Die Erfindung betrifft ein Reagenzsystem zur sogenannten "On-Board-Kontrolle" von Analyseelementen, insbesondere Teststreifen, enthaltend ein organisches N-Oxid oder eine Nitrosoverbindung. Die Erfindung betrifft ebenfalls Analyseelemente, enthaltend ein Reagenzsystem für eine Nachweisreaktion und ein Reagenzsystem für eine On-Board-Kontrolle. Weriterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle von Analyseelementen, wobei ein Reagenzsystem für eine On-Board-Kontrolle mithilfe eines Messgeräts optisch oder elektrochemisch auf Veränderungen hin untersucht wird, die auf eine Belastung des Analyseelements hindeuten können.
Beschreibung[de]
Die Erfindung betrifft ein Kontrollreagenzsystem für ein Analyseelement,
beispielsweise in Form eines Teststreifens, insbesondere eines Teststreifens zur
Bestimmung eines Gerinnungsparameters, das es erlaubt, funktionsfähige Analyseelemente
von nicht funktionsfähigen Analyseelementen zu unterscheiden. Weiterhin betrifft
die Erfindung entsprechende Analyseelemente und Verfahren zu deren Kontrolle.
Zur qualitativen und quantitativen Analyse von Bestandteilen einer
flüssigen Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit von Menschen oder Tieren,
werden zunehmend sogenannte trägergebundene Tests eingesetzt. Dabei werden Analyseelemente
(auch bezeichnet als Testelemente) verwendet, bei denen mindestens ein Reagenz in
einem aus einer oder mehreren Schichten bestehenden Testfeld eingebettet ist, das
mit der Probe in Kontakt gebracht wird. Die Reaktion von Probe und Reagenz führt
zu einer visuellen oder mit Hilfe eines Gerätes (meistens reflektionsphotometrisch
oder elektrochemisch) auswertbaren Veränderungen des Analyseelementes. Nach der
Durchführung eines Tests wird das benutzte Analyseelement entsorgt.
Es sind zahlreiche unterschiedliche Analyseelement-Typen bekannt,
die sich durch Messprinzip (z. B. optisch oder elektrochemisch) und die verwendeten
Reagenzien sowie durch ihren Aufbau, insbesondere hinsichtlich der Anordnung und
Befestigung der Testschichten, unterscheiden. Von besonderer praktischer Bedeutung
sind streifenförmige Analyseelemente. Diese auch als Teststreifen bezeichneten Analyseelemente
bestehen im Wesentlichen aus einer länglichen Tragschicht aus einem Kunststoffmaterial,
auf der ein oder mehrere Testfelder angebracht sind.
Die Analyseelemente werden in Primärverpackungen verpackt, in deren
Innenräumen sie bis zum Verbrauch, d. h. der Entnahme durch den Benutzer und Durchführung
eines Tests mit anschließender Entsorgung, lagern. Die Analyseelemente können dabei
jeweils einzeln in ihrer eigenen Primärverpackung verpackt sein. Überwiegend sind
Analyseelement-Packungseinheiten gebräuchlich, bei denen sich mehrere Analyseelemente
im Innenraum einer gemeinsamen Primärverpackung befinden. In der Regel enthalten
die Primärverpackungen ein Trockenmittel.
Der Innenraum der Primärverpackung ist üblicherweise weitgehend luftdicht
abgeschlossen. Die Lagerungsbedingungen sind somit im Wesentlichen durch die Umweltbedingungen
in der Primärverpackung während der Lagerung bestimmt.
Viele Analyseelemente enthalten Reagenzien, die infolge bestimmter
Lagerungsbedingungen, z. B. Temperatur, Feuchtigkeit, Sauerstoff, Licht etc., Schaden
nehmen können, sodass sie für die Durchführung eines zuverlässigen Tests unbrauchbar
werden. Zur Vermeidung von Schäden ist es daher erforderlich, die Analyseelement-Packungseinheit
unter bestimmten, vom Hersteller empfohlenen Lagerungsbedingungen sachgemäß zu lagern.
Seitens des Herstellers wird die Haltbarkeit des Analyseelements bei sachgemäßer
Lagerung für einen bestimmten Zeitraum garantiert.
Die Verwendung eines Analyseelements mit geschädigtem Reagenz kann
zu einem falschen Testergebnis führen, woraus unter Umständen eine schwerwiegende
Fehleinschätzung, beispielsweise des Gesundheitszustandes einer Person resultiert.
Daher wurden in der Vergangenheit Anstrengungen unterschiedlicher Art unternommen,
um die Gefahr der Verwendung von Analyseelementen mit Lagerungsschäden zu verringern.
Beispielsweise sind Testreagenzien entwickelt worden, die gegenüber
äußeren Einflüssen relativ unempfindlich sind. Eine andere Entwicklung geht dahin,
aufwendige Primärverpackungen zu verwenden, um die Einwirkungen äußerer Einflüsse
auf die Reagenzien der Analyseelemente gering zu halten. Beide Lösungen sind mit
wesentlich erhöhten Herstellungskosten verbunden. Aus Sicherheitsgründen wird oft
ein relativ kurzer Haltbarkeitszeitraum angegeben. Dies führt dazu, dass Analyseelemente
nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet werden, wobei jedoch nicht
nachprüfbar ist, ob tatsächlich Bedingungen geherrscht haben, die eine Schädigung
der Reagenzien bewirkt haben könnten.
Teststreifen für diagnostische Blutuntersuchen unterliegen vor dem
Vertrieb einer umfangreichen Qualitätskontrolle. Die geeigneten Versandbedingungen
und Lagerbedingungen werden vor der Markteinführung intensiv untersucht und beispielsweise
auf der Verpackung oder in der Packungsbeilage beschrieben. Trotzdem ist es nicht
vollständig ausgeschlossen, dass beim Transport der Ware zum Kunden oder durch unsachgerechte
Aufbewahrung beim Kunden Streifen vor dem Verfallsdatum geschädigt werden und die
Gefahr besteht, dass bei ihrer Verwendung falsche Messwerte erhalten werden.
Unsachgemäße Transport- und/oder Lagerbedingungen können durch Messungen
mit Flüssigkontrollen, die für die meisten dezentral eingesetzten (d.h. ausserhalb
von spezialisierten Labors, also beispielsweise in Arztpraxen, Apotheken, oder beim
Patienten zu Hause) sogenannten „Point-of-Care-Systeme" (PoC-Systeme) als
weitere Systemkomponente neben Gerät und Streifen vertrieben werden, entdeckt werden.
Nachteile der Verwendung von Flüssigkontrollen bei PoC-Systemen (z. B. für Gerinnungsmesssysteme)
sind die nicht ganz einfache Handhabung, die Kosten für den Verbrauch von meist
2 Teststreifen und 2 Kontrollflüssigkeiten (Level 1 – & Level 2 – Kontrolle)
sowie die Tatsache, dass bei den Kontrollmessungen zwar meist Streifen aus der selben
Herstellcharge und Verpackung erfasst werden, dies allerdings zwangsläufig andere
Streifen sind, als diejenigen, mit denen tatsächlich die Blutprobe eines Patienten
untersucht wird.
Diese Nachteile vermeidet man mit einer „On-Board-Kontrolle"
(englisch: On-board control, im Folgenden abgekürzt „OBC"), die in jedem
Teststreifen integriert ist und ohne eine weitere Testflüssigkeit auskommt. Systeme
mit „On-Board-Kontrollen" benötigen keine Kontrollflüssigkeiten, sondern
arbeiten mit der selben Probenflüssigkeit, aus der der zu bestimmende Parameter
mit dem Messsystem bestimmt wird.
Derartige „On-Board-Kontrollen" sind beispielsweise in den
Patenten US 5,504,011 (ITC), US
6,084,660 (Lifescan) und US 6,060,323
(Hemosense) beschrieben. Den in den genannten Dokumenten offenbarten Kontrollsystemen
ist gemeinsam, dass eine Blutprobe durch einen Kapillarkanal in ein Analyseelement
aufgenomen wird und durch Kapillarkräfte zu einem Untersuchungsort innerhalb des
Analyseelements transportiert wird. Durch eine oder mehrere Verzweigungen des Kapillarensystems
wird dir Probe aufgeteilt und in einen oder mehrere Seitenkanäle geleitet. In diesen
Seitenkanälen befinden sich dann Reagenzien, die die eigentliche OBC bilden.
Ein gemeinsamer Nachteil dieser „On-Board-Kontrollen" ist es,
dass die Teststreifen – neben dem eigentlichen Messkanal für die Patientenprobe
– mehrere (meist zwei) weiterere Kanäle benötigen. In diesen zusätzlichen
Kanälen werden nach Füllung mit demselben Patientenblut die Messungen durchgeführt,
die Auskunft über die Integrität des Streifens erlauben sollen. Dieses Konzept führt
zu hohen Herstellkosten, da die einzelnen Kanäle separat mit unterschiedlichen Reagenzien
ausgestattet werden müssen. Weiterhin benötigen derartige Kontrollsysteme vergleichsweise
hohen Probenvolumina, da neben dem eigentlichen Messkanal zumindest ein, meist jedoch
sogar mehrere Kontrollkanäle mit Probe befüllt werden müssen. Hohe Probenvolumina
werden insbesondere dort als nachteilig empfunden, wo Patienten selbst regelmäßig
die Probe gewinnen müssen, also beispielsweise beim sogenannten „Home-Monitoring",
insbesondere bei Diabetikern oder Patienten, die Gerinnungswerte selbst kontrollieren
müssen, da die Gewinnung von Blutproben durch Punktur der Haut schmerzhaft ist und
zwar umso schmerzhafter, je mehr Blutprobe benötigt wird. Darüberhinaus leiden Mehrkanal-On-Board-Kontrollsysteme
unter schwierigen Befüllungsmechanismen, da die Probe selbständig in mehrere Kanäle
eindringen und diese befüllen muss.
Aus DE-A 198 31 519 ist es bekannt, auf Testelementen oder deren Verpackung
irreversible Feuchte- oder Temperaturindikatorelemente anzubringen, die eine Schädigung
von Testelementen, beispielsweise durch zu hohe Temperaturen oder Luftfeuchtigkeit,
durch Licht oder Sauerstoffeinwirkung, anzeigen sollen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, ein On-Board-Kontrollsystem
zu entwickeln, das die genannten Nachteile – insbesondere bezüglich Herstellkosten
und Probenvolumen – nicht besitzt und trotzdem zuverlässig die mögliche Unbrauchbarkeit
von Testelementen, insbesondere aufgrund falscher Lager- oder Transportbedingungen,
anzeigt. Insbesondere sollte schädigende Feuchtigkeits- und/oder Temperaturbelastung
der Testelemente mit Hilfe der erfindungsgemäßen OBC erkannt werden. Die angestrebte
OBC sollte desweiteren nicht zu früh reagieren, um eine lange Raumtemperaturlagerung
des Produkts zu ermöglichen, und mit hoher Präzision eine gute Diskriminierung von
intakten und defekten Streifen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst.
Der Gegenstand der Erfindung ist ein Kontrollreagenzsystem gemäß Anspruch
1, dessen Verwendung gemäß Anspruch 8, ein entsprechendes Analyseelement gemäß Anspruch
9, sowie ein Verfahren zur Kontrolle von Analyseelementen gemäß Anspruch 12. Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die Erfindung wird durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung,
die Figuren und Beispiele näher erläutert.
Das erfindungsgemäße Konzept, das auch als 1-Kanal-On-Board-Kontrolle
bezeichnet werden kann, sieht vor, dass ein Reagenzbezirk auf einem Testelement,
welcher vorzugsweise ebenfalls für die eigentliche Vermessung der Patientenprobe
dient, eine Substanz enthält, die sich bei Belastung verändert. Die Veränderung
dieser Substanz führt dabei bevorzugt zu einem Abbauprodukt, welches entweder visuell
oder von dem für den Teststreifen zur Vermessung vorgesehenen Gerät detektiert wird.
Ein als defekt erkannter Streifen kann beispielsweise durch das Messgerät für die
Messung der Patientenprobe nicht frei gegeben werden.
Das erfindungsgemäße Reagenzsystem eignet sich zur On-Board-Kontrolle
von Analyseelementen. Das Reagenzsystem enthält dabei zumindest eine chemische Substanz,
vorzugsweise jedoch ein Gemisch von chemischen Substanzen. Zumindest eine der Substanzen
eignet sich dabei für die direkte oder indirekte Anzeige von Umweltbedingungen,
die die Zuverlässigkeit eines Analyseelements beeinträchtigen können. Diese Eigenschaft
wird als On-Board-Kontrolleigenschaft bezeichnet. Dabei werden schädigende Umwelteinflusse,
wie Temperatur, Feuchtigkeit, Licht, Sauerstoff etc., dazu ausgenutzt, in der besagten
Substanz oder mit der besagten Substanz eine vorzugsweise irreversible Veränderung
durchzuführen, die eine nachträgliche Detektion der schädigenden Einflüsse ermöglicht.
Hierbei ist es meist unerheblich, die genaue Art der schädigenden Einflüsse zu bestimmen;
es reicht in aller Regel, die Tatsache nachzuweisen, dass ein schädigendes Ereignis
stattgefunden hat.
Das Reagenzsystem zur On-Board-Kontrolle kann neben der Substanz,
die die eigentliche On-Board-Kontrollfunktion bewirkt, weitere Hilfssubstanzen enthalten.
Beispielsweise können dies Puffersubstanzen, Füllstoffe, Filmbildner und dergleichen
mehr sein, die dem Fachmann in einer Vielzahl von Ausführungsformen im Zusammenhang
mit Reagenzienrezepturen für analytische Testelemente bekannt sind.
Im erfindungsgemäßen Sinn sind Analyseelemente (auch als Testelemente,
analytische Testelemente, Teststreifen, Testchips, Testdevices bezeichnet) vorzugsweise
für die Bestimmung von Analyten oder sonstigen Parametern in flüssigen Proben, insbesondere
in flüssigen Proben menschlichen Ursprungs, wie Blut, Serum, Plasma, Urin und dergleichen
mehr geeignet. Analyseelemente im erfindungsgemäßen Sinn enthalten stets auf einem
Trägermaterial ein Reagenz oder Reagenzsystem, welches in Abhängigkeit von dem zu
untersuchenden Analyten in der Probe bzw. von der zu untersuchenden Eigenschaft
der Probe ein detektierbares Signal erzeugen. Solche Analyseelemente sind dem Fachmann
in einer Vielzahl von Ausführungsformen bekannt. Beispielsweise seien genannt optische
oder elektrochemische Teststreifen für den Nachweis von Metaboliten in Blut oder
davon abgeleiteten Probenflüssigkeiten, insbesondere zur Bestimmung von Glucose,
Cholesterin und dergleichen. Darüber hinaus sind Teststreifen bekannt, mit deren
Hilfe in einer Blutprobe Gerinnungsparameter bestimmt werden können.
Das Reagenzsystem, das auf dem Analysenelement angeordnet ist und
zu einem detektierbaren Nachweissignal für einen Analyten in der Probe bzw. für
eine Eigenschaft der Probe verantwortlich ist, kann vorzugsweise zu einem optisch
erfass- und auswertbaren Messsignal oder zu einem elektrochemisch detektierbaren
Signal führen. Beide Varianten sind dem Fachmann in einer Vielzahl von Ausführungsformen
bekannt.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Reagenzsystem zur On-Board-Kontrolle
in das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion integriert. Es ist jedoch auch denkbar
und möglich, auf einem Analyseelement in räumlich getrennten Bezirken Reagenzsysteme
für die Nachweisreaktion und Reagenzsysteme für die On-Board-Kontrolle unterzubringen.
Für den bevorzugten Fall, dass das Reagenzsystem für die On-Board-Kontrolle
in das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion integriert ist, ist darauf zu achten,
dass die Reagenzien sich nicht gegenseitig negativ beeinflussen.
Das Reagenzsystems für die On-Board-Kontrolle und das Reagenzsystem
für die Nachweisreaktion können auf den selben oder auf unterschiedlichen Nachweisprinzipien
beruhen. So ist es erfindungsgemäß möglich, die On-Baord-Kontrolle optisch oder
elektrochemisch auszuwerten. Ebenso ist es möglich, die eigentliche Nachweisreaktion
optisch oder elektrochemisch zu erfassen. Besonders bevorzugt ist es, sowohl die
On-Board-Kontrolle als auch die Nachweisreaktion elektrochemisch zu erfassen. Ein
optischer Nachweis kann dabei visuell oder apparativ mit Hilfe eines Photometers
erfolgen, wobei hier beliebige, dem Fachmann geläufige Techniken, wie Reflektionsmessung,
Absorptionsmessung, Transmissionsmessung, Lumineszenzmessung und
dergleichen mehr, eingesetzt werden können. Für die elektrochemische Detektion eignen
sich wiederum sämtliche, dem Fachmann bekannte Techniken, wie Potentiometrie, Amperometrie,
Coulometrie, Chronoamperometrie und dergleichen mehr.
Insbesondere die optisch auszuwertende Veränderung des On-Board-Kontrollfeldes
bzw. des Nachweisreagenzienfeldes kann ohne Zuhilfenahme eines Messgeräts mit bloßem
Auge durchgeführt werden. Bevorzugt ist es aber, die Auswertung der On-Baord-Kontrolle
und des Nachweisfeldes mit Hilfe eines Messgeräts, beispielsweise eines Photometers
oder eines elektrochemischen Messgeräts durchzuführen. Es ist auch möglich, die
On-Board-Kontrolle ohne Messgerät, die Nachweisreaktion jedoch mit einem Messgerät
auszuwerten.
Die Reagenzienrezepturen der On-Board-Kontrolle und des Nachweisfeldes
können mit beliebigen, dem Fachmann bekannten Methoden auf einen Träger eines Analyseelementes
aufgebracht werden. Dabei können die unterschiedlichen Reagenzien mit den selben
oder mit unterschiedlichen Methoden aufgebracht werden. Beispielsweise seien als
mögliche Methoden genannt: Aufbringen in flüssiger Form und anschließendes Auf-
bzw. Eintrocknen auf bzw. in einen Träger; Aufbringen als Beschichtungsmasse durch
Aufrakeln, Schlitzdüsenbeschichtung und dergleichen mehr; Druckverfahren wie Ink-Jet-Druck,
Siebdruck, Dispergieren etc. Es ist auch möglich, bereits auf einen ersten Träger
aufgebrachte Reagenzien mit diesem ersten Träger auf den eigentlichen, zweiten Träger
des Analyseelements aufzubringen und mit diesem zu verbinden, z.B. durch Verkleben,
Verschweissen etc.
Die erfindungsgemäße On-Board-Kontrolle soll zuverlässig belastete
Testelemente erkennen können. Unter Belastung wird hierbei verstanden, dass die
Testelemente Umweltbedingungen ausgesetzt werden, die zu einer Schädigung oder Beeinträchtigung
der Reagenzien für die eigentliche Nachweisreaktion führen können. Für Analyseelemente,
für die eine Raumtemperaturlagerung in geschlossenen, mit Trockenmittel versehenen
Dosen oder für feuchtigkeitsundurchlässige Folien vorgesehen ist, ist unter Belastung
beispielsweise das Ausgesetztsein gegenüber hohen Temperaturen in an sich geschlossenen
Dosen oder Folien (z. B. beim Transport zum Kunden oder hinter einer Glasscheibe
im Sonnenlicht) oder eine feuchte Lagerung (bei nicht sachgerecht verschlossenen
Dosen nach Entnahme von Teststreifen oder bei defekten Folienverpackungen). Natürlich
können auch Kombinationen von belastenden Ereignissen, wie beispielsweise gleichzeitige
Feuchtigkeit oder erhöhte Temperatur eine Schädigung hervorrufen. Wichtig ist hier
nur, dass eine Belastung schlussendlich zu einer Beeinträchtigung oder einem Versagen
des Nachweisreagenzsystems führt. Für unterschiedliche Analyseelemente können dies
durchaus unterschiedliche konkrete Bedingungen sein. Dem Fachmann ist bekannt, wie
er entsprechende schädigende Ereignisse für das jeweilige Reagenzsystem identifizieren
kann.
Erfindungsgemäß führt eine Belastung des Analyseelements bzw. des
Reagenzsystems zur On-Board-Kontrolle zu einer – vorzugsweise irreversiblen
– Veränderung des Reagenzsystems zur On-Board-Kontrolle. Somit ist gewährleistet,
dass schädigende Umwelteinflüsse auch dann erkannt werden, wenn die Umweltbedingungen
zwischenzeitlich sich in an sich günstige Bedingungen geändert haben sollten. Beispielsweise
kann so eine einmalige schädigende Temperaturerhöhung oder eine einmalige kurzzeitige
Einwirkung von Feuchte, die zu Schädigungen geführt hat, zuverlässig identifiziert
werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Reagenzien, die N-Oxide oder
Nitrosoverbindungen, insbesondere in Verbindung mit Reduktionsmitteln wie Zuckern,
Polyalkoholen, cysteinhaltigen Proteinen, Glycin, etc., enthalten, unter denselben
Bedingungen und Umwelteinflüssen reduziert werden, unter denen eine OBC unerwünschte
Einflüsse und negative Veränderungen eines Teststreifens anzeigen sollte. Die durch
Reduktion aus den N-Oxiden oder Nitrosoverbindungen entstandenen Abbauprodukte können
im Teststreifen durch geeignete, vorzugsweise elektrochemische oder optische Verfahren
detektiert werden. Insbesondere für den Fall, dass als Reduktionsmittel Zucker verwendet
werden, können die Redoxeigenschaften und damit die Kinetik der Redoxreaktion über
den pH-Wert des Reagenzes eingestellt werden.
Erfindungsgemäß hat sich als besonders gut geeignetes Molekül für
die beschriebene „Indikatorreaktion" und damit als bevorzugt das N-Oxid Resazurin
herausgestellt.
Das blaue Resazurin wird bei Belastung unter Bedingungen, die einen
Teststreifen schädigen können (erhöhte Temperaturen, Feuchtigkeit und Licht), zu
dem roten Resorufin reduziert (vgl. 1), wobei die Reduktion
insbesondere in Gegenwart geeigneter Redoxpartner, vorzugsweise solcher aus der
Reagenzienrezeptur, stattfindet. Die Veränderung, d.h. die Abnahme der Resazurinkonzentration
bei gleichzeitiger Zunahme der Resorufinkonzentration, kann visuell, durch einen
optischen Detektor in einem Messgerät oder durch einen elektrochemischen
Sensor festgestellt werden.
Für Resazurin wurde überraschenderweise Glycin als sehr spezifisches
Reduktionsmittel gefunden. Die Kombination von geeigneten Mengen Resazurin mit Glycin
in einem OBC-Reagenz ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt. Für Resazurin hat
sich dabei eine Mindestkonzentration von ca. 0,01 g/l als bevorzugt herausgestellt,
da unterhalb dieser Konzentration ein Nachweis des Resazurins praktisch sehr schwierig
ist. Die Höchstmenge an Resazurin sollte 20 mmol/l nicht überschreiten, da ansonsten
Löslichkeitsprobleme auftreten können. Wie oben beschrieben ist Glycin nicht unbedingt
für das Funktionieren der OBC mit Resazurin erforderlich; als maximale Menge an
Glycin hat sich eine Konzentration von ca. 250 g/l erwiesen, da oberhalb dieser
Menge Löslichkeitsprobleme auftreten und Gylcin unter Umständen aus der Lösung auskristallisiert,
was wiederum beim Beschichten der Reagenzmasse problematisch sein kann und möglicherweise
zu Inhomogenitäten in der beschichteten Masse führen kann.
Für die elektrochemische Detektion der OBC-Reaktion kann die Quantifizierung
des verbliebenen Resazurins und/oder die Quantifizierung des entstandenen Resorufins
verwendet werden.
Die Quantifizierung von Resazurin ist bei großen Konzentrationsänderungen
zu bevorzugen und kann beispielsweise durch elektrochemische Reduktion des Resazurins
bei einem Potential von –700mV gegen Ag/AgCl durchgeführt werden. Bei diesem
Potential wird das entstehende Resorufin bis zum Dihydro-Resorufin weiter reduziert
(vgl. 1).
Wenn im OBC-Reagenz überwiegend Resazurin vorliegt (und das Reagenz
folglich nicht oder kaum belastet ist) wird ein 4-Elektronenübergang provoziert,
der zu einem höheren Strom führt als wenn vorwiegend Resorufin vorliegt, dessen
Reduktion nur zu einem Umsatz von 2 Elektronen führt. Der bei einem vorgegebenen
Potential, insbesondere bei dem bevorzugten Potential von –700mV gegen Ag/AgCl
gemessene Strom bzw. Ladung erlauben somit Rückschlüsse auf die Höhe der Temperatur-
und/oder Feuchtigkeitsbelastung des Reagenzes
Die Quantifizierung von Resorufin ist durch elektrochemische (Re-)Oxidation
des Resorufins zu Resazurin nicht möglich, weil die Reduktion von Resazurin zu Resorufin
irreversibel verläuft. Bei einem reduktiven Nachweis in dem beschriebenen OBC-System
ist es notwendig, spezifisch nur die Reduktion von Resorufin, nicht jedoch die Reduktion
von eventuell im Reagenz vorhandenem Resazurin zu erfassen. Dies gelingt beispielsweise
durch die Verwendung eines spezifischen Reduktionspotentials, welches bevorzugt
im Bereich von –450 bis –550 mV gegen Ag/AgCl liegt.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Quantifizierung von Resorufin
in dem beschriebenen OBC-System besonders gut möglich ist, wenn in einem ersten
Schritt das im Teststreifen vorliegende Resorufin elektrochemisch in Dihydro-Resorufin
umgewandelt wird (im Folgenden „OBC Prepare" genannt) und in einem zweiten
Schritt (im Folgenden „OBC Test" genannt) das in situ erzeugte Dihydro-Resorufin
elektrochemisch zu Resorufin zurückoxidiert wird. Diese Oxidationsreaktion verläuft
besonders spezifisch vorzugsweise bei einem Potential von –100 mV gegen Ag/AgCl.
Durch die Länge der „OBC Prepare Phase" kann die Intensität
und Spezifität des „OBC Test Signals" gesteuert werden.
Neben dem besonders bevorzugten Resazurin/Resorufin-System sind Nitrosoverbindungen,
insbesondere p-Nitrosoaniline, ein weiteres bevorzugtes Beispiel für eine Substanzklasse,
die unter den Bedingungen, die Teststreifen schädigen können, zu Produkten umgesetzt
werden können, die eine eventuelle Schädigung eines Teststreifens anzeigen können.
p-Nitrosoaniline können beispielsweise unter den Bedingungen, die auch Reagenzien
in einem Nachweisreagenz schädigen können, reduziert werden. Die reduktiv erzeugten
Produkte (wie z.B. Phenylendiamine) können ebenfalls optisch oder elektrochemisch
detektiert werden. Weitere Nitrosoverbindungen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden
können, sind in US 5,206,147,
US 5,334,508, US
5,122,244 und US 5,286,362 beschrieben.
Besonders bevorzugt ist eine Kombination der in diesen 4 US-Patenten offenbarten
Nitrosoverbindungen mit Heteropolysäuren, insbesondere Heteropolysäuren in gefällter
Form gemäß US 5,240,860, die bei Belastung
in Gegenwart von Reduktionsmitteln leicht sichtbares Heteropolyblau bilden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Strukturformeln von Resazurin
1, das durch Reduktion in Resorufin 2 und durch weitere Reduktion
in Dihydro-Resorufin 3 umgewandelt wird.
2 zeigt Absorptionsspektren (relative
Absorption A aufgetragen gegen die Wellenlänge &lgr; (in nm)) von Resazurin 1 und
Resorufin 2.
3 zeigt die Remissionsspektren (relative
Remission R (in %) aufgetragen gegen die Wellenlänge &lgr; (in nm)) der Reagenzfelder
von unterschiedlich stark belasteten Testelementen (unbelastet 1, gering belastet
2, stark belastet 3).
4 zeigt anhand der Zunahme der relativen
Remission R (in %) (gemessen bei einer Wellenlänge von 620 nm) über die Belastungszeit
t (in h) die Zunahme an Abbauprodukt (Resorufin) in einem Resazurin-haltigen Reagenzfilm.
5 zeigt anhand der gemessenen Ladung
Q in Abhängigkeit von der Belastungszeit t (in h) die Veränderung des elektrochemisch
messbaren Signals während einer ersten, 3 Sekunden dauernden Messphase bei –700
mV vs. Ag/AgCl (Q700) (untere beiden Kurven) und einer zweiten, 1,5 Sekunden
dauernden Messphase bei –100 mV vs. Ag/AgCl (Q100) (obere beiden
Kurven).
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher charakterisiert.
Dabei werden exemplarisch anhand von Teststreifen für die Gerinnungsmessung (am
Beispiel eines Prothrombinzeittests oder PT-Tests) die Vorteile und Eigenschaften
der erfindungsgemäßen OBC beschrieben. Für den Fachmann ist klar, dass die anhand
des Beispiels der Gerinnungsteststreifen gemachten Aussagen ebenso für andere Teststreifenarten
(insbesondere für solche zur optischen oder elektrochemischen Bestimmung von Blutglucose,
Lipiden wie Cholesterin und HDL-Cholesterin, Triglyceriden, etc., zur Bestimmung
anderer Gerinnungsparameter als PT wie z. B. aPTT, ACT, ECT, anti-Faktor Xa-Tests,
aber auch für immunologische Testelemente, insbesondere optisch auswertbare Chromatographieteststreifen)
gelten und auf diese übertragen werden können.
Beispiel 1: 2 Reagenzrezepturen mit unterschiedlichen Reduktionsmitteln
für eine optisch auswertbare On-Board-KontrolleTabelle 1 Rezeptur für eine optisch auswertbare OBC mit Glycin als
Reduktionsmittel
Die in Tabelle 1 aufgeführten Stoffe wurden homogen vermischt und
mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die so erhaltene Reaktionsmasse
wurde als 20 mm breites und ca. 10 &mgr;m dickes Reagenzband auf einen reflektionsfotometrisch
zu vermessenden Teststreifen beschichtet.
Tabelle 2 Rezeptur für eine optisch auswertbare OBC mit Glucose als
Reduktionsmittel
Der pH-Wert der Reagenzienmasse wird jeweils mit Natronlauge auf den
angegebenen Wert eingestellt.
Die in Tabelle 2 aufgeführten Stoffe wurden homogen vermischt. Die
so erhaltene Reaktionsmasse wurde als 20 mm breites und ca. 10 &mgr;m dickes Reagenzband
auf einen reflektionsfotometrisch zu vermessenden Teststreifen beschichtet.
Die Reaktionsgeschwindigkeit der OBC-Reaktion, d.h. die von den Umgebungsbedingungen
abhängige Umwandlung von Resazurin in Resorufin, kann über den pH-Wert eingestellt
werden. Je alkalischer der pH-Wert, desto schneller erfolgt diese Umwandlung und
desto sensitiver ist somit die OBC.
Beispiel 2: Massenspektroskopischer Nachweis des Abbauprodukts
nach Belastung in der Reagenzienrezeptur gemäß Tabelle 1 aus Beispiel 1
Für die Teststreifen, für die eine Raumtemperaturlagerung in geschlossenen
mit Trockenmittel versehenen Dosen oder für Feuchtigkeit undurchlässigen Folien
vorgesehen ist, darf die Abbaureaktion unter diesen Lagerbedingenen nicht oder nur
in sehr geringem Maße ablaufen.
Als „Fehllagerung" sind vor allem
• hohe Temperaturen in geschlossenen Dosen/Folien (z.B. beim Transport
zum Kunden oder hinter einer Glasscheibe im Sonnenlicht), und
• feuchte Lagerung (nicht sachgerecht verschlossene Dosen nach Entnahme
von Teststreifen oder defekte Folienverpackungen) von der On-Board-Kontrolle zu
detektieren.
Diese Anforderungen wurden durch folgende Belastungsmodelle simuliert:
• Lagerung über mehrere Wochen bei 50°C in geschlossenen Dosen
• Lagerung über Stunden und mehrere Tage bei 50°C und erhöhter (50%/75%)
Luftfeuchtigkeit
• Lagerung über mehrere Tage bei geöffneter oder defekter Verpackung unter
Umweltbedingungen der Klimazone 4 (30°C, 70% Luftfeuchtigkeit)
Das Massenspektrum einer belasteten Ragenzienrezeptur, die gemäß Tabelle
1 in Beispiel 1 hergestellt wurde zeigt, dass nach Belastung (6 Stunden bei 50 °C
und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit) einige Prozent des Resazurins in Resorufin
umgesetzt waren (vgl. auch 1). Neben dem Hauptpeak
des Massenspektrums von Resazurin bei 228.17 Masseneinheiten ist der Hauptpeak des
Resorufinspektrums (212,20 Masseneinheiten) vorhanden.
Beispiel 3: Absorptionsspektren von Resazurin und Resorufin
(2)
Die in 2 wiedergegebenen Absorptionsspektren
von Resazurin 1 (einem blauen Farbstoff) und Resorufin 2 (einem roten Farbstoff)
zeigen, dass prinzipiell eine optische Detektion (bspw. visuell oder reflektionsfotometrisch)
der Umwandlung von Resazurin 1 in Resorufin 2, die – wie in Beispiel 2 gezeigt
– bei der Belastung einer Reagenzienrezeptur erfolgt, möglich ist.
Beispiel 4: Reflektionsspekten von unbelasteten und belasteten
Teststreifen
Teststreifen, deren Reagenzfilme auf Basis der Rezeptur aus Tabelle
1 von Beispiel 1 hergestellt waren, wurden 0 Stunden (unbelastet; vgl. Kurve 1 in
3), 6 Stunden (gering belastet; vgl. Kurve 2 in
3) und 12 Stunden (stark belastet; vgl. Kurve 3 in
3) bei 50°C und 75% Luftfeuchtigkeit belastet.
Die Veränderung der zugehörigen Remissionsspektren wurde gemessen (3).
Mit zunehmender Belastung zeigt sich eine Zunahme der Remission bei einer Wellenlänge
620 nm, die mit einer Abnahme der Menge an Resazurin verknüpft ist.
Beispiel 5: Optische Detektion des Abbauprodukts Resorfurin
in unterschiedlich stark belasteten Teststreifen
Teststreifen, deren Reagenzfilme auf Basis der Rezeptur aus Tabelle
1 von Beispiel 1 hergestellt waren, wurden unterschiedlich lange bei 50°C und
75% Luftfeuchtigkeit belastet und dann mit einem einfachen Reflektionsphotometer
vermessen, dessen LED mit Licht der Wellenlänge 620 nm arbeitete.
4 zeigt die Zunahme an Abbauprodukt (erkennbar
an der Zunahme der Remission R) über die Belastungszeit t (in h).
Die Veränderung des Testfelds kann auch visuell, d.h. vom Benutzer
mit bloßem Auge, leicht erkannt werden. Der zunächst blaue Reagenzbezirk des unbelasteten
Teststreifens verändert seine Farbe mit zunehmender Belastungsdauer in rosa.
Beispiel 6: Rezeptur für einen PT-Gerinnungstest mit integrierter
OBC und elektrochemischer DetektionTabelle 3 Rezeptur für einen amperometrischen Prothrombinzeit-Test
mit integrierten OBC-Reagenzien
Die in Tabelle 3 aufgeführten Stoffe wurden homogen vermischt und
mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die so erhaltene Reaktionsmasse
wurde in einer Breite von 4 mm und einer Dicke von ca. 90 &mgr;m (nass) bzw. ca.
10 &mgr;m (trocken) auf einen amperometrisch zu vermessenden Teststreifen beschichtet,
so dass die Arbeitselektrode mit dem Reagenz vollflächig bedeckt war. Als Referenzelektrode
diente eine Ag/AgCl-Elektrode, die ebenfalls als Gegenelektrode diente.
Beispiel 7: Elektrochemische Detektion von Resazurin und
des Abbauproduktions Resorfurin in unterschiedlich stark belasteten Teststreifen
Die gemäß Beispiel 6 hergestellten Teststreifen wurden unterschiedlich
lange bei 50°C und 75% Luftfeuchtigkeit belastet. Mit diesen Teststreifen wurden
dann Vollblute amperometrisch vermessen.
Für die Quantifizierung von Resazurin und Resorufin wurden folgende
Potentiale angelegt:
–700 mV vs. Ag/AgCl für 3 Sekunden (sogenannte "OBC-Prepare"-Phase); anschließend
–100 mV vs. Ag/AgCl für 1,5 Sekunden (sogenannte "OBC-Test"-Phase); anschließend
+200 mV vs. Ag/AgCl für 90 Sekunden (für die eigentliche Gerinnungsmessung).
Für die Quantifizierung der „OBC Prepare" – und „OBC-Test"
– Signale wurden die Integrale unter den Strom-Zeit-Kurven berechnet.
5 zeigt, wie sich diese Integrale (als Q700
bzw. Q100 bezeichnet) mit zunehmender Belastung der Teststreifen verändern.
Während sich die OBC-Signale stark verändern, ist die mit belasteten
Teststreifen gemessene Gerinnungszeit bis hin zu einer sehr langen Belastungsdauer
nahezu stabil (vgl. Tabelle 4).
Tabelle 4 Auswirkungen einer Belastung bei 50°C und 75 % relativer
Luftfeuchtigkeit auf die Messung der Gerinnungszeit
Damit ist gewährleistet, dass die OBC die falsche Lagerung der Teststreifen
anzeigt bevor falsche Gerinnungszeiten generiert werden.
Beispiel 8: Anzeige der OBC mit elektrochemischer Detektion
bei Lagerung unverpackter Streifen in Klimazone IV
Die größte Gefahr einer Schädigung von Tesstreifen, deren Verpackung
defekt ist oder nicht wieder verschlossen wurde, besteht bei Kunden, die in der
Klimazone IV leben (feucht warm). Für diese Klimazone werden in der Literatur als
„mittlere Klimabedingungen" eine Feuchtigkeit von 70% und eine Temperatur
von 30°C beschrieben.
Tabelle 5 zeigt, dass die OBC mit elektrochemischer Detektion Veränderungen
des Teststreifens durch Lagerung bei diesen Bedingungen anzeigt.
Tabelle 5 zeigt für unterschiedliche Probenmaterialien (Normalblut
(N) 1 und 2; Blut von Spendern, die mit Marcumar behandelt werden (M) 1 und 2),
anhand der gemessenen Ladung Q (in nAs) in Abhängigkeit von der Belastungszeit t
(in h) die Veränderung des elektrochemisch messbaren Signals während einer 3 Sekunden
dauernden Messphase bei –700 mV vs. Ag/AgCl (Q700) bzw. während
einer 1,5 Sekunden dauernden Messphase bei –100 mV vs. Ag/AgCl (Q100).
Tabelle 5 Auswirkungen einer Belastung bei 30°C und 70 % relativer
Luftfeuchtigkeit auf die elektrochemische On-Board-Kontrolle für unterschiedliche
Probenmaterialien
Sowohl anhand Messdaten, die während der sogenannten OBC-Prepare-Phase
(vgl. Beispiel 7) als auch während der sogenannten OBC-Test-Phase (vgl. Beispiel
7) gewonnen werden, können somit "belastete" Analyseelemente identifiziert werden.
Die Gerinnungszeiten sind – wie Tabelle 6 zeigt – auch
unter diesen Bedingungen deutlich stabiler, so dass belastete Teststreifen zuverlässig
durch die OBC erkannt werden können, bevor unter Umständen falsche Gerinnungsmesswerte
erzeugt worden wären.
Tabelle 6 Auswirkungen einer Belastung bei 30°C und 70 % relativer
Luftfeuchtigkeit auf die Messung der GerinnungszeitBeispiel 9: Glycin als spezifischer Redoxpartner für Resazurin
Lagert man Testelemente, die die Rezeptur aus Beispiel 6 enthalten,
bei 25°C über 48 Stunden, so verändert sich das Verhältnis von Resazurin zu
Resorufin, weil wegen der „OBC-Reaktion" ersteres in letztes umgesetzt wird.
Die folgende Tabelle 7 zeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit dieser Reaktion
von der An- oder Abwesenheit von Glycin beeinflusst wird. Eine
OBC ist auch bei Abwesenheit von Glycin möglich; die Empfindlichkeit der OBC wird
jedoch durch die Anwesenheit von Glycin deutlich erhöht.
Tabelle 7 Relative Menge Resorufin (%) in Bezug auf die Gesamtmenge
an Resorufin und Resazurin in Abhängigkeit von der Belastungsdauer
Anspruch[de]
Reagenzsystem zur On-Board-Kontrolle von Analyseelementen, enthaltend
ein organisches N-Oxid oder eine Nitrosoverbindung.
Reagenzsystem gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es bei
Belastung eine Veränderung erfährt, die optisch oder elektrochemisch nachweisbar
ist.
Reagenzsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
es ein Reduktionsmittel umfasst.
Reagenzsystem gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel
ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Zucker, Polyalkohole, Glycin, und cysteinhaltige
Proteine.
Reagenzsystem gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel
Glycin oder Glucose ist.
Reagenzsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
dass das N-Oxid Resazurin ist.
Reagenzsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
dass die Nitrosoverbindung ein gegebenenfalls substituiertes p-Nitrosoanilin ist.
Verwendung eines Reagenzsystems gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur
On-Board-Kontrolle von Analyseelementen.
Analyseelement enthaltend ein Reagenzsystem für eine Nachweisreaktion
und ein Reagenzsystem für eine On-Board-Kontrolle gemäß einem der Ansprüche 1 bis
7.
Analyseelement gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
On-Board-Kontrolle in das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion integriert ist.
Analyseelement gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass
das Reagenzsystem für die Nachweisreaktion Reagenzien zur Bestimmung von Gerinnungsparametern
enthält.
Verfahren zur Kontrolle von Analyseelementen gemäß Anspruch 9 bis
11, wobei das Reagenzsystem für die On-Board-Kontrolle mit Hilfe eines Messgeräts
optisch oder elektrochemisch auf Veränderungen hin untersucht wird, die auf eine
Belastung des Analyseelements hindeuten können.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Messgerät
Analyseelemente, bei denen eine Belastung detektiert wurde, nicht zur Vermessung
einer Probenflüssigkeit mit Hilfe des Reagenzsystems für die Nachweisreaktion freigibt.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass
sowohl die Untersuchung der Reagenzien für die Kontrollreaktion als auch die Untersuchung
der Reagenzien für die Nachweisreaktion optisch erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass
sowohl die Untersuchung der Reagenzien für die Kontrollreaktion als auch die Untersuchung
der Reagenzien für die Nachweisreaktion elektrochemisch erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass
die Untersuchung der Reagenzien für die Kontrollreaktion optisch und die Untersuchung
der Reagenzien für die Nachweisreaktion elektrochemisch erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass
die Untersuchung der Reagenzien für die Kontrollreaktion elektrochemisch und die
Untersuchung der Reagenzien für die Nachweisreaktion optisch erfolgt.