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Dokumentenidentifikation DE69632715T2 30.06.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000786665
Titel Verfahren und Vorrichtung zur Immunoanalyse
Anmelder ARKRAY, Inc., Kyoto, JP
Erfinder Dou, Xiaoming, Minami-ku, Kyoto 601, JP;
Yamaguchi, Yoshinori, Minami-ku, Kyoto 601, JP;
Uenoyama, Harumi, Minami-ku, Kyoto 601, JP
Vertreter Schoppe, Zimmermann, Stöckeler & Zinkler, 82049 Pullach
DE-Aktenzeichen 69632715
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IT, LI
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 29.01.1996
EP-Aktenzeichen 961012119
EP-Offenlegungsdatum 30.07.1997
EP date of grant 16.06.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.06.2005
IPC-Hauptklasse G01N 33/58
IPC-Nebenklasse G01N 21/17   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum immunologischen Analysieren eines Messobjekts auf dem Gebiet des klinischen Testens, der biochemischen Probenmessung und der Qualitätssteuerung von Medikamenten und ähnlichem.

Beschreibung des Hintergrunds der Technik

Immunologische Analyseverfahren, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwenden, umfassen eine Fluoreszenz-Immununtersuchung und eine Leucht-Immununtersuchung. Bei einem dieser Verfahren reagiert ein Antigen, das mit einem Fluoreszenzmaterial oder einem Chemielumineszenzmaterial markiert ist mit einem Antikörper mit einem Antigen, das ein Messobjekt in Konkurrenz ist, um einen Immunkomplex zu bilden, der ein Molekularkomplex ist, durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, zum Messen der Fluoreszenz oder Lumineszenz aus dem Etikett, wodurch das Zielmaterial quantitativ analysiert wird.

Andererseits ist ein Verfahren zum Hinzufügen eines Antigens oder eines Antikörpers eines Messobjekts zu einem Antikörper oder Antigen und Messen der Absorption oder Streuung von Licht durch einen Immunkomplex, der durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird, wodurch eine quantitative Analyse durchgeführt wird, als ein optisches Messverfahren bekannt, das weder Fluoreszenz noch Lumineszenz verwendet. Quantitative Analyseverfahren, die Lichtstreuungsphänomene verwenden, umfassen Turbidimetrie und Nephelometrie. Das Erstere ist angepasst, um übertragenes Licht zu messen, das durch Absorption und Streuung gedämpft wird, während das Letztere angepasst ist, um eine Streulichtintensität zu messen. Das Verfahren durch Lichtstreuung ist angepasst, um eine Rayleigh-Streuung oder eine Mie-Streuung zu messen, ansprechend auf Größen von Partikeln, die gemessen wurden.

Eine Fluoreszenz-Immununtersuchungsvorrichtung, die zu der Fluoreszenz-Immununtersuchung gehört, wird als eine Immununtersuchungsvorrichtung vorgeschlagen, die eine Totalreflexionszelle verwendet (siehe japanische Patentoffenlegung Gazetten-Nr. 5-203574 (1993)). Bei dieser Fluoreszenz-Immununtersuchung ist ein Antikörper fest an einer Oberfläche eines Totalreflexionsprismas, ein Antigen, das in einer Probe enthalten ist, ist mit dem Antikörper durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion verbunden, und ein Antikörper, der mit einem Fluoreszenzmaterial markiert ist, ist ferner mit dem Antigen durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion verbunden. Nachfolgend wird eine B-F-Trennung durchgeführt, um einen nicht-reagierten Antikörper zu entfernen, der mit dem Fluoreszenzmaterial markiert ist, und dann wird ein Erregungsstrahl in das Totalreflexionsprisma eingebracht, um den markierten Antigen-Antikörper-Immunkomplex zu erregen, der auf der Oberfläche des Totalreflexionsprismas begrenzt ist, zum Messen einer Fluoreszenz, die aus dem Fluoreszenzmaterial erzeugt wird.

Das Verfahren, das die Lichtstreuung verwendet, was eine homogene Immununtersuchung ist, ist ein einfaches Verfahren, das weder B-F-Trennung noch -Waschen erfordert. Das Verfahren jedoch, das Rayleigh-Streuung oder Mie-Streuung verwendet, hat Probleme bei der Niedrigerfassungsempfindlichkeit und Niedrigmessgenauigkeit im Hinblick auf ein Material mit geringer Konzentration.

Andererseits erfordert die Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Immununtersuchung eine komplizierte chemische Behandlung zum Markieren eines Antigens oder eines Antikörpers mit einem Fluoreszenz- oder Chemielumineszenz-Material. Ferner ist ein Großteil davon eine heterogene Immununtersuchung, die zwingend eine B-F-Trennung erfordert, zum Trennen eines Immunkomplexes (B), der die Antigen-Antikörper-Reaktion durchführt, von einem Antigen oder einem Antikörper (F), der keine Antigen-Antikörper-Reaktion verursacht und durch eine große Anzahl von analytischen Schritten wäscht.

Die EP-A-0 254 430 offenbart ein Immunanalyseverfahren zum Qualifizieren oder zum weiteren Bestimmen eines Antigens oder eines Antikörpers, das in einer Probe enthalten ist, durch Messen des Lichts, das von einem Wechselwirkungspunkt zwischen Goldkolloidpartikeln, die mit einem Antikörper oder einem Antigen markiert sind, und einer abklingenden Welle zurückgestreut wird.

Die EP-A-0 714 024, die ein Dokument gemäß Artikel 54(3) EPC ist, offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen von Wasserstoffperoxyd, wobei die Vorrichtung ein optisches Einfallsystem, ein Totalreflexionsprisma, eine Totalreflexionszelle und ein optisches Messsystem aufweist, das einen Ausgangsstrahl aus dem Prisma empfängt, zum Messen der Absorbanz durch eine Probenlösung, die in der Zelle vorhanden ist.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunanalyseverfahren und eine Immununtersuchungsvorrichtung zu schaffen, so dass das Durchführen der Messung weniger kompliziert ist.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und eine Vorrichtung gemäß Anspruch 6 gelöst.

Die Erfinder haben eine fundierte Studie durchgeführt, um einen Immunkomplex qualitativ und quantitativ zu analysieren, durch eine Absorptionsmessung des Immunkomplexes, um zu entdecken, dass die Absorption des Immunkomplexes mit ausgezeichneter Empfindlichkeit gemessen werden kann, wenn der Immunkomplex in einen Zustand gebracht wird, in dem er durch Edelmetallkolloidpartikel absorbiert wird, obwohl keine Absorption, die eine Empfindlichkeit aufweist, die geeignet für eine Messung ist, von dem Immunkomplex selbst erhalten werden kann.

Ein Immunanalyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst folgende Schritte: Mischen einer Lösung, die einen Antikörper oder ein Antigen enthält, das mit Edelmetallkolloidpartikeln markiert ist, mit einer Probenlösung, um eine gemischte Probenlösung zu bilden, für eine Reaktion eines Antigens oder eines Antikörpers, der in der Probenlösung enthalten ist, mit dem markierten Antikörper oder Antigen, wodurch ein edelmetallkolloid-markierter Immunkomplex gebildet wird, und Verwenden einer Zelle, die ein Totalreflexionsprisma zumindest an einer Oberfläche derselben aufweist, und Einbringen eines Messstrahls einer Wellenlänge in einem Bereich von sichtbaren zu Infrarot-Regionen in das Totalreflexionsprisma mit einem Einfallswinkel, was eine Totalreflexion verursacht, wodurch die Absorption des Messstrahls gemessen wird, die an der Grenzfläche zwischen dem Totalreflexionsprisma und der gemischten Probenlösung verursacht wird. Somit wird das Antigen oder der Antikörper, der in der Probe enthalten ist, qualifiziert oder weiter bestimmt.

Das Edelmetallkolloid kann aus einem Kolloid aus Gold, Silber oder Kupfer vorbereitet sein, und eine angemessene Korngröße dafür ist 5 bis 50 nm.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Absorptionsmessung durch den Messstrahl ausgeführt werden, ohne den Antikörper oder das Antigen zu trennen, das mit dem Edelmetallkolloid markiert ist, oder ein Nicht-Reagiertes aus dem Antigen oder dem Antikörper, das in der Probenlösung enthalten ist, wodurch eine homogene Immununtersuchungsanalyse implementiert wird. Abgesehen davon kann eine Hochempfindlichkeitsmessung implementiert werden durch Verwenden des Edelmetallkolloids.

Eine Immununtersuchungsvorrichtung, die angepasst ist, um das zuvor erwähnte Verfahren zu implementieren, weist eine Totalreflexionszelle, mit einem Totalreflexionsprisma, das aus einem Material besteht, das einen größeren Brechungsindex aufweist als die gemischte Probenlösung, an zumindest einer der Wandoberflächen, die einen Raum definieren, in dem die gemischte Probenlösung vorliegt, ein optisches Einfallsystem zum Einbringen eines Messstrahls einer Wellenlänge in einem Bereich von sichtbaren bis Infrarot-Regionen in das Totalreflexionsprisma bei einem Einfallswinkel, der eine Totalreflexion verursacht, und ein optisches Messsystem auf, das einen ausgehenden Strahl aus dem Totalreflexionsprisma empfängt, zum Messen der Absorbanz durch die gemischte Probenlösung. Die Absorption bei der Totalreflexion wird aus der Intensität der gedämpften Totalreflexion gemessen.

Die Totalreflexionszelle kann durch eine Zelle vom Behältertyp gebildet sein, die nur eine Öffnung aufweist, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion in der Zelle zu verursachen, zum Bilden eines Edelmetallkolloid-markierten Immunkomplexes oder zum Durchführen einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einem anderen Behälter zum Bilden eines Edelmetallkolloid-markierten Immunkomplexes und nachfolgend Speichern einer gemischten Probelösung, die den Edelmetallkolloid-markierten Immunkomplex enthält, oder eine Flusszelle, die ein Lösungseinlasstor und ein Lösungsauslasstor aufweist, die mit einer gemischten Probenlösung gespeist werden sollen, nach der Bildung eines Edelmetallkolloidmarkierten Immunkomplexes.

Eine Lichtquelle, die in dem optischen Einfallsystem umfasst ist, kann gemäß dem Verfahren aus Anspruch 1 gebildet werden, zum Emittieren eines Strahls einer durchgehenden Wellenlänge, oder sowohl dem Verfahren gemäß Anspruch 1 als auch der Vorrichtung gemäß Anspruch 6, durch eine Einwellenlängen-Lichtquelle, wie z. B. eine Lasereinheit, die einen Einwellenlängenstrahl emittiert. Wenn die Lichtquelle einen Strahl mit kontinuierlicher Wellenlänge emittiert, kann eine Spektrometrie ausgeführt werden, obwohl das optische Einfall- oder Messsystem ein Spektroskop umfassen muss. Wenn eine Einwellenlängen-Lichtquelle verwendet wird, wird andererseits eine Absorptionsmessung nur an der einen Wellenlänge der Lichtquelle ausgeführt, ohne ein Spektroskop zu erfordern.

Wenn nur ein Antikörper oder ein Antigen, das mit einem Edelmetall markiert ist, in einer gemischten Probenlösung vorliegt, die in einer Totalreflexionszelle vorhanden ist, wird keine Absorption mit einer Empfindlichkeit erkannt, die geeignet für eine Messung ist. Wenn ein Immunkomplex nicht mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, wird auch keine Absorption mit einer Empfindlichkeit erkannt, die geeignet für eine Messung ist. Eine Absorption mit einer Empfindlichkeit, die geeignet für eine Messung ist, wird bei einer spezifischen Wellenlänge nur erkannt, wenn ein Immunkomplex, der mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, vorhanden ist. Das Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in diesem Punkt, durch den eine homogene Immununtersuchungsanalyse ermöglicht wird.

Angenommen, dass n2 den Brechungsindex einer gemischten Probenlösung darstellt, die einen Immunkomplex enthält, und n1 (n2 < n1) den Brechungsindex eines Totalreflexionsprismas darstellt, wird ein kritischer Winkel &thgr;c, der eine Totalreflexion verursacht, wie folgt ausgedrückt: &thgr;c = sin–1(n2/n1)

Wenn ein Messstrahl in das Totalreflexionsprisma von einem optischen Einfallsystem eingebracht wird, ist ein Einfallswinkel &thgr; (siehe 1) an der Grenzfläche zwischen dem Totalreflexionsprisma und der gemischten Probenlösung auf die nachfolgende Bedingung eingestellt: &thgr; > &thgr;c

Wenn die homogene Immununtersuchungsanalyse ausgeführt wird, ist eine gemischte Probenlösung, die einer Absorptionsmessung unterzogen wird, eine gemischte Lösung, die einen mit Edelmetallkolloid markierten Antikörper (oder Antigen), einen mit Edelmetallkolloid markierten Immunkomplex, ein nicht-reagiertes Antigen (oder Antikörper), ein Biopolymer und ähnliches aufweist.

Der Messstrahl ist der, der einen Strahl mit kontinuierlicher Wellenlänge in einer entsprechenden Region aus einer Nahe-Infrarot-, Mittel-Infrarot- und Entfernt-Infrarot-Region, oder einen Einwellenlängenstrahl aufweist.

Eine Absorption bei dem Totalreflexionsprisma wird durch eine Absorbanz A wie folgt ausgedrückt: A = N·&agr;·de·loge wobei N die Anzahl von Malen einer Totalreflexion in dem Totalreflexionsprisma darstellt, &agr; den Absorptionskoeffizienten der gemischten Probenlösung darstellt und de eine optische Weglänge darstellt, entlang der der Messstrahl in die gemischte Probenlösung bei einer einzelnen Totalreflexion eindringt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Absorption durch einen mit Edelmetallkolloid markierten Immunkomplex, der in einer gemischten Probenlösung vorhanden ist, mit einer Totalreflexionszelle bei hoher Empfindlichkeit gemessen. Eine Absorption mit einer Empfindlichkeit, die geeignet für eine Messung ist, wird nur in einem Immunkomplex gemessen, der in einem Zustand vorliegt, markiert mit einem Edelmetallkolloid, und keine Absorption mit einer Empfindlichkeit, die für eine Messung geeignet ist, wird in nur einem Antikörper oder einem Antigen erkannt, das mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, oder in einem Immunkomplex, der in einem Zustand ist, der nicht mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, wodurch eine Qualifikation und Bestimmung des Immunmaterials durch eine Absorption durch eine Totalreflexionsmessung ausgeführt werden kann, ohne Durchführen einer B-F-Trennung, während eine Immununtersuchung durch eine einfache Operation und eine einfache Messvorrichtung ausgeführt werden kann.

Das Vorangehende und andere Ziele, Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 stellt schematisch ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung dar;

2 ist ein Blockdiagramm, das eine Messvorrichtung zeigt, die gemäß Anspruch 1 arbeitet;

3 stellt Spektren eines mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes und eines mit Goldkolloid markierten Antikörpers dar;

4 stellt Spektren des mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes und einen Immunkomplex, der nicht mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, dar;

5 stellt ein Totalreflexions-Absorptions-Spektraldifferenzspektrum des mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes basierend auf den Spektren dar, die in 3 gezeigt sind;

6 stellt eine Konzentrationsabhängigkeit der Absorbanz bei 2.942,5 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration des Antikörpers IgG bei den Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dar;

7 stellt eine Konzentrationsabhängigkeit der Absorbanz bei 2.888,1 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration des Antikörpers IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dar;

8 stellt eine Konzentrationsabhängigkeit der Absorbanz bei 1.112,4 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration des Antikörpers IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dar;

9 stellt eine Konzentrationsabhängigkeit der Absorbanz bei 1.043,3 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration des Antikörpers IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dar;

10 stellt die Konzentrationsabhängigkeit der Absorbanz bei 993,8 cm–1 im Hinblick auf eine Konzentration des Antikörpers IgG bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dar;

11A ist eine Frontquerschnittansicht, die eine exemplarische Totalreflexionszelle mit nur einer Öffnung darstellt; und

11B zeigt eine Frontquerschnittansicht und eine Draufsicht, die eine weitere Totalreflexionszelle mit nur jeweils einer Öffnung darstellen; und

12A ist eine perspektivische Ansicht und eine Frontquerschnittansicht, die eine exemplarische Weg werf-Totalreflexionszelle darstellt, und

12B bis 12E sind eine perspektivische Ansicht und eine Frontquerschnittansicht, die jeweils eine andere exemplarische Totalreflexions-Flusszelle zeigen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

1 stellt schematisch ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung dar. Eine Totalreflexionszelle 2 weist ein Totalreflexionsprisma 4 an zumindest einer Oberfläche derselben auf. Eine gemischte Lösung 8, die einen mit Goldkolloid markierten Antikörper 6 enthält, der an einem Goldkolloid absorbiert ist, das als ein exemplarisches Edelmetallkolloid dient, ist in der Totalreflexionszelle 2 gespeichert, und eine Probenlösung 12, die ein Antigen 10 enthält, das eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem Antikörper 6 verursacht, wird zu derselben hinzugefügt, so dass der Antikörper 6 und das Antigen 10 eine Antigen-Antikörper-Reaktion in der gemischten Lösung 8 durchführen, die in der Totalreflexionszelle 2 gespeichert ist, wodurch ein mit Goldkolloid markierter Immunkomplex 14 gebildet wird. Ein Messstrahl wird in das Totalreflexionsprisma 4 von einem optischen Einfallsystem 16 bei einem Einfallswinkel &thgr; eingebracht, was eine Totalreflexion verursacht, wodurch der Messstrahl durch das Totalreflexionsprisma 4 übertragen wird, während er total reflektiert wird, und etwas in die gemischte Lösung 8 eindringt, durch die Schnittstelle zwischen dem Totalreflexionsprisma 4 und der gemischten Lösung 8, um durch den mit Goldkolloid markierten Immunkomplex 14 in der gemischten Lösung 8 absorbiert zu werden. Ein ausgehender Strahl von dem Totalreflexionsprisma 4 wird durch ein optisches Messsystem 18 empfangen, so dass dessen Absorbanz gemessen wird, wodurch das Antigen 10, das in der Probenlösung 12 enthalten ist, qualifiziert und bestimmt werden kann.

2 stellt schematisch eine Messvorrichtung gemäß Anspruch 1 dar. Das optische Einfallsystem 16 umfasst eine Lichtquelle 16a, die den Messstrahl emittiert, und ein optisches Strahleinstellsystem 16b. Das optische Strahleinstellsystem 16b umfasst ein optisches System zum Umwandeln des Strahls aus der Lichtquelle 16a in einen parallelen Strahl, einen Strahlsplitter zum Splitten des Strahls in einen Messstrahl 20s und einen Referenzstrahl 20r und ein optisches System zum Einbringen des Messstrahls 20s in das Totalreflexionsprisma 4 der Totalreflexionszelle 2 mit einem Einfallswinkel, der eine Totalreflexion verursacht. Ein optisches System 22 zum Einstellen des Lichtstroms des Messstrahls 20s, der total reflektiert und durch das Totalreflexionsprisma 4 der Totalreflexionszelle 2 übertragen wird und ein Spektroskop 23 zum Empfangen des Messstrahls 20s, das durch das optische System 22 eingestellt wird und den empfangenen Messstrahl in seine Spektralkomponenten unterteilt, sind auf einem optischen Weg des Messstrahls 20s angeordnet, so dass der Messstrahl 20s, der in seine Spektralkomponenten unterteilt ist, zu einem Erfassungsteil 26 geleitet und durch dasselbe erfasst wird. Das optische Messsystem 18, das in 1 gezeigt ist, umfasst das optische System 22, das Spektroskop 23 und das Erfassungsteil 26.

Andererseits ist ein optisches System 24 zum Einstellen des Lichtstroms des Referenzstrahls 20r auf einem optischen Weg des Referenzstrahls 20r angeordnet, zum Korrigieren einer Fluktuation des Messstrahls 20s, so dass der eingestellte Referenzstrahl 20r zu dem Erfassungsteil 26 geleitet und durch dasselbe erfasst wird. Das Erfassungsteil 26 ist so gebildet, um den Messstrahl 20s zu korrigieren, der durch das Totalreflexionsprisma 4 übertragen wird und in seine Spektralkomponenten durch das Spektroskop 23 unterteilt wird, durch die Intensität des Referenzstrahls 20r, der die Lichtquellenintensität anzeigt, wodurch die Absorbanz berechnet wird.

Das Bezugszeichen 28 bezeichnet eine Steuerung, die die Spektraloperation des Spektroskops 23 steuert, zum Übertragen eines Erfassungsausgangssignals von dem Erfassungsteil 26 zu einem Datenprozessor 30. Das Bezugszeichen 32 bezeichnet eine Ausgabeeinheit, wie z. B. eine Aufzeicheneinheit oder eine CRC (CRC = Cathode Ray Tube = Kathodenstrahlröhre), die das Ergebnis des Verarbeitens in dem Datenprozessor 30 ausgibt.

Die Lichtquelle 16a, die verwendet wird, um das Immunanalyseverfahren zu implementieren, das in Anspruch 1 definiert ist, kann durch eine Fluoreszenzlampe, eine Xenonlampe, eine Schwarzkörper-Strahlungsquelle, einen Gaslaser, einen Festkörperlaser oder einen Halbleiterlaser gebildet sein.

Das Material für das Totalreflexionsprisma 4 kann vorbereitet werden aus ZnSe, Ge, Si, Al2O3 oder MgO. Nur das Totalreflexionsprisma 4 oder die gesamten Wandoberflächen der Totalreflexionszelle 2, die das Totalreflexionsprisma 4 umfasst, können aus einem solchen Material hergestellt sein.

Das Spektroskop 23 kann durch ein FTIR gebildet sein (FTIR = Fourier Transformation Infrared Spectrophotometer = Infrarot-Fouriertransformations-Spektrophotometer), ein System, das ein IR-Blaze-Gitter und einen IR-empfindlichen Detektor oder ähnliches aufweist. Das Spektroskop 23 kann in dem optischen Einfallsystem 16 umfasst sein. Wenn eine Einwellenlängen-Lichtquelle, die einen Strahl einer einzelnen Wellenlänge emittiert, als die Lichtquelle 16a verwendet wird, werden das Spektroskop 23 und die Steuerung 28 zum Steuern desselben unnötig.

Die Zelle 2, die in 1 gezeigt ist, wurde verwendet, das Spektroskop 23 der Messvorrichtung, die in 2 gezeigt ist, wurde durch ein FTIR gebildet, und ein optisches ZnSe-Kristall wurde als das Totalreflexionsprisma 4 der Zelle 2 verwendet, Anti-Mouse IgG (Produkt von BioCell (U.S.A.)), absorbiert auf einem Goldkolloid von 30 nm in seiner Korngröße, wurde als der mit Edelmetallkolloid markierte Antikörper 6 verwendet, und eine gemischte Lösung (pH 7,65) aus 0,01 M von TWEEN 21 (eingetragenes Warenzeichen) und PBS (phosphatgepuffertes Salin) wurde als ein Lösungsmittel für eine gemischte Lösung verwendet, die den Antikörper 6 enthält. Eine Erfassung wurde 10 mal in einer einzelnen Messzeit von 2 Minuten ausgeführt, und die Ergebnisse der Erfassung wurden geschätzt. Das Spektroskop 23 wies einen Spektralbereich von 800 bis 3.200 cm–1 und eine Auflösung von 2 cm–1 auf.

3 und 4 zeigen Totalreflexionsspektren der Ergebnisse der Messung. Bezug nehmend auf 3 ist ein Spektrum 2 das einer gemischten Lösung, die nur das zuvor genannte 30 nm mit Goldkolloid markierte Anti-Mouse IgG enthält. Eine umfassende Absorption ist die von Wasser, während keine andere charakteristische Absorption erkannt wird. Bezug nehmend auf 4 ist andererseits ein Spektrum 3 das einer gemischten Lösung von 2 mg/ml in Konzentration, die nur einen IgG-Immunkomplex enthält, der nicht mit einem Edelmetallkolloid markiert ist. Keine charakteristische Absorption wird auch in dem Spektrum 3 erkannt, außer der von Wasser. Andererseits ist ein Spektrum 1, das in jeder der 3 und 4 erscheint, das einer gemischten Lösung, die einen mit Goldkolloid markierten Immunkomplex enthält, gebildet durch eine Reaktion von 7,5 &mgr;g/ml des zuvor genannten 30 nm mit Goldkolloid markierten Anti-Mouse IgG-Antikörpers und 62,5 &mgr;g/ml eines Mouse-IgG-Antigens, und eine charakteristische Absorption wird zusätzlich zu der von Wasser erkannt.

5 stellt ein Spektrum dar, das durch Subtrahieren des Spektrums 2 von dem Spektrum 1 in 3 als ein Hintergrund erhalten wird, um die Absorption deutlich zu zeigen.

Dieses Spektrum ist ein Totalreflexions-Absorptionsspektraldifferenzspektrum des mit Goldkolloid markierten Immunkomplexes, der durch die Reaktion von 7,5 &mgr;g/ml des 30 nm mit Goldkolloid markierten Anti-Mouse IgG-Antikörpers und 62,5 &mgr;g/ml des Mouse-IgG-Antigens gebildet wird. In diesem Spektrum erscheinen charakteristische Absorptionsbänder bei 2.888 cm–1 und 2.942 cm–1 in der Nähe von 2.900 cm–1, und 993 cm–1, 1.043 cm–1 und 1.112 cm–1 zwischen ungefähr 900 cm–1 und 1.500 cm–1, und dies ist eine Absorption durch eine interne Schwingung des IgG-Immunkomplexes.

6 bis 10 stellen Konzentrationsabhängigkeitspegel der Absorbanzwerte bei jeweiligen Wellenzahlen von 2.942,5 cm–1, 2.881,1 cm–1, 1.112,4 cm–1, 1.043,3 cm–1 bzw. 993,8 cm–1 im Hinblick auf verschiedene Konzentrationswerte der Mouse-IgG-Antigene dar, die mit 7,5 &mgr;g/ml der mit 30 nm Goldkolloid markierten Anti-Mouse IgG-Antikörper reagierten. Die x-Achsen zeigen IgG-Konzentrationswerte, und die y-Achsen zeigen Absorbanzwerte. Jede ist gesättigt in einer Hochkonzentrationsregion von IgG, während eine lineare Beziehung in Niedrigkonzentrationsregionen vorliegt, und dies zeigt, dass eine quantitative Analyse durch das erfinderische Verfahren möglich ist.

11A und 11B zeigen exemplarische Totalreflexionszellen ausschließlich mit Einzelöffnungen. 11A stellt die Zelle 2 dar, die in 1 gezeigt ist, mit dem Totalreflexionsprisma 4 auf ihrer unteren Oberfläche.

11B zeigt eine Frontquerschnittansicht und eine Draufsicht von oben von einer Zelle 40 mit einem Totalreflexionsprisma 4 auf ihrer Seitenoberfläche.

12A bis 12E zeigen perspektivische Ansichten und Frontquerschnittansichten von Zellen mit jeweils anderen Formen.

12A zeigt eine einseitige Wegwerfzelle, die mit einem schmalen Spielraum 42, zum Ansaugen einer gemischten Probenlösung durch ein Kapillarphänomen, und einem Totalreflexionsprisma 4 versehen ist, das entlang des Spielraums 42 gebildet ist. Das Bezugszeichen 15 bezeichnet die gemischte Probenlösung, die in den Spielraum 42 gesaugt wird.

12B zeigt eine exemplarische doppelseitige Totalreflexions-Flusszelle, die an der oberen und unteren Oberfläche derselben vorgesehen ist, mit Totalreflexionsprismen 4 und 4' durch einen Raum, der mit einer gemischten Probenlösung gespeist wird. Das Bezugszeichen 44 bezeichnet ein Einlasstor für eine gemischte Probenlösung für die Zelle, und das Bezugszeichen 46 bezeichnet ein Auslasstor für eine gemischte Probenlösung aus der Zelle.

12C zeigt eine exemplarische zylindrische Totalreflexions-Flusszelle, die gebildet ist, um eine Seitenoberfläche eines zylindrischen Totalreflexionsprismas 4 einzuschließen. Eine gemischte Probenlösung 15 wird entlang der zylindrischen Oberfläche des Totalreflexionsprismas 4 zugeführt.

12D zeigt eine andere exemplarische doppelseitige Totalreflexions-Flusszelle, die so gebildet ist, dass eine gemischte Probenlösung 15 entlang zwei gegenüberliegenden Oberflächen eines Totalreflexionsprismas 4 zugeführt wird. Die Bezugszeichen 44, 44' bezeichnen Einlasstore für eine gemischte Probenlösung für die Zelle, und die Bezugszeichen 46, 46' bezeichnen Auslasstore für eine gemischte Probenlösung aus der Zelle.

12E zeigt eine exemplarische einseitige Totalreflexions-Flusszelle mit einem Totalreflexionsprisma 4 auf einer Oberfläche, die einen Raum definiert, der mit einer gemischten Probenlösung 15 gespeist wird.


Anspruch[de]
  1. Ein Immunanalyseverfahren zum Qualifizieren oder zum weiteren Bestimmen eines Antigens oder eines Antikörpers, der in einer Probe enthalten ist, das folgende Schritte aufweist:

    Mischen einer Lösung (8), die einen Antikörper oder ein Antigen enthält, das mit Edelmetall-Kolloidpartikeln markiert ist, mit einer Probenlösung (12), um eine gemischte Probenlösung zu bilden, für eine Reaktion eines Antigens oder eines Antikörpers, der in der Probenlösung (12) enthalten ist, mit dem markierten Antikörper oder dem Antigen, um dadurch einen mit Edelmetallkolloid markierten Immunkomplex (14) zu bilden;

    Einbringen eines Meßstrahls einer Wellenlänge in einem Bereich von sichtbaren zu Infrarot-Regionen in ein Totalreflexionsprisma (4) mit einem Einfallswinkel (&thgr;), was eine Totalreflexion verursacht, wobei das Reflexionsprisma (4) auf zumindest einer Oberfläche einer Totalreflexionszelle (2) angeordnet ist, in der die gemischte Probenlösung vorhanden ist; und

    Empfangen eines Lichtstrahls, der an der Grenzfläche zwischen dem Totalreflexionsprisma (4) und der gemischten Probenlösung verursacht wird,

    gekennzeichnet durch

    Messen der Absorption des Meßstrahls, die an der Grenzfläche zwischen dem Totalreflexionsprisma (4) und der gemischten Probenlösung verursacht wird.
  2. Das Immunanalyseverfahren gemäß Anspruch 1, bei dem

    eine Absorptionsmessung durch den Meßstrahl als homogene Immununtersuchungsanalyse ausgeführt wird, bei der die gemischte Probenlösung sowohl den Antikörper oder das Antigen enthält, das mit dem Edelmetallkolloid markiert ist, als auch das Antigen oder den Antikörper, der in der Probenlösung (12) enthalten ist, wobei keine Antigen-Antikörper-Reaktion von dem markierten Immunkomplex (14) verursacht wird.
  3. Das Immunanalyseverfahren gemäß Anspruch 2, bei dem

    die Antigen-Antikörper-Reaktion in der Totalreflexionszelle (2) verursacht wird, zum nachfolgenden Messen einer Absorption des Meßstrahls.
  4. Das Immunanalyseverfahren gemäß Anspruch 2, bei dem

    die gemischte Probenlösung, die hergestellt ist, um die Antigen-Antikörper-Reaktion in einem anderen Behälter zu verursachen, in der Totalreflexionszelle (2) gespeichert ist oder in dieselbe gespeist wird, zum Messen einer Absorption des Meßstrahls.
  5. Das Immunanalyseverfahren gemäß Anspruch 1, bei dem

    das Edelmetallkolloid ein Kolloid aus Gold, Silber oder Kupfer ist.
  6. Eine Immununtersuchungsvorrichtung, die folgende Merkmale aufweist:

    eine Totalreflexionszelle (2), die ein Totalreflexionsprisma (4) auf zumindest einer der Wandoberflächen aufweist, die einen Raum definieren, in dem eine gemischte Probenlösung, die einen Immunkomplex (14) enthält, der mit einem Edelmetallkolloid markiert ist, vorhanden ist;

    ein optisches Einfallsystem (16) zum Einbringen eines Meßstrahls einer Wellenlänge in einem Bereich von sichtbaren zu Infrarot-Regionen in das Totalreflexionsprisma (4) mit einem Einfallswinkel, der eine Totalreflexion verursacht; und

    ein optisches Meßsystem (18) zum Empfangen eines aus dem Totalreflexionsprisma austretenden Strahls (4),

    dadurch gekennzeichnet, daß

    das optische Meßsystem (18) angeordnet ist, um eine Absorbanz durch die gemischte Probenlösung zu messen, und

    das optische Einfallsystem (16) eine Einwellenlängen-Lichtquelle umfaßt, zum Emittieren eines Einwellenlängenstrahls, so daß eine Absorptionsmessung nur bei der einen Wellenlänge der Lichtquelle ausgeführt wird.
  7. Die Immununtersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 6, bei der

    die Totalreflexionszelle (2) eine Zelle vom Behältertyp ist, die nur eine Öffnung aufweist.
  8. Die Immununtersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 6, bei der

    die Totalreflexionszelle eine Flußzelle ist, die ein Lösungseinlaßtor (44, 44') und ein Lösungsauslaßtor (46, 46') aufweist; und

    die Immununtersuchungsvorrichtung eine Einrichtung zum Speisen der Totalreflexionszelle mit der gemischten Probenlösung aufweist, nach der Bildung des Immunkomplexes (14), der mit dem Edelmetallkolloid markiert ist.
Es folgen 12 Blatt Zeichnungen






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