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Dokumentenidentifikation DE69433682T2 21.04.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000683791
Titel WÄSSRIGE PROTEINZUSAMMENSETZUNG, ENTHALTEND GLYKOPROTEINE, VERFAHREN ZUR HERST ELLUNG UND VERWENDUNGEN
Anmelder Apoh Technologies SA, Montpellier, FR
Erfinder Stefas, Elie, 34280 La Grande-Motte, FR;
Rucheton, Marcel, 34000 Montpellier, FR;
Graafland, Hubert, 34000 Montpellier, FR
Vertreter Reitstötter, Kinzebach & Partner (GbR), 81679 München
DE-Aktenzeichen 69433682
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 09.02.1994
EP-Aktenzeichen 949062533
WO-Anmeldetag 09.02.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/FR94/00143
WO-Veröffentlichungsnummer 0094018228
WO-Veröffentlichungsdatum 18.08.1994
EP-Offenlegungsdatum 29.11.1995
EP date of grant 07.04.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.04.2005
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 14/435   A61K 38/00   G01N 33/569   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Proteinzusammensetzung, die ausgehend von humanem Blutplasma bei der Herstellung von Albumin als Sekundärprodukt erhalten wird, ihr Herstellungsverfahren, das Glycoprotein, das sie enthält, und die Verwendung des Glycoproteins in Agenzien zur Stabilisierung von Albumin und als Agens, mit dem sich Antikörper nachweisen und/oder messen lassen.

Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, entweder nach der Methode von COHN (siehe Cohn J. et al., J. Amer. Chem. Soc. 72, 465-474 (1950)) oder nach einer abgeleiteten Methode, bei der man aufeinanderfolgende Behandlungen mit Wärme und Ethanol vornimmt, oder nach einer analogen Methode, bei der man ein anderes Fällungsmittel als Ethanol verwendet (insbesondere Ether, Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol oder Caprylsäure), Blutplasma zu fraktionieren, um Lösungen humanen Albumins zu erhalten. Nach der Methode von Cohn, welche in der Praxis am häufigsten verwendet wird, wird das Plasma auf –30 °C abgekühlt und dann auf –2 °C erwärmt, was zu einem Kryopräzipitat führt, das den Blutgerinnungsfaktor VIII, Fibronogen und Fibronektin enthält. Man trennt den Überstand, "Überstand I" genannt, von dem oben erwähnten Präzipitat ab, senkt seinen pH Wert auf 5,85 ± 0,05 ab und gibt Ethanol zu, bis die Ethanolkonzentration 19 Vol.-% beträgt, wobei die Temperatur allmählich mit der Zugabe von Ethanol bis auf -5 °C abgesenkt wird. Auf diese Art und Weise erhält man ein Präzipitat, "Präzipitat (II + III)" genannt, das insbesondere die Gammaglobuline und einen Albumin und Verunreinigungen enthaltenden Überstand, "Überstand (II + III)" genannt, enthält. Man nimmt den auf diese Art und Weise erhaltenen Überstand auf und erhöht den Alkoholanteil bis auf eine Ethanolkonzentration von 40 Vol.-%, wobei die Temperatur bis auf etwa –8 °C abgesenkt wird. Auf diese Art und Weise erhält man ein Präzipitat, "Präzipitat IV" genannt, und einen Überstand, "Überstand IV" genannt, der das Albumin mit einem Reinheitsgrad von etwa 94 bis 97 Gew.-% enthält. Der Überstand IV kann als Ausgangsmaterial für die gewünschten Albuminlösungen dienen, jedoch enthält er eine große Menge Ethanol; einer ersten Technik folgend kann man den Überstand IV direkt gegen physiologisches Serum dialysieren, jedoch muss man eine sehr große Menge Wasser verwenden und das Verfahren ist daher langsam und teuer; einer weiteren Technik folgend senkt man den pH-Wert des Überstands IV auf 4,80 ± 0,05 ab, wodurch das Albumin ausfällt: man trennt das Präzipitat, "Präzipitat V" genannt, ab und löst es wieder in physiologischem Serum, wobei der Ethanolrest durch Dialyse extrahiert wird.

Die nach Dialyse des „Überstands IV" oder des erneut gelösten „Präzipitats V" erhaltenen wässrigen Lösungen enthalten Albumin und, bezogen auf das Gesamtproteingewicht, etwa 4 Gew.-% weitere sogenannte Sekundär- oder verunreinigende Proteine und/oder Polymere.

Der FR-A-2 690 444 zufolge trennt man das Albumin von anderen Proteinen mit einem Flüssigphasenchromatographie-Verfahren ab, wobei man nach Dialyse die Albumin enthaltende wässrige Lösung über wenigstens eine als „hydrophob" bezeichnete Chromatographiesäule gibt, die mit einem partikulären Material befällt ist, das einen Teil der von Albumin verschiedenen Proteine zurückzuhalten vermag; um die Trennung abzuschließen, wird ebenfalls vorgeschlagen, die wässrige Albuminlösung über wenigstens eine Affinitätschromatographiesäule zu geben, die einen neutralen oder nahezu neutralen, mit einer polysulfatierten Verbindung beladenen, partikulären Träger enthält. Das mit diesem Verfahren erhaltene Eluat besteht aus einer Lösung gereinigten Albumins, wobei der Großteil der Sekundärproteine entweder auf der (den) hydrophoben Chromatographie-Säule(n) oder auf der (den) Affinitätschromatogra-phie-Säule(n) fixiert ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens chromatographiert man eine wässrige Albuminlösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,8 und einer Konzentration von mehr als 1 g/l und weniger als 400 g/l.

Vorteilhafterweise wählt man als partikuläres Material, das die verunreinigenden Proteine in der hydrophoben Chromatographie zurückzuhalten vermag, einen neutralen partikulären Träger, dessen Partikel mit einer hydrophoben C3-C8-Alkylreste tragenden Verbindung beladen sind; insbesondere wählt man als die Trägerpartikel beladene Verbindung eine Verbindung, die Butylreste aufweist: das Füllbett besteht beispielsweise aus dem Produkt, das von der Firma „MERCK" unter der Handelsbezeichnung „FRACTOGEL TSK BUTYL-650" vertrieben wird. Die Affinitätschromatographie wird vorzugsweise auf einem Dextransulfatgel durchgeführt. Zur Durchführung der Affinitätschromatographie und der hydrophoben Chromatographie wählt man vorzugsweise ein partikuläres Material mit mittleren granulometrischen Abmessungen von weniger als 300 &mgr;m. Der Chromatographiefluss beträgt im Allgemeinen 10 bis 20 cm/Stunde und die Temperatur 2 bis 25 °C. Die Affinitätschromatographie kann nach oder vorzugsweise vor der hydrophoben Chromatographie durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß hat man festgestellt, dass man die auf den Füllbetten der oben erwähnten Chromatographiesäulen fixierten Sekundärproteine eluieren und auf diese Art und Weise Proteinzusammensetzungen erhalten konnte, die insbesondere für den pharmazeutischen Bereich nützlich sind.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Proteinzusammensetzung aus humanem Blutplasma, wobei man das Plasma durch Einwirkung von Temperatur und eines Fällungsagens aufeinander folgenden Behandlungen unterwirft, um nach wenigstens partieller Abtrennung der Faktoren VIII und IX und von Gammaglobulinen zu Fällungsagens enthaltenden Albuminlösungen zu gelangen, man dann aus den erhaltenen Lösungen, insbesondere durch Dialyse, das Fällungsagens abtrennt, um eine rohe wässrige Albuminlösung zu erhalten, und man die rohe wässrige Albuminlösung wenigstens einer Flüssigphasenchromatographie unterwirft, um wenigstens einen Teil der von Albumin verschiedenen Sekundärproteine zurückzuerhalten, wobei die Flüssigphasenchromatographie wenigstens eine Affinitätschromatographie auf einem partikulären Träger beinhaltet, der aus Partikeln besteht, die mit wenigstens einer Sulfatgruppen aufweisenden Verbindung beladen sind, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man nach Durchlauf der Albuminlösung den partikulären Träger der vorstehend genannten Affinitätschromatographie einer Elution unterwirft, und man die gewünschte Proteinzusammensetzung durch Eluieren gewinnt.

Die Elution wird vorzugsweise bewirkt, indem man eine Salzlösung durchlaufen lässt, um die Ionenstärke zu erhöhen. Die Salzlösung ist vorzugsweise eine NaCl-Lösung mit einer Konzentration von wenigstens 0,3 M, vorteilhafterweise 2 M; ihr geht vorteilhafterweise ein Waschvorgang voraus. Das Waschen des Affinitätschromatographieträgers wird insbesondere mit Hilfe eines Salzpuffers mit einer Molarität von 0,16 mol/l, vorzugsweise eines Phosphatpuffers durchgeführt, der aus Mono- und Dinatriumphosphaten, insbesondere mit einer Konzentration von 0,01 mol/l, und aus Natriumchlorid, insbesondere mit einer Konzentration von 0,15 mol/l, in einen pH-Wert von 7,00 ± 0,05 ergebenden Anteilen besteht. Man wäscht so lange wie die optische Dichte des Eluats oberhalb eines vorgegebenen Wertes, beispielsweise 0,1 ODE (Optische Dichte-Einheit), liegt.

Die durch Elution der Affinitätschromatographiesäule(n) erhaltene Lösung enthält ein Proteingemisch. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die auf diese Art und Weise erhaltene Proteinzusammensetzung. Diese Zusammensetzung enthält ein Glycoprotein, das ein Molekulargewicht von 50 000 ± 3000 Dalton nach Reduktion oder ohne Reduktion mit 2-Mercaptoethanol aufweist. Das Glycoprotein macht 5 bis 100 Gew.-% des Gesamtproteingehalts der nach der Herstellungsweise erhaltenen Zusammensetzung aus; im Allgemeinen lässt sich mit der Elution eine gewichtsbezogene Konzentration von 0,05 g bis 30 g Glycoprotein pro Liter Eluat erhalten; diese Konzentration kann aber durch Verdünnung verringert oder durch Konzentration des Eluats erhöht werden.

Das erfindungsgemäß isolierte Glycoprotein weist die nachfolgend angegebenen Charakteristika und Eigenschaften auf.

Die 20 ersten Aminosäuren seiner N-terminalen Region sind insbesondere durch Mikrosequenzierung in der Gasphase mit Hilfe einer Vorrichtung „Applied Biosystems Inc., Modell 470", die an ein Phenylrheohydantoin-Analysegerät Modell 120 A (ABI) gekoppelt war, bestimmt worden:

Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp-Asp-Leu-Pro-Phe-Ser-Thre-Val-Val-Pro-Leu-Lys-Thre.

Diese Sequenz aus den 20 ersten Aminosäuren entspricht derjenigen eines &bgr;2-Glycoproteins aus Plasma, welches (1) in dem Artikel von J. LOZIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 81, Seiten 3640–3644, Juni 1984 und (2) in dem Artikel von T. KRISTENSEN et al., FEBS Letters, Vol. 289, 1991, Seiten 183–186 beschrieben ist.

Die Aminosäurezusammensetzung des erfindungsgemäß isolierten Glycoproteins wurde an zwei verschiedenen Präparationen von zwei verschiedenen Laboratorien durchgeführt:

  • a) die erste Präparation A wurde durch saure Hydrolyse in 5,7 M HCl 24 Stunden lang bei 110 °C mit einem Aminosäure-Analysegerät „BECKMANN 6 300", das zwecks Auswertung mit einem System „GOLD" verbunden war, behandelt,
  • b) die zweite Präparation B wurde ebenfalls mit einem Aminosäure-Analysegerät „BECKMANN 6 300" nach 24- und 72-stündiger Hydrolyse mit 6N HCl analysiert.

Die erhaltenen Resultate sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben, wo sie mit den von J. LOZIER et al. (1) und T. KRISTENSEN et al. (2) veröffentlichten Resultaten verglichen werden. Diese Resultate zeigen, dass das Glycoprotein ein &bgr;2'-Glycoprotein I ist, das dem von J. LOZIER et al. und T. KRISTENSEN et al. beschriebenen &bgr;2-Glycoprotein I nahe kommt.

Dennoch unterscheidet sich dieses Glycoprotein von dem &bgr;2-Glycoprotein I. Nach Reinigung, Präzipitation des erfindungsgemäßen Glycoproteins mit Aceton und Dialyse gegen destilliertes Wasser führt die Sequenzierung nämlich zur Identifizierung von 14 Aminosäuren, die jeweils zu zweit herauskommen und der Nterminalen Region des Proteins entsprechen. Angesichts des Reinheitsgrads der Proteinpräparation entspricht dies einer Spaltung des Ausgangsproteins. Tatsächlich entsprechen 7 dieser Aminosäuren der N-terminalen Region. Es handelt sich um die Sequenz:

Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro

Nach Deduktion entsprechen die anderen 7 Aminosäuren dem Peptid:

Phe-Trp-Lys-Ser-Asp-Ala-Ser

Dieses Peptid entspricht der Region zwischen den Aminosäuren 315 und 321, die von J. LOZIER für das &bgr;2-Glycoprotein I beschrieben worden ist; es gibt jedoch einen Unterschied von einer Aminosäure. Es handelt sich um ein Serin an Stelle eines Threonins. Das erfindungsgemäß isolierte Glycoprotein ist daher ein Allotyp des &bgr;2-Glycoproteins I, das in Folge &bgr;2'-Glycoprotein I genannt wird.

Nach Spaltung des Proteins mit Bromcyan, Auftrennung der erhaltenen Peptide und Analyse der ersten drei Aminosäuren eines jeden Peptids findet man die von J. LOZIER et al. beschriebenen Resultate wieder.

Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Proteinzusammensetzung, die mit dem oben beschriebenen Verfahren durch Elution der Affinitätschromatographiesäule(n) erhalten wird, und das &bgr;2'-Glycoprotein I wie es oben definiert ist.

Man hat gefunden, dass sowohl die Proteinzusammensetzung als auch das &bgr;2'-Glycoprotein I antigen sind, d.h. mit Antikörpern aus humanen Wesen, beispielsweise solchen, die mit HBV, HIV oder dem Gougerot-Sjögren-Syndrom infiziert sind, im ELISA oder Immunabdruck nachweisbar sind; unter bestimmten Bedingungen werden sie ebenfalls von monoklonalen Antikörpern, die für p25/p55-GAG des Virus HIV1 (Ac. Mo. RL4.72.1) und das antioncogene Protein p53 (Ac. Mo. 122) spezifisch sind, im ELISA erkannt; man kann die Zusammensetzung und das &bgr;2'-Glycoprotein I daher zur Charakterisierung und Messung von Antikörpern gegen diese Proteine bei Kranken, die an AIDS, Hepatitis B, Leukämien, dem Gougerot-Sjögren-Syndrom oder Myelomen leiden, verwenden. Das ELISA-Verfahren ist beispielsweise in dem Artikel von ENGVALL et al., Immunochemistry 1971, 8, Seiten 871 bis 879, und das Verfahren zum Immunabdruck beispielsweise in TOWBIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, Seiten 4350–4354 beschrieben.

Die Proteinzusammensetzung und das &bgr;2'-Glycoprotein I inhibieren dosisabhängig die Denaturierung von Albumin bei 60 °C, die in der Turbidimetrie beobachtet wird; sie können daher zur Stabilisierung von Albumin, insbesondere bei seiner Tyndallisierung verwendet werden.

Das &bgr;2'-Glycoprotein I kann von den Sekundärproteinen, mit denen es in der durch Elution der Affinitätschromatographiesäule erhaltenen Proteinzusammensetzung vermischt ist, wie folgt abgetrennt werden: Die Zusammensetzung wird vom sulfatierten Dextrangel mit einer wenigstens 0,3 M, vorteilhafterweise etwa 2 M, NaCl-Lösung eluiert; das erhaltene Eluat wird in einem Salzpuffer so verdünnt, dass seine Ionenstärke auf weniger als 0,2 sinkt; die erhaltene Lösung wird einer Chromatographie auf Phosphatgel unterzogen, und dann wird das auf dem Phosphatgel fixierte Glycoprotein eluiert, indem man die Ionenstärke mit einem Salzpuffer mit einer Ionenstärke von vorzugsweise mehr als 0,4 erhöht. Der Chromatographiefluss auf phosphatiertem Gel beträgt vorzugsweise 10 bis 20 cm/Stunde und die Temperatur beträgt vorzugsweise 0 bis 40 °C, vorzugsweise 2 bis 25 °C, unter üblichen Bedingungen.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Albumin bei seiner Tyndallisierung stabilisierendes Agens, welches die Proteinzusammensetzung oder das &bgr;2'-Glycoprotein I, wie oben definiert, enthält, und ein Agens, mit dem sich Antikörper aus humanen Wesen, die mit HBV, HIV, mit dem Gougerot-Sjögren-Syndrom oder Myelomen infiziert sind, im ELISA-Verfahren oder Immunabdruck nachweisen und/oder messen lassen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die oben definierte Proteinzusammensetzung oder das &bgr;2'-Glycoprotein I enthält.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird nun in rein veranschaulichender und nicht beschränkender beispielhafter Weise ein Herstellungsweg des erfindungsgemäßen &bgr;2'-Glycoprotein I beschrieben.

Als Ausgangssubstanz verwendet man Humanplasma, das mit dem von KISTLER und NITSCHMAN (Vox Sang. 7, 414–424 (1962)) beschriebenen Verfahren fraktioniert wurde; das Verfahren leitet sich von dem Verfahren von COHN ab, wobei die Albumin enthaltenden Ausgangsfraktionen entweder der Überstand IV oder das Präzipitat V sind.

Geht man vom Überstand IV aus, der 40 % (Volumen) Ethanol beinhaltet und einen pH-Wert von 5,85 ± 0,05 aufweist, verdünnt man den Überstand zur Hälfte mit einer NaCl-Lösung (7 g/l). Der pH-Wert wird mit 1 N Natronlauge auf 7,45 ± 0,05 eingestellt. Man konzentriert das Albumin bis auf 90 g/l in einer Ultrafiltrationskassette vom Typ "Omega" (Filtron), welche in einem Ultrafiltrationssystem "Minisette SS Cell NPT Cell" (Filtron Tech. Corp.) betrieben wird, vor. Diese Kassette besitzt eine Filtrationsoberfläche von 0,07 m2 und eine Ausschlussgrenze von 30 KDa. Die Zirkulation wird durch eine peristaltische Pumpe gewährleistet, deren Druck sich von 2 × 105 Pa zu Beginn des Vorgangs bis auf 5 × 105 Pa gegen Ende ändert. Wird die Konzentration von 90 g/l Albumin erreicht, setzt man der Albuminlösung eine NaCl-Lösung (9 g/l) zu und dialysiert bei konstantem Volumen weiter, bis man einen Alkoholanteil von weniger als 0,1 Vol.-% erhält. Ist das Ethanol auf diese Weise eliminiert, setzt man die Dialyse fort, um die Lösung bis auf 200 g Albumin pro Liter zu konzentrieren. Man stellt den pH-Wert mit 1 N Salzsäure auf 7,10 ± 0,05 ein.

Geht man vom Präzipitat V aus, suspendiert man das Präzipitat in physiologischem Serum (NaCl-Lösung mit 9 g pro Liter), wobei man 4 Liter physiologisches Serum pro kg Präzipitat verwendet. Man filtriert, um Präzipitatklümpchen zu entfernen, die während des Rührens nicht suspendiert wurden; man stellt den pH-Wert mit 1 N Natronlauge auf 7,45 ± 0,05 ein und konzentriert die so erhaltene Lösung auf 90 g Proteine pro Liter, wobei man dasselbe Dialysesystem verwendet, das zuvor für den Überstand IV beschrieben wurde. Die Dialyse wird fortgeführt, indem man physiologisches Serum nachgibt und bei konstantem Volumen arbeitet, bis ein endgültiger Ethanolanteil von weniger als 0,1 Vol.-% erreicht ist. Ist das Ethanol auf diese Weise eliminiert worden, führt man die Dialyse fort, um die Lösung bis auf 200 g Proteine pro Liter zu konzentrieren. Man stellt den pH-Wert mit 1 N Salzsäure auf 7,10 ± 0,05 ein.

Die auf diese Weise ausgehend vom Überstand IV oder vom Präzipitat V hergestellte Albuminlösung wird dann steril filtriert (Filter "Millex-GS", 0,2 Micron (Millipore)).

Die auf diese Weise erhaltene rohe wässrige Albuminlösung wird dann zunächst einer Affinitätschromatographie unterzogen. Diese Chromatographie wird in einer 50 ml-Säule (2,5 cm × 10 cm) (Biorad) durchgeführt, die mit einem von der Firma "SIGMA" unter der Handelsbezeichnung "DEXTRAN BEADS SULFATED" vertriebenen partikulären Material beladen ist. Die Säule wird zunächst äquilibriert, indem man 3 Säulenvolumina physiologisches Serum über das Bett laufen lässt. Dann wird die Albuminlösung über die Säule geschickt, und das Eluat kann zur Herstellung von Albumin gewonnen werden.

Der Fortgang der Chromatographie wird verfolgt, indem man die Extinktion der Fraktionen bei 280 nm am Ausgang der Säule misst. Der Chromatographiefluss beträgt 16 cm/Stunde; die Chromatographie wird bei 20 bis 25 °C durchgeführt. Nachdem das als Eluat wiedergewonnene Albumin die Säule passiert hat, wird die Affinitätssäule mit einem nahezu isotonischen Salzpuffer, vorzugsweise einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,00 ± 0,05, der aus Mono- und Dinatriumphosphaten (insbesondere 0,01 mol/l) und aus Natriumchlorid (insbesondere 0,15 mol/l) besteht, gewaschen, bis die Extinktion des Eluats weniger als 0,1 beträgt. Dann eluiert man die auf der Affinitätssäule fixierten Proteine, indem man die Ionenstärke durch Durchlauf einer 2 M NaCl-Lösung erhöht. Das Waschen und die Elution werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Fließgeschwindigkeiten für das Waschen und die Elution 16 cm/h betragen.

An der erhaltenen Lösung wurde eine denaturierende SDS-PAGE-Elektrophorese durchgeführt. Man stellte fest, dass es eine diffuse Bande gab, die einem Protein mit einem Molekulargewicht von 50 000 ± 3000 Dalton nach Reduktion oder ohne Reduktion mit 2-Mercaptoethanol entsprach. Die Färbetechnik nach Schiff zeigte, dass dieses Protein ein Glycoprotein ist. Nachdem man in diesem Experiment das Gel mit Coomassie-Blue angefärbt hat, zeigt die Untersuchung der Oberfläche der Extinktionspeaks, dass die Zusammensetzung 55 Gew.-% &bgr;2'-Glycoprotein I bezogen auf die Gesamtproteine enthält.

Das &bgr;2'-Glycoprotein I wird dann folgendermaßen abgetrennt und gereinigt: Die durch Elution der Affinitätschromatographiesäule(n) mit Hilfe einer 2 mol/l NaCl-Lösung erhaltene Proteinzusammensetzung wird mit einem Puffer, der aus Mono- und Dinatriumphosphaten (insbesondere 0,01 mol/l) in einen pH-Wert von 6,8 ± 0,05 ergebenden Anteilen besteht, 10-fach verdünnt. Anschließend wird sie einer Chromatographie auf phosphatiertem Gel unterzogen. Diese Chromatographie wird auf einer 50 ml-Säule (2,5 cm × 10 cm) (Biorad) durchgeführt, die mit einem von der Firma „BIO-RAD" unter der Handelsbezeichnung „BIO-GEL HTP" vertriebenen partikulären Material beladen ist. Die Säule wird zunächst äquilibriert, indem man 3 Säulenvolumina Puffer, der aus Mono- und Dinatriumphosphaten (insbesondere 0,01 mol/l) in einen pH-Wert von 6,8 ± 0,05 ergebenden Anteilen besteht, über das Bett schickt. Dann wird das Proteineluat aus der vorhergehenden Chromatographie, verdünnt, über diese Säule geschickt. Die Chromatographie wird mit einem Fluss von etwa 15 cm/h bei einer Temperatur von 20 °C durchgeführt. Das Eluat wird eliminiert und der Chromatographieträger anschließend gewaschen, wobei man einen Phosphatpuffer verwendet, der mit demjenigen übereinstimmt, der der Äquilibrierung der Säule diente. Man wäscht so lange wie die Extinktion des Eluats größer als ein vorbestimmter Wert, beispielsweise als 0,1 ODE (Optische Dichte-Einheit), ist.

Dann eluiert man das &bgr;2'-Glycoprotein I, das unter diesen Bedingungen auf dem Phosphatgel fixiert wird, indem man die Ionenstärke erhöht. Der Elutionsvorgang wird vorzugsweise mit Hilfe einer KCl-Lösung durchgeführt, die eine Konzentration von etwa 1 M besitzt. Diese Elutionslösung besteht aus Mono- und Dinatriumphosphaten (insbesondere 0,01 mol/l) in einen pH-Wert von 6,8 ± 0,05 ergebenden Anteilen und aus 1 mol/l KCl. Der Fortgang der Chromatographie wird verfolgt, indem man die Extinktion der Fraktionen bei 280 nm am Ausgang der Säule misst. Der Säulenfluss zur Äquilibrierung, zur Beladung, zum Waschen und zur Elution beträgt 16 cm/h. Die Chromatographie wird bei 20 °C durchgeführt.

Das Eluat wird gewonnen und anschließend dialysiert, vorzugsweise in einem isotonischen Puffer. Verfolgt man den Fortgang der Chromatographie, stellt man fest, dass man wenigstens 0,5 g &bgr;2'-Glycoprotein I pro Liter Chromatographiebett laden kann.

Das vom Hydroxyapatit-Gel (BIO-GEL HTP) erhaltene Eluat wurde mit denaturierender SDS-PAGE Elektrophorese analysiert. Man stellte fest, dass es eine einzige Bande gab, die einem Protein mit einem Molekulargewicht von 50 000 ± 3000 entsprach, und dies nach Reduktion oder ohne Reduktion mit 2-Mercaptoethanol. Die Reinheit dieser Präparation wurde mit einer sogenannten „HPLC"-Chromatographie auf „FRAKTOGEL TSK 3000 SW" (Tosho-Gerät) untersucht, und man stellte ebenfalls fest, dass es einen einzigen Proteinpeak gab.

Das auf diese Weise isolierte Glycoprotein besitzt die zuvor in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Zusammensetzungs- und Sequenzcharakteristika, die zeigen, dass es sich um einen Allotyp des &bgr;2'-Glycoprotein I handelt: das &bgr;2'-Glycoprotein I.

Die im Folgenden gegebenen Beispiele zeigen die Stabilisierung des Albumins durch die Zusammensetzung, die das &bgr;2'-Glycoprotein I enthält.

Beispiel 1

Man stellt zwei Albuminlösungen her, A und B, welche die gleiche Proteinkonzentration (90 mg/ml), den gleichen pH-Wert (7,1) und die gleiche Ionenstärke aufweisen. Bei der Lösung A handelt es sich um eine Albuminlösung, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten, nicht aber der Chromatographiebehandlung unterzogen wurde, und bei der Lösung B handelt es sich um eine gereinigte Albuminlösung, die nach Affinitätschromatographie auf einem Dextransulfatgel vor allem zur Entfernung der auf der Chromatographiesäule zurückgehaltenen Proteinzusammensetzung erhalten wurde. Diese beiden Albuminlösungen A und B werden bei 60 °C inkubiert. Während der Inkubation wird über eine Zeitspanne von 5 Stunden jede Stunde die Turbidität jeder Lösung mit Hilfe eines Turbidimeters RATIO XR (HACH 43900) bestimmt.

Die zeitabhängige Turbiditätskurve 1 zeigt eine der Wärme zuzuschreibende Turbidität, die für die Albuminlösung B größer ist als für die Albuminlösung A, was zeigt, dass man aus dem Albumin A dank der Chromatographieschritte einen Stoff, der die auf Wärme zurückzuführende Proteindenaturation hemmt, entfernt hat.

Beispiel 2

Zu der im vorangehenden Beispiel beschriebenen Albuminlösung B, die eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml besitzt, werden zunehmende Mengen des Eluats aus der Affinitätschromatographie auf Dextransulfat, welches die Proteinzusammensetzung bildet, zugegeben. Die Kurve 2 zeigt, dass mit zunehmender Konzentration dieses Eluats die Turbidität des Albumins nach 5-stündiger Erwärmung auf 60 °C abnimmt. Diese Kurve ist zum einen ein Beleg dafür, dass die Proteinzusammensetzung die Tyndallisierung hemmt, und zum anderen dafür, dass diese Hemmung dosisabhängig ist.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Proteinzusammensetzung aus humanem Blutplasma, wobei man das Plasma durch Einwirkung von Temperatur und eines Fällungsagens aufeinander folgenden Behandlungen unterwirft, um nach wenigstens partieller Abtrennung der Faktoren VIII und IX und von Gammaglobulinen zu Fällungsagens enthaltenden Albuminlösungen zu gelangen, man dann aus den erhaltenen Lösungen das Fällungsagens abtrennt, um eine rohe wässrige Albuminlösung zu erhalten, und man die rohe wässrige Albuminlösung wenigstens einer Flüssigphasenchromatographie unterwirft, um wenigstens einen Teil der von Albumin verschiedenen Sekundärproteine zurückzuhalten, wobei die Flüssigphasenchromatographie wenigstens eine Affinitätschromatographie auf einem partikulären Träger, bestehend aus neutralen, mit wenigstens einer Sulfatgruppen aufweisenden Verbindung beladenen Partikeln, beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, dass man nach Durchlauf der Albuminlösung den partikulären Träger der vorstehend genannten Affinitätschromatographie einer Elution unterwirft, und man die gewünschte Proteinzusammensetzung durch Eluieren gewinnt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution durch Durchlauf einer Salzlösung bei ansteigender Ionenstärke bewirkt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionsvorgang mit Hilfe einer NaCl-Lösung realisiert wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass dem Elutionsvorgang wenigstens ein Waschvorgang vorhergeht.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Waschen mit Hilfe eines nahezu isotonischen Salzpuffers mit einen pH-Wert von 7,00 ± 0,05 ergebenden Anteilen bewirkt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man solange wäscht wie die optische Dichte des Eluats über einem vorgegebenen Wert liegt.
  7. Wässrige Proteinzusammensetzung, erhältlich mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  8. Glycoprotein, &bgr;2'-Glycoprotein I genannt, das in der wässrigen Proteinzusammensetzung nach Anspruch 7 enthalten ist und ein Molekulargewicht von 50.000 ± 3.000 Dalton nach Reduktion oder ohne Reduktion mit 2-Mercaptoethanol aufweist, worin die 20 ersten Aminosäuren der N-terminalen Region die folgenden sind:

    Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp-Asp-Leu-Pro-Phe-Ser-Thr-Val-Val-Pro-Leu-Lys-Thr

    und die Sequenz der Aminosäuren 315 bis 321

    Phe-Trp-Lys-Ser-Asp-Ala-Ser

    ist.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie 5 bis 100 Gew.% des Glycoproteins des Anspruchs 8 bezogen auf den Gesamtproteingehalt enthält.
  10. Verfahren zur Abtrennung des Glycoproteins nach Anspruch 8 aus der Zusammensetzung, die durch Elution der Affinitätschromatographiesäule(n) nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung auf Dextransulfatgel mit einer wenigstens 0,3 M NaCl-Lösung behandelt wird; das erhaltene Eluat in einem Salzpuffer so verdünnt wird, dass seine Ionenstärke auf weniger als 0,2 sinkt; die erhaltene Lösung einer Chromatographie auf Phosphatgel unterzogen wird, und dann das auf dem Phosphatgel fixierte Glycoprotein eluiert wird, indem man die Ionenstärke mit einem Salzpuffer mit einer Ionenstärke von mehr als 0,4 erhöht.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Chromatographiefluss auf phosphatiertem Gel 10 bis 20 cm/Stunde beträgt, wobei die Temperatur 0°C bis 40°C beträgt.
  12. Agens, das Albumin bei seiner Tyndallisierung stabilisiert, dadurch gekennzeichnet, dass es die Proteinzusammensetzung nach Anspruch 7 oder das Glycoprotein nach Anspruch 8 enthält.
  13. Agens, mit dem sich Antikörper aus humanen Wesen, die mit HBV, HIV, mit dem Gougerot-Sjögren-Syndrom oder Myelomen infiziert sind, im ELISA oder Immunabdruck nachweisen und/oder messen lassen, dadurch gekennzeichnet, dass es die Proteinzusammensetzung nach Anspruch 7 oder das Glycoprotein nach Anspruch 8 enthält.
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