Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in einem Getränk durch die Zugabe einer Endoprotease, und neue Getränke, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Sie betrifft auch neue Endoproteasen.

Die Trübung ist ein bekanntes Phänomen in der Getränkeindustrie. Eine Trübung kann beispielsweise in Bier, Wein und Fruchtsaft vorhanden sein. Die Bildung einer Trübung kann in verschiedenen Stufen während des Brauvorgangs auftreten. In „Enzymes in food processing", herausgegeben von T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic Press Inc., San Diego, Kapitel V, S. 448–449, wurde vorgeschlagen, dass die Trübung im Bier das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen Bierproteinen und polyphenolischen Procyanidinen ist. Es wird erklärt, dass bei Bier die Trübung häufig nach dem Kühlen des Biers auftritt. Bier wird fermentiert und danach gereift, häufig unter gekühlten Bedingungen. Um klares Bier zu erhalten, wird dieses oft filtriert, während es kalt ist. Trotz der Filterung wird Bier oft trüb nachdem es verpackt und an Käufer verteilt und vor dem Servieren wieder gekühlt wird. Schließlich bildet sich sogar eine Trübung in Bier, wenn es nicht oder nicht mehr gekühlt ist, und es kann sich ein Sediment bilden. Das Entstehen einer Trübung ist unerwünscht, da die durch die Bildung einer Trübung entstandene Schleierbildung einer durch mikrobielle Zersetzung hervorgerufenen Schleierbildung ähnlich ist, die insbesondere für helle Biere unerwünscht ist.

In „Industrial Enzymology", 2. Ausgabe, Kapitel 2.6, S. 124-125 wurde beschrieben, dass eine Trübung in Bier aus der Vernetzung der hochmolekulargewichtigen Hordein-Fraktion von Malz, die einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren hat, welche sich mit Polyphenolen verbindet, die im Prinzip aus Proanthocyanidinen und Catechinen (Flavanoiden) bestehen, entstehen kann. Es ist beschrieben, dass geringe Mengen von Kohlehydraten und Spuren-Mineralionen auch an der Trübe-Bildung beteiligt sind, sowie eine Oxidation, von der festgestellt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der Polymerisation von Polyphenolen zur Erzeugung einer irreversiblen Trübung spielt. Es wird vorgeschlagen, dass Polyphenole sich langsam mit Protein vereinigen, um beim Kühlen eine Kühlungs-Trübung zu bilden, die sich aber beim Erwärmen wieder auflösen. Schließlich werden jedoch die Polyphenole, während sie polymerisieren und an Größe zunehmen, bei Raumtemperatur unlöslich, so dass sie eine irreversible oder permanente Trübung bilden.

In mehreren anderen Veröffentlichungen wurde vorgeschlagen, dass die Bildung einer Trübung, beispielsweise in Bier, Wein und Fruchtsaft, Kaffees und Tees das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Polyphenolen ist (K.J. Siebert et al., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 1997–2005, und K.J. Siebert et al., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80–85, K.J. Siebert, J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 353–362).

Es wurde auch geoffenbart, dass die Trübungs-aktiven Proteine reich an Prolin sind (K.J. Siebert et al., J. Am. Soc. Brewing 55, 2 (1997) 73–78).

Seit seiner Entdeckung durch L. Wallerstein im Jahr 1911 war bekannt, dass ein Verfahren zur Verringerung der Kühlungs-Trübungsbildung bei Bier in der Zugabe von Papain zum Bier besteht. Papain ist ein Extrakt der Papaya mit proteolytischer Aktivität. In „Enzymes in food processing", herausgegeben von T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic Press Inc., San Diego, Kapitel V, S. 448–449, wird Papain als jedem anderen Enzym zur Verhinderung von Kühlungs-Trübung in Bier weit überlegen beschrieben. Der genaue Mechanismus, über welchen Papain wirkt, wurde jedoch nie ermittelt („Enzymes in food processing", herausgegeben von T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic Press Inc., San Diego, Kapitel V, S. 448–449).

Ein Nachteil der Verwendung von Papain ist jedoch, dass es eine negative Wirkung auf Schaum hat. Proteine sind zur Bildung eines stabilen Schaums auf Bier notwendig. Durch seine proteolytische Aktivität beeinträchtigt Papain jedoch die Schaumkronen-Stabilität.

Die Bildung einer Trübung bei Wein wurde beispielsweise in „Enzymes in food processing", herausgegeben von T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic Press Inc., San Diego, Kapitel 16, S. 425, besprochen, wo beschrieben ist, dass man Traubenproteine als verantwortlich für die Bildung einer Trübung während der Lagerung von Wein hält. Wenn sich nach dem Abfüllen in Flaschen ein Niederschlag im Wein bildet, verliert der Wein für den Konsumenten an Attraktivität, was sich negativ auf den Verkauf auswirkt. Um einen Niederschlag zu verhindern, wird beispielsweise Bentonit verwendet. Obwohl Bentonit und andere Adsorptionsmittel die Proteine mit Erfolg entfernen, ist er nicht selektiv und entfernt andere erwünschte Verbindungen aus dem Wein, was häufig die organoleptischen Eigenschaften von Wein beeinträchtigt. Außerdem führt die Verwendung von Bentonit zu einem beträchtlichen Verlust an Wein, und das Entsorgen des Bentonit enthaltenden Abfalls bringt Schwierigkeiten mit sich.

Obwohl man den Mechanismus nicht genau versteht, nimmt man an, dass der Zusatz von Papain das Protein im Bier in einem Maße hydrolysiert, dass sich keine Protein-Polyphenol-Trübung bildet oder nur in einem geringeren Ausmaß. Bentonit wird aus einem ähnlichen Grund in Wein verwendet: durch Absorption von Proteinen verhindert er die Bildung von Protein-Polyphenol-Trübung und Niederschlägen. Anstatt das Protein zu entfernen, kann man jedoch Polyphenole entfernen, um die Bildung einer Trübung zu verringern oder zu verhindern. Ein typisches Beispiel für eine zum Entfernen von Polyphenolen aus Getränken verwendete Verbindung ist Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP). In jüngster Zeit erkannte man, dass Polyphenole wichtige Antioxidantien sind. Wegen all der günstigen Wirkungen, die man Antioxidantien zuschreibt, ist das Entfernen von Polyphenolen aus Getränken nicht der attraktivste Weg zur Verhinderung der Bildung einer Trübung.

Da alle bekannten Techniken zum Verhindern oder Entfernen einer Trübung Nachteile haben, besteht noch immer der Bedarf an einem neuen Verfahren zur Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in Getränken.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in einem Getränk vorzusehen.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass dieses Ziel durch das Vorsehen eines Verfahrens zur Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in einem Getränk, bei welchem dem Getränk eine Prolyl-spezifische Endoprotease zugesetzt wird, erreicht wird.

Im Rahmen dieser Erfindung inkludiert der Ausdruck „Getränk" Getränke in allen Stufen ihrer Herstellung. So ist ein Getränk nicht nur ein für den Verbrauch fertiges Getränk, sondern auch jede Zusammensetzung, die zur Herstellung des Getränkes verwendet wird. Beispielsweise ist Bierwürze, wie sie in der Biererzeugung verwendet wird, vom Ausdruck „Getränk", wie hierin verwendet, mit umfasst. Auch die Zugabe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease während der Herstellung eines Getränks zu Zusammensetzungen, die nicht oder nicht vollständig flüssig sind, soll unter das erfindungsgemäße Verfahren fallen. Eine Prolylspezifische Endoprotease, die einer Maische am Beginn des Bierbrauens zugesetzt wird, ist ein Beispiel für eine solche Zusammensetzung.

Eine Prolyl-spezifische Endoprotease ist als Endoprotease definiert, die Proteine oder Peptide in der Nähe von oder an Stellen schneidet, an welchen das Protein oder Peptid einen Prolyl-Rest in seiner Kette enthält. Vorzugsweise ist eine Prolylspezifische Endoprotease eine Endoprotease, die Proteine oder Peptide an Stellen Schneidet, wo das Protein oder Peptid einen Prolyl-Rest enthält. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise eine Prolyl-spezifische Endoprotease verwendet, die Prolyl-Reste an ihrem C-Terminus schneidet. Eine Prolylspezifische Endoprotease, die Prolyl-Reste an ihrem NH2-Terminus schneidet, ist z.B. in einer Veröffentlichung in Nature vom 15. Jänner 1998, Bd. 391, S. 301–304, beschrieben.

In diesem Text werden die Ausdrücke Prolyl-spezifische Endoprotease, Prolin-spezifische Endoprotease, Prolin-spezifische Endopeptidase und Peptid mit einer Prolyl-spezifischen Aktivität oder ähnliche Ausdrücke untereinander austauschbar verwendet.

In diesem Text sind die Wörter Peptid und Protein untereinander austauschbar verwendet. In diesem Text sind auch die Wörter „Trübung", „Schleierbildung" und „Trübe" untereinander austauschbar verwendet. Um die Menge an Trübung in einem Getränk zu quantifizieren, wird oft ein Turbidimeter verwendet. Bei einem Turbidimeter wird die Menge an Licht, die in einem vorgeschriebenen Winkel in Bezug auf die Richtung des einfallenden Lichtstrahls gestreut wird, gemessen. Trübemessungen sind zur Messung einer als Folge von Protein-Polyphenol-Wechselwirkungen gebildeten Trübung sehr geeignet.

Ein Polyphenol ist definiert als eine Verbindung mit einer chemischen Struktur, die mindestens zwei aromatische Ringe, welche durch mindestens eine Hydroxylgruppe substituiert sind, oder mit einer chemischen Struktur, die mindestens einen aromatischen Ring, der durch mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, enthält.

Beispiele für Phenole sind Tannine und Flavonoide, zu welchen beispielsweise Catechine, Flavonole und Anthocyanine zählen.

Endoproteasen mit einer Prolyl-spezifischen Aktivität sind bekannt (E.C. 3.4.21.26). Die Verwendung von Prolyl-spezifischen Endoproteasen zur Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in Getränken wurde jedoch niemals beschrieben oder nahegelegt.

Wie für Enzymaktivitäten typisch ist, hängt die Aktivität von Prolyl-spezifischen Endoproteasen vom pH-Wert ab. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dem Getränk eine Endoprotease zugesetzt, die eine maximale Prolyl-spezifische Aktivität bei einem pH-Wert hat, der dem pH-Wert des Getränkes, welchem sie zugesetzt wird, entspricht. Bevorzugte Getränke sind Protein-hältige Getränke. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Getränk Proteine und Polyphenole. Bevorzugte Getränke sind Getränke mit einem pH-Wert von unter 7.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei Bier, Wein und Fruchtsaft angewendet. Es kann auch vorteilhafter Weise für andere alkoholische Getränke als Bier und Wein angewendet werden.

Der Ausdruck „Bier", wie hierin verwendet, soll mindestens Bier umfassen, das aus Maischen aus ungemalzenen Zerealien zubereitet ist, sowie Bier aus Maischen aus gemalzenen Zerealien und aus allen Maischen aus einer Mischung von gemalzenen und ungemalzenen Zerealien. Der Ausdruck „Bier" umfasst auch Biere, die mit Zusätzen zubereitet sind und Biere mit allen möglichen Alkoholgehalten.

Fruchtsaft kann Saft sein, der z.B, aus roten Beeren, Erdbeeren, Äpfeln, Birnen, Tomaten, Zitrusfrüchten, Gemüsen usw. erhalten wurde.

Die Menge an Prolin-spezifischer Endoprotease, die einem Getränk bei erfindungsgemäßen Verfahren zugesetzt wird, kann innerhalb weiter Grenzen variieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Gramm Protein im Getränk mindestens 150 Millieinheiten Prolinspezifischer Endoprotease-Aktivität zugesetzt, wobei die Aktivität mit einer Aktivitätsmessung unter Verwendung von Z-Gly-Pro-pNA als Substrat gemessen wurde.

Mehr bevorzugt werden mindestens 500 Millieinheiten Prolinspezifische Endoprotease dem Getränk zugesetzt, und am meisten bevorzugt wird mindestens 1 Einheit Prolin-spezifische Endoprotease zugesetzt.

Eine maximale Menge an zuzusetzender Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität kann nicht spezifisch angegeben werden. Die maximale Menge hängt beispielsweise von der gewünschten Stärke der Verringerung oder Verhinderung einer Trübung, der Zusammensetzung des Getränks, dem pH-Wert des Getränks und dem pH-Wert, bei welchem die Endoprotease ihre maximale Aktivität aufweist, ab.

Eine Prolyl-spezifische Endoprotease kann in verschiedenen Stufen während der Herstellung eines Getränks zugesetzt werden.

Während des Herstellungsverfahrens von Bier wird die Prolylspezifische Endoprotease vorteilhaft einer Maische zugesetzt. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Prolyl-spezifische Endoprotease einem fermentierten Bier zugesetzt, bevor sich eine Trübung bildet. Es ist jedoch auch möglich, dass Prolylspezifische Endoprotease einem fermentierten Bier nach der Bildung einer Trübung zugesetzt wird. Die Prolyl-spezifische Endoprotease kann vorteilhaft dem Maischungs- oder Reifungsschritt bei einem Verfahren zur Herstellung von Bier zugesetzt werden.

Während der Herstellung von Wein wird die Prolyl-spezifische Endoprotease vorteilhaft einem fermentierten Wein zugesetzt. Die Prolyl-spezifische Endoprotease kann vorteilhaft nach der alkoholischen Fermentation oder nach der malolaktischen Fermentation in einem Verfahren zur Herstellung eines Weins zugesetzt werden.

Bei einem Verfahren zur Herstellung eines Fruchtsafts wird die Prolyl-spezifische Endoprotease vorteilhaft während des Mazerierens oder Pektinentfernung zugegeben.

Da die Bildung einer Trübung oft in sauren Getränken, wie z.B. Bier, Wein und Fruchtsaft, vorkommt, werden vorzugsweise Prolyl-spezifische Endoproteasen mit einer Prolyl-spezifischen Aktivität bei einem pH-Wert unter 7 verwendet. Am meisten bevorzugt werden beim erfindungsgemäßen Verfahren Prolyl-spezifische Endoproteasen mit einer maximalen Prolyl-spezifischen Aktivität bei einem pH-Wert unter 7 verwendet.

Die vorliegende Erfindung sieht weiter ein isoliertes Polypeptid mit Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität vor, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

• (a) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die mindestens 40% Gesamt-Aminosäuresequenz-Identität mit SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7, oder einem Fragment davon, aufweist,
• (b) einem Polypeptid, das durch ein Polynukleotid codiert ist, das hybridisiert mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 oder einem Fragment davon, welches zumindest zu 80% oder 90% identisch über 60, vorzugsweise über 100 Nukleotide, mehr bevorzugt zumindest zu 90% identisch über 200 Nukleotide ist, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die zur Nukleinsäuresequenz von (i) komplementär ist.

Sie sieht auch ein Nukleinsäuremolekül vor, das für die Prolyl-spezifische Endoprotease codiert.

Die Erfindung betrifft auch gereinigte oder isolierte Polypeptide mit Prolyl-spezifischer Endoprotease-Aktivität. Bevorzugt sind gereinigte Prolyl-spezifische Endoproteasen mit einer maximalen Aktivität bei pH-Werten von unter 7.

Die Erfindung sieht auch ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7, eine Aminosequenz erhältlich durch Exprimieren der Polynukleotid-Sequenzen von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 in einem geeigneten Wirt, vor. Auch ein Peptid oder Polypeptid, das ein funktionelles Äquivalent der obigen Polypeptide aufweist, ist von der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Die obigen Polypeptide sind kollektiv vom Ausdruck „erfindungsgemäße Polypeptide" umfasst.

Die Ausdrücke „Peptid" und „Oligopeptid" werden als synonym angesehen (wie allgemein anerkannt), und jeder Ausdruck kann austauschbar verwendet werden, je nachdem, wie es der Zusammenhang verlangt, um eine Kette von mindestens zwei Aminosäuren, gekoppelt durch Peptidyl-Bindungen, anzugeben. Das Wort „Polypeptid" wird hierin für Ketten verwendet, die mehr als sieben Aminosäurereste enthalten. Alle Oligopeptid- und Polypeptid-Formeln oder Sequenzen hierin sind von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben. Der hierin verwendete Einbuchstaben-Code der Aminosäuren ist auf dem Gebiet allgemein bekannt und in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zu finden.

„Isoliertes" oder „gereinigtes" Polypeptid oder Protein soll ein Polypeptid oder Protein bedeuten, das aus seiner nativen Umgebung entfernt ist. Beispielsweise werden rekombinant erzeugte Polypeptide und Proteine, die in Wirtszellen exprimiert sind, als isoliert für die Zwecke der Erfindung angesehen, sowie native oder rekombinante Polypeptide, die im Wesentlichen mittels jeder geeigneten Technik gereinigt wurden, wie z.B. mit der Ein-Schritt-Reinigungsmethode, die in Smith und Johnson, Gene 67:31-40 (1988) offenbart ist.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann aus rekombinanten Zellkulturen mittels wohlbekannter Methoden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Fällung, Säure-Extraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie, gewonnen und gereinigt werden. Am meisten bevorzugt wird für die Reinigung die Hochleistungs-Flüssigkeits-chromatographie („HPLC") verwendet.

Zu den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zählen natürlich gereinigte Produkte, Produkte chemischer synthetischer Verfahren und Produkte, die mittels rekombinanter Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt, einschließlich beispielsweise Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säuger-Zellen, erzeugt wurden. Je nach dem verwendeten Wirt in einem rekombinanten Produktionsverfahren können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert oder nichtglykosyliert sein. Außerdem können die Polypeptide der Erfindung auch einen initialen modifizierten Methionin-Rest enthalten, in einigen Fällen als Folge von durch den Wirt vermittelten Prozessen.

Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein gereinigtes oder isoliertes Polypeptid mit Endo-Pro-Aktivität. Ein solches gereinigtes oder isoliertes Polypeptid kann aus einer Nährlösung erhalten werden, in welcher ein erfindungsgemäßer Organismus, wie ein A. niger-Stamm, der ein Polynukleotid gemäß der Erfindung trägt, gezüchtet worden ist. Ein Fachmann auf dem Gebiet weiß, wie man ein zumindest teilweise gereinigtes Enzym aus dem Überstand einer solchen Kultur erhält.

Ein besonders vorteilhaftes Reinigungsverfahren ist das Folgende: Nach dem Züchten der Zellen in einer geeigneten Nährlösung werden die Zellen aus dem Zellüberstand durch Zentrifugieren getrennt. Der Überstand sieht trüb aus. Größere Teilchen, die im Überstand blieben, wurden dann nachfolgend durch Filtern mit 0,5% Dicalite oder vorzugsweise 1,0% Dicalite entfernt, um ein Verstopfen des Filters, der im nächsten Schritt angewendet wird, zu verhindern. Dann wurde eine Keimreduktionsfilterung angewendet, um die Menge an Keimen in der Lösung zu verringern. Noch immer war das Filtrat nicht klar. Ein Millipore-Filter mit einer Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von 10kDalton wurde danach zur weiteren Reduktion des Wasser-, Salz- und Zuckergehalts der Lösung verwendet. Ein Druck von 1 bar wurde über den Filter angelegt. Typische erhaltene Ausbeuten lagen zwischen 50 und 92%, bezogen auf in der Nährlösung vorhandene Einheiten, gegenüber Einheiten, die im gereinigten Ultrafiltrat erhalten wurden. Typische Enzymkonzentrationen im Ultrafiltrat resultieren in einer Prolyl-spezifischen Endoprotease-Aktivität im Bereich von 4 bis 10 Einheiten pro ml.

Eine weitere Reinigung wurde durch Anwendung einer der folgenden Methoden erreicht:

Eine Reinigung im Labor-Maßstab wurde unter Verwendung des Akta Explorers auf einer 24 ml Q-Sepharose FF-Säule (Betthöhe 12 cm/Durchmesser 1,6 cm) durchgeführt. 10 ml UF-Konzentrat wurde 10 mal in Puffer A verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Die Proteine wurden in einem Gradienten eluiert: 0 bis 50% B in 20 CV. Puffer A war 20 mM NaAc pH 5,1. Puffer B war 20 mM NaAc + 1 M NaCl pH 5,1. Fließgeschwindigkeit war 5 ml/min.

Die Reinigung wurde unter Verwendung der Akta-Reinigungsvorrichtung gemäß der Arbeitsvorschrift W-0894.A auf einer 500 1 Q-Sepharose-FF-Säule (Betthöhe 23,5 cm/Durchmesser 5 cm) vorgenommen. 200 ml UF-Konzentrat wurden 10 mal in Puffer A verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Die Proteine wurden in einem Gradienten eluiert: 0 bis 40% B in 20 CV. Puffer A war 20 mM NaAc pH 5,1. Puffer B war 20 mM NaAc + 1 M NaCl pH 5,1. Die Fließgeschwindigkeit war 10ml/min. Die Fraktionen wurden manuell gesammelt.

Das erhaltene Produkt wies einen einzigen Peak bei HPSEC auf und schien als einzige Bande in SDS PAGE und IEF auf. Es kann daher geschlossen werden, dass Prolyl-spezifische Endoprotease unter Verwendung von Q-Sepharose FF zur Homogenität gereinigt werden kann. Die geschätzte Reinheit war über 90% und die spezifische Aktivität auf Z-Gly-Pro-pNA war mindestens 0,094E/mg.

Die Polypeptide der Erfindung können in isolierter From vorliegen. Man wird verstehen, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln, die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht stören, gemischt sein kann und noch immer als isoliert angesehen wird. Ein Polypeptid der Erfindung kann auch in einer mehr im Wesentlichen gereinigten Form vorliegen, in welchem Fall sie das Polypeptid im Allgemeinen in einem Präparat umfassen wird, in welcher mehr als 70%, z.B. mehr als 80%, 90%, 95%, 98% oder 99%, der Proteine in der Zubereitung ein Polypeptid der Erfindung sind.

Die Polypeptide der Erfindung können in einer solchen Form vorgesehen werden, dass sie sich außerhalb ihrer natürlichen Zellumgebung befinden. So können sie im Wesentlichen isoliert oder gereinigt sein, wie oben besprochen, oder in einer Zelle, in welcher sie nicht in der Natur vorkommen, beispielsweise einer Zelle anderer Pilz-Spezies, Tiere, Pflanzen oder Bakterien.

Vorteilhafterweise werden isolierte oder gereinigte Prolylspezifische Endoproteasen beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.

Eine isolierte oder gereinigte Prolin-spezifische Endoprotease gemäß der Erfindung hat vorzugsweise mindestens 10 Einheiten Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität pro Gramm proteinhältigem Material. Diese Einheiten sollten unter Verwendung des synthetischen Peptids Z-Gly-Pro-pNA bei 37°C und pH5 gemessen werden, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben.

Prolin-spezifische Endoproteasen findet man weit verbreitet in Tieren und Pflanzen, doch ihr Vorhandensein in Mikroorganismen scheint begrenzt zu sein. Bisher wurde Prolin-spezifische Endoprotease in Spezies von Aspergillus (EP 0 522 428), Flavobacterium (EP 0 967 285) und Aeromonas (J. Biochem. 113, 790-796), Xanthomonas und Bacteroides identifiziert. Obwohl die Prolin-spezifischen Enzyme der meisten dieser Organismen bei einem pH-Wert von etwa 8 aktiv sind, ist das Aspergillus-Enzym optimalerweise aktiv bei etwa pH 5. Die Prolin-spezifische Endoprotease der Erfindung kann aus einer der oben erwähnten Mikroben-Spezies isoliert werden, insbesondere aus einer Spezies von Aspergillus. Vorzugsweise wird die Prolin-spezifische Endoprotease aus einem Stamm von Aspergillus niger isoliert. Mehr bevorzugt wird die Prolin-spezifische Endoprotease aus einem Aspergillus niger-Wirt isoliert, der zur Überexpression eines Gens, das für eine Prolin-spezifische Endoprotease codiert, hergestellt wurde, obwohl auch andere Wirte, wie E. coli, geeignete Expressionsvektoren sind. Beispielsweise machten das Klonieren und die Überproduktion der von Flavobacterium stammenden Prolinspezifischen Endoprotease in u.a. E. coli bestimmte Prolinspezifische Endoproteasen in reiner Form erhältlich. Ein Beispiel für ein solches überproduzierendes Konstrukt ist in World Journal of Microbiology & Biotechnology, Bd. 11, S. 209–212, vorgesehen. Ein Aspergillus niger-Wirt wird vorzugsweise verwendet, um ein nicht-rekombinantes Selbst-Konstrukt zu erzeugen, wobei A. niger-Promotoren zum Steuern der Expression eines Gens, das für A. niger-Prolin-spezifische Endoprotease codiert, verwendet wird.

In einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz vor, die einen Gesamtgrad an Aminosäuresequenz-Identität mit den Aminosäuren der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5, oder SEQ ID NR. 7 (d.h. dem Polypeptid) von mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 65%, vorzugsweise mindestens 70%, mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, sogar noch mehr bevorzugt mindestens etwa 95%, und am allermeisten bevorzugt mindestens etwa 97% aufweist, und das eine Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität besitzt.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Identität zwischen zwei oder mehr Aminosäuresequenzen mit dem BLAST P-Protein-Datenbank-Suchprogramm (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389–3402) mit Matrix Blosum 62 und einer erwarteten Schwelle (threshold) von 10 bestimmt.

Ein Polypeptid der Erfindung kann die in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. [7] angeführte Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder ein Fragment einer dieser Sequenzen mit Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität aufweisen. Im Allgemeinen ist die natürlicherweise vorkommende Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 gezeigt ist, bevorzugt.

Das Polypeptid der Erfindung kann auch eine natürlich vorkommende Variante oder ein Spezies-Homolog des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 aufweisen.

Eine Variante ist ein Polypeptid, das natürlicherweise z.B. in Pilz-, Bakterien-, Hefe- oder Pflanzenzellen vorkommt, wobei die Variante eine Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität und eine Sequenz aufweist, die ähnlich dem Protein von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 ist. Der Ausdruck „Varianten" bezieht sich auf Polypeptide, die denselben wesentlichen Charakter oder die grundlegende biologische Funktionalität aufweisen wie die Prolin-spezifische Endoprotease von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7, und inkludiert allele Varianten. Vorzugsweise hat eine Polypeptid-Variante mindestens dieselbe Menge an Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität wie das Polypeptid von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7. Die Varianten inkludieren allele Varianten entweder vom selben Stamm wie das Polypeptid von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 oder von einem anderen Stamm derselben Gattung oder derselben Spezies.

In ähnlicher Weise ist ein Spezies-Homolog des erfindungsgemäßen Proteins ein äquivalentes Protein mit einer ähnlichen Sequenz, das eine Prolin-spezifische Endoprotease ist und von Natur aus in anderen Spezies von Aspergillus vorkommt.

Varianten und Spezies-Homologe können unter Verwendung der hierin beschriebenen Vorgangsweisen, die zur Isolierung des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 verwendet wurden, und unter Durchführung solcher Vorgangsweisen auf einer geeigneten Zellen-Quelle, z.B. einer Bakterien-, Hefe-, Pilz- oder Pflanzenzelle isoliert werden. Es ist auch möglich, eine Sonde der Erfindung zu verwenden, um aus Hefe-, Bakterien-, Pilz- oder Pflanzenzellen hergestellte Bibliotheken zu sondieren, um Klone zu erhalten, die Varianten oder Spezies-Homologe des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 exprimieren. Diese Klone können mittels herkömmlicher Techniken manipuliert werden, um ein Polypeptid der Erfindung zu erzeugen, welches danach mittels an sich bekannter rekombinanter oder synthetischer Techniken erzeugt werden kann.

Die Sequenz des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 und von Varianten und Spezies-Homologen kann auch modifiziert werden, um Polypeptide der Erfindung vorzusehen. Aminosäure-Substitutionen können vorgenommen werden, z.B. von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen. Die selbe Anzahl Deletionen und Insertionen kann ebenfalls vorgenommen werden. Diese Veränderungen können außerhalb von Regionen, die für die Funktion des Polypeptids kritisch sind, vorgenommen werden, da ein solches modifiziertes Polypeptid seine Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität beibehält.

Die Polypeptide der Erfindung umfassen Fragmente der oben erwähnten Gesamtlängen-Polypeptide und von Varianten derselben, einschließlich Fragmente der oben in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 angeführten Sequenz. Solche Fragmente behalten typischerweise die Aktivität als Prolin-spezifische Endoprotease bei. Die Fragmente können eine Länge von mindestens 50, 100 oder 200 Aminosäuren haben, oder es kann ihnen diese Anzahl von Aminosäuren von der in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 gezeigten Gesamtlängen-Sequenz fehlen.

Die Polypeptide der Erfindung können, falls nötig, mit synthetischen Mitteln erzeugt werden, obwohl sie üblicherweise rekombinant hergestellt werden, wie nachstehend beschrieben. Synthetische Polypeptide können modifiziert werden, z.B. durch das Hinzufügen von Histidin-Resten oder einer T7-Markierung, um ihre Identifizierung oder Reinigung zu unterstüzten, oder durch die Addition einer Signalsequenz, um ihre Sezernierung aus einer Zelle zu fördern.

Somit können Sequenz-Varianten jene umfassen, die von Stämmen von Aspergillus stammen, die nicht jener Stamm sind, von welchem das Polypeptid der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 isoliert wurde. Varianten können aus anderen Aspergillus-Stämmen identifiziert werden, indem man nach Prolinspezifische Endoprotease-Aktivität sucht und wie hierin beschrieben sequenziert und kloniert. Zu den Varianten kann die Deletion, Modifikation oder Addition einzelner Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren innerhalb der Proteinsequenz zählen, solange das Peptid die grundlegende biologische Funktionalität der Prolin-spezifischen Endoprotease von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 beibehält.

Aminosäure-Substitutionen können durchgeführt werden, z.B. 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen. Das modifizierte Peptid behält im Allgemeinen die Aktivität als Prolinspezifische Endoprotease bei. Konservative Substitutionen können durchgeführt werden; solche Substitutionen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Vorzugsweise beeinträchtigen die Substitutionen nicht die Faltung oder Aktivität des Polypeptids.

Kürzere Polypeptid-Sequenzen fallen in den Bereich der Erfindung. Beispielsweise wird ein Peptid mit einer Länge von mindestens 50 Aminosäuren oder bis zu 60, 70, 80, 100, 150 oder 200 Aminosäuren als in den Umfang der Erfindung fallend angesehen, solange es die grundlegende biologische Funktionalität der Prolin-spezifischen Endoprotease der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 zeigt. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, umfasst dieser Aspekt der Erfindung die Situation, in welcher das Protein ein Fragment der vollständigen Protein-Sequenz ist.

In einer zweiten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid vor, das eine Prolinspezifische Endoprotease-Aktivität aufweist und durch Polynukleotide codiert ist, die unter Bedingungen niedriger Stringenz, mehr bevorzugt, Bedingungen mittlerer Stringenz, und am meisten bevorzugt, Bedingungen hoher Stringenz mit (i) der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 oder einem Nukleinsäure-Fragment, das zumindest den C-terminalen Teil der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SE ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 aufweist, aber weniger als alle aufweist, oder Basen aufweist, die sich von den Basen der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 unterscheiden, oder mit (ii) einem Nukleinsäure-Strang, der zu SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 komplementär ist, hybridisieren oder hybridisieren können.

Der Ausdruck „hybridisieren können" bedeutet, dass das Ziel-Polynukleotid der Erfindung mit der als Sonde verwendeten Nukleinsäure hybridisieren kann (z.B. der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 angeführt ist, oder einem Fragment davon, oder dem Komplement von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6) in einer Menge wesentlich über dem Hintergrund. Die Erfindung inkludiert auch jene Polynukleotide, die für die Prolinspezifische Endoprotease der Erfindung codieren, sowie Nukleotid-sequenzen, die dazu komplementär sind. Die Nukleotidsequenz kann RNA oder DNA sein, einschließlich genomischer DNA; synthetischer DNA oder cDNA. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz eine DNA und am meisten bevorzugt, eine genomische DNA-Sequenz. Typischerweise umfasst ein Polynukleotid der Erfindung eine aufeinanderfolgende Sequenz von Nukleotiden, die unter selektiven Bedingungen mit der Codiersequeez oder dem Komplement der Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren kann. Solche Nukleotide können gemäß Methoden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, synthetisiert werden.

Ein Polynukleotid der Erfindung kann mit der Codiersequenz oder dem Komplement der Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 in einer Menge wesentlich über dem Hintergrund codieren. Eine Hintergrund-Hybridisierung kann vorkommen, z.B. weil andere cDNAs in einer cDNA-Bibliothek vorhanden sind. Die von der Interaktion zwischen einem Polynukleotid der Erfindung und der Codiersequenz oder einem Komplement der Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 erzeugte Signalstärke ist typischerweise mindestens 10 mal, vorzugsweise mindestens 20 mal, mehr bevorzugt, mindestens 50 mal, und noch mehr bevorzugt, mindestens 100 mal so stark wie die Interaktionen zwischen anderen Polynukleotiden und der Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6. Die Intensität von Interaktionen kann beispielsweise durch radioaktives Markieren der Sonde, z.B. mit ³²P, gemessen werden. Die selektive Hybridisierung kann typischerweise unter Verwendung von Bedingungen einer niedrigen Stringenz (0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat bei etwa 40°C), einer mittleren Stringenz (z.B. 0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat bei etwa 50°C) oder einer hohen Stringenz (z.B. 0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat bei etwa 60°C) erreicht werden.

Die Polynukleotide der Erfindung können DNA oder RNA umfassen. Sie können einzel- oder doppelsträngig sein. Sie können auch Polynukleotide sein, die in sich synthetische oder modifizierte Nukleotide, inklusive Peptid-Nukleinsäuren, einschließen. Eine Anzahl verschiedener Arten von Modifikationen an Polynukleotiden sind auf dem Gebiet bekannt. Zu diesen zählen ein Methylphosphonat und Phosphorothioat-Gerüste, und die Addition von Acridin- oder Polylysin-Ketten an den 3'- und/oder 5'-Enden des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sei verstanden, dass die hierin beschriebenen Polynukleotide mit jedem auf dem Gebiet verfügbaren Verfahren modifiziert sein können.

Selbstverständlich können Fachleute unter Verwendung von Routine-Techniken Nukleotid-Substitutionen durchführen, die die von den Polynukleotiden der Erfindung codierte Polypeptidsequenz nicht beeinflussen, um die Codon-Verwendung irgendeines bestimmten Wirtsorganismus, in welchem die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimiert werden sollen, wiederzugeben.

Die Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 kann durch Nukleotid-Substitutionen, beispielsweise 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen, modifiziert werden. Das Polynukleotid der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 kann alternativ oder zusätzlich durch eine oder mehrere Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch eine Verlängerung an einem der beiden oder an beiden Enden modifiziert werden. Das modifizierte Polynukleotid codiert im Allgemeinen für ein Polypeptid, das eine Prolinspezifische Endoprotease-Aktivität hat. Es können degenerierte Substitutionen erzeugt werden und/oder Substitutionen, die zu einer konservativen Aminosäure-Substitution führen würden, wenn die modifizierte Sequenz translatiert wird, wie beispielsweise später in Bezug auf Polypeptide besprochen ist.

Eine Nukleotidsequenz, die selektiv an das Komplement der DNA-Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren kann, ist in der Erfindung inkludiert und hat im Allgemeinen mindestens 50% oder 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenz-Identität mit der Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 über einen Bereich von mindestens 60, vorzugsweise mindestens 100, mehr bevorzugt, mindestens 200 aneinander angrenzende Nukleotide, oder am meisten bevorzugt, über die gesamte Länge der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6. Desgleichen ist von der Erfindung auch ein Nukleotid, welches für eine aktive Prolin-spezifische Endoprotease codiert, die selektiv mit einem Fragment eines Komplements der DNA-Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren kann, umfasst. Ein C-terminales Fragment der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6, welches zumindest zu 80% oder 90% identisch über 60, vorzugsweise über 100 Nukleotide, mehr bevorzugt zumindest zu 90% identisch über 200 Nukleotide ist, ist von der Erfindung umfasst.

Jede Kombination der oben erwähnten Identitätsgrade und Minimalgrößen kann verwendet werden, um Polynukleotide der Erfindung zu definieren, wobei die stringenteren Kombinationen (d.h., größere Identität über größere Längen) bevorzugt ist. So bildet beispielsweise ein Polynukleotid, welches zumindest zu 80% oder 90% identisch über 60, vorzugsweise über 100 Nukleotide ist, einen Aspekt der Erfindung, sowie auch ein Polynukleotid, welches zumindest zu 90% identisch über 200 Nukleotide ist.

Das UWGCG Package sieht das BESTFIT-Programm vor, welches verwendet werden kann, um die Identität zu berechnen (beispielsweise an ihren Standardeinstellungen verwendet).

Die PILEUP- und BLAST N-Algorithmen können ebenfalls zur Berechnung der Sequenz-Identität oder zum Aufreihen von Sequenzen (wie als Identifizierungs-Äquivalent oder korrespondierende Sequenzen, beispielsweise an ihren Standardeinstellungen („default settings") verwendet werden.

Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist öffentlich erhältlich durch das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Bei diesem Algorithums werden zuerst Sequenz-Paare mit hoher Bewertung (high scoring sequence pairs, HSPs) identifiziert, indem kurze Wörter der Länge W in der Abfragesequenz identifiziert werden, die entweder passen oder irgendeine positiv bewertete Schwellen-Bewertung T („positive valued threshold score T") erfüllen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbank-Sequenz ausgerichtet werden. T wird als Nachbarschafts-Wortbewertungs-Schwelle („neighborhood word score threshold") bezeichnet. Diese anfänglichen Nachbarschafts-Worttreffer fungieren als Ausgangspunkte zum Ingangsetzen von Nachforschungen zum Auffinden von HSPs, die diese enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz soweit verlängert, wie die kumulative Ausrichtungs-Bewertung („cumulative alignment score") gesteigert werden kann. Verlängerungen für die Worttreffer in jeder Richtung werden gestoppt, wenn: die kumulative Ausrichtungs-Bewertung um die Menge X von ihrem maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Bewertung auf Null oder darunter geht infolge der Ansammlung einer oder mehrerer Rest-Ausrichtungen mit negativer Bewertung; oder das Ende einer der Sequenzen erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Standardeinstellungen eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Bewertungs-Matrix-Ausrichtungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M=5, N=4, und einen Vergleich beider Stränge.

Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch. Ein Maß für die Ähnlichkeit, das vom BLAST-Algorithmus vorgesehen wird, ist die kleinste Summen-Wahrscheinlichkeit („sum probability", (P(N)), was eine Anzeige der Wahrscheinlichkeit ist, mit welcher ein Zusammenpassen zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zufällig vorkommen würde. Beispielsweise wird eine Sequenz als einer anderen Sequenz ähnlich angesehen, wenn die kleinste Summen-Wahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz weniger als etwa 1, vorzugsweise weniger als etwa 0,1, mehr bevorzugt, weniger als etwa 0,01, und am meisten bevorzugt, weniger als etwa 0,001 ist.

Die Polynukleotide der Erfindung inkludieren Primer und können als Primer verwendet werden, beispielsweise als Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Primer, als Primer für alternative Amplifikations-Reaktionen, oder als Sonden, beispielsweise mit einer sichtbarmachenden Markierung mit herkömmlichen Mitteln unter Verwendung radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierungen markiert, oder die Polynukleotide können in Vektoren cloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente sind mindestens 15, beispielsweise mindestens 20, 25, 30 oder 40 Nukleotide lang. Sie sind typischerweise bis zu 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 oder 300 Nukleotide lang, oder selbst bis zu ein paar Nukleotide (wie 5 oder 10) kürzer als die Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6.

Im Allgemeinen werden Primer mit synthetischen Mitteln erzeugt, wobei die gewünschte Nukleinsäuresequenz schrittweise, ein Nukleotid nach dem anderen, hergestellt wird. Techniken um dies unter Verwendung automatisierte Protokolle zu erreichen, sind auf dem Gebiet leicht erhältlich. Längere Polynukleotide werden im Allgemeinen unter Verwendung rekombinanter Mittel, z.B. unter Verwendung von PCR-Kloniertechniken, erzeugt. Dazu gehören die Herstellung eines Primer-Paares (von typischerweise etwa 15–30 Nukleotiden), um die gewünschte Region der zu klonierenden Prolin-spezifischen Endoprotease zu amplifizieren, das In-Kontakt-Bringen der Primer mit mRNA, cDNA oder genomischer DNA, die aus einer Hefe-, Bakterien-, Pflanzen-, prokaryontischen oder Pilz-Zelle, vorzugsweise von einem Aspergillus-Stamm erhalten wurde, das Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, die für die Amplifizierung der gewünschten Region geeignet sind, das Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B. durch Reinigen der Reaktionsmischung auf einem Agarose-Gel) und das Gewinnen der amplifizierten DNA. Die Primer können so entworfen werden, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonier-Vektor kloniert werden kann.

Solche Techniken können verwendet werden, um alle oder einen Teil der Polynukleotide zu erhalten, die für die hierin beschriebenen Prolin-spezifischen Endoprotease-Sequenzen codieren. Introns, Promotor- und Trailer-Regionen fallen in den Bereich der Erfindung und können auch auf analoge Weise erhalten werden (z.B. mit rekombinanten Mitteln, PCR oder Kloniertechniken), beginnend mit genomischer DNA von einer Pilz-, Hefe-, Bakterien-, Pflanzen- oder prokaryontischen Zelle.

Die Polynukleotide oder Primer können eine sichtbarmachende Markierung tragen. Zu den geeigneten Markierungen zählen Radioisotope, wie ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Protein-Markierungen, wie Biotin. Solche Markierungen können Polynukleotiden oder Primern der Erfindung zugsetzt werden und können unter Verwendung von Techniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, detektiert werden.

Polynukleotide oder Primer (oder Fragmente davon), markiert oder unmarkiert, können in auf Nukleinsäure basierenden Tests zur Detektion oder Sequenzierung einer Prolin-spezifischen Endoprotease oder einer Variante davon in einer Pilz-Probe verwendet werden. Solche Detektions-Tests umfassen im Allgemeinen das In-Kontakt-Bringen einer Pilzprobe, von der man vermutet, dass sie die interessierende DNA enthält, mit einer Sonde, die ein Polynukleotid oder einen Primer der Erfindung aufweist, unter hybridisierenden Bedingungen, und das Detektieren von jeglichem zwischen der Sonde und der Nukleinsäure in der Probe gebildeten Duplex. Die Detektion kann unter Verwendung von Techniken, wie PCR, erreicht werden, oder durch Immobilisieren der Sonde auf einem festen Träger, Entfernen jeglicher Nukleinsäure in der Probe, die nicht mit der Sonde hybridisiert ist, und nachfolgendes Detektieren jeglicher Nukleinsäure, die mit der Sonde hybridisiert ist. Alternativ kann die Proben-Nukleinsäure auf einem festen Träger immobilisiert werden, die Sonde hybridisiert werden, und die Menge der an einen solchen Träger gebundenen Sonde nach dem Entfernen jeglicher ungebundenen Sonde detektiert werden.

Die erfindungsgemäßen Sonden können praktischer Weise in Form eines Test-Sets in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Bei solchen Sets kann die Sonde an einen festen Träger gebunden sein, soferne das Test-Format, für welchen das Set ausgelegt ist, eine solche Bindung erfordert. Das Set kann auch geeignete Reagenzien zum Behandeln der zu sondierenden Probe, Hybridisieren der Sonde mit der Nukleinsäure in der Probe, Kontroll-Reagenzien, Instruktionen u. dgl., enthalten. Die Sonden und Polynukleotide der Erfindung können auch im Mikroassay verwendet werden.

Vorzugsweise ist das Polynukleotid der Erfindung aus demselben Organismus wie das Polypeptid erhältlich, wie aus einem Pilz, insbesondere aus einem Pilz der Gattung Aspergillus.

Die Polynukleotide der Erfindung inkludieren auch Varianten der Sequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6, die für ein Polypeptid mit Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität codieren. Varianten können durch Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen gebildet werden. Solche Varianten der Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 können somit für Polypeptide codieren, die die Fähigkeit aufweisen, eine Polypeptid-Kette an der Carboxy-terminalen Seite von Prolin zu verdauen.

Polynukleotide, die keine 100% Identität mit SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 aufweisen, jedoch in den Bereich der Erfindung fallen, können auf vielerlei Weisen erhalten werden. So können Varianten der hierin beschriebenen Prolin-spezifischen Endoprotease-Sequenz beispielsweise durch Sondieren genomischer DNA-Bibliotheken erhalten werden, die aus einer Reihe von Organismen, wie jenen, die als Quellen der Polypeptide der Erfindung besprochen wurden, hergestellt wurden. Außerdem können andere Pilz- Pflanzen oder prokaryontische Homologe von Prolin-spezifischer Endoprotease erhalten werden, und solche Homologe und Fragmente davon können im Allgemeinen mit SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren. Solche Sequenzen können durch Sondieren von cDNA-Bibliotheken oder genomischen DNA-Bibliotheken aus anderen Spezies, und das Sondieren solcher Bibliotheken mit Sonden, die ganze oder einen Teil der SEQ ID NR. 1 enthalten, unter Bedingungen einer geringen, mittleren bis hohen Stringenz (wie früher beschrieben), erhalten werden. Nukleinsäuresonden, die alles oder einen Teil von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 aufweisen, können verwendet werden, um cDNA oder genomische Bibliotheken aus anderen Spezies zu sondieren, wie jenen, die als Quellen für die Polypeptide der Erfindung beschrieben wurden.

Spezies-Homologe können auch unter Verwendung von degenerierter PCR erhalten werden, welche Primer verwendet, die so gestaltet sind, dass sie auf Sequenzen innerhalb der Varianten und Homologe zielen, die für konservierte Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer können eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden zu Stringenz-Bedingungen verwendet, die niedriger als jene sind, die zum Klonieren von Sequenzen mit einzelnen Sequenz-Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.

Alternativ können solche Polypeptide durch Stellengerichtete Mutagenese der Prolin-spezifischen Endoprotease-Sequenzen oder Varianten davon erhalten werden. Dies kann dort nützlich sein, wo beispielsweise stille Codon-Änderungen an Sequenzen notwendig sind, um Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle, in welcher die Polynukleotid-Sequenzen exprimiert werden, zu optimieren. Andere Sequenzveränderungen können durchgeführt werden, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen oder um die Eigenschaft oder Funktion des von den Polynukleotiden codierten Polypeptids zu verändern.

Die Erfindung inkludiert doppelsträngige Polynukleotide, die ein Polynukleotid der Erfindung und sein Komplement umfassen.

Die vorliegende Erfindung sieht auch Polynukleotide vor, die für die oben beschriebenen Polypeptide der Erfindung codieren. Da solche Polynukleotide als Sequenzen für eine rekombinante Produktion von erfindungsgemäßen Polypeptiden nützlich sein werden, ist es nicht notwendig, dass sie an die Sequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren können, obwohl dies im Allgemeinen wünschenswert ist. Andernfalls können solche Polynukleotide gewünschtenfalls wie oben beschrieben markiert, verwendet und hergestellt werden.

Die Erfindung sieht auch Vektoren vor, die ein Polynukleotid der Erfindung aufweisen, einschließlich Klonierungs- und Expressions-Vektoren, und in einem anderen Aspekt Verfahren zum Züchten, Transformieren oder Transfektieren solcher Vektoren in eine geeignete Wirtszelle, beispielsweise unter Bedingungen, unter welchen die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder codiert durch eine erfindungsgemäße Sequenz erfolgt. Ebenso vorgesehen sind Wirtszellen, die ein Polynukleotid oder einen Vektor der Erfindung aufweisen, wobei das Polynukleotid heterolog zum Genom der Wirtszelle ist. Der Ausdruck „heterolog", gewöhnlich bezogen auf die Wirtszelle, bedeutet, dass das Polynukleotid nicht natürlicherweise im Genom der Wirtszelle vorkommt, oder dass das Polypeptid nicht natürlicherweise von dieser Zelle erzeugt wird. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Hefezelle, z.B. eine Hefezelle der Gattung Kluyveromyces oder Saccharomyces, oder eine filamentöse Pilzzelle, beispielsweise der Gattung Aspergillus.

Die Polynukleotide der Erfindung können in einen rekombinanten, replizierbaren Vektor, beispielsweise einen Klonier- oder Expressions-Vektor, inkorporiert werden. Der Vektor kann zum Replizieren der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Somit sieht die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden der Erfindung durch Einführen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle, und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Replikation des Vektors führen, vor. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind nachstehend in Verbindung mit Expressionsvektoren beschrieben.

Der Vektor, in welchen die Expressionskassette der Erfindung insertiert wird, kann jeder Vektor sein, der in zweckmäßiger Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt oft von der Wirtszelle ab, in welche er eingeführt werden soll. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Entität existiert, deren Replikation von chromosomaler Replikation unabhängig ist, wie ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der bei Einführung in eine Wirtszelle in das Wirtszellen-Genom integriert wird und sich zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welche (s) er integriert worden ist, repliziert.

Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, wenn es sich in einem Vektor befindet, funktionell mit einer regulierenden Sequenz verknüpft, die für die Expression der Codiersequenz durch die Wirtszelle sorgen kann, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Ausdruck „funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, wobei die beschriebenen Bestandteile in einem Verhältnis stehen, das es ihnen ermöglicht, in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine regulierende Sequenz, wie ein Promotor, Verstärker („Enhancer"), oder ein anderes Expressions-Regulierungssignal, das „funktionsmäßig verknüpft" ist mit einer Codiersequenz, ist so positioniert, dass die Expression der Codierseqeunz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.

Die Vektoren können, z.B. im Fall eines Plasmids, Cosmids, Virus oder Phagen-Vektors, mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls mit einem Promotor für die Expression des Polynukleotids und gegebenenfalls mit einem Verstärker und/oder einem Regulator des Promotors, versehen sein. Eine Terminator-Sequenz kann vorhanden sein, sowie auch eine Polyadenylierungssequenz anwesend sein kann. Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Marker-Gene enthalten, beispielsweise ein Ampicillin-Resistenz-Gen im Fall eines bakteriellen Plasmids, oder ein Neomycin-Resistenz-Gen für einen Säuger-Vektor. Die Vektoren können in vitro verwendet werden, beispielsweise für die Produktion von RNA, oder sie können zum Transfektieren oder Transformieren einer Wirtszelle verwendet werden.

Die für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz wird vorzugsweise in einen geeigneten Wirt als Teil eines Expressions-Konstrukts eingeführt, in welchem die DNA-Sequenz funktionell mit Expressionssignalen verknüpft ist, die die Expression der DNA-Sequenz in den Wirtszellen lenken können. Zur Transformation des geeigneten Wirts mit dem Expressionskonstrukt sind Transformations-Verfahren verfügbar, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Das Expressionskonstrukt kann zur Transformation des Wirts als Teil eines Vektors, der einen selektierbaren Marker trägt, verwendet werden, oder das Expressionskonstrukt wird als separates Molekül zusammen mit dem Vektor, der einen selektierbaren Marker trägt, co-transformiert. Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Marker-Gene enthalten.

Bevorzugte selektierbare Marker inkludieren – ohne auf diese eingeschränkt zu sein – jene, die einen Defekt in der Wirtszelle ergänzen oder eine Resistenz gegen eine Droge vermitteln. Sie inkludieren beispielsweise vielseitige Marker-Gene, die zur Transformation der meisten filamentösen Pilze und Hefen verwendet werden können, wie Acetamidase-Gene oder cDNAs (die amdS-, niaD-, facA-Gene oder cDNAs aus A.nidulans, A.oryzae oder A.niger) oder Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika, wie G418-, Hygromycin-, Bleomycin-, Kanamycin-, Phleomycin- oder Benomyl-Resistenz (benA), verleihen. Alternativ können spezifische Selektionsmarker verwendet werden, wie auxotrophe Marker, die korrespondierende mutierte Wirtsstämme erfordern: z.B. URA3 (aus S.cerevisiae oder analoge Gene aus anderen Hefen), pyrG oder pyrA (aus A.nidulans oder A.niger), argB(aus A.nidulans oder A.niger) oder trpC. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Selektionsmarker aus der transformierten Wirtszelle nach dem Einführen des Expressionskonstrukts deletiert, um transformierte Wirtszellen, die das Polypeptid erzeugen können, zu erhalten, welche frei von Selektionsmarker-Genen sind.

Andere Marker inkludieren ATP-Synthetase-Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphat-decarboxylase (pvrA), das bakterielle G418-Resistenz-Gen (geeignet in Hefe, aber nicht in filamentösen Pilzen), das Ampicillin-Resistenz-Gen (E. coli), das Neomycin-Resistenz-Gen (Bacillus) und das E. coli uidA-Gen, das für Glucuronidase (GUS) codiert. Vektoren können in vitro verwendet werden, beispielsweise für die Herstellung von RNA, oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle.

Für die meisten filamentösen Pilze und Hefe wird das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das Genom der Wirtszelle integriert, um stabile Transformanten zu erhalten. Für bestimmte Hefen sind jedoch auch geeignete episomale Vektor-Systeme erhältlich, in welche das Expressionskonstrukt für eine stabile und starke Expression inkorporiert werden kann. Zu den Beispielen dafür zählen Vektoren, die von den 2 &mgr;m, CEN- und pKD1-Plasmiden von Saccharomyces bzw. Kluyveromyces stammen, oder Vektoren, die eine AMA-Sequenz (z.B. AMA1 aus Aspergillus) enthalten. Wenn Expressionskonstrukte in Wirtszellen-Genome integriert werden, sind die Konstrukte entweder an randomisierten Loci im Genom oder an vorbestimmten Target-Loci integriert, wobei homologe Rekombination verwendet wird, in welchem Fall die Target-Loci vorzugsweise ein hoch exprimiertes Gen umfassen. Ein hoch exprimiertes Gen ist ein Gen, dessen mRNA mindestens 0,01 (Gew./Gew.) der gesamten Zell-mRNA ausmachen kann, beispielsweise unter induzierten Bedingungen, oder alternativ ein Gen, dessen Genprodukt mindestens 0,2% (Gew./Gew.) des gesamten Zell-Proteins ausmachen kann, oder im Falle eines sezernierten Genprodukts, bis zu einer Menge von mindestens 0,05 g/l sezerniert werden kann.

Ein Expressionskonstrukt für eine bestimmte Wirtszelle enthält üblicherweise die folgenden Elemente funktionsmäßig miteinander verknüpft in konsekutiver Reihenfolge vom 5'-Ende zum 3'-Ende, bezogen auf den Codierstrang der Sequenz, die für das Polypeptid des ersten Aspekts codiert: (1) eine Promotor-Sequenz, die die Transkription der DNA-Sequenz, welche für das Polypeptid in der bestimmten Wirtszelle codiert, lenken kann, (2) vorzugsweise eine 5'-nicht-translatierte Region (leader), (3) gegebenenfalls eine Signalsequenz, die die Sezernierung des Polypeptids aus der bestimmten Wirtszelle in das Kulturmedium lenken kann, (4) die DNA-Sequenz, die für eine reife und vorzugsweise aktive Form des Polypeptids codiert, und vorzugsweise auch (5) eine Transkriptions-Terminations-Region (terminator), die die Transkription stromabwärts der für das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz terminieren kann.

Stromabwärts der für das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz enthält das Expressionskonstrukt vorzugsweise eine 3'-nicht-translatierte Region, die eine oder mehrere Transkritpions-Terminations-Stellen enthält, auch als Terminator bezeichnet. Der Ursprung des Terminators ist nicht so kritisch. Der Terminator kann beispielsweise für die für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz nativ sein. Vorzugsweise wird jedoch ein Hefe-Terminator in Hefe-Wirtszellen und ein filamentöser Pilz-Terminator in filamentösen Pilz-Wirtszellen verwendet. Mehr bevorzugt ist der Terminator für die Wirtszelle, in welcher die für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz exprimiert wird, endogen.

Eine verstärkte Expression des für das erfindungsgemäße Polypeptid coiderenden Polynukleotids kann auch durch die Selektion heterologer, regulierender Regionen erreicht werden, z.B. Promotor-, Signalsequenz- und Terminator-Regionen, die dazu dienen, die Expressions- und gewünschtenfalls Sezernierungsmengen des Proteins, an dem ein Interesse besteht, aus dem gewählten Expressions-Wirt zu erhöhen und/oder für die induzier-bare Kontrolle der Expression des Polypeptids der Erfindung zu sorgen.

Abgesehen vom Promotor, der für das für das erfindungsgemäße Polypeptid codierende Gen nativ ist, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids zu lenken. Der Promotor kann wegen seiner Effizienz bei der Lenkung der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids im gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.

Promotoren/Verstärker (Enhancer) und andere Expressions-Regulierungs-Signale können so ausgewählt werden, dass sie mit der Wirtszelle, für welche der Expressionsvektor entworfen wird, kompatibel sind. Beispielsweise können prokaryontische Promotoren verwendet werden, insbesondere jene, die zur Verwendung in E.coli-Stämmen geeignet sind. Wenn die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide in Säugerzellen durchgeführt wird, können Säuger-Promotoren verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, z.B. Hepatocyten-zellspezifische Promotoren, können ebenso verwendet werden. Es können auch virale Promotoren verwendet werden, z.B. Moloney-Maus-Leukämievirus-long terminal repeat (MMLV LTR), der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-LTR-Promotor, der SV40-Promotor, der humane Cytomegalovirus (CMV)-IE-Promotor, Herpessimplex-Virus-Promotoren oder Adenovirus-Promotoren.

Zu den geeigneten Hefe-Promotoren zählen die S. cerevisiae GAL4 und ADH-Promotoren und den S. pombe nmt1- und adh-Promotor. Zu den Säuger-Promotoren zählen der Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle, wie Cadmium, induziert werden kann. Virale Promotoren, wie der SV40 large T antigen-Promotor oder Adenovirus-Promotoren können ebenfalls verwendet werden. Alle diese Promotoren sind auf dem Gebiet leicht erhältlich.

Säuger-Promotoren, wie &bgr;-Actin-Promotoren, können verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, insbesondere Endothel- oder Neuronal-Zellen-spezifische Promotoren (z.B. die DDAHI- und DDAHII-Promotoren) sind besonders bevorzugt. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise der Moleney-Maus-Leukämie-Virus-long terminal repeat (MMLV LTR)-, der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-LTR-Promotor, der SV40-Promotor, der humane Cytomegalovirus (CMV)-IE-Promotor, Adenovirus-, HSV-Promotoren (wie die HSV-IE-Promotoren), oder HPV-Promotoren, insbesondere die HPV-upstream regulatory region (URR). Virale Promotoren sind auf dem Gebiet leicht erhältlich.

Eine Vielfalt von Promotoren kann verwendet werden, die fähig sind, die Transkription in den Wirtszellen der Erfindung zu lenken. Vorzugsweise stammt die Promotor-Sequenz von einem hoch exprimierten Gen, wie zuvor definiert. Beispiele für bevorzugte hoch exprimierte Gene, von welchen Promotoren vorzugsweise stammen und/oder welche in bevorzugten vorbestimmten Ziel-Loci zur Integration der Expressionskonstrukte mit umfasst sind, inkludieren, ohne auf diese eingeschränkt zu sein, Gene, die für glykolytische Enzyme, wie Triose-Phosphat-Isomerasen (TPI), Glyceraldehyd-phosphat-dehydrogenasen (GAPDH), Phosphoglyceratkinasen (PGK), Pyruvatkinasen (PYK), Alkoholdehydrogenasen (ADH), codieren, sowie Gene, die für Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Xylanasen, Cellobiohydrolasen, &bgr;-Galactosidasen, Alkohol(Methanol)-oxidasen, Elongationsfaktoren und ribosomale Proteine codieren. Zu den spezifischen Beispielen für geeignete hoch exprimierte Gene zählen z.B. das LAC4-Gen von Kluyveromyces sp., die Methanoloxidase-Gene (AOX und MOX) von Hansenula bzw. Pichia, die Glucoamylase(glaA)-Gene von A.niger und A.awamori, das A.oryzae-TAKA-Amylase-Gen, das A.nidulans gpdA-Gen und die T.reesei-Cellobiohydrolase-Gene.

Beispiele für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die zur Verwendung in Pilz-Expressions-Wirten bevorzugt sind, sind jene, die erhältlich sind aus den Pilz-Genen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase-Untereinheit 9 (oliC), Triose-phosphat-isomerase (tpi), Alkoholdehydrogenase (AdhA), Amylase (amy), amyloglucosidase (AG – aus dem glaA-Gen) Acetamidase (amdS) und Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase(gpd)-Promotoren.

Zu den Beispielen für starke Hefe-Promotoren, die verwendet werden können, zählen jene, die aus den Genen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglycerat-kinase und Triosephosphat-isomerase erhältlich sind.

Zu den Beispielen für starke bakterielle Promotoren, die verwendet werden können, zählen die Amylase- und SPo2-Promotoren sowie Promotoren aus extrazellulären Protease-Genen.

Für Pflanzenzellen geeignete Promotoren, die man verwenden kann, umfassen Napalinsynthase (nos), Octopinsynthase (ocs) Mannopinsynthase (mas), Ribulose-kleine Untereinheit (Rubisco ssu), Histon, Reisaktiv, Phaseolin, Blumenkohl-Mosaikvirus (CMV)35S und 19S und Circovirus-Promotoren.

Der Vektor kann weiters Sequenzen inkludieren, die das zur RNA führende Polynukleotid flankieren, welche Sequenzen, die zu solchen aus eukaryontischen Genom-Sequenzen homolog sind, vorzugsweise Säuger-Genom-Sequenzen, oder virale Genom-Sequenzen, umfassen. Das ermöglicht die Einführung der Polynukleotide der Erfindung in das Genom eukaryontischer Zellen oder Viren durch homologe Rekombination. Insbesondere kann ein Plasmid-Vektor, welcher die Expressionskassette flankiert von viralen Sequenzen aufweist, zur Herstellung eines Virus-Vektors verwendet werden, der zur Abgabe der erfindungsgemäßen Polynukleotide an eine Säugerzelle geeignet ist. Andere Beispiele für geeignete Virus-Vektoren inkludieren Herpes simplex-Virus-Vektoren und Retroviren, einschließlich Lentiviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren und HPV-Viren (wie HPV-16 ODER HPV-18). Gen-Transfer-Techniken unter Verwendung dieser Viren sind den Fachleuten bekannt. Retrovirus-Vektoren können beispielsweise verwendet werden, um das Polynukleotid, das zur antisense-RNA führt, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren. Replikations-defekte Adenovirus-Vektoren bleiben dagegen episomal und ermöglichen daher eine vorübergehende Expression.

Der Vektor kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten, das in einer antisense-Richtung orientiert ist, um für die Produktion von antisense-RNA zu sorgen. Dies kann verwendet werden um gewünschtenfalls die Expressionsmengen der Polypeptide zu verringern.

Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids vor, welches das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben, unter Bedingungen, die für die Expression einer für das Polypeptid codierenden Codiersequenz durch den Vektor geeignet sind, transformiert oder transfektiert wurde, und das Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfasst. Die Polynukleotide der Erfindung können in einen rekombinanten, replizierbaren Vektor, wie einen Expressions-Vektor, inkorporiert sein. Der Vektor kann zur Replikation der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. So sieht die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids durch Einführen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Replikation des Vektors bewirken, vor. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Zu den geeigneten Wirtszellen zählnen Bakterien, wie E.coli, Hefe, Säugerzelllinien und andere eukaryontische Zelllinien, beispielsweise Insektenzellen, wie Sf9-Zellen, und (z.B. filamentöse) Pilz-Zellen.

Vorzugsweise wird das Polypeptid als sezerniertes Protein erzeugt, in welchem Fall die für eine reife Form des Polypeptids codierende DNA-Sequenz im Expressionskonstrukt funktionell verknüpft ist mit einer DNA-Sequenz, die für eine Signal-Sequenz codiert. In jenem Fall, in dem das für das sezernierte Protein codierende Gen im Wildtyp-Stamm eine Signalsequenz aufweist, ist die verwendete Signalsequenz vorzugsweise für die für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz nativ (homolog). Alternativ ist die Signalsequenz für die für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz fremd (heterolog), in welchem Fall die Signalsequenz vorzugsweise für die Wirtszelle, in welcher die DNA-Sequenz exprimiert wird, endogen ist. Beispiele für geeignete Signalsequenzen für Hefe-Wirtszellen sind die Signalsequenzen, die von Hefe-MFalpha-Genen stammen. In ähnlicher Weise ist eine geeignete Signalsequenz für filamentöse Pilz-Wirtszellen z.B. eine Signalsequenz, die von einem filamentösen Pilz-Amyloglucosidase(AG)-Gen, z.B. dem A.niger-glaA-Gen, stammt. Diese Signalsequenz kann in Kombination mit dem Amyloglucosidase-(auch (Gluco)amylase genannt)-Promotor selbst, sowie in Kombination mit anderen Promotoren verwendet werden. Hybrid-Signalsequenzen können auch im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bevorzugte heterologe Sezernierungs-Leader-Sequenzen sind jene, die vom Pilz-amyloglucosidase(AG)-Gen (glaA, sowohl die 18- als auch die 24-Aminosäuren-Version, z.B. von Aspergillus), vom MFalpha-Gen (Hefen, z.B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder vom alpha-Amylase-Gen (Bacillus) abstammen.

Die Vektoren können wie oben beschrieben transformiert oder in eine geeignete Wirtszelle transfektiert werden, um für die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu sorgen. Dieses Verfahren kann das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben, unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind, transformiert ist, und das fakultative Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfassen.

So sieht ein weiterer Aspekt der Erfindung Wirtszellen vor, die mit einem Polynukleotid oder Vektor der Erfindung transformiert oder transfektiert wurden oder dieses bzw. diesen aufweisen. Vorzugsweise wird das Polynukleotid in einem Vektor getragen, welcher die Replikation und Expression des Polynukleotids ermöglicht. Die Zellen werden so gewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind und können beispielsweise prokaryontische (z.B. bakterielle) oder eukaryontische Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.

Die Erfindung umfasst Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Polypeptids mittels rekombinanter Expression einer DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert. Zu diesem Zweck kann die DNA-Sequenz der Erfindung zur Gen-Amplifikation und/oder zum Austausch von Expressionssignalen, wie Promotoren, Sezernierungssignalsequenzen verwendet werden, um eine wirtschafliche Produktion des Polypeptids in einer geeigneten homologen oder heterologen Wirtszelle zu ermöglichen. Eine homologe Wirtszelle ist hierin als eine Wirtszelle definiert, die von derselben Spezies ist oder eine Variante innerhalb derselben Spezies ist wie jene Spezies, von welcher die DNA-Sequenz stammt.

Geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise prokaryontische Mikroorganismen, wie Bakterien, oder mehr bevorzugt, eurkaryontische Organismen, beispielsweise Pilze, wie Hefen oder filamentöse Pilze, oder Pflanzenzellen. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber filamentösen Pilzzellen bevorzugt, weil sie leichter manipulierbar sind. Einige Proteine werden jedoch aus Hefen schlecht sezerniert, oder in einigen Fällen werden sie nicht richtig prozessiert (z.B. Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein filamentöser Pilz-Wirtsorganismus gewählt werden.

Bakterien der Gattung Bacillus sind als heterologe Wirte wegen ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium zu sezernieren, sehr geeignet. Andere Bakterien, die als Wirte geeignet sind, sind jene der Genera Streptomyces und Pseudomonas. Eine bevorzugte Hefe-Wirtszelle für die Expression der für das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz ist eine der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia oder Schizosaccharomyces. Mehr bevorzugt ist eine Hefe-Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Spezies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (auch als Kluyveromyces marxianus var. lactis bekannt), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica und Schizosaccharomyces pombe.

Am meisten bevorzugt für die Expression der für das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz sind jedoch filamentöse Pilz-Wirtszellen. Bevorzugte filamentöse Pilz-Wirtszellen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Genera Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia und Talaromyces. Mehr bevorzugt stammt eine filamentöse Pilz-Wirtszelle von der Spezies Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae oder Aspergillus nidulans oder stammt von einer Spezies aus der Aspergillus niger-Gruppe (wie von Raper und Fennell The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, S. 293-344, 1965) definiert. Zu diesen zählen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae und Aspergillus ficuum, und auch jene der Spezies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum und Thielavia terrestris.

Beispiele für bevorzugte Expressionswirte im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Spezies (insbesondere jene, die in der EP-A 184 438 und in der EP-A 284 603 beschrieben sind) und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie Bacillus-Spezies (insbesondere jene, die in der EP-A 134 048 und in der EP-A 253 455 beschrieben sind), besonders Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas-Spezies; und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies (insbesondere jene, die in der EP-A 096 430 beschrieben sind, wie Kluyveromyces lactis, und in der EP-A 301 670 beschrieben sind), und Saccharomyces-Spezies, wie Saccharomyces cerevisiae.

Zu den erfindungsgemäßen Wirtszellen zählen Pflanzenzellen, und die Erfindung erstreckt sich daher auf transgene Organismen, wie Pflanzen und Teile davon, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Zellen enthalten. Die Zellen können das erfindungsgemäße Polypeptid heterolog exprimieren oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide heterolog enthalten. Die transgene (oder genetisch modifizierte) Pflanze kann daher in ihr Genom eine Sequenz (typischerweise stabil) insertiert haben, die für die Polypeptide der Erfindung codiert. Die Transformation der Pflanzenzellen kann unter Verwendung bekannter Techniken, beispielsweise unter Verwendung eines Ti- oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens, durchgeführt werden. Das Plasmid (oder der Vektor) kann daher Sequenzen enthalten, die zum Infizieren einer Pflanze notwendig sind, und derivate des Ti- und/oder Ri-Plasmids können verwendet werden.

Die Wirtszelle kann das Polypeptid überexprimieren, und Techniken zur Herbeiführung einer Überexpression sind wohl bekannt und können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Wirt kann somit zwei oder mehr Kopien des Polynukleotids aufweisen.

Alternativ kann eine direkte Infektion eines Teils einer Pflanze, wie eines Blattes, einer Wurzel oder eines Stiels, bewirkt werden. Bei dieser Technik kann die zu infizierende Pflanze verwundet werden, beispielsweise, indem man die Pflanze mit einem Rasiermesser schneidet, die Pflanze mit einer Nadel sticht oder die Pflanze mit einem Scheuermittel reibt. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium inokuliert. Die Pflanze oder der Pflanzenteil kann dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden und sich zu einer reifen Pflanze entwickeln lassen. Eine Regeneration transformierter Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann unter Verwendung bekannter Teckniken erreicht werden, z.B. durch Selektion transformierter Triebe unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Sub-Kultivieren der Triebe auf einem Medium, welches die entsprechenden Nährstoffe, Pflanzenhormone u.dgl. enthält.

Züchten von Wirtszellen und rekombinante Produktion Die Erfindung umfasst auch Zellen, die modifiziert wurden, damit sie Prolin-spezifische Endoprotease oder eine Variante davon exprimieren. Zu solchen Zellen gehören vorübergehend, oder vorzugsweise stabil modifizierte höhere eukaryontischen Zelllinien, wie Säugerzellen oder Insektenzellen, niedrigere eukaryontische Zellen, wie Hefe- und filamentöse Pilzzellen, oder prokaryontische Zellen, wie Bakterienzellen.

Es ist auch möglich, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide vorübergehend in einer Zelllinie oder auf einer Membran, wie z.B. in einem Baculovirus-Expressionssystem, exprimiert werden. Solche Systeme, die zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine adaptiert sind, sind auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Erzeugung des Polypeptids der Erfindung durch Züchten von mikrobiellen Expressions-Wirten, die mit einem oder mehreren Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, in einem herkömmlichen Nähr-Fermentationsmedium bewirkt werden.

Die rekombinanten Wirtszellen gemäß der Erfindung können unter Verwendung von Vorgangsweisen, die auf dem Gebiet bekannt sind, gezüchtet werden. Für jede Kombination eines Promotors und einer Wirtszelle stehen Kulturbedingungen zur Verfügung, die für die Expression der für das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz förderlich sind. Nach dem Erreichen der gewünschten Zelldichte oder dem Titer des Polypeptids, wird das Züchten beendet, und das Polypeptid wird unter Verwendung bekannter Vorgangsweisen gewonnen.

Das Fermentationsmedium kann ein bekanntes Kulturmedium umfassen, welches eine Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Maltose, Molasse usw.), eine Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid etc.) und anorganische Nährstoffquellen (z.B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen usw.) enthält. Gegebenenfalls kann ein Inducer (abhängig vom verwendeten Expressionskonstrukt) inkludiert oder nachträglich zugesetzt werden.

Die Selektion des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirtes und/oder auf den regulierenden Erfordernissen des Expressionskonstrukts basieren. Geeignete Medien sind den Fachleuten gut bekannt. Das Medium kann gewünschtenfalls zusätzliche Bestandteile enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen, potentiell kontaminierenden Mikroorganismen favorisieren.

Die Fermentation kann über einen Zeitraum von 0,5–30 Tagen durchgeführt werden. Die Fermentation kann ein Chargen-, kontinuierliches oder ein Verfahren mit zugeführten Chargen („fedbatch") sein, bei einer geeigneten Temperatur im Bereich von zwischen 0°C und 45°C und beispielsweise bei einem pH-Wert von 2 bis 10. Zu den bevorzugten Fermentationsbedingungen gehören eine Temperatur im Bereich von 20°C bis 37°C und/oder ein pH-Wert zwischen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen werden üblicherweise auf Grund der Wahl des Experessionswirtes und des zu exprimierenden Proteins ausgewählt.

Nach der Fermentation werden die Zellen, falls nötig, aus der Nährlösung durch Zentrifugieren oder Filtern entfernt. Nach Beendigung der Fermentation oder nach dem Entfernen der Zellen kann dann das Polypeptid der Erfindung gewonnen werden und gewünschtenfalls mit herkömmlichen Mitteln gereinigt und isoliert werden. Die Prolin-spezifische Endoprotease der Erfindung kann aus dem Pilzmyzelium oder aus der Nährlösung, in welche die Prolin-spezifische Endoprotease durch die gezüchteten Pilzzellen freigesetzt wird, gereinigt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid von einem Pilz, mehr bevorzugt von einem Aspergillus, am meisten bevorzugt, von Aspergillus niger, erhalten.

Die Polypeptide der Erfindung können chemisch modifiziert werden, z.B. post-translational modifiziert. Beispielsweise können sie (ein- oder mehrmals) glykosyliert werden oder modifizierte Aminosäurereste aufweisen. Sie können auch durch die Zugabe von Histidinresten modifiziert werden, um ihre Reinigung zu unterstützen, oder durch die Zugabe einer Signalsequenz, um die Sezernierung aus der Zelle zu fördern. Das Polypeptid kann Amino- oder Carboxyl-terminale Verlängerungen aufweisen, wie einen Amino-terminalen Methionin-Rest, ein kleines Linker-Peptid von bis zu etwa 20–25 Resten, oder eine kurze Verlängerung, die die Reinigung erleichtert, wie einen Polyhistidin-Trakt, ein antigenes Epitop oder eine Bindungs-Domäne.

Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann mit einer sichtbarmachenden Markierung markiert sein. Die sichtbarmachende Markierung kann jede geeignete Markierung sein, die eine Detektion des. Polypeptids ermöglicht. Zu den geeigneten Markierungen zählen Radioisotope, z.B. ¹²⁵I, ³⁵S, Enzyme, Antikörper, Polynukleotide und Linker, wie Biotin.

Die Polypeptide können modifiziert sein, so dass sie nicht natürlicherweise vorkommende Aminosäuren inkludieren oder um die Stabilität des Polypeptids zu erhöhen. Wenn die Proteine oder Peptide mit synthetischen Mitteln erzeugt werden, können solche Aminosäuren während der Herstellung eingeführt werden. Die Proteine oder Peptide können auch entweder nach einer synthetischen oder nach einer rekombinanten Produktion modifiziert werden.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch unter Verwendung von D-Aminosäuren erzeugt werden. In solchen Fällen sind die Aminosäuren in reverser Sequenz in Orientierung C nach N verknüpft. Dies ist auf dem Gebiet zur Erzeugung solcher Proteine oder Peptide herkömmlich.

Eine Reihe von Seitenketten-Modifikationen ist auf dem Gebiet bekannt und kann an den Seitenketten der Proteine oder Peptide der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden. Zu solchen Modifikationen zählen beispielsweise Modifikationen von Aminosäuren durch reduktive Alkylierung durch Umsetzung mit einem Aldehyd, gefolgt von einer Reduktion mit NaBH₄, Amidierung mit Methylacetimidat oder Acylierung mit Essigsäureanhydrid.

Die von der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Sequenzen können auch als Ausgangsmaterialien für die Konstruktion von Enzymen der „zweiten Generation" verwendet werden. Prolinspezifische Proteasen der „zweiten Generation" sind Prolinspezifische Proteasen, die durch Mutagenese-Techniken (z.B. Stellen-gerichtete Mutagenese) verändert sind, die Eigenschaften haben, die sich von jenen der Wildtyp-Prolin-spezifischen Protease oder von rekombinanten Prolin-spezifischen Proteasen, wie jenen, die durch die vorliegende Erfindung erzeugt werden, unterscheiden. Beispielsweise können ihre Temperatur oder das pH-Optimum, die spezifische Aktivität, Substrat-Affinität oder Thermostabilität verändert sein, damit sie zur Verwendung in einem bestimmten Verfahren besser passen.

Aminosäuren, die für die Aktivität der Prolin-spezifischen Endoprotease der Erfindung wesentlich sind und daher vorzugsweise einer Substitution unterliegen, können gemäß Vorgangsweisen, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie stellengerichteter Mutagenese oder Alanin-Scanning Mutagenese, identifiziert werden. Bei der letzteren Technik werden Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische Aktivität (z.B. Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität) getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls von kritischer Bedeutung sind. Stellen einer Enzym-Substrat-Interaktion können ebenfalls durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt weren, wie sie durch Techniken, wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie oder Photoaffinitäts-Markierung, bestimmt wird.

Man erwartet, dass die Verwendung von Hefe und filamentösen Pilz-Wirtszellen solche post-translationalen Modifikationen (z.B. proteolytische Verarbetiung, Myristilierung, Glycosylierung, Trunkierung, und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung), die man möglicherweise braucht, um rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung eine optimale biologische Aktivität zu verleihen, vorsieht.

Die Polypeptide der Erfindung können in isolierter Form vorliegen. Man wird verstehen, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln, die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht stören, gemischt werden kann und noch immer als isoliert angesehen werden kann. Ein Polypeptid der Erfindung kann auch in einer im Wesentlichen gereinigten Form vorliegen, in welchem Fall dies im Allgemeinen das Polypeptid in einem Präparat umfassen wird, in welchem mehr als 70%, z.B. mehr als 80%, 90%, 95%, 98% oder 99% der Proteine im Präparat ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist.

Die Polypeptide der Erfindung können in einer solchen Form vorgesehen werden, dass sie außerhalb ihrer natürlichen Zellumgebung vorliegen. So können sie im Wesentlichen isoliert oder gereinigt, wie oben besprochen, sein, oder in einer Zelle, in welcher sie in der Natur nicht vorkommen, beispielsweise einer Zelle anderer Pilz-Spezies, Tiere, Pflanzen oder Bakterien.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Prolylspezifischen Endoprotease bei der Herstellung eines Getränks. Eine Prolyl-spezifische Endoprotease wird vorzugsweise bei der Herstellung von Bier, Wein oder Fruchtsaft verwendet. Durch die Zugabe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Verringerung oder Verhinderung einer Trübung erreicht. Durch Zusetzen dieser Prolylspezifischen Endoproteasen werden neue Getränke erhalten. So betrifft die Erfindung auch Getränke, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Zu diesen Getränken zählen beispielsweise Bier, Wein und Fruchtsaft, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.

Ein Vorteil der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Getränke ist, dass diese Getränke einen hohen Gehalt an Antioxidantien aufweisen. Polyphenole sind Antioxidantien. Bier wird üblicherweise mit einem Polyphenol-entfernenden Agens behandelt, um die Bildung einer Trübung zu verhindern, und infolgedessen hat das erhaltene Bier eine geringe antioxidative Aktivität. Dasselbe gilt für andere mit Polypheol-entfernenden Mitteln behandelte Getränke. Bier, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist, hat eine höhere endogene antioxidative Aktivität. Da man Antioxidantien als gesundheitsfördernde Ingredienzien ansieht, kann man die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Getränke als Getränke ansehen, die gesünder sind als dieselbe Art Getränk, die mit Polyphenol-entfernenden Mitteln, wie PVPP, zubereitet wurden. Es ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Farbe von mit diesem Verfahren erhältlichen Fruchtsäften nicht bzw. weniger blass ist als die Farbe von Fruchtsäften, die nach dem Entfernen von Polyphenolen erhalten werden. Weine und Fruchtsäfte, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, haben ein besseres Aroma und einen besseren Geschmack im Vergleich zu Getränken, die mit einem Verfahren erhalten werden, bei welchem Bentonit oder eine ähnliche Verbindung verwendet wird, da Bentonit nicht nur Proteine entfernt, sondern auch Aroma und/oder Geschmackskomponenten.

Aspergillus niger G306 wurde beim CBS (CBS109712) am 10. September 2001 hinterlegt. A.niger G306 enthält ein Gen, das für eine Prolyl-spezifische Endoprotease gemäß der Erfindung codiert. Das Gen oder die cDNA, welche (s) aus diesem Organismus erhältich ist, kann unter Verwendung bekannter Methoden in jedem Aspergillus niger-Wirt kloniert und exprimiert werden.

Die folgenden Proben wurden verwendet:

• 1) „Endo-Pro A", eine Prolin-spezifische Endoprotease, wurde in Versuchen mit Bier verwendet. Die Probe war ein Ultrafiltrationskonzentrat, erhalten nach Ultrafiltration einer Nährlösung, die nach Fermentation eines Aspergillus niger-Stamms umfassend ein Gen, das für eine Prolin-spezifische Endoprotease codiert, erhalten wurde. Die Prolyl-spezifische Aktivität der Endo-pro A-Probe betrug 5,06 E/ml, bestimmt wie unter „Methoden" beschrieben. Die Proteinkonzentration wurde mit 50g/l ermittelt, bezogen auf die spezifische Aktivität einer Probe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease mit einer Reinheit von mehr als 90%.
• 2) „Endo-Pro B", eine Prolin-spezifische Endoprotease, wurde in Versuchen mit Wein verwendet. Die Probe wurde nach Reinigung über eine Säule erhalten und hatte eine Aktivität von 6,0 E/ml.

Collupulin, ein von DSM, Frankreich, erhältliches flüssiges Papain-Präparat, wurde für Versuche mit Papain verwendet. Die Aktivität beträgt 5280 NF/mg. Eine Einheit NF ist die Menge an Papain-Aktivität, die die Hydrolyse von Casein katalysiert, um ein Mikrogramm-Äquilanet von löslichem Tyrosin pro Stunde bei pH 6,0 zu erzeugen. Die Protein-Konzentration in der Papain-Probe wurde gemessen, und sie ist 119 g/l (Lowry).

Das verwendete PVPP war ein im Handel erhältliches, nicht-wasserlösliches PVPP mit der Bezeichnung „Polyclar AT".

Ein Malzbier (Pilsener Typ) von „Les Trois Brasseurs" in Lille, Frankreich, wurde bei allen mit Bier durchgeführten Versuchen verwendet. Der Prozentsatz Alkohol dieses Biers betrug 5,2% (V/V), und der pH-Wert war 4,4. Dieses bestimmte Bier wurde ausgewählt wegen der relativ hohen Menge an Trübung, die bei diesem Bier nach dem Kühlen gemessen wurde, im Vergleich zu anderen im Handel erhältlichen Bieren. Das Bier hatte eine Protein-Konzentration von 0,9 g/l, wie mittels der Lowry-Methode bestimmt.

Ein aus weißen Sauvignon-Trauben hergestellter Weißwein wurde ohne Protein-Entfernungs-Behandlung verwendet. Die alkoholische Fermentierung während der Weinerzeugung erfolgte mit einer ausgewählten Hefe VL3 von Lallemand. Die önologische Analyse des Weins ergab die folgenden Resultate:

Die Substrat-Lösung ist eine 2 mM Lösung von N-Carbobenzoxyglycin-prolin-p-nitro-anilid (Z-Gly-Pro-pNA; MW 426,43; Bachem), hergestellt in einem 0,1 M Zitronensäure/0,2 M Dinatriumphosphat-Puffer, pH 5,0, enthaltend 40% Dioxan.

Zu 1 ml Puffer, pH 5,0, werden 250 &mgr;l der Substratlösung zugegeben, gefolgt von 100 &mgr;l der Enzymlösung (größere oder geringere Volumsmengen der Enzymlösung sollten durch Pufferlösung kompensiert werden). Die Reaktionsmischung wird bei 37°C inkubiert, und die Freisetzung von pNA wird durch Messen der Absorptionssteigerung bei 410 nm verfolgt.

Aktivitäts-Definition: 1 Einheit ist die Enzym-Aktivität, die 1 &mgr;mol pNA aus Z-Gly-Pro-pNA in 1 Minute unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen freisetzt. Um die Konzentrationen zu berechnen, wird ein molarer Extinktionskoeffizient (E) von 8.800 M^–1 verwendet.

Die Trübe oder Trübung wurde mit einem Turbidimeter mit der Bezeichnung Tannometer, von Pfeuffer GmbH, Kitzingen, Deutschland, gemäß der Bedienungsanleitung von Pfeuffer gemessen. Stark unterkühltes Bier weist eine reversible Trübe, verursacht durch ausgefällte Polypehnol-Protein-Komplexe, auf. Die Zugabe von Alkohol verringert die Löslichkeit der Komplexe und beschleunigt somit die Bildung von Schleiern. Um das Tannometer zu eichen, wurde eine Formazin-Standard-Lösung hergestellt, wie von Jean de Clerk, „Cours de Brasseries", 2. Ausgabe, (S. 595–596)Unviersite de Louvain, Belgien, beschrieben. Der Standard für die Trübe war in Einheiten EBC. Vom Bier wurde durch Filtration über einen Papierfilter die Kohlensäure entfernt. Direkt vor dem Durchführen des Kühlungs-Trübungs-Tests wurde Ethanol zu den Proben in einer Menge zugegeben, die ausreichte, um den Alkoholgehalt auf 6% (V/V) zu erhöhen. Der Kühlungs-Trübungs-Test wurde durchgeführt, indem jede Probe während 30 min auf –8°C gekühlt wurde. Die gebildete Trübung (Trübe, in Einheiten EBC) wurde rasch im Turbidimeter, dessen Messkammer auch auf –8°C gehalten wurde, gemessen.

Die für Bier beschriebenen Kühlungs-Trübungs-Tests können auch mit Bierwürzen oder mit alkoholfreien Bieren durchgeführt werden. In diesen Fällen wird ebenfalls Ethanol zu den Proben in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um einen Alkoholgehalt von 10% (V/V) in den Proben zu erreichen. Die verwendete Biertrübungs- oder Trübe-Einheit ist das ECB, das sind nephelometrische Trübe-Einheiten, wie von der European Brewery Convention empfohlen.

Wie von K.J. Siebert (K.J. Siebert et al., J. Agric. Food Chem. 44 (1996)) beschrieben, kann eine Trübe in Getränken, wie Wein oder Fruchtsäften, durch einen Erhitzungs-Test induziert werden. Das Ausmaß der gebildeten Trübung ist hauptsächlich eine Funktion der Mengen an trübungsaktiven Proteinen und Polyphenolen im Getränk. Beim Erhitzungs-Test wird die Turbidität von Proben (z.B. von Wein oder Fruchtsaft) mit einem Turbidimeter vor und nach dem 30 Minuten langen Erhitzen bei 80°C gemessen. Vor dem Messen der Trübung wird die erhitzte Probe unter kaltem Wasser abgekühlt, bis eine Temperatur von 22–25°C erreicht ist. Bei den Wein-Versuchen (vgl. Beispiel III) erfolgte die Eichung des Turbidimeters mit NTE-Formazin-Standard-Lösungen, für die Fruchtsaft-Versuche (vgl. Beispiel V) wurde die NTE-Trübungs-Standard-Lösung von Reagecon, Irland, gekauft. NTE=nephelometrische Turbiditäts-Einheiten.

• (i) Ein Leer-Experiment wurde durchgeführt, wobei kein exogenes Protein während der Inkubation zugesetzt wurde.
• (ii) Ein Versuch wurde durchgeführt, bei welchem Bier verwendet wurde, das mit einer großen Menge an PVPP (1000 g/hl) vor der Inkubation behandelt worden war. Dieser Versuch ermöglichte die Bestimmung des durchschnittlichen Ausmaßes der Trübe, die durch den Kühlungs-Trübungs-Test induziert wird, welche auf Polyphenol-Protein-Präzipitat zurückzuführen ist, weil PVPP Polyphenole aus dem Bier entfernt und somit die Bildung einer Trübung beeinträchtigt.
• (iii) Versuche wurden durchgeführt, bei welchen exogene Proteine (Prolin-spezifische Endoprotease bzw. Papain) dem nach einer einstündigen Inkubation bei 40°C auf 0°C gekühlten Bier zugesetzt wurden. Die Inkubation bei 0°C erfolgte 15 min lang vor den Trübungsmessungen. Da das Enzym und Papain bei 0°C nicht oder kaum aktiv sind, ermöglichten diese Versuche eine Unterscheidung zwischen dem Effekt der Enzymaktivität und nicht-enzymatischen Protein-Effekten.

Zu einem Malzbier, aus dem die Kohlensäure entfernt worden war (Les Trois Brasseurs), Proteingehalt: 0,9 g/l, wurden verschiedene Mengen eines Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms („Endo-Pro A", vgl. „Materialien") zugegeben. Zwei Reihen von Trübemessungen wurden durchgeführt. Bei der ersten Reihe wurden die Bier-Endo-Pro A-Zusammensetzungen vor dem Kühlungs-Trübungstest 1 h lang bei 40°C inkubiert. Nach der Inkubation bei 40°C und direkt vor dem Kühlungs-Trübungs-Test wurde Ethanol zur Bier-Endo-Pro A-Zusammensetzung in einer Menge zugegeben, die ausreichte, um den Alkohol auf 6% (V/V) zu erhöhen. Bei der zweiten Reihe wurde das Bier ohne Endo-Pro A 1 h lang bei 40°C inkubiert und danach auf 0°C gekühlt. Bei 0°C wurde das Endo-Pro A zugesetzt, und die resultierenden Zusammensetzungen wurden 15 min lang bei 0°C inkubiert. Direkt vor dem Kühlungs-Trübungs-Test wurde der Bier-Endo-Pro A-Zusammensetzung Ethanol in einer Menge zugesetzt, die ausreichte, um den Alkoholgehalt auf 6% (V/V) zu erhöhen.

Die Mengen an zugesetztem Endo-Pro A und der Prozentsatz der Trübungsverringerung bezogen auf die gemessene Trübung, wenn kein Endo-Pro A zugesetzt wurde, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Mengen an zugesetzten Endo-Pro A deckten einen großen Bereich von weniger als 1% zugesetzter exogener Proteine bis zu mehr als 10% ab, bezogen auf die Menge von im Bier vorhandenem Protein.

Die Tabelle 1 zeigt deutlich, dass sich nach dem Kühlen weniger Trübung gebildet hat, wenn dem Bier eine Prolylspezifische Endoprotease bei einer Temperatur zugesetzt wird, (und) wenn die Protease vor dem Kühlen aktiv ist. Die Tabelle 2 zeigt deutich, dass etwas Wirkung vorhanden ist, wenn eine Prolyl-spezifische Endoprotease dem Bier bei einer Temperatur zugesetzt wird, die so niedrig ist, dass die Protease nicht oder kaum aktiv ist, jedoch die Auswirkung sehr gering im Verglich zu jener Wirkung ist, die beobachtet wird, wenn die Protease bei einer Temperatur zugesetzt wird, bei welcher sie aktiv ist.

Zu einem Malzbier (Les trois Brasseur), von welchem die Kohlensäure entfernt worden war, Proteingehalt: 0,9 g/l, wurden verschiedene Mengen an Papain (von 0 bis 100 g/hl) zugegeben. Zwei Reihen Kühlungs-Trübungs-Messungen wurden durchgeführt. Für die erste Reihe wurden die Bier-Papain-Zusammensetzungen vor dem Kühlungs-Trübungs-Test 1 h lang bei 40°C inkubiert. Ethanol wurde den inkubierten Proben zugesetzt, so dass sie 6% Alkohol (V/V) vor den Trübungsmessungen erreichten. Bei der zweiten Reihe wurden Bierproben 1 h lang bei 40°C inkubiert, und danach auf 0°C abekühlt. Danach wurde das Papain zugesetzt, und die Proben wurden 15 min lang bei 0°C inkubiert. Die Mengen an zugesetztem Papain und der Prozentsatz der Trübungsverringerung im Vergleich zur Trübung, die gemessen wurde, wenn kein Papain zugesetzt wurde, sind in Tabelle 3 gezeigt.

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen die Wirkung von Papain auf die nach dem Kühlen in Bier gebildete Trübungsmenge. Es ist klar, dass die Wirkung von Papain auf die Trübung sich einpendelt, wenn Papain in einer Menge von 3g/hl und darüber zugesetzt wird. Offensichtlich ist es nicht möglich, mit Papain dieselbe Menge einer Trübungsverminderung zu erreichen wie mit einer Prolyl-spezifischen Endoprotease.

Sowohl bei den Bier/Prolyl-spezifischen Endoprotease-Versuchen als auch bei den Bier/Papain-Versuchen wurde ein Kontrollversuch vorgenommen, indem eine große Menge an PVPP (1000 g/hl) dem Bier vor der Inkubation zugesetzt wurde. Nach 15-minütigem Mischen wurde das PVPP durch Filtration entfernt (es wurde kein Prolyl-spezifisches Endoprotease-Enzym oder Papain zugesetzt). Bei beiden Kontrollen entstand während des Kühlungs-Trübungs-Versuchs fast keine Trübung. Da bekannt ist, dass PVPP Polyphenole aus Getränken entfernt, weisen diese Kontrollversuche darauf hin, dass Polyphenole an der Entstehung einer Trübung in Bier sehr wohl beteiligt sind. Um die PVPP-Wirkung auf die Bier-Trübungsstabilität zu messen, wurden verschiedene Mengen an PVPP einem Bier, dem die Kohlensäure entzogen worden war, zugesetzt und durch Filterung nach 15-minütigem Mischen entfernt. Vor der Zugabe des PVPP wurde das Bier 1 h lang bei 40°C inkubiert.

Tabelle 5 zeigt die Wirkung der Zugabe verschiedener Mengen von PVPP auf die Menge der in Bier nach dem Kühlen vorhandenen Trübung. Kein Endo-Pro A oder Papain wurde zugesetzt.

In Tabelle 3 ist gezeigt, dass die Zugabe von 3g Papain/hl Bier (welches die in der Bierindustrie empfohlene maximale Dosis ist) nach einstündiger Inkubation bei 40°C eine Trübungsverringerung von fast 36% induziert. Im Falle einer Zugabe der Prolylspezifischen Endoprotease, induziert die Zugabe von 1% (bezogen auf die Menge an Protein im Bier) Prolyl-spezifischer Endoprotease nach einer einstündigen Inkubation bei 40°C eine Verringerung einer Bier-Kühlungs-Trübung von 38% (vgl. Tabelle 1). In Brauereien wird PVPP im Allgemeinen in einer Menge zugesetzt, die 30 g/hl nicht übersteigt. Da PVPP die Trübung um etwa 20% verringert, wenn es in dieser Menge zugesetzt wird, kann man schließen, dass sowohl Papain als auch Prolyl-spezifische Endoprotease-Enzyme bessere Trübungs-Hemmer sind als PVPP.

Das Ziel war, zu bestimmen, ob die Zugabe von Prolylspezifischer Endoprotease zu einer 100 Malzmaische in der endgültigen Malz-Bierwürze zu einer Trübungsminderung führen könnte.

Jeder Maischversuch beginnt mit dem Mischen von 25g gemahlenem Malz mit 100 ml Wasser. Danach wird die Maische auf 50°C erhitzt, und nach der Zugabe einer Menge an „Endo-Pro A" wird die Maische gemäß einer stufenweisen Erhitzung auf vier jeweils höhere Temperaturen behandelt. Die Tabelle 6 zeigt dieses Maischen-Temperaturprofil. Während des gesamten Maischens wurde die Maische mit 200 U/min gerührt. Am Ende des Maischens wird die Maische bei Raumtemperatur gehalten, und Wasser wurde zugegeben, um die Wasserverdampfung zu kompensieren. Danach wurde die Maische auf Papier filtriert, um die Bierwürze (Flüssigkeit) von den Feststoffen zu trennen.

0, 200 bzw. 500 &mgr;l Endo-Pro A wurde den Maischen zugesetzt. Ein Kontrollversuch wurde durchgeführt, wobei 500 &mgr;l Endo-Pro A verwendet wurden, welches durch 15-minütiges Erhitzen desselben auf 90°C inaktiviert wurde. Die Trübung oder Trübe der Bierwürze wurde bei Raumtemperatur und nach dem Kühlungs-Trübungs-Test gemessen. Die Bierwürzen-Kühlungs-Tests werden, wie im Alkohol/Niedrigtemepratur-Test gemäß Chapon (Kühlungs-Trübungs-Test Pfeuffer Bedienungsanleitung) beschrieben, durchgeführt, indem Ethanol zugesetzt wurde, um 10% (V/V) in der Probe zu erreichen, wie von Chapon für alkoholfreie Biere empfohlen.

Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen deutlich, dass, wenn einer Malzmaische eine Prolyl-spezifische Endoprotease zugesetzt worden ist, die resultierende Bierwürze nach dem Kühlen viel weniger trüb ist als eine ohne Zugabe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease hergestellte Bierwürze.

Um die Endo-Pro A-Wirkung zu untersuchen, wurde ein Kühlungs-Trübungs-Test auf einer Malz-Bierwürze durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass der Zusatz einer Prolyl-spezifischen Endoprotease die Bierwürze-Kühlungs-Trübung verringerte. Eine Verringerung der im Kühlungs-Trübungs-Test gebildeten Trübung wurde selbst bei geringen Mengen zugesetztem Prolyl-spezifischem Endoprotease-Enzym beobachtet. Wenn das Enzym vor der Zugabe zur Maische inaktiviert wird, verschwindet der Stabilisierungseffekt vollständig, d.h. die Menge der gebildeten Trübung wird nicht mehr verringert. Die die durch die Zugabe eines Prolylspezifischen Enzyms induzierte Trübungsverringerung ist sehr wichtig. Im Beispiel wurde eine Trübungsverringerung von bis zu 82% erreicht.

Um die Wirkungen der Zugabe eines Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms in Malz-Bierwürzen und in Gerste-Bierwürzen zu vergleichen, wurden Versuche durchgeführt, wobei verschiedene Mengen an Endo-Pro A Gerste-Maischen zugesetzt wurden. Der pH-Wert war 5,6 bei Malz-Bierwürzen, bzw. 6,1 bei Gerste-Bierwürzen. Die bei Gerste-Bierwürzen-Kühlungs-Trübungs-Tests erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass, wie früher bei Malz-Bierwürzen beobachtet, die Behandlung von Gerste-Maischen mit einer Prolyl-spezifischen Endoprotease eine wichtige Verringerung der Gersten-Bierwürzen-Kühlungs-Trübung induziert. Sowohl Malz- als auch Gerste-Maischen, die mit einer Prolylspezifischen Endoprotease behandelt wurden, führen zu sehr stabilisierten Bierwürzen, doch ist die Wirkung bei Malz-Bierwürzen stärker als bei Gerste-Bierwürzen. Tatsächlich induzierte die Zugabe von 200 &mgr;l Endo-Pro A zur Maische eine Trübungsverringerung von etwa 59% bei Gerste-Bierwürzen, und mehr als 70% bei Malz-Bierwürzen. Die mit 500 &mgr;l Endo-Pro A durchgeführten Versuche steigerten die Trübungsverringerung bis zu 82% bei Malz-Bierwürzen und verbesserten die Trübungsverringerung bei Gerste-Bierwürzen nicht, im Vergleich zum 200 &mgr;l Endo-Pro A-Versuch. Überraschenderweise führte die Zugabe von Endo-Pro A zu Gerste-Maischen zu klaren filtrierten Bierwürzen, wogegen die nicht mit Endo-Pro behandelten Maischen trübe filtrierte Bierwürzen ergaben (die Gerste-Maische-Filterungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, und die Trübe der Bierwürzen wurde bei Raumtemperatur ohne Ethanol-Zugabe gemessen). Diese Wirkung wird beobachtet, gleichgültig, wie hoch die Menge der den Gerste-Maischen zugesetzten Prolyl-spezifischen Endoprotease ist.

Verschiedene Dosen (0, 30, 60, 150 &mgr;l) einer Prolylspezifischen Endoprotease (Endo-Pro B) mit einer spezifischen Aktivität von 6,0 E/ml wurden in Kolben gegeben, die 500 ml Weißwein (Wein, wie unter „Materialien" beschrieben) enthielten und bei Raumtemperatur (22–25°C) 19 Tage lang unter einer Stickstoffatmosphäre inkubiert. Die Wein-Trübungsstabilität wurde nach 0, 6, 8, 12 und 19 Tagen gemessen, wobei der Erhitzungs-Test wie unter „Methoden" beschrieben, verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 8 gezeigt. In Tabelle 8 ist die Wein-Trübung oder Trübe in Nephelos-Turbidiäts-Einheiten (NTE) ausgedrückt, &Dgr;NTE=Trübe in NTE, gemessen an Weinproben nach dem Erhitzen- Trübe in NTE gemessen an Weinproben vor dem Erhitzen. Die Menge an Bentonit, die notwendig war, um die Proteine des Weins zu stabilisieren, wurde gemäß der Formel (1,48 × &Dgr;NTE)+2 errechnet. Wie bekannt, ist weniger Bentonit notwendig, um im Wein die Entstehung einer Trübung zu verhindern, wenn ein Wein weniger empfänglich für eine Trübungsbildung ist.

Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, dass der Zusatz einer Prolyl-spezifischen Endoprotease zu einem Weißwein vor dem Erhitzen die im Wein nach dem Erhitzen gebildete Trübung verringert. Nach 6-tägiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Wirkung beobachtet. Tatsächlich erreicht die Abnahme der Trügung 39% mit 150 &mgr;l zugesetztem Endo-Pro B und etwa 12% mit 30 &mgr;l oder 60 &mgr;l Endo-Pro B. Nach 12 Tagen, und unabhängig von der Menge der verwendeten Prolyl-spezifischen Endoprotease erreicht die Trübungsverringerung 46% und übersteigt 70% nach 19 Tagen. Daher ist es klar, dass eine Prolyl-spezifische Endoprotease verwendet werden kann, um Bentonit, der notwendig ist, um Wein gegen die Bildung einer Trübung zu stabilisieren, zu vermeiden oder dessen Menge stark zu verringern.

Ein Erdbeer-Fruchtsaft wurde, wie folgt, hergestellt: Erdbeeren wurden aufgetaut und zerstoßen und danach blanchiert (erhitzt) bei 90°C, um alle endogenen Enzyme, wie Polyphenoloxidasen, zu zerstören und die Proteine zu denaturieren. Die zerstoßenen Erdbeeren wurden dann auf 50°C abegekühlt, 30 min lang bei 50°C mit 600g/t Papidase BE super (einem handelsüblichen Enzymprodukt von DSM, Frankreich) mazeriert, und in einer pneumatischen Presse gepresst. Um die denaturierten Proteine zu entfernen, wurde die resultierende Mischung bei einer Geschwindigkeit von 8000 U/min zentrifugiert und filtriert. Der Erdbeersaft wurde gesammelt. Ein angesäuerter Alkoholtest war negativ, was bestätigte, dass der Saft Pektin-frei war. Der pH-Wert des Saftes war 3,3.

Endo-ProA/Erdbeersaft-Inkubationen: Unterschiedliche Volumina (0, 5, 10, 20 &mgr;l) von Endo-Pro A (5,06 E/ml) wurden 100 ml Erdbeersaft zugesetzt und bei 50°C 60 min lang inkubiert. Zwei Kontroll-Versuche wurden durchgeführt, (i) einer durch Zugabe von 20 &mgr;l inaktiviertem Endo-Pro A (30 min lang bei 80°C inkubiert) und (ii) eine zweite Kontrolle, durch Zugabe von 200 mg PVPP zu 20 ml Erdbeersaft, welcher zuvor 1 h lang bei 50°C inkubiert worden war. Nach 15-minütigem Mischen bei Raumtemperatur wurde das PVPP durch Zentrifugieren entfernt.

Saft-Erhitzungs-Test: die Saft-Trübung wurde vor und nach dem 30-minütigen Erhitzen der Fruchtsaft-Proben bei 80°C gemessen. Vor dem Messen der Trübung wurden die erhitzten Säfte unter kaltem Wasser abgekühlt.

Die Trübungsmessungen wurden in einem Turbidimeter durchgeführt, welches zuvor mit NTE-Trübungs-Standards von Reagecon (Irland) geeicht worden waren.

Die Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass die Zugabe von 5 &mgr;l Endo-Pro A zu 100 ml Erdbeersaft die Trübe, die nach einem Saft-Erhitzungs-Test gebildet war, um 25,7 verringerte. Die Zugabe von 10 &mgr;l Endo-Pro A zu 100 ml Erdbeersaft verbesserte die Trübungs-Verringerungswirkung im Vergleich zum Versuch mit 5 &mgr;l nicht. Möglicherweise ist die Enzymwirkung bei 5 &mgr;l maximal und wird mit vermehrter Enzymzugabe eine vermehrte Protein-Ausfällung erhalten.

Inaktiviertes Enzym verringerte noch immer die Menge der gebildeten Trübung, die Wirkung war jedoch viel weniger ausgeprägt. Nach Zugabe von PVPP wurde fast keine Trübung beobachtet, doch ging auch die Farbe der Probe verloren. Die Tatsache, dass der Zusatz von PVPP eine Trübungsbildung verhindert, deutet darauf hin, dass auch bei Erdbeersaft die Trübung wahrscheinlich ein Ergebnis von Polyphenol-Protein-Interaktionen ist.