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Dokumentenidentifikation DE69824856T2 21.07.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001002055
Titel RÜCKGEWINNUNG VON VIREN AUS ZELLKULTUREN DURCH VERWENDUNG EINER HYPERTONISCHEN SALZLÖSUNG
Anmelder Xenova Research Ltd., Cambridge, Cambridgeshire, GB
Erfinder JOHNSTON, Denis, Michael, Cambridge CB4 4NY, GB;
O'KEEFFE, Simon, Roderic, Essex SB11 3GA, GB
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69824856
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.08.1998
EP-Aktenzeichen 989387659
WO-Anmeldetag 07.08.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/GB98/02387
WO-Veröffentlichungsnummer 0099007834
WO-Veröffentlichungsdatum 18.02.1999
EP-Offenlegungsdatum 24.05.2000
EP date of grant 30.06.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.07.2005
IPC-Hauptklasse C12N 7/02

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Herstellung von Viren und die Ernte von Viruspräparaten aus vireninfizierten Zellkulturen, beispielsweise zu experimentellen und therapeutischen Zwecken, wie z. B. zur Herstellung von Virusvakzinen. In speziellen Aspekten betrifft die Erfindung Verfahren und Anordnungen zur Herstellung von Herpesviren. Andere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Zur Herstellung von Lebendviruspräparaten, z. B. Herpesviruspräparaten, zu Impf- oder anderen Zwecken sind mehrere Verfahren bekannt.

Die US-A-3.985.615 (Osaka Res Foundation: T. Kubo et al.) beispielsweise zeigt die Herstellung von abgeschwächten Varicella-Lebendviren als Vakzine durch Kultivieren, umfassend die Passage in primärembryonale Gewebezellen von Meerschweinchen. US-A-5.024.836 (Merck: W. J. McAleer et al.) betrifft die Herstellung von darauf basierenden gefriergetrockneten Vakzinenpräparaten.

Die DD-A-209 738 (Cent Cerc Bioprep: I. V. Patrascu) veranschaulicht die Herstellung einer anderen Art von Herpesvirus zur Verwendung als Vakzine gegen die Mareksche Erkrankung, das hergestellt wird durch: (a) Kultivieren spezifisch pathogenfreier Hühnerembryonalzellen auf Dextran-Mikrokügelchen; (b) Inkubation der Kultur bis zu 80%iger Konfluenz mit dem Truthahn-Herpesvirusstamm FC-126 (Klon 1, IIIb); (c) Sammeln der infizierten Zellen in einem SPGA-Medium (Saccharose-Phosphat-Glutamat-Rinderalbumin, Fraktion V), als der zytopathogene Effekt 80% betrug; (d) einminütiges Aussetzen der Suspension drei Ultraschallwellenimpulsen in Zweiminuten-Intervallen und Zentrifugieren der Suspension, um eine erste Ernte an Vakzine zu erhalten; (e) Resuspendieren des Sediments im SPGA-Medium und Wiederholung des Schritts (d), um eine zweite Ernte an Vakzine zu erhalten (und somit die Vakzinenausbeute um nahezu 20% zu erhöhen); (f) Einfrieren der kombinierten Vakzine bei –100°C, wonach der Virustiter bestimmt wird; und (g) Verdünnen mit SPGA-Medium und Gefriertrocknen.

JP-A-06234659 (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) beschreibt in einem Beispiel die Herstellung einer Herpesvirus-Vakzine auf menschlichen diploiden Fibroblasten-MRC-5-Zellen, die in MEM-Medium bei 37°C kultiviert wurden; umfassend die Inokulation des Varicellavirus-Oka-Stamms als Keimvirus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,03 in MRC-5-Zellen und zweitägiges Kultivieren bei 37°C. Das Virus wurde dann in einer Lösung, die 6,4 g NaCl, 0,16 g KCl, 2,3 g Na2HPO4 × 12H2O, 0,16 g KH2PO4, 50,0 g Saccharose, 1,0 g Na-L-Glutamat, 2,0 g Gelatine, 25,0 g Gelatinehydrolysat und 0,1 g EDA-3Na pro Liter enthielt, suspendiert.

Die EP-A-0.573.107, US-A-5.360.736 und US-A-5.607.852 (Merck: P. A. Friedman et al.) beschreiben Verfahren zur Herstellung von abgeschwächten Varicella-zoster-Virus-Vakzinen, die ein Verfahren zur Herstellung einer abgeschwächten, zellfreien, lebenden Varicella-zoster-Virus-(VZV-)Vakzine umfasst, das folgende Schritte umfasst: (a) Kultivieren von VZV-infektionsanfälligen Zellen, die aus menschlichen diploiden Zellen ausgewählt werden, bis zur Konfluenz in einer Monolayerkultur unter der Bedingung ausreichend reicher Ernährung, um einen hohen Grad an Zellreplikation zu erzielen, und Zuführen eines nicht metabolisierbaren Disaccharids; (b) Infizieren der in Schritt (a) kultivierten Zellen möglichst nahe am Konfluenzpunkt mit einer möglichst hohen in der Praxis erzielbaren Infektionsmultiplizität der VZV-infizierten Zellen; (c) Aufrechterhalten der VZV-infizierten Kultur in einem nährmediumreichen Zustand für etwa 22 bis 96 Stunden und Ernten im Zustand der höchsten infektiösen VZV-Produktion; (d) Waschen der VZV-infizierten Kultur mit einer physiologischen Lösung, die gegebenenfalls ein lysosomotropisches Agens, wie z. B. Ammoniumchlorid oder Chloroquin enthält, bevor die VZV-infizierten Zellen geerntet werden; (e) Ernten der VZV-infizierten Zellen in ein minimales Volumen einer stabilisierenden Lösung und entweder unmittelbarer Zellaufschluss oder Einfrieren der Zellen für späteren Aufschluss; (f) Aufschließen der VZV-infizierten Zellen, um optimalerweise das zellassoziierte VZV freizusetzen und die Zellbruchstücke zu entfernen, um ein zellfreies VZV-Präparat bereitzustellen. Das Verfahren offenbart die Verwendung von Zelldichten von bis zu etwa 500.000 Zellen/cm2 in gewöhnlichen Kultivierungsgefäßen. Das Verfahren wird zur Massenproduktion von Lebendvakzinen vorgeschlagen. Ein geeignetes Nährmedium für die gezüchteten Zellen in einer Monolayerkultur wird in diesem Zusammenhang als eines beschrieben, das vorwiegend aus SFRE-2-Medium, angereichert mit zwischen 0,2 mg/ml und 0,4 mg/ml Sojabohnenlipid, besteht, wobei die Zellen aus MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen und Verozellen ausgewählt sind.

Die WO 92/05263 (Immunology LTD: S. C. Inglis et al.) und WO 94/21807 (Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis et al.) sind veranschaulichende Beispiele für die Bereitstellung von rekombinanten Zellen und für Kultivierungsverfahren zur Produktion eines genetisch unschädlich gemachten Herpesvirus, wie z. B. eines Herpes-simplex-Virus, zu Impfzwecken.

Es bleibt wünschenswert, Verfahren zur Behandlung virushältiger Präparate bereitzustellen, die zur Herstellung von Viruspräparaten mit guter Ausbeute und Reinheit beitragen können.

ZUSAMMENFASSUNG UND BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine mit einem Herpesvirus infizierte Zellkultur so behandelt werden, dass durch Ernteinkubation mit einer hypertonischen wässrigen Salzlösung eine Virussuspension erhalten wird. Die Salzlösung kann mit der Zellkultur in Kontakt gebracht werden, sodass eine Flüssigkeit erhalten wird, die im Vergleich mit (beispielsweise) dem Produkt, das durch Ultraschallwellenaufschluss erhalten wird, einen brauchbaren Virusgehalt und einen stark reduzierten Gehalt an Zellen oder Zellbruchstücken enthält. Dieses Verfahren ist beispielsweise besonders gut anwendbar, um eine bessere Virusernte zur Herstellung von Lebendvirusvakzinen zu erzielen, wo ansonsten ein Zellaufschluss-Schritt eingesetzt werden könnte, um Viren durch Aufschluss virusinfizierter Zellen einer virusproduzierenden Zellkultur zu ernten.

Zahlreiche pharmazeutisch annembare Salze sind für diesen Zweck geeignet und akzeptabel, z. B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumchlorid und andere. Vorzugsweise kann die Salzlösung Natriumchlorid in einer Konzentration von z. B. etwa 0,8 M bis 0,9 M oder mehr umfassen. Wird Natriumsulfat eingesetzt, so kann die Konzentration vorzugsweise etwa 0,4 M oder mehr ausmachen. Andere Salze können, falls gewünscht, in einer der oben angegebenen Konzentration ähnlichen Osmolarität oder Ionenstärke eingesetzt werden. Das Virus hält oft Salzkonzentration von bis zu 1 M oder 2 M stand, doch jedenfalls soll vorzugsweise nicht zu weit über die angegebene Konzentration gegangen werden, um übermäßige Aufnahme von Protein in die Salzlösung zu vermeiden. Puffer und andere Bestandteile können gemäß üblicher Praxis im Umgang mit den betreffenden Viren geeignet gewählt werden.

Die Ernteinkubation kann unter leichtem Schütteln durchgeführt werden, und vorzugsweise wird sie so durchgeführt, dass es zu keinem oder minimalem Zellaufschluss kommt. Die mit Ernteinkubation zu behandelnden Zellkulturen können beispielsweise eine Monolayerkultur oder eine Mikroträgerkultur oder auch eine Rollflaschenkultur sein.

Die Erntesalzlösung kann gepuffert und bei einem pH und einer Temperatur, die an sich zum Kultivieren virusinfizierter Zellen geeignet sind, z. B. bei einem pH von etwa 7 und vorteilhafterweise bei etwa 34°C für das Herpes-simplex-Virus, gehalten werden.

Die Kontaktzeit zwischen den kultivierten Zellen und der Ernteflüssigkeit ist nicht speziell entscheidend und kann beispielsweise im Bereich von etwa 2 bis 24 Stunden liegen. Es wurde in Verbindung mit bestimmten Beispielen herausgefunden, dass beispielsweise eine Kontaktzeit von vier Stunden zu bevorzugen ist, da sie zu einer guten Ausbeute mit annehmbar geringem Zellproteingehalt führen kann.

Nach dem Kontakt zwischen den kultivierten infizierten Zellen und der Ernteflüssigkeit kann die Flüssigkeit, die die geernteten Viruspartikel enthält, mittels Dekantieren oder jeglicher anderer geeigneter Verfahren abgetrennt werden: die kultivierten Zellen selbst können an die Oberfläche, auf der sie kultiviert wurden, gebunden bleiben und nach Abtrennung der Erntelösung verworfen werden.

Die Erntelösung kann dann, falls gewünscht, durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren behandelt werden, um Restzellen zu entfernen.

Wünschenswerterweise kann das geerntete Präparat auf etwa isotonische Konzentration verdünnt oder diafiltriert werden, z. B. auf etwa 138 mM in Natriumchlorid.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann das auf diese Weise geerntete Viruspräparat mit einem Nucleaseenzym behandelt werden, um jeglichen Anteil an kontaminierender Nucleinsäure auf ein akzeptables Niveau zu reduzieren.

Die verdünnte Flüssigkeit kann beispielsweise mit dem Nucleaseenzym BenzonaseTM behandelt werden, um freie Nucleinsäuren (im Wesentlichen DNA, und üblicherweise auch RNA) bei bis zu etwa 50 Einheiten/ml in Gegenwart von etwa 2 bis 10 mM Magnesiumionen bis zu eine Stunde lang bei etwa 4°C bis Raumtemperatur abzubauen.

Der Gehalt an Nucleaseenzym und anderen Proteinen kann dann beispielsweise durch eine Membran mit einer Virusrückhalteausschlussgrenze von z. B. 500 kD mittels Diafiltration gegen einen geeigneten Formulierungspuffer reduziert werden.

Nach diesen Behandlungen kann das geerntete Virus in eine gewünschte Trägerflüssigkeit übertragen und eingefroren, gefriergetrocknet oder auf andere geeignete Weise stabilisiert werden.

Verfahren als Beispiele der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit stark zellassoziierten Viren, d. h. jenen Viren, die in Kultur einen besonders hohen Grad an Zellassoziierung aufweisen, z. B. mit dem Herpes-simplex-Virus vom Typ 2 (HSV-2), dem Pseudo-Rabies-Virus (PRV), dem Truthahn-Herpesvirus und dem Varicella-zoster-Virus (VZV) besondere Vorteile bieten. Bei bestimmten Herpesviren unter bestimmten Kultivierungsbedingungen (z. B. bei dem Herpes-simplex-Virus vom Typ 1 (HSV-1)) kann es zu einer wesentlichen spontanen Freisetzung des Virus aus der infizierten Zelle in die Zellkulturflüssigkeit kommen, sodass die Anwendung des Verfahrens gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung hier manchmal nicht erforderlich sein kann und demgemäß solche Beispiele der Erfindung weniger bevorzugt sind.

Für Fachleute auf diesem Gebiet ist es selbstverständlich, dass die Erfindung unter jeglicher geeigneter Detailanpassung auf Herpesviren unterschiedlicher Typen angewandt werden kann, wie beispielsweise auf den Wildtyp des Herpes-simplex-Virus und genetisch unschädlich gemachte Herpesviren, wie z. B. das Herpes-simplex-Virus, und beispielsweise auch auf andere Herpesviren, die in den hierin zitierten Dokumenten erwähnt werden.

Die Viruspräparate, die unter Einsatz der hierin beschriebenen Verfahrensschritte erhalten werden, können weiter bearbeitet und so zu Bestandteilen pharmazeutischer Zusammensetzungen, z. B. an sich bekannten Bestandteilen von Virusvakzinen, gemacht werden.

Die Erfindung wird weiters anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele beschrieben und veranschaulicht.

BEISPIELE

Ein Verfahren gemäß einem Beispiel der Erfindung zum Ernten und Reinigen von Viruspartikeln kann eine Kultur von Verozellen nutzen, die mit HSV-2 infiziert und auf im Wesentlichen bekannte Weise in einem herkömmlichen Nährmedium gezüchtet wurden, wobei sie in Rollflaschen bei etwa 100 ml Medium pro Flasche aufbewahrt wurden. Das Nährmedium, der Zelltyp und die Kultivierungsbedingungen können beispielsweise wie folgt sein:

Die Verozellen können mit 2 × 107 Zellen pro Rollflasche passagiert werden. Die Kultur kann unter Einsatz von DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glucose ohne Natriumpyruvat und mit 862 mg/l Glutamax-1 (TM) (L-Alanyl-L-glutamin) durchgeführt werden. Die Inkubation kann beispielsweise bei etwa 37°C und etwa 120 Stunden (5 Tage) lang durchgeführt werden. Konfluente Zellkulturen können dann mit HSV-2 bei einer Infektionsmultiplizität von etwa 0,01 infiziert werden, wobei das Virus in DMEM so weit verdünnt wird, dass jeder Rollflasche 1 ml zugegeben wird, was dann in das Roll-Inkubationsgerät bei etwa 34 bis 37°C zurück übertragen wird. Wird beobachtet, dass der zytopathogene Effekt bei 80 bis 100% liegt, z. B. 65 bis 72 Stunden nach der Infektion, sind die Rollflaschen als bereit für die Virusernte anzusehen und zu behandeln.

Das Nährmedium kann aus jeder Flasche dekantiert und pro Flasche durch 10 ml gepufferte Natriumchloridlösung (etwa 0,8 bis 0,9 M), die 0,01 M Natriumcitrat mit einem pH von 7,0 enthält, ersetzt werden. Die Zellen in der Rollflasche in Kontakt mit dieser gepufferten Natriumchloridlösung können bei etwa 34°C für etwa 4 Stunden rotiert und inkubiert werden.

Die kultivierten Zellen selbst in der Rollflasche können weitgehend an die Flaschenoberfläche gebunden bleiben und können nach der Abtrennung der Lösung, die die geernteten Viruspartikel enthält, verworfen werden.

Die Flüssigkeit in der Flasche, umfassend die gepufferte Salzlösung und Material aus der Zellkultur in Suspension, einschließlich Virus, kann mit einer Pipette entfernt und bei etwa 3000 U/min in einer Sorvall RT6000TM-Zentrifuge etwa 10 Minuten lang (z. B. bei einem RCFmax von etwa 1876) zentrifugiert werden. Die Zellen im Pellet und jene, die in der Flasche zurückbleiben, werden (unter geeigneten Bedingungen zur virensicheren Behandlung) verworfen und der Überstand wird mittels einer Pipette zum nächsten Verfahrensschritt, der kontinuierliche Durchflusszentrifugation sein kann, übertragen. Vorfiltration kann mit einem 0,8-&mgr;m-Filter durchgeführt werden. Die überstehende Flüssigkeit, die nach dem Zentrifugieren zurückbleibt, kann auf eine Endkonzentration (berechnet als Natriumionen) von 138 mM verdünnt oder diafiltriert werden.

Die verdünnte Flüssigkeit kann dann mit BenzonaseTM-Nucleaseenzym behandelt werden, um freie Nucleinsäuren (die verwendeten Enzyme weisen bedeutsamerweise DNase-Aktivität, und üblicherweise auch – wie BenzonaseTM – RNase-Aktivität auf) bei bis zu etwa 50 Einheiten/ml in Gegenwart von etwa 2 bis 10 mM Magnesiumionen, z. B. für bis zu etwa einer Stunde bei einer Temperatur von etwa 4°C bis Raumtemperatur, abzubauen.

Die Reaktionsflüssigkeit kann dann tangentialer Querstromfiltration (Diafiltration) unterzogen werden, wobei ein Filter/eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 500 kD in einer FiltronTM- oder einer anderen tangentialen Querstromvorrichtung bei einer Umlaufgeschwindigkeit von 100 ml/min, einer Filterrate von 100 ml/min und einem Rücklauf von 100 ml Natriumcitrat (0,01 M/7,25 pH), das 138 mM Natriumchlorid enthält, eingesetzt wird.

Der Filterrückstand aus dem Verfahrensschritt der Querstromultrafiltration kann dann durch Diafiltration gegen 5 bis 10 Volumina des Citrat/Salzlösungs-Puffers behandelt werden, um die Menge der Nucleaseenzyme zu verringern, und der Filterrückstand wird schließlich einer (sterilisierenden) 0,2-&mgr;m-Filtration, der gegebenenfalls eine Filtration mit einem Filter mit etwa 0,45 bis 5 &mgr;m vorangeht, unterzogen, wobei derselbe Puffer erneut eingesetzt wird, nachdem die Flüssigkeit, die das Viruspräparat enthält, auf bis zu 20 mg/ml in einem geeigneten stabilisierenden Protein, vorzugsweise Humanserumalbumin mit etwa 20 mg/ml, eingestellt wurde. Es kann nützlich sein, die Filter mit einer Flüssigkeit, die dasselbe stabilisierende Protein in demselben Puffer enthält, vorzuwaschen, bevor sie zur Behandlung des Viruspräparats eingesetzt werden.

Das resultierende Produkt kann als Suspension der Viruspartikel in einem Salzlösungspuffer und einem stabilisierenden Protein erhalten werden, in der der DNA-Restgehalt zufrieden stellend niedrig sein kann.

Es wurde herausgefunden, dass die Ausbeute aus solch einem Verfahren im Vergleich zu einem Verfahren, das Zellaufschluss mit Ultraschallwellen, um Viruspartikel freizusetzen, und weiters das Abtrennen der Viruspartikel von den Zellbruchstücken umfasst, brauchbar gut ist.

Die Erfindung kann sehr nützlich eingesetzt werden, beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform, die gemäß dem oben beschriebenen Beispiel ausgeführt wird, um das genetisch unschädlich gemachte HSV-2-Virus zu Impfzwecken zu kultivieren und zu ernten, wobei das Virus eine Deletion bezüglich des GH-Gens, das für die Produktion infektiöser neuer Viruspartikel unentbehrlich ist, aufweist und in einer Zelllinie kultivierbar ist, die auf Verozellen basiert, welche rekombiniert wurden und die Fähigkeit haben, das virale GH-Gen zu exprimieren, das dem Virusgenom fehlt, wie es z. B. in den Beschreibungen der WO 92/05263 und WO 94/21807 beschrieben wird (siehe auch A. Forrester et al., J. Virol. 66, 341–348 (1992), weiters H. E. Farrell et al., J. Virol 68, 927–932 (1994), und C. McLean et al., J. Infect. Dis. 170, 1100–1109 (1994)).

Vorzugsweise kann, wenn es von Vorteil ist, das Kultivieren der Zellen und Viren statt in Rollflaschen auch auf verschiedenen Formen von Trägerkügelchen auf an sich bekannte Weise erfolgen.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Ernte eines Herpesvirus aus einer Zellkultur, die damit infiziert wurde, umfassend das Behandeln der Kultur mit einer hypertonischen wässrigen Salzlösung, um eine Virussuspension zu erhalten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Virussuspension weiter behandelt wird, um sie als pharmazeutisches Präparat zu formulieren, das zur Verwendung als Virusvakzine geeignet ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 0,8 M oder mehr umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Erntesalzlösung auf einen pH von etwa 7 und eine Temperatur von etwa 34°C gepuffert wird, um das Herpes-simplex-Virus zu ernten.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das geerntete Präparat dann auf etwa isotonische Konzentration verdünnt oder diafiltriert wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das geerntete Viruspräparat mit einem Nucleaseenzym behandelt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Präparat nach der Nucleasebehandlung durch eine Membran mit einer Virusrückhalteausschlussgrenze gegen einen Formulierungspuffer diafiltriert wird.
  8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das geerntete Virus nach Übertragung in eine gewünschte Trägerflüssigkeit gefroren, gefriergetrocknet oder auf andere Weise stabilisiert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Virus ein Herpes-simplex-Virus vom Typ 2 (HSV-2), ein Pseudo-Rabies-Virus (PRV), ein Truthahn-Herpesvirus oder ein Varicella-zoster-Virus (VZV) umfasst.
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