Diese Erfindung betrifft allgemeine adsorptive Trennung von Triglyceriden. Spezieller betrifft diese Erfindung ein neues Verfahren zur Abtrennung eines ersten Triglycerids, das einen Docosahexaensäurerest umfaßt, von wenigstens einem anderem Triglycerid unter Verwendung einer chromatographischen Trennzone mit einer stationären Phase, die Metallionen besitzt, welche in der Lage sind, mit einer Doppelbindung eines Fettsäurerestes des ersten Triglycerids unter Bildung eines Metallkomplexes mit dem Fettsäurerest eine Koordinationsbindung zu bilden.

Docosahexaensäuren („DHA") sind 22-Kohlenstoff-, natürlich vorkommende, unverzweigte Fettsäuren, die 6 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten. Es ist bekannt, daß viele Triglyceride, die einen DHA-Rest (und besonders Triglyceride mit zwei DHA-Resten) besitzen, günstige Nährstoffeigenschaften und pharmazeutische Eigenschaften haben. Beispielsweise können solche Verbindungen verwendet werden, um kardiovaskuläre und entzündliche Krankheiten zu behandeln. Sie können auch Arzneien für Kinder zugegeben werden, um die Entwicklung des Hirns und der Retina zu fördern.

Wie hier verwendet, ist ein „Triglycerid" ein Ester von drei Fettsäuren und Glycerin und hat die allgemeine chemische Formel: CH₂(OOCR¹)CH(OOCR²)CH₂(OOCR³), worin OOCR¹, OOCR² und OOCR³ jeweils Fettsäurereste sind. Jeder Rest kann gesättigt sein (d.h., alle Bindungen zwischen den Kohlenstoffatomen sind Einfachbindungen) oder ungesättigt (d.h., der Rest enthält ein oder mehrere Kohlenstoff Kohlenstoff-Doppelbindungen oder -Dreifachbindungen), und die Doppelbindungen können jeweils cis- oder trans-Konfiguration haben. Um zu erläutern ein Triglycerid mit zwei 4, 7, 10, 13 16 oder 19-DHA-Resten (d.h. ein Fettsäurerest mit 22 Kohlenstoffatomen, und 6 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen zwischen dem 4. & 5., dem 7. & 8, dem 10. & 11., dem 13. & 14., dem 16. & 17. und dem 19. & 20. Kohlenstoffatom, gerechnet von der Carbonylgruppe des Restes, gerechnet von der Carbonylgruppe des Restes, wobei der Kohlenstoff der Carbonylgruppe das erste gerechnete Kohlenstoffatom ist) und einem Palmitinsäurerest (d.h. ein gesättigter Fettsäurerest, der 16 Kohlenstoffatome umfaßt) kann die folgende Formel (I) haben (ohne Berücksichtigung, ob die Doppelbildungen cis- oder trans-Konfiguration haben):

Gleichermaßen kann ein Triglycerid mit einem 4, 7, 10, 13, 16, 19-DHA-Rest, einem 4, 7, 10, 13, 16-Docosapentaensäurerest („DPA") (d.h. einen Fettsäurerest, der 22 Kohlenstoffatome und 5 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen zwischen dem 4. & 5., dem 7. & 8, dem 10. & 11, dem 13. & 14. sowie dem 16. & 17. Kohlenstoffatom, gerechnet von der Carbonylgruppe des Restes, wobei der Kohlenstoff der Carbonylgruppe das erste gerechnete Kohlenstoffatom ist), und einem Palmitinsäurerest eine cis- oder trans-Konfiguration sein:

Ungesättigte Fettsäurereste von Triglyceriden sind manchmal in der Literatur durch eine Omega („&ohgr;")-Zahl identifiziert. Diese Nomenklatur wird hier verwendet. Die Omega-Zahl bezeichnet die Position der ersten Doppelbindung, wenn man von der endständigen Methylgruppe des Fettsäurerestes aus rechnet. Beispielsweise ist in der Formel (II) der DHA-Rest ein &ohgr;-3-Fettsäurerest und der DPA-Rest ist ein &ohgr;-6-Fettsäurerest. Oftmals haben die Fettsäurereste (und besonders die DHA-Reste) die günstigsten Herzkranzgefäßwirkungen und sind &ohgr;-3-Fettsäurereste, obwohl auch andere Fettsäurereste (wie Arachidonsäure und &ggr;-Linolensäure, die beide &ohgr;-6-Fettsäurereste sind) sich auch als günstig erwiesen.

Quellen von Triglyceriden, die wenigstens einen DHA-Rest enthalten, sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, modifizierte Pflanzenöle, Meerestieröle (zum Beispiel Robben- und Walspeck, siehe beispielsweise Patent Abstracts of Japan, Band 1997, Nr. 06), Fischöle (zum Beispiel Mehadenöl, Lachsöl, Makrelenöl, Dorschäl, Heringsöl, Sardinenöl, Capelinöl und Thunfischöl), Meeresalgen und menschliche Milch. Solche Quellen enthalten jedoch typischerweise noch viele andere Kategorien von Verbindungen. Diese Verbindungen schließen verschiedene andere Triglyceride, die eine breite Vielzahl von Fettsäureresten (z. B. den &ohgr;-6 DPA-Rest in der Formel (II)) mit variierenden Graden von Nährstoff- oder pharmazeutischem Wert. Es ist daher oftmals erwünscht, ein Triglycerid, welches mindestens einen DHA-Rest enthält (besonders ein Triglycerid, das zwei DHA-Reste besitzt) aus anderen Verbindungen in der Quelle, bevor das Triglycerid für Nahrungs- oder pharmazeutische Zwecke verwendet wird.

Zahlreiche Methoden wurden alleine oder in Kombination miteinander verwendet, um spezielle Fettsäuren und deren Derivate (d.h. Ester, Amide, Triglyceride, usw.) aus verschiedenen natürlich vorkommenden Quellen zu isolieren (oder wenigstens zu konzentrieren). Diese Verfahren schließen fraktionierte Kristallisation bei niedrigen Temperaturen, Molekulardestillation, Kristallisation von Harnstoffadukt, Extraktion mit Metallsalzlösungen, Fraktionierung von Fluid bei überkrischen Bedingungen auf im Gegenstrom arbeitenden Kolonnen, sowie Chromatographie mit stationärem Bett).

Ein Chromatographiesystem mit stationärem Bett kann eine nicht-polare stationäre Phase (d.h. ein chromatographisches Phasenumkehrsystem) oder eine polare stationäre Phase (d.h. ein chromatographisches System mit normaler Phase) verwenden. Die Verwendung eines chromatographischen Systems mit Umkehrphase ist in T. Nakahara, T. Yokochi, T. Higashihara, S. Tanaka, T. Yaguchi & D. Honda in „Herstellung von Docosahexaen- und Docosapentaeinsäuren durch Schizochytrium sp., isoliert aus Yap Islands" JAOCS, Band 73, Nr. 11, Seiten 1421 – 26 (1996) beschrieben. Nakahara et al. berichten über eine Isolierung von vier Triglyceriden, die DHA-Reste enthalten, aus Mikromeeresalgen (d. h. Schizochytrium sp.) durch ein Flüssigkeits-Chromatographieverfahren mit hoher Leistung und einer Umkehrphase unter Verwendung einer mobilen Aceton/Acetonitril-Phase und eines stationären Octodecylsilanphase („ODS"). Die stationäre Phase trennt die Triglyceride auf der Basis der Stärke der Van der Waals'schen Kräfte zwischen der stationären Phase und den Fettsäureresten der Triglyceride. Eine solche stationäre Phase neigt dazu, in Relation zu anderen herkömmlichen Phasen (zum Beispiel Kieselgel), die in Chromatographie mit normaler Phase verwendet wurden, kostspielig zu sein.

Dünnschicht-Silberionen-Chromatographie und Chromatographie von Triglyceriden mit überkritischem Fluid sind in H. Kallio, T. Vanhonen & R. R. Linko in „Dünnschicht-Silberionen-Chromatographie und Chromatographie mit überkritischem Fluid bei baltischen Herings-Triglyceriden", J. Agrig Food Chemistry, Band 39, 1991, Seiten 1573 – 1577 (1991) offenbart.

Andere haben eine Verwendung von Flüssigkeits-Chromatographie hoher Leistung, welche eine stationäre Phase verwendet, die Silberionen umfaßt, beschrieben. Die Trennung unter Verwendung einer solchen Kolonne beruht auf dem Prinzip, daß ein Metallion (zum Beispiel ein Silberion) reversibel mit Elektronen von einem &pgr;-Orbital einer Doppelbindung zwischen Kohlenstoffatomen eines ungesättigten Fettsäurerests koordinativ bindet, um einen Metallkomplex mit dem ungesättigten Fettsäurerest zu bilden. Die Festigkeit des Komplexes neigt dazu, beispielsweise von der Kettenlänge des Festsäurerests, der Anzahl der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in dem Rest, den Positionen der Doppelbindungen und davon, ob die Doppelbindungen cis- oder trans-Konfigurtion haben, abzuhängen. Obwohl diese Technik verwendet wurde, um Triglyceride von Gemischen von Triglyceriden zu trennen, sind die Triglycerid-Typen, die nach dieser Technik getrennt wurden, bisher noch begrenzt. Die Anwendung von Flüssigkeits-Hochleistungs-Chromatographie zur Trennung von Triglyceriden wurde beispielsweise in 1. Elflnan-Borjesson, S. V. D. Hark & M. Harrod in „Gradienten von &pgr;-Heptan und Acetonitril in Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographieanalysen mit Silberionen von cis- und trans-Bindungen in Lipiden", JAOCS, Band 74, Nr. 9, Seiten 1177 – 80 (1997) diskutiert. Eine getrennte Diskussion einer solchen Anwendung kann man in P. Laakso & P.Voutilainen in „Analyse von Triacylglycerolen mit Silberionen-Nochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie – Chemische Ionisierungs-Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck", Lipide, Band 31, Nr. 12. Seiten 1311 – 21 (1996) finden. Eine weitere getrennte Diskussion einer solchen Anwendung kann man in G. Dobson, W. W. Christie & B. Nikolova-Damyanova in „Review: Silberionen-Chromatographie von Lipiden und Fettsäuren", J. Chrom. B. Band 671, Seiten 197 – 222(1995) finden. Eine weitere separate Diskussion einer solchen Anwendung findet sich in B. Nilolova-Damyanova, „Silberionen-Chromatographie und Lipide", Advances in Lipid Methology – One, Ch. 6, Seiten 182 – 237 (W. W. Christie, Herausgeber The Oily Press, Ayr, Schottland 1992). Chromatographie unter Verwendung von Kohlendioxid als überkritisches Fluid einer silberhaltigen Säule zur Abtrennung von Triglyceriden ist in EP-A-0 644 157 beschrieben.

Diese Erfindung bietet ein zuverlässiges und kosteneffektives Verfahren, das verwendet werden kann, um ein Triglycerid, das wenigstens einen DHA-Rest umfaßt (und besonders Triglyceride mit zwei DHA-Resten) von seiner natürlich vorkommenden Quelle abzutrennen, die typischerweise wenigstens ein anderes Triglycerid enthält. Dieses Verfahren überwindet die folgenden primären Schwierigkeiten: (1) die hier betroffenen Triglyceride sind hochkomplexe Moleküle und (2) oftmals gibt es nur einen feinen Unterschied (wie einen Unterschied von einer Doppelbindung) in der Struktur zwischen dem erwünschten Triglycerid und dem anderen Triglycerid oder den anderen Triglyceriden in der Quelle.

Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bekommt man ein Verfahren zur Abtrennung eines ersten Triglycerids, das einen Docosahexaensäurerest umfaßt, von einem zweiten, indem man ein Beschickungsgemisch, welche Triglycerid aus Meeresalgen einschließlich des ersten Triglycerids und des zweiten Triglycerids enthält, in eine erste chromatographische Trennzone einführt und eine erste Fraktion dieses Beschickungsgemisches in der genannten ersten Trennzone isoliert, wobei diese erste Fraktion ein Massenverhältnis des ersten Triglycerids zu dem zweiten Triglycerid hat, das größer als jenes in dem Beschickungsgemisch ist, und wobei die erste Trennzone eine stationäre Phase umfaßt, die Metallionen enthält, welche zu einer koordinativen Bindung mit einer Doppelbindung eines Fettsäurerests des ersten Triglycerids in der Lage ist.

Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung bekommt man ein Verfahren zur Abtrennung eines ersten Triglycerids, das einen Docosahexaensäurerest umfaßt, von einem zweiten Triglycerid, indem man ein Beschickungsgemisch, welches Triglyceride aus Meeresalgen einschließlich des ersten Triglycerids und des zweiten Triglycerids in eine chromatographische Trennzone einführt und eine Fraktion des Beschickungsgemischs in dieser Trennzone isoliert, wobei diese Fraktion des Beschickungsgemischs ein Massenverhältnis des ersten Triglycerids zu dem zweiten Triglycerid aufweist, das größer als jenes in dem Beschickungsgemisch ist, wobei die Trennzone eine stationäre Phase umfaßt, die Metallionen enthält, die aus der Gruppe Silber-, Magnesium- und Calciumionen ausgewählt sind.

Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung bekommt man ein Verfahren zur Abtrennung eines ersten Triglycerids, das zwei &ohgr;-3-Docosahexaensäurereste und einen Palmitinsäurerest umfaßt, von einem zweiten Triglycerid, das einen &ohgr;-3-Docosahexaensäurerest, einen &ohgr;-6-Docosapentaensäurerest und einen Plamitinsäurerest umfaßt, indem man ein Beschickungsgemisch, welches Triglyceride aus Meeresalgen einschließlich des ersten Triglycerids und des zweiten Triglycerids enthält, in eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesäule einführt, die eine stationäre Phase umfaßt, welche (a) Kieselgel und (b) Metallionen aus der Gruppe der Silberionen und Magnesiumionen umfaßt, und das erste Triglycerid aus der Säule durch Kontakt der stationären Phase mit einem Eluirmittel eluiert, um ein Eluat mit einem Massenverhältnis des ersten Trglycerids zu dem zweiten Triglycerid zu bekommen, das größer als jenes in dem Beschickungsgemisch ist.

Andere Merkmale dieser Erfindung werden teilweise ersichtlich und teilweise nachfolgend ausgeführt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein neues und brauchbares Verfahren für die Abtrennung und Gewinnung eines erwünschten Triglycerids mit einem DHA-Rest (und besonders ein Triglycerid mit zwei DHA-Resten) von einem Gemisch, das wenigstens ein anderes Triglycerid enthält, entwickelt. Diese Methode erwies sich als besonders brauchbar für die Abtrennung von Triglyceriden von dem Öl von Meeresmikroalgen (zum Beispiel goldenen Meeresmikroalgen).

Die Triglyceride, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung abgetrennt und gewonnen werden, umfassen allgemein wenigstens einen DHA-Rest und vorzugsweise einen &ohgr;-3-DHA-Rest. Dieser DHA-Rest kann in irgendeiner der drei Positionen im Glycerol-Grundgerüst angeordnet sein (d.h. der Rest kann OOCR¹, OOCR² oder OOCR³ in der allgemeinen Formel CH₂(OOOR¹)CH(OOCR²)CH₂(OOCR³). Es wurde herausgefunden, daß das Verfahren besonders brauchbar zur Abtrennung und Gewinnung von Triglyceriden mit zwei DHA-Resten ist (zum Beispiel Formel (I) oben), die in irgendwelchen der drei Positionen am Glycerol-Grundgerüst angeordnet sein können. Diese Methode ist brauchbar, selbst wenn das Anfangsgemisch andere Triglyceride enthält, die einen DHA-Rest umfassen. In der Tat wurde mit dieser Erfindung herausgefunden, daß dieses Verfahren besonders brauchbar ist zur Abtrennung und Gewinnung eines Triglycerids, das zwei DHA-Reste und einen Palmitinsäurerest umfaßt (zum Beispiel Triglycerid mit der Struktur der Formel (I) oben) von einem Gemisch, das auch ein Triglycerid mit einem DHA-Rest, einem DPA-Rest und einem Palmitinsäurerest enthält (zum Beispiel einem Triglycerid mit der Struktur der Formel (II) oben), Und, wenn erwünscht, kann dieses Verfahren weiter verwendet werden, um ein zweites Triglycerid abzutrennen und zu gewinnen (zum Beispiel ein Triglycerid mit der Struktur der Formel (II) oben) aus dem Gemisch.

Typischerweise ist der Mechanismus der Abtrennung, anders als bei der Ionenaustauschsäulenabtrennung, hier nicht auf Ionenaustauschgleichgewichten basierend. Statt dessen beruht die Abtrennung gewöhnlich wenigstens teilweise auf Metallionen in der Kolonne, die koodinativ reversibel mit Elektronen eines n-Orbital einer Doppelbindung zwischen Kohlenstoffatomen eines ungesättigten Fettsäurerests des gewünschten Triglycerids unter Bildung eines Metallkomplexes mit dem ungesättigten Fettsäurerest bindet. Dieser Komplex stammt von dem Ladungsüberführungstyp; der ungesättigte Fettsäurerest wirkt als ein Elektronendonor, und das Silberion wird auch als ein Elektronenakzeptor. So bleiben im wesentlichen alle Metallionen in der Trennzone während der ganzen Trennung.

Die Struktur der chromatographischen Trennzone, die gemäß der Erfindung verwendet wird, kann stark variieren. Die Trennzone kann beispielsweise eine Kolonne mit Packung oder eine offene Röhrenkolonne sein. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Trennzone eine zylindrische Säule, die mit einem porösen Material (d.h. der stationären Phase) gepackt ist. Da zylindrische gepackte Säulen derzeit die am meisten bevorzugte Struktur für die Durchführung der Trennung sind, konzentriert sich die folgende Diskussion auf Ausführungsformen, die eine zylindrische gepackte Kolonne verwenden. Es sollte jedoch erkannt werden, daß diese Erfindung nicht auf die Verwendung von Trennzonen mit zylindrisch gepackten Kolonnen beschränkt ist. Es sollte weiterhin erkannt werden, daß diese Erfindung ansatzweise oder in kontinuierlicher Weise ausgeführt werden kann.

Der Durchmesser und die Länge der Kolonne können weitgehend variieren. Beispielsweise können Kolonnen mit Durchmessern so eng wie 2 mm verwendet werden, besonders für analytische Zwecke. Andererseits können gewerbliche Kolonnen Durchmesser im Bereich von etwa 5 bis etwa 60 cm oder mehr haben. Vorzugsweise ist das Verhältnis der Länge zum Durchmesser etwa 5:1 bis etwa 125:1, stärker bevorzugt etwa von 10:1 bis etwa 40:1 und am meisten bevorzugt von etwa 10:1 bis etwa 25:1.

Typischerweise hat die stationäre Phase die Form von Teilchen (manchmal als das „Packungsmaterial" bezeichnet). Die bevorzugte Größe dieser Teilchen variiert, je nach dem Durchmesser und der Länge der Kolonne, sowie der Form der Teilchen. Kleinere Packungsgrößen erzeugen normalerweise bessere Trennung, doch erzeugen kleinere Packungsgrößen einen höheren Duckabfall und Rückdruck. So sind die Teilchen bevorzugt so klein wie möglich ohne Erzeugung von mehr Rückdruck als von der Struktur der Chromatographiezone toleriert werden kann. Im allgemeinen liegt die bevorzugte Größe der Packungsbereiche von etwa 1 bis etwa 1000 &mgr;m in ihrer größten Abmessung. Beispielsweise hat bei einer Ausführungsform dieser Erfindung die Kolonne einen Innendurchmesser von etwa 2 mm bis etwa 10 mm, und die Größe der Teilchen liegt vorzugsweise bei etwa 3 bis etwa 20 &mgr;m in ihrer größten Abmessung. Stärker bevorzugt liegt die Größe der Teilchen in einer solchen Kolonne bei etwa 5 &mgr;m in ihrer größten Abmessung. In größeren Kolonnen, die typischerweise in gewerblichem Maßstab verwendet werden (d.h. Kolonnen mit Durchmessern von etwa 5 bis etwa 60 cm) ist die Größe der Teilchen vorzugsweise etwa 60 bis etwa 200 &mgr;m in ihrer größten Abmessung.

Die Teilchen sind auch vorzugsweise regelmäßig geformt, um Gleichmäßigkeit in der gesamten Kolonne zu erzeugen. Typischerweise ist es bevorzugt, daß die Teilchen kugelig sind, da kugelige Teilchen dazu neigen, eine dichtere Packung als Teilchen mit anderen Formen zu geben. In einigen Situationen jedoch sind unregelmäßig geformte Teilchen bevorzugt, um den Rückdruck zu vermindern oder eine größere Oberfläche bei einem bestimmten Rückdruck zu erzeugen.

Die stationäre Phase kann eine große Vielzahl von Materialien umfassen. Vorzugsweise umfaßt die stationäre Phase einen Träger und Metallionen. Die Metallionen sind vorzugsweise an den Träger gebundne, so daß sie nicht aus der Kolonne während des Trennverfahrens eluiert werden. Es ist bevorzugt, daß die Metallionen in der Lage sind, koordinativ mit einer Doppelbindung eines Fettsäurerests des enrwünschten Triglycerids einen Metallkomplex mit dem ungesättigten Fettsäurerest zu bilden. Beispiele geeigneter Metallionen sind Metallionen aus der Gruppe Silber-, Magnesium- und Calciumionen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die Metallionen Silberionen. Bei einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Metallionen Magnesiumionen. Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sei betont, daß es in einigen Fällen erwünscht sein kann, unterschiedliche Metallionen in der stationären Phase zu vereinigen, besonders um eine erwünschte Selektivität zu erreichen.

Die Trägertypen in der stationären Phase können weit variiert werden. Der Träger kann beispielsweise Borax oder ein vernetztes Polystyrol umfassen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat der Träger Kieselsäurebasis. Beispielsweise kann der Träger ein Silikat umfassen. Geeignete Silikatträger sind beispielsweise Zeolith, Calciumsilikat und Magnesiumsilikat (zum Beispiel Mg₃(Si₄O₁₀)(OH)₂ („Talkum") und FLORISIL^® (Sigma Chemical, St. Louis, MO)). In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Träger ein Kieselgel. Metallionen können an das Kieselgel beispielsweise durch Vermischen des Kieselgels mit einer Lösung, die ein Salz von Metallionen enthält, gebunden werden. Diese Methode ist in der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel US-Patent 5,672,726 (Bindung von Silberionen an Kieselsäuregel durch Vermischen des Kieselsäuregels mit Ethanol, das 10g gelöstes Silbernitrat per 100 g Kielsesäuregel enthält), welches hier durch Bezugnahme einbezogen wird. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Kieselsäuregel mit Liganden auf s einer Oberfläche. Ein Beispiel einer geeigneten, gewerblich erhältlichen Kolonne, die ein Kieselgel mit Liganden auf der Oberfläche enthält, ist das ChromSpher 5 Lipids HPLC-Kolonne aus Chrompack (Raritan, NJ). Diese spezielle Kolonne verwendet, wie berichtet, Silber-modifiziertes kugelförmiges Kieselgel. Die Liganden auf der Oberfläche des Gels sind Sulfonsäurereste, gebunden an Silberionen. In einer Ausführungsform wird Kieselsäuregel mit Metallionen gesättigt.

Die Trennzone umfaßt auch eine mobile Phase (manchmal als das „Eluirmittel" bezeichnet). Die mobile Phase umfaßt vorzugsweise ein nicht-polares Lösungsmittel. Allgemein ist es bevorzugt, daß dieses Lösungsmittel ein unsubstituierter Kohlenwasserstoff ist. Dieser Kohlenwasserstoff kann eine gerade Kette, verzweigte Kette oder zyklisch sein. Beispiele besonders geeigneter Kohlenwasserstoffe sind Pentan, Hexan, Cyclohexan, Isohexan, Heptan und Octan.

Die mobile Phase kann auch ein polares Lösungsmittel umfassen, wie ein Nitril (zum Beispiel Acetonitril und Propionitril), einen Ester zum Beispiel Ethylacetat) ein Keton (zum Beispiel Aceton, Methylethylketon und Methylisoamylketon), Dichlormethan oder Chloroform. Das polare Lösungsmittel macht typischerweise nicht mehr als etwa 5 Vol.-% der mobilen Phase aus und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 2 Vol.-% der mobilen Phase. Der Zweck der polaren Verbindung ist der, die Reversibilität der Komplexbildung zwischen den Metallionen in der Kolonne und den Fettsäureresten zu verbessern. Dies seinerseits vermindert (a) die Verweilzeit der Triglyceride in der Trennzone und (b) die Menge des Eluiermittels. Das polare Lösungsmittel löst vorzugsweise die stationäre Phase nicht oder stört nicht die Technik, die angewendet wird, die Peaks in dem aus der Säule austretenden Eluat. Es ist besonders bevorzugt, beispielsweise Acetonitril als die polare Komponente in der mobilen Phase zu verwenden, wenn die Trennung (a) in der stationären Phase unter Verwendung mit einem Kieselgel und mit Metallionen und (b) Ultraviolettfeststellung verwendet wird, um das Eluat zu analysieren. Wasser, Alkohole und Amine werden andererseits vorzugsweise vermieden, wenn man solch ein System verwendet.

Die Abtrennung kann isokratisch erfolgen (d.h. die Konzentration der polaren Komponente in der mobilen Phase ist während der Trennung im wesentlichen konstant entlang der gesamten Länge der Kolonne). Alternativ kann die Konzentration des polaren Lösungsmittels in der mobilen Phase, die in die Kolonne eintritt, mit der Zeit während der Trennung variieren, was zu anschließender Entwicklung eines Gradienten in der Konzentration in polarem Lösungsmittel (a) gegen den Abstand entlang der Kolonne und (b) gegen die Zeit an einem Punkt in der Kolonne führt. Ein solcher Gradient neigt dazu, den Bereich der Zeit, in welcher ein spezielles Triglycerid aus der Kolonne in dem Eluat erscheint, zu verengen und dabei die Konzentration des Triglycerids zu steigern, wenn es als ein Eluat aus der Kolonne auftaucht. Wenn ein Gradient verwendet wird, ist der Grad der Veränderung in der Konzentration der polaren Komponente gegenüber der Zeit vorzugsweise konstant, und die Konzentration der polaren Komponente in dem in die Kolonne eingeführten Eluirmittel liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 Vol-% nahe dem Beginn der Abtrennung bis etwa 5 Vol-% nahe dem Ende der Abtrennung. Beispielsweise wenn Acetonitril als die polare Komponente verwendet wird und ein Konzentrationsgradient des Acetonitrils erwünscht ist, ist es bevorzugt, daß der Bereich der Acetonitrilkonzentration etwa 0,1 Vol.-% nahe dem Beginn der Abrennung bis etwa 2 Vol.-% nahe dem Ende der Abtrennung ist. Die bevorzugte Veränderungsgeschwindigkeit in der Acetonitrilkonzentration liegt bei etwa 0,3 bis etwa 5,7 Vol.-% je Stunde und stärker bevorzugt im Bereich von etwa 1 bis etwa 3 Vol.-% je Stunde. Allgemein kann eine bessere Auflösung unter Verwendung einer langsameren Veränderungsgeschwindigkeit in der Konzentration der polaren Komponente erzielt werden. Eine langsamere Veränderungsgeschwindigkeit glättet aber auch die Peaks und erzeugt daher stärker verdünntes Produkt.

Die Kolonne wird vorzugsweise vor der Durchführung der Trennung äquilibriert. Äquilibrierung kann typischerweise erreicht werden, indem man die mobile Phase allein (d.h. die nicht-polaren und polaren Lösungsmittel alleine, ohne das Triglycerid-Beschickungsmaterial) durch die Kolonne während einer Zeitdauer, vorzugsweise von etwa 15 bis etwa 120 Minuten passieren läßt. Während der Äquilibrierung geht die mobile Phase vorzugsweise durch die Kolonne mit der Geschwindigkeit, die während der Abtrennung verwendet wird. Bei den meisten Kolonnen kann eine Äquilibrierung erreicht werden, indem man etwa 5 bis etwa 20 Kolonnenvolumenteile der mobilen Phase durch eine feuchte Kolonne gehen läßt. Beispielsweise wurde gemäß dieser Erfindung gefunden, daß bei Verwendung von zwei feuchten Chrompack ChromSpher 5 Lipid-HPLC-Kolonnen in Reihe mit 2 mm Inndurchmesser und 250 mm Länge die mobile Phase vorzugsweise durch die Kolonne während etwa 120 Minuten bei 0,2 cm³/Min. geht. Und für eine feuchte ChromSpher 5 Lipid-HPLC-Kolonne mit 10 mm Innendurchmesser und mit 250 mm Länge geht die mobile Phase vorzugsweise durch die Kolonne während etwa 120 Minuten bei 3 cm³/Min.

Bevor das Triglycerid-Beschickungsmaterial in die Trennzone eingeführt wird, wird es vorzugsweise zunächst in einem Lösungsmittel gelöst. Es ist besonders bevorzugt, das Triglycerid-Beschickungsmaterial in dem gleichen nicht-polaren Lösungsmittel zu lösen, wie es als das nicht-polare Lösungsmittel in der mobilen Phase verwendet wird. Somit wird beispielsweise, wenn die mobile Phase Cyclohexan und Acetonitril enthält, das Triglycerid-Beschickungsmaterial vorzugsweise in Cyclohexan gelöst. Allgemein ist es bevorzugt, das Triglycerid-Beschickungsmaterial in ausreichend Lösungsmittel zu lösen, so daß die Konzentration des Triglycerid-Beschickungsmaterials in dem Lösungsmittel bei etwa 1 bis etwa 10 mg/ml liegt.

Vorzugsweise wird, nachdem das Triglycerid-Beschickungsmaterial in dem Lösungsmittel aufgelöst wurde und die Trennzone äquilibriert wurde, das Triglycerid-Beschickungsgemisch (d.h. das Lösungsmittel und das Triglycerid-Beschickungsmaterial) in einen Beschickungsstrom der mobilen Phase eingeführt, welcher anschließend in die Chromatographie-Trennzone eingeführt wird. Die bevorzugte Beladung des Triglycerid-Beschickungsmaterials kann beispielsweise je nach der Kolonnengröße und dem erwünschten Trennungsgrad variieren. Allgemeine wird bei einer Kolonne mit einem Innendurchmesser von 10 mm diese vorzugsweise mit etwa 0,1 mg bis etwa 100 mg Triglycerid-Beschickungsmaterial beladen, am meisten bevorzugt mit etwa 10 mg Trglycerid-Beschickungsmaterial. Verdopplung des Kolonnendurchmessers ermöglicht typischerweise als Faustregel, das Vierfache an Triglycerid-Beschickungsmaterial in die Kolonne einzuführen.

Typischerweise liegt die Trennungszeit bei etwa 20 Minuten bis etwa 6 Stunden. Stärker bevorzugt liegt die Abtrennungszeit bei etwa 20 Minuten bis etwa 2 Stunden. Wie die bevorzugte Beladung, kann die bevorzugte Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase variieren, beispielsweise je nach der Größe der Kolonne und dem erwünschten Trennungsgrad. Sie variiert auch beispielsweise mit der Menge an Rückdruck, den die Anlage tolerieren kann. Unter Anwendung der technischen Lehre dieser Beschreibung und des allgemeinen Fachwissens kann der Fachmann die geeignete Beladung und Fließgeschwindigkeit routinemäßig bestimmen.

Der Fließwiderstand der Kolonne erfordert gewöhnlich, daß der Beschickungsstrom der mobilen Phase in die Kolonne unter Druck eingeführt wird. Typischerweise wird der Strom der mobilen Phase über eine Pumpe mit mäßigem Druck oder eine Hochdruckpumpe eingeführt. Dies bewirkt, daß der Strom der mobilen Phase, der das Triglycerid-Beschickungsgemisch enthält, durch die Packung hindurchsickert und schließlich die Kolonne als eine Reihe von Eluaten verläßt. Der während der Abtrennung verwendete Druck beeinflußt die Trennung allgemein nicht. Der Druck sollte ausreichend sein, um die erwünschte Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase durch die Kolonne zu bekommen, vorzugsweise aber nicht so groß, daß die Unversehrtheit der Kolonnenstruktur gefährdet wird. Für die meisten Kolonnen liegt de bevorzugte Druck bei etwa 100 bis etwa 6000 psi (700000 bis etwa 41000000 Pa) und stärker bevorzugt, bei etwa 500 bis etwa 3000 psi (3500000 bis 21000000 Pa).

Die Temperatur während der Trennung ist allgemein nicht kritisch. Es ist jedoch bevorzugt, Temperaturen zu vermeiden, die bewirken, daß die mobile Phase sieded oder ein Abbau der Triglyceride verursacht wird. Typischerweise ist es bevorzugt, daß die Temperatur von etwa 0 bis etwa 60°C und stärker bevorzugt von etwa 20 bis etwa 25°C beträgt.

Wenn ein Eluat aus der Kolonne kommt, kann es unter Verwendung verschiedener quantitativer oder qualitativer analytischer, in der Technik bekannter Einrichtungen analysiert werden, wie mit Refraktometern, Polarimetern und Detektoren (zum Beispiel Ultraviolettdetektoren). Beispielsweise kann eine Analyse des Eluats unter Verwendung eines Verdampfungs-Lichtstreuungsdetektors (zum Beispiel Modell #750/14 der Applied Chromatography Systems Ltd., Macclesfield, Cheshire, England) durchgeführt werden. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Eluat unter Verwendung eines Ultraviolettdetektors, wie des Diode-Array Ultraviolet Detektors (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA), der auf 205 nm eingestellt ist, analysiert. Bei Verwendung einer solchen Analyse kann das Eluat mit der erwünschten Triglyceridzusammensetzung isoliert und aus der Kolonne gewonnen werden.

Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung wird auch ein zweites Eluat aufgefangen, um ein zweites Triglycerid zu isolieren und zu gewinnen. Dieses Triglycerid kann selbst erwünscht sein, zum Beispiel für Nährzwecke oder aus medizinischen Gründen. Statt dessen kann das zweite Triglycerid anschließend hydrolysiert werden (d.h. die Fettsäurereste der Triglyceride können von dem Glycerin-Grundgerüst des Triglycerids unter Bildung der entsprechenden freien Fettsäuren) oder umgeestert werden (d.h. die Fettsäurereste des Triglycerids können von dem Glycerin-Grundgerüst des Triglycerids abgespalten und dann zur Bildung zu Estern der Fettsäurereste verwendet werden).

Hydrolyse des zweiten Triglycerids können beispielsweise durch säurekatalysierte oder basenkatalysierte Hydrolyse durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung wird eine Hydrolyse des zweiten Triglycerids unter Verwendung des säurekatalysierten Verfahrens durchgeführt, bei dem man das Triglycerid bei etwa 20 bis 150°C (am meisten bevorzugt bei etwa 100°C) in einem Gemisch inkubiert, das Wasser und eine Mineralsäure enthalt (zum Beispiel ein Gemisch von Wasser und HCl mit einer HCl-Konzentration von etwa 4 bis etwa 10 Gew.-%). Die Triglycerid-Konzentration in dem Gemisch von Säure und Wasser liegt vorzugsweise bei etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt bei etwa 1 Gew.-%. Um die Hydrolyse unter Verwendung einer Base durchzuführen, wird ein Basenkatalysator (zum Beispiel KOH) anstelle eines Säurekatalysators verwendet. Ungeachtet dessen, ob der Katalysator eine Säure oder eine Base ist, wird die Hydrolyse vorzugsweise in einer nicht-oxidierenden Atmosphäre durchgeführt (d.h. die Atmosphäre umfaßt nicht-oxidierende Gase, wie N₂ und/oder ein Edelgas, und vorzugsweise besteht sie im wesentlichen aus nicht-oxidierendem Gas).

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das zweite Triglycerid umgeestert, um Alkylester des Fettsäurerestes zu bilden. Umesterung ist allgemein in der Technik bekannt, siehe zum Beispiel W. W. Christie, „Herstellung von Esterderivaten von Fettsäuren für chromatographische Analyse", Advances in Lipid Methodology – Band zwei, Ch. 2, Seiten 70 – 82 (W. W. Christie, Herausgeber, The Oily Press, Dundee, United Kingdom, 1993). (wird hier unter Bezugnahme einbezogen). Die durch die Umesterung gebildeten Alkylester sind vorzugsweise niedermolekulare Alkylester der Fettsäurereste und stärker bevorzugt Methylester oder Ethylester der Fettsäurereste, d.h. die Alkylester der Formal (III):

Gleichermaßen hat der Ethylester von 4, 7, 10, 13, 16, 19-DHA die Formel (V) (ohne zu berücksichtigen, ob die Doppelbindungen cis oder trans sind):

Ethylester sind allgemein am meisten bevorzugt, da sie typischerweise weniger giftig sind, wenn man sie ißt. Beispielswiese hydrolysieren Ethylester typischerweise unter Bildung von Ethanol beim Aufschließen, während Methylester typischerweise hydrolysieren und beim Aufschluß Methanol bilden.

Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung wird das Triglycerid umgeestert, um die Alkylester der Fettsäurereste durch säurekatalysierte Umesterung zu bilden, bei der das Triglycerid durch einen Alkohol in Gegenwart eines Säurekatalysators umgeestert wird. Säurekatalysierte Umesterung kann beispielsweise durch Inkubieren eines Triglycerids bei etwa 20 bis etwa 50°C (am meisten bevorzugt bei etwa 100°C) in einem Gemisch, das Alkohol und eine Mineralsäure (zum Beispiel HCl) enthält, vorzugsweise unter einer nicht-oxidierenden Atmosphäre und in Abwesenheit von Wasser (d.h. das Gemisch von Alkohol und Säure besteht im wesentlichen nicht aus Wasser) durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform wird das Gemisch von Triglycerid, Säure und Alkohol wenigstens etwa 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Bei einer anderen Ausführungsform wird das Gemisch von Triglycerid, Säure und Alkohol auf etwa 20 bis etwa 50°C über Nacht gehalten. Der Alkohol hat die Formel R₁-OH (worin R₁ wie oben für Formel III) definiert ist, und so ausgewählt wird, daß der erwünschte Fettsäureester gebildet wird. Beispielsweise kann Methanol zur Bildung von Methylestern verwendet werden, und Ethanol kann zur Bildung von Ethylestern benutzt werden. Da säurekatalysierte Umesterung typischerweise reversibel ist, ist der Alkohol vorzugsweise in einem großen Überschuß vorhanden, so daß die Reaktion im wesentlichen vollständig abläuft. Vorzugsweise liegt die Triglycerid-Konzentration in dem Alkohol/Säuregemisch bei etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt bei etwa 1 Gew.-%. In den meisten Fällen ist die Säure vorzugsweise HCl. Wenn die Säure HCl ist, liegt die Konzentration an HCl in dem Alkohol/HCl-Gemisch vorzugsweise bei etwa 4 bis etwa 10 Gew- %. Ein solches Gemisch kann nach verschiedenen Methoden hergestellt werden, die bekannt sind, wie Einperlen von trockenem gasförmigem Chlorwasserstoff in trockenes Ethanol. Obwohl HCl am meisten bevorzugt ist, können auch andere Säuren alternativ verwendet werden. Eine solche Säure ist H₂SO₄, die typischerweise in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 5 Gew. % in dem Alkohol verwendet wird. Es sei jedoch bemerkt, daß, weil H₂SO₄ ein stark oxidierendes Mittel ist, sie bevorzugt nicht mit langen Rückflußzeiten (d.h. länger als etwa 6 Stunden) bei hohen Konzentration (d.h. größer als etwa 5 Gew.-%) oder bei hohen Temperaturen (d.h. höher als 150°!C) verwendet wird. Ein anderes Beispiel einer geeigneten Säure ist Bortrifluorid, welches vorzugsweise bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 20 Gew.-% in dem Alkohol verwendet wird. Bortrifluorid ist jedoch weniger bevorzugt als HCl, da Bortrifluorid eine größere Neigung besitzt, unerwünschte Nebenprodukte zu erzeugen.

Ein Triglycerid kann alternativ beispielsweise durch basenkatalysierte Umesterung umgeestert werden, indem man das Triglycerid mit einem Alkohol in Gegenwart eines basischen Katalysators umestert. In diesem Fall kann das Umesterungsmittel beispielsweise Natrium- oder Kaliummethoxid (vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 2 M) in wasserfreiem Ethanol sein. Andere Basen können auch verwendet werden, obwohl Basen (zum Beispiel KOH), die in dem Gemisch unter Bildung von Wasser reagieren, weniger bevorzugt sind, da Wasser dazu neigt, die Fettsäureester unter Bildung von freien Fettsäuren zu hydrolysieren.

Die Abtrennung der freien Fettsäuren oder Alkylester, die aus der Hydrolyse oder Umesterung des zweiten Triglycerids resultieren, können unter Verwendung beispielsweise einer Trennzone durchgeführt werden, die eine stationäre Phase umfaßt, welche Metallionen aufweist, die koordinativ an eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung der erwünschten Fettsäure oder des erwünschten Esters binden können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gemisch, welches die freien Fettsäuren oder Alkylester enthält, in die gleiche Trennzone eingeführt, die anfangs zur Isolierung der Triglyceride benutzt wird, während die Triglyceride abgetrennt werden oder danach. Die mobile Phase umfaßt vorzugsweise ein nicht-polares Lösungsmittel (am meisten bevorzugt einen unsubstituierten Kohlenwasserstoff, wie Pentan, Hexan, Cyclohexan, Isohexan, Heptan oder Octan) und ein polares Lösungsmittel (wie Acetonitril, Ethylacetat, Dichlormethan, Chloroform oder Aceton). Das polare Lösungsmittel macht vorzugsweise bis nicht mehr als etwa 5 Vol.-% der mobilen Phase aus (stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 2 Vol.-% der mobilen Phase) und löst die stationäre Phase nicht oder stört nicht die Technik, die verwendet wird, die Peaks in dem Eluat zu ermitteln, welches aus der Kolonne auftaucht. Die Trennung kann isokratisch sein oder eine mobile Phase verwenden, die einen polaren Lösungsmittelkonzentrationsgradienten enthält. Die bevorzugte Beladung, Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase, der Druck und die Temperatur fallen allgemein in die gleichen Bereich wie jene für die Triglycerid-Trennung unter Verwendung der gleichen Trennzone.

Eine andere Methode zur Abtrennung vieler freier Fettsäuren und niedermolekularer Alkylester von Fettsäuren aus Gemischen von Fettsäuren und niedermolekularen Alkylestern von Fettsäuren unter Verwendung von Silberionen mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie sind in der Technik bekannt. Eine Diskussion, die ein Beispiel einer solchen Methode zeigt, kann man beispielsweise in 1. Elfman-Borjesson, S. V. D. Haerk & N,. Harrod, „Gradienten von n-Heptan und Acetonitril in Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Analysen der cis- und trans-Bindungen in Lipiden mit Silberionen", JAOCS, Band 74, Nr. 9, Seiten 1177 – 80 (1997) (unter Bezugnahme hier einbezogen) (die Trennung des Ethylesters von DHA aus einer 395 &mgr;g-Probe von Fischöl, das auch den Ethylester von Eicosapentaensäure enthält, unter Verwendung eines 4,6 × 250 mm Chrompack ChromSpher Lipids, einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographiekolonne einer mobilen Phase von Heptan/Acetonitril, einem Acetonitril-Gradienten von 0,1 bis 0,3 Vol.-% in der mobilen Phase, einer mobilen Phase mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. und einer Trenntemperatur von 23 bis 25°C). Eine getrennte allgemeine Diskussion solcher Trennungen kann man beispielsweise in B. Nikolova-Damyanova, „Silberionen-Chromatographie und Lipide", Advances in Lipid Methodology-One, Ch. 6, Seiten 182 – 237 (W. W. Christie, Herqausgeber, The Oily Press, Ayr, Schottland 1992) hier durch Bezugnahme eingeführt) finden. Eine weitere getrennte allgemeine Diskussion kann man beispielsweise in G. Dobson, W. W. Christie, & B. Nilolova-Dayanova „Überblick: Silberionen-Chromatographie von Lipiden und Fettsäuren", J. Chrom. B., Band 671, Seiten 197 – 292, 1995) finden (einbezogen hier durch Bezugnahme).

Wenn die erwünschte freie Fettsäure oder der Alkylester erst isoliert und gewonnen wurden, kann die freie Fettsäure oder der Alkylester selbst direkt verwendet werden (zum Beispiel für medizinische oder Nährstoffzwecke). Alternativ kann, wenn die isolierte Verbindung eine freie Fettsäure ist, die freie Fettsäure beispielsweise zu einem Alkylester verestert werden. Wenn andererseits die isolierte Verbindung ein Alkylester ist, kann der Alkylester beispielsweise unter Bildung der entsprechenden freien Fettsäure hydrolysiert oder unter Bildung eines anderen Esters umgeestert werden. Diese Ausführungsform ist besonders brauchbar zur Gewinnung von DHA-Resten aus Triglyceriden in Fällen, wo die Triglyceride selbst weniger erwünscht sind infolge der anderen Fettsäurereste, die in den Triglyceriden vorhanden sind.

Wenn nichts anderes angegeben ist, bedeutet der Begriff „Hydrocarbyl" einen Rest, der ausschließlich aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht. Das Hydrocarbyl kann verzweigt oder unverzweigt sein, kann gesättigt oder ungesättigt sein und kann eine Ringstruktur umfassen.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiter erläutern und erklären.

Zwei Silberionen-Chromatographiekolonnen mit enger Bohrung (d.h. 1 ChromSpher 5 Lipid HPLC-Kolonne von Chrompack, Raritan, NJ) in Reihe wurden verwendet, ein DHA-reiches Öl, extrahiert aus goldenen Meeresmikroalgen (Kelco, San Diego, CA) zu analysieren. Dieses Öl enthält einen weiten Bereich von Triglycenden. Von den Fettsäureresten in diesen Triglyceriden schätzte Kelco, daß etwa 9,1% 14-Kohlenstoff-gesättigte Fettsäurereste vorlagen. Etwa 22,8% waren 16-Kohlenstoff-gesättigte Fettsäurereste. Etwa 2,4% waren &ohgr;-6,20-Kohlenstoff-Fettsäurereste mit drei Doppelbindungen, etwa 2,2% waren &ohgr;-3,20-Kohlenstoff Fettsäurereste mit drei Doppelbindungen, etwa 2,2% waren &ohgr;-3,20-Kohlenstoff-Fettsäurereste mit fünf Doppelbindungen, etwa 16,2% waren &ohgr;-6,22-Kohlenstoff-Fettsäurereste mit fünf Doppelbindungen (DPA) und etwa 40,9% waren &ohgr;-3,22-Kohlenstoff-Fettsäurereste mit sechs Doppelbindungen (DHA).

Die Kolonnen hatten jeweils eine Länge von 250 mm (d.h. die Gesamtlänge der beiden Kolonnen war 500 mm) und einen Innendurchmesser von 2 mm. Die Packung war mit Silbermodifizierte kugelige Kieselsäure mit Ligandenbedeckung. Die mobile Phase enthielt 1,0% Acetonitril in Cyclohexan, die Trennung erfolgte bei einer Temperatur von etwa 22°C. Vor Durchführung der Trennung wurden die Kolonnen zunächst äquilibriert, indem man die mobile Phase durch die Kolonnen mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. während etwa 2 Stunden gehen ließ. Das Triglycerid-Beschickungsmaterial wurde in die Kolonne als ein Gemisch eingeführt, das 1 mg/ml des DHA-reichen Öls in Cyclohexan enthielt. Etwa 10 &mgr;l dieses Gemisches wurden in den Beschickungsstrom der mobilen Phase eingespritzt, während die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase auf 0,2 ml/Min. aufrechterhalten wurde. Das Eluat wurde dann unter Verwendung eines Dioden-Array-Ultraviolettdetektors von Hewlett-Packard, auf 250 nm eingestellt, analysiert. Zwei Hauptpeaks erschienen in dem Eluat bei etwa 24,4 Minuten und bei etwa 30,3 Minuten. Die Peaks hatten keine Überlappung miteinander.

Infolge der in diesem Experiment analysierten kleinen Probenmenge konnte die Zusammensetzung der Peaks nicht analysiert werden. So wurde ein zweites Experiment unter Verwendung einer größeren Kolonne und einer größeren Probenmenge durchgeführt und ist in Beispiel 2 diskutiert.

Eine chromatographische Silberionenkolonne (d.h. eine Chrompack ChromSpher 5-Lipid-HPLC-Kolonne) mit zwei 4, 7, 10, 13, 16, 19-DHA-Resten und einem Palmitinsäurerest von bei Kelco angereichertem DHA-Öl (in Beispiel 1 oben beschrieben) und speziell zur Isolierung und Gewinnung des Triglycerids aus einem Gemisch, das zusätzlich ein Triglycerid mit einem 4, 7, 10, 13, 16, 19-DHA-Rest, einem 4, 7, 10, 13, 16-DPA-Rest und einem Palmitinsäurerest besteht. Diese Trennung wurde bei einer Temperatur von etwa 22°C durchgeführt. Die Kolonne hatte eine Länge von 250 mm und einen Innendurchmesser von 10 mm. Die mobile Phase enthielt 1,0% Acetonitril in n-Hexan. Bevor die Trennung durchgeführt wurde, wurde zunächst die Kolonne äquilibriert, indem die mobile Phase durch die Kolonne mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. während etwa 2 Stunden hindurchlief. Das Triglycerid-Beschickungsmaterial wurde in die Kolonne als ein Gemisch eingeführt, das 10 mg/ml DHA-reiches Öl in n-Hexan enthielt. Spezieller wurden etwa vier Proben dieses Gemisches von 20 ml (d.h. insgesamt etwa 8 mg Triglyceride) in den Beschickungsstrom der mobilen Phase eingespritzt, während die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase auf 3 ml/Min. gehalten wurde. Das Eluat wurde dann unter Verwendung eines Dioden-Array-Ultraviolettdetektors von Hewlett-Packard, der auf 205 nm eingestellt war, analysiert. Zwei große Peaks erschienen in dem Eluat, die jenen entsprachen, die in der analytischen Kolonne in Beispiel 1 erhalten wurden. Diese Peaks hatten keine Überlappung miteinander. Etwa 1,5 mg wurden aus dem ersten Peak und etwa 3,5 mg aus dem zweiten Peak gesammelt.

Um die Zusammensetzung der beiden Peaks zu bestimmen, wurden die gesammelten Anteile der Peaks jeweils durch Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie-Kennzeichnung analysiert. Insbesondere wurden die Peaks in 10 mM Ammoniumacetat zur Bildung von Probenlösungen mit einem Gehalt von 10 &mgr;g der Triglyceride per ml Lösung gelöst. Etwa 4 &mgr;l je Minute von jeder Probenlösung wurden in ein Massenspektrometer Sciex API-III ES/MS/MS (Toronto, Kanada) unter Verwendung eines Multipliers von 6000 Volt, einer Ionensprayspannung von 5000 Volt und 60-Volt-Öffnung gegeben. Diese Analyse zeigte, daß das Triglycerid in dem ersten Peak ein Gesamtmolekulargewicht hatte, das zu einem Triglycerid mit einem DHA-Rest, einem DPA-Rest und einem Palmitinsäurerest bestand. Es wird auch gezeigt, daß das Triglycerid in diesem Peak einen Bestandteil mit einem Molekulargewicht enthielt, das zu jenem eines Palmitinsäurerestes paßte und daß ein Bestandteil ein Molekulargewicht hatte, das zu jenem des DPA-Restes paßte, und einen Bestandteil hatte, dessen Molekulargewicht zu dem DHA paßte. Das Triglycerid in dem zweiten Peak hatte andererseits ein Gesamtmolekulargewicht, das zu jenem eines Triglycerids mit zwei DHA-Resten sowie einem Palmitinsäurerest paßte. Das Triglycerid enthielt auch einen Bestandteil mit einem Molekulargewicht, das zu jenem eines Palmitinsäurerestes paßte, und einen Bestandteil mit einem Molekulargewicht, das zu einem DHA-Rest paßte.

Um zu bestimmen, ob die DHA-Reste in den Triglyceriden beider Peaks 4, 7, 10, 13, 16, 19-DHA-Reste und jene des DPA-Rests in dem ersten Peak ein 4, 7, 10, 13, 16-DPA-Rest war, wurde eine Probe des Kelco-DHA-reichen Öls umgeestert und durch eine Silberionen-Chromatographiesäule geschickt, um eine Trennung zu bekommen, die ihrerseits die Silberionen-chromatographische Spaltung gewerblich verfügbarer Standards von 4, 7, 10, 13, 16, 19-HDA und 4, 7, 10, 13, 16-DPA-Methylestern (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA) verfügbar sind. Spezieller wurden etwa 100 mg der Kelco DHA-reichen Säure in 2,0 ml einer 4%-igen HCl in Methanol während 2 Stunden bei 100°C inkubiert, um die Triglyceride in dem Öl umzuestern (d.h. die Fettsäurereste der Triglyceride wurden von den Glycerol-Grundgerüsten der Triglyceride unter Bildung von Methylestern der Fettsäurerest abgespalten). Etwa 1,0 ml Toluol wurde zugegeben, und das Gemisch ließ man bei 100°C eine weitere Stunde stehen. Danach wurde das Gemisch zwischen 2 ml H₂O und 2 ml Hexan aufgeteilt. Die Hexan-Fraktion ergab 80 mg gelbes Öl. Etwa 10 &mgr;m des gelben Öls wurden in zwei Silberionen-Chromatographiesäulen mit enger Bohrung (d.h. ChromSpher 5 Lipis-HPLC-Kolonnen mit Innendurchmesser von 2 mm und Längen von 250 mm) in Reihe bei einer Temperatur von etwa 22°C eingeführt. Die mobile Phase enthielt 1,0% Acetonitril in Cyclohexan und war durch die Kolonnen mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/mm während etwa 2 Stunden vor der Äquilibrierung der Kolonnen gegangen. Die Fließgeschwindigkeit während der Trennung war auch 0,2 ml/mm. Zwei Hauptpeaks wurden bei etwa 10 und 12 Minuten eluiert. Diese Peakzeiten entsprachen den Peakzeiten, die man erhielt, wenn die Matreya-Standardproben durch die Säule unter den gleichen Säulenbedingungen geschickt wurden.