Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung pharmazeutischer Verbindungen in der Therapie, insbesondere in der Behandlung von Zuständen der Atemwege und Zuständen des Magen-Darm-Traktes, wie entzündliche und allergische Zustände von diesen und anderen Geweben, während unerwünschte oder nachteilige Wirkungen an Stellen, die vom Zielgewebe entfernt sind, reduziert oder eliminiert werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verbindungen zur Verwendung in der Therapie, die ein vorteilhaftes Nebenwirkungsprofil besitzen, pharmazeutische Formulierungen davon und Verfahren zur Auswahl der Verbindungen.

Es ist allgemein bekannt, daß einige, in der Therapie nützliche pharmazeutische Verbindungen zusätzlich zu ihrer gewünschten pharmakologischen Wirkung unerwünschte oder nachteilige Nebenwirkungen an Stellen verursachen können, die vom Zielgewebe entfernt sind, sogenannte systemische Wirkungen. Die Nützlichkeit der Verbindung zur Behandlung einer gegebenen Störung hängt u. a. vom Verhältnis zwischen der Wirksamkeit der Verbindung in bezug auf ihre erwünschte pharmakologische Aktivität und ihrer systemischen Neigung ab.

Glukokortikosteroide (ebenfalls bekannt als Kortikosteroide) sind eine Kategorie bekannter Wirkstoffe, die weithin zur Behandlung von entzündlichen Störungen oder Erkrankungen wie Asthma und Rhinitis verwendet werden, die allgemein an dem Nachteil leiden, daß sie ungewollte systemische Wirkungen im Anschluß an ihre Verabreichung verursachen. Solche Wirkungen schließen Nebennierenverhaltung, erhöhten Knochenumsatz, beeinträchtiges Wachstum, Hautverdünnung und leichtes Prellen und erhöhtes Risiko für Katarakte ein. WO 94/13690, WO 94/14834, WO 92/13873 und WO 92/13872 offenbaren jeweils Glukokortikosteroide, die angeblich entzündungshemmende Aktivität gekoppelt mit reduzierter systemischer Wirkung besitzen.

S. Al-Habet et al., J. Pharm. Sci. 79/10, 916 (1990) beschreibt die in-vitro-Hydrolyse von Steroidsäureester-Derivaten von Prednisolon in Plasma verschiedener Arten.

Eine andere Klasse von Wirkstoffen, die weithin zur Behandlung von z. B. Asthma verwendet wird, sind &bgr;₂-Adrenorezeptoragonisten, die ebenfalls an dem Nachteil leiden, daß sie ungewollte systemische Wirkungen im Anschluß an ihre Verabreichung verursachen. Solche Wirkungen schließen stimulatorische Wirkungen des zentralen Nervensystems und Pulsarrhythmie ein.

US 4 935 421 und US 4 906 661 beschreiben jeweils &bgr;-Blocker, die nützlich zur Behandlung von Glaukom sind. Die Verbindungen sollen eine kurze Verweilzeit im systemischen Kreislauf besitzen, aber mit guter Stabilität in der Augenflüssigkeit, und sollen somit ein geringes Potential zur Erzeugung systemischer Nebenwirkungen besitzen.

Eine Art, auf die die potentiellen nachteiligen Nebenwirkungen einer Verbindung gelindert werden können, ist durch den Versuch, die pharmakologische Aktivität der Verbindung auf das Zielgewebe oder die Wirkungsstelle im Körper zu beschränken, wodurch ungewollte systemische Wirkungen reduziert oder eliminiert werden, die mit der Verabreichung der Verbindung verbunden sind.

Wir haben jetzt überraschend festgestellt, daß bestimmte Verbindungen mit therapeutischer Aktivität im Blutstrom zu anderen Verbindungen umgewandelt werden, denen die Aktivität im wesentlichen fehlt. Insbesondere haben wir festgestellt, daß bestimmte Verbindungen, die eine 5-gliedrige Ringstruktur besitzen, die eine Esterbindung beinhaltet, schnell im Blut (Plasma) unter Bildung von Verbindungen hydrolysiert werden, denen die therapeutische Aktivität im wesentlichen fehlt. Von solchen plasmalabilen Verbindungen kann somit erwartet werden, daß sie eine reduzierte systemische Wirksamkeit im Vergleich mit Verbindungen besitzen, die nicht plasmalabil sind.

Obwohl wir nicht durch eine Theorie in bezug auf mögliche Wirkungsmechanismen gebunden sind, wird angenommen, daß ein nachfolgend als "Lactonase" bezeichnetes Enzym verantwortlich für die Hydrolyse der zuvor genannten Verbindungen im Blut ist.

Wir haben somit ein Verfahren zur Lokalisierung der therapeutischen Aktivität einer Verbindung auf eine vorher festgelegte Stelle innerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers gefunden, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Verbindung oder eines physiologisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon an das gewünschte Zielgewebe eines menschlichen oder tierischen Patienten umfaßt, wobei die Verbindung eine therapeutische Aktivität besitzt und im Blut zu einer anderen Verbindung hydrolysierbar ist, der die therapeutische Aktivität im wesentlichen fehlt.

Wir haben damit ebenfalls ein Verfahren zur Ausübung einer therapeutischen Wirkung in einem Zielgewebe gefunden, während die begleitende systemische Tendenz vermieden wird, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Verbindung oder eines physiologisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon in einer Menge, die für eine therapeutische Aktivität ausreichend ist, an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der der Therapie bedarf, umfaßt, wobei die Verbindung im Blut zu einer anderen Verbindung hydrolysierbar ist, der die therapeutische Aktivität im wesentlichen fehlt.

Zusätzlich haben wir ein Verfahren zur Behandlung einer Störung mit einer pharmazeutischen Verbindung gefunden, während alle systemischen Effekte, die mit der Verabreichung der Verbindung verbunden sind, reduziert oder eliminiert werden, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder eines physiologisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon an einen menschlichen oder tierischen Patienten umfaßt, wobei die Verbindung im Blut zu einer anderen Verbindung hydrolysierbar ist, der die therapeutische Aktivität im wesentlichen fehlt.

Außerdem haben wir gefunden, daß es möglich ist, die chemischen Strukturen bekannter ("Stamm"-) Wirkstoffverbindungen in einer solchen Weise zu modifizieren, daß die modifizierte Verbindung die gewünschte therapeutische Aktivität beibehält, sich aber von der "Stamm"-Verbindung darin unterscheidet, daß sie im Blut zu einer Verbindung hydrolysierbar ist, der die therapeutische Aktivität der "Stamm"-Verbindung im wesentlichen fehlt. Damit haben wir ein Verfahren zur Reduzierung der systemischen Wirkungen gefunden, die mit der Verabreichung einer Wirkstoffverbindung verbunden sind, wobei das Verfahren das Modifizieren der Verbindung umfaßt, so daß die modifizierte Form der Verbindung die gewünschte therapeutische Aktivität beibehält und im Blut zu einer Verbindung hydrolysierbar gemacht wird, der die gewünschte therapeutische Aktivität im wesentlichen fehlt.

Es wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereitgestellt, die eine therapeutische Wirkung an einem Zielort innerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers mit reduzierter systemischer Wirksamkeit auf den Körper bereitstellen kann, umfassend:

• (a) Vergleichen der Anfälligkeit der Verbindung für die Hydrolyse in Gegenwart eines gereinigten Lactonase-Enzyms oder einer rekombinanten Form davon mit der entsprechenden Anfälligkeit in Abwesenheit des Lactonase-Enzyms; und
• (b) Auswählen einer Verbindung auf der Basis gesteigerter Anfälligkeit für die Hydrolyse in Gegenwart des Lactonase-Enzyms.

Die Anfälligkeit für Hydrolyse wird bevorzugt mittels des hier definierten "enzymatischen Hydrolysetestverfahrens" verglichen.

Es wird eine therapeutisch aktive Verbindung oder ein Salz oder Solvat davon bereitgestellt, die/das in menschlichem oder tierischem Blut zu einer Verbindung mit der reduzierter therapeutischer Aktivität hydrolysierbar ist. Die therapeutisch aktive Verbindung ist eine andere als die in WO 97/24365, WO 97/24367 und WO 97/24368 offenbarten Verbindungen.

Die therapeutische aktive Verbindung umfaßt bevorzugt eine Ringstruktur, besonders bevorzugt eine 5-gliedrige Ringstruktur, die eine Esterbindung einschließt, worin die Esterbindung durch ein Lactonase-Enzym hydrolysierbar ist. Verbindungen mit einer Esterbindung werden hier definiert, um ebenfalls Verbindungen einzuschließen, in denen die "Esterbindung" (d. h. -CO-O-) Teil einer breiteren Bindung ist, wie z. B. eine Carbonatbindung (d. h. -O-CO-O-).

Die vorliegenden Verbindungen sind therapeutisch aktiv. Bevorzugt sind diejenigen Verbindungen, die nützlich zur Behandlung von Atemwegsstörungen und Störungen des Magen-Darm-Traktes, der Haut, der Augen und Gelenke sind. Ebenfalls bevorzugt sind entzündungshemmende oder antiallergische Verbindungen wie Kortikosteroide, die einen Nutzen in der Behandlung von u. a. allergischen und entzündlichen Zuständen der zuvor genannten Gewebe aufweisen. Ebenfalls bevorzugt sind &bgr;₂-Adrenorezeptoragonisten.

Die vorliegenden Verbindungen sind hydrolysierbar im menschlichen oder tierischen Blut zu einer Verbindung mit reduzierter therapeutischer Aktivität. Mit "therapeutischer Aktivität" ist die pharmakologische Aktivität gemeint, für die die Verbindung verabreicht wird. Mit "einer Verbindung mit reduzierter therapeutischer Aktivität" ist eine Verbindung gemeint, die weniger wirksam in bezug auf ihre gewünschte pharmakologische Aktivität verglichen mit der Stammverbindung ist. Bevorzugt ist das Hydrolysat der Stammverbindung wenigstens zweimal weniger wirksam, insbesondere 5-mal weniger wirksam und speziell wenigstens 10-mal weniger wirksam als die Stammverbindung.

In einem bevorzugten Aspekt sind die vorliegenden Verbindungen hydrolysierbar durch ein Lactonase-Enzym.

Geeigneterweise hat das Lactonase-Enzym ein Molekulargewicht von ca. 40 kDa und ist:

• – unempfindlich gegen Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei einer Konzentration von 10 mM (alkyliert Serin-Reste in der katalytischen Ser/His/Asp-Triade von klassischen Ser-Proteasen und -Esterasen);
• – unempfindlich ebenfalls gegen p-Chlormercuribenzoat (PCMB) bei einer Konzentration von 1 mM (alkyliert Cys-Reste in der katalytischen Cys/His/Asp-Triade von klassischen Cys-Proteasen und -Esterasen);
• – unempfindlich gegen Eserin bei einer Konzentration von 50 mM;
• – Ca²⁺-abhängig. Diese letzte Abhängigkeit ist reversibel, d. h. EDTA kann zur Komplexierung von Ca²⁺ mit gleichzeitigem Verlust der Aktivität verwendet werden, die durch Zugabe von Ca²⁺ zurückgewonnen werden kann.

Enzyme, die ein ähnliches Profil besitzen, werden im Stand der Technik beschrieben. Z. B. beschreiben W. N. Fishbein et al., Journal of Biological Chemistry 1966, 241 (21), 4835–4841 die Reinigung einer &ggr;-Lactonase (d. h. eines Enzyms, das aliphatische &ggr;-Lactone hydrolysieren kann) aus Rattenleber und menschlichem Plasma. Außerdem wird angenommen, daß das Enzym "Lactonase" mit dem Enzym Paraoxonase verwandt oder im wesentlichen homolog dazu ist, das in WO 96/01322 und in C. E. Furlong et al., Chem. Biol. Interactions, Bd. 87, S. 35–48 (1993) offenbart wird, deren beider Inhalte hier durch Verweis eingeführt werden, als ob sie vollständig wiedergegeben wären. Paraoxonase wird von G. J. Kelso, Biochem. 1994, 33, 832–839, als in der Leber und im Blut vorhanden beschrieben, aber abwesend in Lunge, Herz, Hirn, Plazenta, Skelettmuskulatur, Niere und Bauchspeicheldrüse.

Die vorliegenden Verbindungen besitzen relativ kurze Halbwertszeiten im Blut in vitro. Ein Testverfahren zur Bestimmung der Halbwertszeit der Verbindungen unter definierten enzymatischen Hydrolysebedingungen in vitro wird jetzt beschrieben. Es wird angenommen, daß das Testverfahren einen geeigneten Indikator bezüglich der Wirkungen in vivo liefert. Im Testverfahren wird die Hydrolyse von Testverbindungen durch ein Lactonase-Enzym unter Verwendung von RP-HPLC mit UV-Detektion überwacht.

Das "enzymatische Hydrolysetestverfahren" ist wie folgt: Inkubationen werden in 1 ml Volumina in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das 5% Rinderserumalbumin in Gegenwart von 20 mM CaCl₂ enthält. Die Lösungen werden bei 37°C für 5 Minuten vor der Zugabe der Testverbindung (5 &mgr;l einer 5 mg/ml Lösung in DMSO) und dann Lactonase-Enzym (10 &mgr;l zu den 1 ml Inkubationen) vorinkubiert. Kontrollinkubationen, die kein Enzym enthalten, werden ebenfalls eingeschlossen. Die enzymatische Hydrolyse wird durch Entfernung von Teilmengen und Beenden der Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens von Acetonitril überwacht. Die Proben werden wirbelvermischt, dann zentrifugiert und die Überstände in Autosampler-Fläschchen zur HPLC-Analyse überführt.

In einem geeigneten HPLC-Verfahren werden Teilmengen (20 &mgr;l) der Überstände auf eine Zorbax Rx C8-Säule (250 × 4,6 mm; Hichrom) injiziert. Die Säule wird auf 40°C gehalten und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit einer mobilen Phase aus Acetonitril: 50 mM Ammoniumformiat (65 : 35), die auf pH 4,2 mit Ameisensäure eingestellt ist, eluiert. Die Detektion erfolgt durch UV-Extinktion bei 240 nm, und die chromatographischen Peak-Flächen für sowohl Stammverbindung als auch Metabolit werden gemessen.

In einem bevorzugten Aspekt kann die Halbwertszeit jeder Verbindung durch ein Verfahren bestimmt werden, in dem Peak-Flächen gegen die Zeit in einem logarithmisch/linearen Maßstab aufgetragen werden und die Halbwertszeiten durch Extrapolation oder Interpolation einer geraden Linie, die die zwei Punkte verbindet, bestimmt werden.

Das oben beschriebene "enzymatische Hydrolysetestverfahren" setzt Lactonase-Enzym ein. Geeignete Formen von Lactonase-Enzym schließen menschliche Serum-Paraoxonase oder eine rekombinante Form davon oder gereinigte Lactonase ein, die aus menschlichem Plasma wie nachfolgend beschrieben erhalten wird. Die Reinigung von menschlicher Serum-Paraoxonase wird von C. E. Furlong et al., Chem. Biol. Interactions, Bd. 87, S. 35–48, beschrieben, und rekombinante menschliche Serum-Paraoxonase wird in WO 96/01322 beschrieben.

Allgemein besitzen die Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung eine Halbwertszeit in Gegenwart von Lactonase-Enzym von weniger als 1 Stunde, bevorzugt weniger als 30 Minuten, speziell weniger als 10 Minuten. Entsprechend würde man erwarten, daß die Verbindungen eine Halbwertszeit in menschlichem Plasma von weniger als 1 Stunde besitzen, bevorzugt weniger als 30 Minuten, speziell weniger als 10 Minuten (siehe das später beschriebene Testverfahren "Stabilität in menschlichem Plasma"). Als Ergebnis dieser schnellen Hydrolyse in Gegenwart von Lactonase-Enzym werden die Verbindungen wahrscheinlich eine reduzierte systemische Wirksamkeit besitzen. Solche Verbindungen können daher eine sicherere Alternative gegenüber plasmastabilen Wirkstoffen darstellen, die eher wahrscheinlich schlechte Nebenwirkungsprofile besitzen.

Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung enthalten typischerweise eine Ringstruktur, bevorzugt eine 5-gliedrige Ringstruktur, die eine Esterbindung beinhaltet. Die Esterbindung ist für die Hydrolyse durch Lactonase-Enzym anfällig.

Bevorzugte Verbindungen schließen diejenigen ein, die eine lactonartige Gruppe enthalten, bevorzugt eine Lacton-Gruppe, am meisten bevorzugt eine &ggr;-Lacton-Gruppe. Im Fall, daß eine solche Verbindung ein Steroid-Derivat ist, kann die lactonartige Gruppe entweder an einen Ring des Steroidkerns kondensiert oder an den Steroidkern über eine geeignete Linker-Gruppe gebunden sein. Bevorzugt ist die lactonartige Gruppe an den Cyclopentan-Ring (herkömmlich bekannt als Ring D) des Steroidkerns kondensiert oder gebunden.

Illustrative lactonartige Verbindungen schließen ein:

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-17-spiro[androsta-1,4-dien-17,5'-[1,3]oxathiolan]-2',3,4'-trion;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure-S-(2-oxo-tetrahydrofuran-3-ylmethyl)ester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-(2-oxo-tetrahydrofuran-4-ylsulfanyl-acetoxy)-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäuremethylester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;,21-dihydroxy-16&agr;,17&agr;-[2-(2-oxo-tetrahydrofuran-3-yl)sulfanyl]ethylidendioxy-pregn-4-en-3,20-dion;

9&agr;-Fluor-11&bgr;,17&agr;,21-trihydroxy-3,20-dioxo-pregna-1,4-dien-16&agr;-essigsäure-&ggr;-lacton;

3-[3-[2-(4-Amino-3,5-dichlorphenyl)-2-hydroxyethylamino]propylsulfanyl]-dihydro-furan-2-on-trifluoracetat;

und Salze und Solvate davon.

Man wird einsehen, daß einige der oben beschriebenen lactonartigen Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung individuelle diastereomere R- und S-Formen am asymmetrischen Zentrum am Anbindungspunkt des lactonartigen 5-gliedrigen Rings aufweisen; diese individuellen Isomere sind im Erfindungsumfang eingeschlossen, ebenso wie die Mischungen daraus. Man wird ferner einsehen, daß die Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung die individuellen R- und S-Diastereomere an anderen asymmetrischen Zentren einschließen können. So sind individuelle R- und S-Diastereomere, die isoliert sind, um im wesentlichen frei vom anderen Diastereomer zu sein, d. h. rein, und Mischungen daraus im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ein individuelles R- oder S-Diastereomer, das isoliert ist, so daß es im wesentlichen frei vom anderen Diastereomer ist, d. h. rein, wird bevorzugt so isoliert werden, daß weniger als 10%, bevorzugt weniger als 1%, speziell weniger als 0,1% des anderen Diastereomers vorhanden ist.

Andere geeignete Verbindungen schließen eine Ringstruktur ein, bevorzugt eine 5-gliedrige Ringstruktur, die eine Carbonatbindung (d. h. -O-CO-O-) aufweist. Bevorzugte Verbindungen dieses Typs schließen diejenigen der Formel (Ia) oder (Ib)

In den obigen Definitionen bezeichnet der Begriff "Alkyl" als Gruppe oder Teil einer Gruppe eine geradkettige oder, wenn verfügbar, verzweigtkettige Alkyl-Einheit. Z. B. kann er eine C_1-4-Alkylfunktion darstellen, wie sie durch Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl und t-Butyl dargestellt wird.

Die Solvate können z. B. Hydrate sein.

Nachfolgende Verweise auf "Verbindungen der Formel (I)" schließen Verbindungen der Formel (Ia) und der Formel (Ib) und alle Stereoisomere und Mischungen daraus ein.

Diastereomere und Mischungen daraus am asymmetrischen Zentrum, die gebildet werden, wenn R₂ und R₃ zusammen

Bevorzugt stellt R₈ Wasserstoff oder Methyl dar.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R₁ S darstellt.

Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R₂ individuell OC(=O)C_1-6-Alkyl darstellt, besonders bevorzugt OC(=O)C_1-3-Alkyl, speziell OC(=O)Ethyl. Verbindungen innerhalb dieser Gruppe, in der R₃ Methyl ist, sind allgemein bevorzugt.

Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R₂ und R₃

Verbindungen der Formel (I), worin R₄ und R₅, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Fluor oder Chlor darstellen, insbesondere Wasserstoff oder Fluor, sind bevorzugt. Speziell bevorzugt sind Verbindungen, worin sowohl R₄ als auch R₅ Fluor ist.

Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R₁ S ist; R₂ OC(=O)C_1-6-Alkyl ist, insbesondere OC(=O)C_1-3-Alkyl, speziell OC(=O)Ethyl; R₃ Methyl ist; und R₄ und R₅, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff oder Fluor darstellen, speziell Fluor.

Ebenfalls besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R₁ S ist; R₂ und R₃ zusammen

Man wird einsehen, daß jede der obigen Verbindungen der Formel (Ia) die individuellen R- und S-Diastereomere am asymmetrischen Zentrum am Punkt der Bindung des cyclischen Carbonat-Rings sowie die Mischungen daraus einschließt. Man wird ferner einsehen, daß die Verbindungen der Formel (I) die individuellen R- und S-Diastereomere am asymmetrischen Zentrum einschließen, das gebildet wird, wenn R₂ und R₃ zusammen

Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) schließen ein:

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure-S-(2-oxo-1,3-dioxolan-4-yl)ester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;,17&agr;-isopropylidendioxy-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure-S-(2-oxo-1,3-dioxolan-4-yl)ester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-carbonsäure-O-(2-oxo-1,3-dioxolan-4-yl)ester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure-S-(5-methyl-2-oxo-1,3-dioxol-4-ylmethyl)ester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;,17&agr;-isopropylidendioxy-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure-S-(5-methyl-2-oxo-1,3-dioxol-4-ylmethyl)ester;

6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-carbonsäure-O-(5-methyl-2-oxo-1,3-dioxol-4-ylmethyl)ester;

und Solvate davon.

Die Verbindungen der Formel (2) und Solvate davon können durch die nachfolgend beschriebene Methodik hergestellt werden.

Gemäß einem ersten Verfahren (A) kann eine Verbindung der Formel (Ib) hergestellt werden durch Behandeln einer Verbindung der Formel (II):

So kann eine Verbindung der Formel (II), worin X OH darstellt, mit einem Aktivierungsmittel wie einem Triazol, z. B. 1-Hydroxybenzotriazol, und einem Carbodiimid wie 1-(3-Dimethylamino-propyl)-3-ethyl-carbodiimidhydrochlorid in einem polaren Lösungsmittel wie Dimethylformamid aktiviert werden, zweckmäßig bei erhöhten Temperaturen, z. B. ca. 100°C, und unter einer inerten Atmosphäre wie Stickstoff oder dgl., um ein aktiviertes Derivat der Verbindung der Formel (II) zu bilden, wie z. B. ein Triazol-Derivat, z. B. ein Benzotriazol-Derivat der Formel (IV):

Das aktivierte Derivat, das nach Bedarf isoliert werden kann, wird mit einer Verbindung der Formel (III) wie oben definiert umgesetzt, um die gewünschte Verbindung der Formel (Ib) zu bilden.

Die Fachleute werden einsehen, daß die Kupplungsreaktion in einem Schritt ohne Isolierung des aktivierten Derivats erfolgen kann, falls eine Verbindung der Formel (III) während der Aktivierung vorhanden ist oder im Anschluß daran hinzugegeben wird. Alternativ kann das aktivierte Derivat isoliert und dann anschließend mit einer Verbindung der Formel (III) behandelt werden, um die gewünschte Verbindung der Formel (Ib) zu bilden.

Verbindungen der Formel (Ib) können ebenfalls hergestellt werden gemäß dem obigen Verfahren (A) durch Kupplung einer Verbindung der Formel (II), worin X OH darstellt, mit einer Verbindung der Formel (III) wie oben definiert über ein intermediäres gemischtes Anhydrid, z. B. ein gemischtes Phosphatanhydrid, wie eine Verbindung der Formel (V), wie beschrieben von Kertesz und Marx, Journal of Organic Chemistry, 1986, 51, 2315–2328.

So kann eine Verbindung der Formel (II), worin X OH darstellt, mit einem Aktivierungsmittel wie Diethylchlorphosphat in Gegenwart einer Base wie einem tertiären Amin, z. B. Triethylamin, und in einem geeigneten Lösungsmittel wie einem chlorierten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, zur Bildung eines aktivierten Derivats der Verbindung der Formel (II), z. B. einem gemischten Diethylphosphatanhydrid-Derivat der Formel (V), aktiviert werden:

Das aktivierte Derivat, das nach Bedarf isoliert werden kann, wird mit einer Verbindung der Formel (III) wie oben definiert umgesetzt, um die gewünschte Verbindung der Formel (Ib) zu bilden.

Die Fachleute werden einsehen, daß die Kupplungsreaktion ohne Isolierung des aktivierten Derivats erfolgen kann, falls eine Verbindung der Formel (III) während der Aktivierung vorhanden ist oder im Anschluß daran hinzugegeben wird. Alternativ kann das aktivierte Derivat isoliert und dann anschließend mit einer Verbindung der Formel (III) behandelt werden, um die gewünschte Verbindung der Formel (Ib) zu bilden.

Verbindungen der Formel (I), worin R₁ O oder S darstellt, können ebenfalls gemäß einem zweiten Verfahren (B) hergestellt werden, worin eine Verbindung der Formel (II), worin R₂, R₃, R₄, R₅ und ------- wie hier zuvor definiert sind und X OH oder SH oder ihre entsprechenden Salze darstellt, mit einer Verbindung der Formel (VI) oder der Formel (VII) behandelt wird:

Verbindungen der Formel (I), worin R₁ O oder S darstellt, können gemäß dem obigen Verfahren (B) durch Alkylierung einer Verbindung der Formel (II), worin X OH bzw. SH darstellt, mit einer Verbindung der Formel (VI) oder der Formel (VII), worin Q eine geeignete Abgangsgruppe darstellt, unter Verwendung fachbekannter Verfahren oder einer Anpassung dieser Verfahren hergestellt werden.

So kann z. B. eine Verbindung der Formel (I), worin R₁ O darstellt, durch Alkylierung einer Verbindung der Formel (II), worin X OH darstellt, zweckmäßig in Form eines geeigneten Salzes (wie ein Alkalimetall-, z. B. Natrium- oder quaternäres Ammoniumsalz), mit einer Verbindung der Formel (VI) oder der Formel (VII) hergestellt werden, worin Q eine geeignete Abgangsgruppe darstellt, bevorzugt Chlor, Brom oder Mesylat. Die Alkylierungsreaktion wird bevorzugt in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt, geeignet in einem polaren Lösungsmittel, unter inerten Bedingungen, z. B. Stickstoff oder dgl., zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen ca. 0 und 100°C. Geeignete polare Lösungsmittel können Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan oder Chloroform einschließen. Bevorzugt wird die Alkylierungsreaktion in Gegenwart einer Base wie Kaliumcarbonat in einem inerten Lösungsmittel wie Dimethylformamid und bei einer Temperatur von 0 bis 20°C durchgeführt.

In ähnlicher Weise können Verbindungen der Formel (I), worin R₁ S darstellt, gemäß dem obigen Verfahren (B) durch Alkylierung einer Verbindung der Formel (II), worin X SH darstellt, mit einer Verbindung der Formel (VI) oder der Formel (VII), worin Q eine geeignete Abgangsgruppe darstellt, durch Anpassung der Verfahren hergestellt werden, die von Phillipps et al. beschrieben werden, Journal of Medicinal Chemistry, 1994, 37, 3717–3729. So kann eine Verbindung der Formel (I), worin R₁ S darstellt, durch Alkylierung der entsprechenden Verbindung der Formel (II), worin X SH darstellt, zweckmäßig in Form eines geeigneten Salzes (wie das Alkalimetall-, z. B. Natrium- oder quaternäre Ammoniumsalz), mit einer Verbindung der Formel (VI) oder der Formel (VII), worin Q eine geeignete Abgangsgruppe darstellt, wie hier oben für ähnliche Alkylierungsreaktionen beschrieben, hergestellt werden.

Alternativ können Verbindungen der Formel (Ib), worin R₁ O oder S darstellt, gemäß dem obigen Verfahren (B) durch Alkylierung einer Verbindung der Formel (II), worin X OH oder SH darstellt, mit einer Verbindung der Formel (VII), worin Q OH darstellt, unter Mitsunobu-Bedingungen unter Verwendung von Triphenylphosphin und eines Dialkylazodicarboxylats oder unter Verwendung der Vilsmeier-Methodik hergestellt werden, wie von Barrett und Procopiou beschrieben, Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1995, 1403–1404.

Verbindungen der Formel (I) können ebenfalls aus anderen Verbindungen der Formel (I) unter Verwendung herkömmlicher gegenseitiger Umwandlungsverfahren, wie z. B. Transacetalisierung oder Epimerisierung, hergestellt werden. So stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) durch gegenseitige Umwandlung einer anderen Verbindung der Formel (I) (Verfahren C) einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.

Verbindungen der Formel (I) mit einer 1,2-Einfachbindung können durch partielle Reduktion der entsprechenden Verbindung mit 1,2-Doppelbindung durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. So z. B. durch Hydrierung der entsprechenden Verbindung der Formel (I) oder einer Zwischenstufe, die zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) verwendet wird, unter Verwendung eines Palladium-Katalysators, zweckmäßig in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat, oder bevorzugt unter Verwendung von Tris(triphenylphosphin)rhodium(I)-chlorid (bekannt als Wilkinson-Katalysator), zweckmäßig in einem geeigneten Lösungsmittel wie Toluol, Ethylacetat oder Ethanol.

Die Fachleute werden einsehen, daß es wünschenswert sein kann, geschützte Derivate der in der Herstellung der Verbindungen der Formel (I) verwendeten Zwischenstufen zu verwenden. So können die obigen Verfahren das Entschützen als intermediären oder letzten Schritt erfordern, um die gewünschte Verbindung zu liefern. So kann gemäß einem anderen Verfahren (D) eine Verbindung der Formel (I) hergestellt werden durch Unterwerfen eines geschützten Derivats einer Verbindung der Formel (I) einer Reaktion zur Entfernung der vorhandenen Schutzgruppe(n), was einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt.

Das Schützen und Entschützen funktioneller Gruppen kann unter Verwendung herkömmlicher Mittel bewirkt werden. So können Hydroxyl-Gruppen unter Verwendung jeder herkömmlichen Hydroxyl-Schutzgruppe geschützt werden, wie z. B. beschrieben in "Protective Groups in Organic Chemistry", Hrsg. J. F. W. McOmie (Plenum Press, 1973) oder "Protective Groups in Organic Synthesis" von Theodora W. Green (John Wiley and Sons, 1991).

Beispiele für geeignete Hydroxyl-Schutzgruppen schließen Gruppen ein, die aus Alkyl- (z. B. t-Butyl oder Methoxymethyl), Aralkyl- (z. B. Benzyl, Diphenylmethyl oder Triphenylmethyl), heterocyclischen Gruppen wie Tetrahydropyranyl, Acyl- (z. B. Acetyl oder Benzoyl) und Silyl-Gruppen, wie Trialkylsilyl (z. B. t-Butyldimethylsilyl), ausgewählt sind. Die Hydroxyl-Schutzgruppen können durch herkömmliche Techniken entfernt werden. So können z. B. Alkyl-, Silyl-, Acyl- und heterocyclische Gruppen durch Solvolyse entfernt werden, z. B. durch Hydrolyse unter sauren oder basischen Bedingungen. Aralkyl-Gruppen wie z. B. Triphenylmethyl können in ähnlicher Weise durch Solvolyse entfernt werden, z. B. durch Hydrolyse unter sauren Bedingungen. Aralkyl-Gruppen wie Benzyl können durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators wie Palladium auf Aktivkohle abgespalten werden.

Die Verbindungen der Formel (II), (III), (IV), (V), (VI) und (VII) sind entweder allgemein bekannte Verbindungen oder können durch Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die auf diesem Gebiet zur Herstellung der bekannten Verbindungen der Formel (II), (III), (IV), (V), (VI) und (VII) beschrieben werden, oder können hergestellt werden durch die hier beschriebenen Verfahren. Neue Verbindungen der Formeln (II), (III), (IV), (V), (VI) und (VII) bilden noch einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.

Z. B. können die Verbindungen der Formel (II), worin X OH darstellt, durch Oxidation eines geeigneten 21-Hydroxy-20-keto-pregnans der Formel (VIII) hergestellt werden:

Verbindungen der Formel (VIII) sind kommerziell erhältlich, z. B. sind Fluocinolonacetonid, Budesonid und Triamcinolonacetonid von Sigma-Aldrich erhältlich, oder können aus den kommerziell erhältlichen Verbindungen der Formel (VIII) hergestellt werden, z. B. durch die in EP 0262108 beschriebenen Transacetalisierungsverfahren und durch partielle Reduktion der 1,2-Doppelbindungsverbindungen durch die hier beschriebenen Verfahren. Alternativ können Verbindungen der Formel (VIII) aus handelsüblichen 17&agr;-Hydroxyl-Derivaten der Verbindungen der Formel (VIII) hergestellt werden, z. B. Betamethason, Flumethason, Prednisolon, Beclomethason und Dexamethason, erhältlich von Sigma-Aldrich, durch Veresterung der 17&agr;-Hydroxyl-Gruppe gemäß dem von Gardi et al. beschriebenen Verfahren, Tetrahedron Letters, 1961, 448. Neue Verbindungen der Formel (VIII) bilden noch einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.

Verbindungen der Formel (II), worin X SH darstellt, können durch die Anwendung oder Anpassung bekannter Verfahren hergestellt werden, z. B. unter Verwendung der von Phillipps et al. beschriebenen Verfahren, Journal of Medicinal Chemistry, 1994, 37, 3717–3729.

Verbindungen der Formel (III), (VI) und (VII) sind kommerziell erhältlich von Sigma-Aldrich oder können leicht durch Anwendung oder Anpassung bekannter Verfahren hergestellt werden. Z. B. können Verbindungen der Formel (III), worin Z OH ist und R₈ Methyl ist, durch das Verfahren von Miyauchi et al. hergestellt werden, Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 1077–1078; Verbindungen der Formel (III), worin Z OH ist und R₈ Wasserstoff ist, können hergestellt werden durch das Verfahren von Jung et al., Heterocycles 1989, 28, 93–97; Verbindungen der Formel (III), worin Z SH ist, können hergestellt werden aus den entsprechenden Verbindungen, worin Z Brom ist, durch Verdrängung des Bromatoms unter Verwendung von z. B. Kaliumthioacetat und anschließendes Hydrolysieren des Produkts in herkömmlicher Weise; Verbindungen der Formel (VII), worin Q Brom ist und R₈ Wasserstoff ist, können hergestellt werden durch das Verfahren von Wender et al., Tetrahedron Letters 1990, 31, 6605–6608; und die Verbindung der Formel (VII), worin Q Brom ist und R₈ Methyl ist, durch die in W. S. Saari et al. beschriebenen Verfahren, J. Med. Chem. 1984, 27, 713.

Individuelle Isomere der Formel (Ia) am Punkt der Bindung der cyclischen Carbonat-Ringeinheit können entweder aus Ausgangsstoffen mit der gewünschten Stereochemie oder durch Epimerisierung, Auftrennung, fraktionierte Kristallisation oder Chromatographie (z. B. HPLC-Trennung) in einer geeigneten Stufe in der Synthese der erforderlichen Verbindungen der Formel (Ia) unter Verwendung herkömmlicher Mittel hergestellt werden.

So wird man z. B. einsehen, daß eine Synthese, die eine racemische Mischung von Verbindungen der Formel (VI) einsetzt, Verbindungen der Formel (Ia) als Mischung der Diastereomere liefern wird, die dann getrennt werden können. Alternativ können die individuellen Diastereomere durch Einsatz von Verbindungen der Formel (VI) in enantiomerenreiner Form hergestellt werden.

In ähnlicher Weise können Verbindungen der Formel (I), worin R₂ und R₃ zusammen

Solvate (z. B. Hydrate) einer Verbindung der Formel (I) können während des Aufarbeitungsverfahrens einer der zuvor genannten Verfahrensschritte gebildet werden. So können die Verbindungen der Formel (I) in Verbindung mit Lösungsmittelmolekülen durch Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Verdampfen eines geeigneten Lösungsmittels isoliert werden, um die entsprechenden Solvate zu ergeben.

Wie oben erwähnt wurde, besitzen die Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung Nutzen in der Behandlung einer großen Vielzahl von Krankheiten und Zuständen in der Human- oder Veterinärmedizin. Die Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung besitzen insbesondere Nutzen als entzündungshemmende und antiallergische Mittel, speziell zur Behandlung von Störungen der Atemwege und des Magen-Darm-Traktes.

Beispiele für Krankheitszustände, in denen die Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung Nutzen aufweisen, schließen Hautkrankheiten wie Ekzem, Psoriasis, allergische Dermatitis, Neurodermatitis, Pruritis und Hypersensibilitätsreaktionen; entzündliche Zustände der Nase, des Rachens oder der Lungen, wie Asthma (einschließlich allergen-induzierter asthmatischer Reaktionen), Rhinitis (einschließlich Heuschnupfen), nasale Polypen, chronisch obstruktive Lungenkrankheit, interstitielle Lungenerkrankung und Fibrose; Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis; und entzündliche Zustände des Magen-Darm-Traktes wie Urtikarie und entzündliche Darmzustände wie ulzeröse Kolitis und Morbus Crohn ein. Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung können ebenfalls Nutzen in der Behandlung von Störungen des Auges aufweisen, wie Konjunktiva und Konjunktivitis.

Die Fachleute werden einsehen, daß sich hier ein Verweis auf die Behandlung auf die Prophylaxe sowie auf die Behandlung etablierter Zustände erstreckt.

Es wird somit als weiterer Aspekt in der Erfindung eine Verbindung wie zuvor definiert oder ein physiologisch akzeptables Salz oder Solvat davon zur Verwendung in der Human- oder Veterinärtherapie bereitgestellt, insbesondere in der topischen oder lokalen Therapie, ganz besonders in der Behandlung von Patienten mit entzündlichen und/oder allergischen Zuständen, speziell mit Atemwegsstörungen oder Störungen des Magen-Darm-Traktes.

Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung wie zuvor definiert oder eines physiologisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Therapie bereitgestellt, insbesondere in der topischen oder lokalen Therapie, insbesondere zur Behandlung von Patienten mit entzündlichen und/oder allergischen Zuständen, speziell mit Atemwegsstörungen oder Störungen des Magen-Darm-Traktes.

In einem besonders bevorzugten Aspekt wird ein Verfahren zur Bereitstellung einer lokalisierten therapeutischen Wirkung an einem Zielort innerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers bereitgestellt. Mit Zielort ist der Ort gemeint, an der die therapeutische Wirkung gewünscht ist. Beispiele für geeignete Ziele würden die Lunge, wenn eine therapeutische respiratorische Wirkung gewünscht ist, oder den Magen-Darm-Trakt einschließen, wenn eine therapeutische gastrointestinale Wirkung gewünscht ist. Das Verfahren umfaßt das Verabreichen einer Verbindung an den Zielort. Die Verbindung wird allgemein in "einer therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht, d. h. einer ausreichenden Menge, um den Zustand oder die Störung zu lindern, für den/die die Verbindung verabreicht wird. Die Verbindung ist im menschlichen oder tierischen Blut zu einer Verbindung mit reduzierter therapeutischer Aktivität hydrolysierbar.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Test- oder Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereitgestellt, die eine therapeutische Wirkung an einem Zielort innerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers mit reduzierter systemischer Wirkung auf den Körper bereitstellen kann.

Das Verfahren beruht auf einem Vergleich der Hydrolyseanfälligkeit der Verbindung in Gegenwart von Lactonase-Enzym mit der entsprechenden Anfälligkeit in Abwesenheit des Lactonase-Enzyms. Eine Verbindung wird ausgewählt, falls sie eine gesteigerte Hydrolyseanfälligkeit in Gegenwart des Lactonase-Enzyms besitzt. Die Hydrolyseanfälligkeit wird bevorzugt mittels des hier definierten "enzymatischen Hydrolysetestverfahrens" verglichen.

Das Lactonase-Enzym ist bevorzugt menschliche Serum-Paraoxonase oder eine rekombinante Form davon oder gereinigtes Lactonase-Enzym, das aus Plasma erhalten wird. Bevorzugte Verbindungen besitzen eine Halbwertszeit in Gegenwart von Lactonase-Enzym von weniger als 1 Stunde, bevorzugt weniger als 30 Minuten, besonders bevorzugt weniger als 10 Minuten.

Die Verbindungen der Erfindung können zur Verabreichung in jeder herkömmlichen Weise formuliert werden, und die Erfindung schließt daher in ihrem Umfang ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die eine Verbindung wie zuvor definiert oder ein physiologisch akzeptables Salz oder Solvat davon im Gemisch mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Verdünnungsmitteln oder Trägern umfassen.

Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen bereitgestellt, welches das Vermischen der Bestandteile umfaßt. Die Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung können z. B. zur oralen, bukkalen, sublingualen, lokalen oder rektalen Verabreichung formuliert werden, speziell zur lokalen Verabreichung.

Die lokale Verabreichung wie hier definiert schließt die Verabreichung durch Insufflation und Inhalation ein. Beispiele für verschiedene Typen der Zubereitung zur lokalen Verabreichung schließen Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Schäume, Zubereitungen zur Übertragung durch transdermale Pflaster, Puder, Sprays, Aerosole, Kapseln oder Kartuschen zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator oder Tropfen (z. B. Augen- oder Nasentropfen), Lösungen/Suspensionen zur Vernebelung, Suppositorien, Pessare, Retentionsklistiere und kaubare oder lutschbare Tabletten oder Pellets (z. B. zur Behandlung von Aphthen) oder Liposom- oder Mikroverkapselungszubereitungen ein.

Salben, Cremes und Gele können z. B. mit einer wäßrigen oder öligen Basis unter Zugabe geeigneter Verdickungs- und/oder Geliermittel und/oder Lösungsmittel formuliert werden. Solche Basen können daher z. B. Wasser und/oder ein Öl wie flüssiges Paraffin oder ein Pflanzenöl wie Erdnußöl oder Rizinusöl, oder ein Lösungsmittel wie Polyethylenglykol einschließen. Verdickungsmittel und Geliermittel, die gemäß der Natur der Basis verwendet werden können, schließen weiches Paraffin, Aluminiumstearat, Cetostearylalkohol, Polyethylenglykol, Wollfett, Bienenwachs, Carboxypolymethylen und Cellulose-Derivate und/oder Glycerylmonostearat und/oder nichtionische Emulgatoren ein.

Lotionen können mit einer wäßrigen oder öligen Basis formuliert werden und werden allgemein ebenfalls einen oder mehrere Emulgatoren, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel, Suspendiermittel oder Verdickungsmittel enthalten.

Puder zur äußeren Anwendung können mit Hilfe jeder geeigneten Puderbasis gebildet werden, z. B. Talkum, Lactose oder Stärke. Tropfen können mit einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Basis formuliert werden, die ebenfalls ein oder mehrere Dispergiermittel, Solubilisierungsmittel, Suspendiermittel oder Konservierungsmittel umfaßt.

Sprayzusammensetzungen können z. B. als wäßrige Lösungen oder Suspensionen oder als Aerosole formuliert werden, die aus Druckpackungen, wie z. B. aus einem Dosierinhalator, unter Verwendung eines geeigneten verflüssigten Treibmittels übertragen werden. Aerosolzusammensetzungen, die zur Inhalation geeignet sind, können entweder eine Suspension oder Lösung sein und enthalten allgemein eine Verbindung der Erfindung und ein geeignetes Treibmittel, wie z. B. einen Fluorkohlenstoff oder wasserstoffhaltigen Chlorfluorkohlenstoff oder Mischungen daraus, insbesondere Hydrofluoralkane, speziell 1,1,1,2-Tetrafluorethan, 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluor-n-propan oder eine Mischung daraus. Die Aerosolzusammensetzung kann gegebenenfalls zusätzliche Formulierungsexzipienten enthalten, die allgemein fachbekannt sind, wie Tenside, z. B. Oleinsäure oder Lecithin, und Cosolventien, z. B. Ethanol.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Aerosolformulierung bereitgestellt, die eine Verbindung wie hier zuvor definiert oder ein physiologisch akzeptables Salz oder Solvat davon und einen Fluorkohlenstoff oder wasserstoffhaltigen Chlorfluorkohlenstoff als Treibmittel umfaßt, gegebenenfalls in Kombination mit einem Tensid und/oder einem Cosolvens.

Vorteilhaft können die Formulierungen der Erfindung durch Zugabe geeigneter Puffermittel gepuffert werden.

Kapseln und Kartuschen zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator aus z. B. Gelatine können formuliert werden, die eine Pulvermischung zur Inhalation aus einer Verbindung zur Verwendung in der Erfindung und einer geeigneten Pulverbasis wie Lactose oder Stärke enthalten. Jede Kapsel oder Kartusche kann allgemein zwischen 20 &mgr;g und 10 mg der Verbindung zur Verwendung in der Erfindung enthalten. Alternativ kann die Verbindung zur Verwendung in der Erfindung ohne Exzipienten wie Lactose angeboten werden.

Der Anteil der aktiven Verbindung zur Verwendung in der Erfindung in den lokalen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hängt vom genauen Typ der herzustellenden Formulierung ab, aber wird allgemein im Bereich von 0,001 bis 10 Gew.-% sein. Allgemein wird jedoch für die meisten Typen der Zubereitung der verwendete Anteil vorteilhaft im Bereich von 0,005 bis 1 und vorzugsweise 0,01 bis 0,5% sein. Jedoch wird in Pulvern zur Inhalation oder Insufflation der verwendete Anteil im Bereich von 0,1 bis 5% sein.

Aerosolformulierungen werden bevorzugt so angepaßt, daß jede abgemessene Dosis oder der "Sprühstoß" von Aerosol 20 bis 2000 &mgr;g, bevorzugt ca. 20 bis 500 &mgr;g einer Verbindung zur Verwendung in der Erfindung enthält. Die Verabreichung kann einmal täglich oder mehrere Male täglich erfolgen, z. B. 2-, 3-, 4- oder 8-mal, was z. B. 1, 2 oder 3 Dosen jedes Mal ergibt. Die tägliche Gesamtdosis mit einem Aerosol wird im Bereich von 100 &mgr;g bis 10 mg sein, bevorzugt 200 bis 2000 &mgr;g. Die tägliche Gesamtdosis und die abgemessene Dosis, die durch Kapseln und Kartuschen in einem Inhalator oder Insufflator übertragen werden, werden allgemein die doppelten derjenigen mit Aerosolformulierungen sein.

Zur internen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen z. B. in herkömmlicher Weise zur oralen oder rektalen Verabreichung formuliert werden. Formulierungen zur oralen Verabreichung schließen Sirupe, Elixiere, Pulver, Granalien, Tabletten und Kapseln ein, die typischerweise herkömmliche Exzipienten enthalten, wie Bindemittel, Füllstoff, Schmiermittel, Tablettensprengmittel, Benetzungsmittel, Suspendiermittel, Emulgatoren, Konservierungsmittel, Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und/oder Süßungsmittel nach Bedarf. Einheitsarzneiformen sind jedoch bevorzugt, wie nachfolgend beschrieben.

Bevorzugte Formen der Zubereitung zur internen Verabreichung sind Einheitsarzneiformen, d. h. Tabletten und Kapseln. Solche Einheitsarzneiformen enthalten 0,1 bis 20 mg, bevorzugt 2,5 bis 10 mg der Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung.

Allgemein können Zubereitungen zur internen Verabreichung 0,05 bis 10% des aktiven Bestandteils enthalten, abhängig vom Typ der beteiligten Zubereitung. Die tägliche Dosis kann von 0,1 bis 60 mg variieren, z. B. 5 bis 30 mg, abhängig vom behandelten Zustand und der gewünschten Dauer der Behandlung.

Formulierungen mit langsamer Freisetzung oder enterisch überzogene Formulierungen können vorteilhaft sein, insbesondere zur Behandlung von entzündlichen Darmstörungen und entzündlichen Störungen des Magen-Darm-Traktes.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls in Kombination mit einem anderen Therapeutikum verwendet werden. Wenn die Verbindung der Erfindung z. B. ein Steroid ist, könnte dieses in Kombination mit einem &bgr;₂-Adrenorezeptoragonisten, einem Antihistaminikum oder einem Antiallergikum verwendet werden, speziell mit einem &bgr;₂-Adrenorezeptoragonisten. Die Erfindung stellt somit in einem weiteren Aspekt eine Kombination bereit, die eine Verbindung der Erfindung oder ein physiologisch akzeptables Salz oder Solvat davon zusammen mit einem anderen Therapeutikum umfaßt.

Die oben bezeichnete Kombination kann zweckmäßig zur Verwendung in Form einer pharmazeutischen Formulierung angeboten werden, und daher stellen pharmazeutische Formulierungen, die eine Kombination wie oben definiert zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Träger umfassen, einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.

Die individuellen Verbindungen solcher Kombinationen können entweder sequenziell oder gleichzeitig in separaten oder kombinierten pharmazeutischen Formulierungen verabreicht werden. Geeignete Dosen bekannter Therapeutika werden leicht für die Fachleute ersichtlich sein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, aber beschränken die Erfindung keineswegs.

Die grundsätzlichen Verfahrensschritte, die zur Isolierung und Reinigung von Lactonase-Enzym aus menschlichem Plasma verwendet werden, können wie folgt zusammengefaßt werden:

• – das Blut wird zentrifugiert und das Plasma zurückbehalten;
• – das Plasma wird durch eine Affinitätschromatographiesäule geleitet, wie z. B. eine Säule aus Cibracon Blue-Matrix, um Albumin aus dem Plasma zu entfernen, dann durch eine Ionenaustauschersäule, die eine Anionenaustauschermatrix enthält, wie z. B. eine quaternäre Ammoniumanionenaustauschermatrix, um die Plasmaproteine abzutrennen und zu reinigen;
• – die Enzymaktivität wird zurückgewonnen, unter Verwendung von Ammoniumsulfat ausgefällt und dann weiter unter Verwendung einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographiesäule (HIC), einer Gelpermeationschromatographie-Matrix (GPC) und schließlich Heparin/Lectin-Affinitäts-Matrizen gereinigt.

Das folgende ausführliche Reinigungsverfahren wurde für dieses Beispiel eingesetzt:

Menschliches Blut (600 ml) aus mehreren Freiwilligen wurde in heparinisierten Röhrchen (250 Einheiten Heparin/ml Blut) gesammelt und unter Verwendung einer Zentrifuge Heraeus Labofuge 400R bei 4°C mit 3501 g rotiert. Plasma (300 ml) wurde abdekantiert, vereinigt und bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Nach Auftauen über Nacht bei 4°C wurde das Plasma mit dem 5-fachen seines Eigenvolumens an Beladungspuffer A (25 mM HEPES, 6 mM Calciumchlorid, 5 mM Dithiothreit, pH 6,95) verdünnt und für 20 Minuten in 20 ml-Teilmengen zentrifugiert, um teilchenförmiges Material zu entfernen. Das verdünnte Plasma wurde dann auf eine Pseudo-Affinitätschromatographiesäule geladen, die Cibracon Blue-Matrix enthielt, um selektiv Albumin vom Plasma zu entfernen. Diese Säule war in Reihe mit einer Ionenaustauschersäule gekoppelt, die eine Q-Sepharose-Matrix enthielt (quaternäre Ammoniumanionenaustauscher-Matrix). Die zwei Säulen wurden mit Beladungspuffer A gewaschen, bis die UV-Extinktion (bei 280 nm) der eluierenden Lösung den Basislinienwert erreichte. Die Cibracon Blue-Säule wurde entfernt und die Q-Sepharosesäule wiederum mit Natriumchlorid-Lösung in Beladungspuffer A und dann Natriumchlorid-Lösung gewaschen um sicherzustellen, daß die Säule kein weiteres gebundenes Protein enthielt. Schließlich wurde die Säule mit 1,0 M Natriumchlorid gewaschen. Fraktionen, die die Lactonase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt, und festes Ammoniumsulfat (auf 4,1 M) wurde langsam hinzugegeben, um den Großteil der löslichen Proteine auszufällen. Diese wurden dann durch Zentrifugieren mit 3501 g für 30 Minuten bei 20°C zurückgewonnen. Die Pelletfraktion, die die Lactonase-Aktivität enthielt, wurde in 1,64 M Ammoniumsulfatpuffer gelöst und dann auf eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographiesäule (HIC) geladen. Die Lactonase-Aktivität schien an die Matrix zu binden. Die Säule wurde mit einer Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen und dann weiter mit Puffer gewaschen, bis die UV-Extinktion den Basislinienwert erreichte. Die vereinigten aktiven Fraktionen wurden mit Puffer verdünnt und auf die nächste Säule geladen, die keramischen Hydroxylapatit (Biorad) enthielt. Die ungebundene Fraktion enthielt keine Lactonase-Aktivität. Die Säule wurde mit Kaliumphosphat-Lösung in einem Beladungspuffer gewaschen. Es wurde festgestellt, daß das eluierende Protein die Lactonase-Aktivität enthielt, und diese Fraktionen wurden deshalb vereinigt und unter Verwendung von Ultrafiltrations-Konzentratoreinheiten (Amicon) aufkonzentriert. Die gesamte aufkonzentrierte vereinigte aktive Fraktion wurde auf eine Säule geladen, die eine Gel-Permeationschromatographiematrix enthielt, Superdex 200 (Pharmacia). Die eluierten Fraktionen, die die Lactonase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und bei –20°C gelagert. Die vereinigte aktive Fraktion wurde auf < 0,5 ml unter Verwendung von Ultrafiltrations-Konzentratoreinheiten (Amicon) aufkonzentriert. Die gesamte aufkonzentrierte vereinigte aktiv Fraktion wurde auf den letzten chromatographischen Schritt geladen, der zwei Säulen in Reihe verwendete. Die erste war eine Säule, die eine Heparin-Affinitätsmatrix enthielt, und die zweite Säule enthielt eine Weizenkeim-Lectinaffinitätsmatrix.

Lactonase-Aktivität wurde im Leervolumen beobachtet, was zeigt, daß sie nicht an Heparin oder Weizenkeimlectin unter beschriebenen Bedingungen bindet.

Die gemäß A oben gereinigte Enzymaktivität wurde mit klassischen Inhibitoren getestet um festzustellen, zu welcher Enzymfamilie sie gehört. Ebenfalls wurde untersucht, ob ein zweiwertiges Kation als Cofaktor erforderlich war, wie in W. N. Fishbein et al. offenbart, Journal of Biological Chemistry 1966, 241(21), 4835–4841.

Die untersuchte "Lactonase"-Aktivität wurde nicht durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (10 mM) oder Eserin (50 mM) inhibiert, schwach durch p-Chlormercuribenzoat (PCMB) (1 mM) inhibiert und vollständig durch Zinksulfat (1 mM), EDTA (1 mM) und EGTA (1 mM) inhibiert. Die Aktivität in Gegenwart von EDTA und EGTA wird vollständig wiederhergestellt, falls CaCl₂ (100 mM) hinzugegeben wird. Diese Aktivität wird nicht mit MgCl₂ (100 mM) wiederhergestellt. Diese Daten scheinen nahezulegen, daß "Lactonase": (i) sich von bekannten "klassischen" Arylesterasen in seiner Unempfindlichkeit gegenüber PCMB unterscheiden mag; (ii) aufgrund seiner mangelnden Empfindlichkeit gegenüber PMSF keine Carboxyesterase sein mag; und (iii) wahrscheinlich keine Cholinesterase ist, da sie nicht durch Eserin inhibiert wurde. Die Daten der Calciumabhängigkeit legen nahe, daß das "Lactonase"-Enzym wahrscheinlich mit demjenigen verwandt ist, von dem W. N. Fishbein et al. berichten, Journal of Biological Chemistry 1966, 241(21), 4835–4841.

Das Molekulargewicht der "Lactonase"-Aktivität wurde unter Verwendung einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Technik untersucht. Eine der sichtbaren Banden wurde als menschliche Serum-Paraoxonase identifiziert, wie in WO 96/01322 erörtert. Dieses bekannte Enzym hat ein Molekulargewicht von ca. 40 kDa.

Schmelzpunkte wurden auf einem Kofler-Block bestimmt und sind unkorrigiert. ¹H-NMR-Spektren wurden bei 250 oder 400 MHz aufgezeichnet, und die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan ausgedrückt. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet, um die Multiplizitäten der Signale zu beschreiben: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), m (Multiplett), dd (Dublett von Dubletts), dt (Dublett von Tripletts) und b (breit). MS (TSP + ve) und Ms (ES + ve) bezeichnen Massenspektren, die im positiven Modus unter Verwendung von Thermospray- bzw. Elektrospray-Techniken erhalten werden. HRMS (Es + ve) bezeichnet ein hochauflösendes Elektrospray-Massenspektrum, das im positiven Modus erhalten wird. DC (Dünnschichtchromatographie) wurde an Merck Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten durchgeführt, und Säulenchromatographie wurde an Merck Kieselgel 60 (Art. 7734 oder 9385) durchgeführt. PLC (präparative Schichtchromatographie) wurde an Whatman-Kieselerdeplatten durchgeführt. Präparative HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) wurde an einem Gilson Medical Electronics-System unter Verwendung der im Beispiel angegebenen stationären Phase durchgeführt. DMF wird als Abkürzung für wasserfreies N,N-Dimethylformamid verwendet. Organische Lösungen wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.

Wenn Mischungen aus Isomeren, die aus dem asymmetrischen Zentrum in der Lacton-Gruppe resultieren, hergestellt wurden, können diese Isomere durch herkömmliche Chromatographie an Kieselerde getrennt und als Isomere A bzw. B in der Reihenfolge der Elution aus der Säule zugeordnet werden.

Die angegebenen Ausgangsstoffe und Zwischenstufen können entweder durch schon fachbekannte Verfahren, durch die in den angegebenen Literaturverweisen beschriebenen Verfahren oder gemäß der nachfolgend angegebenen Beschreibung hergestellt werden.

1,1'-Carbonyldiimidazol (1 g, 6,17 mmol) wurde in einer Portion zu einer gerührten Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;,17&agr;-dihydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (1,2 g, 2,91 mmol) in trockenem DMF (15 ml) gegeben. [6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;,17&agr;-dihydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure ist ein bekannter Stoff, der z. B. gemäß dem in GB-A-2088877 beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.] Die Mischung wurde unter Stickstoff für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zwischen Wasser (100 ml) und Ethylacetat (100 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Schaum eingedampft. Das Rohprodukt wurde in Ethylacetat (10 ml) verrieben. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen, mit Ethylacetat (2 × 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben (684 mg, 54%). Das Ethylacetatfiltrat wurde aufkonzentriert und an Kieselgel unter Elution mit Diethylether chromatographiert, um eine zusätzliche Menge der Titelverbindung zu ergeben (275 mg, 22%):

MS (TSP + ve) m/z 439 [MH]⁺;

NMR &dgr; (DMSO-d₆) schließt ein: 7,24 (1H, d, J10 Hz), 6,29 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 6,21 (1H, s), 5,72 und 5,54 (1H, 2m), 5,69 (1H, d, J4 Hz), 4,2 (1H, m), 3,03 (1H, m), 1,50 (3H, s), 1,2 (3H, s), 0,96 (3H, d, J7 Hz).

(Gefunden: C, 60,11; H, 5,45; S, 7,01.

C₂₂H₂₄F₂O₅S erfordert: C, 60,26; H, 5,52; S, 7,31%).

Gepulvertes wasserfreies Kaliumcarbonat (69 mg, 0,5 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (234 mg, 0,5 mmol) in trockenem DMF (2,5 ml) gegeben. [6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure ist ein bekannter Stoff, der z. B. gemäß dem in GB-A-2088877 beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.] Die Mischung wurde unter Stickstoff für 1 h gerührt und dann mit &agr;-Methylen-&ggr;-butyrolacton (0,1 ml, 1,14 mmol) behandelt, und die Mischung wurde für 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zwischen Wasser (25 ml) und Ethylacetat (25 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 2 M HCl (20 ml) und Kochsalzlösung (2 × 25 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Feststoff eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel und durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Elution mit Diethylether gereinigt, um eine Mischung der zwei Diastereomere zu ergeben (37 mg), die durch HPLC (Chiracel, 25 cm × 2 cm) unter Elution mit 30% Isopropanol-Heptan mit 6 ml/min und Detektion bei 240 nm getrennt wurden, um das Isomer A der Titelverbindung zu ergeben (9 mg, 3%):

MS (TSP + ve) m/z 567 [MH]⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,15 (1H, d, J10 Hz), 6,43 (1H, s), 6,38 (1H, d, J10 Hz), 5,49 und 5,3 (1H, 2m), 4,4 (1H, m), 4,38 (1H, dt, J7 und 2 Hz), 4,2 (1H, dt, J10 und 7 Hz), 3,49 (1H, dd, J14 und 5 Hz), 3,4 (1H, m), 3,10 (1H dd, J14 und 7,5 Hz), 2,95 (1H, m), 2,36 (2H, q, J7,5 Hz), 1,53 (3H, s), 1,12 (3H, t, J7,5 Hz), 1,05 (3H, s), 0,98 (3H, d, J7 Hz);

und das Isomer B der Titelverbindung (7 mg, 2%):

MS (TSP + ve) m/z 567 [MH]⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,15 (1H, d, J10 Hz), 6,43 (1H, s), 6,39 (1H, d, J10 Hz), 5,49 und 5,29 (1H, 2m), 4,4 (2H, dt, J10 und 2 Hz), 4,20 (2H, dt, J10 und 6 Hz), 3,40 (1H, dd, J14 und 5 Hz), 3,3 (1H, m), 3,14 (1H, dd, J14 und 8 Hz), 2,91 (1H, m), 2,35 (2H, q, J7,5 Hz), 1,53 (3H, s), 1,12 (3H, t, J7,5 Hz), 1,08 (3H, s), 1,01 (3H, d, J7 Hz).

Bromessigsäure (588 mg, 4,33 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung aus &bgr;-Mercapto-&ggr;-butyrolacton (500 mg, 4,23 mmol) und Triethylamin (0,59 ml, 4,23 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 ml) bei 0°C unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. [&bgr;-Mercapto-&ggr;-butyrolacton ist ein bekannter Stoff, der z. B. gemäß dem Verfahren hergestellt werden kann, das beschrieben wird von G. Fuchs, Ark. Kemi. 1968, 29, 379.] Die Reaktionsmischung wurde für 15 Minuten bei 0°C und für 17 h bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (20 ml) und Ethylacetat (20 ml) wurden hinzugegeben, die die organische Phase wurde abgetrennt, mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab die Titelverbindung (437 mg, 59%):

MS (TSP + ve) m/z 194 (M + NH₄)⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 8,3–7,9 (1H, br), 4,65 (1H, dd, J9,5 und 7 Hz), 4,21 (1H, dd, J9,5 und 6 Hz), 3,88 (1H, m), 3,35 (2H, AB q, J16 Hz). 2,98 (1H, dd, J18 und 8 Hz), 2,56 1H, dd, J18 und 7 Hz).

Oxalylchlorid (0,316 ml, 3,62 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung aus (2-Oxo-tetrahydrofuran-4-ylsulfanyl)-essigsäure (424 mg, 2,41 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (5 ml), das DMF (1 Tropfen) enthielt, unter einer Stickstoffatmosphäre getropft. Nach 4 h wurde das Lösungsmittel entfernt, um die Titelverbindung zu ergeben (434 mg, 93%):

MS (TSP + ve) m/z 195 (M + H)⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 4,63 (1H, dd, J10 und 7 Hz), 4,19 (1H, dd, J10 und 6 Hz), 3,81 (3H, m), 2,98 (1H, dd, J18 und 8 Hz), 2,52 (1H, dd, J18 und 6,5 Hz).

Eine Lösung aus (2-Oxo-tetrahydro-furan-4-ylsulfanyl)-acetylchlorid (354 mg, 1,82 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (4 ml) wurde über 4 Minuten zu einer gerührten Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;,17&agr;-dihydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (300 mg, 0,73 mmol) [siehe Beispiel 1] und Triethylamin (0,254 ml, 1,82 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (15 ml) bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre getropft. Die resultierende Lösung wurde für 1,5 h gerührt und dann mit Diethylamin (0,188 ml, 1,82 mmol) versetzt. Nach 1,5 h wurde Triethylamin (0,142 ml, 1,02 mmol) hinzugegeben, gefolgt von Iodmethan (0,054 ml, 0,874 mmol), und die Reaktionsmischung wurde für weitere 45 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser (30 ml) gegossen und mit Dichlormethan (30 ml × 2) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit gesättigter Kochsalzlösung (40 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte einen hellbraunen Schaum, der an Kieselgel unter Verwendung von Dichlormethan-Ethylacetat (3 : 1) als Elutionsmittel chromatographiert wurde. Entfernung des Lösungsmittels aus den erforderlichen Fraktionen ergab die Titelverbindung (317 mg, 72%):

MS (ES + ve) m/z 585 (M + H)⁺;

IR &ngr;_max (KBr) 1780, 1742, 1686, 1666 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,12 (1H, d, J10 Hz), 6,43 (1H, s), 6,38 (1H, d, J10 Hz), 5,49 und 5,29 (1H, 2m), 4,58 (1H, dd, J9,5 und 7 Hz), 4,41 (1H, m), 4,16 (1H, m), 3,79 (1H, m), 3,39 (1H, m), 3,31 (2H, m), 2,91 (1H, dd, J18 und 8 Hz), 2,37 (3H, s), 1,52 (3H, s), 1,09 (3H, s), 1,05 (3H, d, J7 Hz).

(Gefunden: C, 56,48; H, 5,83; S, 10,86.

C₂₈H₃₄F₂O₇S₂·0,15CH₂Cl₂ erfordert: C, 56,59; H, 5,79; S, 10,73%).

Perchlorsäure (70%ig, 1,62 ml, 18,8 mmol) wurde zu einer gerührten Mischung aus 21-Acetyl-6&agr;,9&agr;-difluor-11&bgr;,21-dihydroxy-16&agr;,17&agr;-isopropylidendioxy-pregn-4-en-3,20-dion (2,33 g, 4,69 mmol), Bromacetaldehyddimethylacetal (1,11 ml, 9,38 mmol) und Sand (46,6 g) in Heptan (58 ml) bei Raumtemperatur gegeben. [21-Acetyl-6&agr;,9&agr;-difluor-11&bgr;,21-dihydroxy-16&agr;,17&agr;-isopropylidendioxy-pregn-4-en-3,20-dion ist ein bekannter Stoff, der z. B. gemäß dem in den US-PSen 4 524 134, 4 684 610, 4 704 358 und 4 749 649 im Namen von Upjohn beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.] Nach Rühren für 17 h wurde das Heptan durch Filtration entfernt, und ein weiterer Teil Heptan (60 ml) wurde zum Sand hinzugegeben, der für 5 Minuten gerührt und dann filtriert wurde. Ethylacetat wurde zum Sand hinzugegeben und die Mischung für 5 Minuten gerührt und dann filtriert. Dieser Prozeß wurde dreimal unter Verwendung von Ethylacetat wiederholt (3 × 60 ml). Die vereinigten Ethylacetat-Filtrate wurden aufkonzentriert und dann durch einen Kieselgelstopfen unter Elution mit Ethylacetat geleitet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und Ethylacetat (60 ml) und gesättigtes Natriumbicarbonat (60 ml) wurden hinzugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (60 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (60 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte einen braunen Schaum, der mit Kieselgel unter Verwendung von Diethylether-Ethanol (30 : 1) als Elutionsmittel chromatographiert wurde. Entfernung des Lösungsmittels aus den erforderlichen Fraktionen ergab die Titelverbindung (480 mg, 20%):

MS (ES + ve) m/z 519 (M + H)⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 6,14 (1H, s), 5,48 (1H, t, J3 Hz), 5,36 (1,5H, m), 5,18 (0,5H, m), 4,88 (1H, d, J20 Hz), 4,41 (1H, m), 4,22 (1H, d, J20 Hz), 3,35 (2H, m), 1,51 (3H, s), 0,93 (3H, s).

Triethylamin (0,315 ml, 2,26 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung aus 16&agr;,17&agr;-(2-Bromethyliden)dioxy-6&agr;,9&agr;-difluor-11&bgr;,21-dihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion (470 mg, 0,905 mmol) und &agr;-Mercapto-&ggr;-butyrolacton (267 mg, 2,26 mmol) in wasserfreiem DMF (3 ml) bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. [&agr;-Mercapto-&ggr;-butyrolacton ist ein bekannter Stoff, der z. B. gemäß dem Verfahren hergestellt werden kann, das beschrieben wird von G. Fuchs, Ark. Kemi. 1968, 29, 379.] Nach Rühren für 42 h wurden Ethylacetat (30 ml) und Wasser (30 ml) hinzugegeben, und die organische Phase wurde abgetrennt, mit gesättigter Kochsalzlösung (30 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte ein braunes Öl, das an Kieselgel unter Verwendung von Dichlormethan-Ethylacetat (1 : 1) als Elutionsmittel chromatographiert wurde. Entfernung des Lösungsmittels aus den erforderlichen Fraktionen ergab die Titelverbindung (185 mg, 37%):

MS (ES + ve) m/z 557 (M + H)⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 6,14 (1H, s), 5,57 (0,5H, t, J3 Hz), 5,51 (0,5H, dd, J5 und 3 Hz), 5,41–5,28 (1,5H, m), 5,18 (0,5H, m), 4,92–4,71 (1H, m), 4,47–4,16 (4H, m), 3,64 (1H, dd, J8,5 und 4,5), 3,28 (0,5H, dd, J14,5 und 2,5), 3,1–2,76 (2,5H, m), 1,52 (3H, s), 0,94 (3H, s).

(Gefunden: C, 56,93; H, 6,02; S, 5,35;

C₂₇H₃₄F₂O₈S·0,2CH₂Cl₂ erfordert: C, 56,96; H, 6,04; S, 5,59%).

Eine Lösung aus 21-Acetoxy-9&agr;-fluor-11&bgr;-hydroxy-pregna-1,4,16-trien-3,20-dion (12,14 g, 30,16 mmol) in DMF (260 ml) wurde mit Diallylmalonat (6,8 g, 36,92 mmol) und DBU (5,11 g, 33,57 mmol) behandelt. [21-Acetoxy-9&agr;-fluor-11&bgr;-hydroxy-pregna-1,4,16-trien-3,20-dion ist ein bekannter Stoff, der z. B. gemäß dem Verfahren hergestellt werden kann, das beschrieben wird von U. Ramesh, Tetrahedron Letters, 1996, 37, 8403.] Die Reaktionsmischung wurde für 11 Tage bei Raumtemperatur gerührt, und dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und mit 1 M HCl gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel unter Elution mit Methanol-Chloroform (3 : 97) chromatographiert, um die Titelverbindung (16,43 g, 93%) als weißen Feststoff zu ergeben:

MS (FAB + ve) m/z 587 [MH]⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,25 (1H, d, J10 Hz), 6,33 (1H, dd, J10 und 1,5 Hz), 6,11 (1H, s), 5,86 (2H, m), 5,27 (4H, m), 4,78 (1H, d, J17 Hz), 4,60 (1H, d, J6 Hz), 4,53 (1H, d, J6 Hz), 4,43 (1H, d, J17 Hz), 4,33 (1H, m), 3,33 (1H, m), 2,15 (3H, s), 1,55 (3H, s), 0,98 (3H, s).

Eine Mischung aus 21-Acetoxy-16&agr;-diallylmalonyl-9&agr;-fluor-11&bgr;-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (9,75 g, 16,6 mmol), Palladium(II)-acetat (74,6 mg, 0,33 mmol), Triphenylphosphin (349 mg, 1,33 mmol), Ameisensäure (1,91 g, 41,5 mmol) und Triethylamin (5,55 g, 54,8 mmol) in Dioxan (530 ml) wurde für 20 min zum Rückfluß erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter reduziertem Druck zu einem Volumen von 250 ml aufkonzentriert und mit Dichlormethan verdünnt. Die Mischung wurde dann mit 0,1 M HCl angesäuert, die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel unter Elution mit Methanol-Chloroform (3 : 47) chromatographiert, um die Titelverbindung (4,02 g, 52%) als weißen Feststoff zu ergeben:

MS (FAB – ve) m/z 461 [M – H]^–;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,25 (1H, d, J10 Hz), 6,23 (1H, dd, J10 und 1 Hz), 6,01 (1H, s), 5,42 (1H, br), 4,71 (1H, d, J17 Hz), 4,58 (1H, d, J17 Hz), 4,13 (1H, m), 2,16 (3H, s), 1,55 (3H, s), 0,98 (3H, s).

Eine Lösung aus 21-Acetoxy-9&agr;-fluor-11&bgr;-hydroxy-3,20-dioxo-pregna-1,4-dien-16&agr;-essigsäure (6,03 g, 13,04 mmol) in DMF (250 ml) wurde mit CuCr₂O₄ (1 g, 33 mol-%), Kieselgel (500 mg), Celite (500 mg) und Essigsäure (25 Tropfen) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde für insgesamt 5 h kräftig gerührt und refluxiert, wobei zusätzliche Mengen von CuCr₂O₄ (1 g), Kieselgel (500 mg), Celite (500 mg) und Essigsäure (25 Tropfen) in stündlichen Intervallen hinzugegeben wurden. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde an Kieselgel unter Elution mit Ethylacetat-Hexan (3 : 2) chromatographiert, um die Titelverbindung (2,55 g, 42%) als weißen Feststoff zu ergeben:

MS (FAB + ve) m/z 461 [MH]⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,24 (1H, d, J10 Hz), 6,33 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 6,12 (1H, s), 4,88 (1H, d, J18 Hz), 4,76 (1H, d, J18 Hz), 4,41 (1H, m), 3,45 (1H, d, J8 Hz), 2,75 (1H, dd, J10 und 18 Hz), 2,63 (1H, m), 2,16 (3H, s), 1,55 (3H, s), 1,03 (3H, s).

Eine Suspension aus 21-Acetoxy-11&bgr;,17&agr;-dihydroxy-9&agr;-fluor-3,20-dioxo-pregna-1,4-dien-16&agr;-essigsäure-&ggr;-lacton (227 mg, 0,49 mmol) in DMSO (11 ml) und Phosphatpuffer pH 7,2 (95 ml) wurde mit Tween 80 (30 Tropfen) gefolgt von Esterase (EC 3.1.1.1; 14,5 mg/ml, 2,2 ml) bei 37°C behandelt. Die Reaktionsmischung wurde kräftig für 20 min gerührt und dann auf 0°C abgekühlt und mit Ethylacetat verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel unter Elution mit Ethylacetat-Hexan (4 : 1 → 9 : 1) chromatographiert, um die Titelverbindung (342,7 mg, 84%) als weißen Feststoff zu ergeben:

MS (FAB + ve) m/z 419 [MH]⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,17 (1H, d, J10 Hz), 6,33 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 6,12 (1H, s), 4,58 (1H, d, J20 Hz), 4,40 (1H, m), 4,28 (1H, d, J20 Hz), 3,52 (1H, t, J9 Hz), 2,77 (1H, dd, J16 und 9 Hz), 2,65 (1H, m), 1,56 (3H, s), 1,01 (3H, s).

&agr;-Mercapto-&ggr;-butyrolacton (772 mg, 6,53 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Diiodpropan (1,12 ml, 9,75 mmol) und Triethylamin (0,906 ml, 6,6 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (6 ml) bei 0°C unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. [&agr;-Mercapto-&ggr;-butyrolacton ist ein bekannter Stoff, der z. B. hergestellt werden kann gemäß dem Verfahren, das beschrieben wird von G. Fuchs, Ark. Kemi. 1968, 29, 379.] Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten bei 0°C und für 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Die rohe Reaktionsmischung wurde an Kieselgel adsorbiert und unter Elution mit Cyclohexan-Ethylacetat (3 : 1) chromatographiert. Entfernung des Lösungsmittels aus den erforderlichen Fraktionen unter reduziertem Druck ergab die Titelverbindung (920 mg, 49%):

MS (TSP + ve) m/z 304 (M + NH₄)⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 4,50–4,30 (2H, m), 3,51 (1H, dd, J8 und 4 Hz), 3,30 (2H, t, J6 Hz), 3,03–2,6 (3H, m), 2,22–2,04 (3H, m).

Diisopropylethylamin (0,228 ml, 1,3 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung aus 2-Amino-1-(4-amino-3,5-dichlor-phenyl)ethanol (504 mg, 2,28 mmol) in wasserfreiem DMF (4 ml) gegeben, gefolgt von einer Lösung aus 3-(3-Iodpropylsulfanyl)-dihydro-2(3H)-furanon (340 mg, 1,19 mmol) in DMF (10 ml) bei 20°C unter einer Stickstoffatmosphäre. [2-Amino-1-(4-amino-3,5-dichlor-phenyl)ethanol ist ein bekannter Stoff, der z. B. hergestellt werden kann gemäß dem Verfahren, das beschrieben wird von J. Keck, Arzneim. Forsch. 1972, 22, 861.] Die Reaktionsmischung wurde für 20 h bei Raumtemperatur gerührt, und dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Die rohe Reaktionsmischung wurde an Kieselgel unter Elution mit Methanol : Chloroform : Triethylamin (4 : 40 : 1) chromatographiert. Entfernung des Lösungsmittels aus den erforderlichen Fraktionen unter reduziertem Druck ergab ein Öl (408 mg), von dem ein Teil weiter durch präparative HPLC (Spherisorb ODS-2, 25 × 2 cm) unter Elution mit einem Gradienten von Acetonitril-0,05% wäßrigem TFA mit 15 ml/min und Auffangen der Fraktionen mit einer Retentionszeit von 10,4 min gereinigt wurde, um die Titelverbindung zu ergeben (103 mg, 17%):

MS (TSP + ve) m/z 379 [M + H]⁺;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,29 (2H, s), 4,46–4,28 (2H, m), 3,73 (1H, dd, J9 und 6 Hz), 3,35–3,05 (4H, m), 3,0–2,62 (3H, m) und 2,2–2,0 (3H, m).

Eine Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (5 g, 10,67 mmol) in DMF (50 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (1,5 g, 10,85 mmol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde unter Stickstoff für 1 h gerührt. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde Chlorethylencarbonat (1,25 ml, 13,81 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 20 h gerührt, worauf Wasser (500 ml) und Ethylacetat (500 ml) hinzugegeben wurden. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (150 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Schaum eingedampft. Dieser wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Diethylether-Cyclohexan (3 : 1) gereinigt, um das Isomer A der Titelverbindung zu ergeben (878 mg, 15%); Smp. 155–167°C;

MS (TSP + ve) 555 [MH]⁺;

HRMS (ES + ve) gefunden: 555,1873 [MH]⁺; C₂₇H₃₃F₂O₈S erfordert 555,1864;

IR &ngr;_max (KBr) 3351, 1820, 1741, 1670, 1635 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,13 (1H, d, J10 Hz), 6,44 (1H, s), 6,43–6,35 (2H, m), 5,49 und 5,30 (1H, 2m), 4,87 (1H, dd, J9 und 8 Hz), 4,48 (1H, dd, J9 und 5 Hz), 4,43 (1H, m), 3,36 (1H, m), 2,40 (2H, q, J7 Hz), 1,54 (3H, s), 1,14 (3H, t, J7 Hz), 1,11 (3H, s), 0,97 (3H, d, J7 Hz);

und das Isomer B der Titelverbindung (840 mg, 14%); Smp. 234–236°C;

MS (TSP + ve) 555 [MH]⁺;

HRMS (ES + ve) gefunden: 555,1851 [MH]⁺; C₂₇H₃₃F₂O₈S erfordert 555,1864;

IR &ngr;_max (KBr) 3336, 1823, 1747, 1668, 1633 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,15 (1H, d, J10 Hz), 6,44 (1H, s), 6,39 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 6,31 (1H, dd, J8 und 5 Hz), 5,50 und 5,30 (1H, 2m), 4,86 (1H, dd, J10 und 8 Hz), 4,53 (1H, dd, J10 und 5 Hz), 4,42 (1H, m), 3,22 (1H, m), 2,38 (2H, q, J7 Hz), 1,53 (3H, s), 1,16 (3H, s), 1,13 (3H, t, J7 Hz), 1,02 (3H, d, J7 Hz);

(Gefunden: C, 58,10; H, 5,91; S, 5,55.

C₂₇H₃₂F₂O₈S erfordert: C, 58,47; H, 5,82; S, 5,77%).

Eine Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;,17&agr;-isopropylidendioxy-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (200 mg, 0,44 mmol) in DMF (5 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (61 mg, 0,44 mmol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde unter Stickstoff für 0,5 h gerührt. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde Chlorethylencarbonat (0,043 ml, 0,53 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 2 h gerührt, worauf Wasser (15 ml) und Ethylacetat (15 ml) hinzugegeben wurden.

Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Feststoff eingedampft. Dieser wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Ethylacetat-Cyclohexan (1 : 1) gereinigt, um das Isomer A der Titelverbindung zu ergeben (27 mg, 11%); Smp. 247–250°C;

MS (TSP + ve) 541 [MH]⁺;

IR &ngr;_max (KBr) 3350, 1822, 1682, 1666, 1621 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,13 (1H, d, J10 Hz), 6,45 (2H, m), 6,39 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 5,49 und 5,30 (1H, 2m), 4,99 (1H, d, J5 Hz), 4,88 (1H, dd, J9 und 8 Hz), 4,42 (2H, m), 3,50 (1H, br s), 1,54 (3H, s), 1,46 (3H, s), 1,24 (3H, s), 1,00 (3H, s)

und das Isomer B der Titelverbindung (42 mg, 18%) Smp. 254–257°C;

MS (TSP + ve) 541 [MH]⁺;

IR &ngr;_max (KBr) 3340, 1821, 1693, 1666, 1623 cm^–1;

NMR &dgr; (DMSO-d₆) schließt ein: 7,27 (1H, d, J10 Hz), 6,40 (1H, dd, J9 und 5 Hz), 6,32 (1H, d, J10 Hz), 6,12 (1H, s), 5,75 und 5,55 (1H, 2m), 5,58 (1H, d, J4 Hz), 4,93 (2H, m), 4,52 (1H, dd, J9 und 6 Hz), 4,20 (1H, m), 1,50 (3H, s), 1,47 (3H, s), 1,21 (3H, s), 0,90 (3H, s);

(Gefunden: C, 57,5; H, 5,6; S, 5,8.

C₂₆H₃₀F₂O₈S erfordert: C, 57,8; H, 5,6; S, 5,9%).

Eine Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-carbonsäure (249 mg, 0,55 mmol) in DMF (5 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (38 mg, 0,28 mmol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde unter Stickstoff für 2 h gerührt. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde Natriumiodid (20 mg, 0,13 mmol) hinzugegeben, gefolgt von Chlorethylencarbonat (0,456 ml, 5,52 mmol). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 20 h gerührt, worauf Wasser (10 ml) und Ethylacetat (10 ml) hinzugegeben wurden. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Schaum eingedampft. Dieser wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Chloroform-Ethanol (15 : 1) gereinigt, um das Isomer A der Titelverbindung zu ergeben (23 mg, 8%); Smp. 251–253°C;

MS (TSP + ve) 539 [MH]⁺;

HRMS (ES + ve) gefunden: 539,2068 [MH⁺],

C₂₇H₃₃F₂O₉ erfordert: 539,2093;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,09 (1H, dd, J10 und 1 Hz), 6,77 (1H, dd, J7 und 2 Hz), 6,44 (1H, s), 6,38 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 5,48 und 5,28 (1H, 2m), 4,61 (1H, dd, J10 und 7 Hz), 4,39 (1H, m), 4,35 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 3,33 (1H, m), 2,39 (2H, q, J7 Hz), 1,53 (3H, s), 1,14 (3H, t, J7 Hz), 1,10 (3H, s), 0,94 (3H, d, J7 Hz);

und das Isomer B der Titelverbindung (14 mg, 5%);

MS (TSP + ve) 539 [MH]⁺;

HRMS (ES + ve) gefunden: 539,2069 [MH]⁺;

C₂₇H₃₃F₂O₉ erfordert 539,2093;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,10 (1H, dd, J10 und 1 Hz), 6,62 (1H, dd, J6 und 2 Hz), 6,44 (1H, s), 6,38 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 5,48 und 5,28 (1H, 2m), 4,65 (1H, dd, J10 und 5 Hz), 4,55 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 4,41 (1H, m), 3,81 (1H, m), 3,24 (1H, m), 2,38 (2H, q, J7 Hz), 1,53 (3H, s), 1,12 (6H, s und t, J7 Hz), 0,96 (3H, d, J7 Hz).

Eine Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (228 mg, 0,49 mmol) in DMF (4 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (67 mg, 0,49 mmol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde unter Stickstoff für 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde eine Lösung aus 4-Brom-methyl-5-methyl-1,3-dioxol-2-on (123 mg, 0,64 mmol) in DMF (1 ml) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt, worauf die Mischung unter reduziertem Druck aufkonzentriert wurde. Wasser (25 ml) und Ethylacetat (25 ml) wurden zum Rückstand hinzugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (20 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Gummi eingedampft. Dieses wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Chloroform-Methanol (40 : 1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, und der Rückstand (115 mg) wurde in Diethylether (3 ml) verrieben, um die Titelverbindung zu ergeben (76 mg, 27%);

MS (TSP + ve) 581 [MH]⁺;

IR &ngr;_max (KBr) 3412, 1821, 1740, 1668, 1629 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,11 (1H, dd, J10 und 1 Hz), 6,44 (1H, s), 6,38 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 5,44 und 5,32 (1H, 2m), 4,41 (1H, m), 3,90 (2H, AB q, J14 Hz), 3,34 (1H, m), 2,35 (2H, q, J7 Hz), 2,17 (3H, s), 1,52 (3H, s), 1,12 (3H, t, J7 Hz), 1,00 (3H, s), 0,97 (3H, d, J7 Hz);

(Gefunden: C, 59,6; H, 6,2;

C₂₉H₃₄F₂O₈S erfordert: C, 60,0; H, 5,9%).

Eine Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;,17&agr;-isopropylidendioxy-3-oxo-androsta-1,4-dien-17&bgr;-thiocarbonsäure (200 mg, 0,44 mmol) in DMF (5 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (61 mg, 0,44 mmol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde unter Stickstoff für 0,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde 4-Brommethyl-5-methyl-1,3-dioxol-2-on (102 mg, 0,53 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 22 h gerührt, worauf Wasser (20 ml) und Ethylacetat (20 ml) hinzugegeben wurden. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (20 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Feststoff eingedampft. Dieser wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Ethylacetat-Cyclohexan (1 : 1) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (212 mg, 85%); Smp. 241–244°C;

MS (TSP + ve) 567 [MH]⁺; IR &ngr;_max (KBr) 3418, 1822, 1667, 1663 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,12 (1H, d, J10 Hz), 6,44 (1H, s), 6,38 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 5,49 und 5,29 (1H, 2m), 4,98 (1H, d, J5 Hz), 4,40 (1H, m), 4,03 (1H, d, J18 Hz), 3,70 (1H, d, J18 Hz), 2,19 (3H, s), 1,53 (3H, s), 1,44 (3H, s), 1,22 (3H, s), 0,87 (3H, s);

(Gefunden: C, 59,4; H, 5,7; S, 5,6.

C₂₈H₃₂F₂O₈S erfordert: C, 59,4; H, 5,7; S, 5,7%).

Eine Lösung aus 6&agr;,9&agr;-Difluor-11&bgr;-hydroxy-16&agr;-methyl-3-oxo-17&agr;-propionyloxy-androsta-1,4-dien-17&bgr;-carbonsäure (220 mg, 0,49 mmol) in DMF (4 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (67 mg, 0,49 mmol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde unter Stickstoff für 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde eine Lösung aus 4-Brommethyl-5-methyl-1,3-dioxol-2-on (123 mg, 0,64 mmol) in DMF (1 ml) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 3,5 h gerührt, worauf die Mischung unter reduziertem Druck aufkonzentriert wurde. Wasser (30 ml) und Ethylacetat (30 ml) wurden zum Rückstand hinzugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen, getrocknet und zu einem Schaum eingedampft. Dieser wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Chloroform-Methanol (60 : 1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, und der Rückstand (65 mg) wurde in Diethylether (3 ml) verrieben, um die Titelverbindung zu ergeben (26 mg, 9%);

MS (TSP + ve) 565 [MH]⁺;

IR &ngr;_max (KBr) 3393, 1822, 1747, 1669, 1630 cm^–1;

NMR &dgr; (CDCl₃) schließt ein: 7,11 (1H, d, J10 Hz), 6,43 (1H, s), 6,38 (1H, dd, J10 und 2 Hz), 5,44 und 5,32 (1H, 2m), 4,95 und 4,80 (1H jeweils, d, J14 Hz), 4,39 (1H, m), 3,28 (1H, m), 2,35 (2H, q, J7 Hz), 2,20 (3H, s), 1,52 (3H, s), 1,15 (3H, t, J7 Hz), 0,98 (3H, s), 0,93 (3H, d, J7 Hz);

(Gefunden: C, 60,7; H, 6,35;

C₂₉H₃₄F₂O₉0,5H₂O erfordert: C, 60,7; H, 6,15%).

Die pharmakologische Aktivität wurde in einem funktionellen in-vitro-Test untersucht, um Glukokortikoidaktivität nachzuweisen, die allgemein voraussagend für entzündungshemmende oder antiallergische Aktivität in vivo ist.

Der verwendete funktionelle Test war eine Modifikation des Verfahrens, das von T. S. Berger et al. beschrieben wird, J. of Steroid Biochem. Molec. Biol. 1992, 41 (3–8), 733–738, "Interaction of Glucocorticoid analogues with the Human Glucocorticoid Receptor".

Dabei wurden Hela-Zellen stabil mit einem detektierbaren Reportergen (sezernierte plazentale alkalische Phosphatase, sPAP) unter der Kontrolle eines Glukokortikoid-Response-Promotors (der LTR des Maus-Mammatumorvirus, MMTV) transfiziert.

Unterschiedliche Konzentrationen von Standard (Dexamethason) oder Verbindungen der Erfindung wurden mit transfizierten Hela-Zellen für 72 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde Substrat (p-Nitrophenolacetat) für sPAP hinzugegeben und das Produkt durch ein spektrophotometrisches Verfahren gemessen. Eine erhöhte Extinktion spiegelte eine erhöhte sPAP-Transkription wider, und Konzentrations-Reaktions-Geraden wurden konstruiert, so daß EC₅₀-Werte abgeschätzt werden konnten.

In diesem Test besaßen die Verbindungen der Beispiele, 1, 2, 3, 4 und 5 EC₅₀-Werte von weniger als ca. 250 nM. Die Verbindungen von Beispiel 7 (Isomere A und B) und 10 besaßen EC₅₀-Werte von weniger als 500 nM.

Die Verbindung von Beispiel 6 wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, eine Relaxation der elektrisch induzierten kontraktilen Reaktionen in trachealen Streifen vom Meerschweinchen zu induzieren, wie beschrieben von Coleman und Nials, Journal of Pharmacological Methods 1989, 21, 71–86. EC₅₀-Werte wurden für die Testverbindung und für den Standard Isoprenalin für den gleichen trachealen Streifen erhalten. Es wurde festgestellt, daß der EC₅₀-Wert für die Verbindung von Beispiel 6 5,3-mal größer als derjenige des Isoprenalin-Standards war.

Die Stabilität verschiedener Verbindungen der Beispiele in menschlichem Plasma wurde unter Verwendung des folgenden Testverfahrens "Stabilität in menschlichem Plasma" getestet: 500 &mgr;l-Teilmengen von menschlichem Plasma in schraubverschlossenen Polypropylenröhrchen wurden bei 37°C in einem Wasserbad für 5 min vorinkubiert. Die Plasmaproben wurden dann mit 5 &mgr;l Testverbindung versetzt (nominell 5 mg/ml in DMSO). Teilmengen (100 &mgr;l) wurden unmittelbar und nach 5 Minuten entfernt und mit einem gleichen Volumen Acetonitril vermischt. Die Proben wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden in Autosampler-Fläschchen zur HPLC und Halbwertszeit-Analyse überführt.

Im HPLC-Verfahren wurden Teilmengen (20 &mgr;l) aller Überstände auf eine Zorbax Rx C8-Säule (250 × 4,6 mm; Hichrom) injiziert. Die Säule wurde bei 40°C gehalten und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit einer mobilen Phase aus Acetonitril: 50 mM Ammoniumformiat (65 : 35), die mit Ameisensäure auf pH 4,2 eingestellt war, eluiert. Die Detektion erfolgte durch UV-Extinktion bei 240 nm, und die chromatographischen Peak-Flächen für sowohl Stammverbindung als auch Metabolit wurden gemessen.

Zur Bestimmung der Halbwertszeit wurden die Peakflächen für jede Verbindung gegen die Zeit in einem logarithmisch-linearen Maßstab aufgetragen und die Halbwertszeiten durch Extrapolation oder Interpolation einer geraden Linie bestimmt, die die zwei Punkte verbindet.

Es wurde festgestellt, daß alle Isomere/Verbindungen der Beispiele instabil in menschlichem Plasma waren, was anzeigt, daß von ihnen erwartet wird, daß sie ein vorteilhaftes Nebenwirkungsprofil in vivo besitzen. Die Verbindungen/Isomere aller Beispiele zeigen Halbwertszeiten von weniger als 1 h. Die Verbindungen der Beispiele 3, 4 und 6 bis 12 zeigen Halbwertszeiten von weniger als 10 min.

Die Hydrolyseanfälligkeit für menschliche Serum-Paraoxonase bestimmter Verbindungen der Beispiele wurde unter Verwendung des Testprotokolls des hier beschriebenen "enzymatischen Hydrolysetestverfahrens" bewertet.

Es wurde festgestellt, daß die Verbindungen der Beispiele 3, 4, 7 (Isomer A), 9 (Isomer A) und 12 alle durch das Paraoxonase-Enzym hydrolysiert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Verbindungen der Beispiele 2, 3, 4, 6 und 7 (Isomer B) erhalten, als der Test unter Verwendung von gereinigtem Lactonase-Enzym wiederholt wurde, das aus menschlichem Plasma erhalten wurde.

Die Stabilität der Verbindung der Beispiele 4 und 6 in einer Modellumgebung der menschlichen Lunge wurde unter Verwendung des folgenden Testprotokolls bewertet: Inkubationen wurden durchgeführt bei 37°C in 500 &mgr;l-Volumina von menschlicher Lunge S9, verdünnt 1 : 1 mit 10 mM Phosphatpuffer pH 7,4, zu dem 50 &mgr;l 30 mg/ml (aq) NADPH gegeben worden waren. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5 &mgr;l Testverbindung begonnen (nominell 5 mg/ml Lösung in DMSO). Teilmengen (100 &mgr;l) wurden unmittelbar und nach 1 Stunde entfernt und mit einem gleichen Volumen Acetonitril zum Beenden der Reaktion vermischt. Proben wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden in Autosampler-Fläschen zur HPLC-Analyse und Halbwertszeit-Analyse unter Verwendung von Verfahren überführt, die identisch mit denjenigen waren, die im oben beschriebenen Testprotokoll "Stabilität in menschlichem Plasma" beschrieben wurden. Kontrollinkubationen, die kein Lunge S9 enthielten, wurden ebenfalls eingeschlossen.

Die Verbindungen der Beispiele 4 und 6 wurden nur langsam in dieser Lunge S9-Zubereitung hydrolysiert (Halbwertszeit > 60 min). Es wird somit veranschaulicht, daß dieser Verbindungen Stabilität in einer Zielgewebeumgebung (in diesem Fall die Lunge) zeigen, während sie schnell in einer Plasmaumgebung inaktiviert werden.