Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, ein On-Board-Kontrollsystem zu entwickeln, das die genannten Nachteile – insbesondere bezüglich Herstellkosten und Probenvolumen – nicht besitzt und trotzdem zuverlässig die mögliche Unbrauchbarkeit von Testelementen, insbesondere aufgrund falscher Lager- oder Transportbedingungen, anzeigt. Insbesondere sollte schädigende Feuchtigkeits- und/oder Temperaturbelastung der Testelemente mit Hilfe der erfindungsgemäßen OBC erkannt werden. Die angestrebte OBC sollte desweiteren nicht zu früh reagieren, um eine lange Raumtemperaturlagerung des Produkts zu ermöglichen, und mit hoher Präzision eine gute Diskriminierung von intakten und defekten Streifen ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst.

Der Gegenstand der Erfindung ist ein Kontrollreagenzsystem gemäß Anspruch 1, dessen Verwendung gemäß Anspruch 8, ein entsprechendes Analyseelement gemäß Anspruch 9, sowie ein Verfahren zur Kontrolle von Analyseelementen gemäß Anspruch 12. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die Erfindung wird durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung, die Figuren und Beispiele näher erläutert.

Das erfindungsgemäße Konzept, das auch als 1-Kanal-On-Board-Kontrolle bezeichnet werden kann, sieht vor, dass ein Reagenzbezirk auf einem Testelement, welcher vorzugsweise ebenfalls für die eigentliche Vermessung der Patientenprobe dient, eine Substanz enthält, die sich bei Belastung verändert. Die Veränderung dieser Substanz führt dabei bevorzugt zu einem Abbauprodukt, welches entweder visuell oder von dem für den Teststreifen zur Vermessung vorgesehenen Gerät detektiert wird. Ein als defekt erkannter Streifen kann beispielsweise durch das Messgerät für die Messung der Patientenprobe nicht frei gegeben werden.

Das erfindungsgemäße Reagenzsystem eignet sich zur On-Board-Kontrolle von Analyseelementen. Das Reagenzsystem enthält dabei zumindest eine chemische Substanz, vorzugsweise jedoch ein Gemisch von chemischen Substanzen. Zumindest eine der Substanzen eignet sich dabei für die direkte oder indirekte Anzeige von Umweltbedingungen, die die Zuverlässigkeit eines Analyseelements beeinträchtigen können. Diese Eigenschaft wird als On-Board-Kontrolleigenschaft bezeichnet. Dabei werden schädigende Umwelteinflusse, wie Temperatur, Feuchtigkeit, Licht, Sauerstoff etc., dazu ausgenutzt, in der besagten Substanz oder mit der besagten Substanz eine vorzugsweise irreversible Veränderung durchzuführen, die eine nachträgliche Detektion der schädigenden Einflüsse ermöglicht. Hierbei ist es meist unerheblich, die genaue Art der schädigenden Einflüsse zu bestimmen; es reicht in aller Regel, die Tatsache nachzuweisen, dass ein schädigendes Ereignis stattgefunden hat.

Das Reagenzsystem zur On-Board-Kontrolle kann neben der Substanz, die die eigentliche On-Board-Kontrollfunktion bewirkt, weitere Hilfssubstanzen enthalten. Beispielsweise können dies Puffersubstanzen, Füllstoffe, Filmbildner und dergleichen mehr sein, die dem Fachmann in einer Vielzahl von Ausführungsformen im Zusammenhang mit Reagenzienrezepturen für analytische Testelemente bekannt sind.

Im erfindungsgemäßen Sinn sind Analyseelemente (auch als Testelemente, analytische Testelemente, Teststreifen, Testchips, Testdevices bezeichnet) vorzugsweise für die Bestimmung von Analyten oder sonstigen Parametern in flüssigen Proben, insbesondere in flüssigen Proben menschlichen Ursprungs, wie Blut, Serum, Plasma, Urin und dergleichen mehr geeignet. Analyseelemente im erfindungsgemäßen Sinn enthalten stets auf einem Trägermaterial ein Reagenz oder Reagenzsystem, welches in Abhängigkeit von dem zu untersuchenden Analyten in der Probe bzw. von der zu untersuchenden Eigenschaft der Probe ein detektierbares Signal erzeugen. Solche Analyseelemente sind dem Fachmann in einer Vielzahl von Ausführungsformen bekannt. Beispielsweise seien genannt optische oder elektrochemische Teststreifen für den Nachweis von Metaboliten in Blut oder davon abgeleiteten Probenflüssigkeiten, insbesondere zur Bestimmung von Glucose, Cholesterin und dergleichen. Darüber hinaus sind Teststreifen bekannt, mit deren Hilfe in einer Blutprobe Gerinnungsparameter bestimmt werden können.

Das Reagenzsystem, das auf dem Analysenelement angeordnet ist und zu einem detektierbaren Nachweissignal für einen Analyten in der Probe bzw. für eine Eigenschaft der Probe verantwortlich ist, kann vorzugsweise zu einem optisch erfass- und auswertbaren Messsignal oder zu einem elektrochemisch detektierbaren Signal führen. Beide Varianten sind dem Fachmann in einer Vielzahl von Ausführungsformen bekannt.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Reagenzsystem zur On-Board-Kontrolle in das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion integriert. Es ist jedoch auch denkbar und möglich, auf einem Analyseelement in räumlich getrennten Bezirken Reagenzsysteme für die Nachweisreaktion und Reagenzsysteme für die On-Board-Kontrolle unterzubringen.

Für den bevorzugten Fall, dass das Reagenzsystem für die On-Board-Kontrolle in das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion integriert ist, ist darauf zu achten, dass die Reagenzien sich nicht gegenseitig negativ beeinflussen.

Das Reagenzsystems für die On-Board-Kontrolle und das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion können auf den selben oder auf unterschiedlichen Nachweisprinzipien beruhen. So ist es erfindungsgemäß möglich, die On-Baord-Kontrolle optisch oder elektrochemisch auszuwerten. Ebenso ist es möglich, die eigentliche Nachweisreaktion optisch oder elektrochemisch zu erfassen. Besonders bevorzugt ist es, sowohl die On-Board-Kontrolle als auch die Nachweisreaktion elektrochemisch zu erfassen. Ein optischer Nachweis kann dabei visuell oder apparativ mit Hilfe eines Photometers erfolgen, wobei hier beliebige, dem Fachmann geläufige Techniken, wie Reflektionsmessung, Absorptionsmessung, Transmissionsmessung, Lumineszenzmessung und dergleichen mehr, eingesetzt werden können. Für die elektrochemische Detektion eignen sich wiederum sämtliche, dem Fachmann bekannte Techniken, wie Potentiometrie, Amperometrie, Coulometrie, Chronoamperometrie und dergleichen mehr.

Insbesondere die optisch auszuwertende Veränderung des On-Board-Kontrollfeldes bzw. des Nachweisreagenzienfeldes kann ohne Zuhilfenahme eines Messgeräts mit bloßem Auge durchgeführt werden. Bevorzugt ist es aber, die Auswertung der On-Baord-Kontrolle und des Nachweisfeldes mit Hilfe eines Messgeräts, beispielsweise eines Photometers oder eines elektrochemischen Messgeräts durchzuführen. Es ist auch möglich, die On-Board-Kontrolle ohne Messgerät, die Nachweisreaktion jedoch mit einem Messgerät auszuwerten.

Die Reagenzienrezepturen der On-Board-Kontrolle und des Nachweisfeldes können mit beliebigen, dem Fachmann bekannten Methoden auf einen Träger eines Analyseelementes aufgebracht werden. Dabei können die unterschiedlichen Reagenzien mit den selben oder mit unterschiedlichen Methoden aufgebracht werden. Beispielsweise seien als mögliche Methoden genannt: Aufbringen in flüssiger Form und anschließendes Auf- bzw. Eintrocknen auf bzw. in einen Träger; Aufbringen als Beschichtungsmasse durch Aufrakeln, Schlitzdüsenbeschichtung und dergleichen mehr; Druckverfahren wie Ink-Jet-Druck, Siebdruck, Dispergieren etc. Es ist auch möglich, bereits auf einen ersten Träger aufgebrachte Reagenzien mit diesem ersten Träger auf den eigentlichen, zweiten Träger des Analyseelements aufzubringen und mit diesem zu verbinden, z.B. durch Verkleben, Verschweissen etc.

Die erfindungsgemäße On-Board-Kontrolle soll zuverlässig belastete Testelemente erkennen können. Unter Belastung wird hierbei verstanden, dass die Testelemente Umweltbedingungen ausgesetzt werden, die zu einer Schädigung oder Beeinträchtigung der Reagenzien für die eigentliche Nachweisreaktion führen können. Für Analyseelemente, für die eine Raumtemperaturlagerung in geschlossenen, mit Trockenmittel versehenen Dosen oder für feuchtigkeitsundurchlässige Folien vorgesehen ist, ist unter Belastung beispielsweise das Ausgesetztsein gegenüber hohen Temperaturen in an sich geschlossenen Dosen oder Folien (z. B. beim Transport zum Kunden oder hinter einer Glasscheibe im Sonnenlicht) oder eine feuchte Lagerung (bei nicht sachgerecht verschlossenen Dosen nach Entnahme von Teststreifen oder bei defekten Folienverpackungen). Natürlich können auch Kombinationen von belastenden Ereignissen, wie beispielsweise gleichzeitige Feuchtigkeit oder erhöhte Temperatur eine Schädigung hervorrufen. Wichtig ist hier nur, dass eine Belastung schlussendlich zu einer Beeinträchtigung oder einem Versagen des Nachweisreagenzsystems führt. Für unterschiedliche Analyseelemente können dies durchaus unterschiedliche konkrete Bedingungen sein. Dem Fachmann ist bekannt, wie er entsprechende schädigende Ereignisse für das jeweilige Reagenzsystem identifizieren kann.

Erfindungsgemäß führt eine Belastung des Analyseelements bzw. des Reagenzsystems zur On-Board-Kontrolle zu einer – vorzugsweise irreversiblen – Veränderung des Reagenzsystems zur On-Board-Kontrolle. Somit ist gewährleistet, dass schädigende Umwelteinflüsse auch dann erkannt werden, wenn die Umweltbedingungen zwischenzeitlich sich in an sich günstige Bedingungen geändert haben sollten. Beispielsweise kann so eine einmalige schädigende Temperaturerhöhung oder eine einmalige kurzzeitige Einwirkung von Feuchte, die zu Schädigungen geführt hat, zuverlässig identifiziert werden.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass Reagenzien, die N-Oxide oder Nitrosoverbindungen, insbesondere in Verbindung mit Reduktionsmitteln wie Zuckern, Polyalkoholen, cysteinhaltigen Proteinen, Glycin, etc., enthalten, unter denselben Bedingungen und Umwelteinflüssen reduziert werden, unter denen eine OBC unerwünschte Einflüsse und negative Veränderungen eines Teststreifens anzeigen sollte. Die durch Reduktion aus den N-Oxiden oder Nitrosoverbindungen entstandenen Abbauprodukte können im Teststreifen durch geeignete, vorzugsweise elektrochemische oder optische Verfahren detektiert werden. Insbesondere für den Fall, dass als Reduktionsmittel Zucker verwendet werden, können die Redoxeigenschaften und damit die Kinetik der Redoxreaktion über den pH-Wert des Reagenzes eingestellt werden.

Erfindungsgemäß hat sich als besonders gut geeignetes Molekül für die beschriebene „Indikatorreaktion" und damit als bevorzugt das N-Oxid Resazurin herausgestellt.

Das blaue Resazurin wird bei Belastung unter Bedingungen, die einen Teststreifen schädigen können (erhöhte Temperaturen, Feuchtigkeit und Licht), zu dem roten Resorufin reduziert (vgl. 1), wobei die Reduktion insbesondere in Gegenwart geeigneter Redoxpartner, vorzugsweise solcher aus der Reagenzienrezeptur, stattfindet. Die Veränderung, d.h. die Abnahme der Resazurinkonzentration bei gleichzeitiger Zunahme der Resorufinkonzentration, kann visuell, durch einen optischen Detektor in einem Messgerät oder durch einen elektrochemischen Sensor festgestellt werden.

Für Resazurin wurde überraschenderweise Glycin als sehr spezifisches Reduktionsmittel gefunden. Die Kombination von geeigneten Mengen Resazurin mit Glycin in einem OBC-Reagenz ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt. Für Resazurin hat sich dabei eine Mindestkonzentration von ca. 0,01 g/l als bevorzugt herausgestellt, da unterhalb dieser Konzentration ein Nachweis des Resazurins praktisch sehr schwierig ist. Die Höchstmenge an Resazurin sollte 20 mmol/l nicht überschreiten, da ansonsten Löslichkeitsprobleme auftreten können. Wie oben beschrieben ist Glycin nicht unbedingt für das Funktionieren der OBC mit Resazurin erforderlich; als maximale Menge an Glycin hat sich eine Konzentration von ca. 250 g/l erwiesen, da oberhalb dieser Menge Löslichkeitsprobleme auftreten und Gylcin unter Umständen aus der Lösung auskristallisiert, was wiederum beim Beschichten der Reagenzmasse problematisch sein kann und möglicherweise zu Inhomogenitäten in der beschichteten Masse führen kann.

Für die elektrochemische Detektion der OBC-Reaktion kann die Quantifizierung des verbliebenen Resazurins und/oder die Quantifizierung des entstandenen Resorufins verwendet werden.

Die Quantifizierung von Resazurin ist bei großen Konzentrationsänderungen zu bevorzugen und kann beispielsweise durch elektrochemische Reduktion des Resazurins bei einem Potential von –700mV gegen Ag/AgCl durchgeführt werden. Bei diesem Potential wird das entstehende Resorufin bis zum Dihydro-Resorufin weiter reduziert (vgl. 1).

Wenn im OBC-Reagenz überwiegend Resazurin vorliegt (und das Reagenz folglich nicht oder kaum belastet ist) wird ein 4-Elektronenübergang provoziert, der zu einem höheren Strom führt als wenn vorwiegend Resorufin vorliegt, dessen Reduktion nur zu einem Umsatz von 2 Elektronen führt. Der bei einem vorgegebenen Potential, insbesondere bei dem bevorzugten Potential von –700mV gegen Ag/AgCl gemessene Strom bzw. Ladung erlauben somit Rückschlüsse auf die Höhe der Temperatur- und/oder Feuchtigkeitsbelastung des Reagenzes

Die Quantifizierung von Resorufin ist durch elektrochemische (Re-)Oxidation des Resorufins zu Resazurin nicht möglich, weil die Reduktion von Resazurin zu Resorufin irreversibel verläuft. Bei einem reduktiven Nachweis in dem beschriebenen OBC-System ist es notwendig, spezifisch nur die Reduktion von Resorufin, nicht jedoch die Reduktion von eventuell im Reagenz vorhandenem Resazurin zu erfassen. Dies gelingt beispielsweise durch die Verwendung eines spezifischen Reduktionspotentials, welches bevorzugt im Bereich von –450 bis –550 mV gegen Ag/AgCl liegt.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Quantifizierung von Resorufin in dem beschriebenen OBC-System besonders gut möglich ist, wenn in einem ersten Schritt das im Teststreifen vorliegende Resorufin elektrochemisch in Dihydro-Resorufin umgewandelt wird (im Folgenden „OBC Prepare" genannt) und in einem zweiten Schritt (im Folgenden „OBC Test" genannt) das in situ erzeugte Dihydro-Resorufin elektrochemisch zu Resorufin zurückoxidiert wird. Diese Oxidationsreaktion verläuft besonders spezifisch vorzugsweise bei einem Potential von –100 mV gegen Ag/AgCl.

Durch die Länge der „OBC Prepare Phase" kann die Intensität und Spezifität des „OBC Test Signals" gesteuert werden.

Neben dem besonders bevorzugten Resazurin/Resorufin-System sind Nitrosoverbindungen, insbesondere p-Nitrosoaniline, ein weiteres bevorzugtes Beispiel für eine Substanzklasse, die unter den Bedingungen, die Teststreifen schädigen können, zu Produkten umgesetzt werden können, die eine eventuelle Schädigung eines Teststreifens anzeigen können. p-Nitrosoaniline können beispielsweise unter den Bedingungen, die auch Reagenzien in einem Nachweisreagenz schädigen können, reduziert werden. Die reduktiv erzeugten Produkte (wie z.B. Phenylendiamine) können ebenfalls optisch oder elektrochemisch detektiert werden. Weitere Nitrosoverbindungen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind in US 5,206,147, US 5,334,508, US 5,122,244 und US 5,286,362 beschrieben. Besonders bevorzugt ist eine Kombination der in diesen 4 US-Patenten offenbarten Nitrosoverbindungen mit Heteropolysäuren, insbesondere Heteropolysäuren in gefällter Form gemäß US 5,240,860, die bei Belastung in Gegenwart von Reduktionsmitteln leicht sichtbares Heteropolyblau bilden.

1 zeigt die Strukturformeln von Resazurin 1, das durch Reduktion in Resorufin 2 und durch weitere Reduktion in Dihydro-Resorufin 3 umgewandelt wird.

2 zeigt Absorptionsspektren (relative Absorption A aufgetragen gegen die Wellenlänge &lgr; (in nm)) von Resazurin 1 und Resorufin 2.

3 zeigt die Remissionsspektren (relative Remission R (in %) aufgetragen gegen die Wellenlänge &lgr; (in nm)) der Reagenzfelder von unterschiedlich stark belasteten Testelementen (unbelastet 1, gering belastet 2, stark belastet 3).

4 zeigt anhand der Zunahme der relativen Remission R (in %) (gemessen bei einer Wellenlänge von 620 nm) über die Belastungszeit t (in h) die Zunahme an Abbauprodukt (Resorufin) in einem Resazurin-haltigen Reagenzfilm.

5 zeigt anhand der gemessenen Ladung Q in Abhängigkeit von der Belastungszeit t (in h) die Veränderung des elektrochemisch messbaren Signals während einer ersten, 3 Sekunden dauernden Messphase bei –700 mV vs. Ag/AgCl (Q₇₀₀) (untere beiden Kurven) und einer zweiten, 1,5 Sekunden dauernden Messphase bei –100 mV vs. Ag/AgCl (Q₁₀₀) (obere beiden Kurven).