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Dokumentenidentifikation DE69729808T2 14.07.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001002227
Titel GLEICHZEITIGE BESTIMMUNG EINES ANALYTS UND REFERENZAUSGLEICH FÜR VORRICHTUNGEN MIT REFERENZ-T-SENSOREN
Anmelder University of Washington, Seattle, Wash., US
Erfinder WEIGL, H., Bernhard, Seattle, US;
HOLL, R., Mark, Seattle, US;
ZEBERT, Diane, Seattle, US;
KENNY, Margaret, Edmonds, US;
WU, Caicai, Seattle, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69729808
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.11.1997
EP-Aktenzeichen 979484318
WO-Anmeldetag 21.11.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/21258
WO-Veröffentlichungsnummer 0099005512
WO-Veröffentlichungsdatum 04.02.1999
EP-Offenlegungsdatum 24.05.2000
EP date of grant 07.07.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 14.07.2005
IPC-Hauptklasse G01N 21/64
IPC-Nebenklasse G01N 21/05   G01N 15/06   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In dem berühmten Gedanken-Experiment von Maxwell betätigt ein Dämon eine Tür zwischen zwei Kästen mit Gas auf derselben Temperatur. Der Dämon sortiert die Moleküle, wobei die schnelleren Moleküle in einem Kasten und die langsameren in dem anderen gehalten werden, unter Missachtung der Grundgesetze der Thermodynamiken. Dieses Paradox ist seit dem auf viele Arten und Weisen aufgelöst worden. Leff, H. S., und Rex, A. F. (1990), „Resource letter md-1: Maxwell's demon", Am. J. Physics 58: 201–209.

Eine ähnliche Anordnung kann dazu verwendet werden, Partikel zu separieren. Es wird eine Mischung von Partikel aus zwei unterschiedlichen Größen, suspendiert in Wasser in einem Kasten, und reines Wasser in dem anderen, betrachtet. Falls der Dämon die Tür zwischen den Kästen schnell genug öffnet und schließt, so dass keines der größeren Partikel Zeit hat, um durch die Türöffnung hindurch zu diffundieren, allerdings lang genug, so dass einige der kleineren Partikel genug Zeit haben, um in den anderen Kasten zu diffundieren, wird eine bestimmte Separation erreicht werden.

In neuerer Zeit sind zwei Experimente vorgenommen worden, bei denen ein räumlich asymmetrisches Potential periodisch bei dem Vorhandensein einer Anzahl von Brown'schen Partikeln aufgebracht wird. Faucheux, L. S. et al. (1195), „Optical thermal ratchet", Physical Rev. Letters 74: 1504–1507; Rousselet, J. et al: (1994), „Directional motion of Brounian particles induced by a periodic asymmetric potential", Nature 370: 446–448.

Es ist gezeigt worden, dass dies zu einer direkten Bewegung der Partikel unter einer Rate in Abhängigkeit von dem Diffusionskoeffizienten führt. Ein Experiment (Rousselet, J. et al. (1994), „Directional motion of Brounian particles induced by a periodic asymmetric potential", Natur 370: 446–448) verwendete mikro-hergestellte Elektroden auf einem Mikroskop-Objektträger, um ein elektrisches Feld für das Potential anzulegen. Diese Idee ist auch Gegenstand der Europäischen Patentoffenlegung 645169 vom 29. März 1995 für „Separation of particles in a fluid – using a saw-tooth electrode and an intermittent exitation field", Adjari, A. et al.. Das andere Experiment (Faucheux, L. S. et al. (1995), „Optical thermal ratchet", Physical Rev. Letters 74: 1504–1507) verwendete eine modulierte, optische Pinzetten-Anordnung (tweezer arrangement).

Diffusion ist ein Vorgang, der leicht unter großen Maßstäben vernachlässigt werden kann, allerdings schnell in einem Mikro-Maßstab wichtig wird. Die durchschnittliche Zeit für ein Molekül, um über einen Abstand von d zu diffundieren, ist 2t = d2/D, wobei D der Diffusionskoeffizient des Moleküls ist. Für ein Protein oder ein anderes, großes Molekül ist eine Diffusion relativ langsam unter dem Makro-Maßstab (z. B. Hämoglobin mit D gleich zu 7 × 10–7 cm2/s in Wasser bei Raumtemperatur benötigt ungefähr 106 Sekunden (10 Tage), um über ein Rohr von einem Zentimeter zu diffundieren, benötigt allerdings ungefähr 1 Sekunde, um über einen Kanal von 10 Mikron zu diffundieren).

Unter Verwendung von Tools, entwickelt durch die Halbleiter-Industrie, um Elektroniken zu Miniaturisieren, ist es möglich, aufwändige Fluid-Systeme mit Kanalgrößen bis zu einem Mikron-Bereich klein herzustellen. Diese Vorrichtungen können kostengünstig in der Massenproduktion hergestellt werden, und es wird erwartet, dass sie sich bald in weit verbreiteter Verwendung für einfache, analytische Tests befinden.

Ein Verfahren, bezeichnet als „field-flow fractionation" (FFF), ist verwendet worden, um Komponenten eines einzelnen Eingangsstroms in ein System, nicht hergestellt in einem Mikro-Maßstab, sondern mit Kanälen klein genug, um eine laminare Strömung zu erzeugen, zu separieren und zu analysieren. Verschiedene Felder, einschließlich Konzentrationsgradienten, werden verwendet, um eine Kraft senkrecht zu der Strömungsrichtung zu erzeugen, um eine Separation von Partikeln in dem Eingangsstrom zu bewirken. Siehe z. B. Giddings, J. C., US-Patent 3,449,938, 17. Juni 1969, „Method for Separating and Detecting Fluid Materials"; Giddings, J. C., US-Patent 4,147,621, 3. April 1979, „Method and Apparatus for Flow Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C. US-Patent 4,214,981, 29. Juli 1980, „Steric Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C. et al., US-Patent 4,250,026, 10. Februar 1981, „Continuous Steric FFF Device for The Size Separation of Particles"; Giddings, J. C. et al., (1983), „Outlet Stream Splitting for Sample Concentration in Field-Flow Fractionation", Separation Science and Technology 18: 293–306; Giddings, J. C. (1985), „Optimized Field-Flow Fractionation System Based on Dual Stream Splitters", Anal. Chem. 57: 945–947; Giddings, J. C., US-Patent 4,830,756, 16. Mai 1989, „High Speed Separation of Ultra-High Molecular Weight Polymers by Hyperlayer Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 4,141,651, 25. August 1992, „Pinched Channel Inlet System for Reduced Relaxation Effects and Stopless Flow Injection in Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 5,156,039, 20. Oktober 1992, „Procedure for Determining the Size and Size Distribution of Particles Using Sedimentation Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C. US-Patent 5,193,688, 16. März 1993, „Method and Apparatus for Hydrodynamic Relaxation and Sample Concentration in Field-Flow Fraction Using Permeable Wall Elements"; Caldwell, K. D. et al., US-Patent 5,240,618, 31. August 1993, „Electrical Field-Flow Fractionation Using Redox Couple Added to Carrier Fluid"; Giddings, J. C. (1993), „Field-Flow Fractionation: Analysis of Macromolecular, Colloidal and Particulate Materials"; Science 260: 1456–1465; Wada, Y., et al., US-Patent 5,465,849, 14. November 1995, „Column and Method for Separating Particles in Accordance with Magnetic Susceptibility". Keine dieser Referenzen offenbart die Verwendung eines separaten Eingangsstroms, um Partikel, diffundiert von einem Partikel enthaltenden Eingangsstrom, aufzunehmen.

Ein in Bezug stehendes Verfahren für eine Partikel-Fraktionierung ist der „Split Flow Thin Cell" (SPLITT) Prozess. Siehe z. B. Williams, P. S., et al. (1992), „Continuous SPLITT Fractionation Based on a Diffusion Mechanism", Ind. Eng. Chim. Res. 31: 2172–2181; and J. C. Giddings, US-Patent 5,039,426. Diese Publikationen offenbaren Vorrichtungen mit Kanälen, klein genug, um eine laminare Strömung zu erzeugen, liefern allerdings wiederum nur einen Eingangsstrom. Ein weiteres US-Patent für J. C. Giddings, US-Patent Nr. 4,737,268, offenbart eine SPLITT Durchfluss-Zelle, die zwei Eingangsströme besitzt; allerdings ist der zweite Eingangsstrom kein Indikatorstrom, sondern vielmehr ein Partikel freier Strom. Das US-Patent 4,894,146 für Giddings offenbart auch eine SPLITT Durchfluss-Zelle, die zwei Eingangsströme besitzt, allerdings keinen Indikatorstrom. Alle diese SPLITT Strömungsverfahren erfordern das Vorhandensein von mehr als einen Ausgangsstrom, um verschiedene Partikel-Fraktionen zu separieren.

Keine der vorstehenden Publikationen beschreibt eine Kanal-System-Vorrichtung, die zum Analysieren von kleinen Partikeln in sehr kleinen Mengen einer Probe geeignet sind, die auch größere Partikel enthalten können, insbesondere größere Partikel, die dazu geeignet sind, den Indikator zu beeinflussen, der für die Analyse verwendet ist. Keine Vorrichtungen oder Verfahren, die Indikatorströme innerhalb der Zellen-System-Vorrichtung verwenden, werden beschrieben.

Mikrofluide Vorrichtungen ermöglichen auch, vorteilhaft Gebrauch von einer Diffusion als ein schneller Separations-Mechanismus zu machen, was auch eine effiziente und präzise Erfassung der separierten (diffundierten) Partikel ermöglicht. Ein Strömungsverhalten in Mikro-Strukturen unterscheidet sich wesentlich von demjenigen in der makroskopischen Welt. Aufgrund der extrem kleinen Trägheits-Kräfte in solchen Strukturen ist praktisch die gesamte Strömung in Mikro-Strukturen laminar. Dies ermöglicht die Bewegung von unterschiedlichen Schichten eines Fluids und von Partikeln, die am nächsten zueinander liegen, in einem Kanal ohne irgendein Vermischen, anders als Diffusion. Andererseits ist, aufgrund der kleinen, lateralen Abstände in solchen Kanälen, eine Diffusion eine wirkungsvolle Maßnahme, um Moleküle und kleine Partikel entsprechend zu deren Diffusionskoeffizienten zu separieren, was allgemein eine Funktion deren Größe ist. Ein Probenstrom kann in einer laminaren Strömung vorliegen, mit einer Strömung, die eine Indikator-Substanz enthält, was ein Mittel zum Erfassen eines Analyts darstellt, das von dem Probenstrom in den Indikatorstrom hinein diffundiert ist.

Weigl, B. H., Yager, P., „Silicon-Microfabricated Diffusion-Based Optical Chemical Sensor", Sensors & Actuators B – „Europetrode" (Conference) 2. April 1996; Zürich Schweiz; Weigl, B. H., Holl, M. A., Schutte, D., Brody, J. P., und Yager, P., „Diffusion-Based-Optical Chemical Detection in Silicon Flow Structures", Analytical Methods an Instrumentation, &mgr;TAS 96 special edition, 1996; Weigl, B. H., von den Engh, G., Kaiser, R., Altendorf, E., an Yager, P. „Rapid Sequential Chemical Analysis Using Multiple Fluorescent Reporter Beads", &mgr;TAS96, Conference Proceedings, 1996; Weigl, B. H., Hixon, G. T., Kenny, M., Zeert, D., Dwinnell, S., Buj, T., und Yager, P., „Fluorescence Analyte Sensing in Whole Blood Besed on Diffusion Separation in Silicon-Microfabricated Flow Structures, SPIE Proceedings, 9.–11. Februar 1997, J. Lakowitz (ed.), Fluorescence Sensing Technology III; und Brody, J., und Yager, P., „Low Reynolds Number Micro-Fluidic Devices", Solid State Sensor and Actuator Workshop, Hilton Head SC 2.–6. Juni 1996, beschreiben verschiedene Vorrichtungen und Verfahren, die eine laminare Strömung und Diffusions-Prinzipien verwenden, um das Vorhandensein der Konzentration von verschiedenen Analyten in Proben, z. B. das gesamte Blut, zu erfassen und zu bestimmen.

Die US-Patentanmeldung Serial No. 08/625,808 „Microfabricated Diffusion-Based Chemical Sensor", angemeldet am 29. März 1996, nun US-Patent 5,716,852, herausgegeben am 10. Februar 1998, US-Patentanmeldung Serial No. 08/829,679 (Attorney Docket No. 6-96A) „Microfabricated Diffusion-Based Chemical Sensor", angemeldet am 31. März 1997, und PCT Patentanmeldung Serial No. PCT/US 91/05245 „Microfabricated Diffusion-Based Chemical Sensor", angemeldet am 31. März 1997, offenbaren eine mikro-hergestellte Vorrichtung, die einen laminaren Strömungskanal, mindestens zwei Einlässe in einer Fluidverbindung mit dem laminaren Strömungskanal zum Leiten in den Strömungskanal hinein einen Indikatorstrom und einen Probenstrom, und einen Auslass aufweist. Kleinere Partikel in der Probenströmung diffundieren in die Indikatorströmung hinein, was einen Erfassungsbereich bildet, in dem Messungen einer erfassbaren Eigenschaft vorgenommen werden. Diese drei Anmeldungen offenbaren Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Analyten in einem Probenstrom durch Erfassen der Position innerhalb des laminaren Strömungskanals von Analyt-Partikel von dem Probenstrom, die in den Indikatorstrom hinein diffundieren, was eine erfassbare Änderung in dem Indikatorstrom verursacht. Alternativ kann die Position innerhalb des laminaren Strömungskanals des Bereichs, wo ein Gleichgewicht einer Diffusion des Analyts von dem Probenstrom in den Indikatorstrom hinein aufgetreten ist, verwendet werden, um eine Analyt-Konzentration zu bestimmen. Zusätzlich können Informationen, die zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikel in dem Probenstrom nützlich sind, durch Vorsehen von Einrichtungen, wie beispielsweise Probenkanälen, zum Leiten von Probenströmen von dem Indikatorstrom unter aufeinander folgenden Intervallen entlang der Länge des laminaren Strömungskanals, erhalten werden. Änderungen in der Intensität der Signale von Probenkanal zu Probenkanal können dazu verwendet werden, die Konzentration von Analyt-Partikel in der originalen Probe zu berechnen.

Die Vorrichtungen dieser drei Anmeldungen können in einer Fluidverbindung mit einer Vorrichtung stehen, wie beispielsweise diejenige, die in der US-Patentanmeldung Serial No. 08/534,515 „Silicon Microchannel Optical Flow Cytometer", angemeldet am 27. September 1995, nun US-Patent 5,726,751, herausgegeben am 10. März 1998, offenbart ist, die eine Single-File-Strömung von Partikel ermöglicht und die reflektive Oberflächen zum Erfassen von reflektivem Licht, im Gegensatz zu transmittiertem Licht, vorsieht. Die Vorrichtungen dieser drei Anmeldungen können alternativ in einer Fluid-Verbindung mit einem Hülsenströmungs-Modul stehen, wie es in der US-Patentanmeldung Serial No. 08/823,747, „Device and Method for 3-Dimensional Alignment of Particles in Microfabricated Flow Channels", angemeldet am 26. März 1997, offenbart ist.

In der WO97/00442 ist ein mikro-hergestelltes Extraktionssystem zum Extrahieren von erwünschten Partikeln aus einem Probenstrom, enthaltend sowohl erwünschte als auch nicht erwünschte Partikel, dargestellt. Das System besitzt zwei Einlässe, einen für sowohl einen Probenstrom als auch einen Extraktionsstrom; einen Extraktionskanal; und zwei Auslässe, einen für einen Produktstrom und einen für einen By-Produkt-Strom.

In der WO97/01087 ist eine Vorrichtung dargestellt, die angrenzende, laminare Ströme in einem Strömungskanal einsetzt. Der Zweck dieser Strömungen ist derjenige, einen oder mehrere der Probenströme von bestimmten Bereichen des Strömungskanals weg zu halten, so dass dort kein Erfordernis vorhanden ist, physikalische Unterteilungen vorzusehen.

Die Verwendung von Qualitäts-Kontroll-Materialien und internen Standard-Materialien ist natürlich ausreichend im Stand der Technik bekannt. Siehe L. A. Kaplan, Clinical Chemistry, 1989, 2nd ed., The C. V. Mosby Co., St. Louis, zur Diskussion von früheren, bekannten Verfahren und Materialien für eine Qualitätskontrolle, für interne Standards und für Kalibratoren. Der Zweck einer Qualitätskontrolle des analytischen Testens ist derjenige, sicherzustellen, dass jede Messung, durchgeführt an einer Probe, zuverlässig ist. Allgemein wird, in früheren, bekannten Verfahren einer Verwendung von Qualitätskontroll-Materialien, wie dies in Clinical Chemistry, von Kaplan, Seite 278, beschrieben ist, eine Kontrolle täglich (eine Unze pro Schicht) gemessen und kann in einem Levy-Jennings Ausdruck ausgedruckt werden, der grafisch den erreichten Soll-Durchschnitt ± zwei Standard-Abweichungen (auf der y-Achse) gegenüber der Zeit darstellt, z. B. die Tage des Monats (auf der x-Achse). Der Sollwert ist die abgeschätzte Konzentration des Analyts, der in der Probe von Interesse ist, innerhalb eines bestimmten Grads einer Genauigkeit, da sich bei jedem gegebenen Tag, der gemessene Kontrollwert leicht innerhalb der Spezifikationen des Instruments, der Kalibrierung, usw., unterscheiden wird. Der Benutzer muss einen Sollwert für jeden Analyt durch reguläre Laboratoriums-Vorgänge, die im Stand der Technik bekannt sind, einrichten. Allerdings sollte der gemessene Kontrollwert ziemlich konstant über die Zeit sein. Falls die Kontrollwerte leicht nach unten oder nach oben zu dem Sollwert driften, dann zeigt dies einen Trend an. Falls die Kontrollwerte einen plötzlichen Sprung in den Werten, aufgezeichnet von einem Durchschnitt zu einem anderen, darstellen, dann zeigt dies eine Verschiebung an. Falls eine systematische Vorspannung angezeigt wird (eine Änderung in der Genauigkeit) oder eine Änderung in der Präzision angezeigt wird, muss der Benutzer die Reagenzien, die internen Standards und das Instrumentarium prüfen.

Wie in Clinical Chemistry von Kaplan beschrieben ist, ist der Zweck von internen Standards derjenige, eine Genauigkeit und Präzision zu verbessern, ebenso wie eine Prüfung einer Qualitätskontrolle zu erreichen, und zwar aufgrund eines gegebenen, internen Standard-Bündels, aus einem gemessenen Wert (z. B. erfassbare Eigenschaft, korrelierbar zu einer Konzentration, wie dies durch irgendeine von verschiedenen Erfassungs-Einrichtungen erfassbar ist), und sollte derselbe über die Zeit sein.

In früheren, bekannten Verfahren und Materialien für die Qualitätskontrolle und die Verwendung von internen Standards waren Qualitätskontroll-Materialien gegenüber solchen, verwendet für interne Standards, unterschiedlich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Mikrosensoren und Verfahren zum Analysieren des Vorhandenseins und der Konzentration von kleinen Partikeln in Strömungen, die diese kleinen Partikel enthalten, durch Diffusions-Prinzipien. Die Erfindung ist, zum Beispiel, zum Analysieren von Blut nützlich, um die Konzentration von kleinen Partikeln, wie beispielsweise Wasserstoff-, Natrium- oder Kalziumionen, in einem Strom, der Zellen enthält, zu bestimmen, oder zum Analysieren von Trinkwasser, um seine Reinheit zu bestimmen, nützlich.

Diese Erfindung schafft eine Vorrichtung zum Erfassen des Vorhandenseins oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikeln in einer Probenströmung, die aufweist:

  • a) einen laminaren Strömungskanal;
  • b) mindestens drei Einlasseinrichtungen in einer Flüssigkeitsverbindung mit dem laminaren Strömungskanal zum jeweiligen Leiten in den laminaren Strömungskanal (1) mindestens einer Indikatorströmung, wobei die Indikatorströmung(en) vorzugsweise eine Indikatorsubstanz, zum Beispiel einen pH-empfindlichen Farbstoff, der das Vorhandensein der Analyt-Partikel, die von Interesse sind, durch eine erfassbare Änderung in der Eigenschaft anzeigt, wenn er mit den Analyt-Partikel in Kontakt tritt, aufweist, (2) mindestens einer Probenströmung und (3) mindestens einer Referenzströmung, die als eine Kontrollströmung, als eine interne Standardströmung oder für beide, oder als eine Kalibrierungsströmung, verwendet werden kann;
  • c) wobei der laminare Strömungskanal eine Dimension (entweder Tiefe und/oder Breite), ausreichend klein, um eine laminare Strömung der Strömungen angrenzend zueinander zu ermöglichen, und eine Länge, ausreichend, um zu ermöglichen, dass Analyt-Partikel in die Indikatorströmung(en) hinein diffundieren, um einen Erfassungsbereich zu bilden;
  • d) eine Auslasseinrichtung zum Leiten der Strömungen aus dem laminaren Strömungskanal heraus.

In der einfachsten Ausführungsform dieser Erfindung werden eine einzelne Indikatorströmung, eine einzelne Probenströmung, und eine einzelne Referenzströmung verwendet; allerdings können die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung auch mehrere Proben- und/oder Indikator- und/oder Referenzströmungen, alle in einer laminaren Strömung, verwenden.

Die Verfahren dieser Erfindung sind so ausgelegt, um in einer Vorrichtung ausgeführt zu werden, die Mikrokanäle einer Größe so besitzt, dass die Reynold'sche-Zahl für eine Strömung innerhalb des Kanals unterhalb von ungefähr 1 liegt. Die Reynold'sche-Zahl ist das Verhältnis der Trägheitskraft zu der Viskosität. Eine niedrige Reynold'sche-Zahl bedeutet, dass die Trägheitskraft im Wesentlichen vernachlässigbar ist, eine Turbulenz im Wesentlichen vernachlässigbar ist und die Strömung der zwei angrenzenden Strömungen laminar ist, d. h. die Strömungen mischen sich nicht, mit der Ausnahme der Diffusion von Partikel, wie dies vorstehend beschrieben ist.

Ein Verfahren wird hier zum Erfassen des Vorhandenseins und/oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikeln in einer Probenströmung, vorzugsweise einer Flüssigkeitsströmung, geschaffen, das aufweist:

  • a) Leiten der Probenströmung in einen laminaren Strömungskanal hinein;
  • b) Leiten einer Indikatorströmung, wobei die Indikatorströmung vorzugsweise eine Indikatorsubstanz aufweist, die das Vorhandensein der Analyt-Partikel durch eine Änderung in einer erfassbaren Eigenschaft anzeigt, wenn sie mit Partikeln des Analyts in Kontakt gebracht wird, in den laminaren Strömungskanal hinein, wodurch die Probenströmung und die Indikatorströmung in einer angrenzenden, laminaren Strömung in dem Kanal fließen;
  • c) Leiten einer Referenzströmung, die eine konstante Konzentration enthält, umfassend Null bis zu einer Sättigung, von Referenz-Partikeln, vorzugsweise Analyt desselben Typs wie solche in der Probenströmung, die eine Kontrollströmung, eine interne Standardströmung oder eine Kalibrierungsströmung ist, in den laminaren Strömungskanal hinein, wodurch die Referenzströmung in einer laminaren Strömung angrenzend an die Indikatorströmung in dem Kanal fließt;
  • d) Ermöglichen, dass Analyt-Partikel in die Indikatorströmung von der Probenströmung hinein diffundieren;
  • e) Ermöglichen, dass Referenz-Partikel in die Indikatorströmung von der Referenzströmung hinein diffundieren; und
  • f) Erfassen des Vorhandenseins oder Bestimmen der Konzentration der Analyt- und Referenz-Partikel in der Indikatorströmung.

Die Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung dienen dazu, eine Kontrolle für jede Probe gleichzeitig mit dem Ablauf der Probe (nicht nur einmal pro Tag oder einmal pro jede 8-Stunden-Schicht, wie in den zuvor bekannten Verfahren einer Qualitätskontrolle) laufen zu lassen. Die Kontrolle kann auch als ein interner Standard dienen. Die internen Standards dieser Erfindung erfordern kein exogenes Material, d. h. ein Material, das unterschiedlich zu dem Analyt, der von Interesse ist, ist. Da eine Kontrolle dieser Erfindung auch als ein interner Standard dienen kann, liefern die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung eine erhöhte Effektivität einer Fluid-Analyse gegenüber zuvor bekannten Verfahren und Vorrichtungen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt eine schematische Darstellung von Strömungen einer Proben-, Referenz- und Indikatorströmung, und die Änderungen in der Indikatorströmung, die sich aus einer Diffusion von Analyt-Partikel von der Proben- und Referenzströmung ergeben, und zwar in einer Ausführungsform dieser Erfindung.

2 zeigt eine schematische Darstellung einer Strömung einer Probenströmung, von zwei Indikatorströmungen, und von zwei Referenzströmungen, und die Änderungen in den Indikatorströmungen, die sich aus einer Diffusion von Analyt-Partikel von Proben- und Referenzströmungen ergeben, und zwar in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung. In dieser Ausführungsform befinden sich zwei Indikatorströmungen in einer Fluid-Verbindung mit einer einzelnen Einlassöffnung für die Indikatorströmung.

3 zeigt eine schematische Darstellung einer Probenströmung, von zwei Indikatorströmungen und von zwei Referenzströmungen, und die Änderungen in den Indikatorströmungen, die sich aus einer Diffusion von Analyt-Partikel von Proben- und Referenzströmungen ergeben, und zwar in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung. In dieser Ausführungsform besitzt jede der zwei Indikatorströmungen eine separate Eingangsöffnung.

4A zeigt eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung, wobei eine Mehrzahl von Strömungskanälen parallel über einen Kanal an der Rückseite des Substrats, z. B. eines Silizium-Wafers, verbunden sind.

4B zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskanäle der Vorrichtung der 4A und der Einlasskanäle in einer Fluid-Verbindung dazu.

4C zeigt eine Seitenansicht von 4B.

5 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform mit mehreren Strömungskanälen in einem Substrat.

6 stellt eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform dieser Vorrichtung dar.

7, die die 7A7C aufweist, stellt eine Ausführungsform dieser Vorrichtung dar, wobei die Strömungsrate durch Einsetzen einer gemeinsamen (geteilten) Pumpeinrichtung kontrolliert wird.

8 zeigt eine schematische Darstellung von fünf foto-mikrografischen Darstellungen, die während der Verwendung der Vorrichtung dieser Erfindung, wie sie in 1 dargestellt ist, aufgenommen sind.

9 zeigt eine grafische Darstellung einer Fluoreszenz-Intensität gegenüber einer x-Koordinate (Position in der Diffusions-Richtung) von 5 Experimenten, wobei die Probenströmung 0, 2, 4, 6, und 8 g eines menschlichen Serums Albumin (HSA)/100 ml Puffer, jeweils, enthielt. Auch ist in dieser grafischen Darstellung die Fluoreszenz von Kontrollströmungen dargestellt, die 3,8 g HSA/100 ml Puffer enthalten.

10 zeigt eine grafische Darstellung einer Fluoreszenz-Intensität gegenüber einer Konzentration von HSA (bestimmt durch eine Vorrichtung nach dem Stand der Technik) für sowohl rohe (nicht korrigierte) Daten als auch korrigierte Daten. Auch umfasst ist eine Kalibrierungskurve.

11 zeigt einen QC-Diagramm(Levy-Jennings)Ausdruck einer Fluoreszenz-Intensität einer Kontrollströmung (Kontroll-Analyt-Erfassungs-Bereich) für 20 unterschiedliche Experimente.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung schafft Vorrichtungen und Verfahren zum gleichzeitigen Überwachen einer oder mehrerer Probenströmung(en), während eine oder mehrere Referenzströmung(en) überwacht werden. Die Referenzströmungen sind Kontrollströmungen und/oder interne Standardströmungen. Diese Vorrichtungen und Verfahren dienen weiterhin zum Bestimmen der Konzentration einer Analyse in einer Probe, während kontinuierlich die Vorrichtung kalibriert wird, da eine interne Standardströmung mit einer bekannten Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, in einer laminaren Strömung mit der Probe vorliegen kann. Diese Vorrichtungen und Verfahren dienen weiterhin zum Bestimmen der Konzentration eines Analyts in einer Probe mit einer erhöhten Genauigkeit als eine Folge eines Einschließens von einer oder mehreren Standardströmungen) in einem laminaren Strom mit der Probe: Fluktuation in der Lichtquelle, Temperaturänderungen, Variationen in der Indikator-Konzentration, der Proben-Trübheit und -Farbe, usw., werden berücksichtigt (herausgesondert). Diese Vorrichtungen dienen auch zum kontinuierlichen Überwachen der Genauigkeit des Systems als eine Folge einer Verwendung einer Kontrollströmung mit einer konstanten Konzentration.

Wie für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird, werden allgemein, je häufiger eine Vorrichtung kalibriert wird, desto genauer die Messungen dadurch erhalten. Die Verwendung von internen Standards ermöglicht eine Beibehaltung einer Genauigkeit von Messungen ungeachtet einer weniger häufigen Kalibrierung und/oder zum Erhöhen einer Genauigkeit von Messungen, die zu der Häufigkeit einer Kalibrierung in Bezug gesetzt ist.

Die Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwenden eine Diffusion von Partikeln, die von Interesse sind, von einer laminaren Strömung in eine angrenzende, laminare Strömung. Eine Diffusion dient nicht nur als ein Mittel zum Separieren von kleineren Partikeln von einer Probenströmung, sondern, was noch wichtiger ist, erleichtert auch ein Erfassen und Analysieren solcher Partikel, z. B. eine Bestimmung der Konzentration solcher Partikel, unter deren Diffusion von Probenströmungen, in Indikatorströmungen hinein.

Kontrollströmungen enthalten konstante Konzentrationen der Partikel, die von Interesse sind, vorzugsweise nahe zu den geschätzten Konzentrationen der Partikel, die von Interesse sind, in der Probenströmung. Vorzugsweise verwenden die Kontrollströmungen auch dasselbe Trägerfluid und andere Komponenten als die Probenströmung. Kontrollströmungen werden dazu verwendet, anzuzeigen, ob die Vorrichtung und/oder das Erfassungs-System konsistente Ergebnisse über die Zeit liefern oder nicht, oder ob die Vorrichtung oder das System eingestellt werden muss, da sich die Ergebnisse über die Zeit ändern. Allgemein zeigen Ergebnisse, die nicht innerhalb von zwei Standard-Abweichungen des Durchschnitts, eingerichtet für vorherige Messungen einer Partikel-Konzentration in der Kontrollströmung liegen, an, dass die Vorrichtung oder das System eingestellt werden muss.

Interne Standardströmungen enthalten konstante Konzentrationen von Partikeln, die von Interesse sind, die dieselben oder unterschiedlich gegenüber der abgeschätzten Konzentration der Partikel in der Probenströmung sein können, oder enthalten konstante Konzentrationen eines anderen (exogenen) Materials. Interne Standardströmungen werden als eine Basis eines Vergleichs mit der Probenströmung verwendet, so dass die Ergebnisse von einer Messung der gleichen Konzentration in der Probenströmung eingestellt werden kann, um Variationen in System-Parametern zu berücksichtigen, die gleich auf die Probenströmung und die interne Standardströmung wirken. Der Ausdruck „Referenzströmung" umfasst sowohl Kontrollströmungen als auch interne Standardströmungen, und, in einer bevorzugten Ausführungsform, kann dieselbe Strömung sowohl als eine Kontrollströmung als auch eine interne Standardströmung verwendet werden. Wenn eine solche einzelne Referenzströmung sowohl als eine Kontroll- als auch als eine interne Standardströmung verwendet wird, wird sie die Zusammensetzung einer Kontrollströmung haben, wie dies nachfolgend beschrieben ist. Der Ausdruck „Referenzströmung" umfasst auch Kalibrierungsströmungen, wie sie nachfolgend beschrieben sind. Der Ausdruck „Referenz-Partikel" bezieht sich auf die Partikel, die von Interesse sind (d. h. Partikel, die erfasst werden sollen, und/oder gemessen werden sollen), in der Referenzströmung.

Die Referenzströmung kann gleichzeitig mit der Probenströmung, in demselben Strömungskanal, überwacht werden. Eine Erfassung von Partikeln, die von Interesse sind, in Bezug auf deren Diffusion in Indikatorströmungen von Referenzströmungen aus hinein, verwendet als Kontrollströmungen und interne Standardströmungen, dient für kontinuierliche Qualitätskontroll-Prüfungen und zum Sammeln von experimentellen Zuständen, die zu einer verringerten Genauigkeit in gemessenen Werten, jeweils, führen könnten. Solche experimentellen Zustände umfassen Lichtquellen-Fluktuationen, Variationen der Detektor-Empfindlichkeit, Temperatur-Fluktuationen, Strömungsraten-Fluktuationen, Indikator-Konzentration und -Qualität/Reinheit, und Proben-Trübheit. Ein Laufen lassen von internen Standards gleichzeitig mit der Probe ermöglicht eine erhöhte Genauigkeit in den Werten, die gemessen sind. Die Verwendung einer Kontrollströmung kann den Benutzer warnen, dass sich die Funktion des Systems wesentlich über die Zeit seit der Anfangs-Kalibrierung als eine Folge von Faktoren geändert hat, wie beispielsweise Energie-Fluktuationen, die die Elektroniken oder Lampen erwärmen, oder Fehlausrichtung, verursacht durch Bewegen des Instruments so, dass solche Bedingungen korrigiert werden können.

Die Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung sind für den Benutzer bequemer als andere Vorrichtungen und Verfahren zum Erfassen des Vorhandenseins oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyten in einer Probe, da diese Erfindung eine weniger häufige Kalibrierung zulässt. Die Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung beseitigen die Notwendigkeit für gesonderte Kalibrierungs-Läufe durch den Benutzer, aufgrund der Benutzung von Kontrollen gleichzeitig und in demselben Strömungskanal wie die Probenströmung, was Informationen liefert, die anzeigen, ob die gegebene Kalibrierungskurve (die durch den Hersteller bestimmt werden kann und die nicht durch den Benutzer bestimmt werden muss) fortlaufend gültig ist, und die Benutzung von internen Standards gleichzeitig und in demselben Strömungskanal liefert Informationen über Reaktions-Zustände, die die gemessenen Werte für eine Probe beeinflussen und eine Korrektur davon ermöglichen.

Ein Vorteil der Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung ist derjenige, dass eine Fluidströmung (nachfolgend bezeichnet als eine Referenzströmung) dienen kann als 1) eine Kontrolle, 2) ein interner Standard, und/oder 3) sowohl als eine Kontrolle als auch ein interner Standard. Ein Laufen lassen von einem oder mehreren Referenzströmung(en) gleichzeitig mit der Probe führt zu einer Bequemlichkeit und Effizienz gegenüber früheren, bekannten Verfahren und Vorrichtungen für eine Fluid-Analyse.

In der einfachsten Ausführungsform (siehe 1), bei der eine einzelne Probenströmung, eine einzelne Indikatorströmung und eine einzelne Referenzströmung in eine Vorrichtung dieser Erfindung geleitet werden, sind zwei Analyt-Erfassungsbereiche vorhanden: 1) ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich, gebildet durch Diffusion von Proben-Analyt-Partikel in die Indikatorströmung hinein, und 2) ein Referenz-Analyt-Erfassungsbereich, gebildet durch Diffusion von Referenz-Analyt-Partikel in die Indikatorströmung hinein. Da die Referenzströmung eine Kontrollströmung, eine interne Standardströmung oder eine Kalibrierungsströmung sein kann, kann der Referenz-Analyt-Erfassungsbereich entweder ein Kontroll-Analyt-Erfassungsbereich, ein interner Standard-Analyt-Erfassungsbereich oder ein Kalibrierung-Erfassungsbereich sein.

Der Ausdruck „Probenwert" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, die durch die Indikator-Substanz in dem Proben-Analyt-Erfassungsbereich gezeigt ist. In ähnlicher Weise bezieht sich der Ausdruck „Referenzwert" auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, gezeigt durch die Indikator-Substanz, in dem Referenz-Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „interner Standard-Wert" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, die durch die Indikator-Substanz in dem internen Standard-Analyt-Erfassungsbereich gezeigt ist. Der Ausdruck „Steuer-Wert" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, die durch die Indikator-Substanz in dem Steuer-Analyt-Erfassungsbereich gezeigt wird.

Messungen einer erfassbaren Eigenschaft können auch in Bereichen der Probenströmung, der Referenzströmung und der Indikatorströmung irgendwo als die Analyt-Erfassungsbereiche genommen werden, um einen Background zu geben, d. h. eine Basislinie, Messungen einer erfassbaren Eigenschaft. Viele Substanzen und Lösungen haben niedrige Hintergrund-Fluoreszens-Niveaus, z. B. das gesamte Blut emittiert ein sehr niedriges Niveau einer (Hintergrund) Fluoreszenz aufgrund bestimmter Komponenten, wie beispielsweise Metabolite und Nährstoffe, die fluoreszieren, mit niedriger Konzentration. Der Ausdruck „Hintergrund-Wert des internen Standards" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in der internen Standardströmung, d. h. nicht in einem Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „Kontroll-Hintergrund-Wert" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in der Kontrollströmung, d. h. nicht in dem Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „Proben-Hintergrund-Wert" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in der Probenströmung, d. h. nicht in einem Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „Indikator-Hintergrund-Wert" bezieht sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in einem Bereich der Indikatorströmung, wo keine Analyt-Partikel darin hinein diffundiert sind, oder im Wesentlichen keine Analyt-Partikel sind darin diffundiert, so dass keine erfassbare Eigenschaft erfassbar ist, d. h. nicht in einem Analyt-Erfassungsbereich.

Die bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung verwenden Flüssigkeitsströmungen, obwohl die Verfahren und Vorrichtungen auch zur Verwendung mit gasförmigen Strömungen geeignet sind.

Der Ausdruck „Erfassung", wie er hier verwendet ist, bedeutet eine Bestimmung, dass eine bestimmte Substanz vorhanden ist. Die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung können auch dazu verwendet werden, die Konzentration einer Substanz in einer Probenströmung zu bestimmen.

Der Ausdruck „abgeschätzte Konzentration", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Konzentration innerhalb eines bestimmten Grads einer Genauigkeit bekannt ist. Vorzugsweise sollten gemessene Werte dieser geschätzten Konzentration innerhalb von ±zwei Standard-Abweichungen des abgeschätzten Soll-Werts liegen.

Der Ausdruck „Partikel" bezieht sich auf irgendein partikel- bzw. teilchenförmiges Material, einschließlich Molekülen, Zellen, suspendierte oder aufgelöste Partikel, Ionen und Atome. Die Partikel können organisch oder anorganisch sein.

Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise vor einer Messung einer gegebenen Probe oder einer Mehrzahl von Proben kalibriert. Eine Kalibrierung kann auch während einer Proben-Messung unter Verwendung von Kalibrierungsströmungen durchgeführt werden.

Der Ausdruck „Kalibrierungsströmung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Strömung, die eine bekannte Konzentration, einschließlich einer Konzentration von Null, des Analyts, der von Interesse ist, enthält. Kalibrierungsströmungen werden dazu verwendet, Kalibrierungs-Kurven zu bestimmen, die sich auf Analyt-Konzentrationen zu gemessenen Werten einer erfassbaren Eigenschaft des Analyts beziehen. Die Konzentrationen einer Mehrzahl von Kalibrierungsströmungen gegenüber deren entsprechenden, gemessenen Werte einer erfassbaren Eigenschaft, z. B. einer Fluoreszenz oder eines Absorptions-Vermögens, werden grafisch dargestellt, um eine Kalibrierungs-Kurve zu erhalten. Kalibrierungsströmungen, und die sich ergebenden Kalibrierungs-Kurven, die davon abgeleitet sind, liefern Werte einer erfassbaren Eigenschaft, mit der eine Probe oder eine Referenz verglichen werden kann. Kalibrierungsströmungen können laufen und gemessen werden, bevor oder nachdem Probenströmungen laufen und gemessen werden. Vorzugsweise wird eine Vorrichtung vor deren Verwendung, und vorzugsweise nur einmal, kalibriert. Eine Kalibrierung kann gleichzeitig mit einem Laufen lassen der Probe durch Laufen lassen von einer oder mehreren, vorzugsweise einer Mehrzahl von Kalibrierungsströmungen in dem System, zusammen mit der Probenströmung durchgeführt werden.

Eine Kalibrierung wird durchgeführt, um die geometrischen Parameter (strukturelle Variation), z. B. Breiten und Tiefen des Strömungskanals, und Oberflächen-Reflektivität, in der Vorrichtung selbst, zu berücksichtigen. Ein Hersteller kann eine große Anzahl von Vorrichtungen in einer Charge herstellen, z. B. 10.000 bis 100.000 Silizium-Chips mit einer Vorrichtung dieser Erfindung jeweils. Der Hersteller kann dann einen kleinen Prozentsatz der Vorrichtungen in dieser Charge kalibrieren, z. B. 5–10 Vorrichtungen, und kann Kalibrierungs-Kurven mit einem bestimmten Grad einer Genauigkeit bestimmen. Zum Beispiel kann eine Kalibrierung bestimmen, dass die durchschnittliche Breite des Strömungskanals (die Dimension orthogonal zu der Diffusions-Richtung; die Breite ist die Dimension des optischen Pfads für Ausführungsformen mit optischer Erfassung) 50 Mikrometer beträgt, und dass sie zwischen 49 und 51 Mikrometern variiert. Demzufolge erkennt ein Benutzer, dass die Werte, erhalten von irgendeiner Vorrichtung in dieser Charge, akkurat innerhalb von 4% liegen, und kann deshalb auswählen, die Vorrichtung nicht zu kalibrieren.

Eine Kalibrierung wird durch Messen einer erfassbaren Eigenschaft, z. B. Fluoreszenz, einer Strömung, die eine bekannte Konzentration eines Analyts enthält, durchgeführt. Irgendein Abschnitt der Vorrichtung, der hinsichtlich Proben-Messungen überwacht werden kann, kann kalibriert werden. Eine Kalibrierungsströmung einer bekannten Konzentration einer Substanz, die eine erfassbare Eigenschaft besitzt, wird an allen Abschnitten des Strömungskanals überwacht, wo Proben-Messungen vorgenommen werden können, um dadurch eine Kalibrierungs-Kurve für diesen Analyt zu erhalten. Dieselbe Vorrichtung kann auch für irgendeine Zahl von anderen Analyten, z. B. bestimmten Proteinen, einem pH-Wert, Kationen, Viren, usw., kalibriert werden.

Wie für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet verständlich werden wird, können die Kalibrierungsströmungen allgemein die meisten, oder irgendwelche, Analyte, die analysiert werden sollen, sein, oder eine Kalibrierungsströmung kann spezifisch für den Analyt, der analysiert werden soll, sein. Zum Beispiel kann, falls der Analyt ein menschliches Serum Albumin ist, die Probe mit einer Vorrichtung, kalibriert mit einer allgemeinen Kalibrierungs-Lösung nach dem Stand der Technik, z. B. Rhodamin, analysiert werden. Alternativ kann die Vorrichtung innerhalb einer Kalibrierungsströmung kalibriert werden, die eine bekannte Konzentration eines menschlichen Serums Albumin enthält. Die Auswahl von Kalibrierungs-Lösungen/Strömungen kann durch eine routinemäßige Auswahl ohne unnötiges Experimentieren vorgenommen werden, wobei Fachleute erkennen, dass die Genauigkeit von Messungen von Kalibrierungs-Lösungen und der Häufigkeit abhängt.

Ein Hersteller kann Kalibrierungen so durchführen, dass ein Benutzer nicht die Vorrichtung kalibrieren muss. Ein Benutzer kann dann interne Standards verwenden, um experimentelle Zustände zu berücksichtigen, die die gemessenen Werte beeinflussen könnten. Ein Benutzer kann die Vorrichtung, zusätzlich zu einer vorherigen Kalibrierung des Herstellers, kalibrieren, falls eine größere Genauigkeit erwünscht ist.

In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung kann ein Hersteller eine Vorrichtung hinsichtlich verschiedener Analyte kalibrieren und kann den Benutzer mit derselben Anzahl von Kalibrierungs-Kurven, zum Beispiel in einem Software-Package, ausstatten. In diesem Fall kann der Benutzer den Analyt, der gemessen werden soll, eingeben, so dass das Programm korrekt die Daten mit der korrekten Kalibrierungs-Kurve vergleichen könnte.

Die Eingangs-Probenströmung kann irgendeine Strömung sein, die Partikel enthält, einschließlich von Partikeln unterschiedlicher Größen, zum Beispiel Blut, kontaminiertes Trinkwasser, kontaminierte, organische Lösungsmittel, Urin, biotechnologische Prozess-Proben, z. B. Fermentations-Brühen und Immuntests, Medikamenten-Analyse-Proben, und dergleichen. Die Eingangs-Probenströmung ist nicht notwendigerweise kontaminiert: reines Trinkwasser und hochwertige Chemikalien können mit Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung analysiert werden, um Konzentrationen von Analyten zu bestimmen, die keine Kontaminierungs-Bestandteile sind, z. B. Natriumionen in sauberem Trinkwasser und Protonen in chemischen Lösungen (um den pH-Wert davon zu bestimmen). Der Analyt kann irgendein kleines Partikel in der Eingangs-Probenströmung sein, der dazu geeignet ist, in die Indikatorströmung hinein in der Vorrichtung zu diffundieren, z. B. Sauerstoff-Moleküle, Protonen, Kalzium- oder Natriumionen, Proteine, z. B. Albumin, organische Moleküle, Medikamente, Pestizide, und andere Partikel. In einer bevorzugten Ausführungsform diffundieren, wenn die Probenströmung das gesamte Blut ist, kleine Ionen, wie beispielsweise Protonen und Natriumionen, schnell über den Kanal, wogegen größere Partikel, wie beispielsweise große Proteinen, langsam diffundieren. Ein Vorteil der Vorrichtung und von Verfahren dieser Erfindung ist derjenige, dass sie zur Separation von kleinen Analyt-Partikeln durch Diffusion von größeren Partikel dienen, um dadurch eine Erfassung und Messung von kleineren Partikeln durch eine optische Einrichtung zu erleichtern. Größere Partikel tendieren dazu, Licht, verwendet durch die optische Erfassungs-Einrichtung, zu streuen, wobei es folglich bevorzugt ist, größere, Licht streuende Partikel von kleineren Analyt-Partikel zu separieren. Vorzugsweise sind die Analyt-Partikel nicht größer als ungefähr 3 Mikrometer, noch bevorzugter sind sie nicht größer als ungefähr 0,5 Mikrometer, oder bevorzugt sind sie nicht größer als ungefähr 1.000.000 MW, und noch bevorzugter sind sie nicht größer als ungefähr 50.000 MW.

Eine oder mehrere Referenzströmung(en) können gleichzeitig mit einer Probenströmung laufen und gemessen werden. Das bedeutet, dass eine oder mehrere Referenzströmung(en) in demselben Strömungskanal zu derselben Zeit wie Probenströmung(en) und Indikatorströmung(en) (und in einer laminaren Strömung dazu) laufen gelassen und gemessen werden können. Eine Probenströmung befindet sich angrenzend an eine Indikatorströmung (auf einer ersten Seite davon), und eine Indikatorströmung befindet sich angrenzend (auf der zweiten Seite davon) zu einer Referenzströmung. Das bedeutet, dass sowohl eine Probenströmung als auch eine Referenzströmung angrenzend zu der Indikatorströmung vorliegen.

Kontrollströmungen dienen für Qualitäts-Kontroll-Prüfungen in Bezug auf verschiedene Parameter in den Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung, einschließlich einer Strömungsrate. Eine Qualitätskontrolle (Quality Control – QC) der Probenströmungsrate kann durch Ausdrucken eines QC-Diagramms (Levy-Jennings Ausdruck) des gemessenen Kontroll-Werts durchgeführt werden, d. h. Konzentration eines Analyts, wie sie durch eine bekannte Erfassungs-Einrichtung erfasst, z. B. Fluoreszenz, gegenüber der Proben-Zahl. Alternativ kann ein QC-Diagramm (Levy-Jennings Ausdruck) von der Position (x-Koordinate) in der Diffusions-Dimension (Tiefe) der Peak-Intensität, die gemessen ist, gegenüber der Proben-Zahl, vorgenommen werden.

Alternativ kann eine Qualitätskontrolle der Probenströmungsrate unter Verwendung derselben Pump-Einrichtung, z. B. eines Motors, erreicht werden, um die Proben- und Referenzströmungen in dem laminaren Strömungskanal der Vorrichtung zu pumpen. In dieser Ausführungsform kann jede der Eingangsöffnungen mit einer Spritze ausgestattet sein, wobei jede Spritze durch einen Motor angetrieben wird, um eine konsistente Strömungsrate sicherzustellen. Eine Fluktuation in der Strömungsrate der Probenströmung wird unmittelbar durch Hinweisen auf eine entsprechende Fluktuation in der Kontrollströmung erscheinen. Wiederum liefert ein QC-Ausdruck (Levy-Jennings) entweder der Analyt-Konzentration der gemessenen Kontrollströmung oder der gemessenen Position (x-Koordinate) des Kontrollströmung-Peaks gegenüber der Proben-Zahl ein einfaches Mittel, um eine Kontrollströmungsflussrate zu prüfen.

Sowohl die Probenströmung als auch die Referenzströmung(en) werden durch dieselbe Quelle gepumpt, wobei dann die Strömungsrate in einer Strömung dieselbe wie die Strömungsrate in einer anderen Strömung ist. Dies stellt sicher, dass keine Blockade der Einlasskanäle vorhanden ist. Deshalb kann es bevorzugt sein, einen Strömungsraten-Sensor in jedem Einlasskanal vorzusehen, um eine Strömungsraten-Konsistenz zu bestätigen.

Der Ausdruck „Kontrollieren einer Strömungsrate", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Bestimmung, dass eine Probenströmung unter einer gegebenen (erwünschten) Strömungsrate fließt, durch Überwachen der Strömungsrate einer Kontrollströmung.

Der Ausdruck „interne Standardströmung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Strömung, die eine Konstante, geschätzte oder bekannte Konzentration von Partikeln, vorzugsweise Analyt-Partikeln, die von Interesse sind, enthält. Die interne Standardströmung enthält vorzugsweise Analyt-Partikel desselben Typs, d. h. derselben chemischen und molekularen Struktur, wie die Analyt-Partikel in der Probenströmung. Zum Beispiel enthält, falls der Analyt, der in der Probenströmung analysiert werden soll, Kalziumionen sind, dann die interne Standardströmung eine konstante Konzentration von Kalziumionen. Der Ausdruck „konstant", wie er hier verwendet wird, bedeutet sich im Wesentlichen nicht ändernd. Obwohl eine exogene Substanz, d. h. eine Substanz, die nicht bei der Probe vorhanden ist, als Referenz-Partikel in der internen Standardströmung verwendet und gemessen werden kann, muss ein solches exogenes Material nicht in den internen Standards dieser Erfindung eingeschlossen sein, da die internen Standard-Partikel nicht zu der Probenströmung wie bei Verfahren nach dem Stand der Technik hinzu gegeben werden, sondern in einer separaten Strömung gemessen werden. Eine erfassbare Eigenschaft, z. B. eine Fluoreszenz, proportional zu der Konzentration des Referenz-Partikels, das von Interesse ist, wird in dem internen Standard-Analyt-Erfassungsbereich in demselben Strömungskanal zu derselben Zeit, zu der die erfassbare Eigenschaft gemessen wird, und zwar in dem Proben-Analyt-Erfassungsbereich, gemessen. Das Verhältnis zwischen dem letzteren Wert und dem ersteren Wert, Probenwert/interner Standard-Wert, oder interner Standard-Wert/Probenwert, kann bestimmt werden, um einen korrigierten Wert zum Bestimmen einer Proben-Konzentration, z. B. durch Vergleichen mit einer Kalibrierungs-Kurve, zu liefern.

Die Verwendung des Verhältnisses des Probenwerts zu dem internen Standard-Wert liefert ein Verfahren zum Berücksichtigen oder Kompensieren, d. h. Korrigieren, von bestimmten experimentellen Zuständen, die die Genauigkeit der gemessenen Werte verringern könnten, z. B. Variationen in der Intensität der Lichtquelle über die Zeit, Variationen in der Farbton-Intensität (z. B. Farb-Ausbleichen), Variationen in den Strömungsgeschwindigkeiten zwischen einem Probenlauf und dem nächsten, zu kompensieren. Das Laufen lassen des internen Standards in demselben Strömungskanal zu derselben Zeit, d. h. in demselben Lauf, mit der Probe führt dazu, dass dieselben, experimentellen Bedingungen sowohl die internen Standardströmungen) als auch die Probenströmung(en), und mit demselben Grad, beeinflussen. Eine Berücksichtigung dieser experimentellen Bedingungen erhöht die Genauigkeit der gemessenen Werte für die Probenströmungen.

Um weiter die Genauigkeit der gemessenen Werte der Probenströmungen zu prüfen, können die Verhältnisse des Probenwerts zu dem internen Standard-Wert (vorzugsweise unter Verwendung derselben Konzentration in jeder internen Standardströmung) für eine Mehrzahl von Proben grafisch dargestellt werden, was eine Linie oder Kurve mit korrigierten Werten ergibt. Eine Kontrollströmung kann laufen gelassen und gemessen werden, zusammen mit demselben, internen Standard. Das Verhältnis des Kontroll-Werts zu dem internen Standard-Wert sollte auf die grafische Linie von korrigierten Werten fallen.

Andere mathematische Operationen können in Bezug auf die Daten, die von einer solchen Vorrichtung gesammelt sind, durchgeführt werden. Zum Beispiel sind die folgenden Verhältnisse zum Verbessern der Genauigkeit des gemessenen Werts der Probe nützlich:

(Probenwert – Proben-Hintergrund-Wert)/(Referenz-Wert – Referenz-Hintergrund-Wert);

{(Probenwert – Proben-Hintergrund-Wert)/(Referenz-Wert – Referenz-Hintergrund-Wert)}/Indikator-Hintergrund-Wert; und

(Probenwert – Indikator-Hintergrund-Wert)/(Referenz-Wert – Indikator-Hintergrund-Wert);

wie für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird, ermöglicht das Einschließen von mehr als einen internen Standard pro Probe eine größere Korrektur der gemessenen Werte, und verschiedene, mathematische Manipulationen werden verwendet, um diese Korrekturen vorzunehmen. Zum Beispiel ist es, falls das Analyt Natriumionen sind, bevorzugt, zwei interne Standardströmungen zu verwenden: eine mit einer hohen Konzentration an Natriumionen, die andere mit einer niedrigen Konzentration an Natriumionen. Alternativ kann es, falls die Probenströmung das gesamte Blut ist, bevorzugt sein, zwei interne Standardströmungen zu verwenden: eine, die BC1 enthält (das niedrige Konzentrationen von bestimmten Blutkomponenten enthält), und die andere, die BC2 enthält (die hohe Konzentrationen dieser selben Blutkomponenten enthält). Ein anderes Beispiel einer Verwendung von zwei internen Standards ist der Fall, bei dem eine Probe hinsichtlich zwei Analyten analysiert wird, z. B. Kalziumionen und menschliches Serum Albumin (HSA). In diesem Fall befindet sich die Probenströmung in der Mitte des Strömungskanals. Auf einer Seite der Probenströmung ist eine Indikatorströmung vorhanden, die das Vorhandensein und die Konzentration von Kalziumionen anzeigen, auf der anderen Seite der Probenströmung befindet sich eine Indikatorströmung, die das Vorhandensein und die Konzentration von HSA anzeigt. Auf der anderen Seite der Kalzium-Indikatorströmung befindet sich eine interne Standardströmung, die eine konstante, vorzugsweise bekannte, Konzentration an Kalzium enthält. Auf der zweiten Seite der Indikatorströmung befindet sich eine interne Standardströmung, die eine konstante, bevorzugt bekannte, Konzentration von HSA enthält. Demzufolge ist dabei eine interne Standardströmung für jeden Analyt vorhanden.

In Ausführungsformen, bei denen zwei oder mehr interne Standards für eine gegebene Probe verwendet werden, müssen sie mit der Kalibrierungs-Kurve verglichen werden, um zu bestimmen, ob die Kalibrierungs-Kurve ebenso genau dafür ist, d. h. ob jeder der internen Standard-Werte ebenso nahe zu der Kalibrierungs-Kurve liegt. Die mathematischen Operationen, die in Bezug auf die Probenwerte und eine Mehrzahl von internen Standard-Werten durchgeführt werden, hängen davon ab, ob die Kalibrierungs-Kurve gleich genau für jede der Mehrzahl von internen Standards ist.

Falls die Kalibrierungs-Kurve gleich genau für jede der Mehrzahl der internen Standards ist, dann kann, zum Beispiel, der Probenwert durch jeden der internen Standard-Werte dividiert werden. Unter den verschiedenen, mathematischen Operationen, die in Bezug auf Daten, erhalten von einem Fall, durchgeführt werden, bei dem zwei interne Standards mit einer Probe laufen, kann der gemessene Probenwert durch jeden der zwei gemessenen, internen Standard-Werte dividiert werden. Alternativ können zwei interne Standard-Werte gemittelt werden, und dann kann der Probenwert durch diesen Mittelwert geteilt werden. Wie für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet verständlich wird, wird die Auswahl einer mathematischen Operation, die in Bezug auf den Probenwert mit den internen Standard-Werten durchgeführt werden soll, durch die mathematische Operation vorgegeben, die in Bezug auf die Kalibrierungs-Werte und die internen Standard-Werte durchgeführt wird, wenn die Kalibrierungs-Kurve, die verwendet werden soll, bestimmt wird: die internen Standard-Werte werden mathematisch in derselben Art und Weise in jedem Fall verwendet, ob nun bei einer Bestimmung einer Kalibrierungs-Kurve oder bei einer Korrektur einer Proben-Messung.

Falls die Kalibrierungs-Kurve nicht gleich genau für jeden der Mehrzahl der internen Standards ist, wie dies durch Ausdrucken einer Mehrzahl von internen Standard-Werten bestimmt ist, und zwar gegenüber der Kalibrierungs-Kurve für die Vorrichtung, dann kann die mathematische Funktion, die die Beziehung zwischen den internen Standard-Werten beschreibt, mathematisch, z. B. durch Multiplikation, mit der Funktion, die die Kalibrierungs-Kurve beschreibt, verknüpft werden, um eine korrigierte Kalibrierungs-Kurve zu erhalten. Allgemein besitzt eine Kalibrierungs-Kurve einen bestimmten Grad einer Genauigkeit nur innerhalb eines bestimmten Konzentrations-Bereichs. Deshalb wird, in einigen Fällen, zum Beispiel, ein Standard-Wert mit einer hohen Konzentration weiter von der Kalibrierungs-Kurve entfernt liegen, als, beispielsweise, ein interner Standard-Wert einer niedrigen Konzentration. Demzufolge ergibt ein Multiplizieren der Funktion, die die Beziehung zwischen diesen zwei internen Standard-Werten beschreibt, mit der originalen Kalibrierungs-Kurve eine korrigierte Kalibrierungs-Kurve. Unter Bestimmen eines Probenwerts kann man dann diesen zu einem internen Standard-Wert in Bezug setzen, z. B. durch Dividieren des Probenwerts durch den internen Standard-Wert, falls die Kalibrierungs-Werte durch interne Standard-Werte dividiert wurden, um die originale Kalibrierungs-Kurve zu bestimmen. Dies führt zu einer dimensionslosen Zahl, die mit der (korrigierten) Kalibrierungs-Kurve verglichen werden kann, um eine Konzentration eines Analyts zu erhalten, d. h. die dimensionslose Zahl wird auf der y-Achse der Kalibrierungs-Kurve gefunden und der entsprechende x-Achsen-(Konzentration)-Wert wird von der Kalibrierungs-Kurve gelesen.

In einer Ausführungsform wird sowohl eine hohe als auch eine niedrige Konzentration von Referenz-Partikeln, die von Interesse sind, zum Kalibrieren und für eine Proben-Korrektur verwendet. Zum Beispiel werden Kalibrierungsströmungen, die 5, 10, und 15 g/100 ml HSA enthalten, laufen gelassen, und hinsichtlich einer Fluoreszenz überwacht. Interne Standardströmungen, die 3 g/100 ml (niedrig) und 18 g/100 ml (hoch) enthalten, werden gleichzeitig laufen gelassen und hinsichtlich der Fluoreszenz überwacht. Eine Fluoreszenz-Intensität jeder der Kalibrierungsströmungen (die 5, 10 und 15 g/100 ml HSA enthalten) werden gegenüber der Fluoreszenz-Intensität der Kontrollströmung mit niedriger Konzentration plus der Fluoreszenz-Intensität des internen Standards mit hoher Konzentration durch zwei dividiert. Dies führt zu einer Kalibrierungs-Kurve, mit der Probenwerte verglichen werden können. Probenwerte, geteilt durch das Mittel der internen Standard-Werte, für die die Kalibrierungs-Kurve bereits dahingehend bestimmt worden ist, dass sie ebenso gültig ist, können auch mit einer solchen Kalibrierungs-Kurve verglichen werden.

Vorrichtungen dieser Erfindung können für räumliche Variationen in der Licht-Intensität und in der Lichtsammel-Effektivität in der folgenden Art und Weise kalibriert werden: der gesamte Kanal wird mit einer Farbstoff-Lösung mit einem Spektrum ähnlich zu demjenigen des Indikators (vorzugsweise der Indikator selbst, gesättigt mit Analyt) geflutet, um das zu erzielen, was, unter idealen Umständen, ein gleichförmiges, optisches Bild sein sollte. Das Inverse dieses Bilds wird dann durch alle Proben-Bilder, verwendet dazu, das Ansprechverhalten des optischen Systems in darauf folgenden Proben-Messungen mit mehreren Strömungen zu „normieren" (zu korrigieren), multipliziert.

Falls zwei zusammensetzungsmäßig unterschiedliche Indikatorströmungen verwendet werden, können zwei Referenzströmungen, wobei jede davon Analyte enthält, mit denen die zwei Indikatoren reagieren, verwendet werden, ohne dass ein Indikator quer-empfindlich zu beiden Analyten ist. Alternativ können, falls zwei zusammensetzungsmäßig unterschiedliche Indikatorströmungen verwendet werden, zwei Referenzströmungen, wobei eine nur einen Analyt enthält, für den einer der Indikator-Ströme empfindlich ist, und eine zweite Referenzströmung, die einen unterschiedlichen Analyt enthält, für den die andere Indikatorströmung empfindlich ist, verwendet werden.

In einer anderen Ausführungsform kann eine Indikatorströmung ein Reagenz umfassen, das, z. B., chemisch reagiert, mit einem Analyt in einer Probe, um ein Produkt zu bilden, das durch eine andere Indikatorströmung erfasst wird. Ein Beispiel einer Ausführungsform, die eine Mehrzahl von Indikatorströmungen mit einer unterschiedlichen Zusammensetzung verwendet, ist eine Vorrichtung, die vier Einlassströmungen besitzt, die in einer laminaren Strömung fließen, wobei eine mittlere Strömung eine Indikatorströmung ist, die ein Reagenz enthält. Zum Beispiel befindet sich auf der am weitesten links liegenden Seite der Vorrichtung eine Probenströmung aus Blut, die nächste Strömung nach rechts hin ist eine Indikatorströmung, die Glukose-Oxidase (ein Reagenz) enthält, die dritte Strömung ist eine Indikatorströmung, die einen pH-empfindlichen Farbstoff enthält, und die vierte Strömung (auf der am weitesten rechts liegenden Seite) ist eine Kontrollströmung, die eine bekannte Menge an Glukonsäure enthält. Da Glukose-Partikel von der Probenströmung durch die Reagenzströmung diffundieren, werden sie zu Glukonsäure hin geändert, die durch einen pH-empfindlichen Farbstoff erfasst wird, wenn die Glukonsäuremoleküle in die Indikatorströmung hinein diffundieren. Die Glukonsäuremoleküle von der Kontrollströmung werden in die Indikatorströmung hinein diffundieren. Die Fluoreszenz von jeder Seite der Indikatorströmung kann gemessen werden. Der Fluoresenzwert von der Seite der Indikatorströmung am nächsten zu der Probenströmung (d. h. der Proben-Analyt-Erfassungsbereich) zeigt die Menge an Glukonsäure an, die davon abgeleitet ist, und deshalb die Menge von Glukose in der Probe, die mit dem Wert verglichen werden kann, der von dem Kontrollströmung-Analyt-Erfassungsbereich erhalten ist, was als eine (Qualitätskontroll-)Prüfung des gemessenen Werts der Probe dient.

Das System kann auch eine Indikatorströmung umfassen, die in eine der Einlasseinrichtungen hinein eingeführt ist, aufweisend einen Flüssigkeitsträger, der Substratpartikel, wie beispielsweise Polymere oder Kügelchen, enthält, die eine Indikatorsubstanz, die darauf immobilisiert ist, besitzen, wie dies in der US-Patentanmeldung „Fluorescent Reporter Beads for Fluid Analysis", Serial Number 08/621,170, angemeldet am 20. März 1996, nun US-Patent 5,747,349, herausgegeben am 5. Mai 1998, beschrieben ist. Solche Substratpartikel, die eine Indikatorsubstanz besitzen, die darauf immobilisiert ist, sind groß genug (besitzen einen Diffusionskoeffizienten, der klein genug ist), dass deren Diffusion aus der Indikatorströmung heraus vernachlässigbar ist, d. h. nicht wesentlich ist. Der Flüssigkeitsträger kann irgendeine Flüssigkeit sein, die eine Indikatorsubstanz besitzt und die dazu geeignet ist, Partikel, die von der Proben- und/oder Referenzströmung diffundieren, aufzunehmen. Bevorzugte Indikatorströmungen in Fällen, bei denen die Probe das gesamte Blut ist, weisen Wasser und Lösungen auf, die denselben, osmotischen Druck wie das gesamte Blut haben, wie beispielsweise Salzwasser mit einer Salzkonzentration von ungefähr 10 mM NaCl, KCl oder MgCl, oder organische Lösungsmittel, wie Aceton, Isopropylalkohol, Ethanol oder irgendeine andere passende Flüssigkeit, die nicht den Effekt des Analyts an der Indikator-Substanz oder der Erfassungs-Einrichtung beeinflusst.

Falls die Konzentration von Analyt-Partikel hoch ist, d. h. hoch genug, um die Indikator-Substanz zu sättigen, dann können Messungen an der voran führenden Flanke des Analyt-Erfassungsbereichs vorgenommen werden, wo ein lokaler Überschuss von Indikator-Partikeln vorhanden ist. Die „voranführende Flanke" bezieht sich auf die Grenze des Analyt-Erfassungsbereichs und der Indikatorströmung, d. h. die Kante des Analyt-Erfassungsbereichs, die am weitesten von der Strömung weg liegt, von wo aus die Analyt-Partikel diffundieren.

Kalibrierungsströmungen, Kontrollströmungen und interne Standardströmungen können alle Strömungen sein, die eine bekannte Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, enthalten, d. h. sie können zusammensetzungsmäßig dieselben sein. Sie unterscheiden sich untereinander in Bezug auf deren Zweck und darin, wann und wie häufig sie verwendet werden. Kalibrierungsströmungen werden dazu verwendet, die Vorrichtungen dieser Erfindung zu kalibrieren, d. h. die Dimensionen und die spezifischen Details der Vorrichtung, wie beispielsweise die Kanalbreite, zu berücksichtigen. Eine Kalibrierung kann nur einmal für eine gegebene Vorrichtung durchgeführt werden und wird vor, nach oder während der Zeit, zu der Proben-Messungen vorgenommen werden, durchgeführt. Falls eine größere Genauigkeit erwünscht ist, kann eine Kalibrierung häufiger durchgeführt werden. Interne Standardströmungen werden verwendet, um Effekte von experimentellen Bedingungen zu berücksichtigen, d. h. die herauszunehmen, die die Werte, die gemessen sind, beeinflussen; sie laufen alle zu derselben Zeit in demselben Strömungskanal wie die Probe. Kontrollströmungen dienen als eine Qualitäts-Kontroll-Prüfung der gemessenen Werte und laufen vorzugsweise zu derselben Zeit und in demselben Strömungskanal wie die Probe.

Eine gegebene Strömung kann sowohl als eine Kontrollströmung als auch eine interne Standardströmung dienen. Zum Beispiel kann, in einer Ausführungsform, bei der drei Eingangsströmungen vorhanden sind – eine Probenströmung, eine Indikatorströmung und eine Referenzströmung, die eine konstante, geschätzte Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, enthält –, der gemessene Wert einer erfassbaren Eigenschaft, z. B. Fluoreszenz-Intensität, in dem Referenz-Analyt-Erfassungsbereich gemessen werden. Dieser Wert kann gegenüber dem verglichen werden, was dahingehend bekannt ist, dass es ein annehmbarer Wert ist, und zwar basierend auf einer Kalibrierungs-Kurve. In diesem Sinne dient die Referenzströmung als eine Qualitäts-Kontroll-Prüfung, d. h. eine Kontrollströmung. Zusätzlich kann (derselbe) gemessene Wert einer erfassbaren Eigenschaft als ein interner Standard dienen, z. B. der Probenwert kann durch den internen Standard-(Referenz)-Wert dividiert werden, um experimentelle Bedingungen zu korrigieren. Demzufolge kann eine Referenzströmung zu Daten führen (ein gemessener, erfassbarer Wert), die als sowohl eine Kontrolle als auch ein interner Standard dienen können. Natürlich ist es bevorzugt, sowohl eine interne Standardströmung als auch eine Kontrollströmung zu haben, so dass die Kontrollströmung durch eine mathematische Manipulation unter Verwendung des gemessenen Werts der internen Standardströmung korrigiert werden kann.

Der Ausdruck „laminarer Strömungskanal", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Kanal, der eine laminare Strömung unter hydrodynamischen Bedingungen ermöglicht, definiert durch Viskosität und Strömungsgeschwindigkeit. Für einen Kanal mit gegebenen Dimensionen kann eine laminare Strömung für eine Flüssigkeit mit einer bestimmten Viskosität und Strömungsgeschwindigkeit erreicht werden. Die Dimensionen der Vorrichtungen werden so ausgewählt, dass eine laminare Strömung aufrechterhalten wird, d. h. eine niedrige Reynold'sche Zahl, vorzugsweise unterhalb von ungefähr 1. Das bedeutet, dass mindestens eine Dimension – entweder die Tiefe und/oder die Breite – klein genug ist, um eine niedrigere Reynold'sche Zahl und demzufolge eine laminare Strömung beizubehalten. Der laminare Strömungskanal ist lang genug, um zu ermöglichen, dass kleine Analyt-Partikel von einer Probenströmung, und von einer Referenzströmung, falls eine solche Referenzströmung Analyt-Partikel enthält, diffundieren, und haben einen erfassbaren Effekt in Bezug auf eine Indikator-Substanz oder eine Erfassungseinrichtung, vorzugsweise mindestens ungefähr 2 mm lang. In bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung liegt die Kanallänge (L) (siehe 1) zwischen ungefähr 5 mm und ungefähr 50 mm. Die Kanaltiefe (d) (Diffusionsrichtung) beträgt vorzugsweise zwischen ungefähr 20 Mikrometern und ungefähr 1 mm. Der Kanal ist bevorzugter relativ tief ausgebildet, z. B. mindestens ungefähr 200 Mikrometer, was es einfacher macht, eine Indikator-Fluoreszenz mit einfachen Optiken zu messen, und bei dem es weniger wahrscheinlich ist, dass Partikel den Kanal verstopfen. Allerdings kann der Kanal so flach wie möglich ausgebildet werden, während ein Verstopfen des Kanals mit den Partikeln, die verwendet werden, vermieden wird. Die Kanalbreite (die Dimension orthogonal zu der Tiefe und Länge) ist klein genug, um eine laminare Strömung von zwei Strömungen darin zu ermöglichen, vorzugsweise nicht größer als ungefähr einen Millimeter und noch bevorzugter zwischen ungefähr 100 Mikrometern und ungefähr 400 Mikrometern. Falls die Probe menschliches Blut umfasst, das Blutzellen bis zu ungefähr 20–30 Mikrometern groß enthält, beträgt vorzugsweise die Tiefe an der T-Verbindung 50 Mikrometer.

Für eine gegebene Strömungsgeschwindigkeit kann der laminare Strömungskanal lang genug gemacht werden, um den Indikator-Referenz- und Probenströmungen zu ermöglichen, ein Gleichgewicht in Bezug auf die Analyt-Partikel innerhalb des Kanals zu erreichen. Ein Gleichgewicht tritt dann auf, wenn die maximale Menge von kleineren Partikel in die Indikatorströmung hinein von der Probenströmung, der Kalibrierungsströmung und/oder der Referenzströmung aus diffundiert sind. Alternativ kann, für eine gegebene Länge eines Strömungskanals, die Strömungsgeschwindigkeit verringert werden, um Zeit zu erhalten, damit ein Gleichgewicht erreicht wird. Minimale und maximale Strömungsgeschwindigkeiten können durch ein Programm-Experiment durch Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet bestimmt werden. Zum Beispiel muss die Einstellrate von Zellen berücksichtigt werden, wenn die minimale Strömungsgeschwindigkeit für biologische Fluide, die Zellen, z. B. das gesamte Blut, enthalten, bestimmt wird. Zusätzlich müssen Scherraten berücksichtigt werden, da sie die Geschwindigkeit sind, unter denen sich Zellen langsam genug bewegen, dass deren Wechselwirkung mit den Kanalwänden größer als die Kraft werden kann, die das Fluid auf die Zellen aufbringt, um sie fließend entlang des Strömungskanals zu halten. Weiterhin ist, in Fällen, bei denen zwei oder mehr Fluide mit unterschiedlichen Viskositäten und Geschwindigkeiten in einer angrenzenden, laminaren Strömung vorliegen, ein Lysing von Zellen eine Möglichkeit, die von einer abrupten Änderung in Strömungsgeschwindigkeiten (Geschwindigkeiten) resultiert. Es kann bevorzugt sein, abrupte Änderungen in den Strömungsgeschwindigkeiten in einer angrenzenden, laminaren Strömung von Fluiden zu vermeiden, zum Beispiel in Fällen, bei denen die Strömungsrate so hoch ist, dass Scherkräfte groß genug sind, um Analyte oder andere Partikel zu beeinflussen oder zu beschädigen, z. B. ein Lysing von Zellen, in der Probe, was zu einer Interferenz mit Messungen führen würde.

Die Vorrichtung einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung (siehe 1) weist Kanalnuten in der Form eines „✝" oder „&psgr;" auf, mit einem zentralen Strang und drei Verzweigungen, die in die Oberfläche eines Silizium-Mikrochips hineingeätzt sind, wobei die Oberfläche danach mit einer Glasplatte abgedeckt wird. Die zentrale Nut bzw. Vertiefung ist aus dem Strang des „✝" oder „&psgr;" gebildet, und die Verzweigungen sind die Einlass-Einrichtungen in einer Fluidverbindung mit dem laminaren Strömungskanal für ein jeweiliges Leiten der Proben-, Referenz- und Indikatorströmungen in den laminaren Strömungskanal hinein.

Vorrichtungen dieser Erfindung können auch mehr als drei Einlass-Verzweigungen in einer Fluidverbindung mit dem laminaren Strömungskanal zum Leiten einer Mehrzahl von Einlassströmungen in den Kanal hinein umfassen. Diese können in einer Anordnung ähnlich eines „Leuchters" angeordnet sein oder können aufeinander folgend entlang eines „Querbalkens" für die „✝" oder die Verzweigungen der „&psgr;" Konfiguration angeordnet sein, wobei die einzige Einschränkung diejenige ist, dass die laminare Strömung aller Strömungen bewahrt werden muss.

Einlass-Einrichtungen umfassen die Einlasskanäle oder „Verzweigungen" und können auch andere Einrichtungen, wie beispielsweise Rohre, Spritzen, und dergleichen, umfassen, die Einrichtungen bilden, um Fluide in die Vorrichtung einzuspritzen. Auslass-Einrichtungen umfassen Sammel-Öffnungen und/oder Einrichtungen zum Entfernen von Fluid von dem Auslass, einschließlich Aufnahmen für das Fluid, Einrichtungen, um eine Strömung durch eine kapillare Wirkung, Druck, Schwerkraft, eine positive Verschiebung (z. B. Pumpen durch eine Spritzenpumpe), ein elektroosmotisches (elektrokinetisches) Pumpen, und können andere Einrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind, umfassen. Solche Aufnahmen können Teil einer analytischen oder Erfassungs-Vorrichtung sein.

Vorrichtungen dieser Erfindung können externe Erfassungs-Einrichtungen zum Messen einer erfassbaren Eigenschaft oder einer Änderung in einer erfassbaren Eigenschaft aufweisen. Eine Erfassung und Analyse werden mittels Einrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind, vorgenommen, einschließlich optischer Einrichtungen, wie beispielsweise optische Spektroskopie. Andere Einrichtungen, wie beispielsweise Absorptions-Spektroskopie, insbesondere sichtbar, allerdings auch ultraviolett und infrarot; Fluoreszenz; durch chemische Indikatoren, die eine Farbe oder andere Eigenschaften ändern, wenn sie dem Analyt ausgesetzt sind; Chemie-Lumineszenz, die durch Fachleute dahingehend bekannt ist, auf eine Lumineszenz aufgrund einer chemischen Reaktion Bezug zu nehmen – das gesamte Licht, das gemessen ist, ist dasjenige, das emittiert ist, wobei kein Licht in das System eingeführt wird, und Beispiele und Chemie lumineszente Reagenzien umfassen „Luzigenin", das eine Lumineszenz bei einem bestimmten (hohen) pH emittiert, Luminol und Luziferine. Andere Erfassungs-Einrichtungen umfassen immunologische Mittel; elektrische Mittel, z. B. Elektroden, eingesetzt in die Vorrichtung; elektrochemische Einrichtungen; radioaktive Einrichtungen; oder virtuell irgendeine mikroanalytische Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich magnetischer Resonanztechniken; oder andere Einrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind, um das Vorhandensein eines Analyts, wie beispielsweise eines Ions, eines Moleküls, eines Polymers, eines Virus, einer DNA-Folge, eines Antigens, eines Mikroorganismus, oder anderer Faktoren, zu erfassen. Vorzugsweise werden optische oder fluoreszente Einrichtungen verwendet, und Antikörper, DNA-Folgen, und dergleichen, werden an fluoreszente Markierer angehängt. Änderungen in einer Indikator-Substanz, getragen innerhalb der Indikatorströmung, als eine Folge eines Kontakts mit Analyt-Partikel, werden erfasst, ebenso wie Hintergrund (Basislinien) Messungen, z. B. ein Hintergrund-Absorptionsvermögen der Indikatorströmung oder der Probenströmung.

Vorzugsweise ermöglicht die Erfassungs-Einrichtung eine räumliche Auflösung, d. h. ermöglicht ein Lokalisieren der Position, an der eine erfassbare Eigenschaft gemessen ist. Man kann die gesamte Tiefe (Diffusionsrichtung) des Strömungskanals überwachen, um die Positionen jedes Analyt-Erfassungsbereichs zu identifizieren. Zum Beispiel liefert ein Detektor mit einem linearen Diodenfeld eine optische Intensität (erfassbare Eigenschaft) als eine Funktion einer Position in der Diffusionsrichtung (Kanaltiefe). Alternativ ermöglicht eine Kamera in Form einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (Charge Coupled Device – CCD) dem Benutzer, einen Vergrößerungsbereich auszuwählen, so dass die gesamte Tiefe (Diffusionsrichtung) des Strömungskanals, einschließlich der Kanten, überwacht werden kann.

Die Erfassungseinrichtung kann stationär sein, während die Vorrichtung dieser Erfindung (den Strömungskanal aufweisend) mobil ist, und Messungen werden vorgenommen, wenn die Vorrichtung bewegt wird, vorzugsweise automatisch, und zwar in Bezug auf die Erfassungseinrichtung. Alternativ ist die Erfassungseinrichtung mobil, die Vorrichtung ist stationär und die Messungen werden vorgenommen, wenn sich die Erfassungseinrichtung in Bezug auf die Vorrichtung bewegt.

Wie vorstehend diskutiert ist, umfassen die Verfahren dieser Erfindung ein Führen einer Probe und von Referenzströmungen in einem laminaren Fluss in einem Strömungskanal mit einer Indikatorströmung und Erfassen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration des Analyts und der Referenz-Partikel in der Indikatorströmung. Die Verfahren können auch umfassen:

Messen einer erfassbaren Eigenschaft in einem Proben-Analyt-Erfassungsbereich, um dadurch einen Probenwert zu erhalten;

Messen der erfassbaren Eigenschaft in einem Referenz-Analyt-Erfassungsbereich, um dadurch einen Referenzwert zu erhalten;

wenn die Referenzströmung eine interne Standardströmung ist, Korrigieren der experimentellen Bedingungen durch Bestimmen des Verhältnisses zwischen dem Probenwert und dem Referenzwert, und wenn die Referenzströmung eine Kontrollströmung ist, Bestimmen der Konstanz des Referenz-Partikel-Werts über die Zeit.

Das Verfahren kann alternativ, oder zusätzlich, irgendeinen der folgenden Schritte umfassen:

wenn die Referenzströmung eine interne Standardströmung ist, Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der internen Standardströmung, um dadurch einen internen Standard-Hintergrund-Wert zu erhalten;

wenn die Referenzströmung eine Kontrollströmung ist, Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der Kontrollströmung, um dadurch einen Kontroll-Hintergrund-Wert zu erhalten;

Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der Probenströmung, um dadurch einen Proben-Hintergrund-Wert zu erhalten;

Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der Indikatorströmung in einem Bereich der Indikatorströmung, wo im Wesentlichen keine Analyt-Partikel dort hinein diffundiert sind, um dadurch einen Indikator-Hintergrund-Wert zu erhalten;

Korrigieren der experimentellen Bedingungen (Verbesserung der Genauigkeit des gemessenen Werts der Probe eines Analyts) unter Durchführen von mathematischen Operationen, die unter den folgenden ausgewählt sind:

  • i) Subtrahieren des Proben-Hintergrund-Werts von dem Probenwert, und dann Dividieren dieses Werts durch den Referenzwert minus dem Referenz-Hintergrund-Wert;
  • ii) Teilen des Quotienten von Schritt i) durch den Indikator-Hintergrund-Wert; oder
  • iii) Subtrahieren des Indikator-Hintergrund-Werts von dem Probenwert, und dann Teilen dieses Werts durch den Referenzwert minus des Indikator-Hintergrund-Werts.

Wie leicht durch Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird, sind Variationen in Bezug auf die mathematischen Operationen, durchgeführt in Bezug auf die Werte, bestimmt durch Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung, möglich und fallen innerhalb des Schutzumfangs und des Gedankens dieser Erfindung.

Die Strömungsgeschwindigkeit der Eingangsströmungen (Strömungen, eingeführt in die Vorrichtung) liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05 und ungefähr 50 mm/sec. Ohne den Wunsch, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass es in einigen Fällen bevorzugt für die Proben- und Indikatorströmungen ist, unter unterschiedlichen Raten zu strömen. Zum Beispiel ist, in Fällen einer geringen Testempfindlichkeit, wo die Probe eine sehr niedrige Konzentration eines Analyts enthält und/oder die erfassbare Eigenschaft selbst klein ist, z. B. ein niedriges Fluoreszenz-Quantenfeld, falls die Indikatorströmung langsamer als die Probenströmung fließt, dann die Indikator-Substanz in der Indikatorströmung effektiv durch eine größere Anzahl von Analyt-Partikel für eine längere Zeitperiode umgeben, d. h. jedes Indikator-Substanz-Molekül „sieht" mehr Analyt-Partikel, da sich die letzteren langsamer hinter die ersteren bewegen. So ist es, in diesen Fällen, bevorzugt, Proben- und Referenzströmungen, die durch denselben Motor gepumpt sind, und die Indikatorströmung, die durch einen unterschiedlichen Motor gepumpt ist, zu haben.

Die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung ermöglichen eine Bestimmung der Viskosität einer Probenströmung durch Erfassen der Position innerhalb des laminaren Strömungskanals von Analyt-Partikel von der Probenströmung, die in die Indikatorströmung hinein diffundieren, was eine erfassbare Änderung in der Indikatorströmung oder in einer Indikator-Substanz in der Indikatorströmung verursacht. Wie durch Fachleute verständlich werden wird, kann die Viskosität von Fluiden geändert werden, z. B. durch Hinzugabe von Polymeren mit hohem Molekulargewicht, wie beispielsweise Dextran mit hohem Molekulargewicht. Ein Ändern der Viskosität von Fluiden ändert die Geschwindigkeit, unter der sie unter einem gegebenen Druck fließen.

Das Verfahren einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Verwendung einer Indikator-Substanz, die auf einem teilchenförmigen Substrat immobilisiert ist, getragen innerhalb der Indikatorströmung, wie dies vorstehend beschrieben ist. Die Partikel-Substanz ist groß genug, dass deren Diffusion aus der Indikatorströmung hinaus vernachlässigbar ist, d. h. sie verursacht keine erfassbare Änderung in der Eigenschaft, die gemessen wird. Die Indikator-Substanz ist vorzugsweise eine Substanz, die sich in der Fluoreszenz oder der Farbe beim Vorhandensein von Analyt-Partikel, wie beispielsweise einem Farbstoff, Enzymen und anderen organischen Molekülen, die Eigenschaften als eine Funktion einer Analyt-Konzentration ändern, ändert. Der Ausdruck „Indikator-Substanz" wird auch dazu verwendet, auf polymere Kügelchen, Antikörper, oder dergleichen, Bezug zu nehmen, die Farbstoffe oder andere Indikatoren, die darauf immobilisiert sind, haben. Es ist nicht notwendig, dass die Indikatorströmung eine Indikator-Substanz aufweist, wenn Erfassungseinrichtungen, wie solche, die direkt elektrische, chemische oder andere Änderungen in der Indikatorströmung, verursacht durch die Analyt-Partikel, aufweisen, verwendet werden.

Vorteile dieses Systems umfassen die Tatsache, dass Analyte in getrübten und stark gefärbten Lösungen, wie beispielsweise Blut, optisch ohne das Erfordernis nach einem vorherigen Filtern oder einer Zentrifugation bestimmt werden können. Querempfindlichkeiten von Indikator-Farbstoffen zu größeren Proben-Komponenten (dies war ein übliches Problem) können vermieden werden, da die größeren Partikel nicht in die Indikatorströmung in der Zeit hinein diffundieren, während die Strömungen in Kontakt stehen, und demzufolge beeinflussen sie nicht eine Erfassung des Analyts. Alternativ können solche Querempfindlichkeiten durch Referenzströmungen (interne Standards) berücksichtigt werden. Ein anderer Vorteil der Vorrichtung und des Verfahrens dieser Erfindung ist derjenige, dass, aufgrund der geringen Tiefen (Diffusionsrichtung) der Strömungskanäle, die Analyt-Partikel sehr kurze Wege durchlaufen, bevor eine Messung vorgenommen werden kann, um dadurch zu ermöglichen, dass Messungen in einer kurzen Zeit vorgenommen werden können.

Der Indikator kann in einer Lösung gehalten werden, in der er seine optimalen Charakteristika anzeigt (z. B. Querempfindlichkeiten zu einem pH oder ionische Stärke können unter Verwendung von stark gepufferten Lösungen unterdrückt werden). Zusätzlich kann der Strömungskanal tief sein, was es einfach macht, die Indikator-Fluoreszenz mit einfachen Optiken zu messen. Keine Membran(e), die Probe- und Indikator- und Referenzströmungen separieren, werden benötigt; das System ist weniger anfälliger auf ein Biofaulen und Verstopfen als Membran-Systeme. Das System ist auch dahingehend abstimmbar, dass Proben- Referenz- oder Indikatorströmung-Konzentrationen und/oder Flussraten variiert werden können, um das Signal, das erfasst werden soll, zu optimieren. Zum Beispiel kann, falls eine Reaktion zwischen einem Analyt in einer Probe oder einer Referenzströmung und einem Reagenz in einer Indikatorströmung eine erfassbare Eigenschaft nach ungefähr fünf Sekunden ergibt, das System so eingestellt werden, dass das Reaktions-Produkt in dem zentralen Bereich der Vorrichtung erfasst werden wird.

Das Verfahren kann durch ein kontinuierliches Durchfließen lassen einer Proben-, Referenz- und Indikatorströmung durchgeführt werden. Die bereitschaftsmäßige Art dieses Verfahrens macht längere Signal-Integrationszeiten möglich.

Vorrichtungen dieser Erfindung können durch Mikro-Herstellverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, z. B. so, wie dies hier beispielhaft hier angegeben ist, ein Verfahren, das ein Bilden von Kanälen in einem Silizium-Mikrochip, wie beispielsweise durch Ätzen von Nuten in die Oberfläche des Silizium-Mikrochips hinein und Platzieren einer optisch transparenten Abdeckung, z. B. Glas, über der Oberfläche, aufweist (Brody, J. P., und Yager, P. „Low Reynolds Number Micro-Fluidic Devices" Solid State Sensor and Actuator Workshop, Hilton Head, SC Juni 2–6, 1996). Präzisionsspritzgegossene Kunststoffe können auch zur Herstellung verwendet werden. Ein Deckel, vorzugsweise aus einem optisch klaren Material, wie beispielsweise eine Glas- oder Silicon-Gummiplatte, wird auf dem geätzten Substrat abgedichtet. Andere Einrichtungen zum Herstellen der Vorrichtungen dieser Erfindung umfassen die Verwendung von Silizium-Strukturen oder anderen Materialien als eine Maske bzw. Schablone zum Formen oder Mikrobearbeiten der Vorrichtung in Kunststoff, und andere Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Präzisionsspritzgegossene Kunststoffe, um die Vorrichtungen zu bilden, können auch verwendet werden. Mikro-Herstelltechniken sind im Stand der Technik bekannt, und werden insbesondere nachfolgend beschrieben.

Die Vorrichtungen dieser Erfindung sind vorzugsweise mikro-hergestellte Vorrichtungen. Der Ausdruck „mikro-hergestellt" bezieht sich auf Vorrichtungen, die dazu geeignet sind, auf Silizium-Wafer, die leicht von Fachleuten, die die Mikrofertigung von Silizium praktizieren, erhältlich sind, hergestellt zu werden, und haben die Merkmale, die Größen und die Geometrien, die sich durch solche Verfahren, wie beispielsweise LIGA, thermoplastisches Mikromuster-Transfer, auf Harz basierendes Mikrogießen, Mikroformen in Kapillaren (MIMIC), nass-isotropes und anisotropes Ätzen, Laser unterstütztes, chemisches Ätzen (LACE) und reaktives Ionenätzen (RIE), oder andere Techniken, die innerhalb des Stands der Technik der Mikroherstellung bekannt sind, ergeben. In dem Fall einer Silizium-Mikroherstellung, werden größere Wafer eine Mehrzahl von Vorrichtungen dieser Erfindung in einer Mehrzahl von Konfigurationen aufnehmen. Ein paar Standard-Wafer-Größen sind 76,2 mm, 101,6 mm, 152,4 mm und 203,2 mm (3'', 4'', 6'' und 8''). Die Anwendung der Prinzipien, die hier angegeben sind, unter Verwendung von neuen und entstehenden Mikroherstellverfahren, liegen innerhalb des Schutzumfangs und des Gedankens der Ansprüche.

Die Vorrichtungen dieser Erfindung und die Kanäle hier können so dimensioniert werden, wie sich dies durch die Größe der Partikel, in Bezug auf die es erwünscht ist, dass sie erfasst werden, ergibt. Wie im Stand der Technik bekannt ist, ist der Diffusionskoeffizient für die Analyt-Partikel umgekehrt zu der Größe des Partikels in Bezug gesetzt und ist demzufolge im Wesentlichen linear zu der Größe des Partikels in Bezug gesetzt. Wenn einmal der Diffusionskoeffizient für die Partikel, in Bezug auf die es erwünscht ist, dass sie erfasst werden sollen, bekannt ist, können die Kontaktzeit der zwei Strömungen, die Größe des zentralen Strömungskanals, die relativen Volumina der Strömungen, Druck und Geschwindigkeiten der Strömungen eingestellt werden, um das erwünschte Diffusions-Muster zu erreichen.

Ein fluid-dynamisches Verhalten ist zu der Reynold'schen Zahl der Strömung direkt in Bezug gesetzt. Bei Mikrohergestellten Vorrichtungen variiert, falls die Geschwindigkeit mit der Kanallänge abnimmt (wobei die Vorrichtung dahingehend angenommen wird, dass sie in einer festgelegten Zeit unter allen Maßstäben arbeitet), dann die Reynold'sche Zahl im Verhältnis zu dem Quadrat der Länge.

Die Reynold'sche Zahl ist das Verhältnis der Trägheitskräfte zu viskosen Kräften. Wenn die Reynold'sche Zahl verringert wird, hängen die Strömungs-Muster mehr von viskosen Effekten und weniger von Trägheitseftekten ab. Unterhalb einer bestimmten Reynold'schen Zahl, z. B. ungefähr 1 (basierend auf einer Lumen-Größe eines Systems von Kanälen mit Biegungen und Lumen-Größen-Änderungen), können Trägheitseffekte im Wesentlichen ignoriert werden. Die mikrogefertigten Vorrichtungen dieser Erfindung erfordern keine Trägheitseffekte, um deren Aufgaben durchzuführen, und besitzen deshalb keine ihnen eigene Grenze in Bezug auf deren Miniaturisierung aufgrund der Effekte der Reynold'schen Zahl. Vorrichtungs-Designgestaltungen des Anmelders arbeiten, während sie sich wesentlich von früher angegebenen Designgestaltungen unterscheiden, in diesem Bereich. Diese Mikrohergestellten Vorrichtungen dieser Erfindung erfordern eine laminare, nicht turbulente Strömung und sind entsprechend den vorstehenden Prinzipien ausgelegt, um Strömungen zu erzeugen, die niedrige, Reynold'sche Zahlen haben.

Die Vorrichtungen der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung sind dazu geeignet, eine Probe mit einer Größe zwischen ungefähr 0,01 Mikrolitern und ungefähr 20 Mikrolitern innerhalb von ein paar Sekunden, z. B. innerhalb ungefähr drei Sekunden, zu analysieren. Sie können auch wieder verwendet werden. Ein Verstopfen wird minimiert und ist reversibel. Ein Kanal mit den Dimensionen von 400 &mgr;m (Tiefe) mal 50 &mgr;m (Breite), mit Fluiden, die unter einer Geschwindigkeit von 100 nL/s, zum Beispiel, fließen, zeigen eine Reynold'sche Zahl (Re = plv/&eegr;) von 0,2, so dass das Fluid in einem Bereich vorliegt, wo eine Viskosität gegenüber einer Trägheitskraft dominiert.

Durch Einstellen der Konfiguration der Kanäle entsprechend den Prinzipien, die vorstehend diskutiert sind, um eine geeignete Kanallänge, Strömungsgeschwindigkeit und Kontaktzeit zwischen den Proben-Referenz- und/oder Kalibrierungsströmungen und den Indikatorströmungen zu erreichen, kann die Größe der Partikel, die in der Probenströmung verbleiben und in die Indikatorströmung hinein diffundieren, kontrolliert werden. Die Kontaktzeit, die erforderlich ist, kann als eine Funktion des Diffusionskoeffizienten des Partikels D und des Abstands d, über den das Partikel mit 2t = d2/D diffundieren muss, berechnet werden. Partikel oder Moleküle, die Diffusionskoeffizienten größer als D haben, werden in die Indikatorströmung hinein diffundieren, und Partikel oder Moleküle, die einen Diffusionskoeffizienten im Wesentlichen kleiner als D haben, werden dies nicht tun. Falls der Diffusionskoeffizient der größeren Partikel ungefähr zehnmal kleiner als D ist, sollte die Indikatorströmung vollständig frei von den großen Partikel sein.

In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung besitzen Kanäle dieser Erfindung hydrophile Oberflächen, um eine Strömung von Flüssigkeit darin zu erleichtern und einen Betrieb der Vorrichtung um die Notwendigkeit einer unter Drucksetzung zu ermöglichen. Das Substrat kann so behandelt sein, um Oberflächenbenetzungseigenschaften durch Mittel, die im Stand der Technik bekannt sind, der Herstellung der Kanäle folgend, zu erhöhen, um sie hydrophil zu gestalten. Der Deckel kann auch so behandelt werden, um ihn hydrophil zu gestalten.

Einrichtungen, um Druck auf die Strömung der fluiden Strömungen über die Vorrichtung aufzubringen, können an den Einlassöffnungen und/oder dem Auslass (z. B. als Vakuum, ausgeübt durch chemische oder mechanische Mittel) vorgesehen sein. Einrichtungen, um einen solchen Druck aufzubringen, sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel so, wie dies in Shoji, S., und Esashi, M. (1994), „Microflow devices and Systems", J. Micromechanics and Microengineering, 4: 157–171, beschrieben sind, und umfassen die Verwendung einer Wassersäule oder anderer Mittel eines Aufbringens von Wasserdruck, elektroendoosmotischen Kräften, optischen Kräften, Gravitationskräften und Oberflächenspannungskräften. Drücke von ungefähr 0,07 N/m2 (10–6 psi) bis ungefähr 70.000 N/m2 (10 psi) können verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von den Erfordernissen des Systems. Vorzugsweise wird ungefähr 7 N/m2 (10–3 psi) verwendet. Die bevorzugtesten Drücke liegen zwischen ungefähr 20 N/m2 und ungefähr 1.000 N/m2 (ungefähr 2 mm und ungefähr 100 mm eines Wasserdrucks).

Die Größe des Druckabfalls, die benötigt wird, um eine durchschnittliche Geschwindigkeit, v, eines Fluids mit einer absoluten Viskosität, n, und einer Dichte, p, durch einen kreisförmigen Kanal (Länge, l, Durchmesser, d) zu erhalten, kann aus dem Poiseuille'schen Gesetz (Batchelor, G. K., An Introduction to Fluid Dynamics, Cambridge Univ. Press 1967) berechnet werden:

Unter Verwendung von v = 100 &mgr;m/sec und d = 100 &mgr;m erhält man einen Druckabfall äquivalent zu ungefähr 3 N/m2 (0,3 mm an H2O) pro cm einer Kanallänge. Die Poiseuille'sche Gleichung ist nur streng für kreisförmige Strömungskanäle gültig. Die Kanäle dieser Erfindung können Querschnitte von verschiedenen Formen haben, z. B. keilförmig und im Wesentlichen rechteckig, zusätzlich zu kreisförmig. Demzufolge kann, in Ausführungsformen ohne nicht kreisförmige Querschnitte, die Poiseuille'sche Gleichung nur als eine ungefähre Beziehung zwischen den Variablen, die dargestellt sind, angesehen werden.

Wenn eine Flüssigkeit in eine Vorrichtung eingeführt wird, ist dort zuerst ein effektiver Druck, Peff = P0 + Pst, gleich zu der Summe des angelegten Drucks, P0, und einem Druck aufgrund der Oberflächenspannung, vorhanden:

Pst ist eine Funktion der Oberflächenspannung des Fluids, &ggr;, des Kontaktwinkels des Fluids mit der Oberfläche, &THgr;, und des Krümmungsradius der Fluid-Oberfläche, r.

Für hydrophile Oberflächen ist cos &THgr; nahezu 1, und für kleine Kanäle wird kein angelegter Druck benötigt, um die Vorrichtung zu benetzen. Dies wird als „Benetzung durch kapillare Wirkung" bezeichnet. Allerdings muss man, wenn die Vorrichtung einmal vollständig benetzt ist, die Oberflächenspannung an dem Austrittsbereich betrachten. In der Vorrichtung, die in dem Beispiel hier beschrieben ist, war der Krümmungsradius des Fluids in dem Ausgangsbereich mehrere Millimeter, so dass der Druck aufgrund der Oberflächenspannung vernachlässigbar war.

Mit einer Kanaltiefe von 100 &mgr;m ist Pst ungefähr 1 cm an H2O, so dass eine Oberflächenspannung an der Ausgangs-Öffnung wesentlich ist. Allerdings bedeutet, unter Verwendung eines Ätzmittels, wie beispielsweise EPW F-Etch, wie dies nachfolgend beschrieben ist, das {100} Ebenen von Silizium angreift, dies, dass die Ecken, wenn sie geätzt sind, nicht so schart sind, wie dies in den Figuren dargestellt ist. Dies führt zu einer graduellen Erweiterung des Kanals auf ungefähr 1 mm, was den Effekt der Oberflächenspannung verringert.

Wie in 1 dargestellt ist, ist eine Vorrichtung dieser Erfindung in der Form eines „✝" vorgesehen, bezeichnet hier als ein Referenz-T-Sensor 10. Die Vorrichtung kann zum Beispiel durch Ätzen auf einem Silizium-Mikrochip oder durch Mikrobearbeitung von Kunststoff mikro-hergestellt werden. Die Geometrie muss nicht notwendigerweise ein „✝" oder ein „&psgr;" sein. Irgendwelche Winkel zwischen den Kanälen, die hergestellt werden können, werden auch ausreichen, so lange wie eine laminare Strömung beibehalten wird. Wie vorstehend diskutiert ist, kann eine Vielzahl von Eingangs-Kanälen vorhanden sein. In dieser Ausführungsform ist es nur notwendig, dass sich alle Eingangs-Kanäle in einen einzelnen Strömungskanal vereinigen, und alle Kanäle ausreichend klein sind, dass eine laminare Strömung (Reynold'sche Zahl geringer als ungefähr 1) für alle Betriebszustände beibehalten wird. Die Probe, die kleine Partikel, die von Interesse sind, die Probenströmung 80, enthält, wird in die Vorrichtung über die Probenströmung-Einlassöffnung 30 eingebracht, von wo aus sie in den Probenströmung-Einlasskanal 50 hineinfließt. Eine Indikatorströmung 70 wird in eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 gebracht, von wo aus sie in den Indikatorströmung-Einlasskanal 40 fließt. Eine Referenzströmung 75 wird in einen Referenzströmung-Einlassöffnung 25 hineingebracht. Eine Erfassungseinrichtung 150 ist relativ zu dem Strömungskanal, z. B. oberhalb oder unterhalb des Kanals, positioniert, so dass sie eine erfassbare Eigenschaft, z. B. Fluoreszenz oder Absorptionsvermögen, erfassen kann.

Probenströmung 80, Referenzströmung 75 und Indikatorströmung 70 treffen sich an einem Verbindungspunkt 58 an dem Beginn des Strömungskanals 100, und die drei Strömungen fließen in eine parallele, angrenzende, laminare Strömung zu der Auslassöffnung 60 an dem Ende des Strömungskanals 100. Die Indikatorströmung 70 enthält eine Indikator-Substanz, wie beispielsweise einen Farbstoff, der mit Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 und der Referenzströmung 75 reagiert, was eine erfassbare Änderung in den physikalischen Eigenschaften hervorruft. Die Indikatorströmung 70 ist durch eine horizontale Schraffierung dargestellt, wogegen die Probenströmung 80 und die Referenzströmung 75 durch eine diagonale Schraffierung in entgegengesetzten Richtungen in 1 dargestellt sind. Aufgrund der niedrigen Reynold'schen Zahl in dem kleinen Strömungskanal 100 tritt keine durch eine Turbulenz induzierte Mischung auf und die drei Strömungen fließen parallel zueinander ohne Mischen. Allerdings wirkt eine Diffusion senkrecht zu der Strömungs-Richtung, das bedeutet senkrecht zu der Länge (y-Koordinate), so dass Analyt-Partikel in der Probenströmung und in der Referenzströmung nach rechts und links, jeweils, in die Indikatorströmung 70 diffundieren, und können schließlich gleichförmig über die Breite des Strömungskanals 100 an einem gleichförmigen Analyt-Partikel-Diffusionsbereich 120 verteilt werden.

Die Indikatorströmung 70 fließt in den Strömungskanal 100 hinein, um einen Anfangs-Referenzbereich 85 zu bilden, in den hinein Analyt-Partikel bis jetzt noch nicht diffundiert sind. Analyt-Partikel von der Probenströmung 80, die in die Indikatorströmung 70 hinein diffundieren, bilden einen Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140, wo Analyt-Partikel eine erfassbare Änderung in der Indikatorströmung 70 erzeugen, vorzugsweise durch Verursachen einer erfassbaren Änderung in der Eigenschaft in einer Indikator-Substanz innerhalb der Indikatorströmung 70. Analyt-Partikel von der Referenzströmung 75, die in die Indikatorströmung 70 hinein diffundieren, bilden einen Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145, wo Analyt-Partikel eine erfassbare Änderung in der Indikatorströmung 70 erzeugen. Partikel einer Indikator-Substanz, z. B. Farbstoff-Partikel, können auch in die Probenströmung 80 hinein diffundieren, um einen diffundierten Indikator-Bereich 110 (nicht dargestellt) zu bilden. Falls diese Änderung in einer lokalen Konzentration der Indikator-Substanz ein Problem in einigen Anwendungen ist, kann die Diffusionsrate wahlweise klein durch Immobilisieren auf teilchenförmigen Substanzen, z. B. Polymeren und Reporter-Kügelchen, gemacht werden. Polymere, wie beispielsweise Dextran mit hohem Molekulargewicht, können verwendet werden, um Indikator-Substanzen zu immobilisieren, um dadurch den Diffusionskoeffizienten der Indikator-Substanz zu verringern. Das Molekulargewicht des Polymers beträgt vorzugsweise ungefähr 1.000 bis ungefähr 100.000 g/mol. Eine Immobilisierung einer Indikator-Substanz auf einem Polymer, wie beispielsweise auf einem Dextran mit hohem Molekulargewicht, erhöht auch die Viskosität der Indikatorströmung. Polymere mit hohem Molekulargewicht haften wesentlich unwahrscheinlicher an den Kanalenden als die Kügelchen an, die auch dazu verwendet werden, um Indikator-Substanzen zu immobilisieren.

In dem Referenz-T-Sensor 10 der 1 werden eine Probenströmung 80, z. B. Blut, eine Referenzströmung 75 und eine Indikatorströmung 70, einen Indikator-Farbstoff enthaltend, an dem Knotenpunkt des Probenströmung-Einlasskanals 50, dem Referenzströmung-Einlasskanals 55 und dem Indikatorströmung-Einlasskanals 40 vereinigt, wobei der Strömungskanal 100 (d. h. der Verbindungspunkt 58) und die Strömung laminar am nächsten zueinander in dem Strömungskanal 100 fließen, bis sie die Struktur an der Auslassöffnung 60 verlassen. Kleine Ionen, wie beispielsweise H+ und Na+, diffundieren schnell über den Durchmesser des Strömungskanals 100, wogegen größere Ionen, wie beispielsweise ein Farbstoff-Anion, nur langsam diffundieren. Größere Partikel, wie beispielsweise Zucker, Proteine, und dergleichen, zeigen keine wesentliche Diffusion innerhalb der Zeit, zu der die Indikatorströmung 70, die Referenzströmung 75 und die Probenströmung 80 in Kontakt zueinander stehen. Die kleineren Proben-Komponenten diffundieren schneller und würden näher zu dem Verbindungspunkt 58, als dies größere Komponenten tun, ins Gleichgewicht treten, was weiterhin in Strömungskanälen 100 in Ausführungsformen mit Strömungskanälen lang genug, oder Strömungsraten, langsam genug, um deren Ausgleich zu ermöglichen, ins Gleichgewicht versetzen würden. Wenn die Diffusion bis zu dem Kanal fortschreitet, werden ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 und ein Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145 gebildet.

Die Analyt-Erfassungsbereiche 140 und 145 können so groß wie notwendig sein, um ein erfassbares Indikator-Signal zu liefern. Ein ähnlicher Referenzbereich 85 kann so gestaltet werden, dass er so groß wie notwendig sein wird, um einen erfassbaren Referenz-Hintergrund-Wert zu liefern. Einstellungen dieser Bereiche werden so vorgenommen, wie dies hier beschrieben ist, basierend auf den Diffusionskoeffizienten des Analyts und der Indikator-Substanz, den Strömungsraten und den Kanalgrößen.

Das Vorhandensein oder die Konzentration eines Analyts, der in einer Probenströmung von Interesse ist, kann durch Vergleichen des gemessenen Werts (Probenwert) der Probenströmung einer erfassbaren Eigenschaft, z. B. sichtbares Absorptionsvermögen bei einer bestimmten Wellenlänge, zu dem gemessenen Wert einer Kalibrierungsströmung, einer Kontrollströmung oder einer internen Standardströmung (Referenzwert), bestimmt werden. Durch Überwachen der Referenzströmung gleichzeitig mit der Abtastströmung und in demselben Strömungskanal wie diese, werden die Referenzströmung und die Abtastströmung denselben experimentellen Bedingungen, einschließlich solchen Bedingungen, die zu einer verringerten Genauigkeit des gemessenen Werts in der Probe führen könnten, zum Beispiel eine Fluktuation in der Intensität der Lichtquelle, unterworfen. Sowohl die Probenströmung als auch die Referenzströmung werden denselben Bedingungen ausgesetzt; deshalb werden die Effekte dieser beeinträchtigenden Bedingungen korrigiert (heraus subtrahiert).

2 stellt eine Vorrichtung dieser Erfindung dar, bei der zwei Indikatorströmungen 70A und 70B in einen Strömungskanal 100 von einer gemeinsam (geteilten) Einlassöffnung 20 der Indikatorströmung fließen, um dadurch zu zwei laminaren Strömungen (derselben) Indikatorströmung 70A und 70B zu führen, beide angrenzend zu der Probenströmung 80. Die Indikatorströmungen 70A und 70B und die Probenströmung 80 sind durch diagonale und horizontale Schraffierung, jeweils, dargestellt, wogegen die Referenzströmungen 75A und 75B anhand von Linien (ähnlich eines quer liegenden „S") und einer quer liegenden „8", jeweils, in 2, dargestellt sind. Die Probenströmung 80 enthält kleine Moleküle, die von Interesse sind, und wird in die Vorrichtung über die Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht, von wo aus sie in den Probenströmung-Einlasskanal 50 fließt. Die Indikatorströmungen 70A und 70B werden in die Einlassöffnung 20 für die Indikatorströmung gebracht, von wo aus sie in die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40A und 40B fließen. Zwei Referenzströmungen 75A und 75B werden in die Einlassöffnungen 25A und 25B der Referenzströmung, jeweils, gebracht. Die Referenzströmungen 75A und 75B können von derselben oder von einer unterschiedlichen Zusammensetzung sein, z. B. eine kann eine hohe Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, enthalten, und die andere kann eine niedrige Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, enthalten. Ein Detektor (nicht dargestellt in 2) ist relativ zu dem Strömungskanal positioniert, z. B. oberhalb oder unterhalb des Kanals, so dass er eine erfassbare Eigenschaft, z. B. eine Fluoreszenz oder ein Absorptionsvermögen, erfassen kann.

Die Probenströmung 80, die Referenzströmungen 75A und 75B und die Indikatorströmungen 70A und 70B treffen sich an einem Verbindungspunkt 58 an dem Beginn des Strömungskanals 100, und die fünf Strömungen fließen in einer parallelen, laminaren Strömung zu einer Auslassöffnung 60. Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 und Referenzströmungen 75A und 75B diffundieren in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein. Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 diffundieren nach links und nach rechts (senkrecht zu der Richtung der Strömung) in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein, um Proben-Analyt-Erfassungsbereiche 140A und 140B (dargestellt in 2 durch „X") zu bilden. Analyt-Partikel in der Referenzströmung 75A diffundieren nach rechts (senkrecht zu der Richtung der Strömung) in die Indikatorströmung 70A hinein, um einen Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145A (dargestellt in 2 durch Kreise) zu bilden. Analyt-Partikel in der Referenzströmung 75B diffundieren nach links (senkrecht zu der Strömungsrichtung) in die Indikatorströmung 70B hinein, um einen Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145B (dargestellt in 2 durch Dreiecke) zu bilden. Durch Einstellen der Strömungsrate und der Strömungskanallänge kann ein Gleichgewicht der Diffusion erreicht werden.

Die Vorrichtung in 2 dient für zwei Referenzströmungen so, dass sie laminar innerhalb der Probenströmung fließen. Zum Beispiel kann eine Referenzströmung eine interne Standardströmung sein, die eine bekannte oder „geschätzte" Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, enthält. Der gemessene Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Probe (Probenwert), oder vorzugsweise eine Mehrzahl von Proben, wird durch den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft für einen internen Standard (interner Standard-Wert) dividiert. Der interne Standard-Wert wirkt dahingehend, experimentelle Bedingungen zu korrigieren (heraus zu subtrahieren), die ansonsten die Genauigkeit der gemessenen Werte herabsetzen würden. Die andere Referenzströmung kann eine Kontrollströmung sein, die auch eine bekannte oder abgeschätzte Konzentration des Analyts, der von Interesse ist, enthält, und ist ansonsten identisch zu der Probe. Die Kontrolle dient als eine (Qualitätskontrolle) Prüfung der bestimmten Konzentration des Analyts in der Probe. Sowohl der gemessene Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Probe (Probenwert) als auch für die Kontrolle (Kontroll-Wert) werden durch den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft für den internen Standard (interner Standard-Wert) dividiert. Die bestimmte Konzentration des Analyts in der Probe, erhalten aus dem gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Probe (Probenwert), sollte mit dem gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Kontrolle übereinstimmen, d. h. sie sollten beide eine minimale und ähnliche Abweichung von der Kalibrierungs-Kurve haben. Wie für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird, kann, falls mehr als ein interner Standard verwendet wird, eine desto kompliziertere, mathematische Operation in Bezug auf die Daten, erhalten durch die Vorrichtung und das Verfahren dieser Erfindung, durchgeführt werden, um die Genauigkeit der bestimmten Konzentration des Analyts in einer Probe zu verbessern.

3 stellt eine andere Ausführungsform der Vorrichtung dieser Erfindung dar, wobei zwei Indikatorströmungen 70A und 70B in einer laminaren Strömung angrenzend an die Probenströmung 80 fließen. Die Indikatorströmungen 70A und 70B sind durch diagonale Schraffierung dargestellt, wogegen die Referenzströmungen 75A und 75B und die Probenströmung 80 durch horizontale Schraffierungen dargestellt sind, ungleichmäßig und gleichmäßig, jeweils, beabstandet. Die Probenströmung 80 enthält kleine Partikel, die von Interesse sind, und wird in die Vorrichtung über die Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht, von wo aus sie in den Probenströmung-Einlasskanal 50 und dann in den Strömungskanal 100 fließt. Indikatorströmungen 70A und 70B werden in die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20A und 20B, jeweils, gebracht, von wo aus sie in die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40A und 40B, jeweils, und dann in den Strömungskanal 100 fließen. Zwei Referenzströmungen 75A und 75B (derselben Zusammensetzung in diesem Beispiel) werden in die Referenzströmung-Einlassöffnungen 25A und 25B, jeweils, gebracht. Von den Referenzströmung-Einlassöffnungen 25A und 25B fließen die zwei Referenzströmungen 75a und 75B in die Referenzströmung-Einlasskanäle 55A und 55B und dann in den Strömungskanal 100. Ein Detektor (nicht dargestellt in 3) ist relativ zu dem Strömungskanal so positioniert, dass er eine erfassbare Eigenschaft erfassen kann.

Die Probenströmung 80, die Referenzströmungen 75A und 75B und die Indikatorströmungen 70A und 70B treffen sich an einem Übergangspunkt 58 in dem Strömungskanal 100, und die fünf Strömungen fließen in einer parallelen, laminaren Strömung zu der Auslassöffnung 60. Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 und in den Referenzströmungen 75A und 75B diffundieren in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein. Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 diffundieren nach links und nach rechts in die Indikatorströmungen 70A und 70B, jeweils, hinein, um Proben-Analyt-Erfassungsbereiche 140A und 140B (dargestellt in 3 durch Kreise und Dreiecke, jeweils) zu bilden. Analyt-Partikel in den Referenzströmungen 75A und 75B diffundieren nach rechts und nach links, jeweils, in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein, um Referenz-Analyt-Erfassungsbereiche 145A und 145B (dargestellt in 3 durch Quadrate und „x", jeweils) zu bilden. In dieser Ausführungsform kann wie in der einen in 2, durch Einstellen einer Strömungsrate und einer Strömungskanalgröße, ein Gleichgewicht einer Diffusion erreicht werden.

Die Vorrichtung in 3 dient für zwei Indikatorströmungen so, dass sie laminar zu der Probenströmung und den Referenzströmungen fließen. Zum Beispiel kann eine Indikatorströmung ein Indikator für einen Analyt, der von Interesse ist, sein, z. B. ein menschliches Serum Albumin, während die andere Indikatorströmung ein Indikator für einen anderen Analyt, der von Interesse ist, sein kann, z. B. Natriumionen. Referenzströmungen, z. B. Kontrollströmungen, die BC1 und BC3 enthalten (die herkömmlich erhältliche Kontrollen für das gesamte Blut sind die bekannten Konzentrationen von verschiedenen Blutkomponenten, allerdings keine roten und weißen Blutzellen, enthalten, und die von Biorad in Hercules, CA, erhältlich sind), können in einer angrenzenden, laminaren Strömung zu den Indikatorströmungen vorhanden sein.

4A stellt eine Ausführungsform dieser Erfindung dar, bei der eine Mehrzahl von T-Sensor-Vorrichtungen in einer Fluidverbindung miteinander über eine Verteilerleitung 41 stehen. 4 stellt eine Vorrichtung mit acht Strömungskanälen 100 dar, wobei in jede davon 1) eine Indikatorströmung und 2) entweder eine Referenzströmung (in sieben der acht Strömungskanäle) oder eine Probe (in einem der acht Strömungskanäle) fließt. In 4 sind Strömungskanäle 100, Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und Probenströmung-Einlasskanäle 50 nicht schattiert, und befinden sich alle in einer Ebene des Substrats, z. B. falls das Substrat Silizium ist, ist der Wafer bis zu derselben Tiefe für alle diese Elemente geätzt. Eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20, eine Verteilerleitung 41 und Indikatorströmung-Einlasskanäle 40 sind schraffiert (diagonal schraffiert) und befinden sich in derselben Ebene zueinander, allerdings ist einer davon unterschiedlich gegenüber der ersten Ebene, die die Strömungskanäle enthält. Diese Ausführungsform kann durch Ätzen von Strömungskanälen 100, von Referenzströmung-Einlasskanälen 55 und einem Probenströmung-Einlasskanal 50 von einer Seite/Fläche des Substrats aus hergestellt werden, z. B. ein Silizium-Wafer und die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20, die Verteilerleitung 41 und die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40 von der anderen Seite/Fläche des Substrats (Silizium-Wafer) aus. Durchgangslöcher 88 verbinden die Kanäle 100, 55 und 50, geätzt auf einer Seite des Substrats, mit den Kanälen (40 und 41), geätzt auf der anderen Seite des Substrats. Die Verbindung erfolgt spezifisch über T-Verbindungen 59 mit dem Indikatorströmung-Einlasskanal 40. Eine transparente Abdeckung ist an beiden Seiten/Flächen des Substrats abgedichtet. Löcher sind in den transparenten Abdeckungen gebildet, um einen Zugang zu den Öffnungen zu schaffen, oder die Abdeckungen sind so positioniert, dass sie nicht die Öffnungen abdecken. Ein oder mehrere Detektoren) ist(sind) relativ zu den Strömungskanälen so positioniert, dass Änderungen in einer erfassbaren Eigenschaft nicht in jedem Strömungskanal erfasst und überwacht werden können.

In dieser Ausführungsform ist eine Mehrzahl (z. B. sieben) von Referenzströmungen in Referenzströmung-Einlassöffnungen 25 gebracht, von wo aus die Strömungen in Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und dann in einen Strömungskanal 100 fließen. Die Probenströmung wird in die Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht, von wo aus die Probenströmung in einen Probenströmung-Einlasskanal 50 und dann in einen Strömungskanal 100, fließt. Jeder Strömungskanal 100 enthält eine Indikatorströmung in einem laminaren Fluss zu entweder einer Referenz- oder einer Probenströmung. Die Strömungen treten über Auslassöffnungen 60 aus. In dieser Ausführungsform ist jeder Strömungskanal 100 mit einem Indikatorströmung-Einlasskanal 40 und entweder einem Referenz-Einlasskanal 55 oder einem Probenströmung-Einlasskanal 50 über eine T-Verbindung 59 verbunden. Jeder Indikatorströmung-Einlasskanal 40 ist mit einer Verteilerleitung 41 verbunden, was ermöglicht, dass eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 mit einer Mehrzahl von Indikatorströmungen in eine Mehrzahl von Strömungskanälen 100 hinein versorgt wird.

4B stellt einen Schnitt der Vorrichtung in 4A dar, d. h. sie stellt die Probenströmung-Einlassöffnung 30, den Probenströmung-Einlasskanal 50, den Strömungskanal 100, in Fluidverbindung damit, und eine Auslassöffnung 60, alle geätzt in einer Ebene von einer Seite eines Silizium-Wafers aus, dar. Auch sind (durch punktierte Linien, die die Ebene hinter der ersteren Ebene anzeigen, und demzufolge von der anderen Seite des Wafers aus geätzt sind) eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 und ein Indikatorströmung-Einlasskanal 40 gezeigt. Der Probenströmung-Einlasskanal 50 ist mit dem Indikatorströmung-Einlasskanal über eine T-Verbindung 59 verbunden, die ein Loch 88 aufweist. Acht solcher Abschnitte sind in einer parallelen Art und Weise in der Vorrichtung in 4A verbunden.

4C zeigt eine Seitenansicht der 4B (4C zeigt, wie die Vorrichtung der 4B um 90 Grad auf einer Achse entlang des Strömungskanals 100 gedreht ist). Die Probenströmung-Einlassöffnung 30 (die sich durch eine erste Seite des Wafer-Substrats erstreckt) und der Probenströmung-Einlasskanal 50 (stärkere Linien) sind näher zu dem Betrachter. Der Strömungskanal 100 und der Indikatorströmung-Einlasskanal 40 befinden sich in einer Ebene, und sind mit einem Probenströmung-Einlasskanal 50 über ein Durchgangsloch 88 verbunden. Die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 (punktierte Linie) erstreckt sich zu der anderen Seite des Wafers.

Die Ausführungsform, die in 4A dargestellt ist, dient für eine gleichzeitige, mehrfache Bezugnahme, während eine Probenströmung läuft und überwacht wird. Dies ist vorteilhaft, da ein Indikator in nur eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 eingeführt werden muss. Eine Erfassungseinrichtung kann verwendet werden, um alle Strömungskanäle 100 zu überwachen. Falls eine stärkere Hervorhebung erwünscht ist, dann kann es bevorzugt sein, mehr als einen Detektor einzusetzen. Alternativ kann die Vorrichtung in einer kontinuierlichen Weise so bewegt werden, dass ein Detektor verwendet werden kann, um viele Strömungskanäle unter einer hohen Hervorhebung bzw. Verstärkung zu erfassen. Allerdings können, da jede Referenz- und Probenströmung in einem unterschiedlichen Strömungskanal vorhanden ist, einige experimentelle Bedingungen, z. B. Differenzen in den Strömungsraten, nicht berücksichtigt werden (heraus subtrahiert werden). In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, die Strömungsgeschwindigkeit und in jedem Strömungskanal zu überwachen, um sicherzustellen, dass kein Verstopfen oder eine Blockade in einem Strömungskanal aufgetreten ist, was zu nicht erwünschten Strömungsgeschwindigkeiten in den anderen Kanälen führen könnte.

Die Ausführungsform, die in 4 dargestellt ist, besitzt die Vorteile, dass dieselbe Lichtquelle, dieselben Elektroniken und Fluide (z. B. Indikator-Lösung) verwendet werden. Variationen in irgendwelchen Punkten davon können zu einer verringerten Genauigkeit der Messungen führen. Weiterhin ermöglichen die mehreren, separaten Einlässe eine akkuratere und unabhängige Kontrolle von Strömungsgeschwindigkeiten der verschiedenen Fluidströmungen.

5 stellt eine Ausführungsform der Vorrichtung dieser Erfindung dar, ähnlich zu derjenigen in 4, mit der Ausnahme, dass keine Verteilerleitung vorhanden ist, die die Einlasskanäle für die Indikatorströmung verbinden. 5 stellt ein Vorrichtung mit acht Strömungskanälen 100 dar, wobei in jeden davon 1) eine Indikatorströmung und 2) entweder eine Referenzströmung (in sechs der acht Strömungskanäle) oder eine Probe (in zwei der acht Strömungskanäle) fließt. In 5 sind Strömungskanäle 100, Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und Probenströmung-Einlasskanäle 50 nicht schraffiert, und sie befinden sich alle in einer Ebene des Substrats, z. B. falls das Substrat Silizium ist, ist der Wafer in dieselbe Tiefe für alle diese Elemente geätzt. Die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 und die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40 sind schraffiert (diagonal schraffiert) und befinden sich in derselben Ebene zueinander, allerdings ist einer unterschiedlich gegenüber der ersten Ebene, die die Strömungskanäle, usw., enthält. Ähnlich zu der Ausführungsform in 4 kann diese Ausführungsform durch Ätzen von Strömungskanälen 100, von Referenzströmung-Einlasskanälen 55 und von Probenströmung-Einlasskanälen 50 von einer Seite/Fläche des Substrats, z. B. eines Silizium-Wafers, und von Indikatorströmung-Einlassöffnungen 20 und der Indikatorströmung-Einlasskanälen 40 von der anderen Seite/Fläche des Substrats (Silizium-Wafers), hergestellt werden. Eine transparente Abdeckung ist an beiden Seiten/Flächen des Substrats abgedichtet aufgebracht. Löcher sind in den transparenten Abdeckungen gebildet, um einen Zugang zu den Öffnungen zu schaffen, oder die Abdeckungen sind so positioniert, dass sie nicht die Öffnungen abdecken. Ähnlich zu der Ausführungsform, die in 4 dargestellt ist, ermöglicht die Ausführungsform, dargestellt in 5, die Überwachung einer Mehrzahl von Strömungskanälen mit einem Detektor (nicht in 5 dargestellt).

In dieser Ausführungsform ist eine Mehrzahl (z. B. sechs) von Referenzströmungen in Referenzströmung-Einlassöffnungen 25 gebracht, von wo aus die Strömungen in Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und dann in einen Strömungskanal 100 fließen. Probenströmungen werden in Probenströmung-Einlassöffnungen 30 gebracht, von wo aus die Probenströmungen in die Probenströmung-Einlasskanäle 50 und dann in einen Strömungskanal 100 fließen. Jeder Strömungskanal 100 enthält eine Indikatorströmung in einem laminaren Fluss mit entweder einer Referenz- oder einer Probenströmung. Die Strömungen treten durch Ausgangs-Öffnungen 60 aus. In dieser Ausführungsform ist jeder Strömungskanal 100 mit einem Indikatorströmung-Einlasskanal 40 und entweder einem Referenz- oder einem Probenströmung-Einlasskanal (55 und 50 jeweils) über eine T-Verbindung 59 und ein Loch 88 verbunden.

6 stellt eine andere Ausführungsform dieser Erfindung dar, wobei Strömungen in Öffnungen eingeführt werden, wie dies beschrieben und vorstehend dargestellt ist, die allerdings verteilende Strömungskanäle 105A und 105B enthalten, die die Einlasskanäle mit dem Strömungskanal 100 verbinden.

In der Ausführungsform, die in 6 dargestellt ist, werden Referenzströmungen 75A und 75B in Referenzströmung-Einlassöffnungen 25A und 25B gebracht, von wo aus die Strömungen in Referenzströmung-Einlasskanäle 55A und 55B, dann in Verteilungsströmungs-Kanäle 105A und 105B und dann in den Strömungskanal 100 fließen. Eine Probenströmung wird in eine Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht, von wo aus die Probenströmung in einen Probenströmung-Einlasskanal 50 und dann in einen Verteilerströmungskanal 105B fließt und dann in den Kanal 100 fließt. Die Indikatorströmungen werden in die Indikatorströmung-Einlassöffnungen 20A und 20B gebracht, von wo aus die Strömungen in die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40A und 40B, dann in Verteilerströmungskanäle 105A und 105B und dann in einen Strömungskanal 100 fließen. Die Strömungen befinden sich in einem laminaren Strom von der Einlassöffnung zu der Auslassöffnung 60. Die Verteilerströmungskanäle 105A und 105B müssen nicht angewinkelt werden, wie dies dargestellt ist, sondern können gerade oder angewinkelt unter unterschiedlichen Winkeln sein, so lange eine laminare Strömung aufrechterhalten wird.

Änderungen in einer erfassbaren Eigenschaft können in beiden Verteilerströmungskanälen 105A und 105B und dem Strömungskanal 100 durch Erfassungs-Vorrichtungen überwacht werden.

Eine Qualitätskontrolle der Strömungsrate kann durch 1) Ausdrücken eines QC-Diagramms (siehe Beispiel 4 nachfolgend) und/oder 2) unter Verwendung einer gemeinsamen, d. h. gemeinsam geteilten, Pumpeinrichtung, um sowohl die Referenzströmung als auch die Probenströmung zu pumpen, durchgeführt werden. Die Indikatorströmung kann auch durch die gemeinsame Pumpeinrichtung in einigen Ausführungsformen gepumpt werden.

7A stellt eine Ausführungsform der Vorrichtung dar, bei der separate Pumpeinrichtungen für jede Eingangsströmung verwendet sind. Eine Pumpeinrichtung 150 pumpt eine Indikatorströmung in den Strömungskanal 100 hinein und entlang von diesem über eine Spritze 165, eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 und einen Indikatorströmung-Einlasskanal 40. Eine Pumpeinrichtung 155 pumpt eine Referenzströmung in den Strömungskanal 100 und entlang von diesem über die Spritze 165, eine Referenzströmung-Einlassöffnung 25 und einen Referenzströmung-Einlasskanal 55. Die Pumpeinrichtung 160 pumpt eine Probenströmung in den Strömungskanal 100 und entlang von diesem über eine Spritze 165, eine Probenströmung-Einlassöffnung 30 und einen Probenströmung-Einlasskanal 50.

7B stellt eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung dar, bei der eine gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung für Proben- und Referenzströmungen verwendet wird. Die gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung 170 pumpt eine Referenzströmung und eine Probenströmung in den Strömungskanal 100 und entlang von diesem. Eine Pumpeinrichtung 150 pumpt eine Indikatorströmung in den Strömungskanal 100 und entlang von diesem.

7C stellt eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung dar, bei der eine gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung für Proben-Indikator- und Referenzströmungen verwendet werden. Die gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung 170 pumpt eine Referenzströmung, eine Indikatorströmung und eine Probenströmung in den Strömungskanal 100 und entlang von diesem.

Die Verwendung einer gemeinsam geteilten Pumpeinrichtung, z. B. eines Motors, stellt sicher, dass jede Strömung, gepumpt durch eine solche Einrichtung, demselben Druck unterworfen wird.

Es kann bevorzugt sein, die Strömungsrate in jedem Einlasskanal so zu überwachen, um sicherzustellen, dass sich kein Hindernis für die Strömung entwickelt hat, z. B. eine Verstopfung, und dass alle Strömungen unter der erwünschten Strömungsrate (den erwünschten Strömungsraten) fließen.

Zahlreiche Ausführungsformen neben solchen, die hier erwähnt sind, werden leicht für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden, die innerhalb des Bereichs und des Schutzumfangs dieser Erfindung fallen. Die nachfolgenden Beispiele stellen die Erfindung dar, allerdings ist in keinster Weise beabsichtigt, die Erfindung dadurch einzuschränken.

BEISPIELE Beispiel 1: Herstellung eines Referenz-T-Sensors

Ein Zwei-Masken-Niveau-Prozess wurde verwendet, um eine Referenz-T-Sensor-Vorrichtung dieser Erfindung auf einem Silizium-Wafer herzustellen. Die Referenz-T-Sensor-Vorrichtung besaß einen Strömungskanal 400 mit einer Tiefe von 400 Mikrometern und einer Länge von 20 mm. Drei Einlasskanäle wurden als Nuten, 30 mm lang und 200 Mikrometer tief, gebildet. Eine Einlasskanal- und Strömungskanalbreite betrug 50 Mikrometer.

Das Niveau der ersten Maske definierte die Einlässe und Auslassöffnungen, die geätzt waren, und zwar vollständig durch den Wafer an der Rückseite des Siliziums. Das zweite Niveau definierte die Fluid-Transportkanäle, d. h. die Einlasskanäle und die Strömungskanäle.

Chrom-Masken mit vier Inch wurden nach diesen Spezifikationen durch Photo Sciences, Inc. (Torrance, CA) hergestellt, und 3'' Wafer ({100} n-Typ) mit 500 nm an SiO2, angewachsen darauf, wurden verwendet.

Die Wafer wurden in einem Piranha-Bad (H2SO4 und H2O2) (2 : 1) vor einer Verarbeitung gereinigt. Ein Primer (HMDS geschleudert bei 3000 U/min) wurde verwendet, um eine Fotoresist-Adhäsion zu verstärken. Ungefähr ein &mgr;m an AZ-1370-SF (Hoechst) eines Fotoresists wurde durch Schleuderbeschichtung (3000 U/min) niedergeschlagen, und hierauf folgte ein sanftes Einbrennen (30 min bei 90°C).

Ein Kontakt-Ausrichter wurde verwendet, um Wafer auszurichten und freizulegen. Eine Belichtungszeit wurde variiert, um die besten Ergebnisse zu erhalten. Kein Nachbehandlungseinbrennen wurde vorgenommen. Wafer wurden in AZ-351 (verdünnt 4 : 1) (Hoechst) für eine Minute entwickelt und in DI Wasser gespült. Ein schwarzes Klebeband (Semiconductor Equipment Corporation, Moorpark, CA) wurde auf die Rückseiten der Wafer aufgebracht, um gegen das Oxid-Ätzen zu schützen.

Die Wafer wurden in einem gepufferten Oxid-Ätzmittel (BOE, 10 : 1 HF (49%) und NH4F (10%)) für elf Minuten eingetaucht, um vollständig das nicht geschützte Oxid wegzuätzen. Das blaue Klebeband wurde mit der Hand entfernt und der Fotoresist wurde in einer Azeton-Spülung entfernt.

Ein Silizium-Ätzen wurde in einer Mischung aus Ethylendiamin, Pyrokatechol und Wasser (EPW F-etch, wie es in Reismann, A., et al. (1979) J. Electrochem. Soc. 126: 1406–1415 beschrieben ist), eingesetzt in einem Rückfluss-Siedekolben, vorgenommen. Dieses Ätzmittel griff die {100} Ebenen des Siliziums unter einer Rate von ungefähr 100 &mgr;m pro Stunde an. Fluid-Befestigungsöffnungen wurden in dem ersten Schritt für ungefähr drei Stunden geätzt. Fotoresist wurde erneut aufgebracht, und die Maske, die Strömungskanäle zwischen Fluid-Öffnungen und dem Barrierebereich enthielt, wurde freigelegt. Die Wafer wurden entwickelt und in jedem zweiten Schritt für ungefähr eine Stunde geätzt.

Nach einer Endbearbeitung wurden die Wafer erneut in einem Piranha-Bad gereinigt und in DI-Wasser gespült. Sie wurden dann in einzelne Vorrichtungen mit einer Abmessung von ungefähr 1 cm mal 1 cm unterteilt.

Ein anodisches Bonden gemäß Wallis, G., und Pomerantz, D. I (1969) J. Applikation. Physics 40: 3946–3949, wurde verwendet, um Pyrex-Glas an den Silizium-Vorrichtungen zu befestigen. Teile mit einem Quadrat von einem Inch aus Pyrex-Glas (100 &mgr;m Dicke) von Esco Products Inc. (Oak Ridge, NJ) wurden verwendet. Zuerst wurden das Silizium und das Pyrex-Glas in eine Lösung aus H2O2, NH4OH und H2O (1 : 4 : 6), erwärmt auf 50°C, eingetaucht. Dieser Prozess entfernte irgendwelches organisches Material auf den Oberflächen und machte auch die Oberfläche hydrophil. Nach 20 Minuten in dieser Lösung wurden das Silizium und das Pyrex mit DI Wasser gespült und getrocknet. Ein anodisches Bonden wurde bei 400°C mit 400 V, angelegt zwischen dem Glas und dem Silizium, vorgenommen.

Beispiel 2: Erfassung und Messung der Konzentration des menschlichen Serums Albumin in einem Referenz-T-Sensor

Fünf 0,1 M AMPSO (Aldrich) von wässrigen Pufferlösungen (pH 7,4) mit 0, 2, 4, 6, und 8 g/100 mL des menschlichen Serums Albumin (HSA) wurden von Chemikalien einer analytischen Güte (Aldrich) präpariert. Die erhaltenen Lösungen wurden darauf folgend als Probenströmungen verwendet. Der Analyt, der in diesem Experiment untersucht wurde, war HSA. Eine gesättigte Lösung aus einem fluoreszenten Albumin-Indikator-Farbstoff AB580 (Molecular Probes, Eugene, OR), wurde mit einem Faktor von 10 mit derselben 0,1 M AMPSO Pufferlösung verdünnt und wurde als eine Indikatorströmung verwendet. BC1, ein kommerziell erhältliches Plasma, das 3,8 g/100 mL HSA enthält, wurde als eine Kontrollströmung verwendet. Eine Strömungsgeschwindigkeit von 50 nL/sec wurde verwendet.

Die Referenz-T-Sensor-Vorrichtung (1) wurde auf dem Gestell eines Mikroskops befestigt, so dass der Strömungskanal, von der T-Verbindung bis zu ungefähr 500 &mgr;m von der T-Verbindung, in dem Sichtfeld des Objektivs lag. Die Einlassöffnungen und die Auslassöffnungen wurden mit Injektorschleifen und mit aufrecht stehenden Rohren, die mit Wasser gefüllt wurden, verbunden, so dass dort eine Druckdifferenz von 30 mm Wassersäule zwischen den Einlassöffnungen und der Auslassöffnung vorlag. Die Einlassöffnungen wurden einem identischen Druck ausgesetzt, so dass sich die drei Strömungen, in der Mitte der T-Verbindung vereinigten, und parallel zu der Auslassöffnung flossen. Eine Injektorschleife wurde mit BC1 einer Kontroll-Lösung gefüllt, eine zweite Schleife wurde mit einer Indikator-Farbstoff-Lösung gefüllt, und eine dritte Schleife wurde mit einer der Proben-Lösungen gefüllt. Die Schleifen enthielten genug Volumen, um die Vorrichtung für ungefähr eine Stunde zu betreiben.

Nachdem allen drei Injektionsschleifen ermöglicht wurde, in die Referenz-T-Sensor-Vorrichtung zu fließen, und nach 1 min einer Ausgleichs- und Spülzeit, wurden Fotografien über eine Kamera, befestigt an dem Mikroskop, aufgenommen. Eine Erregungs-Filter-Mittenwellenlänge betrug 590 nm, und der Emissionsfilter war ein Longpass-Filter mit 607 nm.

Das Experiment ergab Fotografien, bei denen die Fluoreszenz des Analyt-Erfassungsbereichs zwischen der Indikatorströmung und der Probenströmung, und zwischen der Indikatorströmung und der Kontrollströmung, eine Funktion der Konzentration des Analyts (HSA) war, der in die Indikatorströmung von der Probenströmung und der Kontrollströmung, jeweils, hinein diffundiert war.

Wie schematisch in 8 dargestellt ist, sind fünf Abschnitte mit A–E markiert. In jedem dieser fünf Fälle zeigte die Fotografie der Vorrichtung die Kontrollströmung 76 (dargestellt in der Figur mit weiß) als dunkle Stellen (schwarz) an, zeigte die Probenströmung 80 (dargestellt in der Figur mit weiß) als dunkle (schwarze) Stelle an, zeigte die Indikatorströmung 70 (dargestellt in der Figur durch horizontale Linien) als rötlich-schwarze Stellen an und zeigte den Kontroll-Analyt-Erfassungsbereich 146 (dargestellt in der Figur durch eine diagonale Schraffierung) als eine helle, rote Linie an, die sich entlang der Länge des Strömungskanals erstreckt, wo HSA von der Kontrollströmung in die Indikatorströmung hinein diffundiert war, und zeigte den Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 als eine hellrote Linie an, die sich entlang der Länge des Strömungskanals erstreckt, wo HSA von der Probenströmung in die Indikatorströmung hinein diffundiert ist. Zusätzlich war, in dem ersten Fall, bei dem die Konzentration von HSA in der Probenströmung 0 g/100 mL eines Puffers war (Abschnitt A von Experiment A), kein erfassbarer Analyt-Erfassungsbereich zwischen der Indikatorströmung 70 und der Probenströmung 80 vorhanden. In dem zweiten Fall war, wo die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 2 g/100 mL eines Puffers betrug (Abschnitt B, Experiment B), ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 ungefähr von der Hälfte der Intensität des Kontroll-Analyt-Erfassungsbereichs 146 zu sehen. In dem dritten Fall, bei dem die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 4 g/100 mL eines Puffers betrug (Abschnitt C, Experiment C), war ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 mit ungefähr derselben Intensität wie der Kontroll-Analyt-Erfassungsbereich 146 zu sehen. In dem vierten Fall, wo die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 6 g/100 mL eines Puffers betrug (Abschnitt D, Experiment D), war ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 mit ungefähr eineinhalbmal der Intensität des Kontroll-Analyt-Erfassungsbereichs 146 zu sehen. In dem fünften Fall, wo die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 8 g/100 mL an Puffer betrug (Abschnitt E, Experiment E), war ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 ungefähr zweimal von der Intensität des Kontroll-Analyt-Erfassungsbereichs 146 zu sehen.

Die Fluoreszenz-Daten, dargestellt in diesen Fotografien, wurden aufgezeichnet und quantitativ grafisch dargestellt, wie dies in Tabelle 1 und in 9 gezeigt ist.

9 zeigt eine grafische Darstellung der Fluoreszenz-Intensität gegenüber der x-Koordinate, was die Position in der Diffusions-Richtung (Tiefe) des Strömungskanals ist. (Die Zahlen auf der y-Achse verringern sich, wenn sich die Fluoreszenz erhöht, und zwar als Folge eines Software-Artifacts: hellere (fluoreszierendere) Bereiche sind mit niedrigen Pixel-Intensitäts-Zahlen bezeichnet, und dunklere (geringere) Fluoreszenz) Bereiche sind mit höheren Pixel-Intensitäts-Zahlen bezeichnet.) In dem oberen, linken Bereich der grafischen Darstellung ist die Hintergrund-Fluoreszenz der Kontrollströmungen dargestellt: sie ist sehr klein, und ist im Wesentlichen dieselbe für jeden der fünf Fälle. Der große nach unten gehende Peak an der Position 122124 stellt die Fluoreszenz der Kontrollströmung dar, die 3,8 g HSA/100 mL an Puffer enthält: die Fluoreszenz ist stark und im Wesentlichen dieselbe für jeden der fünf Fälle. (Drei Daten-Punkte sind gemittelt, um jeden Daten-Wert, dargestellt in Tabelle 1, zu erhalten.) Der flache, nach unten gehende Peak an der Position der 30190 stellt die Hintergrund-Fluoreszenz der Indikatorströmung dar: sie ist nicht sehr stark, sich von ungefähr 185 bis 189 variierend, und ist im Wesentlichen dieselbe für jeden der fünf Fälle. Die vier Peaks an den Positionen 207, 207, 206 und 205 stellen die Fluoreszenz der Proben dar, enthaltend Konzentrationen von HSA mit 2, 4, 6 und 8 g/100 mL, jeweils. Diese entsprechen den Experimenten A, B, C, D und E, jeweils. Die Intensitäts-Werte sind 176,45; 124,15; 72,67 und 39,85 jeweils. An der oberen, rechten Position der Grafik ist die Hintergrund-Fluoreszenz der Probentrömungen dargestellt: sie ist sehr klein, und im Wesentlichen dieselbe für jeden der fünf Fälle.

Beispiel 3: Bestimmung der Konzentration von HSA in acht klinischen Proben und Korrigieren durch interne Standards

10 zeigt eine grafische Darstellung der Fluoreszenz-Intensität gegenüber der Konzentration von HSA von acht klinischen Proben des menschlichen Gesamtbluts. Der Referenz-T-Sensor wurde durch Messen der Fluoreszenz-Intensität von Kalibrierungsströmungen mit bekannten Konzentrationen (2, 4, 6 und 8 g/100 mL eines Puffers) an HSA kalibriert. Die Indikatorströmung wurde entsprechend dem Vorgang, der in Beispiel 2 beschrieben ist, vorgenommen. Die Kalibrierungs-Kurve ist in 10 als eine dunkle Kurve dargestellt. Als nächstes wurde die Fluoreszenz von jeder der acht klinischen Proben gemessen und grafisch (dargestellt als x) in 10 dargestellt. Während diese Daten gemessen wurden, wurden interne Standardströmungen, enthaltend 3,8 g HSA/100 mL an Puffer, laufen gelassen und gemessen und grafisch (dargestellt als Kreise) in 10 dargestellt. Die Fluoreszenz-Intensität von den Probenströmungen wurde durch die Fluoreszenz-Intensität der internen Standardströmungen dividiert, was die korrigierten Werte, dargestellt in 10 als Dreiecke, ergab.

10 stellt dar, dass die korrigierten Werte näher zu der Kalibrierungs-Linie fallen, als dies die nicht korrigierten (groben) Daten tun. Dies stellt einen der Vorteile der Vorrichtung und des Verfahrens dieser Erfindung dar, die eine Korrektur von experimentellen Bedingungen unter Verwendung der internen Standardströmungen liefern. Paramax ist ein Instrument, das für Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet bekannt ist, und setzt optische Absorptions-Messungen und ein automatisiertes Mischen von Proben und Reagenzien ein, um die Konzentration von Analyt in klinischen Proben zu bestimmen.

Beispiel 4: Qualitätskontrolle der Strömungsrate durch grafische Darstellung eines Levy-Jennings Ausdrucks

11 zeigt ein QC-Diagramm (Levy-Jenning) von Daten, gesammelt von einer Vorrichtung dieser Erfindung, um die Qualitäts-Kontroll-Funktion der Vorrichtung zu demonstrieren. Eine Fluoreszenz-Intensität wurde auf der y-Achse ausgedruckt und die Experiment-Nummer wurde auf der x-Achse ausgedruckt. 11 gibt 20 Kontrollströmungen an und zeigt, dass 18 von den 20 innerhalb von zwei durchschnittlichen Standard-Abweichungen fallen, d. h. Soll-Wert für die Konzentration von HSA. Nur die Experimente 4 und 7 ergaben Werte, die außerhalb der zwei Standard-Abweichungen des Soll-Werts fielen. Dieser Typ eines Diagramms ist nützlich, um eine Strömungsraten- und/oder Reagenz-Variationen, Lampenquellen-Variationen und andere Variationen in System-Parametern der Strömungen in der Vorrichtung dieser Erfindung zu prüfen. Falls die gemessenen Kontroll-Werte innerhalb von zwei Standard-Abweichungen des Soll-Werts fallen (oder welcher Bereich auch immer präzise genug für ein gegebenes Projekt ist), werden diese Parameter geeignet dafür kontrolliert oder eingehalten.


Anspruch[de]
  1. Vorrichtung (10) zum Erfassen des Vorhandenseins oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikeln in einer Probenströmung (80), die aufweist:

    a) einen laminaren Strömungskanal (100);

    b) mindestens drei Einlasseinrichtungen (40, 50, 55) in einer Flüssigkeitsverbindung mit dem laminaren Strömungskanal, um jeweils (1) eine Indikatorströmung (70), (2) eine Probenströmung (80) und (3) ein Referenzströmung (75) in den laminaren Strömungskanal zu leiten;

    c) wobei der laminare Strömungskanal (100) eine Dimension, ausreichend klein, um eine laminare Strömung der Strömungen angrenzend zueinander zu ermöglichen, und eine Länge L, ausreichend, um zu ermöglichen, dass Analyt-Partikel in die Indikatorströmung (70) von der Probenströmung (80) und/oder der Referenzströmung (75) diffundieren, um mindestens einen Erfassungsbereich (140; 145) zu bilden, besitzt; und

    d) eine Auslasseinrichtung (60) zum Leiten der Strömungen (70, 75, 80) aus dem laminaren Strömungskanal (100) heraus.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Auslasseinrichtung (60) die Strömungen (70, 75, 80) aus dem laminaren Strömungskanal (100) in einer einzelnen, gemischten Strömung herausleitet.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Erfassungseinrichtung (150), positioniert relativ zu dem Strömungskanal (100), aufweist, so dass die Erfassungseinrichtung eine Änderung in einer erfassbaren Eigenschaft in mindestens einer der Strömungen (70, 75, 80) erfassen kann.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Erfassungseinrichtung (150) Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Kamera mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung, einem Diodenfelddetektor, einem Fluoreszensdetektor und einem elektrochemischen Detektor besteht, aufweist.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Einlasseinrichtung aufweist, um mindestens eine zusätzliche Referenz- oder Probenströmung (75; 80) in einem laminaren Strömungskontakt mit der Indikatorströmung (70) zu leiten.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Einrichtung (25; 41) zum Unterteilen der Indikator-(70)- oder Proben-(80)-Strömung in mindestens zwei separate Strömungen und Leiten der separaten Strömungen in den laminaren Strömungskanal (100) hinein aufweist.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Mehrzahl von laminaren Strömungskanälen (100) in einer Flüssigkeitsverbindung mit einem Indikatorströmungskanal (40) und Einrichtungen (41; 59, 88) zum Leiten von Teilen einer Indikatorströmung von dem Indikatorströmungskanal (40) in eine laminare Strömung mit getrennten Proben- oder Referenzströmungen in die laminaren Strömungskanäle (100) aufweist.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin Einrichtungen (40A, 40B, 55A, 55B, 50) zum Leiten von mindestens zwei Strömungen (105A, 105B), jeweils zusammengesetzt aus mindestens zwei Strömungen in einer laminaren Strömung zueinander, in eine parallele, laminare Strömung in dem laminaren Strömungskanal (100), aufweist.
  9. Verfahren zum Erfassen des Vorhandenseins oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikel in einer Probenströmung (80), das aufweist:

    a) Leiten der Probenströmung (80) in einen laminaren Strömungskanal (100) hinein;

    b) Leiten einer Indikatorströmung (70), wobei die Indikatorströmung eine Indikatorsubstanz aufweist, die das Vorhandensein der Analyt-Partikel durch eine Änderung in einer erfassbaren Eigenschaft anzeigt, wenn sie mit Partikeln des Analyts in Kontakt gebracht wird, in den laminaren Strömungskanal (100) hinein, wodurch die Probenströmung (80) und die Indikatorströmung (70) in einer angrenzenden, laminaren Strömung in dem Kanal (100) fließen;

    c) Leiten einer Referenzströmung (75), die eine konstante Konzentration von 0 oder größer an Referenz-Partikel aufweist, in den laminaren Strömungskanal (100) hinein, wodurch die Referenzströmung (75) in einer laminaren Strömung angrenzend an die Indikatorströmung (70) fließt;

    d) Ermöglichen, dass Analyt-Partikel in die Indikatorströmung (70) hinein diffundieren;

    e) Ermöglichen, dass Referenz-Partikel in die Indikatorströmung (70) hinein diffundieren; und

    f) Erfassen des Vorhandenseins oder Bestimmen der Konzentration der Analyt- und Referenz-Partikel in der Indikatorströmung (70).
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Indikatorsubstanz auf einer teilchenförmigen Substanz, die mit der Indikatorströmung (70) geführt ist, immobilisiert ist.
Es folgen 12 Blatt Zeichnungen






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