Freisetzung sind einem Fachmann gut bekannt.

Wenn diese Art der Therapie über mehrere Tage fortgesetzt wird, werden die Lactattransportierenden Krebszellen nach und nach getötet und das extrazelluläre Tumor-Milieu wird mehr und mehr basisch. Jene Krebszellen, die überleben, werden dann in einem basischen Milieu atmen. In diesem Zusammenhang ist eine Arbeit von Möller, B., Fischer, B., Kreutz, W.: Immunology, 2000, 99, 375–384, interessant, in der gezeigt wird, daß nur Krebszellen, die in einem basischen Milieu proliferieren vom natürlichen Immunsystem angegriffen werden können, und daß diejenigen Krebszellen, die im sauren Milieu proliferieren, überleben. Dies bedeutet, wenn die vorgeschlagene Therapie über mehrere Tage fortgesetzt wird, sollte nach mehr als 6 Tage der Immuninduktionszeit das natürliche Immunsystem beginnen, die alkalische Tumorfraktion zu töten. Bei Fortsetzung der Therapie sollte im Endeffekt der Tumor in Totalremission gehen.

Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Experimente erklärt, die jedoch nicht den Umfang der Erfindung einschränken sollen.

Die Ergebnisse der Experimente sind in den Figuren dargestellt.

1: 1 stellt Apoptose Messungen mit einer Harnblasen-Krebszell-Linie RT 112 dar. Aufgetragen ist das Ausmaß der produzierten DNA-Fragmente (Nukleosomen und Oligonukleosomen) von getöteten Krebszellen in Abhängigkeit von pH und der Diflunisal-Konzentration. Die Albumin-Konzentration beträgt bei allen Messungen 0.06 mM. Neben der Kontroll-Messung ohne Diflunisal wurde eine „Positiv-Kontrolle"(CAM) mit einem kalibrierten definierten System gemessen.

2: 2 stellt die Porenbildung unter interstitiellen Albumin-Bedingungen von 0.2 mM dar. Aufgetragen ist der Prozentsatz PJ-gefärbter toter Zellen in Abhängigkeit von pH und Diflunisal-Konzentration. Die Fraktion toter Zellen im Vergleich zu der Gesamtzahl der Zellen wird in einem Fluß-Cytometer gemessen. Die Experimente wurden mit der Leukämie-Zell-Linie K-562 durchgeführt. Von besonderem Interesse ist die Porenbildung, die aus der 3. Affinitätsstufe von Albumin induziert wird und bei pH 5 7.0 erfolgt, wenn 1.25 mM bis 1.5 mM Diflunisal eingesetzt wird. Von geringerem Interesse ist die zweite Porenbildung, die bei pH 6.4 einsetzt und die jenseits des Säuremilieus der meisten Tumore liegt. Bei einer Konzentration von 1.0 mM Diflunisal besteht eine Übergangssituation, wo beide Transportsysteme überlagert sind. Nicht gezeigt in dieser Abbildung ist ein drittes Porenbildungssystem, das bei pH 7.2 – 7.3 einsetzt und aus der vierten Affinitätsstufe von Albumin transferiert wird.

3: 3 zeigt die Messung des Lactat-Transports an einer Harnblasen-Krebszell-Linie RT 112. Aufgetragen ist eine Kontroll-Messung, die die pH-Abhängigkeit des Lactat-Effluxes ohne Diflunisal Einwirkung zeigt. Durch die Diflunisal Einwirkung wird der Lactat-Efflux bemerkenswert verstärkt zwischen pH 6.0 und 7.2. Dies weist auf einen Diflunisal-Influx (Antiport) in die Krebszellen hin, der als Konsequenz zur Auslösung von Apoptose in diesem pH-Bereich führt.

4: 4 zeigt den indirekten Nachweis von Apoptose-Wirkung anhand der Messung der Aktivität der mitochondrialen Atmungskette. Bei interstitiellen Albumin-Bedingungen von 0.2 mM wird demonstriert, daß bei 1.0 mM Diflunisal ab pH 7.2 eine Abweichung von der normalen Atmungsketten-Aktivität (Kontrolle) einsetzt und eine maximale Abweichung bei pH 6.9 erreicht. Dies bedeutet, daß die Inhibition der Atmungsketten-Aktivität bei pH 7.2 beginnt und total eliminiert ist bei pH ≤ 6.9. Dieses Verhalten spiegelt die Apoptose-Induktion wieder, die durch die zweite Affinitätsstufe von Albumin vermittelt wird. Wird die Diflunisal-Konzentration über 1.0 mM erhöht, so wird auch Atmungsaktivität zwischen pH 7.0 bis 7.4 reduziert und verschwindet ganz bei 1.5 mM Diflunisal. Derselbe Effekt erfolgt auch, wenn die Konzentration bis 2.0 mM erhöht wird. Dieser Effekt wird durch Apoptose-Auslösung bei pH 7.0–7.4 bewirkt, die durch die 3. und 4. Affinitätsstufe des Albumins vermittelt wird. Die Kontroll-Messung stellt die Atmungsketten-Aktivität in Abhängigkeit vom pH ohne Diflunisal-Einwirkung dar.

Allgemeines

Die humane Harnblasen-Krebszell-Linie RT 112 oder die humane chronisch myeloische Leukämie-Zell-Linie K-562 wurde gekauft vom DKFZ, Tumorzell- und Datenbank (Institut für experimentelle Pathologie, Heidelberg, Deutschland) oder von DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland), und ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (beziehbar von der Fa. Biochrom, Berlin, Deutschland), 1% NEAE (Biochrom), 10% hitze-inaktiviertes fetales Kälber-Serum (Biochrom), 100 U/ml Penicillin und 50 &mgr;g/ml Streptomycin (Biochrom) bei 37°C und 5% CO2. Es wurden nur Mycoplasma freie Zell-Kulturen verwendet. Dies wurde häufig getestet mit Hilfe eines spezifischen Nachweis-Kits von Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland.

Apoptose

Apoptose wurde nachgewiesen durch Bestimmung von cytoplasmatischen Histon-assoziierten DNA-Fragmenten (Mono- und Oligonucleosomen)nach induziertem Zelltod. Die qualitative und quantitative in vitro Bestimmung der Apoptose von RT 112 Tumorzellen wurde mit einem photometrischen Enzym Immunassay durchgeführt. Kurz gefaßt: RT 112 Zellen wurden geerntet, zweimal gewaschen und resuspendiert in einem Kultur-Medium, so daß eine Zelldichte von 2.5 × 105/ml eingestellt wurde. Je 100 &mgr;l/Well der RT 112 Zell-Suspension wurden verteilt in 96 Well microtiter Platten (erhältlich von Becton Dickinson) und über Nacht inkubiert bei 37°C und 5% CO2. Der Überstand wurde ersetzt durch 90 &mgr;l pH-justiertem Kulturmedium (pH 6.0 – 7.4) und 10 &mgr;l der vorgesehenen Substanzen oder 100 &mgr;l/Well pH justiertem Kulturmedium allein im Falle der Kontrolle. Dann wurden die Zellen wieder inkubiert für verschiedene Zeitabstände bei 37°C und 5% CO2. Die Überstände der Test-Kulturen wurden verworfen und die RT 112 Zellen wurden lysiert mit Lysierungspuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Zytoplasma Fraktion wurde überführt in eine Streptomycin-coated Mikrotiter-Platte, und das Elisa-Verfahren wurde gemäß der Hersteller-Anleitung durchgeführt (Boehringer Mannheim). Die Ergebnisse der Tests sind in 1 wiedergegeben.

Es ist daraus ersichtlich, daß Diflunisal in Lactat-transportierenden Zellen pH-abhängig Apoptose auslöst. Wenn 0.3 mM Diflunisal und 0.06 mM Albumin auf Harnblasen-Krebszellen (RT 112) einwirkt, wird Apoptose vorzugsweise über die 2. Affinitätsstufe von Albumin vermittelt, aber es existiert bereits auch ein Anteil aus der 3. Stufe. Wenn 0.5 mM Diflunisal eingesetzt wird, erfolgt die Apoptose hauptsächlich aus der 3. Affinitätsstufe und schließlich erfolgt bei 1 mM Diflunisal Apoptose ausschließlich aus der 3. Affinitätsstufe zwischen pH 7.0 bis 7.4.

Poren-Bildung

Poren-Bildung wird gemessen durch Bestimmung der Anzahl nekrotischer Zellen im Durchfluß-Cytometer. Kulturen der Leukämie-Zell-Linie K-562 wurden geerntet und jeweils 5 × 105 Zellen überführt in 6 ml-Tuben (BD). Nach Zentrifugation (250 × g, 5 Minuten, Raumtemperatur: 25°C) wurden die Zellen resuspendiert in 900 &mgr;l pH-eingestelltem Kultur-Medium (pH 6.0 – 7.4, RPMI 1640 ohne NHCO3, erhältlich bei SIGMA). Dann wurden die Test-Substanzen hinzugefügt und die Zellen wurden inkubiert in einem Endvolumen von 1 ml bei 37°C im Wasserbad. Nach der Inkubationsperiode wurde der pH der Proben gemessen, die Zellen gewaschen und resuspendiert in 300 &mgr;l FACS-Medium (PBS + 2% FCS und 0.1% NaN3). Die Zellen wurden angefärbt mit Propidium Jodid (PJ, erhältlich bei SIGMA, 25 &mgr;l/25 &mgr;g/tube) für 15 Minuten bei 25°C (RT). Danach wurden die gefärbten Zellen analysiert mit einem EPICS XL-ML Durchfluß-Cytometer (erhältlich bei COULTER, Krefeld, Deutschland), das mit einem 15 mW Argon-Laser mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm ausgestattet ist. Die PJ-Fluoreszenz wurde im roten Kanal gemessen. (FL3, 620 nm Langpaß-Filter). Die Daten-Erfassung und Analyse wurde mit der XL System II-Software (erhältlich von der Fa. COULTER) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.

Es kann entnommen werden, daß Diflunisal pH-abhängige Poren-Bildung in Krebszellen verursacht. Aus 2 geht hervor, daß Poren-Bildung in einem Therapie relevanten pH-Bereich bei einer interstitiellen Diflunisal-Konzentration von > 1.25 mM stattfindet.

Lactat-Transport

Der Lactat-Transport wurde bestimmt durch quantitative enzymatische Messung des Lactats in Überständen von RT 112 Zellen bei 340 nm. RT 112 wurden geerntet, zweimal gewaschen und resuspendiert im Kultur-Medium, so daß eine Zelldichte von 2 × 105/ml erreicht wurde. Je 500 &mgr;l/Well der RT 112 Zell-Suspension wurden verteilt in 24 Well microtiter Platten (BD) und über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Der Überstand wurde ersetzt durch 450 &mgr;l pH-kalibriertes Kulturmedium (pH 6.0 – 7.4) und 50 &mgr;l der zu prüfenden Substanz oder, im Falle der Kontrolle, durch 500 &mgr;l/Well pH-kalibriertes Kulturmedium allein. Die Zellen wurden nochmal für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Messung des Lactats in den Überständen erfolgte bei 340 nm (PERKIN-ELMER, Lambda 17, UV-VIS-Spektrometer, Überlingen, Deutschland) und ausgewertet gemäß der Hersteller-Anleitung (SIGMA DIAGNOSTICS, Deisenhofen, Deutschland): Quantitative, Enzymatic Determination of Lactate in Whole Blood at 340 nm [Procedure No. 826-UV]). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 3 wiedergegeben.

3 zeigt, daß Diflunisal-Influx in die Krebszelle durch Albumin vermittelt ist und gekoppelt ist an Lactat-Efflux, was bedeutet, daß Diflunisal-Influx als Antiport zum Lactat-Efflux gekoppelt ist. Es geht hervor, daß bei 3 gebundenen Diflunisal an Albumin, die die erste Affinitätsstufe besetzen, kein Antiport stattfindet, während mit 4 bis 6 gebundenen Diflunisal, d.h. aus der 2. Affinitätsstufe effektiv Apoptose bei pH 6.0 – 7.2 durchgeführt wird.

Atmung

Die mitochondriale Atmungsketten-Aktivität von RT 112-Zellen wurde mit einem kolorimetrischen Assay durchgeführt (XTT-Assay).

Das nicht-radioaktive, kolorimetrische Assay-System mit Anwendung von XTT (Natrium 3-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzol sulfonic acid hydrate) (BOEHRINGER Mannheim) wurde verwendet, um den Einfluß zytotoxischer Moleküle auf die mitochondriale Atmungsaktivität humaner Tumorzellen zu messen. Das mitochondriale Succinct-tetrazolium-Reduktase-System spaltet das Tetrazolium Salz XTT zu Formazan. Der Betrag dieses Farbstoffes ist direkt korreliert zu der Zahl metabolisch aktiver Zellen, da das Enzymsystem nur aktiv ist in atmenden und lebenden Zellen. Zu diesem Zweck werden RT 112-Zellen geerntet, zweimal gewaschen und resuspendiert im Kultur-Medium, so daß eine Dichte von 2.5 × 105/ml erzielt wurde. Je 100 &mgr;l/Well der RT 112 Zell-Suspension wurden auf 96 Well microtiter Platten verteilt (Becton Dickinson (BD), Heidelberg, Deutschland) und über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Überstände wurden ersetzt durch 90 &mgr;l pH-kalibriertes Kultur-Medium (pH 6.0 – 7.4) und 10 &mgr;l der zu prüfenden Substanzen oder, im Falle der Kontrolle, durch 100 &mgr;l pH-kalibriertes Kultur-Medium allein. Die Zellen wurden für verschiedene Zeitdistanzen bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal gewaschen und inkubiert in frischem pH-kalibriertem Kultur-Medium. Nach der Inkubationszeit wurde der pH von jedem Well mit einer hochsensitiven Mikroelektrode gemessen, bevor 50 &mgr;l der XTT-Labeling Mischung zugefügt wird. Danach werden die Zellen für weitere 4 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die spektrophotometrische Absorption der Proben wurde danach mit einem „microtiter plate reader" (ELISA) bei einer Wellenlänge von 490 mm (630 nm Referenzwellenlänge) gemessen. (DYNATECH, Denkendorf, Deutschland). Die Datenerfassung und Analyse wurde mit der BioLinx 2.1 Software von Dynatech ausgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 4 wiedergegeben.


Anspruch[de]
  1. Verwendung von Diflunisal für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs, wobei das Medikament für die Verabreichung so angepaßt ist, daß ein molekulares Verhältnis 4:1 bis 6:1 von interstitiellem Diflunisal zu interstitiellem Albumin zur Verfügung gestellt wird.
  2. Verwendung von Diflunisal für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs, wobei das Medikament für die Verabreichung so angepaßt ist, daß eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.55 bis 1.1 mM zur Verfügung gestellt wird.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Medikament für die Behandlung so angepaßt ist, daß eine interstitielle Diflunisal-Konzentration von 0.8 mM bis 1.0 mM zur Verfügung gestellt wird.
  4. Verwendung von Diflunisal für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs, wobei Diflunisal nicht als Bestandteil eine Mittels enthaltend Diflunisal und ein Benzoesäure-Derivat vorliegt.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament so angepaßt ist, daß es ein Dosierungsschema liefert, das beständig ein molekulares Verhältnis 4:1 bis 6:1 von interstitiellem Diflunisal zu interstitiellem Albumin aufrecht erhält.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Medikament so angepaßt ist, daß es eine hohe Anfangsdosis von Diflunisal und in der Folge niedrigere Dosierungen zur Verfügung stellt, so daß eine konstante interstitielle Diflunisal-Konzentration aufrecht erhalten wird.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Medikament, das Diflunisal enthält, für die orale Applikation vorgesehen ist und so angepaßt ist, daß das folgende Dosierungs-Regime zur Verfügung gestellt wird umfassend:

    a. Verabreichung an einen Patienten eine Anfangsdosis von 25 bis 45 mg/kg Körpergewicht p.o.

    b. Verabreichung an den Patienten etwa 12 Stunden nach der Anfangsdosis eine zweite Dosis von Diflunisal von 20 mg/kg bis 40 mg/kg Körpergewicht p.o.

    c. Verabreichung an den Patienten etwa 3 Stunden nach der zweiten Dosis eine dritte Dosis von Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg Körpergewicht p.o.

    d. Verabreichung an den Patienten etwa 3 Stunden nach der dritten Dosis eine vierte Dosis von Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg Körpergewicht p.o.

    e. Verabreichung an den Patienten etwa 3 Stunden nach der vierten Dosis eine fünfte Dosis von Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg Körpergewicht p.o.

    f. Verabreichung an den Patienten etwa 3 Stunden nach der fünften Dosis eine sechste Dosis von Diflunisal von 4 mg/kg bis 8 mg/kg Körpergewicht p.o.

    g. Wiederholung des Zyklus 12 Stunden nach der sechsten Dosis, beginnend mit obigem Schritt b.
  8. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Medikament für die parenterale Verabreichung vorgesehen ist und so angepaßt ist, daß es das folgende Dosierungs-Regime zur Verfügung stellt, umfassend:

    a. Verabreichung an einen Patienten eine Anfangsdosis von Diflunisal von 30 bis 40 mg/kg Körpergewicht i.v.

    b. Verabreichung an den Patienten etwa 12 Stunden nach der Anfangsdosis eine zweite Dosis von Diflunisal von 25 bis 35 mg/kg Körpergewicht i.v.

    c. Verabreichung an den Patienten etwa alle 12 Stunden eine weitere Dosis von Diflunisal von 25 bis 35 mg/kg Körpergewicht i.v.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Medikament, das Diflunisal enthält, so angepaßt ist, daß es teilweise oral und teilweise parenteral verabreicht werden kann, und das folgende Dosierungs-Regime zur Verfügung stellt, umfassend:

    a. Verabreichung an einen Patienten eine Anfangsdosis von Diflunisal von 30 bis 40 mg/kg Körpergewicht p.o.

    b. Verabreichung an den Patienten etwa 12 Stunden nach der Anfangsdosis eine zweite Dosis von Diflunisal von 25 mg/kg bis 35 mg/kg Körpergewicht p.o. und zusätzlich 25 bis 35 mg/kg Körpergewicht i.v.

    c. Verabreichung an den Patienten etwa 24 Stunden nach der zweiten Dosis eine dritte Dosis von Diflunisal von 25 mg/kg bis 35 mg/kg Körpergewicht p.o. und zusätzlich 20 bis 30 mg/kg Körpergewicht i.v.

    d. Verabreichung an den Patienten etwa alle 24 Stunden eine weitere Dosis Diflunisal von 25 mg/kg bis 35 mg/kg Körpergewicht p.o. und zusätzlich 20 bis 30 mg/kg Körpergewicht i.v.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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