Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von biochemischer Aktivität mit einer Nachweisreaktion, wobei die nachzuweisende biochemische Aktivität räumlich getrennt von der Nachweisreaktion verläuft. Die räumliche Trennung wird durch Lipidmembranen und Gap Junctions erreicht.

Dem Fachmann bekannt sind biologische Protein-Moleküle, sogenannte Connexine, welche bei der Kommunikation zwischen lebenden Zellen eine besondere Rolle spielen. Mittlerweile werden etwa fünfzehn verschiedene Connexine aufgrund ihrer Aminosäuresequenz unterschieden [1] [2]. Connexine kommen in allen Veriebraten vor und werden in der Regel mit Abkürzung wie z.B. Cx26 bezeichnet. Hierbei gibt die Zahl die chromatographische Größe der Connexine in kD an. Bekannt sind bislang Connexine mit einem Molekulargewicht zwischen 26 und 56 kD. Alternativ zu dieser Nomenklatur hat sich eine zweite durchgesetzt, die die Connexine anhand von Strukturmerkmalen in wenigstens 3 Klassen a, b und c einteilt und dann die entsprechenden Connexine in den einzelnen Klassen durchnummeriert.

In der Zellmembran lagern sich jeweils sechs Connexine zu einem Connexon zusammen. Ein Connexon ist eine ringförmige Struktur, die die Zellmembran durchquert und grundsätzlich in der Lage ist, einen sehr weiten, unspezifischen Ionenkanal oder eine wassergefüllte Pore zu bilden. Dabei sind diese Poren aber in der Regel geschlossen, solange sich das Connexon in der Membran einer einzelnen, gesunden Zelle befindet. Berühren sich jedoch zwei Zellen, die in ihrer Membran jeweils miteinander kompatible Connexone aufweisen, dann kommt es zwischen zwei Connexonen der gegenüberliegenden Zellen zur Bildung einer Gap Junction (oder auch elektrische Synapse bezeichnet), der nunmehr die beiden Membranen und den Abstand zwischen den Zellmembranen überbrückt. Die Bildung einer Gap Junction erfolgt bei Kontakt in der Regel in wenigen Minuten. Der ausgebildete Gap Junction Kanal ist eine Struktur aus in der Regel 12 identischen oder verschiedenen Connexinen, bzw. aus zwei Connexonen. Der Kanal besitzt eine ggf. verschließbare zentrale Pore mit einem Durchmesser von etwa 1,5 bis 2 nm. Der wesentliche Unterschied zu anderen Membrankanälen ist, das Gap Junction Kanäle zwei aneinanderliegende Zellmembranen durchziehen und damit nicht eine Verbindung zwischen dem Zellinneren mit dem Außenmedium, sondern eine Verbindung zwischen den intrazellulären Medien der beiden Zellen herstellen.

Dabei ermöglichen Gap Junction Kanäle anorganischen Ionen und kleinen wasserlöslichen Molekülen bis zu einer molekularen Masse von ca. 1000 Dalton den direkten Durchgang von dem Cytoplasma der einen Zelle ins Cytoplasma der anderen Zelle. Damit sind die zwei Zellen sowohl mechanisch, elektrisch als auch metabolisch verbunden. Gap Junction Kanäle gehören zu den epithelialen Zell-Zell-Verbindungen und finden sich in nahezu allen Epithelien und vielen anderen Gewebetypen. In der Regel sind viele Gap Junction Kanäle in Form von Feldern organisiert, wobei diese Strukturen dann als Gap Junction im eigentlichen Sinne bezeichnet werden.

Die Gap Junction Kanäle verbundener Zellen sind in der Regel geöffnet und die Connexine gestreckt. Erleidet eine Zelle einen massiven Calciumeinstrom von außen, etwa durch eine Verletzung, so wird die Verbindung zu benachbarten Zellen unterbrochen indem sich die Connexine allosterisch miteinander verwinden.

Connexine können verfügbar gemacht werden durch Aufreinigen von Zellmembranen aus Zellen, die Connexine enthalten, z. B. Augenlinse, Herzmuskel, glatte Muskulatur, oder Epithelzellen sowie durch gentechnische Expression der Connexine in Bakterien, Hefen oder anderen Zellen. Es ist weiter bekannt, dass Connexine durch Verbindung mit einem Marker, wie zum Beispiel einem fluoreszierenden Proteinfragment, versehen werden können so dass ihr Vorhandensein in einer Zellmembran mit einfachen optischen Verfahren nachweisbar wird [3].

Es sind dem Fachmann Verfahren bekannt, mit denen Connexone in künstliche Membranen oder andere zellfreie Systeme eingebaut werden können [4]. Diese Connexone und Gap Junctions weisen häufig noch die gleichen Eigenschaften – wie z.B. Porengröße, Ionenselektivität, elektrisches Verhalten – auf, wie in ihrer natürlichen Umgebung. Es ist bekannt, dass es auch zwischen zwei Connexonen, die in künstliche Membranen eingelagert sind, bei Kontakt der Membranflächen zur Ausbildung eines funktionsfähigen Gap Junction Kanals kommt [5].

Weiterhin ist bekannt, dass Invertebraten eine funktionell ähnliche Klasse von Membranproteinen aufweisen, die Innexine genannt werden [6]. Die hiermit gebildeten Kanäle besitzen allerdings eine größere Pore, die Molekülen bis zu einem Gewicht von 2000 Dalton den Durchgang ermöglicht. Innexine bilden auch Gap Junctions im Sinne der Erfindung.

Es ist weiterhin bekannt, dass auch in Pflanzen Verbindungen zwischen den Zellen vorkommen, die ähnliche Eigenschaften aufweisen wie Gap Junctions und die als Plasmodesmata bezeichnet werden. Diese überspannen ebenfalls die Zellzwischenwand benachbarter Zellen und ermöglichen ebenfalls einer begrenzten Anzahl von Ionen und kleiner Moleküle die Passage von Zelle zu Zelle. Im Gegensatz zu den Kanälen bei tierischen Lebewesen sind die Plasmodesmata jedoch von der Plasmamembran begrenzt. Auch diese Strukturen werden im Sinne der Erfindung unter dem Oberbegriff Gap Junction zusammengefasst.

Bekannt sind weiterhin zelluläre Assays, bei welchen eine bestimmte biochemische Aktivität, die innerhalb einer lebenden Zelle stattfinden, durch geeignete Nachweisreaktionen, welche ebenfalls innerhalb der Zelle stattfinden, nachgewiesen werden. Bekannt sind insbesondere Verfahren, in denen Reaktionsprodukte der biochemischen Aktivität innerhalb der Zelle mit Indikatormolekülen reagieren, welche dann ein leicht detektierbares Signal, z.B. ein Lichtsignal oder eine Farbänderung, hervorrufen. Ein häufig verwendetes Indikatormolekül ist z.B. das Aequorin [7].

Diesen zellulären Assays ist gemeinsam, dass sie auf die Verwendung von Indikatormolekülen beschränkt sind, die nicht toxisch auf die Zellen wirken und die innerhalb der lebenden Zelle ihre Aufgabe erfüllen können. Anderenfalls würden die Zellen durch die toxischen Indikatormoleküle bereits vor oder auch während des Assays so geschädigt, dass der eigentliche Test gar nicht mehr durchgeführt werden könnte.

Weiterhin ist bekannt, dass Ionenkanälen, Rezeptoren und andere Targetmoleküle in künstliche Lipidmembranen eingebaut werden, und dort durch geeignete Experimente funktionell untersucht werden können [8]. Interessant sind besonders jene Verfahren, die eine künstliche Lipidmembran durch ein geeignetes Substrat in der Weise zu stabilisieren, dass sie mechanisch fester, länger haltbar, und reproduzierbarer werden [9]. Als Substrate finden hier zum Beispiel Silicagele Verwendung, die ggf. zur Verbesserung der Stabilität und Fluidität der Membran mit einer polymeren Zwischenschicht versehen worden sind [10]. Auch können Bilayer auf dem Substrat mit geeigneten Kettenmolekülen stabilisiert werden ('tethered bilayers') [11].

Im Stand der Technik sind Verfahren enthalten, bei denen Targetmoleküle (z.B. Ionenkanäle, Rezeptoren, Enzyme, etc.) in eine auf einem sphärischen, festen Substrat immobilisierte Lipiddoppelschicht eingebracht werden. Die biochemische Aktivität dieser Targetmoleküle kann dann durch unterhalb der Lipiddoppelschicht befindliche Indikatormoleküle nachgewiesen werden [10]. Das zumeist feste Substrat ist beispielsweise ein Silica-Träger auf welchem eine Lipiddoppelschicht aus Lecitin aufgebracht ist. Eine solche Anordnung ist u.A. kommerziell erhältlich unter dem Handelsnamen Transil^® der Firma Nimbus Biotechnologie (Leipzig, Germany). Zum Nachweis der biochemischen Aktivität von Targetmolekülen (welche direkt in die Lipiddoppelschicht eingelagert sind) werden hierbei unterhalb der Lipiddoppelschicht immobilisierte Calcium-sensitive oder Phosphat-sensitive Farbstoffe verwendet.

Das vorstehend beschriebene Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass für die Untersuchung eines jeden Targetmoleküls die entsprechend beschichteten und mit dem Targetmolekül angereicherten Substrate hergestellt werden müssen. Außerdem kann nicht immer gewährleistet werden, dass die Targetmoleküle in dieser "künstlichen" Umgebung die gleichen biochemischen Aktivitäten entfaltet, wie in der "natürlichen" zellulären Umgebung.

Ausgehend von dem oben beschriebenen Stand der Technik stellt sich hier die technische Aufgabe, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, bei denen einerseits für zelluläre Assays nicht einsetzbare Indikatorsysteme (z.B. toxische Nachweisreagentien) angewendet werden können und andererseits die untersuchten Targetmoleküle in ihrer natürlichen zellulären Umgebung untersucht werden können.

Die technische Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass Vorrichtungen und Verfahren zur Anwendung kommen, bei denen die zu untersuchende biochemische Aktivität räumlich getrennt stattfindet von der die biochemische Aktivität nachweisenden Reaktion. Dadurch ist es möglich, dass z.B. toxische Nachweisreagentien für den Nachweis der biochemischen Aktivität verwendet werden können, während das Targetmolekül immer noch in seiner natürlichen zellulären Umgebung die nachzuweisende biochemische Aktivität entfaltet. Biochemische Aktivität und Nachweisreaktion sind räumlich entkoppelt.

Die räumliche Trennung wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass Orte, in denen die zu untersuchende biochemische Aktivität bzw. die Nachweisreaktion stattfindet, durch mindestens zwei Lipidmembranen getrennt sind. Die Lipidmembranen sind jeweils mit Connexinen oder Innexinen besetzt, sodass sich zwischen den Membranen Gap Junctions ausbilden, die einen Durchtritt von Molekülen oder anderen Signalen zwischen dem Ort der biochemischen Aktivität und dem Ort der Nachweisreaktion ermöglichen.

"Biochemische Aktivität", im Sinne der Erfindung, ist jedwede biochemische Aktivität, die in oder an oder an der Oberfläche von biologischen Systemen (z.B. Zellen) stattfindet, stattfinden kann oder durch das biologische System katalysiert werden kann. Biochemische Aktivitäten sind z.B. durch Proteine katalysierte chemische Reaktionen, Signaltransduktionsvorgänge oder Änderungen der physikalischen oder chemischen Zustandsgrößen (wie z.B. pH Wert, Ionenkonzentration, Metabolitkonzentrationen, etc.). Die Proteine, welche Targetmoleküle darstellen, können gelöst, z.B. frei in Cytoplasma, oder auch membrangebunden, z.B. an der Cytoplasmamembran oder an Organellen, vorliegen.

"Nachweisreaktionen", im Sinne der Erfindung, sind chemische oder biochemische Reaktionen, welche die biochemische Aktivität oder deren Auswirkungen nachweisen können bzw. detektierbar machen. Bevorzugte Nachweisreaktionen sind Farbreaktionen, Fluoreszenz- oder Lumineszenzerscheinungen oder auch komplexe biochemische Reaktionen, die den Nachweis der biochemischen Aktivität erlauben.

"Lipidmembranen", im Sinne der Erfindung, sind Lipidmembranen, wie sie dem Fachmann aus biologischen oder nicht-biologischen Systemen bekannt sind. Lipidmembranen enthalten bevorzugt eine Lipiddoppelschicht, welche den freien Durchtritt von hydrophilen Substanzen verhindert. Lipidmembranen im Sinne der Erfindung können Moleküle, z.B. Proteine, eingelagert haben. Lipidmembranen können sphärisch oder auch planar ausgeführt sein. Sie können insbesondere auch auf einer festen oder Gel-artigen Unterlage vorgesehen sein. Eine besondere Ausführungsform der Lipidmembran ist eine Lipidmembran aus Lecitin.

"Gap Junctions", im Sinne der Erfindung, sind Verbindungen zwischen zwei räumlichen Bereichen, die durch Lipidmembranen voneinander getrennt sind. Gap Junctions werden von Proteinen ausgebildet, welche die Lipidmembranen und den Zwischenraum zwischen den Membranen überspannen und so einen Durchgang für Stoffe und für Ladungsaustausch ermöglichen.

"Membrankörper", im Sinne der Erfindung, sind von einer Membran umschossene, mit einer Flüssigkeit gefüllte Volumenelemente. Erfindungsgemäße Membrankörper sind bevorzugt biologische Membrankörper, wie z.B. lebende Zellen. Dazu gehören Zellen, die aus lebendem Gewebe durch Dissoziation isoliert wurden (Primärkulturen). Dazu gehören ebenso Zellen, die als etablierte Zelllinien in Kultur gehalten werden, wie CHO-Zellen, HEK-Zellen, NIH3T3-Zellen, HeLa-Zellen aber auch transient transfizierte Zellen oder Primärzellen. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung sind außerdem künstlich erzeugte Membrankörper, bei welchen z.B. eine Lipiddoppelschicht ein begrenztes Volumen eines wässrigen Mediums einschließt (Vesikel). Diese Membrankörper enthalten dann vorzugsweise mindestens eine biologische Komponente, z.B. ein in der Lipiddoppelschicht eingelagertes Polypeptid, ein membranständiges Enzym, einen Ionenkanal oder einen G-Protein gekoppelten Rezeptor. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung können auch bakterielle Zellen, Pilzzellen oder Zellen anderer einzelliger oder mehrzelliger Organismen sein. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung sind, z.B. auch Protoplasten von Pilzzellen und Pflanzenzellen, die durch Entfernen außenliegender Zellwände oder ähnlicher Strukturen erzielt werden. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung sind weiterhin auch Membrankörper, die – wie z.B. Synaptosomen – durch Abspaltung oder Vereinigung aus den Membranen von lebenden Organismen erzeugt oder die durch die Vereinigung solcher Präparate mit synthetischen Lipidvesikeln erhalten worden sind.

"Farbstoffe", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die optisch durch Detektion der von ihnen ausgesandten oder der durch sie nicht absorbierten elektromagnetischen Strahlung nachgewiesen werden können.

"Spannungs-sensitive Indikatoren", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die in Abhängigkeit einer anliegenden elektrischen Potentialdifferenz oder des vorliegenden elektrischen Potentials derart ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen.

Dem Fachmann bekannt sind spannungs-sensitive Indikatoren wie z.B. DIBAC [14].

"pH-Wert-sensitive Indikatoren", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die in Abhängigkeit des pH-Wertes derart ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Solche Indikatorfarbstoffe, wie zB Phenolrot, sind dem Fachmann zahlreich bekannt.

"Calcium-sensitive Indikatoren", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die in Anwesenheit von Calcium derart ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Dem Fachmann bekannte Calcium-sensitive Indikatoren sind z.B. das Aequorin und andere Calcium-sensitive Farbstoffe wie z.B FURA-2.

"Supported Bilayer" sind Membranen, die sich auf der einen Seite in Kontakt mit oder in unmittelbarer Nähe von einem geeigneten festen, porösen oder gel-artigen Material befinden. Dadurch werden sie gegenüber frei tragenden Membranen mechanisch stabiler und belastbarer.

"Wirkstoffe", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, welche die Aktivität von biologischen Molekülen beeinflussen können. Bevorzugte Wirkstoffe, im Sinne der Erfindung, sind solche, die spezifisch die Aktivität von einzelnen biologischen Molekülen oder von Gruppen von biologischen Molekülen beeinflussen. Besonders bevorzugte Wirkstoffe sind solche, welche die Aktivität von Rezeptoren und/oder Ionenkanälen beeinflussen. Ganz besonders bevorzugte Wirkstoffe vermögen bestimmte Krankheitsbilder des Menschen oder von Tieren zu heilen, zu lindern oder zu verhindern.

"Wirkstoff-Screening", in Sinne der Erfindung, ist die zielgerichtete Suche nach chemischen oder biologischen Substanzen, die bei einem bestimmten biologischen System einen bestimmten physiologischen Effekt auslösen. Dieser Effekt ist bevorzugt die Modulation der Aktivität eines Targetmoleküls oder die Heilung, Linderung, oder Verhinderung eines bestimmten Krankheitszustands eines Organismus. Wirkstoff-Screening wird bevorzugt im High-Throughput-Screening (HTS) Format durchgeführt. Hierbei wird eine große Anzahl von chemischen Substanzen während des Screening-Verfahrens mit einem Target in Kontakt gebracht und die Auswirkungen der chemischen Substanzen auf das Target wird ausgewertet.

Gegenstand der Erfindung ist:

• 1. Eine Messanordnung zum Nachweis einer biochemischen Aktivität mit einer Nachweisreaktion für besagte biochemische Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass in der Messanordnung die besagte biochemische Aktivität räumlich getrennt von besagter Nachweisreaktion erfolgt, und die räumliche Trennung durch mindestens zwei Lipidmembranen erfolgt welche mit Gap Junctions verbunden sind.
  
  Die durch die biochemische Aktivität hervorgerufene Änderung (z.B. eine Änderung der Konzentration einer chemischen Substanz oder eine Spannungsänderung) setzt sich durch besagte Gap Junctions vom Ort der biochemischen Aktivität zum Ort der Nachweisreaktion fort. Dort wird die Änderung durch die Nachweisreaktion ggf. verstärkt bzw. detektierbar gemacht und schließlich detektiert. Die Detektion selbst kann irgendwo erfolgen.

Bevorzugte weitere Erfindungsgegenstände sind:

• 2. Eine Messanordnung nach Punkt 1, wobei besagte biochemische Aktivität in einem Membrankörper erfolgt.
• 3. Eine Messanordnung nach Punkt 1, wobei besagte biochemische Aktivität in einer lebenden Zelle erfolgt.
  
  Die verwendeten lebenden Zellen können z.B. Zellen, die aus lebenden Geweben durch Dissoziation isoliert wurden (Primärkulturen) sein. Weiterhin können Zellen, die als etablierte Zelllinien in Kultur gehalten werden, wie CHO-Zellen, HEK-Zellen, NIH3T3-Zellen, HeLa-Zellen aber auch transient transfizierte Zellen oder Primärzellen verwendet werden.
• 4. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Farbstoff ist.
• 5. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Calcium-sensitiven Indikator ist.
• 6. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Spannungs-sensitiven Indikator ist.
• 7. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem pH-Wert-sensitiver Indikator ist.
• 8. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei eine der Lipidmembranen als supported bilayer ausgeführt ist.
• 9. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei die supported bilayer als planare supported bilayer ausgeführt ist.
• 10. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei die supported bilayer als sphärische supported bilayer ausgeführt ist.
• 11. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei die supported bilayer auf einem sphärischen Silica-Träger aufgebracht ist.
• 12. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei sich die supported bilayer auf einem Transil^®-Partikel befindet.
• 13. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei mindestens eine Lipidmembran das Ende einer Kapillare überspannt. Mit einer solchen Anordnung kann eine Nachweisreaktion in einer Glaskapillare stattfinden, wie sie derzeit z.B. für sogenannte "patch-clamp" Anwendungen verwendet wird [12].
• 14. Eine Vorrichtung zur Bestimmung von biochemischen Aktivitäten enthaltend eine Vielzahl von Messanordnungen gemäß einem der Punkte 1 bis 13.
• 15. Ein Verfahren zum Nachweis einer biochemischen Aktivität mit einer Nachweisreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte biochemische Aktivität räumlich getrennt von besagter Nachweisreaktion erfolgt, und dass die räumliche Trennung durch mindestens zwei Lipidmembranen erfolgt, und die Lipidmembranen mit Gap Junctions verbunden sind.
• 16. Verfahren nach Punkt 15, wobei besagte biochemische Aktivität eine Reaktion auf das Vorhandensein eines Wirkstoffs darstellt.
• 17. Verwendung einer Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 13 oder einer Vorrichtung nach Punkt 14 zum Wirkstoff-Screening

1 zeigt eine erfindungsgemäße Anordnung zur Bestimmung von biologischer Aktivität mit einem Targetmolekül (gleichzeitig der Ort der biochemischen Aktivität) (1), dem davon räumlich getrennten Ort der Nachweisreaktion (2), einer ersten (3) und einer zweiten (4) Lipidmembran, Connexinen (5) und Gap Junctions (6). Der Ort der biochemischen Reaktion (1) ist räumlich getrennt vom Ort der Nachweisreaktion (2) und dennoch funktionell über Gap Junctions (6) verbunden. Die erste Lipidmembran (3) ist planar ausgeführt.

2 zeigt eine erfindungsgemäße Anordnung zur Bestimmung von biologischer Aktivität mit einem Targetmolekül (gleichzeitig der Ort der biochemischen Aktivität) (1), dem davon räumlich getrennten Ort der Nachweisreaktion (2), einer ersten (3) und einer zweiten (4) Lipidmembran, Connexinen (5) und Gap Junctions (6). Die Nachweisreaktion findet unterhalb der Lipidmembran (3) auf einem Partikel (z.B. auf einem Transil^® Partikel) statt, der einen Kern (7) und eine Lipidmembran (3) aufweist. Es sind zwei über Gap Junctions an das Partikel gekoppelte Membrankörper dargestellt.

Es werden Connexine aus der Leber aufgereinigt und renaturiert, wie es in der Literatur beschrieben ist [4]. Die Connexine werden nach dem Verfahren von NIMBUS in supported bilayer Membran auf Transil^® Partikel eingefügt. Das Verfahren kann natürlich nicht nur mit Connexin Cx32 aus der Leber, sondern sinngemäß auch mit anderen Connexinen wie z.B. Connexin Cx43 aus Herzmuskel, und praktisch allen anderen Connexinen durchgeführt werden sowie mit Proteinen vergleichbarer Struktur aus anderen Organismen, wie z.B. Innexinen aus Invertebraten oder Plasmodesmata aus Pflanzen.

In vielen Fällen ist es wichtig, das Membranpotential einstellen zu können. Deshalb ist es zweckmäßig, nach demselben Verfahren in die Membran zusätzlich einen Kalium-selektiven Ionenkanal einzufügen, der es erlaubt, mit Hilfe der externen Kaliumkonzentration das Membranpotential des Transil^® Partikeln grob einzustellen. In dieser Weise modifizierte Transil^® Partikel werden im weiteren als "Connexon-Kaliumkanal Partikel" bezeichnet.

Die oben beschriebenen Connexon-Kaliumkanal Partikel werden mit dissoziierten Hepatocyten in Kontakt gebracht. Verfahren zur Gewinnung von dissoziierten Hepatocyten sind dem Fachmann bekannt. Da Hepatocyten ebenfalls das Connexin Cx32 enthalten, lagern sie sich an die Partikel an und bilden mit ihnen Gap Junctions aus. Die Gap Junctions öffnen sich und bilden eine leitende Verbindung zwischen den Hepatocyten und den Partikel. Dies wird nachgewiesen, indem ein Farbstoff z.B. Lucifer Yellow [13] in die Zellen hinein diffundiert, wenn die Partikel zuvor mit diesem Farbstoff beladen worden sind.

Es werden HEK Zellen mit cDNA zur Expression des Connexin 32 transfiziert und zugleich oder anschließend mit cDNA zur Expression eines ligandengesteuteren Ionenkanals, eines nikotinergen Acetylcholinrezeptors, transfiziert. Die Verfahren zur Herstellung derartiger Zellen und zur funktionellen Expression des Ionenkanals, sind allgemein bekannt und gehören zum Fachwissen des Durchschnittsfachmanns.

Zellen, welche beide Proteine exprimieren, werden nun mit den Partikeln aus Beispiel 1 in Kontakt gebracht. Sie lagern sich an die Partikel an und bilden mit diesen Gap Junctions aus, da sowohl die Partikel als auch die Zellen das Connexin 32 besitzen.

Die Aktivierung des nikotinergen Acetylcholinrezeptors mit einem geeigneten Agonisten, wie z.B. Nikotin, führt zu einer Änderung des Membranpotentials. Diese wird über die Gap Junctions auf die Membran des Partikels übertragen und wird optisch nachgewiesen werden. Hierfür werden die Partikel zuvor mit einem spannungssensitiven membranlöslichen Farbstoff (z.B. DIBAC [14]) beladen.

Zellen, die einen second messenger gekoppelten Rezeptor besitzen, werden zusätzlich mit einem Connexin transfiziert, so dass sie dieses Connexin zusätzlich zu den nativ vorhandenen Membranproteinen in ihrer Membran ausbilden. Sie werden mit Partikeln aus Beispiel 1 in Kontakt gebracht, die mit einem dazu kompatiblen Connexin hergestellt worden sind. Die Zellen lagern sich an die Partikel an. Durch die Gap Junctions wird eine Verbindung zwischen den Zellen und dem Innern der Partikel hergestellt. Werden nun die second messenger gekoppelten Rezeptoren in den Zellen aktiviert, so diffundieren die intrazellulären Reaktionsprodukte auch in die Partikel hinein und können dort durch eine entsprechende chemische Reaktion nachgewiesen werden. Zum Beispiel könnte dies der Nachweis einer erhöhten Calciumkonzentration durch FURA-2 sein, wie es in der Literatur an vielen Stellen als Nachweisverfahren ausführlich dokumentiert ist.

Dissoziierte Herzzellen besitzen nativ das Connexin Cx43 [15]. Deshalb können sie sich an Partikel aus Beispiel 1 anlagern, die unter Verwendung des Connexin Cx43 hergestellt worden sind. Werden diese Zellen nun mit Wirkstoffen behandelt, die in den Herzzellen vorhandene Rezeptoren aktivieren, dann können die Effekte beispielsweise mit den in Beispiel 3 und 4 angegebenen Verfahren nachgewiesen werden.

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