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Dokumentenidentifikation DE69433760T2 12.05.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000729509
Titel GEGEN MUMPS IMPFSTOFF, DAS EIN VIRUS DES JERYL-LYNN STAMMES ENTHÄLT
Anmelder GlaxoSmithKline Biologicals S.A., Rixensart, BE
Erfinder HARFORD, Nigel Maurice, B-1330 Rixensart, BE;
COLAU, B.D.A., B-1330 Rixensart, BE;
DIDELEZ, J., B-1330 Rixensart, BE
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69433760
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 15.11.1994
EP-Aktenzeichen 959007519
WO-Anmeldetag 15.11.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/EP94/03801
WO-Veröffentlichungsnummer 0095014083
WO-Veröffentlichungsdatum 26.05.1995
EP-Offenlegungsdatum 04.09.1996
EP date of grant 06.05.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.05.2005
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 39/165   

Beschreibung[de]

Mumps ist im wesentlichen eine Krankheit in der Kindheit, die sich normalerweise mit nur geringen Symptomen manifestiert. Jedoch sind in manchen Fällen die klinischen Konsequenzen einer Mumpsinfektion ernsthaft. Z.B. ist Mumps die häufigste Ursache für Meningoenzephalitis bei Kindern im Alter von weniger als 15 Jahren in Großbritannien und eine Ursache für permanente sensorineurale Taubheit in der Kindheit. Obwohl 30 bis 40 % der natürlichen Mumpsinfektionen ohne Symptome verlaufen, hat gerade die Tatsache, daß die Beteiligung der Speicheldrüse unangenehm sein kann, und daß in der erwachsenen Bevölkerung Mumps Aborte im ersten Drittel der Schwangerschaft und Orchitis beim Mann sowie die oben genannten neurologischen Komplikationen verursachen kann, in vielen Ländern zur Aufnahme von Massenimpfungsprogrammen geführt.

Das Mumpsvirus, das zu den Paramyxoviridae gehört, besteht aus einer einsträngigen genomischen RNA des Minus-Sinnes und ist ca. 15,3 kb lang mit der Gen-Reihenfolge 3'N-P-M-F-SH-HN-L5' (N = Nukleokapsidprotein, P = Phosphoprotein, M = Matrixprotein, F = Fusionsprotein, SH = potentiell exprimiert als kleines hydrophobes Protein, HN = Hämagglutinin-Neuraminidase, L = großes Protein). Unter den verschiedenen Mumpsstämmen ist der Jeryl-Lynn-Stamm (B-Level) eine abgeschwächte Lebendvariante, die durch Sequenzanalyse der F,P,HN,M-Gene charakterisiert wurde.

Bis vor kurzem waren zwei Mumps-Virusstämme für die Impfung gegen Mumps zugelassen. Dieses sind Urabe Am 9 und Jeryl-Lynn. Jedoch wurde im September 1992 der Urabe-Stamm im Anschluß an einen Bericht über das Auftreten eines inakzeptablen Maßes von Nebenwirkungen zurückgezogen [European Journal of Pediatrics (1993) 152:387].

Der Jeryl-Lynn-Stamm wird von Merck Sharp und Dohme seit vielen Jahren unter der Marke "MumpsVax" kommerziell verkauft. Der Jeryl-Lynn-Stamm wurde aus einer klinischen Probe eines Patienten, der an Mumps litt, durch Fruchtwasserimpfung in angebrütete Hühnereier erhalten (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 123 (3) (1966)).

Afzal et al. berichteten kürzlich (J. of Gen. Virology 1993, 74, 917), daß der in Impfstoffen in Großbritannien verwendete Jeryl-Lynn-Stamm tatsächlich eine Mischung aus zwei Viren ist, und zwar JL-2 und JL-5.

Takeuchi et al., Virology (1991), 181, S. 364–366, berichten, daß es unter verschiedenen Mumpsstämmen eine substantielle Nukleotidsequenzvariation auf dem Niveau des SH-Gens geben kann.

Afzal et al. haben betont, daß der derzeit kommerziell erhältliche Impfstoff "MumpsVax" unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen hergestellt wird, einschließlich einer Zellbank und Passagebeschränkungen, die sehr wahrscheinlich das Verhältnis der zwei Varianten von Charge zu Charge bewahren. Jedoch gibt es beim weiteren Passagieren des Jeryl-Lynn-Stammes keine Garantie, daß dieses Gleichgewicht zwischen den zwei Varianten beibehalten werden wird. Außerdem ist es schwierig, das Verhältnis der zwei Varianten in einer gegebenen Charge von Impfstoff zu bewerten.

Die vorliegenden Erfinder haben überraschend ein weiteres Isolat identifiziert, das sich sowohl von JL-2 als auch von JL-5 von Afzal et al. unterscheidet. Der Unterschied wurde durch Nukleotid-Sequenzanalyse des SH-Gens und der dieses umgebenden Regionen bestimmt, insbesondere der nichttranslatierten intercistronischen Region 3' zur SH-codierenden Sequenz und 5' zum HN-Gen. Dieses Isolat induziert in klinischen Versuchen eine höhere Nullumwandlung und besitzt einen höheren geometrischen Mittelwert des Mumps-Antikörper-Titers als der kommerziell erhältliche Mumpsimpfstoff.

Entsprechend stellen die vorliegenden Erfinder einen abgeschwächten Jeryl-Lynn-Mumpsstamm bereit, der die wie in 1 dargestellte Nukleotidsequenz enthält. Diese Sequenz codiert das SH-Gen und den N-Terminus des HN-Gens. Der Stamm wird hier als SBB JL-1 bezeichnet.

In 1 wird die cDNA-Sequenz des JL-1-Mumpsvirus-Isolats über die das SH-Gen codierenden und intergenischen SH-HN-Regionen gezeigt.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Mumpsimpfstoff bereit, der ein immunogenes Jeryl-Lynn-Isolat umfaßt, wobei das Isolat mit nicht mehr als 10 % und bevorzugt weniger als 5 % und am meisten bevorzugt weniger als 1 % eines anderen Jeryl-Lynn-Isolats, wie durch die Sequenz der oben angegebenen Region definiert, kontaminiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Impfstoff ein reines homogenes Jeryl-Lynn-Isolat, das heißt ohne jegliche Kontamination mit anderen Jeryl-Lynn-Mumpsisolaten, die sich innerhalb der in 1 dargestellten Region unterscheiden.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der homogenes SBB JL-1 ohne Kontamination mit JL-2 umfaßt.

Das reine Isolat leidet nicht an den Nachteilen einer potentiellen Variation von Charge zu Charge zwischen Unterstämmen und stellt ein Produkt bereit, für das leichter sicherzustellen ist, daß es konstante Qualitätsrichtlinien erfüllen wird.

Homogenes Jeryl-Lynn gemäß der Erfindung kann durch Passagieren von handelsüblichem MumpsVax an Hühner-Embryofibroblasten-(CEF)-Zellen und Selektieren reiner Kulturen durch Grenzwertverdünnung und Untersuchung der resultierenden Isolate oder durch individuelle Plaque-Isolierung erhalten werden. Andere geeignete Zellinien schließen Verozellen und MRC5-Zellen ein. Dies erfordert, daß Verfahren zum Nachweis kleinerer Anteile einer bekannten Virusvariante innerhalb einer Population verfügbar sind. Solche Untersuchungsverfahren schließen den von Chumakov et al. für abgeschwächtes Poliovirus vorgeschlagenen Maprec-Test (WO 92/07958 und PNAS 1991, 88; 199-203) und die direkte Sequenzierung von viralen Plaques und differentielle Hybridisierung von viralen Plaques ein.

Der Impfstoff der Erfindung kann vorteilhaft andere Komponenten enthalten, wie z.B. abgeschwächtes Masernvirus und/oder abgeschwächtes Rötelnvirus, abgetötet oder Untereinheiten davon, zum Bereitstellen von Schutz gegen Masern- und/oder Rötelninfektionen. Trivalente Mumps-, Masern- und Rötelnimpfstoffe sind allgemein fachbekannt, und das vorliegende Mumpsisolat würde in einem trivalenten Impfstoff in einer analogen Weise zu den bereits verfügbaren Impfstoffen formuliert werden. Zusätzlich oder alternativ kann der Impfstoff der Erfindung ein abgeschwächtes Varicella Zoster-Lebendvirus zur Bereitstellung von Schutz gegen Varicella (Windpocken) oder Zoster (Gürtelrose) enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Varicella Zoster-Virus der Oka-Stamm sein, wie er offenbart wird von F.E. Andre, Postgraduate MED J. (1985) 61 (Suppl. 4), 113–120, oder T. Veskari et al., Acta paediatr. Scared. 80: 1051–1057, 1991. Bevorzugt wird der Impfstoff der Erfindung quadrivalent sein und Schutz gegen Mumps, Röteln, Masern und Varicella Zoster-Viren bereitstellen.

Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Vollvirus-Impfstoffs bereit, z.B. durch Gefriertrocknen des Virus in Gegenwart geeigneter Stabilisatoren oder Vermischen des erfindungsgemäßen Stammes mit einem geeigneten Träger oder Hilfsstoff. Es kann ebenfalls vorteilhaft sein, den Stamm der Erfindung in Liposomen oder mit Trägerpartikeln zu formulieren. Alternativ oder zusätzlich können Immunstimulantien wie 3-Des-O-acylmonophosphoryl-Lipid A (Ribi Immunochem) oder das Saponin-Derivat QS21 (Cambridge Biotech) in der Formulierung eingeschlossen werden.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Mumpsinfektionen im Menschen bereit, wobei das Verfahren das Verabreichen einer immunologisch wirksamen Dosis des erfindungsgemäßen Impfstoffs an einen menschlichen Patienten umfaßt, der dessen bedarf.

Der Verabreichungsmodus des Impfstoffs der Erfindung kann jeder geeignete Weg sein, der eine immunprotektive Menge des Stammes und anderer immunogener Komponenten des Impfstoffs auf den Patienten überträgt. Jedoch wird der Impfstoff bevorzugt parenteral über die intramuskulären oder tiefen subkutanen Wege verabreicht. Andere Verabreichungsmodi können nach Wunsch ebenfalls eingesetzt werden, wie z.B. die orale Verabreichung, oder über andere parenterale Wege, d.h. intradermal, intranasal oder intravenös.

Die geeignete immunprotektive und nicht-toxische Dosis eines solchen Impfstoffs kann leicht durch die Fachleute bestimmt werden, d.h, die angemessene immunprotektive und nicht-toxische Menge des Stammes dieser Erfindung, die im Impfstoff dieser Erfindung enthalten ist, kann im Bereich der wirksamen Mengen von Antigen in herkömmlichen Vollvirus-Impfstoffen sein. Es wird jedoch selbstverständlich sein, daß das spezifische Dosisniveau für jeden Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängen wird, die das Alter, die allgemeine Gesundheit, das Geschlecht und die Ernährung des Patienten einschließen; die Verabreichungszeit; den Verabreichungsweg; synergistische Wirkungen mit etwaigen anderen, verabreichten Wirkstoffen; und den gewünschten Schutzgrad. Natürlich kann die Verabreichung in geeigneten Intervallen nach Bedarf wiederholt werden. Typischerweise werden in einer monovalenten Darreichung wenigstens 3,7 log TCID50 des Virus und allgemeiner 4,5 log TCID50 pro Dosis vorhanden sein. In einem trivalenten Mumps-, Masern-, Röteln-Impfstoff wird die Mumpskomponente mit ca. 4,8 log TCID50 vorhanden sein, um die Beeinträchtigung der anderen zwei viralen Komponenten auszugleichen.

Beispiele 1) Erstsequenzierung des SH-Gens

Kommerzielles MumpsVax-Virus wurde an konfluenten Monoschichten aus Vero-Zellen passagiert, gezüchtet in 25 cm2-Kolben mit dMEM Biorich-Medium (50150, V/V) mit 0,5 % fötalem Kälberserum unter Verwendung von ca. 3,0 log TCID50 als Inoculum. Die infizierten Zellen wurden nach 7 Tagen Inkubation bei 34°C gewonnen und die RNA durch das Verfahren von Ferré und Garduno (Nucleic Acids Research 1989, 17; 2141) in 100 &mgr;l Wasser extrahiert, das für 5 Minuten bei 100°C mit Diethylpyrocarbonat behandelt wurde. 5 &mgr;l dieses Extrakts wurden revers transkribiert durch Zugeben der folgenden Reagenzien: RNAsin 40 Einheiten (Boehringer Mannheim, Deutschland), 4 &mgr;l 5-fach konzentrierter reverser Transkriptasepuffer (Bethesda Research Labs), 2 &mgr;l einer Mischung aus den vier Desoxynukleotidtriphosphaten mit 10 mM, 10 pmol NH2-Oligonukleotidprimer, 1 &mgr;l murine Moloney-Leukämievirus-(MMLV)-reverse Transkriptase (Bethesda Research Labs, 200 Einheiten pro &mgr;l) und Wasser auf ein Endvolumen von 20 &mgr;l. Das Oligonukleotid NH2 besitzt Homologie zum F-Gen des Urabe-Stammes des Mumpsvirus. Die Mischung wurde für 45 min bei 37°C inkubiert und dann für 5 min auf 95°C erwärmt. Die cDNA wurde dann durch zwei aufeinanderfolgende Durchgänge der PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide NH8 und NH14 als Primer und unter Verwendung von 1 &mgr;l einer 1000-fachen Verdünnung der Reaktion des ersten Durchgangs als Ausgangsmaterial für den zweiten Durchgang amplifiziert. Jeder PCR-Durchgang bestand aus 25 Cyclen aus Erwärmen auf 94°C für 1 min, 53°C für 1 min und 72°C für 1 min. Das dem SH-Gen entsprechende PCR-Produkt wurde in beiden Richtungen sequenziert, nach weiterer PCR-Amplifikation in Gegenwart von Fluordidesoxynukleotid-Terminatoren und entweder NH8 oder NH14 als Primer und Analyse der Produkte an einem Applied Biosystems Sequenzautomaten (373A DNA-Sequenzer) gemäß Herstellerprotokoll und -empfehlungen. Unklarheiten wurden an einer Anzahl von Positionen in der Sequenz beobachtet und an beiden Strängen bestätigt. Die erhaltene Sequenz unterschied sich von derjenigen von Takeuchi et al. (Virology 1991, 181; 364–366) für Jeryl Lynn an 17 aus 361 Basen, einschließlich 4 nicht zugeordneter Basen. Die Sequenz unterschied sich ferner zum Teil von derjenigen, die von Afzal et al. (J. Gen. Virol. 1993, 74; 917–920) für ihr JL-5-Isolat erhalten wurde, durch 9 aus 319 Basen, einschließlich 4 nicht zugeordneter Basen. Unklarheiten wurden ebenfalls beobachtet, wenn die gleiche Region direkt aus 4,0 bis 5,0 log TCID50 MumpsVax-Virus, das durch Ultrazentrifugation gewonnen wurde, ohne vorherige Passage an Vero-Zellen und nach reverser Transkription der viralen RNA zu cDNA mit Zufallsprimern gefolgt von PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotiden NH30bis und NH31bis als Primer sequenziert wurde.

2) Klonierung des SH-Gens

Das MumpsVax-Virus wurde verwendet, um Vero-Zellen zu infizieren, und Voll-RNA wurde wie oben beschrieben hergestellt. Die RNA wurde unter Verwendung von Zufallsprimern revers transkribiert und unter Verwendung der Oligonukleotide NH22 und NH23 als Primer PCR-amplifiziert. (NH22 enthält eine HindIII-Restriktionsstelle innerhalb des Primers, und NH23 enthält eine BamHI-Restriktionsstelle innerhalb des Primers, um die Klonierung des amplifizierten DNA-Fragments zu erleichtern). Die amplifizierte DNA wurde mit HindIII- und BamHI-Endonukleasen beschränkt und in den Vektor pUC9 kloniert. 11 Klone, die ein der Mumps-SH-Gen-Region entsprechendes Insert enthielten, wurden gewonnen. Alle 11 besaßen eine Sequenz, die derjenigen von Takeuchi et al. (loc. cit.) entsprach. Zusätzlich besaßen 5 Klone eine DdeI-Restriktionsstelle, die in den sechs anderen Klonen fehlte. Kein der JL-5-Sequenz entsprechendes Insert wurde gewonnen. Dieses Ergebnis und die Sequenzierungsunklarheiten legen nahe, daß die von Afzal et al. definierte Variante des JL-2-Virus einen substantiellen oder leicht detektierbaren Anteil des MumpsVax-Virus bildet.

3) Direktes Passagieren aus MumpsVax

MumpsVax-Virus wurde ebenfalls direkt an Hühner-Embryofibroblasten-(CEF)-Zellen passagiert. Das Virus wurde in der dritten Passage aus 5 unterschiedlichen Chargen gewonnen, einschließlich der Charge MJ05, die zur Herstellung der lyophilisierten Probe MJ05A42 zur Injektion in die Tiere verwendet wurde. Die 5 Viruszubereitungen wurden verwendet, um Vero-Zellen zu infizieren, und RNA wurde gewonnen und für die DNA-Sequenzierung durch Amplifikation mit Primern NH8 und NH14 wie oben beschrieben vorbereitet, außer daß Zufallsprimer verwendet wurden, um die reverse Transkriptase-Reaktion zu primen. Alle 5 Chargen des Virus zeigten eine Sequenz, die identisch mit derjenigen von JL-2 (Takeuchi et al.) und ohne Unklarheiten war.

Zur weiteren Untersuchung wurde das direkte Sequenzierungsverfahren an viralen Plaques wie oben beschrieben verwendet. Die 5 Chargen wurden verwendet, um Vero-Zellkulturen zu infizieren und Plaques zu erhalten, die zur Sequenzierung unter Verwendung von NH30bis und NH31bis als Primer verarbeitet wurden. Von insgesamt 26 Plaques, die für die 5 Chargen getestet wurden, ergaben 13 eine Sequenz, die identisch mit Takeuchi et al. für die JL-2-Sequenz war, 5 ergaben eine Sequenz, die sehr ähnlich zu JL-5 war, ausgenommen zwei Basenunterschiede an den Positionen 270 und 279, und 8 Plaques ergaben Sequenzen mit Unklarheiten, die eine Mischung von Virus anzeigen.

4) Direkte Sequenzierung viraler Plaques

Drei Verdünnungen von MumpsVax, die abgeschätzt 100, 50 und 10 Viruspartikel pro 0,5 ml Teilmenge enthielten, wurden zur Infektion konfluenter Monoschichten aus Vero-Zellen in 5 cm Petrischalen nach Entfernung des Mediums und Waschen mit dMEM-Medium Biorich 50:50 V/V (Biorich) ohne Serum verwendet. Man ließ das Virus während 30 min bei 34°C adsorbieren. Die Zellen wurden dann mit 5 ml von Überschichtungsagar bedeckt, der auf 42°C gehalten wurde und 2,5 ml dMEM Biorich-Medium mit 0,5 % FCS und 2,5 ml von 3%iger (G/V) Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur enthielt. Nach der Verfestigung wurde die Agarschicht mit 3 ml dMEM Biorich-Medium mit 0,5 % fötalem Kälberserum bedeckt und bei 34°C inkubiert. Nach 7 Tagen Inkubation wurden die viralen Plaques durch Entfernung des oberflächlichen flüssigen Mediums und Zugabe von 0,03 % (G/V) Neutralrot-Lösung und Diffundieren für 1 Stunde visualisiert. Die Flüssigkeit und der Agar wurden dann entfernt und ein trockener Nylonfilter auf den Boden der Schale unter Fingerdruck aufgebracht. Der Filter wurde dann mit einigen Tropfen 2X SSC benetzt und abgehoben. Das Virus wurde an den Filter fixiert, indem er auf Papier, das in 2X SSC getränkt war, für 5 min und dann auf Papier, das in 2X SSC und 0,2 % (G/V) Natriumdodecylsulfat getränkt war, für 30 min gegeben wurde und die Filter dann UV-Licht für 3 bis 5 Minuten ausgesetzt wurden. 20 individuelle Plaques wurden aus den Nylonfiltern geschnitten, und das Membranstück wurde in 100 &mgr;l Wasser getaucht, und 1 &mgr;l RNAsin (Boehringer Mannheim, 40 Einheiten) wurde hinzugegeben, bevor für 30 Minuten auf 65°C erwärmt wurde. Die 100 &mgr;l Flüssigkeit wurden in ein frisches Röhrchen überführt und die Nukleinsäuren durch Zugabe von 10 &mgr;l 3 M Natriumacetat gefolgt von 250 &mgr;l Ethanol ausgefällt. Die Mischung wurde über Nacht bei –20°C oder für 1 Stunde bei –70°C vor dem Zentrifugieren gehalten. Das Pellet wurde dann getrocknet. Das Material wurde dann revers transkribiert, indem die folgenden Lösungen zum Pellet gegeben wurden: 4 &mgr;l 5-fach konzentrierter reverser Transkriptasepuffer (Bethesda Research Labs), 2 &mgr;l 0,1 M Dithiothreitol, 1 &mgr;l einer Mischung aus Desoxynukleotidtriphosphaten (Perkin Elmer-Cetus, 10 mM Konzentration), 1 &mgr;l N6 Zufallsprimer-Oligonukleotide (New England Biolabs, Konzentration 100 &mgr;g pro ml) und 11 &mgr;l Wasser. 1 &mgr;l von MMLV reverser Transkriptase wurde dann hinzugegeben und die Mischung für 1 Stunde bei 37°C und dann für 5 min bei 95°C inkubiert. Die cDNA wurde dann PCR-amplifiziert, indem 10 &mgr;l der obigen Mischung genommen und 500 ng von jedem der Oligonukleotidprimer NH30bis und NH31bis, PCR-Puffer und 1 &mgr;l Stoffel-DNA-Polymerase (Perkin Elmer-Cetus, Konzentration 10 &mgr;g/&mgr;l in 100 &mgr;l Endvolumen) hinzugegeben und die Mischung für 30 Cyclen von 1 min bei 95°C, 1 min bei 60°C und 1 min bei 72°C erwärmt wurde. Das resultierende Fragment wurde unter Verwendung eines MagicPrepKits (Promega Biotech A7170) gemäß Herstelleranweisungen gereinigt. Die Sequenzierung erfolgte nach einer weiteren asymmetrischen PCR-Amplifikation unter Verwendung von entweder NH30bis oder NH31bis als Primer und Fluordidesoxynukleotid-Terminatoren durch ein nicht-radioaktives Verfahren an einem Applied Biosystems-Sequenzautomaten (373A) unter Verwendung der Verfahren und Reaktanden des Lieferanten. Von den 20 Plaques aus MumpsVax wurde gefunden, daß sich 19 durch 11 aus 275 Basen von der JL-2-Sequenz von Takeuchi et al. (loc. cit.) und durch 2 Basen von der JL-5-Sequenz von Afzal et al. (loc. cit.) unterschieden. Eine Plaque ergab eine Sequenz mit Unklarheiten. Dieses Ergebnis legte nahe, daß MumpsVax eine Variante oder Varianten enthalten kann, die sich in dieser Region von dem dominanten JL-5-Stamm unterscheiden, der von Afzal et al. gefunden wurde. Die zwei Basen, die sich zwischen JL-5 und den sequenzierten Plaques unterscheiden, befinden sich an den Positionen 270 und 279 und befinden sich in der intergenischen Region zwischen den SH- und HN-codierenden Regionen.

5) Plaque-Hybridisierung

Zum Versuch der direkteren Bestimmung des Verhältnisses der Varianten vom JL-5- und JL-2-Typ in MumpsVax und abgeleiteten Kulturen wurde ein Plaque-Hybridisierungsverfahren verwendet. Das MumpsVax-Virus und das passagierte Virus der Charge MJ05 wurden verwendet, um Monoschichten aus Vero-Zellen zu infizieren und Plaques zu erhalten, die dann auf Nylon-Membranen übertragen und die Nukleinsäuren wie oben beschrieben fixiert wurden. Die Filter wurden für 3 Stunden bei 65°C in 200 ml der folgenden Lösung vorhybridisiert: 5X SSC (SSC ist 0,15 M Natriumchlorid, 0,01 M Natriumcitrat, pH 7,2), 10-fach konzentrierte Denhardts-Lösung (10-fach konzentrierte Denhardt-Lösung ist: 0,2 % G/V Ficoll 400, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Polyvinylchlorid), 0,1 % (G/V) Natriumdodecylsulfat, Lachssperma-DNA 50 &mgr;g pro ml. Die Filter wurden dann unter vorsichtigem Bewegen für 2,5 Stunden bei 65°C in 50 ml einer Lösung mit der gleichen Zusammensetzung wie oben hybridisiert und auf 65°C vorerwärmt und unter Zugabe der radioaktiven Sondenlösung und der Sondenlösung mit kaltem Konkurrenten. Die als variantenspezifische Sonden verwendeten Oligonukleotide waren BC252, das mit JL-5-Varianten hybridisiert, und BC253, das mit JL-2-Varianten hybridisiert. Die Oligonukleotide wurden mit gamma-32P-ATP durch Kinaseeinwirkungen in einer Lösung der folgenden Zusammensetzung markiert: 100 ng des zu markierenden Oligonukleotids, 3 &mgr;l von 10-fach konzentriertem Kinasepuffer (10-fach konzentrierter Kinasepuffer enthält: 0,5 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 M MgCl2, 50 mM Dithiothreitol, 1 mM Spermidin und 1 mM EDTA pH 8,0), 3 &mgr;l 32P-ATP (Amersham International, 3000 Ci/nmol, 10 mCi/&mgr;l) und 2 &mgr;l T4-Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim), aufgefüllt auf 30 &mgr;l mit sterilem Wasser. Diese Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch Erwärmen für 5 Minuten auf 95°C beendet. Kaltes Konkurrenz-Oligonukleotid wurde dann in einem Gewichtsverhältnis von 100:1 hinzugegeben, d.h. 10 &mgr;g kaltes Konkurrenz-Oligonukleotid wurden auf jeweils 100 ng der markierten Sonde hinzugegeben, bevor die Mischung zur Hybridisierungslösung gegeben wurde. Nach der Hybridisierung wurden die Filter einmal für 30 Minuten bei 65°C in 100 ml einer Lösung mit der gleichen Zusammensetzung wie die Hybridisierungslösung gewaschen und dann bei 65°C in zwei Austauschungen von 100 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung gewaschen: SSC 5X, 0,1 % Natriumdodecylsulfat. Die Filter wurden dann getrocknet und mit Röntgenfilm mit einem Intensivierungsschirm in Kontakt gebracht. Als MumpsVax durch diese Technik untersucht wurde, hybridisierte ein großer Überschuß der Plaques mit dem Oligonukleotid BC252, das spezifisch für die JL-5-Variante ist, verglichen mit der gefundenen Hybridisierung mit BC253. Als die Charge MJ05 untersucht wurde, hybridisierten relativ mehr Plaques mit BC253 als mit BC252, obwohl es eine etwa gleiche Anzahl von Plaques gab, die mit beiden Sonden hybridisierten.

6) Isolierung von reinen Jeryl-Lynn-Isolaten

Zur Gewinnung reiner Isolate der JL-5- und JL-2-Varianten wurde eine Probe des kommerziellen MumpsVax (Charge 92A06 von Merck, Sharp und Dohme, hinterlegt bei Public Helth Laboratory Services, Porton Down, Wiltshire, UK unter der Eingangsnummer Jeryl-Lynn Mumps Strain: V93110585 am 5. November 1993) mit einem angegebenen Titer von 4–6 log TCID50 infektiösen Einheiten grenzwertverdünnt und zur Infektion von Hühner-Embryofibroblastenzellen (CEF) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einem abgeschätzten Inoculum von 0,1 infektiösen Einheiten pro Vertiefung verwendet. Die Platten wurden 11 Tage bei 34°C inkubiert, um die Entwicklung des Virus zu erlauben. 17 Vertiefungen von insgesamt 192 geimpften zeigten eine cytopathische Wirkung, die Viruswachstum anzeigt, und diese wurden verwendet, um weitere Kulturen von CEF-Zellen zu impfen. Die Identität des isolierten Virus wurde an diesem Material der zweiten Passage, das einen Titer von ca. 4,9 log TCID50 hatte, durch Filtrieren der Viruszubereitungen durch einen 0,8 &mgr;m-Filter, Zentrifugieren für 1 Stunde mit 42 000 U/min und Resuspendieren des viralen Pellets mit 100 &mgr;l H2O bestimmt. 1 &mgr;l RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim, 40 Einheiten pro &mgr;l) wurde hinzugegeben und die Mischung für 30 Minuten bei 65°C vor der Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Na-Acetat (pH 4,5) gefolgt von 2,5 Volumina Ethanol inkubiert. Man ließ das Material über Nacht bei –20°C oder für 1 Stunde bei –70°C ausfällen, bevor für 30 Minuten bei 4°C in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert und das Pellet getrocknet wurde.

Gewonnene virale RNA wurde durch Zugabe von 20 &mgr;l der folgenden Mischung zum Pellet revers transkribiert. 4 &mgr;l von 5x Kern-RT-Puffer (Bethesda Research Labs), 2 &mgr;l von 10 nM Desoxynukleotidtriphosphat-Mischung (Perkin Elmer, Cetus), 1 &mgr;l Zufallsprimer N6 (Biolabs, mit 100 &mgr;g/ml), 11 &mgr;l H2O, 1 &mgr;l MMLV reverse Transkriptase (Bethesda Research Labs). Diese Mischung wurde für 1 Stunde bei 37°C gefolgt von 5 Minuten bei 95°C inkubiert, um die reverse Transkriptase zu inhibieren. 10 &mgr;l der erwärmten Mischung wurden dann der PCR-Amplifikation in 100 &mgr;l Endvolumen mit den Primern NH30bis und NH31bis unter Verwendung des folgenden Erwärmungsprogramms für 30 Cyclen unterworfen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 60°C, 1 Minute bei 72°C. Die resultierenden Fragmente wurden durch MagicPrep (Promega) gemäß dem Herstellerprotokoll gereinigt.

Die sechs Isolate, die nur mit der JL-5-Sonde reagierten, wurden auf Vero-Zellen zum Erhalt von Plaques übergeimpft. Diese wurden auf Nylon-Membranen abgehoben und die Membranen mit dem Oligonukleotid BC252 und mit dem Oligonukleotid BC253 hybridisiert, die beide mit 32P durch Kinaseeinwirkung wie zuvor beschrieben markiert waren. Die Hybridisierung erfolgte in 5x SSC bei 65°C für 2,5 Stunden unter Verwendung von ca. 100 ng der markierten Oligonukleotide und 10 &mgr;g von kaltem Konkurrenzoligonukleotid in einem Volumen von 50 ml. Ca. 200 Plaques wurden für jedes Isolat untersucht, und keine reagierte mit der JL-2-Sonde (Oligonukleotid BC253). Alle Plaques reagierten mit BC252.

Ein Virusisolat, das aus Vertiefung 9H2A der Mikrotiterplatte stammte und weiter als SBB-Stamm JL-1 identifiziert wurde, wurde durch zwei weitere Passagen an CEF-Zellen geführt. Nach der letzten Passage (4 Passagen ab dem ursprünglichen MumpsVax-Material) wurde das Virus zur Infektion von Vero-Zellen und zum Erhalt von Plaques verwendet. Diese wurden auf Nylon-Membranen abgehoben und durch Hybridisierung mit den Oligonukleotiden BC252 und BC253 getestet, die mit 32P durch Kinaseeinwirkung markiert worden waren. Über 2000 Plaques wurden mit der JL-2-spezifischen Sonde BC253 getestet, und es wurde festgestellt, daß keine damit reagierte. Eine geringere Anzahl von Plaques wurde mit dem Oligonukleotid BC252 getestet, und alle ergaben eine positive Reaktion. Die Sequenzierung wurde direkt am Virusreservoir des JL-1-Stamms durchgeführt, der in der vierten Passage an CEF-Zellen durch Zentrifugieren und Ethanolfällung des Virus gefolgt von reverser Transkription unter Verwendung von Zufallsprimern wie oben beschrieben gewonnen wurde. Die cDNA wurde durch PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide NH14 und BC265 als Primer und mit dem folgenden Erwärmungsprogramm amplifiziert: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 60°C, 1 Minute bei 72°C für 30 Cyclen. Das resultierende DNA-Fragment wurde an einer MagicPrep-Säule (Promega Biotech) gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt und an einem Sequenzierungsautomaten Applied Biosystems 373A gemäß den Herstelleranweisungen und unter Verwendung der Oligonukleotide NH14, BC265, NH30bis und NH31bis als Primer sequenziert. Die in 1 gezeigte Sequenz wurde erhalten. Diese Sequenz unterscheidet sich überraschend von derjenigen, die von Afzal et al. für ihr JL-5-Isolat erhalten wurde, an sechs Positionen in der intergenischen Region zwischen den SH- und HN-codierenden Regionen. Das JL-1-Isolat stellt daher eine weitere Virusvariante dar, die in der MumpsVax-Zubereitung vorhanden ist.

Eine zweites, als 10H5F identifiziertes Virusisolat, das ebenfalls nur mit der Jl-5-Sonde reagierte, wurde durch Infektion von Vero-Zellen mit Virus der zweiten Passage, Abheben einer Plaque auf eine Nylon-Membran und Durchführen der Sequenzierung nach PCR-Amplifikation unter Verwendung von NH14- und BC265-Oligonukleotiden als Primer sequenziert. Dies ergab eine Sequenz, die identisch mit derjenigen für 9H2A oben war und sich von der veröffentlichten JL-5-Isolat-Sequenz durch 6 Basen in der SH-HN-intergenischen Region unterschied.

7) Immunogenität

Die Immunogenität des JL-1-Stammes aus Beispiel 6 wurde in Affen getestet. Eine als MJ11A42 bezeichnete, lyophilisierte JL-1-Viruszubereitung in der vierten Passage aus MumpsVax, geerntet nach 6 Tagen Wachstum bei 34°C auf CEF-Zellen und mit einer Dosis von 4,2 log TCID50, wurde zur Immunisierung einer Gruppe von vier afrikanischen Grünen Meerkatzen durch subkutane Injektion verwendet. Drei weiteren Gruppen von vier Affen wurde injiziert: (a) MumpsVax mit einer Konzentration von 4,3 log TCID50; (b) eine lyophilisierte Zubereitung, MJ21A42, mit einer Konzentration von 4,3 log TCID50 pro Dosis aus Virus, das nach 9 Tagen Wachstum bei 32°C geerntet wurde und aus drei direkten Passagen von MumpsVax an CEF-Zellen stammte; (c) eine lyophilisierte Zubereitung, MJ05A42, mit einer Konzentration von 4,2 TCID50 pro Dosis aus Virus, das nach 7 Tagen Wachstum bei 34°C geerntet wurde und aus drei direkten Passagen von MumpsVax an CEF-Zellen stammte, wobei sich die Passagen von denjenigen für die MJ21A42-Zubereitung unterschieden.

Blutproben wurden vor der Injektion am Tag 0 und an den Tagen 28 und 42 nach der Impfung abgenommen und auf Gegenwart von IgG-Antikörpern gegen das Mumpsvirus unter Verwendung des kommerziellen Enzygnost Anti-Parotitisvirus-Kits von Behring (Behringwerke AG, Marburg, Deutschland) wie vom Hersteller beschrieben getestet. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, induziert die aus dem reinen JL-1-Stamm stammende Zubereitung einen höheren Titer von Anti-Mumpsvirus-Antikörpern in den Tieren als die anderen Zubereitungen, einschließlich MumpsVax. Diese Seren wurden ebenfalls mit zweifachen Reihenverdünnungen in einem Plaque-Reduktionstest unter Verwendung von MumpsVax als Testvirus untersucht. Die Seren aus den Tieren, denen die Charge MJ11A42 injiziert wurde, ergab eine höhere durchschnittliche Reduktion der Anzahl von Plaques im Vergleich zu den anderen Seren.

8) Klinische Untersuchungen

Der JL-1-Stamm wurde weiter in einem klinischen Versuch mit seronegativen Kindern im Alter von ca. 15 Monaten getestet. Trivalente Masern-, Mumps- und Röteln-Impfstoffe wurden unter Verwendung entweder des reinen JL-1-Stammes als Mumpskomponente oder mit Mumpsvirus, das aus dem direkten Passagieren von MumpsVax an CEF-Zellen wie in Beispiel 6 oben stammte, formuliert und lyophilisiert. Der von Merck and Co. Inc. hergestellte und von Merck Frossr Inc. Kirkland, Quebec, Kanada erhältliche kommerzielle M-M-R®II-Impfstoff wurde ebenfalls im Versuch eingeschlossen. Er enthält den Jeryl-Lynn (B-Level)-Stamm als Mumpskomponenten.

Die Titer des Mumpsvirus in den drei Impfstoffzubereitungen wurden als 4,5 log TCID-Dosen für die Impfstoff-Chargennummer MJR111D42, die den reinen JL-1-Stamm enthielt, 4,7 log TCID Dosen für die Impfstoff-Chargennummer MJR121C42, die das passagierte MumpsVax-Virus enthielt, und 4,5 log TCID-Dosen für die Chargennummer 80391 OU, den kommerziellen M-M-R®II-Impfstoff, gemessen.

Blutproben wurden den Kindern vor der Impfung und 42 Tage nach der Impfung abgenommen.

Die Gegenwart von IgG-Antikörpern gegen das Mumpsvirus wurde unter Verwendung des gleichen, oben in Beispiel 6 beschriebenen kommerziellen Kits getestet. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, induzierte der reine JL-1-Stamm MMR-Impfstoff sowohl die höchste Serokonversionsrate als auch ergab er den höchsten geometrischen Mittelwert des Titers der drei Zubereitungen.

Tabelle 1
Tabelle 2 Verwendetes Oligonukleotid
Tabelle 3 Serokonversion und geometrischer Mittelwert des Titers (GMT) gegenMumpsvirus in seronegativen Patienten
SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Abgeschwächter Jeryl-Lynn-Mumpsvirusstamm, dadurch gekennzeichnet, daß er die Nukleotidsequenz wie in 1 dargestellt enthält.
  2. Mumps-Impfstoff, der ein immunogenes Jeryl-Lynn-Isolat enthält, wobei das Isolat mit nicht mehr als 10 % eines anderen Jeryl-Lynn-Isolats kontaminiert ist.
  3. Mumps-Impfstoff gemäß Anspruch 2, der ein homogenes Isolat gemäß Anspruch 1 umfaßt.
  4. Impfstoff gemäß Anspruch 2 oder 3, der zusätzlich ein oder mehrere abgeschwächte Masernviren oder abgeschwächte Rötelnviren oder abgetötete Masern- oder Rötelnviren oder Untereinheiten solcher Viren umfaßt.
  5. Impfstoff gemäß Anspruch 4, worin die zusätzlichen Komponenten ein abgeschwächtes Masernvirus und ein abgeschwächtes Rötelnvirus umfassen.
  6. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, der zusätzlich ein Mittel zum Schutz gegen Windpocken- oder Gürtelrose-Infektionen umfaßt.
  7. Impfstoff gemäß Anspruch 6, worin das Mittel zum Schutz gegen Windpocken- oder Gürtelrose-Infektionen der Varicella zoster-Virus (VZV) OKA-Stamm ist.
  8. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der ein immunogenes Jeryl-Lynn-Isolat umfaßt, wobei das Isolat mit nicht mehr als 10 % eines anderen Jeryl-Lynn-Isolats kontaminiert ist, wobei das Verfahren umfaßt:

    Passagieren einer Jeryl-Lynn-Zubereitung auf einer geeigneten Zellinie,

    Selektieren der Reinkultur unter Verwendung der Schritte aus entweder:

    a) Grenzwertverdünnung oder

    b) individueller Plaqueisolierung.
  9. Immunogenes Jeryl-Lynn-Isolat zur Verwendung in der Medizin, wobei das Isolat mit nicht mehr als 10 % eines anderen Jeryl-Lynn-Isolats kontaminiert ist.
  10. Jeryl-Lynn-Isolat gemäß Anspruch 9, worin das Isolat homogen ist.
  11. Verwendung eines abgeschwächten Jeryl-Lynn-Mumpsstammes gemäß Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Induzierung von Immunität in einem Säugetier, das für eine Mumps-Infektion anfällig ist.
  12. Verwendung eines immunogenen Jeryl-Lynn-Isolats, wobei das Isolat mit nicht mehr als 10 % eines anderen Jeryl-Lynn-Isolats kontaminiert ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Induzierung von Immunität in einem Säugetier, das für eine Mumps-Infektion anfällig ist.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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